expressão heteróloga
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EXPRESSÃO HETERÓLOGA DE PROTEÍNAS
Ivson CassianoMayla Abrahim
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O que são proteínas heterólogas
heterólogo (he-te-ró-lo-go) adj (hétero+logo) 1 Que consiste em elementos diferentes. Expressão heteróloga de proteína significa que uma proteína é experimentalmente colocado em uma célula que normalmente não fazem (ou seja, expressa) a proteína.
A expressão de proteínas funcionais em hospedeiros heterólogos é um desafio da biotecnologia moderna.
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Proteínas e sua importância
A sequência de aminoácidos bem como a função da proteína, são determinadas pela sequência de pares de bases no gene que a codifica. As proteínas são essenciais à estrutura, à função, e ao regulamento celular e são também responsáveis pela homeostasia do organismo.
A expressão heteróloga de proteínas é muito importante quando se pretende proceder ao estudo funcional das mesmas.
A utilização de microrganismos geneticamente modificados, capazes de sintetizar proteínas em grande quantidade, apresenta, sob o ponto de vista econômico, uma vantagem considerável em relação aos processos clássicos de produção.
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Os sistemas de expressão heteróloga em proteínas têm vindo a ser extensivamente utilizados nos dias de hoje, nomeadamente na produção de proteínas de interesse do ponto de vista biotecnológico e medicinal .
EXPRESSÃO HETERÓLOGA DE PROTEÍNAS
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Expansão e desafios da indústria de biotecnologia: produção eficiente e controlada de proteínas
recombinantes
diferentes sistemas de expressão: procariotos e eucariotos
inúmeras finalidades: diagnóstica, terapêutica e de prevenção (vacinas)
Tecnologia de DNA recombinante: obter e combinar genes de uma variedade de fontes
clonar e expressar genes em diferentes hospedeiros
produção de grandes quantidades de proteínas recombinantes
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A clonagem de expressão permite obter o produto do gene clonado.
O produto é utilizado para diferentes fins:
O transcrito da sequência clonada (transcrição in vitro) pode servir como sonda de hibridação.
•A proteína expressa pode servir para identificar o gene clonado, numa biblioteca de expressão, por hibridação com o anticorpo específico.
•O DNA recombinante pode servir para produzir proteínas de valor comercial.
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Relembrando:
Clonagem gênica: isolamento, amplificação e purificação de um gene ou de genes, a partir do material genético de um dado organismo.
Vetores: veículos de clonagem que permitem que os fragmentos de DNA a serem clonados sejam introduzidos e propagados em uma célula hospedeira adequada.
Célula hospedeira: células de fácil manipulação, crescimento rápido e constituição genética bem conhecida (ex: bactérias, leveduras, células de cultura de tecidos de mamíferos e insetos).
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Sistemas de expressão de proteínas recombinantes:
bactérias (Escherichia coli)
leveduras (Pichia pastoris)
baculovírus/células de inseto
cultura de células de mamíferos
células de plantas e plantas transgênicas
animais transgênicos
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Processo: Escolhendo o vetorAplicação da proteína expressada
Características da proteínaSolubilidade e localização celular
Tags
Preparar o vetorDigestão ou Método LIC
Preparar o Inserto Plasmídeo ou DNA
PCRClonar o Inserto no Vetor
AnelamentoTransformação
Transformação em célula
de expressão
InduçãoDeterminação tempo e
temperaturaSDS-PAGE
Cultura de células
ExtraçãoDetergentes
Métodos Físicos
PurificaçãoColuna afinidadeProtases - Tags
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Procedimento: Isolar e preparar o DNA;
Escolher o vetor apropriado;
O fragmento de DNA a clonar é introduzido em vectores de clonagem, formando-se o DNA recombinante.
O DNA recombinante é inserido na célula hospedeira – transformação, que possui mecanismos enzimáticos para a replicação do DNA e para a síntese protéica;
Selecção e identificação de células que incorporam o DNA recombinante;
Verificar se a proteína foi expressa;
Remoção e purificação das proteínas.
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Escolhendo o vetor
Organismos como plasmídeos, bacteriófagos, cosmídios, BAC (Bacterial Artificial Chromosome) e YAC (Yeast Artificial Chromosome) utilizados para transferir DNA/RNA para uma celular hospedeira.
Considerações importantes para escolher o melhor vetor de expressão:
- Aplicação da proteína expressada;
- Informações específicas sobre a proteína a ser expressada (sequência extra de amina terminal)
- Estratégia de clonagem – preparo do inseto (compatibilidade entre sítio de restrição e a região de leitura).
- Solubilidade e localização celular (citoplasma, periplasma ou corpo de inclusão)
- um local de reconhecimento onde as endonucleases o irão cortar.
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Preparando o inserto de DNA
DNA de interesse
Utilizar uma enzima de alta fidelidade;Limitar o número de ciclos da reação;Aumentar a concentração do DNA;Aumentar a concentração de primers.
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Células para clonagem E. coli
Vantagens:Vasto conhecimento da genética e fisiologia de E. coliDiversidade de vectores de clonagem Fácil controlo da expressão génica Fácil crescimento com elevadas produçõesSecreção do produto no meio de cultura
Desvantagens:Não realiza modificações pós-traducionais e tem capacidade limitada de formar pontes dissulfídricasAtividade biológica e imunogenicidade podem diferir da proteína naturalElevado conteúdo de endotoxinas Falta de um mecanismo de secreção
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Escolhendo a melhor célula
A escolha da melhor célula competente depende da natureza da proteína de interesse:
Proteínas mais sensíveis a ação de proteases;
Proteínas eucarióticas que possuem códons próprios, também chamados de raros;
Proteínas insolúveis;
Proteínas tóxicas;
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Deficiência de Protease
Linhagens B834, BL21, BLR, Origami ™B, Rosetta™ 2, Tuner™;São deficientes em proteases que possam degradar as proteínas durante o processo de purificação;Proteínas se tornam mais estáveis nessas linhagens;
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Um pedaço de DNA pode ser inserido em um plasmídeo, se tanto o plasmídeo circular e a fonte de DNA têm sítios de reconhecimento para a mesma endonuclease de restrição.
Vetor de expressão
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Clonagem num vector de expressão plasmídico
Um pedaço de DNA pode ser inserido em um plasmídeo, se tanto o plasmídeo circular e a fonte de DNA têm sítios de reconhecimento para a mesma endonuclease de restrição.
O plasmídeo e o DNA estranho são cortados por esta endonuclease de restrição (EcoRI neste exemplo).
Os dois intermediários recombinar por base o emparelhamento e estão ligadas pela ação da DNA ligase.
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O vector de expressão tem um promotor forte, adjacente ao gene que codifica a proteína, que origina grandes quantidades de mRNA.
O DNA recombinante é introduzido em bactérias, leveduras, células de inserto, ou células de mamífero, onde o gene clonado é transcrito e traduzido eficientemente.
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Tag
O tag é uma curta sequência de nucleotídeos que codifica um peptideo com poucos aminoácidos.
Pode ser adicionado à extremidade N ou C do produto do gene clonado.
Permite a detecção e purificação de proteínas.
Péptideos de fusão específicos conferem vantagens à proteína alvo durante a expressão: aumentam a solubilidade, protegem da proteólise, melhoram a conformação, aumentam a produção.
São vários os tags utilizados nos vectores de clonagem:His6 Glutationa-S-transferase (GST) Proteína de ligação a maltose (MBP)Proteína verde fluorescente (GFP)Epítopos
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Tag adicionado ao inserto
Por engenharia genética, uma tag (epítopo) pode ser adicionado ao inserto.
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Detecção de proteínas
A identificação do DNA clonado é feita por hibridação com um anticorpo específico da proteína expressa.
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Recuperando a Proteína
Lise celular
Remoção dos Ácidos Nucléicos
Otimizar a Purificação
Remover os Tags
Armazenar as proteínas em tampão apropriado.
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Lise celular convencional
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Detergentes para Extração
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Buster Family
É uma mistura de detergentes, própria para o rompimento da parede celular de E.coli e liberação das proteínas ativas.
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Purificação de proteínas com tag
Após obtenção da proteína, esses resíduos devem ser purificados;Podem prejudicar a função / forma da proteína;São removidos por uma protease específica e / ou coluna cromatográfica.
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Proteases de remoção
Proteases específicas promovem remoção eficiente dos resíduosda proteínas.São altamente específicas e podem ser ativadas em baixastemperaturasEvita desnaturação da proteína.
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Fractogel
Purificação eficiente e econômica das protéinas
Purificação de proteínas em larga escala;Purificação de proteínas recombinantes
obtidas da cultura celularPurificação de vírusRemoção de resíduos e toxinasAlta estabilidade química
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Corpos de Inclusão – Fração Insolúvel
Corpos de inclusão: tornam a proteína inativa devido a formação de agregados insolúveis (ácidos nucléicos, fosfolipídios, etc); Consequentemente a proteína deve ser rearranjada para retomar sua atividade;Métodos convencionais de purificação de corpos de inclusão são empíricos e consomem muito tempo do usuário.
iFOLD ™ Protein Refolding System
É um método rápido ereprodutível deidentificar as condiçõesde rearranjo da proteína.
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Gene repórterGene repórter é um gene que produz uma proteína que pode ser detectada e quantificada utilizando um teste simples.
Utilização de genes repórter na localização de proteínas recombinantes
Ratinho transgénico com GFP em fusão com uma proteína epitelial
O ratinho contém um transgene marcado com GFP expresso no corpo; o ratinho fluoresce quando iluminado com luz UV.
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Atualmente
É possível realizar este processo (com modificações especificas para cada célula, proteína de interesse e genoma) em:
Leveduras (Pichia pastoris, Saccharomyces cerevisiae, entre outras).
células de mamífero (células COS, células CV1, etc)
baculovírus/células de inseto
células de plantas e plantas transgênicas
animais transgênicos
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A produção de insulina humana porENGENHARIA GENÉTICA
bactéria E. coli Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento - nº 23 - novembro/dezembro 2001
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vetor de expressão pLMT8.5 construído para a produção da pró-insulina humana em E. coli.
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Aumentando a estabilidade da proteína
Utilize células deficientes de proteases;
Adicione inibidores de proteases durante o processo de extração
Encontre o melhor tampão de armazenagem
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Bibliografia
Como melhorar sua Expressão de Proteínas Recombinantes em E.coli. Paola de Carvalho Braga, 2008.
Clonagem de expressão.
PROTEÍNAS RECOMBINANTES PRODUZIDAS EM LEVEDURAS. Fernando Araripe Gonçalves Torres. Revista Biotecnologia.
A produção de insulina humana por ENGENHARIA GENÉTICA. Beatriz Dolabela de Lima. Revista Biotecnologia.
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OBRIGADO!
Ivson CassianoMayla Abrahim