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Expression, Reinigung und Charakterisierung von Makrolid-
Glykosyltransferasen für die Synthese neuartiger Makrolid-Antibiotika
Von der Fakultät für Mathematik, Informatik und Naturwissenschaften der
Rheinisch-Westfälischen Technischen Hochschule Aachen zur Erlangung des
akademischen Grades eines Doktors der Naturwissenschaften genehmigte Dissertation
vorgelegt von
Diplom-Biologe
Thomas Schumacher
aus Wesel
Berichter: Universitätsprofessor Dr. rer. nat. L. Elling
Universitätsprofessor Dr.-Ing. W. Hartmeier
Tag der mündlichen Prüfung: 24.02.2005
Diese Dissertation ist auf den Internetseiten der Hochschulbibliothek online verfügbar.
Die vorliegende Arbeit wurde in der Zeit von April 1999 bis August 2002 am Institut für
Enzymtechnologie der Heinrich-Heine-Universität Düsseldorf im Forschungszentrum Jülich
und im Zeitraum von September 2002 bis Dezember 2004 im Lehr- und Forschungsgebiet
Biomaterialien, Lehrstuhl für Biotechnologie und Helmholtz-Institut für Biomedizinische
Technik angefertigt.
An dieser Stelle möchte ich mich ganz herzlich bei all denen bedanken, die zum Gelingen
meiner Arbeit beigetragen haben.
Mein besonderer Dank gilt dabei:
Herrn Univ.-Prof. Dr. rer. nat. L. Elling, Lehr- und Forschungsgebiet Biomaterialien, RWTH
Aachen, für die interessante Themenstellung, die Übernahme des Hauptreferats und seine
unermüdliche Diskussionsbereitschaft.
Herrn Univ.-Prof. Dr.-Ing. W. Hartmeier für die freundliche Aufnahme am Lehrstuhl für
Biotechnologie der RWTH Aachen und für die Übernahme des Koreferats.
Frau Univ.-Prof. Dr. rer. nat. M.-R. Kula, Institut für Enzymtechnologie der Heinrich-Heine-
Universität Düsseldorf, für ihre stete Diskussionsbereitschaft und die hervorragenden
Arbeitsbedingungen am Institut für Enzymtechnologie.
Sämtlichen Partnern des EU-Projekts „GENOVA“ für die interessante und anregende
Zusammenarbeit, insbesondere Herrn Prof. Dr. P. F. Leadlay, Frau Dr. S. Gaisser und Frau
Dr. R. Lill, Cambridge University, für die Überlassung der Saccharopolyspora erythraea
Expressionsstämme und die Anfertigung der MS-Spektren.
Herrn Dipl.-Chem. C. Rupprath für seine Freundschaft, seine unerschöpfliche
Diskussionsbereitschaft und für die schnelle und kritische Durchsicht der Arbeit.
allen Mitabeitern und Mitarbeiterinnen des Instituts für Enzymtechnologie und des Lehrstuhls
für Biotechnologie, besonders denen der „Zuckergruppe“, für die gute Zusammenarbeit und
angenehme Arbeitsatmosphäre.
meiner Familie, ohne deren Rückhalt mein Studium niemals möglich gewesen wäre
und meiner Frau Kathryn, die mir mehr als einmal den nötigen moralischen Beistand gegeben
hat.
Für „Den Kleinen“…
I INHALTSVERZEICHNIS
I Inhaltsverzeichnis
A Einleitung 1 Kohlenhydrate und Glykokonjugate S. 1 1.1 Biologische Bedeutung von Kohlenhydraten und Glykokonjugaten S. 1
1.2 Kohlenhydrate - Essentielle Bestandteile von Naturstoffen S. 2
2 Sekundärmetabolite der Actinomyceten S. 3 2.1 Antibiotika S. 3
2.1.1 Biosynthese der komplexen Makrolid-Antibiotika S. 3
2.1.2 Biosynthese von Erythromycin A S. 4
2.1.3 Wirkmechanismus der Makrolid-Antibiotika S. 8
2.1.4 Aromatische Polyketid- und Glykopeptid-Antibiotika S. 14
2.1.5 Biosynthese der nukleotid-aktivierten Desoxyzucker S. 17
2.1.6 Chemische und enzymatische Synthese von
nukleotid-aktivierten Desoxyzuckern S. 22
2.1.7 Naturstoff-Glykosyltransferasen S. 26
2.1.7.1 In vitro Untersuchungen zu den Naturstoff-Glykosyltransferasen S. 32
3 Kombinatorische Biosynthese und
kombinatorische Biokatalyse S. 37 3.1 Manipulation von PKS-Modulen in der kombinatorischen
Biosynthese S. 38
3.2 Manipulation von Desoxyzucker-Biosynthesewegen in der
kombinatorische Biosynthese S. 40
3.3 Die kombinatorische Biokatalyse als Werkzeug für die
Produktion von neuartig glykosylierten Naturstoffen S. 49
4 Das EU-Projekt „GENOVA“ S. 53
5 Zielsetzung der Arbeit S. 56
-I-
I INHALTSVERZEICHNIS
B Ergebnisse und Diskussion
1 Kultivierung und Proteinproduktion S. 58 1.1 Kultivierung der Actinomyceten S. 58
1.1.1 Actinomyceten-Expression der Glykosyltransferasegene S. 58
2 Proteinaufreinigung S. 62 2.1 Anionaustauschchromatographie S. 65
2.1.1 Chromatographie an Q-Sepharose 6 FF S. 65
2.2 Immobilisierte Metallionenaffinitätschromatographie S. 68
2.2.1 Chromatographie an Ni2+-NTA S. 68
2.3 Präparative Aufreinigung von EryCIII
über Anionenaustauschchromatographie und IMAC S. 70
2.4 Gelfiltration S. 76
2.4.1 Chromatographie an Superdex G200 S. 76
3 Biochemische Charakterisierung S. 84 3.1 Biochemische Charakterisierung von EryCIII S. 84 3.1.1 Untersuchung des Donorsubstratspektrums von EryCIII S. 85
3.1.2 Untersuchung des Akzeptorsubstratspektrums von EryCIII S. 85
3.1.3 Charakterisierung des Enzymtests für die
Makrolid-Glykosyltransferasen S. 93
3.1.4 Bestimmung des pH-Optimums für die Transferreaktion von EryCIII S. 97
3.1.5 Bestimmung des Temperaturoptimums für die
Transferreaktion von EryCIII S. 98
3.1.6 Untersuchung der thermischen Inaktivierung von EryCIII S. 100
3.1.7 Michaelis-Menten-Kinetiken für EryCIII S. 101
3.1.7.1 Bestimmung des Vmax- und Km-Werts für dTDP-D-Desosamin S. 102
3.1.7.2 Bestimmung der Vmax- und Km-Werte für MEB, REB und NB S. 103
3.2 Biochemische Charakterisierung von EryBV, OleG2 und TylMII S. 107
3.2.1 Untersuchung des Donorsubstratspektrums von EryBV, OleG2 und TylMII S. 108
-II-
I INHALTSVERZEICHNIS
4.1 Untersuchungen zur kombinatorische Biokatalyse S. 110 4.1.1 Einsatz von EryCIII im EMS und Kopplung von Modulen S. 110
4.1.2 Immobilisierung von EryCIII an Ni2+-NTA-MagnetoBeads S. 114
4.1.3 Katalytischer Einsatz der immobilisierten Glykosyltransferase S. 114
C Zusammenfassung S. 117
D Ausblick S. 119
E Material und Methoden 1 Kultivierung und Proteinproduktion S. 120 1.1 Kultivierung der Actinomyceten S. 120 1.1.1 Expression der Glykosyltransferasegene in Actinomyceten S. 120 1.1.2 Stammhaltung der Actinomyceten S. 122 2 Proteinaufreinigung S. 122 2.1 Herstellung des Rohextrakts S. 122 2.1.1 Zellaufschluss durch Ultraschall und Nassvermahlung S. 122 2.2 Anionaustauschchromatographie S. 123 2.2.1 Chromatographie an Q-Sepharose 6 FF S. 123 2.3 Immobilisierte Metallionenaffinitätschromatographie S. 125 2.3.1 Chromatographie an Ni2+-NTA S. 125 2.3.2 Nicht-präparative Chromatographie an Ni2+-NTA und Ni2+-TED S. 128 2.4 Gelfiltration S. 129 2.4.1 Chromatographie an Superdex G200 S. 129 3 Proteinchemische Charakterisierung S. 130 3.1 Nachweis der Expression durch Immunoblotting S. 130 3.1.1 Nachweis der Expression der Glykosyltransferasegene aus Saccharopolyspora erythraea S. 130 3.1.2 Bestimmung der relativen Molmassen der Glykosyltransferasen S. 131 3.2 Nachweis der Expression von eryCIII und eryBV durch N-terminale Mikro-Proteinsequenzierung nach Edman S. 131 3.3 Untersuchung des Fällungsverhaltens von EryCIII in Anwesenheit von PEG4000 S. 132
-III-
I INHALTSVERZEICHNIS
4 Biochemische Charakterisierung S. 132 4.1 Aktivitätstest für die bakteriellen Glykosyltransferasen S. 133 4.2 Biochemische Charakterisierung von EryCIII S. 135 4.2.1 Untersuchung des Donorsubstratspektrums von EryCIII S. 135 4.2.2 Untersuchung des Akzeptorsubstratspektrums von EryCIII S. 135 4.2.3 Bestimmung des pH-Optimums für die Transferreaktion von EryCIII S. 136 4.2.4 Bestimmung des Temperaturoptimums für die Transferreaktion von EryCIII S. 137 4.2.5 Untersuchung der thermischen Inaktivierung von EryCIII S. 137 4.2.6 Michelis-Menten-Kinetiken für EryCIII S. 138 4.2.6.1 Bestimmung des Vmax- und Km-Wertes für dTDP-D-Desosamin S. 138 4.2.6.2 Bestimmung der Vmax- und Km-Werte für MEB, REB und NB S. 139 4.3 Biochemische Charaktersierung von EryBV, OleG2 und TylMII S. 140 4.3.1 Untersuchung des Donorsubstratspektrums von EryBV, OleG2 und TylMII S. 140 4.4 Untersuchungen zur kombinatorische Biokatalyse S. 141 4.4.1 Einsatz von EryCIII im EMS und Kopplung von Modulen S. 141 4.4.2 Immobilisierung von EryCIII an Ni2+-NTA-MagnetoBeads S. 142 4.4.3 Katalytischer Einsatz der immobilisierten Glykosyltransferase S. 144 5 Datenbankrecherchen und berechnete Daten S. 144 5.1 Theoretische pI-Werte und Molekulargewichte S. 144 6 Analytik S. 145 6.1 Dünnschichtchromatographie (DC) S. 145 6.1.1 C18-Festphasenextraktion S. 145 6.1.2 DC-Verfahren zur Trennung von Makroliden S. 145 6.1.3 Makrolidnachweis durch Anisaldehyd-H2SO4-Reagenz S. 146 6.2 Hochleistungsflüssigkeitschromatographie (HPLC) S. 147 6.2.1 HPLC-Verfahren zur Trennung von Nukleosiden, Nukleotiden und nukleotid-aktivierten Zuckern S. 147 6.2.2 HPLC-Verfahren zur Trennung von Makroliden S. 147 6.3 HPLC-Massenspektrometrie (HPLC-MS) S. 148 6.3.1 HPLC-MS-Verfahren zur Bestimmung der Masse von Makroliden S. 148 6.4 Kapillarelektrophorese (CE) S. 149 6.4.1 CE-Verfahren zur Trennung von Nukleosiden, Nukleotiden und nukleotid-aktivierten Zuckern S. 149 6.5 Nachweis der antibiotischen Aktivität S. 150 6.5.1 Plattentest zum Nachweis der antibiotischen Aktivität S. 150
-IV-
I INHALTSVERZEICHNIS
6.6 Bestimmung des Proteingehalts nach Bradford S. 151 6.7 SDS-PAGE, Western- und Immunoblotting S. 151 6.7.1 NuPAGE SDS-PAGE- und Blottingsystem S. 152 6.7.2 Criterion SDS-PAGE-System und Blotting nach Khyse-Andersen S. 155 6.8 Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) S. 156 6.8.1 ELISA-Verfahren zur Detektion der Glykosyltransferasen^ S. 156
F Anhang 1 Verwendete Chemikalien S. 158 2 Kultivierungsmedien, Elektrophorese- und Blottingpuffer S. 160 3 Geräte S. 162 4 Abkürzungen und Symbole S. 165 5 Stämme S. 168 6 Vektorkarten S. 168 7 ESI-MS-Spektren der in vitro Transferansätze S. 169 7.1 ESI-MS-Spektrum von Erythromycin D S. 169 7.2 ESI-MS-Spektrum von Mycarosyl-Erythronolid B S. 169 7.3 ESI-MS-Spektrum von Desosaminyl-rhamnosyl-Erythronolid B S. 170 7.4 ESI-MS-Spektrum von Rhamnosyl-Erythronolid B S. 170 7.5 ESI-MS-Spektrum von Desosaminyl-olivosyl-Erythronolid B S. 171 7.6 ESI-MS-Spektrum von Olivosyl-Erythronolid B S. 171 7.7 ESI-MS-Spektrum von Narbomycin S. 172 8 HPLC-Chromatogramme der in vitro Transferansätze S. 172 8.1 HPLC-Chromatogramm des Transferansatzes mit EryCIII, dTDP-D-Desosamin und Mycarosyl-Erythronolid B S. 172 8.2 HPLC-Chromatogramm des Transferansatzes mit EryCIII, dTDP-D-Desosamin und Rhamnosyl-Erythronolid B S. 173 8.3 HPLC-Chromatogramm des Transferansatzes mit EryCIII, dTDP-D-Desosamin und Olivosyl-Erythronolid B S. 173 8.4 HPLC-Chromatogramme des Transferansatzes mit EryCIII, dTDP-D-Desosamin und Narbonolid S. 174 9 Kalibrierungen S. 175 9.1 Kalibrierungsgeraden für die Proteingbestimmungen nach Bradford S. 175
-V-
I INHALTSVERZEICHNIS
9.2 HPLC-Kalibrierungsgeraden für die Quantifizierung von Nukleotiden und dTDP-Glucose S. 176 9.2.1 Beispielchromatogramm für die HPLC-Trennung von Nukleotiden und nukleotid-aktivierten Zuckern S. 176 9.2.2 Kalibrierungsgerade für die Quantifizierung von dTDP-Glucose S. 176 9.2.3 Kalibrierungsgerade für die Quantifizierung von dTMP S. 177 9.2.4 Kalibrierungsgerade für die Quantifizierung von dTDP S. 177 9.3 CE-Kalibrierungsgeraden für die Quantifizierung von Nukleotiden und dTDP-Glucose S. 178 9.3.1 Beispielelektropherogramm für die Trennung von Nukleotiden und Nukleotidzuckern durch Kapillarelektrophorese (CE) S. 178 9.3.2 Kalibrierungsgeraden für die Quantifizierung von Thymidin, dTMP, dTDP und dTDP-Glucose durch Kapillarelektrophorese (CE) S. 178 9.4 Regressionsanalyse zur Ermittlung der relativen Molmassen von Proteinen anhand von SDS-PAGE S. 179 9.5 Regressionsanalyse zur Ermittlung des nativen Molekulargewichts von Proteinen durch Gelfiltration S. 180 10 ELISA S. 181 10.1 ELISA-Platte eines immunchemischen Nachweises von EryCIII in verschiedenen Chromatographiefraktionen S. 181 11 DC- und Stechagarplatten S. 181 11.1 DC-Platte zum Nachweis der enzymatischen Aktivität von EryCIII nach Präzipitation (PEG4000) und Resuspendierung S. 181 11.2 Stechagarplattentest zum Nachweis der enzymatischen Aktivität von EryCIII nach Präzipitation (PEG4000) und Resuspendierung S. 182 11.3 DC zum Nachweis der direkten Korrelation zwischen dTDP-Freisetzung und Makrolidbildung bei der enzymatischen Reaktion von EryCIII S. 183
G Literatur S. 184
-VI-
A EINLEITUNG
A Einleitung
1 Kohlenhydrate und Glykokonjugate 1.1 Biologische Bedeutung von Kohlenhydraten und
Glykokonjugaten Unter den auf der Erde vorkommenden organischen Naturstoffen machen Kohlenhydrate den
mengenmäßig größten Teil aus und stellen eine der vier Hauptklassen (Aminosäuren, Zucker,
Membranbestandteile, Nukleobasen) der Biomoleküle dar. Kohlenhydrate dienen sowohl als
Energiequelle, insbesondere in Form von Monosacchariden (Glucose) oder langkettigen
Speichermolekülen (Stärke, Glykogen), als auch als Strukturelement in Zellwänden von
Pflanzen (Zellulose), Bakterien (Peptidoglykan) oder Arthropoden (Chitin) (Feizi 1991;
Sharon und Lis 1993; Koolman und Röhm 1998). Des Weiteren vermitteln Kohlenhydrate
eine Vielzahl von biologischen Prozessen. Kohlenhydrate an Zelloberflächen sind ein
Hauptbestandteil von Säugetierzellen (2-10% stellen dabei Glykolipide und Glykoproteine)
und sind oftmals charakteristisch für einen bestimmten Zelltyp. Dabei spielen die
zellspezifischen Kohlenhydratbestandteile eine besondere Rolle sowohl in der intrazellulären
Kommunikation, als auch bei der Zell-Zell Interaktion. Die Erkennung der spezifischen
Glykostrukturen erfolgt in erster Linie durch Lektine, aber auch durch verschiedene
Glykosyltransferasen (Sharon und Lis 1993). Die Gesamtheit aus Glykoproteinen,
Proteoglykanen und Glykolipiden wird häufig unter dem Begriff „Glykokonjugate“
zusammengefasst, jedoch können auch weitere glykosylierte Verbindungen, z.B. glykosylierte
Naturstoffe zu den Glykokonjugaten gezählt werden. Kohlenhydrate sind einzigartig in ihre
Komplexität und kommen im Gegensatz zu Proteinen und Nukleinsäuren in isomeren (α- und
β-Anomer) und verzweigten Formen vor. Theoretisch ist es möglich zwei identische
Monosaccharide zu elf isomeren Disacchariden zu verknüpfen (Sharon und Lis 1993). Dies
unterscheidet Kohlenhydrate vom Rest der biologischen Makromoleküle, die überwiegend
nur lineare Strukturen ausbilden. Oligosaccharide werden daher auch als effiziente
biologische „Informationsträger“ angesehen. Sie können als spezifische Liganden für Viren,
Bakterien, Toxine, blutgruppen- und tumorspezifische Antikörper dienen (Varki 1993).
-1-
A EINLEITUNG
1.2 Kohlenhydrate - Essentielle Bestandteile von Naturstoffen Nach einer aktuellen Schätzung basieren ca. 70% aller in der gegenwärtigen
Arzneimittelforschung untersuchten Leitstrukturen auf Naturstoffen, von denen viele aus dem
Bereich der glykosylierten, bakteriellen Sekundärmetabolite stammen. Aus diesem Grund
tragen bakterielle Glykosyltransferasen und ihre entsprechenden Zuckersubstrate viel zur
Diversität von pharmazeutisch wichtigen Metaboliten bei (Thorson et al. 2001).
Kohlenhydrathaltige Sekundärmetabolite sind seit Jahrzehnten bekannt, jedoch fehlen für die
Kohlenhydrateinheiten häufig genauere Zuordnungen hinsichtlich ihrer Bedeutung für die
biologische Funktion der Metaboliten. Traditionell wurde den Kohlenhydraten häufig eine
pharmakokinetische Funktion zugewiesen, wie z. B. Absorption, Verteilung, Metabolismus
oder die Ausscheidung von Arzneimitteln. Durch neue Forschungsergebnisse und einen
tieferen Einblicke hinsichtlich der Rolle der Kohlenhydrate hat sich dieser eher einseitige
Blickwinkel gewandelt. Die Rigidität der Pyran- oder Furanringe im Zusammenwirken mit
der Flexibilität der glykosidischen Bindung führt für sich alleine gesehen schon zu einer
Voraborganisation. Durch das Zusammenspiel mit desoxygenierten und/oder
funktionalisierten Zuckerresten können ungewöhnliche, hydrophobe und hydrophile
Domänen entstehen. Weiterhin existieren viele Beispiele für Naturstoffe, die nach
biologischer oder chemischer Deglykosylierung keine oder nur geringe biologische Aktivität
besitzen (Thorson et al. 2001).
Die vielfältigen molekularen und zellulären Erkennungsprozesse in Eukaryonten, an denen
Zuckermoleküle beteiligt sind, basieren erstaunlicherweise auf acht Grundmolekülen: D-
Glucose (Glc), N-Acetyl-D-Glucosamin (GlcNAc), D-Galactose (Gal), N-Acetyl-D-
Galactosamin (GalNAc), D-Mannose (Man), L-Fucose (Fuc), D-Glucuronsäure (GlcUA) und
N-Acetylneuraminsäure (NeuAc) (Kornfield und Kornfield 1985; Fukuda und Hindsgaul
1994; Palcic und Hindsgaul 1996; Boons 1996; Simon 1996; Rudd und Dwek 1997; Van den
Steen et al. 1998; Palcic 1999; Elhalabi und Rice 1999). Im Gegensatz dazu sind „bakterielle
Glykokonjugate“, z. B. die Lipopolysaccharide (LPS), aus sehr unterschiedlichen
Zuckermonomeren aufgebaut (Liu und Thorson 1994; Kirschning et al. 1997, Johnson und
Liu 1998; Hallis und Liu 1999; Johnson und Liu 1999; Trefzer et al. 1999; Bechthold und
Rohr 1999). Die Lipopolysaccharide bestehen aus dem toxischen Lip(o)id A und
Polysacchariden, die an die Membranoberfläche Gram-negativer Bakterien gebunden sind.
Sie wirken als Endotoxin, wobei der Polysaccharidanteil dem O-Antigen entspricht.
Gegenwärtig werden die LPS experimentell zur Lymphozytenstimulation bzw. als Adjuvans
angewendet (Reiche 2003).
-2-
A EINLEITUNG
2 Sekundärmetabolite der Actinomyceten
Zu den interessantesten biologisch aktiven Naturstoffen zählen die Polyketide, da sie eine
sehr große Diversität an chemischen Strukturen und biologischen Aktivitäten besitzen
(Hopwood 1997). Die meisten dieser Verbindungen sind Endprodukte von komplexen
Vielschrittreaktionen des biosynthetischen Stoffwechsels. Etwa 75% aller bekannten
bioaktiven Substanzen werden von den Mitgliedern der Familie der Actinomyceten und dort
hauptsächlich von Mitgliedern der Gattung Streptomyces produziert (Demain 1999). Zu den
kommerziell wichtigen Polyketiden gehören Antibiotika (z. B. Erythromycin, Rifamycin,
Tetrazykline, und Oleandomycin), Antitumormedikamente (z. B. Doxorubicin,
Aclacinomycin, Elloramycin), Immunsuppressiva (z.B. Rapamycin), Insektizide (z.B.
Spinosyn) und Antiparasitika (z.B. Avermectine) (Méndez und Salas 2001).
2.1 Antibiotika Geburtsstunde der Antibiotika war die Beobachtung von Alexander Flemming, dass in der
Nähe einer Pilzkolonie Staphylokokken in ihrem Wachstum gehemmt wurden. Nach
anfänglichen Schwierigkeiten wurde die industrielle Produktion des ersten Antibiotikums
namens „Penicillin“ 1944 aufgenommen. Ein weiteres klinisch bedeutendes Antibiotikum,
Erythromycin A, wurde im Jahr 1952 nach Isolierung aus dem Stamm Saccharopolyspora
erythraea entdeckt (McGuire et al. 1952). In biologischen Studien erwies es sich als
hochaktiv gegen Gram-positive Bakterien, bei vergleichbar geringer Toxizität für
Eukaryonten (Clark 1953; Flynn et al. 1954). Erste Abbauversuche führten zur Isolierung von
D-Desosamin und L-Cladinose als Desoxyzuckerkomponenten. Die Struktur wurde 1957
bestimmt (Wiley et al. 1957) und die absolute Stereochemie nach Röntgenstrukturanalyse
1965 aufgeklärt (Harris et al. 1965; Staunton und Wilkinson 1997).
2.1.1 Biosynthese der komplexen Makrolid-Antibiotika Zu den am besten untersuchten Biosynthesen der Makrolid-Antibiotika zählt die Biosynthese
der Erythromycine. Makrolid-Antibiotika zeichnen sich durch einen großen, zumeist 12- bis
16-gliedrigen, mit Desoxyzuckern substituierten Lactonring aus (Vanek und Majer 1967).
Durch eine Reihe von umfangreichen Arbeiten wurde das gesamte Gencluster für die
Biosynthese des Erythromycin A in der Vergangenheit aufgeklärt und charakterisiert. Alle
Biosynthesegene liegen auf einem 50 kBp großen Abschnitt des Chromosoms von
Saccharopolyspora erythraea, dessen gesamte Nukleotidsequenz bekannt ist (Donadio et al.
-3-
A EINLEITUNG
1993; Katz und Donadio 1995; Gaisser et al 1998; Gaisser et al. 2000). Es zeigte sich, dass
die Organisation des Erythromycin A Genclusters typisch für ein bakterielles Gencluster der
Actinomyceten ist. Die großen Gene für die Polyketidsynthasen eryAI, eryAII und eryAIII
werden von zwei Regionen flankiert, die die Gene für die weitere Prozessierung des von den
Polyketidsynthasen gebildeten 6-Desoxyerythronolid B enthalten (Weber et al. 1985; Dhillon
et al. 1989; Weber et al. 1990) (Abbildung 1). Mittlerweile ist das komplette Genom von
Saccharopolyspora erythraea durchsequenziert (Aventis Bulk, Italien).
Abb. 1: Ausschnitt aus dem Biosynthesegencluster von Erythromycin A (Salah-Bey et al.
1998, modifiziert). A: Organisation der linken Seite des Biosynthesegenclusters, B:
Organisation der rechten Seite des Biosynthesegenclusters.
2.1.2 Biosynthese von Erythromycin A Die Biosynthese von Erythromycin A beginnt mit der Synthese des Makrolacton-
Grundgerüsts, das im weiteren Verlauf durch Glykosylierung und Hydroxylierung modifiziert
wird. Für den Aufbau des Makrolactonrings sind die sog. modularen Polyketidsynthasen von
Typ I (PKS) verantwortlich, die 1990 identifiziert wurden (Cortés et al. 1990). Im Fall der
Biosynthese von Erythromycin erfolgt die Produktion durch die drei Enzyme DEBS 1, DEBS
2 und DEBS 3, welche einen Synthesekomplex mit einem Molekulargewicht von ca. 2 MDa
bilden. Jedes der Proteine enthält zahlreiche katalytische Domänen um die Polyketidkette zu
verlängern und zu verändern, wobei jedes Modul für eine spezifische chemische Modifikation
der Polyketidkette verantwortlich ist. Bei vielen Polyketiden finden nach der Bildung der
Acetylketten umfangreiche Modifikationen statt. Im Fall von Erythromycin A oder
Oleandomycin findet z. B. eine Lactonisierung der Polyketide statt, die derartigen Polyketiden
den Namen Makrolid-Antibiotika gegeben hat (Katz 1997). Der Ablauf der Biosynthese des
Makrolactons ist in Abbildung 2 dargestellt.
-4-
A EINLEITUNG
1 Propionyl-CoAS-CoA
OH
S-CoAO
O+ 6 Metylmalonyl-CoAStarter-
versorgung
Aglykon-Biosynthese
AT ACP KS AT KR ACP KS AT KR ACP KS AT ACP KS AT KR DH ER ACP KS AT KR ACP KS AT KR ACP TE
LDmod 1
mod 2mod 3
mod 4 mod 5mod 6 TE
DEBS 1 DEBS 2 DEBS 3
SSSSSSSO O O O O O O
HO HO
HO
HO
HO
O
HO
HO
O
HO
O
HO
HO
HO
HO
O
HO
HO
O
O OH
OH
O
OH
O
6-Desoxyerythronolid B
Lactonisierung
Intermediate derKettenverlängerung
1
2
3
4
5
6
Abb. 2: Biosynthese des Makrolacton-Grundgerüsts von Erythromycin A (Rodríguez und
McDaniel 2001, modifiziert). LD: Loading module, AT: Acyltransferase, ACP: Acyl carrier
protein, KS: Ketosynthase, KR: Ketoreductase, DH: Dehydratase, TE: Thioesterase, mod 1-6:
Module 1 - 6, DEBS 1-3: 6-Desoxyerythronolid B Synthase.
Die für die Biosynthese erforderlichen Acetyl- und Malonyl-CoA-Einheiten stammen aus
dem Intermediärstoffwechsel der Zellen. Zusätzlich sind jedoch bei einigen Makrolid-
Produzenten spezielle Enzyme vorhanden, die zur Vorstufenaktivierung dienen und die in
intensiven Produktionsphasen des Antibiotikums stimuliert werden (Gräfe 1992). Die
Tatsache, dass die Polyketidsynthasen vom Typ I einen modularen Aufbau haben, ermöglicht
einen gezielten Austausch einzelner Domänen. Dies wird in der kombinatorischen
Biosynthese ausgenutzt um modifizierte Polyketide zu produzieren (Rodríguez und McDaniel
2001; Hutchinson und McDaniel 2001; Tang und McDaniel 2001) (Kap. A 3.1). Nach der
erfolgreichen Lactonisierung zum 6-Desoxyerythronolid B (6-dEB) erfolgt die weitere
Modifikation des Macrolactonrings (Abbildung 3).
-5-
A EINLEITUNG
O
O
O
OH
OH
OH
6-Desoxyerythronolid B(6-dEB)
O
O
O
OH
OH
OH
OH
Erythronolid B(EB)
O
O
O
OH
O
OH
OH
Mycarosyl-Erythronolid B(MEB)
O
OHCH3
OHCH3
EryF EryBV
EryCIII
O
O
O
OH
O
O
OH
O
OHCH3
OHCH3
Erythromycin D(EryD)
O
O
O
OH
O
O
OH
O
OHCH3
OHCH3
O CH3
N(CH3)2
HO
Erythromycin C
O
O
O
OH
O
O
OH
O
OCH3
CH3
OHCH3
Erythromycin B
O
O
O
OH
O
O
OH
O
OCH3
CH3
OHCH3Erythromycin A(EryA)
EryK
EryG
EryG
EryK
HO
HO
1 1
1
1
1
1
1
O CH3
N(CH3)2
HO
O CH3
N(CH3)2
HO
O CH3
N(CH3)2
HO
Abb. 3: Biosynthese von Erythromycin A (Carreras et al. 2002, modifiziert). EryF: 6-dEB-
Hydroxylase, EryBV: Mycarosyltransferase, EryCIII: Desosaminyltransferase, EryG: O-
Methyltransferase, EryK: Erythromycin B/D C-12-Hydroxylase.
Im ersten Schritt der sich anschließenden Prozessierung wird das 6-Desoxyerythronolid B
durch Hydroxylierung zu Erythronolid B (EB). Dies geschieht durch EryF (Weber et al.
1991). Danach wird eine L-Mycarose-Einheit mit Hilfe der Mycarosyltransferase EryBV O-
glykosidisch an das C-3 Atom (Gaisser et al. 1997; Summers et al. 1997; Salah-Bey et al.
1998) und mit der Desosaminyltransferase EryCIII eine D-Desosamin-Einheit, ebenfalls O-
glykosidisch, an das C-5 Atom des Makrolactonrings geheftet (Summers et al. 1997; Salah-
Bey et al. 1998). Durch diesen Schritt entsteht Erythromycin D, dass erste Makrolid in der
Biosynthese mit einer antibiotischen Aktivität. Erythromycin D wird nachfolgend durch
Hydroxylierung an C-12 (EryK) (Stassi et al. 1993) und O-Methylierung der Mycarose-
-6-
A EINLEITUNG
Einheit (EryG) (Paulus et al. 1990; Haydock et al. 1991) in Erythromycin A überführt. Die
Reihenfolge, erst Hydroxylierung und dann O-Methylierung, ist offensichtlich die bevorzugte
Reihenfolge (Lambalot et al. 1995). Die Biosynthese von dTDP-L-Mycarose und dTDP-D-
Desosamin wurden bereits ausgiebig studiert (Abbildung 18) (Gaisser et al. 1997; Gaisser et
al. 1998; Summers et al. 1997; Salah-Bey et al. 1998). Das Vorhandensein der spezifischen
Desoxyzucker ist entscheidend für die antibiotische Aktivität von Erythromycin A und
anderer Makrolid-Antibiotika (z. B. Narbomycin, Pikromycin, Oleandomycin, Tylosin und
Megalomicin A) (Abbildung 4) (Liu und Thorson 1994).
O
O
O
OH
O
O
O
O
OHCH3
OHCH3
O CH3
N(CH3)2HO
Megalomicin A
HO
O CH3
N(CH3)2OH
O
O
O
O
O O CH3
N(CH3)2
HO
Narbomycin
O
O
O
OH
O
O
OOCH3
OHCH3
O CH3
N(CH3)2
HO
Oleandomycin
O
O
O
O
O
O O CH3
N(CH3)2HO
Pikromycin
HO
O
O O CH3
N(CH3)2
HO
Methymycin
HO
O
O
O
OO CH3
N(CH3)2HO
Tylosin
CHO
O OH
O
O
OCH3
HOH3C
OCH3
OO
OCH3
OHCH3
OH
Abb. 4: Strukturen verschiedener Makrolid-Antibiotika (Xue et al. 2000; Butler et al. 2002;
Volchegursky et al. 2000; Vilches et al. 1992).
Megalomicin wird von Micromonospora megalomicea produziert und besitzt neben seinem
antibiotischen und antiviralen Potenzial eine antiparasitische Wirkung (Volchekursky et al.
2000). Oleandomycin, produziert von Streptomyces antibioticus, und Tylosin, produziert von
Streptomyces fradiae, besitzen ebenfalls antibiotische Wirkung und werden in der
-7-
A EINLEITUNG
Veterinärmedizin eingesetzt (Vilches et al. 1992; Butler et al. 2002). Des Weiteren wurde
Tylosin in der Tiermast zur Wachstumsförderung eingesetzt, jedoch ist sein Einsatz in der EU
seit 1999 untersagt. Ab 2006 dürfen in der EU in der Tiermast generell keine Antibiotika
mehr zur Wachstumsförderung eingesetzt werden.
2.1.3 Wirkmechanismus der Makrolid-Antibiotika Erythromycine werden als Alternative oder auch in Kombination mit anderen Antibiotika
(z.B. β-Lactamen, Cephalosporinen, Amoxicillin und Clavulanat) bei weit verbreiteten
Infektionen des Hals-Nasen-Ohren Bereichs und bei Pneumonien oder Bronchitis eingesetzt.
Typische Erreger dieser weit verbreiteten Infektionskrankheiten sind Streptococcus
pneumoniae, Haemophilus influenzae, Moraxella catarrhalis und Streptococcus pyogenes.
Diese Infektionen werden auch unter dem Begriff „CA-RTI“ (Community-acquired
respiratory tract infection) zusammengefasst (Nilius und Ma 2002). Weiterhin stellen
Makrolid-Antibiotika ein wichtiges Therapeutikum für untypische Infektionen mit Chlamydia
pneumoniae, Mycoplasma pneumoniae oder auch Legionella, dem Erreger der
Legionärskrankheit, dar. Erythromycine sind außerdem ein wichtiges Ersatztherapeutikum für
Patienten mit Allergien gegen β-Lactame (Nilius und Ma 2002). Makrolid-Antibiotika
inhibieren die bakterielle Protein-Biosynthese, indem sie an die ribosomale 50S-Untereinheit
in der Domäne V der 23S rRNA binden und dadurch eine vorzeitige Ablösung des unfertigen
Proteins bei der Translation auslösen (Nilius und Ma 2002). Basierend auf
Röntgenstrukturanalysen mit verschiedenen Makroliden wird gegenwärtig folgende
Wechselwirkung postuliert: Das 2’-OH des Desosaminrests bildet vier
Wasserstoffbrückenbindungen mit den Nukleotiden A2040, A2058 und A2059 der 23S rRNA
aus, wohingegen das C-11-OH und das C-12-OH des Lactonrings je eine
Wasserstoffbrückenbindung mit dem Nukleotid U2609 der 23S rRNA ausbilden. Eine weitere
Interaktion erfolgt über die Aminofunktion des Desosaminrests mit dem Nukleotid G2505
(Walsh et al. 2003) (Abbildung 5).
-8-
A EINLEITUNG
O
O
O
OH
O
O
OH
O
OCH3
CH3
OHCH3
O CH3
N+
HO
HO
HN
NO
O
U2609
NN
NN
H2N
A2058
NN
NN
H2N
A2040
NN
NN
H2N
A2059
OG
OHHO
OPO-O
O
G2505
CH3H3C
Abb. 5: Interaktion zwischen einem Antibiotikum aus der Familie der 14er Makrolide und der
ribosomalen 23S rRNA (Walsh et al. 2003).
Durch Bindung an die ribosomale 50S-Untereinheit wird der Abgangstunnel für die Peptide
effizient blockiert, ohne dass eine Beeinflussung der Peptidyltransferase-Aktivität stattfindet
(Schlünzen et al. 2001).
Bis heute wurde eine Reihe von Resistenzen gegen Erythromycin gefunden und untersucht.
Wichtige Resistenzen umfassen die Erm-Methylase (Leclercy und Couvalin 1991; Weisblum
1998; Roberts et al. 1999), Ribosomen-Mutation (Tait-Kamradt et al. 2000; Pihlajamäki et al.
2002; Shortridge et al. 2002) und Efflux-Pumpen (Weisblum 1998; Roberts et al. 1999; de
Azavedo et al. 1999; Lina et al. 1999). Im Fall der ribosomalen Erm-Methylase führt eine
Dimethylierung am Nukleotid A2058 der 23S rRNA dazu, dass u. a. Makrolide nicht mehr
interagieren können. Ähnliches gilt für die seltenen Ribosomen-Mutationen, bei denen
Mutationen in den Allelen der Gene rrl und rplD auftreten, die das Ribosom verändern. Bei
den Efflux-Pumpen (z.B. Mef in Streptokokken, oder Msr in Enterokokken) handelt es sich
um spezifische Pumpen, die dafür verantwortlich sind, dass die in die Zellen eingedrungenen
Makrolide wieder exportiert werden.
Semisynthetische Antibiotika
Bedingt durch eine Verbreitung der unterschiedlichen Resistenzmechanismen und der damit
verbundenen erheblichen Einschränkung im Hinblick auf die Erfolgsaussichten einer
-9-
A EINLEITUNG
Antibiotikatherapie, hat man nach neuen, verbesserten Derivaten von Makroliden,
insbesondere von Erythromycin, gesucht. Als Beispiele für semisynthetische Derivate mit
verbessertem klinischem Potenzial sind u. a. Roxithromycin (Methoxyethoxymethyloxim-
Erythromycin), Clarithromycin (O-Methyl-Erythromycin), Flurithromycin (8-Fluoro-
Erythromycin) und Azithromycin (Desoxy-aza-methyl-homo-Erythromycin) (Abbildung 6)
zu nennen.
O
O
OH
O
O
OH
O
OHCH3
OHCH3
O CH3
N(CH3)2
HO
Azithromycin
HO
NH3C
O
O
O
OH
O
O
OCH3
O
OHCH3
OHCH3
O CH3
N(CH3)2
HO
Clarithromycin
HO
O
O
N-O-CH2-O-CH2-CH2-OCH3
OH
O
O
OH
O
OHCH3
OHCH3
O CH3
N(CH3)2
HO
Roxithromycin
HO
O
O
OF
OH
O
O
OH
O
OHCH3
OHCH3
O CH3
N(CH3)2
HO
Flurithromycin
HO
Abb. 6: Semisynthetische Erythromycin-Derivate mit verbessertem klinischem Potenzial.
Eine neue Klasse semisynthetischer Erythromycinderivate sind die Ketolide (Nilius und Ma
2002). Ketolide stammen von den 14er Makroliden ab und sind durch eine Carbonylfunktion
an der C-3 Position des Makrolactonrings gekennzeichnet. Typischerweise werden sie
ausgehend von Erythromycin A (EryA) hergestellt. Dabei wird im ersten Schritt die L-
Cladinose an der C-3 Position durch Hydrolyse entfernt und die entstandene Hydroxylgruppe
zur Carbonylfunktion oxidiert. Im Anschluss daran können weitere Modifikationen am
Makrolactonring durchgeführt werden (Abbildung 7).
-10-
A EINLEITUNG
D-Desosamin
L-Cladinose
O
O
O
O OMe
O
NH
F
OO
O
O
O OMe
O
NHO
O
O
O
R
O OMe
O
NHO
O
O
O
O OMe
O
NO
XAr
F
O
O
O
O OMe
O
NO
XAr
O
O
O
R13
O OMe
O
NO
XAr
O
O
N
O OMe
O
NO
F
O
O
N
O OMe
O
NO
O
O
O
R13
O O
O
NHO
Ar
O
O
O
O ONH
O
Ar
F
O
O
O
O O
O
NHO
Ar
Erythromycin A
2-F Ketolid-Skelett Ketolid-Skelett C-13-modifiziertes Ketolid-Skelett
2-F-11-N-substituierte Ketolide 11-N-substituierte Ketolide C-13-modifizierte 11-N-substituierte Ketolide
2-F-trizyklische Ketolide Trizyklische Ketolide C-13-modifizierte 6-O-substituierte Ketolide
2-F-6-O-substituierte Ketolide 6-O-substituierte Ketolide
O
O
O
OH
O
O1
OH
O
OCH3
OHCH3
HO
O O CH3
N(CH3)2HO
O O CH3
N(CH3)2HO
O O CH3
N(CH3)2HO
O O CH3
N(CH3)2HO
O O CH3
N(CH3)2HO
O O CH3
N(CH3)2HO
O O CH3
N(CH3)2HO
O O CH3
N(CH3)2HO
O O CH3
N(CH3)2
HO
O O CH3
N(CH3)2HO
O O CH3
N(CH3)2HO
O CH3
N(CH3)2HO
Abb. 7: Unterklassen der Ketolide und der Ketolid-Familienstammbaum (Nilius und Ma
2002).
-11-
A EINLEITUNG
Das Ketolid-Motiv ist seit gut 50 Jahren bekannt, jedoch wurde sein Wert für die Herstellung
neuer Antibiotika erst kürzlich entdeckt (Nilius und Ma 2002). 1977 wurde berichtet, dass
Pikromycin und das eng verwandte Narbomycin keine Erythromycin Resistenz in
Streptococcus aureus induzierten, wohingegen diese Induktion bei Makroliden beobachtet
wurde, die in der C-3 Position des Rings eine L-Cladinose trugen (Allen 1977; Pestka et al.
1976). Pikromycin und Narbomycin sind jedoch vergleichsweise schwache Antibiotika, so
dass zum damaligen Zeitpunkt keine weiteren Untersuchungen durchgeführt wurden. 1995
kam das erste semisythetische Ketolid mit dem Namen RU-004 (Abbildung 8) (Aventis
Pharma, Bridgewater, NJ, USA) auf den Markt. Die Herstellung erfolgte ausgehend von
Clarithromycin (Agouridas 1995).
O
O
O
O OCH3
O
N
O
O O CH3
N(CH3)2
HO
HN
Abb. 8: Struktur von RU-004 (Bertho et al. 1998).
In der darauf folgenden Zeit wurden weitere semisynthetische Ketolide produziert und
untersucht, wobei sich herausstellte, dass die unterschiedlichen Derivate in der Lage sind die
verschiedensten Resistenzmechanismen zu unterwandern (Shortridge et al. 2002; Capobianco
et al. 2000; Bonnefoy et al. 1997). Die neue Klasse der Ketolide erwies sich auch als sehr gut
wirksam gegen multiresistente Erreger wie z. B. Streptococcus pneumoniae oder
Streptococcus pyogenes (Nilius und Ma 2002). Die unterschiedlichen Modifikationen und die
Effekte dieser Modifikationen hinsichtlich der Resistenzmechanismen sind in Abbildung 9
dargestellt.
-12-
A EINLEITUNG
O
O
O
R13
OO
O
NH
O
F
NC-11, 12 Carbamat-Gruppe:Verstärkung der Aktivität
sowohl gegen empfindlicheals auch resistente
Organismen.
C-13 Modifikationen:Ausgewählte Gruppen
ermöglichen ein vergleichbares
Wirkungsspektrum und eine vergleichbare
Aktivität.C-2 Fluor-Gruppe:
Verstärkung der Aktivitätgegen empfindliche undresistenteOrganismen;
Verbesserung der Pharmakokinetik.
C-3 Carbonyl-Gruppe:Überwindung der Induktion von Erm;
verantwortlich für eine verbesserteAktivität gegen Efflux-Resistenzen.
6-O oder 11-N -Aryl Gruppe:Vermitteln einen Ankereffekt;
verantwortlich für die verstärkteAktivität gegen Resistenzen, die auf eineMethylierung der Ribosomen beruhen.
O O CH3
N(CH3)2HO
Abb. 9: Struktur-Aktivitätsbeziehungen der Ketolide (Nilius und Ma 2002).
Gegenwärtig befinden sich zwei neue Ketolide mit den Namen Cethromycin (ABT-773;
Abbott Laboratories; Abbott Park, IL, USA) in der präklinischen bzw. Telithromycin (HMR-
3647; RU-66647; Ketek, Aventis Pharma, Bridgewater; NJ, USA) in der klinischen Phase.
Die Strukturen der beiden Ketolide sind in Abbildung 10 dargestellt.
O
O
O
O O
O
NHO
N
O
O
O
O OMe
O
NO
N
N N
Cethromycin Telithromycin
O O CH3
N(CH3)2HO
O O CH3
N(CH3)2HO
Abb. 10: Strukturen von Cethromycin und Telithromycin (Nilius und Ma 2002).
Spinosyne
Bei den Spinosynen handelt es sich um eine relativ junge Klasse vom Makroliden, die von
Saccharopolyspora spinosa produziert werden, und um 1990 entdeckt wurden (Mertz und
Yao, 1990). Spinosyne bestehen aus einem tetrazyklischen Makrolid, das die Desoxyzucker
-13-
A EINLEITUNG
D-Forosamin (4-Amino-2,3,4,6-desoxy-D-glucose) und Tri-O-methyl-L-rhamnose enthält,
wobei das Polyketid sowie die Desoxyzucker unterschiedlich stark methyliert sein können
(Kirst et al. 1991; DeAmicis et al. 1997) (Abbildung 11). Die beiden Hauptbestandteile einer
Saccharopolyspora spinosa Fermentation sind Spinosyn A und Spinosyn D, die sich
ausschließlich durch Methylgruppe an C-6 des Polyketids unterscheiden (Waldron et al.
2001).
O
O
O
O
O
ON
H3C
H3CH3C O
CH3
OCH3
OCH3H3CO
Abb. 11: Spinosyn A (Waldron et al. 2001).
Unter dem Namen „Tracer“ wird die Mischung aus Spinosyn A und Spinosyn D von Dow
AgroSciences im Bereich der Insektizide vermarktet (Waldron et al. 2001; Gaisser et al.
2002). „Tracer“ ist sehr wirksam gegen eine ganze Reihe von Schadinsekten und besitzt unter
Umweltaspekten ein hervorragendes Toxizitätsprofil (Sparks et al. 1998; Crous und Sparks
1998).
2.1.4 Aromatische Polyketid- und Glykopeptid-Antibiotika Die Anthracycline bilden eine große Gruppe innerhalb der aromatischen Polyketid-
Antibiotika und wurden bereits vor mehr als 60 Jahren entdeckt. Dennoch haben sie und ihre
vielfältigen Strukturvarianten erst nach der Entdeckung der tumorstatischen Wirkung des
Daunorubicins (1963) großes Interesse als Chemotherapeutika gefunden (Hutchinson 1995).
Mithramycin (Abbildung 12) ist ein Vertreter der Aureolsäuregruppe, deren Chromophore
über den Polyketid-Biosyntheseweg gebildet werden (Gräfe 1992). An das Polyketid-Skelett
sind ein Disaccharidrest, bestehend aus D-Olivose-D-Olivose, und ein Trisaccharidrest,
bestehend aus D-Olivose-D-Oliose-D-Mycarose, angeknüpft. Mithramycin wird von
Streptomyces argillaceus gebildet und zeigt in der klinischen Verwendung bemerkenswerte
Zytotoxizität gegen eine Vielzahl von Tumorzelllinien (Trefzer et al. 1999; Wohlert et al.
1999).
-14-
A EINLEITUNG
O
CH3
OCH3 OH
O OH
OHOH
H3C
O
O
OH3C
OHOO
H3COH
OO
H3C
HOH3C
OH
OO
OH3CH3C
HOHOHO
Abb. 12: Struktur von Mithramycin (Wohlert et al. 1998; Prado et al. 1999).
Mithramycin bindet nicht-kovalent an die GC-reichen Regionen der DNA ohne dabei zu
interkalieren. In Gegenwart von Mg2+-Ionen, die für die Funktion der DNA-Polymerase I
essentiell sind, inhibiert Mithramycin die Reaktion. Dies konnte in vitro gezeigt werden
(Gräfe 1992; Weymouth-Wilson 1997; Fernandez et al. 1998).
Zur Gruppe der p-chinoiden Polyketide gehören Vertreter vom Angucyclin Typ, wie z. B. die
Landomycine und die Urdamycine (Abbildung 13).
O
OH
O CH3
OHO
O
OH
OCH3
OH
OH3C
HOO
OH3C
OO
H3CHO
HO Abb. 13: Struktur von Urdamycin A (Trefzer et al. 2000).
Urdamycine werden von Streptomyces fradiae Tü2717 produziert und besitzen eine O-
glykosidisch gebundene L-Rhodinose, sowie eine Trisaccharid-Seitenkette, welche mit dem
Aglykon C-glykosidisch verknüpft ist (Sezaki et al. 1970, Drautz et al. 1986). Im Gegensatz
zu den Landomycinen zeigen sich bei den Mitgliedern dieser Gruppe große Variationen in der
Struktur des Polyketidrests. Die Länge der Saccharid-Seitenkette ist hingegen stark
konserviert (Bechthold und Rohr 1999).
-15-
A EINLEITUNG
Das vergleichsweise schmale Wirkspektrum der Glykopeptid-Antibiotika betrifft
verschiedene Gram-positiven Bakterien. Sie werden gegen multiresistente Staphylokokken-
und Enterokokkenstämme eingesetzt. Die Glykopeptide verhindern den Transfer der
bakteriellen Zellwandbausteine auf Peptidoglykanketten des Mureinsacculus, indem sie an
den D-Ala-D-Ala Terminus von Vorstufen aus der Peptidoglykan Synthese binden und so
bakterizid wirken (Lancini und Cavalleri 1997; Auterhoff et al. 1999). Vancomycin
(Abbildung 14) ist ein Vertreter der Glykopeptide (Zmijewski und Fayerman 1995) und
wurde 1955 von Mitarbeitern der Firma Lilly entdeckt (Gräfe 1992). Dieses Antibiotikum
wird von Amycolatopsis orientalis produziert und ist ein trizyklisches Heptapeptid. Der
Kohlenhydratanteil besteht aus einem Glucoserest und dem Aminozucker L-Vancosamin
(Auterhoff et al. 1999).
O O
O ClCl
OH
NH
NH2
OHN
O
NH
O NH2OO
HNO
NH
HO
HNO
O
HO OHOH
O
O
HO
HOOH
O OOH
NH2
Abb. 14: Struktur von Vancomycin (Auterhoff et al. 1999).
-16-
A EINLEITUNG
2.1.5 Biosynthese der nukleotid-aktivierten Desoxyzucker Wie zuvor dargestellt spielen sowohl die Funktionalisierung als auch die Desoxygenierung
der Zucker eine entscheidende Rolle hinsichtlich der Eigenschaften von Zuckermolekülen in
Glykokonjugaten (Kap. A 2.1 – 2.1.4) (Hanessian 1966; Williams und Wander 1980,
Thorson et al. 2001). Die Gene der Biosyntheseenzyme für die Bildung der
Sekundärmetabolite sind in typischen Clustern organisiert (Salah-Bey et al. 1998; Trefzer et
al. 1999) (Abbildung 1), wobei die Biosynthese der nukleotid-aktivierten Zucker getrennt
von der Synthese des jeweiligen Aglykons erfolgt. Die bei bioaktiven Verbindungen am
weitesten verbreiteten und vielfältigsten Zucker sind die Desoxyhexosen (DOH). Über 70
unterschiedliche DOH sind Bestandteil von bioaktiven Verbindungen (Kirschning et al. 1997;
Stockmann und Piepersberg 1992; Trefzer et al. 1999).
OHO
HO
OdTDPOH
O
HO
OdTDPOH
OHO
HO
OPO3-2
OH
OHO
(CH3)2N
OdTDPOH
O
(CH3)2N
OdTDPOH
dTDP-Glucose-Pyrophosphorylase
+ dTTP- PPi
- H2O(NAD+)
dTDP-Glucose-4,6-Dehydratase
O
O
HO
OdTDP
OO OdTDPHO
HOOH
H3C
O OdTDPHO
HO
H3C O
HO
OdTDP
HO HO
H3CH3C
H3C
H3C
H3CHOO OdTDPHO
H3C
H3C
OH
D-Glucose-1-phosphat
dTDP-D-Desosamin
dTDP-L-Pneumose
dTDP-D-Mycaminose
dTDP-D-Olivose
dTDP-D-Glucose
dTDP-L-Mycarose
dTDP-6-Desoxy-4-keto-D-glucose
dTDP-2,6-Didesoxy-4-keto-D-glucose
dTDP-L-Olivose
dTDP-L-Rhamnose
O OdTDP
OHHO
H3C
OH
Biosynthese der primärenNukleotidzucker
Abb. 15: Biosyntheseschema der primären und sekundären Desoxyhexosen. Die Pfeile
entsprechen der Anzahl der Reaktionsschritte die erforderlich sind, um die Zielprodukte zu
erhalten.
Am Anfang der Biosynthese der meisten bakteriellen Desoxyhexosen steht die Bildung des
primären Nukleotidzuckers, typischerweise dTDP-D-Glucose. Die Bildung erfolgt durch die
-17-
A EINLEITUNG
enzymatische Aktivierung von D-Glucose-1-phosphat mittels dTTP unter Abspaltung von
anorganischem Pyrophosphat (PPi) (Abbildung 15). Die Reaktion wird durch eine
Pyrophosphorylase katalysiert [EC. 2.7.7]. Das für die Reaktion erforderliche Hexose-1-
phosphat stammt aus dem Primärstoffwechsel des Organismus (Liu und Thorson 1994;
Piepersberg 1994). In vitro liegt das Gleichgewicht der Pyrophosphorylase-Reaktion auf der
Seite der Zucker-1-phosphate. Mit Hilfe einer Pyrophosphatase [EC 3.6.1.1], die die Spaltung
des entstehenden Pyrophosphats katalysiert, kann die Reaktion jedoch auf die Seite des
primären Nukleotidzuckers gezogen werden. Der Basetyp (Uracil, Adenin, Thymidin,
Cytosin) ist charakteristisch für den Organismus, in dem die Synthese der Nukleotidzucker
abläuft. UDP-aktivierte Zucker werden in Pflanzen, Säugetieren sowie Hefezellen, dTDP-
aktivierte Zucker in Bakterien und GDP-aktivierte Zucker in der Synthese von
Säugerglykokonjugaten verwendet (Gabriel 1982; Liu und Thorson 1994; Piepersberg und
Distler 1997). Die aus Salmonella enterica stammenden Pyrophosphorylasen dTDP-α-D-
Glucose-Pyrophosphorylase (RmlA) (Lindquist et al. 1993) und die GDP-α-D-Mannose-
Synthase (RfbM) (Elling et al. 1996) zählen zu den am besten charakterisierten
Pyrophosphorylasen. Für die Pyrophosphorylasen aus Pflanzen, Tieren, Bakterien und Hefen
wird ein „ordered Bi-Bi“-Mechanismus vorgeschlagen (Turnquist und Hansen 1973;
Kleczkowski et al. 1993; Elling et al. 1996; Zuccotti et al. 2001; Blankenfeldt et al. 2000).
Nach der Bildung der dTDP-D-Glucose erfolgt die Umwandlung zum zentralen Intermediat
der Biosynthese der sekundären Desoxyhexosen, der dTDP-6-Desoxy-4-keto-D-glucose. Die
Umsetzung erfolgt unter Wasserabspaltung und wird durch eine dTDP-D-Glucose-4,6-
Dehydratase [EC 4.2.1.46] katalysiert (Abbildung 15). Mit Hilfe einer 5- bzw. 3,5-Epimerase
kann die Umwandlung der dTDP-aktivierten D-Hexosen in einen L-Zucker (z.B. dTDP-L-
Rhamnose oder dTDP-L-Mycarose) erfolgen. Die verschiedenen Desoxyzucker unterscheiden
sich zusätzlich durch ihre Substituenten (z. B. Methyl- oder Aminogruppen) und/oder der
Stereochemie der C-Atome an den Positionen C-2 bis C-5. Über die Desoxygenierung der
Positionen C-2 bis C-5 wird ein dabei ein ganzer Stammbaum von Desoxyhexosen aufgebaut,
der eine Reihe von Mono-, Di- und Tridesoxyhexosen enthält (Abbildung 16) (Méndez und
Salas 2001).
-18-
A EINLEITUNG
O
OH
H3CH2N
HO
OH
D-Perosamin
O
OH
H3C
D-Forosamin
O
OH
H3CHO
HO
D-Oliose
O
OH
H3CHO
OCH3OCH3
D-Mycinose
O
OH
H3CHO
H2N
OH
O
OH
H3C
H3COOH
D-Chalcose
O
OH
H3CHO
(H3C)2NOH
D-Mycaminose
D-Mycosamin
(H3C)2N
D-Desoxyhexosen
O
OH
OCH3
OH
CH3
O
OH
HO
CH3
L-Oleandrose
L-Rhodinose
O
OH
HO
NH2CH3
O
OH
HO
N(CH3)2
CH3
L-Daunosamin L-Rhodosamin
O
OHH3CO
CH3
HO
CH3
L-Cladinose
O
OHH3C
OH
HO
OHCH3
O
OH
HO
OHCH3
L-NogaloseL-Oliose
O
OH
OH
OH
OHCH3
O
OHH3C
NH2
HO
CH3
H3C
L-Noviose
L-Epivancosamin
L-Desoxyhexosen
Abb. 16: Strukturen einiger D- und L-Desoxyhexosen von bioaktiven Verbindungen (Méndez
und Salas 2001).
Tabelle 1 gibt einen Überblick über Desoxyhexosen von bioaktiven Verbindungen, deren
Biosynthese vollständig bzw. teilweise aufgeklärt wurde (Méndez und Salas 2001).
Tab. 1: Desoxyhexosen in bioaktiven Verbindungen (Méndez und Salas 2001).
6-Desoxyhexose Bioaktive Verbindung Produzentenstamma
D-Desosamin Erythromycin Sacc. erythraea
Oleandomycin S. antibioticus
Pikromycin S. venezuelae
Megalomicin M. megalomicea
D-Olivose Mithramycin S. argillaceus
Urdamycin S. fradiae
Landomycin S. cyanogenus
D-Oliose Mithramycin S. argillaceus
D-Mycarose Mithramycin S. argillaceus
D-Mycaminose Tylosin S. fradiae
D-Mycinose Tylosin S. fradiae
D-Mycosamin Nystatin S. noursei
D-Forosamin Spinosyn A Sacc. spinosa
L-Dihydrostreptose Streptomycin S. griseus
L-Oleandrose Oleandomycin S. antibioticus
-19-
A EINLEITUNG
L-Oleandrose Avermectin S. avermitilis
L-Mycarose Erythromycin Sacc. erythraea
Megalomicin M. megalomicea
Tylosin S. fradiae
L-Novobiose Novobiocin S. spheroides
L-Rhodinose Urdamycin S. fradiae
Landomycin S. cyanogenus
Granaticin S. violaceoruber
L-Daunosamin Daunorubicin S. peucetius
L-Nogalose Nogalamycin S. nogalater
L-Megosaminb Megalomicin M. megalomicea
L-Rhodosamin Aclacinomycin S. galilaeus
L-Epivancosamin Chloroeremomycin A. orientalis
2-Desoxy-L-fucose Aclacinomycin S. galilaeus aAbkürzungen: A., Amycolatopsis; M., Micromonospora; Sacc., Saccharopolyspora; S., Streptomyces balternativ: L-Rhodosamin
Für einige aktivierte Zucker wurde zusätzlich eine zwei Reaktionsschritte umfassende de novo
Biosynthese gefunden. Diese kurzen Aktivierungswege, auch „Salvage-Pathways“ genannt,
erlauben der Zelle Monosaccharide, die als Abbaumetaboliten von Glykokonjugaten auftreten
können, direkt zu aktivieren. Diese Art der kurzen Aktivierung wurde erstmals für L-Fucose
in Säugetieren entdeckt (Abbildung 17) (Bekesi und Winzler 1967).
OH3C
HOHO
OHOH OH3C
OHHO
OHOPO3
2-OH3C
OHHO
OHOGDPKinase
ATP ADP
Pyrophos-phorylase
GTP PPi Abb. 17: De novo Biosynthese von GDP-β-L-Fucose („Salvage-Pathway“) (Bülter und Elling
1999).
Bei dieser Reaktion wird die L-Fucose unter Einwirkung einer Fucokinase [EC 2.7.1.52]
zuerst an C-1 phosphoryliert und dann durch eine GDP-Fucose-Pyrophosphorylase [EC
2.7.7.30] zur GDP-L-Fucose aktiviert (Reitman et al. 1980; Park et al. 1998). Ein derartiger
„Salvage-Pathway“ wurde auch für L-Rhodinose gefunden, einem 2,3,6-Tridesoxzucker aus
dem Biosynthesecluster des Landomycins (Rohr et al. 1997). In Bezug auf die Aktivierung
wird für L-Rhodinose ein identischer Mechanismus angenommen wie für L-Fucose.
-20-
A EINLEITUNG
Wie zu Beginn dieses Abschnitts geschildert, sind die Biosynthesewege der verschiedenen
Desoxyzucker recht komplex aufgebaut. Daher konnte auch bis heute noch nicht für alle
bekannten Gene eine genaue Zuordnung hinsichtlich ihrer Funktion getroffen werden.
Abbildung 18 gibt eine Detailübersicht über die Biosynthesewege von dTDP-D-Desosamin
und dTDP-D-Mycaminose. Die Zuordnungen der Biosynthesenzyme sind teilweise
hypothetischer Natur.
O
OH
H3C
OdTDPO
HO
O
OH
H3C
OdTDPO
O
OH
H3C
OdTDP
HOH2N
3,4-Isomerase(OlePI, EryCII,
DesVIII, MidH, TylM3)
4-Desoxy-genierung
3-Aminotransferase(OleN2, EryCI, DesV,
TylB, MidC)
O
OH
H3C
OdTDP
H2N
3-Aminotransferase(OleN2, EryCI, DesV)
O
OH
H3C
OdTDP
HO(H3C)2N
O
OH
H3C
OdTDP
(H3C)2N
dTDP-D-Desosamin
dTDP-D-Mycaminose
N-Methyltransferase(OleM1, EryCVI, DesVI)
N-Methyltransferase(MidK, TylMI)
O
OHHO
O H3C
OdTDP
dTDP-6-Desoxy-4-keto-D-glucose
4-Desoxy-genierung
Abb. 18: Biosyntheseweg von dTDP-D-Desosamin und dTDP-D-Mycaminose. Ery:
Erythromycin-Biosynthese, Ole: Oleandomycin-Biosynthese, Des: Pikromycin-/Methymycin-
Biosynthese, Tyl: Tylosin-Biosynthese, Mid: Midecamycin-Biosynthese.
Wie dem Biosyntheseschema zu entnehmen ist, erfolgt die Bildung der beiden für die
antibiotische Aktivität der Makrolid-Antibiotika essentiellen Aminozucker ausgehend vom
zentralen Intermediat, der dTDP-6-Desoxy-4-keto-D-glucose, in drei bzw. vier Schritten. In
vivo Untersuchungen haben für dTDP-D-Mycaminose gezeigt, dass die N-Methylierung für
den Transfer durch die entsprechende Glycosyltransferase (TylMII) essentiell ist (Butler et al.
2002). Weitere interessante Zucker bei Makrolid-Antibiotika sind dTDP-L-Mycarose, dTDP-
L-Olivose und dTDP-L-Oleandrose. Die Biosynthese dieser Zucker erfolgt jedoch im
Gegensatz zur Biosynthese der beiden Aminozucker ausgehend von dTDP-2,6-Didesoxy-4-
keto-D-glucose. Die Reaktion verläuft ebenfalls über mehrere Schritte, die u. a. eine O-
Methylierung (dTDP-L-Oleandrose) und eine C-Methylierung (dTDP-L-Mycarose)
einschließen.
Für die Biosynthese und für die sich anschließende Übertragung von dTDP-L-Mycarose und
dTDP-D-Desosamin sind bisher insgesamt sieben eryB-Gene und sechs eryC-Gene
identifiziert, sequenziert und teilweise kloniert worden (Vara et al. 1989; Weber et al. 1990;
-21-
A EINLEITUNG
Haydock et al. 1991; Gaisser et al. 1997; Summers et al. 1997; Gaisser et al. 1998; Salah-Bey
et al. 1998). Eingehende Untersuchungen zum Ablauf der Biosynthese von dTDP-D-
Desosamin und dTDP-L-Mycarose wurden von Liu und Mitarbeitern durchgeführt (Chang et
al. 2000; Zhao et al. 1998a; Zhao et al. 1998b; Zhao et al. 1998c).
2.1.6 Chemische und enzymatische Synthese von nukleotid-aktivierten
Desoxyzuckern Vorraussetzung für eine in vitro Untersuchung von bakteriellen Glykosyltransferasen ist der
präparative Zugang (>100 mg) zu geeigneten nukleotid-aktivierten Zuckern oder aber ein
System mit in situ Regeneration der erforderlichen Nukleotidzucker. Die Herstellung der
Nukleotidzucker kann sowohl chemisch als auch enzymatisch erfolgen, wobei jede Methode
ihre spezifischen Vor- und Nachteile hat. Nachteile der chemischen Synthese sind die
schwierige Kontrolle der Regio- und Stereoselektivität und die damit erforderliche
Schutzgruppenchemie. Ein Hauptvorteil der chemischen Synthese ist hingegen, dass eine
ganze Reihe von interessanten Modifikationen eingebracht werden können, die enzymatisch
nicht oder nur schwer zugänglich sind (Azido-Gruppen, Thiol-Gruppen, etc.) (Fu et al. 2003).
Demgegenüber besteht der Hauptvorteil der enzymatischen Synthese darin, dass die Regio-
und Stereoselektivität der Reaktion durch den Einsatz spezifischer Enzyme gewährleistet und
keine Schutzgruppenchemie erforderlich ist. Weiterhin sind die Ausbeuten von
vergleichbaren Synthesen in der Regel bei der enzymatischen Synthese deutlich höher.
Die typische chemische Synthese von nukleotid-aktivierten (Desoxy)Zuckern erfolgt häufig
über die Kopplung eines Glykosylphosphats mit einem Nukleosidmonophosphat (NMP), das
meistens in Form eines Morpholidats aktiviert ist (Moffatt und Khorana 1961). Mit Hilfe
dieser Methode konnten UDP-Glucose, UDP-Galactose, UDP-N-Acetylglucosamin, UDP-
Glucuronsäure, GDP-Mannose (Roseman et al. 1961), GDP-Fucose (Schmidt et al. 1991),
ADP-Glucose, CDP-Glucose, GDP-Glucose, dTDP-Glucose (Elbein 1966), und dTDP-6-
Desoxy-3-keto-D-glucose (Müller und Schmidt 1995; Müller und Schmidt 1997) in relativ
guten Ausbeuten hergestellt werden. UDP-2-Desoxy-D-galactose war der erste chemisch
synthetisierte NDP-2-Desoxyzucker (Srivastava et al. 1993). Im Bereich der komplexen
dTDP-aktivierten Desoxyzucker wurde ebenfalls eine Reihe von chemischen Synthesen
beschrieben, wobei es sich bei der Mehrzahl der Zucker um Monodesoxyzucker handelt. Als
Beispiele sind u. a. zu nennen: dTDP-β-L-Rhamnose (Zhao und Thorson 1998), dTDP-6-
Desoxy-3-keto- und dTDP-6-Desoxy-4-keto-α-D-glucose (Naundorf et al. 2000), dTDP-β-L-
Noviose (Freel Meyers et al. 2003), dTDP-4-Amino-4,6-dideoxy-α-D-glucose (Klaffke und
-22-
A EINLEITUNG
Chambon, 2000), dTDP-3-Amino-4,6-dideoxy-α-D-glucose, dTDP-β-L-Daunosamin (Lu et
al. 2004), dTDP-β-L-Epivancosamin (Freel Meyers et al. 2003) und dTDP-α-D-Desosamin
(Chang et al. 2000; Chen et al. 2002). Die Syntheseausbeuten bewegten sich dabei im
Rahmen von wenigen Milligramm bis ca. 0,5 g (dTDP-β-L-Noviose).
Für die enzymatische Synthese von NDP-aktivierten Zuckern existieren zwei Strategien:
Erstens die Synthese im großen Maßstab mit nachgeschalteter Isolierung und Aufreinigung
des Nukleotidzuckers (Toone et al. 1989) und zweitens die in situ Regenerierung der
aktivierten Zucker unter Vermeidung aufwendiger und zeitraubender Aufreinigungsschritte
(Ichikawa et al. 1992; Ichikawa et al. 1994; Wong et al. 1982; Zervosen und Elling 1996). Die
Synthese der primären Nukleotidzucker kann, wie bereits unter Kap. A 2.1.5 beschrieben, mit
Hilfe von Pyrophosphorylasen erfolgen, unter Zuhilfenahme der Saccharose Synthase 1
(Sucrose Synthase 1, SuSy 1) oder unter der Ausnutzung der sog. „Salvage-Pathways“. In der
aktuellen Literatur sind einige enzymatische bzw. chemo-enzymatische Synthesen von
verschiedenen dTDP-aktivierten Desoxyzuckern beschrieben. Die dabei erzielten
Syntheseausbeuten bewegen sich im Rahmen von wenigen Milligramm bis in den
präparativen Gramm-Maßstab (Stein et al. 1998). Als Beispiele für erfolgreiche chemo-
enzymatische Synthesen sind die Produktion von dTDP-β-L-Rhamnose (Marumo et al. 1992;
Günther 2000), dTDP-6-Desoxy-4-keto-α-D-glucose (Stein et al. 1998), dTDP-β-L-Olivose
(Amann et al. 2001), dTDP-α-D-Mycaminose (Chen et al. 1998; Chen et al. 2002) und dTDP-
α-D-Desosamin (Chen et al. 2002) zu nennen. Die Synthesen erfolgten ausgehend von zum
Teil sehr unterschiedlichen Ausgangssubstraten, so dass eine unterschiedliche Anzahl an
Enzymen für die Herstellung der Endprodukte eingesetzt wurde.
-23-
A EINLEITUNG
Saccharose Synthase
Saccharose Synthase (UDP-α-D-Glucose: D-Fructose-2-Glucosyltransferase) [EC 2.4.1.13] ist
ein pflanzliches Enzym, welches 1955 in Weizenkeimlingen entdeckt wurde (Cardini et al.
1955). In vivo katalysiert das Enzym die Spaltung von Saccharose in UDP-Glucose und D-
Fructose (Abbildung 19) (Copeland 1990).
O
HOHO
OH
HOH2C
O O
HOHO
OH
HOH2C
ONDP
O
HO
HO
HOOH
+ NDP + D-FructoseSuSy
Abb. 19: Reaktion der Saccharose Synthase (SuSy) (Römer et al. 2004).
Die Funktion der Saccharose Synthase besteht darin, aktivierte Glucose für die Stärkesynthese
und für die Bildung von sekundären Nukleotidzuckern (UDP-Glucuronsäure, UDP-L-
Arabinose und UDP-D-Xylose) zur Verfügung zu stellen (Avigad 1982; Feingold 1982).
Bereits mehrfach wurde die Saccharose Synthase aus Reis isoliert (Smyth und Prescott 1989;
Chan et al. 1990; Elling und Kula 1993; Elling et al. 1995b), wie auch in Saccharomyces
cerevisiae exprimiert (sus1 aus Solanum tuberosum) (Schrader 1998). In vitro kann SuSy
sowohl zur Synthese von Nukleotidzuckern als auch zur Synthese von Disacchariden
verwendet werden. Dabei hängt die Syntheserichtung vom eingestellten pH-Wert ab
(Copeland 1990). Die Reversibilität wird durch die vergleichbare Größenordung der freien
Standardenergien von UDP-D-Glucose und Saccharose
ermöglicht (Grothus 1993). Unter Berücksichtigung der
ausgeprägten Substratüberschussinhibition durch dTDP wurde Saccharose Synthase in einer
kontinuierlichen Synthese von dTDP-D-Glucose im Enzym-Membran-Reaktor (EMR) mit
einer Raumzeitausbeute von 98,1 g/L·d eingesetzt (Zervosen 1992; Zervosen et al. 1994). Die
dabei erreichte Umsatzrate betrug 90% bei einem Enzymbedarf von 10 U/g. Durch Einsatz
von dTMP und einer dTMP-Kinase [EC 2.7.4.9], inklusive der erforderlichen ATP
Regeneration durch Pyruvat-Kinase [EC 2.7.1.40], ist es durch den Einsatz von 3 Enzymen
möglich, dTDP-D-Glucose ausgehend von Saccharose im präparativen Maßstab herzustellen.
Bezogen auf dTMP wurden auf diesem Weg mit einem Gesamtumsatz von 62% 253 mg (430
10GlcUDP molkJ8,31G −
− ⋅−=∆
10Sacch molkJ3,29G −⋅−=∆
-24-
A EINLEITUNG
µmol) dTDP-D-Glucose hergestellt. Durch die Kombination mit weiteren Enzymen aus
Salmonella enterica LT2, (RmlB [EC 4.2.1.46], RmlC [EC 5.1.3.13] und RmlD [EC
1.1.1.133]), ist es möglich sowohl dTDP-6-Desoxy-4-keto-D-glucose als auch dTDP-β-L-
Rhamnose (183,5 mg, 310 µmol) im präparativen Maßstab herzustellen (Günther 2000) und
für weitere in vitro Arbeiten zur Verfügung zu stellen (Abbildung 20). Die bislang größte
Synthese von dTDP-6-Desoxy-4-keto-D-glucose erfolgte ausgehend von dTDP und
Saccharose. Dabei wurden 1100 mg (1864 µmol) produziert (Stein et al. 1998).
OHO
HO
OHO
OH
O
OH
HO
HO
OH
+ dTDPO
HOHO
OdTDPOH
OH
dTMP
ATP
ADP PEP
Pyr
SuSy 1
dTDP-D-Glucose-4,6-Dehydratase
(RmlB)
OO
HO
OdTDP
OH
H3C
dTMP-Kinase
D-Fructose+
Pyruvat-Kinase
Saccharose
dTDP-D-Glucose
dTDP-6-Desoxy-4-keto-D-glucose
Abb. 20: Präparative Synthese von dTDP-6-Desoxy-4-keto-D-glucose ausgehend von
Saccharose und dTMP (Günther 2000).
Mit Hilfe der rekombinanten SuSy 1 wurden insgesamt fünf verschieden aktivierte Glucosen
hergestellt. Dabei zeigte sich, dass die eingesetzten Nukleotide unterschiedlich gut von SuSy
1 akzeptiert wurden (UDP > ADP = dTDP > CDP > GDP) (Römer et al. 2004; Zervosen et al.
1999). Weiterhin wurde das rekombinante Enzym aus Kartoffel zur Herstellung von
verschiedenen Saccharose-Analoga verwendet (Römer et al. 2004, Römer 2003; Sinha et al.
2002) und bei der Synthese des sog. „Galili-Epitops“ eingesetzt (Brinkmann et al. 2001).
Ein weiteres wichtiges Anwendungsgebiet von SuSy 1 ist die in situ Regeneration von
Nukleotidzuckern. Ein Beispiel dafür ist die Synthese von N-Acetyllactosamin (LacNAc)
unter Regeneration von UDP-D-Glucose bzw. UDP-D-Galactose (Zervosen und Elling 1996)
(Abbildung 21).
-25-
A EINLEITUNG
O
HO
OUDP
OH
OHHO
O
HO
OUDP
OH
OH
HO
O
HOHO
NHAc
OH
OH
O
HOO
NHAc
OH
OHO
HOOH
OHHO
UDPSuSy
UDP-Glucose-Epimerase
β1,4-GalT
SaccharoseD-Fructose
UDP-D-Glucose
UDP-D-Galactose
N-Acetylglucosamin
N-Acetyllactosamin (LacNAc)
Abb. 21: Reaktionszyklus für die LacNAc-Synthese durch Kombination von SuSy [EC
2.4.1.13], β1,4-GalT (β1,4-Galactosyltransferase I) [EC 2.4.1.38] und UDP-D-Glucose-
Epimerase [EC 5.1.3.2] (Zervosen und Elling 1996).
Bei dieser präparativen Synthese wurden in 11 „repetitive-batch“ Ansätzen unter in situ
Regeneration des Nukleotidzuckers 594 mg (1.55 mmol) LacNAc produziert. Die
Gesamtausbeute betrug 57,4%. Durch das breite Akzeptanzspektrum an Nukleotiden
ermöglicht der Einsatz von SuSy in Kombination mit anderen Enzymen die in situ
Regeneration einer ganzen Reihe von Zuckern. Dieser Umstand spielte eine wichtige Rolle
bei der in dieser Arbeit mitentwickelten Strategie der kombinatorischen Biokatalyse zur
Herstellung neuartig glykosylierter Makrolide (Enzym-Modul-System, EMS) (Kap. A 4).
2.1.7 Naturstoff-Glykosyltransferasen Durch den Erkenntniszuwachs hinsichtlich des Aufbaus und der Organisation der Antibiotika-
Biosynthesecluster werden stetig neue Glykosyltransferasegene entdeckt. Zurzeit sind mehr
als 50 Glykosyltransferasegene aus Antibiotika produzierenden Actinomyceten bekannt
(Méndez und Salas 2001) und gehören alle zur sog. Glykosyltransferasefamilie 1 (CAZY-
Datenbank (Carbohydrate-Active EnZYmes), http://afmb.cnrs-mrs.fr/CAZY/acc.html)
(Campbell et al. 1997, Méndez und Salas 2001). Die meisten Transferasen teilen sich ein
konserviertes, glycinreiches Motiv in der Nähe des C-Terminus, das charakteristisch ist für
UDP-Glucosyl- und UDP-Glucuronosyltransferasen. Bis heute sind fünf verschiedene
Desosaminyltransferasen aus unterschiedlichen Antibiotika produzierenden Organismen
identifiziert worden (EryCIII, MegCIII, OleG1, DesVII, NbmD). Die Aminosäureidentitäten
reichen von 50% (NbmD) bis 54% (OleG1). Eine Ausnahme bilden EryCIII und MegCIII, da
-26-
A EINLEITUNG
sie eine Aminosäureidentität von 84% aufweisen, jedoch erkennen beide das gleiche Aglykon
(Volchegursky et al. 2000). Eine Übersicht über die bereits identifizierten und teilweise
klonierten Naturstoff-Glykosyltransferasen von verschiedenen Actinomyceten gibt Tabelle 2.
Tab. 2: Antibiotika und ihre Glykosyltransferasen (Méndez und Salas 2001).
Antibiotikum Glykosyltransferase(n) Referenz Spectinomycin SpcF, SpcG Zugangsnummer U70376
Nystatin NysDI Brautaset et al. 2000
Pimaricin PimK Aparicio et al. 2000
Balhimycin BgtfA, BgtfB, BgtfC Pelzer et al. 1999
Chloroeremomycin GtfA, GtfB, GtfC van Wageningen et al. 1998
Vancomycin GtfD, GtfE Solenberg et al. 1997
Tylosin TylN, TylMII, TylCV Gandecha et al. 1997; Fouces et al. 1999;
Bate et al. 2000
Elloramycin ElmGT Blanco et al. 2001
Nogalamycin SnogD, SnogE, SnogZ Zugangsnummer AF187532
Landomycin LanGT1 – LanGT4 Westrich et al. 1999
Urdamycin UrdGT1a – UrdGT1c, UrdGT2 Hoffmeister et al. 2001; Trefzer et al. 2000
Granaticin Gra-orf14 Ichinose et al. 1998
Coumermycin A1 CumH Wang et al. 2000
Novobiocin NovM Steffensky et al. 2000
Mithramycin MtmGI - MtmGIV Fernández et al. 1998; Blanco et al. 2000
Daunomycin DauH Dickens et al. 1996
Doxorubicin DnrS Otten et al. 1995
Baumycin DnrH Lomovskaya et al. 1999
Aclacinomycin AknK, AknS Räty et al. 2000
Erythromycin EryBV, EryCIII Summers et al. 1997
Pikromycin DesVII Xue et al. 1998
Megalomicin MegDI, MegBV, MegCIII Volchegursky et al. 2000
Oleandomycin OleG1, OleG2 Olano et al. 1998
Spiramycin GimA Gourmelen et al. 1998
Oleandomycin OleD, OleI Quirós et al. 1998
Avermectin AveBI Ikeda et al. 1999
Rebeccamycin Ngt Ohuchi et al 2000.
Antibiotic A201A Ard-orf5 Barrasa et al. 1997
Narbomycin NbmD Zugangsnummer Q8KRX7
Mitomycin MitB Mao et al. 1999
-27-
A EINLEITUNG
Anhand eines Dendrogramms kann man die Verwandtschaftsbeziehungen zwischen den
unterschiedlichen bakteriellen Glykosyltransferasen sichtbar machen (Abbildung 22). Die
Zuordnung der verschiedenen Glykosyltransferasen zu den jeweiligen Antibiotikaclustern
kann mit Hilfe von Tabelle 2 erfolgen.
Abb. 22: Dendrogramm einer Reihe von bakteriellen Glykosyltransferasen die an der Bildung
von bioaktiven Verbindungen beteiligt sind (Méndez und Salas 2001).
Die beiden Glykosyltransferasen UrdGT1b und UrdGT1c sind sehr eng miteinander verwandt
(Aminosäureidentität 91%), übertragen jedoch verschiedene Zucker während der Biosynthese
von Urdamycin (UrdGT1b: Transfer von dTDP-D-Olivose, UrdGT1c: Transfer von dTDP-L-
Rhodinose). Eine Reihe von gezielten Mutation ermöglicht es, die Donorsubstratspezifität der
beiden Enzyme umzukehren (UrdGT1b: Transfer von dTDP-L-Rhodinose, UrdGT1c:
Transfer von dTDP-D-Olivose) und neuartige Urdamycin Varianten zu produzieren
-28-
A EINLEITUNG
(Hoffmeister et al. 2001; Hoffmeister et al. 2002). Des Weiteren zeigt sich, dass die Enzyme
DesVII, TylMII, EryCIII, MegCIII, MegDI, OleG1 und OleG2 offensichtlich einem
gemeinsamen Vorläufer entspringen. Dies ist auch sehr wahrscheinlich, da alle Enzyme, bis
auf OleG2, einen methylierten Aminozucker (dTDP-D-Desosamin, dTDP-D-Mycaminose
oder dTDP-L-Megosamin) übertragen und aus dem Bereich der Makrolide stammen.
Interessant ist jedoch, dass sich unter den genannten Enzymen sowohl Transferasen für L-
Zucker (OleG2 und MegDI) als auch für D-Zucker (DesVII, EryCIII und MegCIII) befinden.
Zu den in Streptomyceten am besten charakterisierten Glykosyltransferasen zählen die
Glykosyltransferasen, die den Stämmen Resistenzen gegen das produzierte Antibiotikum
verleihen und nicht für einen Zuckertransfer verantwortlich sind, der für die biologische
Aktivität der Verbindung nötig ist. Beispiele für derartige Glykosyltransferasen sind OleD
und OleI aus Streptomyces antibioticus (Quirós et al. 1998), sowie MgtA aus Streptomyces
ambofaciens (Gourmelen et al. 1998). Typisch für diese Art des Resistenzmechanismus ist
eine Glucosylierung der 2’-OH Gruppe eines Saccharids. Im Fall von OleD findet eine
Glucosylierung in der C-2 Position des Desosaminrests des Oleandomycins statt (Quirós et al.
2000a), wodurch die Interaktion dieser Hydroxylgruppe mit der 23S RNA verhindert wird
(Abbildung 5). Donor für die Glucosylierungsreaktion ist UDP-Glucose (Cundliff 1992b;
Vilches et al. 1992). Diese Art von Resistenzmechanismus ist weit verbreitet und konnte
bereits in einer Vielzahl von Polyketid-Antibiotika produzierenden Stämmen nachgewiesen
werden (Sasaki et al. 1996). Aus der Tatsache, dass spezifische Glucosidasen existieren, die
eine Deglucosylierung des Makrolides bewerkstelligen (Vilches et al. 1992), wurde
geschlossen, dass z. B. Streptomyces antibioticus während der ganzen Zeit der Biosynthese
sensitiv gegen sein eigenes Antibiotikum Oleandomycin ist (Quirós et al. 2000a).
In jüngster Zeit wurden die drei Enzyme GtfA (4-epi-Vancosaminyltransferase), GtfB
(Glucosyltransferase) aus dem Chloroeremomycin-Cluster und GtfD
(Vancosaminyltransferase) aus dem Vancomycin-Cluster kristallisiert und die Proteinstruktur
in unterschiedlicher Auflösung bestimmt (Mulichak et al. 2001; Mulichak et al. 2003,
Mulichak et al. 2004) Es zeigte sich, dass alle drei Enzyme eine „Zwei-Domänenstruktur“,
mit einem tiefen Einschnitt in der Mitte besitzen (Abbildung 23). Alle drei
Glycosyltransferasen gehören zur GT-B-Superfamilie (Mulichak et al. 2003; Mulichal et al.
2004; Hu und Walker 2002), deren Topologie hoch konserviert ist, obwohl die Enzyme keine
nennenswerte Übereinstimmung in der Primärsequenz zeigen. Die bei allen bekannten
Mitgliedern der Familie gefundene „Zwei-Domänenorganisation“, in der jede Domäne
unabhängig für die Erkennung und Bindung des Donor- bzw. Akzeptorsubstrats
-29-
A EINLEITUNG
verantwortlich ist, scheint ein interessantes Ziel für die Herstellung von chimären Enzymen
zu sein, die einen weiteren Ansatzpunkt für die Produktion von neuen Antibiotika darstellen
(Mulichak et al. 2003; Hu und Walker 2002; Méndez und Salas 2001).
Abb. 23: Kristallstruktur der Enzyme GtfA (links) und GtfB (in der Mitte) und GtfD (rechts)
(Mulichak et al. 2001; Mulichak et al. 2003, Mulichak et al. 2004).
Ein Aminosäuresequenzalignment von verschiedenen, ausgewählten Mitgliedern der GT-B
Superfamilie zeigt ein konserviertes Motiv auf, welches mit einer α/β/α-Faltung
übereinstimmt (Subdomäne). Diese Subdomäne findet sich bei fast allen Mitgliedern der GT-
B-Familie und wird heutzutage dazu verwendet potentielle Mitglieder der GT-B-Familie zu
identifizieren (Hu und Walker 2002).
In den vergangenen Jahren wurden eine Reihe von vergleichenden Analysen mit den
bekannten Glykosyltransferasegenen und -familien durchgeführt (Saxena et al. 1995; Geremia
et al. 1996; Campbell et al. 1997; Breton et al. 1998; Breton und Imberty 1999, Kapitonov
und Yu 1999). Bei diesen vergleichenden Analysen wurde u. a. von Henrissat et al. als erstes
ein „Signaturmotiv“ in der primären Aminosäuresequenz einer prokaryontischen α-
Mannosyltransferase aufgezeigt (Geremia et al. 1996). Dieses Motiv wurde als mutmaßliches
katalytisches Motiv (EXFGXXXXE) für die sog. konfigurationserhaltenden („retaining“)
Mannosyltransferasen bezeichnet. Das „konfigurationserhaltend“ bezieht sich dabei auf die
sterische Konfiguration am anomeren C-Atom des Substrats GDP-α-D-Mannose. Unter zu
Hilfenahme eines Glykosidase-Reaktionsmechanismus wurde dem postulierten Motiv
(EXFGXXXXE) folgende Rolle zugewiesen: In einem SN1-Mechanismus fungieren die
beiden Carboxylate (E) als Basen in einer nukleophilen Substitution (Sinnott 1990), wobei
-30-
A EINLEITUNG
das obere Carboxylat (E2) über der Ebene des Zuckers als Nukleophil (Base) und das unter
der Ebene des Zuckers liegende Carboxylat (E1) als Protonendonor (Säure) fungiert
(Kapitonov und Yu 1999) (Abbildung 24). Durch Mutationsstudien konnte in einigen Fällen
gezeigt werden, dass die beiden Carboxylatreste kritisch für die Katalyse sind (Campbell et al.
1997). Kurze Zeit später wurden von Geremia und Imberty diese Untersuchungen auf
Galactosyltransferasen ausgeweitet. Dabei stellte sich heraus, dass sich das EXFGXXXXE-
Motiv auch bei den konfigurationsumkehrenden („inverting“, SN2-Mechanismus)
Glykosyltransferasen finden ließ, obwohl diese sehr unterschiedliche Nukleotidzucker
verwenden (UDP-α-D-Galactose, UDP-α-D-Galacturonsäure, GDP-α-D-Mannose und CMP-
β-Neuraminsäure) (Breton et al. 1998). In einem SN2-Mechanismus fungiert das oberhalb der
Zuckerebene angeordnete Carboxylat (E2) als Base in einer nukleophilen Substitution und der
unter der Ebene des Zuckers liegende Histidinrest (H1) als Protonendonor (Säure)
(Abbildung 24). Als weiteres Motiv wurde, mit einer Ausnahme, in diesen Studien bei allen
Galactosyltransferasefamilien das sog. „DXD-Motiv“ gefunden, welches ebenfalls eine Rolle
bei der Katalyse spielt und einen wesentlichen Teil der Nukleotiderkennungssequenz darstellt
(Thorson et al. 2001). Über weitere Vergleiche von Glykosyltransferasen, die Pyrimidin
basierte Zuckerdiphosphate verwenden, definierten Kapitonov und Yu die sog. NRD1-
Domäne („Nucleotide Recognition Domain“) sowohl für die konfigurationserhaltenden (oder
α), wie auch für die konfigurationsumkehrenden (oder β) Mitglieder dieser umfangreichen
Gruppe (Kapitonov und Yu 1999). Dabei wurde ein, dem Henrissat-Motiv ähnliches Motiv
(FVHGGXXXXSXXXXXE), als NRDβ1-Signatur für die konfigurationsumkehrenden
Enzyme und das ursprüngliche Motiv (EXFGXXXXE) als NRDα-Motiv für die
konfigurationserhaltenden Enzyme festgelegt.
-31-
A EINLEITUNG
O
HOHO
OH
OH
O P
O-O P
OO
O-O
-O
O
E-2
OHR
NHN
H-1
H+
O
HOHO
OH
OH
O P
O-O P
OO
O-O
O-
O
O
O
H
E-2
E-1
O
HOHO
OH
OH
O
O
-O
O
E-2
E-1
δ+
OR H
A BAbb. 24: Postulierter Mechanismus für die konfigurationserhaltenden (A) und die
kofigurationsumkehrenden (B) Glykosyltransferasen (Thorson et al. 2001).
2.1.7.1 In vitro Untersuchungen zu den Naturstoff-Glykosyltransferasen
Bis heute sind in vitro Untersuchungen zu den bakteriellen Glykosyltransferasen aus den
Antibiotikaclustern der Actinomyceten selten, obwohl ihnen eine wichtige Rolle für die
Entwicklung von Synthesestrategien im Rahmen der kombinatorischen Biosynthese zukommt
(Méndez und Salas 2001; Walsh 2002). Dies liegt nicht zuletzt daran, dass große
Schwierigkeiten bestehen, die für die Tests erforderlichen, sehr komplexen Nukleotidzucker
in ausreichenden Mengen zu synthetisieren (Rix et al. 2002) und die erforderlichen Enzyme
(Biosyntheseenzyme und Glykosyltransferasen) in präparativen Mengen zu produzieren
(Walsh et al. 2003). Alle bis dato publizierten Expressionen von bakteriellen
Glykosyltransferasen für in vitro Zwecke (Donor- oder Akzeptorsubstrat Studien,
Kristallisatiosversuche) erfolgten periplasmatisch in E. coli (Mulichak et al. 2001; Mulichak
et al. 2003; Mulichak et al. 2004; Losey et al. 2002; Alberman et al 2003; Lu et al. 2004;
Freel Meyers et al. 2003). Viele der veröffentlichten Ergebnisse sind mit kommerziell
verfügbaren Nukleotidzuckern wie UDP-D-Glucose, dTDP-D-Glucose und UDP-/dTDP-D-
Xylose erzielt worden. Ausnahme bilden u. a. die aktuellen Arbeiten von Losey et al., bei
denen eine Reihe von UDP-D-Glucose- und dTDP-D-Glucose-Derivaten synthetisiert und
eingesetzt wurden (Losey et al. 2002). Die verschiedenen Derivate (z.B. UDP-2-Fluoro-D-
glucose oder dTDP-6-Chloro-D-glucose) wurden rein chemisch (UDP-Derivate) oder
chemoenzymatisch mit Hilfe einer sehr substratflexiblen Pyrophosphorylase (Ep) (dTDP-
-32-
A EINLEITUNG
Derivate) hergestellt. Weitere aktuelle Beispiele sind die Arbeiten von Albermann et al.
(Albermann et al. 2003) und Fu et al. (Fu et al. 2003) im Rahmen der „in vitro
glycorandomization“ Strategie (IVG) von Naturstoffen und den beteiligten Transferasen
NovM und GtfE (Kap. A 3.3). Bei den Studien mit NovM hat sich gezeigt, dass das Enzym in
der Lage ist neben ihrem natürlichen Donor L-Noviose auch dTDP-6-Desoxy-glucose, UDP-
6-Desoxy-glucose, dTDP-6-Desoxy-4-keto-glucose und dTDP-Xylose zu übertragen. Dabei
wurde jedoch dTDP-aktivierte 6-Desoxy-glucose wesentlich effizienter übertragen als die
UDP-aktivierte Variante (90% Umsatz zu 20% Umsatz). Weiterhin wurde festgestellt, dass
keiner der eingesetzten unnatürlichen Akzeptoren glykosyliert werden konnte. Für den Donor
dTDP-6-Desoxy-glucose (und den natürlichen Akzeptor) wurden folgende kinetische
Parameter bestimmt: Km = 156 ± 17 µM, Vmax = 3,0 ± 0,1 mU/mg. Alle drei produzierten
Aminocoumarin-Derivate zeigten antibiotische Aktivität, waren jedoch alle deutlich geringer
wirksam als Novobiocin (Albamycin). Mit Hilfe des Enzyms GtfE war es möglich, eine ganze
Reihe von dTDP-D-Glucose-Derivaten (Amino- Azido-, Keto- und Thio-Derivate) zu
übertragen. Einige der Derivate, z. B. die Azido-Derivate, bieten die Möglichkeit zusätzliche
Modifikationen zur weiteren Funktionalisierung einzuführen (Fu et al. 2003). Eine weitere
aktuelle Arbeit, die sich mit dem Enzym NovM befasst, stammt von Freel Meyers et al. (Freel
Meyers et al. 2003). Ausgehend von kommerziell erhältlicher L-Rhamnose wurde in einem 11
stufigen chemischen Prozess dTDP-L-Noviose hergestellt und als Substrat eingesetzt. Des
Weiteren wurden verschieden Aglyka als Akzeptoren getestet. Untersuchungen mit dTDP-L-
Noviose, welche strukturell sehr eng mit der dTDP-L-Rhamnose verwandt ist, zeigten eine
Inhibition durch dTDP-L-Rhamnose mit einem Ki-Wert von 83,5 ± 5,5 µM und eine
Substratüberschussinhibition für Novobiocinsäurekonzentrationen > 0,6 mM. Ein Transfer
von dTDP-L-Rhamnose wurde nicht beobachtet. Tabelle 3 fasst die
Akzeptorsubstratkinetiken für NovM zusammen. Als Donor fungierte in allen Fällen dTDP-L-
Noviose, für die ein Km-Wert von 8,6 ± 1,1 µM bestimmt wurde. Das pH-Optimum für NovM
liegt bei pH 6,0 und es wurde eine Abhängigkeit von Mn2+ festgestellt.
-33-
A EINLEITUNG
Tab. 3: Kinetische Konstanten unterschiedlicher Akzeptorsubstrate für NovM (Freel Meyers
et al. 2003).
Substrat kcat [min-1] Km [µM] kcat/Km
[mM-1×min-1]
kcat/Km
(relativ) [-]
Novobiocin-
säure
313 ± 16 32 ± 9,9 9,8 1
Cyclonovobiocin-
säure
118 ± 4 39 ± 6,5 3,0 0,3
7-Hydroxy-
coumarin
n/a n/a 5,7 × 10-5 5,8 × 10-6
7-Hydroxy-4-
methyl-coumarin
n/a n/a 6,9 × 10-5 7,0 × 10-5
4-Phenylphenol n/a n/a 5,2 × 10-6 5,3 × 10-7
4-Nitrophenol n/a n/a 4,7 × 10-5 4,8 × 10-6
Zu den in vitro ebenfalls sehr gut studierten Glykosyltransferasen zählen die beiden Enzyme
OleI (Quirós et al. 1998) und OleD (Hernandéz et al. 1993) aus Streptomyces antibioticus.
Kinetische Studien zeigten für die beiden Ole-Enzyme einen vergleichbaren „ordered bi-bi“
Mechanismus (Quirós et al. 1995; Quirós et al. 2000a). Die Katalyse wird durch Bindung von
Oleandomycin an das katalytische Zentrum initiiert, gefolgt von der Bindung der UDP-
Glucose, wodurch ein ternärer Komplex entsteht. Nach Abschluss der Transferreaktion wird
zunächst der Ko-Faktor UDP entlassen und im Anschluss das glykosylierte Oleandomycin.
Untersuchungen ergaben für diese Reaktion ein pH-Optimum von pH 8,0 bis pH 8,5. Die
beschriebenen Km-Werte für OleI betragen für Oleandomycin 2,9 ± 0,19 µM und für UDP-
Glucose 21,57 ± 2,3 µM, sowie bei OleD für Lankamycin 33,17 ± 3,27 µM und für UDP-
Glucose 599,6 ± 0,3 µM. Die kinetischen Daten passen zu einem Reaktionsmechanismus mit
einer einzigen nukleophilen Substitution am anomeren C-Atom, die zu einer
Konfigurationsumkehr führt (SN2-Mechanismus) (Quirós et al. 2000b).
Ein weiteres Enzym, das bereits kinetisch vermessen wurde, ist die D-Glucosyltransferase
GtfB aus dem Chloroeremomycin-Cluster (Mulichak et al. 2001). Das Enzym GtfB
katalysiert den initialen Transfer eines Glucoserests auf das Chloroeremomycin-Aglykon mit
Hilfe von UDP- oder dTDP-D-Glucose. Tabelle 4 fasst die publizierten Daten für das
Wildtyp-Enzym und drei Mutanten zusammen.
-34-
A EINLEITUNG
Tab. 4: Kinetische Daten der GtfB und dreier Mutanten (Mulichak et al. 2001).
Enzym kcat [min-1] Km UDP-Glucose [mM]
Wildtyp-GtfB 33 ± 4 1,3 ± 0,1
D13A 2,6 ± 0,3 1,1 ± 0,1
H125A 43 ± 3 0,45 ± 0,04
D332A 0,13 ± 0,03 3,3 ± 0,8
Als Akzeptor fungierte in allen Fällen das Chloroeremomycin-Aglykon mit einer Konzentration von 0,6 mM.
Aus den kinetischen Daten konnten keine konkreten Aussagen bzgl. des katalytischen
Mechanismus gemacht werden, jedoch zeigte ein Austausch der Asparaginsäure 332 gegen
einen Alaninrest einen Effekt auf den kcat-Wert, ohne jedoch den Km-Wert wesentlich zu
verändern. Weitere aktuelle in vitro Untersuchungen wurden mit den beiden Enzymen GtfE
(D-Glucosyltransferase) und GtfD (L-Vancosaminyltransferase) aus dem Vancomycin-
Biosynthesecluster durchgeführt. Dabei wurde zum einen das in vitro-Transferpotential der
beiden Enzyme untersucht und zum anderen kinetische Daten für die Glucosyltransferase
GtfE generiert. (Losey et al. 2002). Wie zuvor beschrieben wurde für diese Arbeiten eine
Reihe von unterschiedlichen Glucosederivaten synthetisiert und mit der Glucosyltransferase
getestet. Für die Untersuchungen der Vancosaminyltransferase stand eine chemisch
produzierte Mischung aus α- und β-Anomeren von UDP-L-4-epi-Vancosamin zur Verfügung.
Tabellen 5a und 5b fassen die mit dem Enzym GtfE getesteten Zucker zusammen.
Tab. 5a: Mit GtfE getestete UDP-aktivierte Zucker (Losey et al. 2002).
Zucker UDP-2-
Fluoro-
glucose
UDP-2-
Azido-
glucose
UDP-2-
Amino-
glucose
UDP-6-
Chloro-
glucose
UDP-6-
Azido-
glucose
UDP-6-
Amino-
glucose
UDP-
Xylose
Transfer - - + + - + + + = Transfer, - = kein Transfer
-35-
A EINLEITUNG
Tab. 5b: Mit GtfE getestete dTDP-aktivierte Zucker (Losey et al. 2002).
Zucker dTDP-2-
Desoxy-
glucose
dTDP-3-
Desoxy-
glucose
dTDP-4-
Desoxy-
glucose
dTDP-6-
Desoxy-
glucose
dTDP-4-
Amino
-6-
desoxy-
glucose
dTDP-3-
Amino-
glucose
dTDP-4-
Amino-
glucose
Transfer + + + + + + +
+ = Transfer, - = kein Transfer
Als Akzeptoren bei diesen Transferversuchen dienten das Vancomycin-Aglykon (AGV) und
das Teicoplanin-Aglykon (AGT). Mit verschiedenen Zuckern und dem Vancomycin-Aglykon
als Akzeptor wurden für GtfE folgende kinetische Parameter bestimmt (Tabelle 6).
Tab. 6: Kinetische Parameter für die Glucosyltransferase GtfE (Losey et al. 2002).
Substrat Km
[mM]
kcat
[min-1]
kcat/Km
[mM-1×min-1]
kcat/Km
(relativ)
UDP-Glucose 0,72 ± 0,11 31 ± 2 43 1
dTDP-Glucose 0,62 ± 0,09 29 ± 2 47 1,098
UDP-2-NH2-Glucose 0,79 ± 0,08 2,7 ± 0,2 3,4 0,077
dTDP-3-NH2-
Glucose
0,72 ± 0,06 7,1 ± 0,2 9,9 0,233
dTDP-4-NH2-
Glucose
1,1 ± 0,1 2,6 ± 0,1 2,4 0,055
UDP-6-NH2-Glucose 1,2 ± 0,2 1,5 ± 0,2 1,3 0,030
UDP-Xylose 1,8 ± 0,2 8,4 ± 0,6 4,7 0,110
UDP-6-Cl-Glucose 21 ± 6 0,3 ± 0,1 0,014 3,22 × 10-4
Die kinetischen Daten (Tabelle 6) und die Ergebnisse der IVG (Fu et al. 2003) zeigen, dass
GtfE in Bezug auf den Nukleotidzucker sehr flexibel ist. Dabei fällt auf, dass die Art der
Aktivierung (dTDP bzw. UDP) scheinbar eine untergeordnete Rolle spielt. Der mit Abstand
am schlechtesten verwertete Nukleotidzucker ist UDP-6-Chloro-glucose. Durch Kombination
mit dem zweiten Enzym, der Vancosaminyltransferase GtfD und unter Einsatz des
Nukleotidzuckers UDP-L-4-epi-Vancosamin ist es gelungen neue Vancomycin und
-36-
A EINLEITUNG
Teicoplanin Derivate herzustellen (z.B. 4-epi-Vancosaminyl-(1,2)-4-amino-glucosyl-AGV
und 4-epi-Vancosaminyl-(1,2)-4-desoxy-glucosyl-AGT) (Losey et al. 2002).
3 Kombinatorische Biosynthese und kombinatorische
Biokatalyse Die kombinatorische Biosynthese nutzt Enzyme aus Biosynthesewegen („Pathways“) von
Antibiotika- oder anderen Naturstoffproduzenten um neue chemische Strukturen zu erzeugen
(Rodríguez und McDaniel 2001).
Nach der Entdeckung des Penicillins in den zwanziger Jahren und des ersten Einsatzes seit
den vierziger Jahren des vergangenen Jahrhunderts begannen die Antibiotika ihren Siegeszug
auf dem Gebiet der Infektionskrankheiten. Im Verlauf der nächsten 20 – 30 Jahre wurden
durch verbesserte Screeningmethoden weitere, zum Teil noch wirksamere Antibiotika
gefunden. Durch den massenhaften Einsatz von Antibiotika haben sich jedoch neue
Resistenzen bei pathogenen Mikroorganismen gebildet und zum Teil explosionsartig
verbreitet. Dies zeigte sich besonders in den vergangenen 10 – 15 Jahren. Als bedeutende
Problemkeime haben sich in diesem Zusammenhang Methicillin-resistente Staphylococcus
aureus Stämme (MRSA), Vancomycin-resistente Enterococcus faecalis Stämme (VRE),
multiresistente Streptococcus pneumoniae Stämme, multiresistente Mycobacterium
tuberculosis Stämme und multiresistente Pseudomonas aeruginosa Stämme erwiesen.
Alarmierend sind Berichte über MRSA-Stämme, bei denen auch Vancomycin als
Reserveantibiotikum immer häufiger in seiner Wirksamkeit versagt (Sievert et al. 2002).
Dieser Umstand hat dazu geführt, dass das Interesse an neuen Antibiotika stark angestiegen
ist und das es als erforderlich gilt, neue Techniken zur Antibiotika Endeckung und zur
Produktion zu etablieren (Walsh 2000; Coates et al. 2002). Einen möglichen Ausweg aus
diesem Problem kann die kombinatorische Biosynthese aufzeigen, an deren Entwicklung seit
nunmehr 8 Jahren gearbeitet wird. Grundlage der kombinatorischen Biosynthese ist die
genetische Manipulation der Biosynthesemaschinerie der Bakterien und Mikroorganismen,
die Antibiotika oder aber auch andere, pharmazeutisch wichtige Naturstoffe produzieren.
Dabei werden zurzeit in erster Linie die modular aufgebauten Polyketidsynthasen (PKS), die
nichtribosomalen Polypeptidsynthasen (NRPS) und die Desoxyzuckermodule der Organismen
bearbeitet (Rodríguez und McDaniel 2001).
-37-
A EINLEITUNG
3.1 Manipulation von PKS-Modulen in der kombinatorischen
Biosynthese Wie unter Kap. A 2.1.2 beschrieben handelt es sich bei den Polyketidsynthasen vom Typ I
um modular aufgebaute Polyketidsynthasen, wobei jedem der Module eine definierte Rolle in
der Biosynthese zukommt. Dieser modulare Aufbau ermöglich es einzelne Module
auszutauschen, um Polyketidsynthasen mit neuen Funktionalitäten zu schaffen. Die 6-
Desoxyerythronolid B Synthase (DEBS) aus dem Erythromycin A Biosynthesecluster von
Saccharopolyspora erythraea zählt dabei zu den am besten studierten Polyketidsynthasen
(Donadio et al. 1991; Cortés et al. 1990). Durch Manipulation des PKS-Systems (Deletion,
Substitution oder Addition von Modulen, Schaffung von hybriden Modulen aus
unterschiedlichen Polyketidsynthasen) wurden eine Reihe von Erythromycin-Analoga und 6-
Desoxyerythronolid B-Analoga (6-dEB-Analoga) produziert (Katz 1997; Katz und McDaniel
1999, Rodriguez und McDaniel 2001). Inzwischen wurde eine Bibliothek von kombinatorisch
produzierten 6-dEB-Analoga und deren korrespondierenden Makroliden geschaffen, die bis
zu drei Modifikationen an einem oder mehreren Kohlenstoffzentren enthalten. Dies wurde
dadurch erreicht, dass gleichzeitig in mehreren Modulen der DEBS Manipulationen
durchgeführt wurden (McDaniel et al. 1999) (Abbildung 25).
-38-
A EINLEITUNG
O
O
O
OH
OH O
O
O
OH
O
O
O
OH
OH
OH
LDmod 1
mod 2mod 3
mod 4 mod 5mod 6 TE
DEBS 1 DEBS 2 DEBS 3
AT2 KR5 AT6
(a) rapDH/ER/KR1 (b) KR5∆ (c) rapAT2
OH
O
O
O
O
OH
O
Einfach-mutation
Dreifach-mutation
Abb. 25: Kombinatorische Biosynthese modifizierter 6-dEB-Analoga mit drei funktionellen
Mutationen in verschiedenen DEBS-Modulen (Rodríguez und McDaniel 2001). Die
Mutationen sind: Substitution der Ketoreduktase (KR) in DEBS Modul 2 mit der Dehydratase
(DH)/Enoylreduktase (ER)/KR Domäne aus Modul 2 der Rapamycin Polyketidsynthase
(PKS), Deletion einer KR in Modul 5 und Austausch der Methylmalonyl-spezifischen
Acyltransferase (AT) in Modul 6 gegen die Malonyl-spezifische AT der Rapamycin PKS.
Durch eine Erweiterung dieses Systems um Glykosylierung wurde ausgehend von DesVII
eine Bibliothek von desosaminylierten, bioaktiven Makroliden produziert, die auf
modifizierten 6-dEB-Analoga basierten (Abbildung 26) (Tang und McDaniel 2001). Um die
Glykosylierung zu ermöglichen, wurde parallel zu dem manipulierten DEBS-Gencluster auch
das gesamte dTDP-D-Desosamin Biosynthesecluster des Pikromycin/Narbomycin
Produzenten Streptomyces venezuelae in Streptomyces lividans exprimiert.
-39-
A EINLEITUNG
O
O
O
O
O
O
O
OH
OH
O
O
O
O
OH
OH
O O
O
O
OH
OO
O
O
O
O
O
OH
OH
O O
O
O
OH
ODes
O
O
O
OH
OH
O
O
O
O
OH
OH
O O
O
O
OH
O O
O
O
OH
O
O O
O
O
O
O
O O
OH O
Des Des Des Des
Des Des Des
DesDesDesDes
Abb. 26: Kombinatorisch produzierte Bibliothek von desosaminylierten Makroliden
(Rodríguez und McDaniel 2001). Des: D-Desosaminylrest.
Jüngst ist es gelungen 6-dEB mit Hilfe von heterolog exprimierter DEBS in E. coli zu
produzieren, wodurch sich ein neues Feld für die kombinatorische Biosynthese abseits der
Actinomyceten auftut (Pfeifer et al. 2001). Für Produktion von 6-dEB in E. coli mussten nicht
nur die sehr großen Proteine (>330 kDa) der DEBS funktionell exprimiert, sondern auch die
„Precursorversorgung“ ((2S)-Methylmalony-CoA) für die Biosynthese der Polyketide
sichergestellt und die posttranslationale Phosphopantetheinonylierung der Acylcarrierprotein-
Domänen (ACP-Domänen) der PKS-Untereinheiten gewährleistet werden. Dies gelang durch
umfangreiche Modifikationen des E. coli-Stoffwechsels. In der Zwischenzeit ist es gelungen
den Produktionsprozess so weit zu optimieren, dass über eine hochzelldichte „fed-batch“
Fermentation von E. coli große Mengen an 6-dEB produziert werden können (1.1 g/L) (Lau et
al. 2004).
3.2 Manipulation von Desoxyzucker-Biosynthesewegen in der
kombinatorische Biosynthese Aufgrund der Tatsache, dass bei vielen bioaktiven Naturstoffen die Glykosylierung eine
entscheidende Rolle im Hinblick auf ihre biologische Aktivität spielt, ist es erforderlich, die
Biosynthese und den Transfer der Desoxyzucker in die kombinatorischen Biosynthese zu
integrieren. Bei den in der aktuellen Literatur geschilderten Beispielen der kombinatorischen
Biosynthese werden im Wesentlichen vier Strategien eingesetzt, um die Substratflexibilität
der Naturstoff-Glykosyltransferasen zu studieren. Die Substratflexibilität der
-40-
A EINLEITUNG
Glykosyltransferasen ist Vorraussetzung für eine Änderung des Glykosylierungsmusters und
somit Voraussetzung für die Produktion von neuartigen bioaktiven Verbindungen. (Blanco et
al. 2001; Gaisser et al. 2000; Gaisser et al. 2002; Mendéz und Salas 2001; Trefzer et al. 2002).
Unter dem Begriff der „Flexibilität“ ist in diesem Zusammenhang die Fähigkeit der
Glykosyltransferasen zu verstehen, einen unnatürlichen, aktivierten Zucker auf ein natürliches
Akzeptorsubstrat (Donor- oder Zuckerflexibilität), oder einen natürlichen/unnatürlichen
Zucker auf einen unphysiologischen Akzeptor (Aglykon oder glykosylierter Akzeptor) zu
übertragen (Akzeptor- oder Aglykonflexibilität). Zu den ersten kombinatorisch produzierten
Glykosiden gehört ein Epimer des Krebstherapeutikums Doxorubicin (Madduri et al. 1998).
Bei der ersten Strategie werden gezielt einzelne Gene der Zuckerbiosynthese deletiert, um so
ein bestimmtes Intermediat anzustauen und mit Hilfe von ebenfalls in den Stamm
eingebrachten, rekombinanten Enzymen zu einem anderen Zucker umzusetzen. Die neuen
Zucker werden dann mit der stammeigenen Glykosyltransferase auf Transfer getestet
(Yamase et al. 2000; Borisova et al 1999; Zhao et al. 1999; Butler et al. 2002). Die zweite
häufig mit Erfolg verwendete Technik besteht darin, die Glykosyltransferase(n) eines
Stammes zu deletieren ohne die Zuckerbiosynthesegene zu verändern. Durch Einbringen von
rekombinanten Glykosyltransferasen kann man deren Substratflexibilität untersuchen
(Doumith et al. 1999; Blanco et al. 2001; Trefzer et al. 2002). Die dritte erfolgreich
eingesetzte Technik besteht darin, einen rekombinanten Stamm zu verwenden, der sowohl in
der Aglykonbiosynthese als auch in der Expression der stammeigenen Glykosyltransferase(n)
defizient ist. Durch Zufüttern von verschiedenen Aglyka (natürliche und unnatürliche) und
Expression von rekombinanten Glykosyltransferasen kann das Substratspektrum der
Transferasen untersucht werden (Gaisser et al. 2000; Gaiser et al. 2002). Bei der vierten
Strategie werden alle Gene der Zuckerbiosynthese, inklusive der Glykosyltransferasen, in
einen rekombinanten Stamm eingebracht. Durch Austausch der verschiedenen Gene und
durch Zufüttern von geeigneten Aglyka kann die Funktion der einzelnen Gene studiert und
hybride Verbindungen produziert werden, vorausgesetzt die eingesetzten
Glykosyltransferasen sind in der Lage die entstandenen Zucker zu übertragen (Wohlert et al.
2001). Ein genereller Nachteil der in vivo Systeme besteht allerdings darin, dass Enzyme aus
dem jeweiligen Stammhintergrund die Untersuchungen beeinflussen können. Beschrieben ist
dies u. a. für eine „Pathway“ unabhängige 3-Ketoreduktase aus Streptomyces venezuelae
(Borisova et al. 1999; Yamase et al. 2000) und zwei weitere „Pathway“ unabhängige
Ketoreduktasen aus Streptomyces lividans (Wohlert et al. 2001; Salah-Bey et al. 1998). Die
unabhängigen Reduktasen sind in der Lage die angestauten Zuckerintermediate unspezifisch
-41-
A EINLEITUNG
zu reduzieren und abzufangen, bevor sie zum eigentlichen Zielprodukt umgesetzt werden
konnten. Ein weiteres interessantes Beispiel für ein Enzym aus dem Stammhintergrund ist
eine nicht näher charakterisierte Glucosyltransferase aus Saccharopolyspora erythraea, die in
der Lage ist, sowohl Tylacton als auch Spinosyn zu glucosylieren (Gaisser et al. 2000; Gaisser
et al. 2002). Einen Überblick über die bis dato gefundene Zuckerflexibilität bei bakteriellen
Glykosyltransferasen gibt Tabelle 7.
Tab. 7: Übersicht über die Zuckerflexibilität einiger bakterieller Glykosyltransferasen.
Glykosyl- transferase
Natürlicher Zucker
Biosynthese- Cluster
Unnatürlicher Zucker
Referenz
EryCIII D-Desosamin Erythromycin A L-Mycarose D-Mycaminose
Fernández et al. 2002 unveröffentlicht
EryBV L-Mycarose Erythromycin A L-Rhamnose L-Olivose
Persönliche Mitteilung Prof. Salas; GENOVA;
DesVII D-Desosamin Methymycin / Pikromycin
D-Quinovose L-Rhamnose
Borisova et al. 1999; Yamase et al. 2000 ;
OleG2 L-Olivose
Oleandomycin L-Rhamnose L-Mycarose
Doumith et al 1999 ; Gaisser et al. 2000 ; Aguirrezabalaga et al. 2000
SpnP D-Forosamin Spinosyn A/D L-Mycarose Gaisser et al. 2002 TylMII D-Mycaminose Tylosin D-Desosamin Butler et al. 2002 ;
Gaisser et al. 2000 UrdGT2 D-Olivose Urdamycin A D-Rhodinose
D-Mycarose L-Rhodinose
Hoffmeister et al. 2000; Mendéz und Salas 2001; Trefzer et al. 2002 Hoffmeister et al. 2003a
DnrS L-Daunosamin Daunorubicin L-Epidaunosamin Rix et al. 2002 NovM L-Noviose Novobiocin dTDP-6-Desoxy-D-
glucose UDP-6-Desoxy-D-glucose dTDP-6-Desoxy-4-keto-D-glucose dTDP-D-Xylose
Albermann et al. 2003 Freel Meyers et al. 2003
AvrB (AveBI)
L-Oleandrose Avermectin A1 L-Olivose D-Olivose L-Digitose
Wohlert et al. 2001
GtfD L-Vancosamin Vancomycin UDP-L-4-epi-Vancosamin
Losey et al. 2001 Losey et al. 2002
GtfB D-Glucose Chloroeremomycin D-Xylose Solenberg et al. 1997 GtfE’ (Mutante) GtfE
D-Glucose D-Glucose
Vancomycin D-Xylose Desoxy-, Amino-, Keto-, Azido-, Thio- und Chloro-Glucosederivate
Solenberg et al. 1997 Losey et al. 2002 Fu et al. 2003
ElmGT L-Rhamnose L-Rhamnose
Elloramycin Elloramycin
L-Olivose L-Oleandrose L-Rhodinose 3,4-Dimethoxy-L-olivose D-Olivose D-Mycarose D-Olivosyl-Disaccharid
Blanco et al. 2001 Mendéz und Salas 2001
-42-
A EINLEITUNG
Wie anhand der Daten aus Tabelle 7 zu erkennen ist, scheinen einige bakterielle Naturstoff-
Glykosyltransferasen in der Lage zu sein unter in vivo Bedingungen sowohl L- als auch D-
Zucker zu übertragen. Abbildung 27 zeigt am Beispiel der dTDP-D-Forosaminyltransferase
SpnP aus Saccharopolyspora spinosa einen mechanistischen Vorschlag von Gaisser et al. zur
Erklärung dieses Phänomens (Gaisser et al. 2002).
O
H3C
OH
HO
H3C
dTDP-β-O-L-Mycarose
O OdTDP
OdTDP
HO
CH3
OH
O
HO
CH3
OH
OR
SpnP
O
H3C
OH
HO
H3C
OR
1C44C1
β
α
β
α
dTDP-α-O-L-Mycarose
(4)
(6)(7)
(5)
CH3
CH3
Abb. 27: Mechanistischer Vorschlag von Gaisser et al. (2002).
Bei dem vorgeschlagenen Mechanismus wird davon ausgegangen, dass Verbindung 4 in das
energiereichere Konformer 5 umklappt, wodurch die O-dTDP-Gruppe in die axiale Position
gelangt. Das energiereichere Konformer 5 wird dann mit Hilfe von SpnP β-glykosidisch an
das Spinosyn-Aglykon geheftet, wodurch Verbindung 6 entsteht. Durch erneutes Umklappen
in einen energieärmeren Zustand entsteht Verbindung 7. Mit Hilfe dieses Mechanismus ließe
sich erklären, warum SpnP dTDP-L-Mycarose überträgt, und warum der L-Mycarosylrest α-
glykosidisch gebunden vorliegt. Vereinfacht könnte man sagen, dass die Glykosyltransferase
den L-Zucker wie einen D-Zucker behandelt, wodurch der Transfer möglich wird. Einen
weiteren sehr interessanten Aspekt hinsichtlich der Substratflexibilität der bakteriellen
Glykosyltransferasen stellt die Übertragung von Ketozuckern durch Glykosyltransferasen dar,
also die Übertragung von typischen Stoffwechselintermediaten der Zuckerbiosynthese. Einer
der ersten Berichte stammt aus Untersuchungen zur Erythromycin-Biosynthese aus dem Jahre
1998. Bei diesen Untersuchungen wurde bei einer eryBIV Mutante von Saccharopolyspora
erythraea die Übertragung eines 4-Keto-L-mycarose-Rests auf das Aglykon beobachtet
(Salah-Bey et al. 1998). Weitere Hinweise für einen Transfer von Ketozuckern kamen aus
dem Gebiet des Methymycin/Pikromycin Produzenten Streptomyces venezuelae, sowie aus
dem Bereich des Balhimycin Produzenten Amycolatopsis mediterranei, bei dessen
-43-
A EINLEITUNG
Biosynthese durch die Glykosyltransferase bGtfA 4-Keto-vancosamin übertragen wird
(Walsh et al. 2003). Bei verschiedenen weiteren Transferversuchen mit modifizierten Zuckern
wurde mehrfach der Transfer von Ketozuckern postuliert, obwohl sich diese nicht direkt in
den Endprodukten nachweisen ließen (Zhao et al. 1998b; Borisova et al. 1999). Einen
weiteren, eindeutigen Hinweis für den Transfer von Ketozuckern, lieferte eine Arbeit aus der
Arbeitsgruppe Rohr im Jahre 2002 (Remsing et al. 2002). Bei dem Versuch neue
Mithramycin-Derivate zu produzieren wurden eine Reihe von neuen Mithramycinen
gefunden, die eindeutig Ketozucker als Substituenten in ihren Saccharidseitenketten trugen
(Abbildung 28).
OHOH
HO
O
OH
CH3
OCH3
O
H
O O
OH3COH
O
: R = CH3: R = H
HOOH3C
HO
OH
R
OHOH
O
O
OCH3
H
OH3COH
OHOOH3C
HO
OH
H3C
OH
CH3
OHOO
OH3C
OHOOH3C
HOHO
B A
CD
OHOH
O
O
OCH3
H
OH3C
OHOOH3C
O
OH
H3C
OH
CH3
OHOO
OH3C
OHOOH3C
HOHO
B A
CD
OH3C
OHE
H3C
O
4A-Ketopremithramycin A24A-Keto-9-demethylpremithramycin A2
4C-Keto-demycarosylmithramycin
4E-Ketomithramycin Abb. 28: Strukturen neuer Keto(pre)mithramycine (Remsing et al. 2002).
-44-
A EINLEITUNG
Leider liegen noch keine Daten zur Antitumorwirksamkeit der neuen Keto(pre)mithramycine
vor. Kürzlich wurden von Remsing et al. (Remsing et al. 2003) über kombinatorische
Biosynthese weitere, neuartige Mithramycin-Derivate (Mithramycin SK, Mithramycin SA
und Demycarosyl-Mithramycin SK) hergestellt (Abbildung 29).
OHOH
O
O
OCH3
H
OH3C
OHOO
H3C
O
OH
H3C
CH3
O
OHO
OH3C
OHOO
H3C
HOHO
OH3C
HO
H3CHO
Mithramycin SK
OHOH
O
O
OCH3
H
OH3C
OHOO
H3C
HO
OH
H3C
CH3
O
OHO
OH3C
OHOO
H3C
HOHO
Demycarosyl-Mithramycin SK
OHOH
O
O
OCH3
H
OH3C
OHOO
H3C
O
OH
H3C O
OH3C
OHOO
H3C
HOHO
OH3C
OH
H3CHO
Mithramycin SA
OH
O
Abb. 29: Über kombinatorische Biosynthese hergestellte neue Mithramycin-Derivate mit
verbessertem therapeutischen Index (Remsing et al. 2003)
Bei in vitro Studien mit verschiedenen Zelltumorlinien und bei in vitro Untersuchungen zur
Toxizität hat sich herausgestellt, dass Mithramycin SK einen deutlich verbesserten
therapeutischen Index besitzt als das ursprüngliche Mithramycin. Die Ergebnisse zeigen recht
eindrucksvoll das Potential von kombinatorischen Synthesestrategien.
-45-
A EINLEITUNG
Bei nahezu allen bis dato erstellten Studien hat sich gezeigt, dass auch bei Vorhandensein von
mehreren potentiellen O-Glykosylierungsstellen, wie z. B. bei EB, Tylacton, Pikromycin oder
Methymycin, die Glykosylierung immer an ein und derselben Position stattfindet, unabhängig
davon, welcher Zucker übertragen wird. In diesem Verhalten spiegelt sich die hohe
Regioselektivität der Glykosyltransferasen wieder (Abbildung 30).
O
O
OH
O
O
N(CH3)2HO
CH3
O
O
OHOH
CH3
O
OH
O
OHOH
O
O
OH
3-O-Rhamnosyl-Erythronolid B
5-O-Desosaminyl-Tylonolid
O
OO O
OCH3
OCH3OCH3
OCH3
O
OHH3C
H3C
O
HO
17-O-Mycarosyl-Spinosyn
O
O
O
O
OHHO
CH3OH
O
3-O-Quinovosyl-10-desoxymethynolid Abb. 30: Über kombinatorische Biosynthese hergestellte hybride Makrolide.
Weitere Beispiele für hybride Antibiotika und andere bioaktive Verbindungen sind 3-O-
Rhamnosyl-6-Desoxyerythromycin B und 3-O-Rhamnosyl-6-Erythromycin B (Doumith et al.
1999; Gaisser et al. 2000), 4’-Desoxy-20-dihydrodesmycosin und Desosaminyl-Tylonolid
(Butler et al. 2002), L-Rhamnosyl-, L-Olivosyl-, L-Rhodinosyl- und D-Olivosyl-
Tetracenomycin C (Rodríguez et al. 2002), 3-O-4,6-Didesoxyglucosyl-Methymicin (DesVII)
(Zhao et al. 1998) und 3-O-4-N-Acetyl-4,6-didesoxy-glucosaminosyl-Narbonolid bzw. 3-O-4-
N-Acetyl-4,6-didesoxy-glucosaminosyl-10-desoxymethynolid (Zhao et al. 1999).
Untersuchungen zur biologischen Wirksamkeit von 3-O-4-N-Acetyl-4,6-didesoxy-
glucosaminosyl-Narbonolid bzw. 3-O-4-N-Acetyl-4,6-didesoxy-glucosaminosyl-10-
desoxymethynolid (Zhao et al. 1999), sowie zu fünf weiteren neuen Verbindungen, nämlich
9-C-Olivosylpremithramycinon (1), 9-C-Olivosyl-4-O-demethylpremithramycinon (1a), 9- 9-
C-Mycarosylpremithramycinon (2), 9-C-Mycarosyl-4-O-demthylpremithramycinon (2a) und
C-(Olivo-1-4-olivosyl)premithramycinon (3) (Trefzer et al. 2001) haben gezeigt, dass diese
-46-
A EINLEITUNG
Verbindungen keine, bzw. eine nur sehr geringe biologische Wirksamkeit aufwiesen
(Abbildung 31).
OHOH
HO
O
OH
CH3
OR
OH
H
O O
OH3C
HOHO
1: R = CH31a: R = H
2: R = CH32a: R = H
OHOH
HO
O
OH
CH3
OR
OH
H
O O
OH3C
OHO
3O
H3CHO
HO
OHOH
HO
O
OH
CH3
OR
OH
H
O O
OH3C
HOH3C
OH
Abb. 31: Strukturen neuer hybrider Premithramycine (Trefzer et al. 2002).
Betrachtet man die Aglykonflexibilität der Glykosyltransferasen, so zeigt sich, dass diese
weniger deutlich ausgeprägt zu sein scheint als die Zuckerflexibilität. Es gibt jedoch einige
Glykosyltransferasen bei denen man von einer Aglykonflexibilität sprechen kann. Zu diesen
Transferasen gehören u. a. UrdGT2, LanGT1, LanGT4 (Trefzer et al. 2002; Dürr et al. 2004,
Hoffmeister et al. 2004), NovM (Freel Meyers et al. 2003) und die durch Mutation und Gen-
Shuffling produzierten Enzymvarianten von UrdGT1b/1c (Hoffmeister et al. 2002; Rix et al.
2002). Der signifikanteste Sequenzunterschied zwischen UrdGT1b/1c befindet sich in der
jeweiligen N-terminalen Region der Transferasen zwischen den Aminosäurepositionen 52 –
82. Ein Vergleich mit der Kristallstruktur der GtfB zeigt, dass dieser Sequenzabschnitt mit der
Brückenregion zwischen den Regionen β3 und β4 in der N-terminalen Domäne der GtfB
übereinstimmt. Verschiedene Untersuchungen mit Zufallsmutagenese und Domänenaustausch
bzw. gezielte Kombinationen von verschiedenen Domänenbestandteilen haben gezeigt, dass
dieser hypervariable Bereich sowohl die Donor- als auch die Akzeptorspezifität der Enzyme
UrdGT1b und UrdGT1c bestimmt (Hoffmeister et al. 2002; Thorson et al. 2004). Durch den
gleichzeitigen Austausch von mehreren Aminosäuren gelang es, die Spezifität der Enzyme
soweit zu beeinflussen, dass die Regioselektivität der Glykosyltransferasen geändert wurde.
-47-
A EINLEITUNG
Dies führte zu der Entstehung des neuartigen Urdamycin-Derivats Urdamycin P (Hoffmeister
et al. 2002) (Abbildung 32).
O
OH
O CH3
OHHO
O
OHOH3C
HOO
OH3C
OO
H3CHO
HO
O
OH
O CH3
OHHO
O
OHOH3C
OO
OH3C
OH
OH3C
HOHO
O
OH
O CH3
OHHO
O
OHOH3C
HOHO
O
OH
O CH3
OHHO
O
OHOH3C
HOO
OH3C
OH
Aquamycin
12b-Derhodinosyl-Urdamycin G
12b-Derhodinosyl-Urdamycin AUrdamycin P
UrdGT1c
UrdGT1b veränderte ("geshuffelte")Glykosyltransferasen
12b
12b
12b
12b
Abb. 32: Abschließende Glykosylierungsschritte der Urdamycin Biosynthese. Synthese von
Urdamycin P durch „Glycosyl-Engineering“ (Hoffmeister et al. 2002).
Ein gänzlich neuer Aspekt in Bezug auf die Akzeptorsubstratflexibilität zeigt sich in der
kürzlich gemachten Beobachtung, dass UrdGT2 nicht nur die C-glykosidische Bindung
während der Urdamycin-Biosynthese knüpfen kann, sondern auch eine O-glykosidische
Bindung am unnatürlichen Akzeptor Alizarin (1,2-Dihydroxyanthrachinon), wodurch 2-O-β-
D-Olivosyl-1,2-dihydroxyanthrachinon entsteht (Dürr et al. 2004). Diese ungewöhnliche
Substratflexibilität macht das Enzym zu einem interessanten Werkzeug in der
pharmazeutischen Chemie. Eine mögliche Anwendung ist die Umwandlung von Anthralin
und seiner 1,2-Dihydroxy-Derivate in die korrespondierenden C- oder O-Glykoside, um die
inflammatorische Wirkung dieser potenziellen Antipsoriatika abzumildern. Auch die beiden
Glykosyltransferasen OleG1 und OleG2 aus dem Oleandomycin-Biosynthesecluster erwiesen
sich bei Komplementationsstudien zwischen Streptomyces antibioticus und
Saccharopolyspora erythraea als aglykonflexibel (Doumith et al. 1999). Weitere interessante,
flexible Transferasen sind die Mtm-Glykosyltransferasen aus dem Mithramycin-Cluster
(speziell MtmGIII, die einen Transfer auf einen Ketozucker durchführt) (Remsing et al. 2002)
-48-
A EINLEITUNG
und DesVII, die Zucker auf Polyketide der 12er-Familie (Methymycin/Neomethymycin) und
der 14er-Familie (Pikromycin/Narbomycin) übertragen kann (Yamase et al. 2000; Borisova et
al. 1999). Auch EryCIII scheint eine gewisse Aglykonflexibilität zu besitzen, da neben dem
natürlichen Akzeptor Mycarosyl-Erythronolid B auch Erythronolid B, 3-O-Rhamnosyl-
Erythronolid B (REB) und 3-O-Rhamnosyl-6-Desoxyerythronolid B als Akzeptor fungieren
können (Salah-Bey et al. 1998; Doumith et al. 1999; Gaisser et al. 2000).
3.3 Die kombinatorische Biokatalyse als Werkzeug für die Produktion
von neuartig glykosylierten Naturstoffen Ein weiterer interessanter Ansatz für die Synthese von Desoxyzuckern und glykosylierten
Naturstoffen, z.B. Erythromycin-Derivaten, ist die kombinatorische Biokatalyse. Bei der
kombinatorischen Biokatalyse werden Enzyme aus verschiedenen Organismen (z. B.
Actinomyceten, Salmonellen, etc.) in vitro kombiniert eingesetzt, um neuartige Produkte
herzustellen. Dabei ergibt sich durch die vielfältigen Kombinationen und Variationen die
Möglichkeit, sowohl das in vitro Substratspektrum der einzelnen Biosyntheseenzyme, als
auch das der Naturstoff-Glykosyltransferasen zu untersuchen. Eine weitere interessante
Option ist der Einsatz von immobilisierten Enzymen, die z. B. an „MangetoBeads“ gekoppelt
sein können, um eine Art „Werkzeugkasten“ für die kombinatorische Biokatalyse aufzubauen.
Vorraussetzung für die kombinatorische Biokatalyse ist jedoch der präparative Zugang zu
aktiven Enzymen. In den vergangenen Jahren wurden auf dem Gebiet der kombinatorischen
Synthese der dTDP-aktivierten Desoxyzucker bereits einige Arbeiten publiziert (Oh et al.
2003; Stein et al. 1998; Günther 2000; Amann et al. 2001). Die Arbeiten von Stein et al. und
Günther et al. beschäftigten sich mit der Synthese der dTDP-6-Desoxy-4-keto-D-Glucose
ausgehend von dTMP/dTDP und Saccharose (Abbildung 20). Die Arbeiten von Oh et al. mit
der Synthese der dTDP-6-Desoxy-4-keto-D-Glucose ausgehend von dTMP und D-Glucose-1-
phosphat (Abbildung 33). Ein klarer Vorteil der Synthese ausgehend von Saccharose ist, dass
kein D-Glucose-1-phosphat erforderlich ist.
-49-
A EINLEITUNG
O
HOHO
OH
HOH2C
OdTDP
+ dTTP
O
HOOH
H3C
OdTDP
dTDP-Glucose-4,6-Dehydratase
O
HOHO
OH
HOH2C
OPO32-
OdTDPdTMP
+ PPi
dTDP-Glucose-Pyrophosphorylase
Acetat
Acetyphosphat
ATP ADP
AcetylphosphatAcetat
dTMP-Kinase
Acetatkinase
D-Glucose-1-phosphatdTDP-D-Glucose
dTDP-6-Desoxy-4-keto-D-glucose
Abb. 33: Präparative Synthese von dTDP-6-Desoxy-4-keto-D-Glucose ausgehend von dTMP
und D-Glucose-1-phosphat (Acetatkinase [EC 2.7.2.1]) (Oh et al. 2003).
Sowohl die Arbeiten von Oh et al., als auch die Arbeiten von Stein et al. und Günther
ermöglichen einen präparativen Zugang (>1 g) zum wichtigen Keto-Intermediat. Des
Weiteren zeigten die Arbeiten von Günther einen ersten Ansatz zur kombinatorischen
Produktion von dTDP-L-Rhamnose durch den Austausch der dTDP-4-Dehydrorhamnose-3,5-
Epimerase RmlC aus Salmonella enterica LT2 gegen die dTDP-6-Desoxy-4-ketoglucose
Epimerase DnmU aus Streptomyces peucetius (Günther 2000). Die Arbeiten von Amann et al.
beschäftigten sich mit der enzymatischen Synthese von dTDP-L-Olivose. Die Synthese des
Didesoxyzuckers erfolgte ausgehend von 2-Desoxy-D-Glucose-6-phosphat in mehreren
Schritten mit Hilfe von 5 verschiedenen Enzymen (Phosphoglucomutase, RmlA, RmlB,
RmlC und RmlD) mit einer Gesamtausbeute von 28,3 mg. Durch chemischen Reduktion der
6-Desoxy-4-keto-D-Glucose mit Natrium-Borhydrit (NaBH4) war es möglich dTDP-D-
Olivose und dTDP-D-Oliose in einem Verhältnis von 4:1 im kleinen Milligramm-Maßstab
herzustellen (Amann et al. 2001). Im Bereich anderer nukleotid-aktivierter Zucker sind
weitere Verfahren entwickelt worden, die mit isolierten Enzymen und mit gentechnisch
manipulierten Mikrorganismen in Ganzzell-Biotransformationsansätzen Oligosaccharide und
Nukleotidzucker im Multigramm-Maßstab zugänglich machen (Bülter und Elling 1999;
Elling 1997; Endo und Koizumi 2000; Koeller und Wong 2000). In allen Verfahren werden
Enzyme der Nukleotidzuckerbiosynthese und Glykosyltransferasen für die Synthese von
komplexen Kohlenhydraten genutzt. Der Hauptvorteil der kombinatorischen Biokatalyse
-50-
A EINLEITUNG
besteht darin, dass die Arbeiten im wässrigen Milieu durchgeführt werden können, und dass
die Stereo- bzw. Regiospezifität der einzelnen Enzyme für die Synthese ausgenutzt werden
kann ohne dass Schutzgruppen erforderlich sind. Durch die Kombinatorik ergibt sich die
Möglichkeit die Bandbreite der produzierbaren Zucker deutlich zu erhöhen, da unter den in
vitro Bedingungen der Austausch von einzelnen Enzymen vergleichsweise einfach ist. Ein
Nachteil des rein enzymatisch-kombinatorischen Ansatzes besteht allerdings darin, dass es
nicht möglich ist bestimmte funktionalisierte Gruppen, wie z. B. Azido-, Keto-, Amino-,
Acetamido- oder Thiol-Gruppen an eine beliebige Position des jeweiligen aktivierten
Desoxyzuckers einzuführen. Um dies zu erreichen ist in der Regel die chemische
Modifikation des jeweiligen Vorläufers des nukleotid-aktivierten Desoxyzuckers erforderlich
bzw. der Einsatz eines bereits chemisch modifizierten Nukleotiddesoxyzuckers (Amann et al.
2001). Das Hauptproblem bei der Manipulation der Vorläufermoleküle besteht jedoch darin,
dass der modifizierte Zucker chemisch an der anomeren Position phosphoryliert werden muss,
um im nächsten Schritt mit Hilfe einer Pyrophosphorylase und dTTP enzymatisch aktiviert zu
werden. Ob diese enzymatische Aktivierung gelingt, hängt jedoch stark von der
Substratspezifität der verwendeten Pyrophosphorylase ab. Ein gegenwärtig stark forcierter
Ansatz, der sich mit der Kombination der chemo-enzymatischen Herstellung von dTDP-
aktivierten Desoxyzucker-Bibliotheken und deren Anwendung in der enzymatischen Synthese
von neuartig glykosylierten Naturstoffen beschäftigt, ist der sog. „in vitro
glycorandomization“ (IVG) Ansatz von Thorson und Mitarbeitern (Barton et al. 2002;
Albermann et al. 2003; Hoffmeister et al. 2003b; Hoffmeister und Thorson 2004; Fu et al.
2003; Jiang et al. 2003; Thorson et al. 2004; Yang et al. 2003; Yang et al. 2004). Ein Ausweg
im Hinblick auf die Abhängigkeit von der Substratspezifität der Pyrophosphorylase bietet das
„active-site-engineering“ zur Herstellung von Mutanten mit einem veränderten oder
erweiterten Substratspektrum. Erste Erfolge konnten bereits verzeichnet werden, da mit
Mutanten der Pyrophosporylase RmlA aus Salmonella enterica neben dTDP-2-Desoxy-D-
Glucose auch die entsprechenden 3-, 4- und 6-Desoxy-Derivate umgesetzt werden konnten
(Thorson et al. 2004). Weitere Arbeiten im Rahmen der IVG beschäftigen sich mit der
Mutagenese einer Galactokinase aus Escherichia coli und einer Glucokinase aus
Lactobacillus lactis um die chemische Phosphorylierung an der anomeren Position durch eine
enzymatische Phosphorylierung zu ersetzen (Yang et al. 2003; Yang et al. 2004; Hoffmeister
und Thorson 2004). Dabei konnten bereits eine Reihe von Produkten hergestellt werden (L-
Glucose-1-phosphat, L-Altrose-1-phosphat, D-Galacturosäure-1-phosphat, 6-Amino-6-desoxy-
D-galactose-1-phosphat, D-Talose-1-phosphat, 4-Azido-D-galactose-1-phosphat und 4-
-51-
A EINLEITUNG
Desoxy-D-galactose-1-phosphat). Die dargestellten Ergebnisse zeigen deutlich das Potenzial
der vorgestellten Methoden, jedoch sind bis heute keine präparativen Synthesen einzelner
Verbindungen beschrieben. Diese Bibliothek bzw. Teile dieser Bibliothek an dTDP-
aktivierten Zuckern wurde im weiteren Verlauf der IVG mit den Glykosyltransferasen NovM
und GtfE auf Transfer getestet, um neue Aminocoumarin- und Vancomycin-Derivate
herzustellen (Albermann et al. 2003; Fu et al. 2003). Bei diesen Arbeiten hat sich gezeigt,
dass beide Glykosyltransferasen unnatürliche Zucker übertragen können und das GtfE eine
deutlich höhere Flexibilität besitzt als NovM. Mit Hilfe von GtfE ist es gelungen ein neues
monoglykosyliertes Vancomycin-Derivat herzustellen, das nach einer weiteren chemischen
Modifikation eine mit Vancomycin vergleichbare antibiotische Aktivität besitzt (Abbildung
34) (Fu et al. 2003). Besonders interessant ist die Tatsache, dass GtfE Azido-, Keto- und
Aminozucker und einen Thiozucker übertragen kann. Damit ist GtfE das Enzym mit der bis
heute größten, beschriebenen in vitro Substratflexibilität in Bezug auf das Donorsubstrat
(Nukleotidzucker).
O OClCl
OH
NH
NH
OHN
O
NH
ONH2O
O
HNO
NH
HO
HNHO
O
HO OHOH
O
O
O
HOHO OH
NN
N
O
HO
Abb. 34: Monoglykosyliertes Vancomycin-Derivat mit vergleichbarer Wirksamkeit wie
Vancomycin (Fu et al. 2003).
-52-
A EINLEITUNG
4 Das EU-Projekt „GENOVA“ Die vorliegende Arbeit wurde im Rahmen des EU-Projektes „GENOVA“ –„Glycosylation
Engineering for Novel Antibiotics“ – (QLK3-999-00095) angefertigt. Das zentrale Ziel des
Projekts „GENOVA“ bestand darin, neue Technologien für eine schnelle und verbesserte
Manipulation der Zuckerstrukturen von Makrolid-Antibiotika zu entwickeln. Innerhalb des
Projekts wurden fünf Arbeitsbereiche definiert, die von verschiedenen Gruppen bearbeitet
wurden. Der Projektverbund setzte sich aus folgenden Partnern zusammen: Prof. Dr. P. F.
Leadlay (Koordinator, Cambridge, England), Prof. Dr. A. Bechthold (Freiburg), Prof. Dr.
Piepersberg (Wuppertal), Dr. B. Wilkinson (GlaxoSmithKline (GSK), Stevenage, England),
Prof. Dr. L. Elling (Düsseldorf/Aachen), Dr. P. Caffrey (Dublin, Irland) und Prof. Dr. J. A.
Salas (Oviedo, Spanien).
Im Einzelnen wurden folgende Arbeitsbereiche definiert:
1. Klonierung und Charakterisierung der Biosynthesegene von verschiedenen 6-
Desoxyhexosen für die Verwendung in Biotransformationen oder für den Austausch
durch Gene aus heterologen Biosynthesewegen.
2. Expression der Biosynthesegene der verschiedenen 6-Desoxyhexosen mit
anschließender Aufarbeitung der Enzyme für den Einsatz in der in vitro Synthese
von aktivierten Desoxyzuckern.
3. Expression der verschiedenen Glykosyltransferasegene im Fermentationsmaßstab
mit anschließender Aufarbeitung der Enzyme für den Einsatz in der in vitro
Synthese von neuartig glykosylierten Makrolid-Antibiotika und für die
Charakterisierung bzw. Proteinkristallisation der Glykosyltransferasen.
4. Herstellung und Optimierung von Actinomyceten-Biotransformationsstämmen für die
hybride in vivo Glykosylierung durch das Zusammenbringen von Aglykonsubstraten,
klonierten Glykosyltransferasen und Multigenkassetten mit Zuckerbiosynthesegenen
(kombinatorische Biosynthese).
5. DNA-Shuffling zur Änderung und Optimierung von Glykosyltransferasespezifitäten.
Die Teilgebiete 2 und 3 wurden dabei im Rahmen von zwei parallelen Dissertationen in der
Arbeitsgruppe von Prof. Dr. L. Elling bearbeitet. Punkt 2 stellte den Schwerpunkt der Arbeit
von Herrn Dipl.-Chem. C. Rupprath dar und Punkt 3 den Schwerpunkt dieser Arbeit. Das Ziel
der eng angelegten Kooperation beider Arbeiten bestand darin neue dTDP-aktivierte
Desoxyzucker zu produzieren und diese mit Hilfe der rekombinanten Glykosyltransferasen
-53-
A EINLEITUNG
zur exemplarischen in vitro Synthese neuartig glykosylierter Makrolid-Antibiotika zu nutzen.
Vor diesem Hintergrund stand die gemeinsame Entwicklung eines neuartigen, flexiblen
Enzym-Modul-Systems (EMS) zur kombinatorischen Biokatalyse im Vordergrund. Das zu
etablierende EMS sollte dabei die Produktion der hybriden Makrolide mit der Bereitstellung
und der in situ Regeneration der erforderlichen dTDP-aktivierten Desoxyzucker vereinen.
Grundlage für das EMS waren dabei zum einen die Arbeiten von Zervosen und Elling (in situ
Regeneration von Nukleotidzuckern) (Zervosen und Elling 1996) und zum anderen die
Arbeiten von Stein et al. bzw. Günther (Produktion von dTDP-6-Desoxy-4-keto-D-Glucose
und dTDP-L-Rhamnose) (Stein et al. 1998; Günther 2000). Funktionell gliedert sich das EMS
in drei Module, das SuSy-Modul (A) zur Bereitstellung der dTDP-D-Glucose, das
Desoxyzucker-Modul (B) zur Produktion des jeweiligen Desoxyzuckers und das
Glykosyltransferase-Modul (C) für den abschließenden Transfer des Desoxyzuckers auf den
Akzeptor (Abbildung 35). Als preiswerte Quelle für die Bereitstellung der nukleotid-
aktivierten Desoxyzucker sollte dabei Saccharose dienen.
O
HOHO
OH
HOH2C
OO
HOHO
OH
HOH2C
OdTDP
O
HO
HO
HO
OH
SuSy
O
HOOH
H3C
OdTDP
O
O
O
O
OH
OHO
O
O
O
O
O
O
dTDP +
D- und L-Desoxy-zucker
GT+ dTDP
A
B
C
Saccharose dTDP-D-Glucose
dTDP-6-Desoxy-4-keto-D-glucose
Aglykon/Akzeptor
Hybrides Makrolid
Abb. 35: Enzym-Modul-System (EMS) zur Produktion von neuartig glykosylierten
Antibiotika/Naturstoffen durch kombinatorische Biokatalyse. SuSy: Sucrose Synthase, GT:
Glykosyltransferase.
-54-
A EINLEITUNG
Die in Modul A mit Hilfe von SuSy 1 (Römer et al. 2004) und dTDP aus Saccharose
hergestellte dTDP-Glucose kann mit einer Dehydratase (RmlB aus Salmonella enterica LT2;
Stein et al. 1998) weiter zur dTDP-6-Desoxy-4-keto-Glucose umgesetzt werden, welche dann
im Desoxyzucker-Modul (B) durch den Einsatz von verschiedenen Desoxyzucker
modifizierenden Enzymen (Transaminasen, Reduktasen, Methyltransfeasen) zur Synthese
komplexer dTDP-aktivierter D- und L-Desoxyzucker (z. B. dTDP-L-Rhamnose, dTDP-L-
Olivose, dTDP-D-Desosamin, dTDP-L-Mycarose, dTDP-D-Mycaminose) verwendet werden
kann. Das durch die Transferreaktion im Glykosyltransferase-Modul (C) freiwerdende dTDP
kann erneut im SuSy-Modul (A) zur Spaltung von Saccharose dienen. Das hier vorgestellte
Enzym-Modul-System bietet eine sehr hohe Flexibilität in Bezug auf das Desoxyzucker-
Modul (B) bzw. das Glykosyltransferase-Modul (C) und schließt die in situ Regeneration des
primären Nukleotidzuckers ein. Durch Variation von einzelnen Enzymen könnten sowohl
unterschiedlich glykosylierte Produkte hergestellt, als auch in vitro Untersuchungen zum
Substratspektrum der Glykosyltransferasen und der Biosyntheseenzyme durchgeführt werden.
Aus diesem Grund stellt das Enzym-Modul-System (EMS) eine hochaktuelle und sehr
interessante Alternative zum „in vitro glycorandomization“ Ansatz (IVG) von Thorson und
Mitarbeitern dar (Thorson et al. 2004, Hoffmeister und Thorson 2004, Fu et al. 2003). Die im
Rahmen dieser Arbeit durchgeführten Versuche bzgl. des EMS konzentrierten sich dabei
darauf das Glykosyltransferase-Modul (C) zu etablieren und mit den beiden anderen Modulen
(A und B) zu verbinden.
-55-
A EINLEITUNG
5 Zielsetzung der Arbeit
Für die Etablierung des Glykosyltransferase-Moduls (C) im Enzym-Modul-System (EMS)
und für die in vitro Synthese von hybriden Makroliden ist ein präparativer Zugang zu den
Makrolid-Glykosyltransferasen Voraussetzung. Zu diesem Zweck wurden im Rahmen des
EU-Projekts verschiedene Saccharopolyspora erythraea Stämme konstruiert, die eine
rekombinante Expression der einzelnen Makrolid-Glykosyltransferasen ermöglichten. Im
Einzelnen handelte es sich dabei um folgende Stämme: Saccharopolyspora erythraea (NRRL
2338; red variant) pEXCIII (EryCIII, Desosaminyltransferase), pEXBV (EryBV,
Mycarosyltransferase), pSGOleG2 (OleG2, Olivosyltransferase) und pSGTylMII (TylMII,
Mycaminosyltransferase) (Prof. Dr. Leadlay/Dr. S. Gaisser, Cambridge University, England).
Ferner sind für den gezielten Einsatz der Glykosyltransferasen in der kombinatorischen
Biokatalyse Informationen über die protein- und biochemischen Eigenschaften der Enzyme
von entscheidender Bedeutung. Vor diesem Hintergrund ergaben sich für die Arbeit folgende
Schwerpunkte:
1. Kultivierung der rekombinanten Saccharopolyspora erythraea Stämme im
Fermentationsmaßstab bis 30 L zur Expression der verschiedenen
Glykosyltransferasegene.
2. Entwicklung einer effizienten, skalierbaren Aufreinigungsstrategie zur Produktion von
hochreinem Enzym für proteinchemische, biochemische und proteinkristallographische
Zwecke.
3. Protein- und biochemische Charakterisierung der einzelnen Glykosyltransferasen,
insbesondere von EryCIII und in vitro Synthese neuartiger Makrolid-Antibiotika.
4. Etablierung des Glykosyltransferase-Moduls (C) im Enzym-Modul-System (EMS) und
Verbindung des Glykosyltransferase-Moduls mit dem SuSy-Modul (A) und dem
Desoxyzucker-Modul (B).
5. Untersuchungen zur Immobilisierung einer Makrolid-Glykosyltransferase und
katalytische Nutzung des immobilisierten Enzyms.
Die vordringlichste Aufgabe zu Beginn der Arbeit bestand darin, ein geeignetes
Fermentationsprotokoll zur Produktion der Makrolid-Glykosyltransferasen in einem größeren
Maßstab zu entwickeln, da die verschiedenen Expressionsstämme bis zur Anfertigung dieser
Arbeit ausschließlich im Schüttelkolbenmaßstab kultiviert wurden. Als
Fermentationsvolumina wurden sowohl 10 L als auch 30 L eingesetzt. Nach der erfolgreichen
-56-
A EINLEITUNG
Expression der Transferasen sollte eine skalierbare Aufreinigungsstrategie etabliert werden,
um zum einen Protein mit ausreichender Reinheit für die biochemischen Untersuchungen der
Enzyme zu gewinnen (Ionenaustauscher- bzw. IMAC-Reinheit) und zum anderen um
hochreines Protein für die angestrebte Proteinkristallisation zu produzieren. Im
Zusammenhang mit der Produktion der Nukleotidzucker eröffnet die Expression und
Aufreinigung der Makrolid-Glykosyltransferasen im größeren Maßstab erstmals die
Möglichkeit, die entsprechenden Makrolid-Glykosyltransferasen umfangreich unter in vitro
Bedingungen zu charakterisieren. Zu den wesentlichen Aufgaben bei der biochemischen
Charakterisierung gehörten u. a. Untersuchungen zum Akzeptor- (Makrolid) bzw.
Donorsubstratspektrum (Nukleotidzucker) und die Bestimmung der enzymkinetischen
Konstanten Vmax und Km. Für diesen Zweck musste zunächst ein geeigneter Enzymtest für die
bakteriellen Glykosyltransferasen etabliert und die enzymatische Aktivität der exprimierten
Glykosyltransferasen nachgewiesen werden. Für die biochemische Charakterisierung der
Glykosyltransferasen stand eine Reihe von interessanten Akzeptorsubstraten zu Verfügung,
aber, mit Ausnahme von dTDP-D-Desosamin, vergleichsweise wenige Nukleotidzucker. Aus
diesem Grund konzentrierten sich die biochemischen Untersuchungen weitestgehend auf
EryCIII.
-57-
B ERGEBNISSE UND DISKUSSION
B Ergebnisse und Diskussion
1 Kultivierung und Proteinproduktion 1.1 Kultivierung der Actinomyceten 1.1.1 Actinomyceten-Expression der Glykosyltransferasegene Die Proteinexpression erfolgte in erster Linie in Saccharopolyspora erythraea. Bei den
verwendeten Expressionsstämmen handelt es sich um spezielle Stämme, bei denen neben den
beiden stammeigenen Glykosyltransferasegenen eryCIII und eryBV auch die eryAI - eryAIII
Gene der 6-Desoxyerthronolid B-Synthase deletiert waren und die komplette Biosynthese von
Erythromycin A ausgeschaltet wurde (Gaisser et al. 2000). Durch Transformation von
Saccharopolyspora erythraea mit den entsprechenden Vektoren für eryCIII, eryBV, oleG2
und tylMII (pSG142-Derivate) wurden alle vier rekombinanten, mit einem C-terminalen His6-
Tag versehen Glykosyltransferasegene in den Stamm eingebracht, und über Rekombination
ins Genom integriert. Dieser Schritt war erforderlich, da die Vektoren in Saccharopolyspora
erythraea nicht autonom replizieren können. Die Expression erfolgte unter der Kontrolle
eines Actinorhodinpromotors (actI), der in der stationären Wachstumsphase auf Sucrose-
Succinat-Medium (Caffrey et al. 1992) induziert wird. Als Selektionsmarker diente
Thiostrepton. Die Konstruktion der Vektoren ist in den Arbeiten von Rowe et al. 1998 und
Gaisser et al. 2000 ausführlich beschrieben. Weiterhin standen aus dem EU-Vorgängerprojekt
„HYGLIDE“ noch zwei andere rekombinante Streptomyceten-Stämme zur Verfügung, welche
die beiden Gene eryCIII und oleG2 heterolog und ohne Affinitätstag exprimierten. Die
Induktion der Expression von eryCIII erfolgt bei Streptomyces lividans über Thiostrepton,
welches dem Medium zugesetzt wird, da die Expression unter der Kontrolle des
Pristinamycin Resistenzpromotors (ptr) steht. Die Expression von oleG2 in Streptomyces
albus erfolgt ohne Induktion, da das Gen unter der Kontrolle des konstitutiven ermE
Promotors (Erythromycin-Resistenz) exprimiert wurde. Tabelle 8 fasst die Ergebnisse der
verschiedenen Fermentationen zusammen, die zur Produktion der unterschiedlichen
Glykosyltransferasen durchgeführt wurden.
-58-
B ERGEBNISSE UND DISKUSSION
Tab. 8: Zusammenfassung der Ergebnisse der verschiedenen Fermentationen der
Expressionsstämmen zur Produktion der rekombinanten Makrolid-Glykosyltransferasen.
Nummer Stammbezeichnung Kulturvolumen Medium a Ausbeute b
1 Sacc. erythraea pEXCIII 10 L Sucrose-Succinat 90 g
2 Sacc. erythraea pEXCIII 10 L Sucrose-Succinat 180 g
3 Sacc. erythraea pEXCIII 10 L Maltose-Glutamat 404 g
4 Sacc. erythraea pEXCIII 30 L Sucrose-Succinat 481 g
5 Sacc. erythraea pEXBV 10 L Sucrose-Succinat 110 g
6 Sacc. erythraea pSGOleG2 10 L Sucrose-Succinat 415 g
7 Sacc. erythraea
pSGTylMII
10 L Sucrose-Succinat 250 g
8 S. lividans EryCIII 10 L TSB 750 g
9 S. albus OleG2 10 L TSB 780 g a = Bei allen Fermentationen enthielt das Medium 25 mg/L Thiostrepton, außer bei Fermentation Nummer 9.
b = Die Mengenangaben verstehen sich als Gramm Biofeuchtmasse.
Sacc. erythraea: Saccharoployspora erythraea, S.: Streptomyces
Die Ergebnisse zeigen, dass die verschiedenen Expressionsstämme mit recht
unterschiedlichen Ausbeuten erfolgreich fermentiert werden konnten. Deutlich ist der
Unterschied zwischen den verwendeten Minimalmedien (Sucrose-Succinat-Medium und
Maltose-Glutamat-Medium) und dem TSB-Komplexmedium zu erkennen. Beide
Minimalmedien führten erwartungsgemäß zu einer deutlich geringeren Biomasseausbeute als
das Komplexmedium. Im Durchschnitt wurde auf TSB-Medium 2 - 5 Mal mehr Zellmasse
gewonnen als auf den Minimalmedien. Die vergleichsweise hohe Ausbeute bei Fermentation
Nr. 6 ist auf eine unzureichende Abtrennung der Biomasse zurückzuführen. Abbildung 36
und 37 zeigen anhand der während der Fermentation kontinuierlich aufgenommenen Daten
den graphisch dargestellten Fermentationsverlauf einer typischen Sacc. erythraea
Fermentation auf Sucrose-Succinat-Medium (Fermentation Nr. 1) und den typischen Verlauf
einer S. lividans Fermentation auf TSB-Medium (Fermentation Nr. 8).
-59-
B ERGEBNISSE UND DISKUSSION
pO2-Wert
Laugenzufuhr
Rührerdrehzahl
Säurezufuhr
Belüftungsrate
pO2-Wert
Laugenzufuhr
Rührerdrehzahl
Säurezufuhr
Belüftungsrate
Abb. 36: Fermentationsverlauf der Fermentation von Sacc. erythraea pEXCIII auf Sucrose-
Succinat-Medium (Fermentation Nr. 1).
Die Y-Achsen der Diagramme geben den Sauerstoffpartialdruck (pO2-Wert) in Prozent an,
die X-Achsen den zeitlichen Verlauf der Fermentationen. Die Rührerdrehzahl wurde in
Umdrehungen pro Minute (Upm) gemessen, die Belüftungsrate in Normlitern pro Minute
(NL/min). Die Regelung des Sauerstoffpartialdrucks (Grenzwert: pO2 ≤ 30%) erfolgte
dynamisch über die Rührerdrehzahl und die Belüftungsrate.
pO2-Wert
Rührerdrehzahl
Belüftungsrate
pO2-Wert
Rührerdrehzahl
Belüftungsrate
Abb. 37: Fermentationsverlauf der Fermentation von S. lividans EryCIII auf TSB-Medium
(Fermentation Nr. 8).
-60-
B ERGEBNISSE UND DISKUSSION
Wie der direkte Vergleich der beiden Fermentationen deutlich zeigt, erfolgte das Wachstum
der S. lividans Kultur auf TSB-Medium wesentlich schneller als das der Sacc. erythraea
Kultur auf Sucrose-Succinat-Medium (Abbildung 36 und 37). Dies zeigte sich zum einen in
der wesentlich langsameren Abnahme des Sauerstoffpartialdrucks über den
Fermentationsverlauf und darin, dass über den gesamten Verlauf der Sacc. erythraea
Fermentation keine Regulation des Sauerstoffpartialdrucks (pO2) erforderlich wurde
(Grenzwert 30% Sauerstoffsättigung). Das stärkere Wachstum der S. lividans Kultur auf TSB-
Medium hingegen spiegelt sich u. a. darin wieder, das vergleichsweise schnell eine
Regulation des pO2 notwendig wurde. Die permanente Laugenzufuhr bei der Sacc. erythraea
Fermentation (Abbildung 36) ist auf den konstanten Succinat-Verbrauch während der
Fermentation zurückzuführen.
Abschließend kann an dieser Stelle festgehalten werden, dass die Kultivierung der
Actinomyceten erfolgreich vom Schüttelkolbenmaßstab in den Fermentationsmaßstab
überführt wurde. Dadurch stand ausreichend Zellmasse für alle weiteren Versuche zur
Verfügung (Kap. B 2 - 4). Die Fermentationsbedingungen gewährleisteten sowohl eine
optimale Belüftung der verschiedenen Kulturen als auch eine effiziente Kontrolle der
Myzelgröße.
-61-
B ERGEBNISSE UND DISKUSSION
2 Proteinaufreinigung Nach der Fermentation der verschiedenen Expressionsstämme wurde mit den Arbeiten zur
Entwicklung der skalierbaren Aufreinigungsstrategie begonnen. Dazu wurden zunächst alle
Saccharopolyspora erythraea Fermentationen durch Immunoblotting auf Expression des
jeweiligen Glykosyltransferasegens (eryCIII, eryBV, oleG2 und tylMII) hin untersucht. Zu
diesem Zweck wurden Rohextrakte der verschiedenen Expressionsstämme mit identischen
Proteingehalten (15 mg/ml) hergestellt und über das SpinColumn-System der Firma Qiagen
aufgereinigt (Kap. E 2.3.2). Nach der Elution wurden die Proben auf zwei SDS-PAGE-Gele
aufgetragen und durch Immunoblotting analysiert (Abbildung 38) (Kap. E 6.7.1).
100 kDa
75 kDa
50 kDa
37 kDa
25 kDa
RE DL W El MW RE DL W El RE MW DL W El RE DL W El
EryBV EryCIII OleG2 TylM2
100 kDa
75 kDa
50 kDa
37 kDa
25 kDa
RE DL W El MW RE DL W El RE MW DL W El RE DL W El
EryBV EryCIII OleG2 TylM2
Abb. 38: Immunchemische Überprüfung der Expression von eryCIII, eryBV, oleG2, tylMII
und Untersuchung des Aufreinigungsverhaltens an Ni2+-NTA-Material. MW:
Molekulargewichtsstandard (All blue prestained Precision Plus Protein, Bio-Rad), RE:
Rohextrakt, DL: Durchlauf, W: Waschschritt, El: Elution. Als Basispuffer diente ein 50 mM
NaH2PO4, pH 8 mit 300 mM NaCl, 5 mM MgCl2 und 10 mM Imidazol. Von den Rohextrakt-
und Durchlaufproben wurden je 15 µg Protein pro Spur und von den Wasch- und
Elutionsproben je 5 µg Protein pro Spur aufgetragen.
Die Kontrolle der Expression zeigte, dass alle rekombinanten Glykosyltransferasegene
erfolgreich in Sacc. erythraea exprimiert wurden. Jedoch zeichneten sich deutliche
Unterschiede im Expressionsniveau der einzelnen Transferasegene, besonders zwischen
eryCIII/eryBV und oleG2/tylMII, ab. Dies könnte darauf zurückzuführen sein, dass es sich bei
der Expression von eryCIII und eryBV um eine homologe Überexpression in Sacc. erythraea
-62-
B ERGEBNISSE UND DISKUSSION
handelt und bei oleG2 bzw. tylMII im Gegensatz dazu um eine heterologe Überexpression.
Weiterhin belegt das vorliegende Ergebnis, dass alle Enzyme über IMAC aufgereinigt werden
konnten, und dass es scheinbar Unterschiede im Aufreinigungs- bzw. Bindungsverhalten an
Ni2+-NTA gibt. Zur weiteren Identifikation der Proteine wurden anhand des Immunoblots
(Abbildung 38) die relativen Molmassen der rekombinanten Glykosyltransferasen bestimmt
und mit theoretischen Daten verglichen (Kap. E 3.1.2 und 5.1) (Tabelle 9). Alle Angaben
beziehen sich auf Proteine in monomerer Form, ohne His6-tag.
Tab. 9: Vergleich zwischen experimentell ermittelten und berechneten Daten für die
Molmassen der rekombinanten Glykosyltransferasen.
Enzym Relative Molmassen, abgeleitet
aus Immunoblot
Theoretische Molmassen, abgeleitet
aus Aminosäuresequenza
EryCIII 49794 Da 45929 Da
EryBV 48417 Da 45563 Da
OleG2 47480 Da 46006 Da
TylMII 51622 Da 48660 Da a = Zugangsnummern der ExPasy-Datenbank (www.expasy.org): EryCIII: O54224, EryBV: O33939; OleG2:
O87831; TylMII: P95747.
Im Anschluss an den Expressionsnachweis wurde eine erste semi-präparative IMAC (Kap. E
2.3.1) mit Sacc. erythraea pEXCIII-Rohextrakt durchgeführt. Ziel des Versuchs war die
Untersuchung des Reinheitsgrades einer direkt aus Rohextrakt heraus über Ni2+-NTA
aufgereinigten EryCIII Präparation. Nach der Beladung mit der Probe wurde die Säule mit 20
mM Imidazol gewaschen und die gebundenen Proteine mit 250 mM Imidazol eluiert. Der
Proteingehalt der Fraktionen wurde nach Bradford (1976) (Kap. E 6.6) bestimmt und
geeignete Aliquots auf ein SDS-PAGE-Gel (Kap. E 6.7.2) aufgetragen (Abbildung 39).
-63-
B ERGEBNISSE UND DISKUSSION
7 8 9 10 11 12 13 14 MW 15 16 17 18 19 20 21
100 kDa
75 kDa
50 kDa
37 kDa
25 kDa
7 8 9 10 11 12 13 14 MW 15 16 17 18 19 20 21
100 kDa
75 kDa
50 kDa
37 kDa
25 kDa
EryCIII
~30 kDa
Abb. 39: SDS-PAGE-Gel der Ni2+-NTA Aufreinigung von EryCIII direkt aus Rohextrakt.
MW: Molekulargewichtsstandard (Prestained Precision Protein, Bio-Rad), 7 – 21:
Fraktionsnummern der Elution. Säulenvolumen: 15 ml, Auftragsvolumen Rohextrakts: 10 ml
(Proteingehalt: 16,8 mg/ml), Puffer: 50 mM NaH2PO4, pH 8 mit 300 mM NaCl, 5 mM MgCl2
und 10 mM Imidazol.
Das Ergebnis der SDS-PAGE-Analyse zeigt, dass neben EryCIII noch drei weitere
Fremdproteine (~60 kDa, ~30 kDa und >25 kDa) in nennenswerten Mengen eluiert wurden
(Abbildung 39). Somit stand fest, dass ein alleiniger IMAC Aufreinigungsschritt nicht
ausreichte, um hochreines Protein für die Proteinkristallisation zu gewinnen. Bei der späteren
Charakterisierung des Enzymtests (Kap. B 3.1.3) hat sich gezeigt, dass eine derartige IMAC
Präparation jedoch frei von störenden Nebenaktivitäten (z. B. Phosphatasen) ist und daher für
die biochemische Charakterisierung von EryCIII eingesetzt werden konnte. In Bezug auf das
Fremdprotein mit einer relativen Molmasse von ca. 30 kDa bleibt an dieser Stelle
festzuhalten, dass es bei der weiteren Entwicklung der Aufreinigungsstrategie eine wichtige
Rolle spielte (Kap. B 2.2.1). Aufgrund des IMAC Ergebnisses mit EryCIII Rohextrakt
wurden für die weitere Entwicklung der Aufreinigungsstrategie zunächst die theoretischen pI-
Werte der rekombinanten Transferasen anhand der bekannten Aminosäuresequenzen
berechnet. Dabei zeigte sich, dass alle Transferasen einen pI-Wert im Bereich von 4,8 – 6,3
besitzen (EryCIII: 4,86, EryBV: 5,29, OleG2: 6,23, TylMII: 5,70). Das Ergebnis dieser
Berechnungen führte zur Implementierung einer Anionenaustauschchromatographie in die
Aufreinigungsstrategie (Kap. B 2.1.1).
-64-
B ERGEBNISSE UND DISKUSSION
2.1 Anionaustauschchromatographie 2.1.1 Chromatographie an Q-Sepharose 6 FF Nach der Herstellung des Rohextrakts durch Ultraschallaufschluss wurde die Q-Sepharose 6
FF-Säule mit der Probe beladen. Die Elution der gebundenen Proteine erfolgte durch einen
linearen Salzgradienten von 200 – 1000 mM NaCl (Abbildung 40).
Abb. 40: Chromatogramm der semi-präparativen Q-Sepharose 6 FF Aufreinigung von
EryCIII. A: Beginn des Gradienten mit 200 mM NaCl, B: Ende des Gradienten mit 1000 mM
NaCl, 10 – 80: Fraktionsnummern der Elution, (1), (2) und (3): Hauptfraktionen der Elution.
Säulenvolumen: 15 ml, Auftragsvolumen des Rohextraktes: 10 ml (Proteingehalt 21,3
mg/ml), Puffer: 50 mM NaH2PO4, pH 8 mit 200 mM NaCl und 5 mM MgCl2.
Das Chromatogramm der Aufreinigung zeigt, dass die Elution in drei Hauptfraktionen ((1),
(2) und (3)) erfolgte, ohne dass jedoch unter den gewählten Chromatographiebedingungen
eine Basislinientrennung der drei Fraktionen erreicht wurde. Aufgrund der Substratlimitierung
für enzymatische Tests und der Verdünnung der EryCIII Probe durch die Chromatographie
wurden die Fraktionen nicht auf enzymatische Aktivität getestet, sondern durch SDS-PAGE
(Abbildung 41) und Immunoblotting (Abbildung 42) (Kap. E 6.7.2) analysiert.
-65-
B ERGEBNISSE UND DISKUSSION
16 19 22 25 28 31 34 37 40 43 46 49 MW 52 55 58 61 64
100 kDa
75 kDa
50 kDa
37 kDa
25 kDa
16 19 22 25 28 31 34 37 40 43 46 49 MW 52 55 58 61 64
100 kDa
75 kDa
50 kDa
37 kDa
25 kDa
Gradient
Abb. 41: SDS-PAGE-Gel der Q-Sepharose Aufreinigung von EryCIII. Säulenvolumen: 15
ml, Auftragsvolumen des Rohextrakts: 10 ml (Proteingehalt: 21,3 mg/ml), Puffer: 50 mM
NaH2PO4, pH 8 mit 200 mM NaCl und 5 mM MgCl2. Elution von 200 – 1000 mM NaCl.
MW: Molekulargewichtsstandard (Prestained Precision Protein, Bio-Rad), 16 – 64:
Fraktionsnummern der Elution.
Die schon auf dem Chromatogramm (Abbildung 40) zu erkennende Elution in drei
Hauptfraktionen zeichnete sich auch bei der SDS-PAGE-Analyse ab. Auffällig ist, dass in den
ersten Fraktionen (16 – 31) überwiegend Proteine mit einer niedrigen bis mittleren Molmasse
eluierten (ca. 20 – 40 kDa) und im weiteren Verlauf der Elution (Fraktion 34 – 46) primär ein
Hauptprotein mit einer höheren Molmasse (ca. 60 kDa). Trotz des vergleichbaren UV-Signals
von Peak (1) und (2) ließen sich sowohl durch die Proteinbestimmung nach Bradford (1976)
(Kap. E 6.6) als auch durch die SDS-PAGE-Analyse (Abbildung 41) keine nennenswerten
Proteinmengen in den entsprechenden Fraktionen nachweisen. Aufgrund der vorliegenden
Analyse und der zuvor bestimmten relativen Molmasse von EryCIII (Tabelle 9) lag daher die
Vermutung nahe, dass EryCIII im Bereich der Fraktionen 16 – 31 (siehe Markierung in
Abbildung 41) eluiert wurde. Um diese Annahme zu bestätigen, wurde eine
immunchemische Analyse (Kap. E 6.7.2) der Aufreinigung durchgeführt (Abbildung 42).
-66-
B ERGEBNISSE UND DISKUSSION
16 19 22 25 28 31 34 37 40 43 46 49 MW 52 55 58 61 64
75 kDa
50 kDa
37 kDa
25 kDa
16 19 22 25 28 31 34 37 40 43 46 49 MW 52 55 58 61 64
75 kDa
50 kDa
37 kDa
25 kDa
I
Abb. 42: Immunoblot der Q-Sepharose Aufreinigung von EryCIII. Säulenvolu
Auftragsvolumen des Rohextrakts: 10 ml (Proteingehalt: 21,3 mg/ml), Puff
NaH2PO4, pH 8 mit 200 mM NaCl und 5 mM MgCl2. Elution von 200 – 1000
MW: Molekulargewichtsstandard (Prestained Precision Protein, Bio-Rad),
Fraktionsnummern der Elution.
Der Immunoblot zum Nachweis des His6-tags von EryCIII hat die zuvo
Vermutung, dass EryCIII in den ersten Fraktionen eluiert wurde, bestätigt. Wie
erkennen ist, wurde das aufgetragene Enzym in den Fraktionen 16 bis 49
Hauptteil des eluierten Proteins machten dabei die Fraktionen 22 – 40 aus. Ein V
dem Chromatogramm der Aufreinigung (Abbildung 40) zeigt, dass der größ
EryCIII im Bereich der abfallenden Flanke des ersten Hauptpeaks ((1)) eluiert
entspricht einer NaCl Konzentration von 250 – 500 mM. Nach Beendigung d
wurden die Fraktionen 16 – 46 für die nachfolgenden IMAC vereinigt. Zusätzlic
Versuch unternommen die Anionenaustauschchromatographie als Feinreinigung
vorhergehender IMAC zu etablieren. Dazu wurden im ersten Schritt 10
Rohextrakt über IMAC gereinigt (Kap. E 2.3.1) und der Pool anschließend auf ei
Sepharose 6 FF-Säule aufgetragen. Wie das Ergebnis dieser Aufreinigung zeigt
IMAC-Probe in verschiedene Proteinfraktionen aufgetrennt, jedoch gelang es
diese Abfolge der Reinigungsschritte nicht EryCIII homogen darzustellen (
gezeigt).
-67-
EryCII
men: 15 ml,
er: 50 mM
mM NaCl.
16 – 64:
r getroffene
deutlich zu
eluiert. Den
ergleich mit
te Teil von
wurde. Dies
er Analysen
h wurde der
sschritt nach
ml EryCIII
ne kleine Q-
e, wurde die
auch durch
Daten nicht
B ERGEBNISSE UND DISKUSSION
2.2 Immobilisierte Metallionenaffinitätschromatographie 2.2.1 Chromatographie an Ni2+-NTA Nach der Vorreinigung von EryCIII über Q-Sepharose 6 FF (Kap. B 2.1.1) wurden die
vereinigten Fraktionen der Anionaustauschchromatographie auf eine kleine Ni2+-NTA Säule
aufgetragen, die Säule mit 20 mM bzw. 40 mM Imidazol gewaschen und die gebundenen
Proteine mit 250 mM Imidazol eluiert (Abbildung 43). Das Ziel des Versuchs war die
Darstellung von homogen aufgereinigtem EryCIII durch die Kombination der beiden
unterschiedlichen Chromatographieverfahren.
Durchlauf
20 mMImidazol
40 mMImidazol
250 mMImidazol
Waschschritte
Elution
10 20 30 Durchlauf
20 mMImidazol
40 mMImidazol
250 mMImidazol
Waschschritte
Elution
10 20 30
Abb. 43: Chromatogramm der Ni2+-NTA Aufreinigung von EryCIII nach vorheriger
Aufreinigung über Q-Sepharose 6 FF. 10 – 30: Fraktionsnummern der Elution.
Säulenvolumen: 30 ml, Auftragsvolumen des Q-Sepharose-Pools: 42,5 ml (Proteingehalt:
0,96 mg/ml), Puffer: 50 mM NaH2PO4, pH 8 mit 300 mM NaCl, 5 mM MgCl2 und 10 mM
Imidazol.
Wie das Chromatogramm zeigt, wurde der größte Teil der aufgetragenen Probe
erwartungsgemäß im Durchlauf ausgewaschen, da es sich bei der IMAC um eine
vergleichsweise selektive Affinitätschromatographie handelt. Weiterhin ist zu erkennen, dass
bei beiden nachfolgenden Waschschritten (20 mM Imidazol und 40 mM Imidazol) Protein in
-68-
B ERGEBNISSE UND DISKUSSION
sehr geringen Mengen eluiert wurde. Zu Beginn der Elution mit 250 mM Imidazol ist ein
starker Anstieg in der UV-Absorption zu sehen, der nach kurzer Zeit und einer minimalen
Abnahme der UV-Absorption in ein Plateau übergeht. Dies liegt zum einen an der starken
Eigenabsorption des Imidazols im UV-Spektrum und zum anderen an der Elution des
Zielproteins. Proteinbestimmungen nach Bradford (1976) (Kap. E 6.6) zeigten, dass der
größte Teil des Proteins in den Fraktionen 10 bis 20 eluiert wurde. Aufgrund der
Substratlimitierung für enzymatische Tests wurden auch diese Fraktionen nicht auf Aktivität
getestet, sondern durch SDS-PAGE (Kap. E 6.7.2) analysiert (Abbildung 44).
W1 W2 MW 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 MW 16 17 18 19
100 kDa
75 kDa
50 kDa
37 kDa
25 kDa
W1 W2 MW 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 MW 16 17 18 19
100 kDa
75 kDa
50 kDa
37 kDa
25 kDa
EryCIII
Abb. 44: SDS-PAGE-Gel der Ni2+-NTA Aufreinigung von EryCIII nach
Aufreinigung über Q-Sepharose 6 FF. Säulenvolumen: 30 ml, Auftragsvolu
Sepharose-Pools: 42,5 ml (Proteingehalt: 0,96 mg/ml), Puffer: 50 mM NaH2PO
300 mM NaCl, 5 mM MgCl2 und 10 mM Imidazol. MW: Molekulargewi
(Prestained Precision Protein, Bio-Rad), W1: Waschschritt mit 20 mM Im
Waschschritt mit 40 mM Imidazol; 6 – 19: Fraktionsnummern der Elution.
Das Ergebnis der SDS-PAGE-Analyse des Versuchs belegt, dass es mit der S
Anionenaustauschchromatographie und IMAC möglich war, eine fast homog
Präparation herzustellen. Die noch nachweisbaren Fremdproteine besaßen überw
niedrigere Molmasse als EryCIII. Der Vergleich mit dem Ergebnis der IMAC A
von EryCIII aus Rohextrakt heraus (Abbildung 39) macht deutlich, dass mit A
Verunreinigungen im Molekulargewichtsbereich von ca. 30 kDa, praktisch all
aufgereinigten Fremdproteine abgetrennt wurden. Somit bleibt im Ergebnis festzu
-69-
~30 kDa
vorheriger
men des Q-
4, pH 8 mit
chtsstandard
idazol, W2:
trategie aus
ene EryCIII
iegend eine
ufreinigung
usnahme der
e zuvor mit
halten, dass
B ERGEBNISSE UND DISKUSSION
eine der IMAC vorangehende Anionenaustauschchromatographie mit Q-Sepharose 6 FF, zu
einer deutlich homogeneren Darstellung von EryCIII durch Ni2+-NTA führt, als eine IMAC
mit Rohextrakt. Um EryCIII zur exemplarischen Zwecken homogen darzustellen und um
gleichzeitig das bis zum Zeitpunkt dieser Arbeit unbekannte native Molekulargewicht von
EryCIII zu bestimmen, wurde im Rahmen einer präparativen Aufreinigung von EryCIII über
Anionenaustausch und IMAC (Kap. B 2.3) eine semi-präparative Gelfiltration an Superdex
G200 (Kap. B 2.4.1) durchgeführt.
2.3 Präparative Aufreinigung von EryCIII über
Anionenaustauschchromatographie und IMAC Die präparative Aufreinigung von EryCIII wurde ausgehend von 200 ml Sacc. erythraea
pEXCIII-Rohextrakt gestartet und mit einem ÄktaPrime-System durchgeführt (Abbildung
45). Zur Herstellung der Suspension wurden 80 g gefrorene Zellmasse verwendet. Aus
prozesstechnischen Gründen wurden im Vergleich zu den semi-präparativen Aufreinigungen
einige Parameter (Flussrate, Gradientenvolumen, etc.) an die apparativen Gegebenheiten
angepasst. Wegen der zuvor schon erwähnten Substratlimitierung für enzymatische Testes
wurde im Verlauf der Arbeit ein ELISA-Verfahren (Kap. E 6.8.1) zur schnellen und
einfachen Detektion der His6-getaggten Glykosyltransferasen in Chromatographiefraktionen
entwickelt. Ein wesentlicher Vorteil dieser Methode ist der deutlich höhere Probendurchsatz
als beim Immunoblotting. Nach Abschluss des ELISA wurden die Proben photometrisch bei
490 nm vermessen. Über einen Abgleich mit den Chromatogrammen und den
Proteinbestimmungen nach Bradford (1976) (Kap. E 6.6) konnten die EryCIII-haltigen
Fraktionen jeweils eindeutig identifiziert werden. Eine fotografische Abbildung eines
exemplarischen ELISA-Tests ist unter Kap. F 10.1, Abbildung 95 verzeichnet. Des Weiteren
erfolgte am Ende der Aufreinigung aus Anionenaustausch, IMAC und Gelfiltration eine
Kontrolle durch SDS-PAGE bzw. Immunoblotting (Kap. E 6.7.1) und eine Bestimmung der
enzymatischen Aktivität (Kap. E 4.1) von EryCIII in ausgewählten Proben.
-70-
B ERGEBNISSE UND DISKUSSION
Manual Run 8:1_UV Manual Run 8:1_Cond Manual Run 8:1_Fractions Manual Run 8:1_Logbook
0
100
200
300
400
500
mAu
0 1000 2000 3000 4000
Method Run 27.09.2004, 09:08:50, Method : , Result : c:\...\prime\Manual Flow 0.0 ml/min Flow 0.0 ml/min
1 4 7 11 16 21 26 31 36 41 46 51 56 6
1
150 mMNaCl
1 M NaCl
UV280 nm
Leitfähigkeit
Fr
Manual Run 8:1_UV Manual Run 8:1_Cond Manual Run 8:1_Fractions Manual Run 8:1_Logbook
0
100
200
300
400
500
mAu
0 1000 2000 3000 4000
Method Run 27.09.2004, 09:08:50, Method : , Result : c:\...\prime\Manual Flow 0.0 ml/min Flow 0.0 ml/min
1 4 7 11 16 21 26 31 36 41 46 51 56 6
1
150 mMNaCl
1 M NaCl
UV280 nm
Leitfähigkeit
Fr
I
Abb. 45: Chromatogramm der präparativen Q-Sepharose 6 F
Durchlauf des Auftrags, 2 und 3: Hauptfraktionen der Elution
NaCl), 4: Fraktion des Waschschritts mit 1 M Na
Auftragsvolumen des Rohextrakts: 200 ml (Proteingehalt:
NaH2PO4 Puffer, pH 8 mit 150 mM NaCl und 5 mM MgCl2.
Das Chromatogramm der präparativen Anionenaustauschchr
ein sehr ähnliches Bild, wie das Chromatogra
Anionenaustauschchromatographie (Abbildung 40). I
Hauptfraktionen (2 und 3) eluiert. Aufgrund der vorherg
Anionenaustauschchromatographie (Kap. B 2.1.1) lag nah
abfallenden Flanke des ersten Peaks (2) eluiert wurde. Um
gesamte Chromatographie einem ELISA-Test (Kap. E 6.8.1
µl Aliquots jeder zweiten Fraktion, beginnend mit Frak
Rohextrakt, vom Durchlauf und von der 1 M Waschfraktion
Platte aufgebracht (Abbildung 46).
-71-
EryCII
5000 6000 7000 ml
Fraction size 24.0 ml Fraction size 23.0 ml Flow 0.1 ml/min
1 66 71 76 81 86 90 94 98 103 109 115121127133139 Waste
3 4
650 mMNaCl
2
aktionen
5000 6000 7000 ml
Fraction size 24.0 ml Fraction size 23.0 ml Flow 0.1 ml/min
1 66 71 76 81 86 90 94 98 103 109 115121127133139 Waste
2 3 4
650 mMNaCl
aktionen
F Aufreinigung von EryCIII. 1:
(Gradient: 150 mM – 650 mM
Cl. Säulenvolumen: 580 ml,
18,3 mg/ml), Puffer: 50 mM
omatographie mit EryCIII zeigt
mm der semi-präparativen
m Gradienten wurden 2
ehenden Charakterisierung der
e, dass EryCIII primär in der
dies zu bestätigen wurde die
) unterzogen. Dazu wurden 100
tion Nr. 20 und Proben vom
auf eine entsprechende ELISA-
B ERGEBNISSE UND DISKUSSION
0
0,02
0,04
0,06
0,08
0,1
0,12
0,14
0,16
50 60 70 80 90 100 110
Fraktionsnummer
E49
0 nm
Abb. 46: Auswertung des ELISA-Tests der präparativen Anionenaustauschchromatographie
zur Aufreinigung von EryCIII. ELISA-Bedingungen: 100 µl Probe, Inkubation über Nacht bei
4°C, Inkubationszeit mit OPD-Substrat: 10 min bei RT, photometrische Messung bei 490 nm.
Die oben abgebildete Auswertung des ELISA-Tests zeigt, dass die Elution von EryCIII in
Fraktion 62 startete, ihr Maximum bei Fraktion 80 (E490 nm = 0,140) erreichte und sich danach
ab Fraktion 90 auf scheinbar relativ hohem Niveau (E490 nm = 0,070) fortsetzte. Des Weiteren
zeigte sich wie erwartet ein starkes Signal (E490 nm = 0,284) in der Rohextraktprobe, kein
Signal im Durchlauf und ein schwaches Signal im 1 M NaCl Waschschritt (E490 nm = 0,050).
Ein Vergleich mit dem Chromatogramm der Aufreinigung (Abbildung 45) und den
Ergebnissen der Proteinbestimmung nach Bradford (1976) (Kap. E 6.6) ergab, dass sich ab
Fraktion 95 kaum noch Protein nachweisen ließ. Besonders deutlich wird dies auch durch den
direkten Vergleich der Proteingehalte von Peak 2 und 3. Von den insgesamt aufgetragenen
3660 mg Protein, wurden im EryCIII-haltigen Teil des ersten Elutionspeaks (2) 890 mg
Protein und im gesamten zweiten Elutionspeak (3) lediglich 70 mg eluiert. Das ELISA-Signal
in den späteren Fraktionen ist daher sehr wahrscheinlich auf kleine Mengen an unspezifisch
eluiertem Protein und eine zu lange Reaktionszeit im ELISA-Test zurückzuführen. Nach der
erfolgreichen Detektion des His6-getaggten Enzyms wurden die Fraktionen 64 – 95 vereinigt,
eine Konzentration von 10 mM Imidazol eingestellt und die präparative IMAC beladen
(Abbildung 47).
-72-
B ERGEBNISSE UND DISKUSSION
Manual Run 0:1_UV Manual Run 0:1_Cond Manual Run 0:1_Fractions Manual Run 0:1_Logbook
0
100
200
300
400mAu
0 50 100 150 200 250 300 min
Method Run 28.09.2004, 12:28:33, Method : , Result : c:\...\prime\Manual Pause 0.0 28.09.2004, 16:17:27 (Manual)
1357912 16 20 24 28 32 36 40 4448 49
Leitfähigkeit
UV280 nm1
2
3Fraktionen
10 mMImidazol
20 mMImidazol
250 mMImidazol
Manual Run 0:1_UV Manual Run 0:1_Cond Manual Run 0:1_Fractions Manual Run 0:1_Logbook
0
100
200
300
400mAu
0 50 100 150 200 250 300 min
Method Run 28.09.2004, 12:28:33, Method : , Result : c:\...\prime\Manual Pause 0.0 28.09.2004, 16:17:27 (Manual)
1357912 16 20 24 28 32 36 40 4448 49
Leitfähigkeit
UV280 nm1
2
3Fraktionen
10 mMImidazol
20 mMImidazol
250 mMImidazol
Abb. 47: Chromatogramm der präparativen Ni2+-NTA Aufreinigung von EryCIII. 1:
Durchlauf des Auftrags, 2. Waschfraktion mit 20 mM Imidazol, 3: Elution mit 250 mM
Imidazol. Säulenvolumen: 50 ml, Auftragsvolumen des Q-Sepharose 6 FF-Pools: 610 ml
(Proteingehalt: 1,46 mg/ml), Puffer: 50 mM NaH2PO4 Puffer, pH 8 mit 300 mM NaCl, 10
mM Imidazol und 5 mM MgCl2.
Wie zuvor bei der Anionenaustauschchromatographie, bot auch das Chromatogramm der
präparativen IMAC mit EryCIII ein ähnliches Bild wie das der semi-präparativen
Aufreinigung (Abbildung 43). Deutlich ist der großvolumige Durchlauf zu erkennen (1), an
den sich ein vergleichsweise kleiner Peak durch den Waschschritt mit 20 mM Imidazol
anschließt (2) und der abschließende Elutionspeak (3) mit 250 mM Imidazol. Im Gegensatz
zum Chromatogramm der semi-präparativen Aufreinigung ist jedoch bei der präparativen
Chromatographie eine deutliche Überhöhung des Elutionspeaks zu erkennen (Abbildung 47).
Wie schon vorher die Anionenaustauschchromatographie, wurde auch die IMAC
Chromatographie einem ELISA-Test unterzogen. Für diesen Test wurden 100 µl Aliquots
jeder Fraktion, beginnend mit Fraktion Nr. 1, Proben vom Auftrag, vom Durchlauf und von
der 20 mM Waschfraktion auf die ELISA-Platte aufgetragen (Abbildung 48).
-73-
B ERGEBNISSE UND DISKUSSION
0
0,1
0,2
0,3
0,4
0,5
0,6
0,7
0,8
0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50
Fraktionsnummer
E49
0 nm
Abb. 48: Auswertung des ELISA-Tests der präparativen IMAC zur Aufreinigung von
EryCIII. ELISA-Bedingungen: 100 µl Probe, Inkubation über Nacht bei 4°C, Inkubationszeit
mit OPD-Substrat: 3 min bei RT, photometrische Messung bei 490 nm.
Das Ergebnis des ELISA-Tests der IMAC zeigt, dass die Elution von EryCIII offensichtlich
schlagartig mit dem Wechsel von Fraktion 5 zu 6 startete (Anstieg der E490 nm von 0,046 auf
0,350) und das das Maximum der Elution bei Fraktion 13 erreicht wurde (E490 nm = 0,711).
Nach dem Maximum flacht das Signal ab, bevor es sich, ähnlich wie bei der
Anionenaustauschchromatographie zuvor, auf einem mittleren Niveau (E490 nm = 0,200)
stabilisiert. Sämtliche anderen aufgetragenen Chromatographiefraktionen (Auftrag,
Durchlauf, 20 mM Waschschritt) gaben kein Signal im ELISA. Die Proteinbestimmungen
nach Bradford (1976) (Kap. E 6.6) haben auch in diesem Fall gezeigt, dass die hinteren
Fraktionen nur sehr geringe Mengen an Protein enthielten. Daher ist auch bei dieser Analyse
davon auszugehen, dass die Reaktion im ELISA auf kleinste Mengen an unspezifisch
eluiertem Protein zurückzuführen ist. Für die im Anschluss durchgeführte semi-präparative
Chromatographie an Superdex G200 wurden die Fraktionen 6 – 45 vereinigt. Der so gebildete
Pool besaß ein Volumen von 220 ml mit einer Proteinkonzentration von 0,32 mg/ml. Tabelle
10 fasst die Ergebnisse der Proteinbestimmungen (Bradford 1976) der präparativen
Aufreinigung von EryCIII über Anionenaustausch und IMAC zusammen.
-74-
B ERGEBNISSE UND DISKUSSION
Tab. 10: Ergebnisse der Proteinbestimmungen (Bradford 1976) der präparativen
Aufreinigung von EryCIII über Anionenaustausch und IMAC.
Probe Volumen
[ml]
Proteingehalt
[mg]
Gesamtproteingehalt
[mg]
Rohextrakt pEXCIII 200 18,3 3660
Q-Sepharose Durchlauf 900 0,66 594
Q-Sepharose Pool 1a 610 1,46 891
Q-Sepharose Pool 2b 850 0,082 69,7
Q-Sepharose 1 M NaCl 650 0,015 9,8
IMAC Durchlauf 680 1,20 816
IMAC 20 mM Imidazol 78 0,006 0,5
IMAC Pool 250 mM
Imidazol
225 0,32 72
a = Pool aus den EryCIII-haltigen Fraktionen, basierend auf den Ergebnissen des ELISA, b = Pool der
Fraktionen 95 – 138.
Die Bilanzierung der präparativen Aufreinigung von EryCIII (Tabelle 10) offenbarte, dass ca.
98% des ursprünglich aufgetragenen Proteins während der Aufreinigung abgetrennt wurden
und das aus 200 ml Rohextrakt nach beiden Reinigungsschritten insgesamt 72 mg EryCIII
gewonnen werden konnten. Aufgrund der nukleotid-spaltenden Aktivitäten im Rohextrakt
(Phosphatasen) und der damit verbundenen Zersetzung des dTDP konnte keine Bilanzierung
der Aufreinigung über die enzymatische Aktivität von EryCIII erfolgen (Kap. E 4.1). Der
Versuch die enzymatische Aktivität des Q-Sepharose 6 FF Pools 1a zu bestimmen schlug
ebenso fehl, wie der Versuch die enzymatische Aktivität des unkonzentrierten IMAC Pools
festzustellen. Der Grund dafür ist sehr wahrscheinlich in der hohen Verdünnung von EryCIII
zu suchen. Untersuchungen zur Stabilität von dTDP haben gezeigt, dass bereits nach dem
Anionenaustauscherschritt bei einer 2 h Inkubation keine nukleotid-spaltenden Aktivitäten
mehr nachweisbar waren. Für die Untersuchungen wurde dTDP in einer Konzentration von 1
mM in je 20 µl Rohextrakt, Q-Sepharose Pool 1 und IMAC Pool aufgenommen, für 2 h bei
25°C inkubiert und der Ansatz im Anschluss mit CE (Kap. E 6.4.1) analysiert (Daten nicht
gezeigt).
-75-
B ERGEBNISSE UND DISKUSSION
2.4 Gelfiltration 2.4.1 Chromatographie an Superdex G200 Nach der präparativen Aufreinigung über Q-Sepharose 6 FF und Ni2+-NTA wurde der IMAC
Pool über zwei Schritte auf 10,5 ml aufkonzentriert (VivaCell 250 und VivaSpin 20, 10 kDa
cut-off Membran aus Celluloseacetat bzw. Polyethersulfon) und über 0,22 µm filtriert
(Sartorius). Der Versuch, die enzymatische Aktivität des Konzentrats zu bestimmen, schlug
aus unbekanntem Grund fehl. Von diesem Konzentrat wurden 2 ml auf die semi-präparative
Superdex G200 aufgetragen (Abbildung 49). Wie sich später herausstellt gingen während der
Konzentrierung ca. 50% des Gesamtproteins durch Aggregation und Ausflockung verloren.
Insgesamt betrug die Proteinausbeute nach Konzentrierung und 10minütiger Zentrifugation
zur Klärung des Konzentrats (5000 Upm, 4°C, Swing-out Rotor, Rotina 35R, Hettich) 34 mg.
Manual Run 7:1_UV Manual Run 7:1_Fractions Manual Run 7:1_Inject Manual Run 7:1_UV@01,BASEM Manual Run 7:1_Logbook
-30.0
-25.0
-20.0
-15.0
mAu
0 100 200
Injection Valve Inj Injection Valve Load
14 79 12 16 20 24 28 32 36 40 44 48 52 56125.86
135.03
162.36
206.
1
2
UV280 nm
KorrelierteBasislinie
Manual Run 7:1_UV Manual Run 7:1_Fractions Manual Run 7:1_Inject Manual Run 7:1_UV@01,BASEM Manual Run 7:1_Logbook
-30.0
-25.0
-20.0
-15.0
mAu
0 100 200
Injection Valve Inj Injection Valve Load
14 79 12 16 20 24 28 32 36 40 44 48 52 56125.86
135.03
162.36
206.
1
2
UV280 nm
KorrelierteBasislinie
I
Abb. 49: Chromatogramm der semi-präparati
1 – 6: Hauptfraktionen der Elution. Säulenv
Konzentrats: 2 ml (Proteingehalt: 3,25 mg/ml)
mM NaCl und 5 mM MgCl2.
Das Chromatogramm der Aufreinigung von E
aufgetragene Probe in sechs Hauptfraktionen
Basislinientrennung zwischen den Fraktionen
Schritt der Auswertung des Laufs wurde
Elutionsvolumina der einzelnen Fraktione
-
EryCII
300 400 ml
Pause 0.0 30 2004, 15:04:26 (Manual).09. Pause 0.0 30.09.2004, 16:02:06 (Manual)
60 64 68 72 76 80 84 88 92 96 101106111116121126131136141 147152157162167172177 183188 Waste
68
222.35231.81
262.72
294.13 310.71 325.50
376.37
3 4
56Fraktionen
Elutionsvolumen
300 400 ml
Pause 0.0 30.09.2004, 15:04:26 (Manual) Pause 0.0 30.09.2004, 16:02:06 (Manual)
60 64 68 72 76 80 84 88 92 96 101106111116121126131136141 147152157162167172177 183188 Waste
68
222.35231.81
262.72
294.13 310.71 325.50
376.37
3 4
56Fraktionen
Elutionsvolumen
ven Superdex G200 Aufreinigung von EryCIII.
olumen: 380 ml, Auftragsvolumen des IMAC-
, Puffer: 50 mM NaH2PO4 Puffer, pH 8 mit 300
ryCIII an Superdex G200 demonstriert, dass die
aufgetrennt wurde. Dabei wurde jedoch keine
1 und 2 sowie 3,4 und 5 erreicht. Im ersten
eine korrelierte Basislinie erstellt und die
n über Integration berechnet. Aus diesen
76-
B ERGEBNISSE UND DISKUSSION
Elutionsvolumina wurden dann im zweiten Schritt der Verarbeitung die korrespondierenden
Kav-Werte ermittelt und anhand der Kalibrierung für die G200 (Kap. F 9.5, Abbildung 94) in
die korrespondierenden nativen Molekulargewichte umgerechnet (Tabelle 11).
Tab. 11: Elutionsvolumina, Kav-Werte und native Molekulargewichte der Hauptfraktionen
der semi-präparativen Aufreinigung von EryCIII an Superdex G200.
Fraktion 1 2 3 4 5 6
Elutionsvolumen [ml] 135,03a 162,36 222,35 231,81 262,72 376,37b
Kav-Wert [-] ---a 0,1139 0,3582 0,3966 0,5225 ---b
Natives
Molekulargewicht
[kDa]
2000 798,4 130,7 98,3 38,7 ---b
a = Identisch mit dem Elutionsvolumen von Blue Dextran 2000 (Ausschlussvolumen), b = Elutionsvolumen
außerhalb der Kalibrierung.
Bei der Berechnung der nativen Molekulargewichte stellte sich überraschenderweise heraus,
dass keines der Molekulargewichte einer der Hauptfraktionen mit dem nativen
Molekulargewicht eines Monomers von EryCIII (45,9 kDa) übereinstimmte (Tabelle 11). Mit
Ausnahme von Fraktion 5 besaßen alle anderen Fraktionen (1 – 4 und 6) ein wesentlich
höheres Molekulargewicht. Das extrem hohe Molekulargewicht der Fraktionen 1 und 2
(Elution im Ausschlussvolumen bzw. an der Grenze zum Ausschlussvolumen) deutete darauf
hin, dass es sich möglicherweise um Partikel oder unspezifische Proteinaggregate handelte.
Um EryCIII zu identifizieren wurde die gesamte Aufreinigung dem bekannten ELISA-Test
unterzogen. Dazu wurden 100 µl Aliquots jeder zweiten Fraktion, beginnend mit Fraktion Nr.
2 und eine Probe vom Auftrag auf die ELISA-Platte aufgetragen (Abbildung 50).
-77-
B ERGEBNISSE UND DISKUSSION
0
0,05
0,1
0,15
0,2
0,25
0,3
0,35
0,4
0,45
0,5
40 50 60 70 80 90 100
Fraktionsnummer
E49
0 nm
Abb. 50: Auswertung des ELISA-Tests der semi-präparativen Aufreinigung von EryCIII an
Superdex G200. ELISA-Bedingungen: 100 µl Probe, Inkubation über Nacht bei 4°C,
Inkubationszeit mit OPD-Substrat: 3 min bei RT, photometrische Messung bei 490 nm.
Der ELISA-Test beweist eindeutig, dass die Elution von EryCIII in den Fraktionen 50 bis 80
stattfand und dass die Elution das Maximum zwischen Fraktion 60 und 70 (E490nm = 0,450)
erreichte. Die mit analysierte Probe des Auftrags zeigte erwartungsgemäß ein starkes Signal
(E490nm = 0,363). Im Gegensatz zur Anionenaustauschchromatographie und zur IMAC (Kap.
B 2.3) erfolgte aufgrund des Prinzips der Gelfiltration keine unspezifische Elution von
EryCIII in den späteren Fraktionen. In Peak 1 und 2 traten vereinzelte Signale im ELISA auf,
jedoch zeichnete sich kein eindeutiger Peak ab. Dieses Ergebnis unterstützt die zuvor
geäußerte Vermutung, dass es sich bei den Hauptfraktionen 1 und 2 um Partikel und/oder
Proteinaggregate handeln könnte. Der Vergleich mit dem Chromatogramm zeigt, dass der
über ELISA zugeordnete Elutionsbereich von EryCIII mit den Hauptfraktionen 3 und 4
übereinstimmte. Unter Berücksichtigung der errechneten nativen Molekulargewichte (130,7
kDa bzw. 98,3 kDa) muss daher davon ausgegangen werden, dass es sich bei Peak 3 um ein
Trimer und bei Peak 4 um ein Dimer von EryCIII handelte. Aufgrund der Tatsache, dass in
der aktuellen Literatur keine protein- und biochemischen Daten für eine vergleichbare
Makrolid-Glykosyltransferase wie EryCIII existieren, konnten diesbezüglich keine direkten
Vergleiche angestellt werden, jedoch sind bei einer Reihe von publizierten Arbeiten aus dem
Gebiet der Glykopeptid-Antibiotika (Vancomycin, Chloroeremomycin) keine di- oder
-78-
B ERGEBNISSE UND DISKUSSION
trimeren Strukturen beschrieben worden (Mulichak et al. 2001, Mulichak et al. 2003,
Mulichak et al. 2004). Das Fehlen von Monomeren deutet darauf hin, dass EryCIII seine
katalytische Aktivität vermutlich nur als Dimer oder höheres Oligomer entfalten kann. Bei
dieser Annahme ist jedoch die ausgeprägte Aggregationsneigung von EryCIII zu
berücksichtigen, die zu einer Artefaktbildung führen könnte. Aufgrund der vergleichsweise
guten Übereinstimmung im Molekulargewicht (38,7 kDa) könnte es sich bei Fraktion 5 um
die primäre Verunreinigung aus dem Stammhintergrund von Sacc. erythraea handeln
(Abbildung 39). Eine Aktivitätsbestimmung von EryCIII hat für ein aufkonzentriertes
Aliquot des Gelfiltrationspools (Fraktion 57 – 85) eine Volumenaktivität von 90 mU/ml und
eine spezifische Aktivität von 80 mU/mg ergeben. Die Konzentrierung war erforderlich, um
die enzymatische Aktivität detektieren zu können. Um den Erfolg der Aufreinigungsstrategie
abschließend beurteilen zu können und um die Identität des aufgereinigten Enzyms
nachzuweisen wurden Proben der einzelnen Aufreinigungsschritte (pEXCIII-Rohextrakt, Q-
Sepharose Pool 1a, IMAC Pool und G200 Pool) durch SDS-PAGE und Immunoblotting
(Kap. E 6.7.1) analysiert (Abbildung 51).
100 kDa
75 kDa
50 kDa
37 kDa
25 kDa
20 kDa
150 kDaRE Q St I G RE Q St I G
100 kDa
75 kDa
50 kDa
37 kDa
25 kDa
20 kDa
150 kDaRE Q St I GRE Q St I G RE Q St I G
Abb. 51: Analyse der Aufreinigung von EryCIII über Q-Sepharose 6 FF, IMAC und
Gelfiltration durch SDS-PAGE (linke Bildhälfte) und Immunoblotting (rechte Bildhälfte). St:
Molekulargewichtsstandard (Prestained Precision Protein, Bio-Rad), RE: Rohextrakt von
Sacc. erythraea pEXCIII, Q: Q-Sepharose 6 FF Pool 1a, I: IMAC Pool, G: G200 Pool.
Markierung: primäre Verunreinigung aus dem Stammhintergrund von Sacc. erythraea.
Aufgetragene Proteinmengen: RE: 30 µg, Q: 20 µg, I: 15 µg, G: 10 µg.
-79-
B ERGEBNISSE UND DISKUSSION
Die SDS-PAGE Kontrolle der Aufreinigung hat gezeigt, dass EryCIII durch die entwickelte
Aufreinigungsstrategie aus Anionenaustauschchromatographie, IMAC und Gelfiltration
absolut homogen dargestellt werden konnte. Der immunchemische Nachweis hat des
Weiteren die Identität von EryCIII zweifelsfrei belegt.
Aufgrund der Tatsache, dass sich die primäre Verunreinigung aus dem Stammhintergrund von
Sacc. erythraea nicht über Anionenaustausch und IMAC abtrennen ließ und weil sich die
Aufkonzentrierung von EryCIII durch Ultrafiltration als schwierig erwies, waren weitere
Informationen über das Fremdprotein von Interesse, um u. U. eine prozesstechnisch
günstigere Alternative zur Reindarstellung der Glykosyltransferasen zu finden. Zu diesem
Zweck, und um gleichzeitig die Expression von eryCIII und eryBV proteinchemisch
nachzuweisen, wurden verschiedene Blotproben durch N-terminale Mikro-
Proteinsequenzierung nach Edman (Edman 1956) untersucht (Kap. E 3.2) (Tabelle 12). Die
Aminosäuren sind im IUPAC Einbuchstabencode angegeben.
Tab. 12: Sequenzdaten der N-terminalen Mikro-Proteinsequenzierung von EryCIII, EryBV
und einem unbekannten Protein aus Sacc. erythraea.
Probe 1 (EryCIII)a Probe 2 (EryBV)b Probe 3 (Unbekannt)c
Nummer Aminosäure Ausbeute
[pmol]
Aminosäure Ausbeute
[pmol]
Aminosäure Ausbeute
[pmol]
1 M 18,52 M 21,26 V K.A.
2 R 20,47 R 23,84 F K.A.
3 V 21,93 V 21,72 K K.A.
4 V 25,76 L 23,40 K K.A.
5 F 18,63 L 25,66 L K.A.
6 S 8,68 T 14,80 L K.A.
7 (S) 6,58 S 9,37 G K.A.
8 M 7,04 F 12,83 A K.A.
9 A 9,29 A 11,30 L K.A.
10 S 4,77 H 4,47 G K.A.
11 K 3,76 R 6,22 I K.A.
12 (G) 0,77 T 4,21 G K.A.
13 H 2,07 K.A. K.A. G K.A.
14 L 3,49 F 4,57 P K.A.
15 F 3,30 Q 5,37 S K.A.
-80-
B ERGEBNISSE UND DISKUSSION
16 G 2,85 G 3,32 V K.A.
17 (L) 2,81 L 2,97 D K.A.
18 (V) 2,89 V 4,61 T K.A.
19 (P) 2,62 P 3,02 V K.A.
20 --- --- (P) 3,93 L K.A.
a = Startausbeute ca. 20 pmol; b = Startausbeute ca. 25 pmol; c = Startausbeute ca. 100 pmol. K. A.: Keine
Angaben.
Der Vergleich der Aminosäuresequenzen von Probe 1 und Probe 2 mit den bekannten, in der
TrEMBL-Datenbank (www.expasy.org) abgelegten Aminosäuresequenzen für EryCIII und
EryBV ergab, dass in den ersten 20 Aminosäuren eine vollständige Überseinstimmung (100
% Identität) bestand. Damit konnte die Expression der beiden rekombinant exprimierten
Glykosyltransferasen eindeutig proteinchemisch nachgewiesen werden. Die
Datenbankrecherche mit der Sequenz von Probe 3 förderte ein hypothetisches Protein aus
dem Genomprojekt von Streptomyces coelicolor zutage (Zugangsnummer: Q9S1P4,
www.expasy.org), welches in den ersten 20 Aminosäuren ebenfalls eine völlige
Sequenzübereinstimmung aufwies (100 % Identität). Weitere Recherchen ergaben, dass es
sich bei dem identifizierten Protein um ein Protein handelt, das offensichtlich bei der Gattung
Streptomyces weit verbreitet ist und eine Funktion bei der Regulation der Sporulation besitzt.
Anhand der gefundenen Proteinsequenz wurden sowohl das theoretische Molekulargewicht,
als auch der theoretische pI-Wert von Q9S1P4 berechnet. Dabei ergab sich für das Protein
einen pI-Wert von 5,53 und ein Molekulargewicht von 34426 Da (Monomer). Im Folgenden
ist die Aminosäuresequenz von Q9S1P4 wiedergegeben, wobei alle Histidinreste (H) grau
unterlegt sind.
Aminosäuresequenz der Hauptverunreinigung aus Sacc. erythraea (Q9S1P4) MVFKKLLGALGIGGPSVDTVLHHPGTRPGEVLTGEVRITGGSQAVTIEHVALGLVTRIETEHGGHDGDAFVEFHRVVVAGRFELAEGEDRVIPFEFPVPLEAPVTEFYGRHLHGMTLGVRTELSVAKAVDKGDLDPVSVHPLPAQERVLEAFSRLGFHFKHADLEHGRLHGVHQELPFYQEIEFHPPGQYAGRVNEVELTFVAGPHGLDVVLEADKRGGFFTPSHDAFGRFHAGYEEAEHIDWAARIDEWLAQVAERRHAMPHGHHQHGSHDHHHGHHGAGMGGVIAGAAAGAAAGIVGGMVLGEVVDEVGDFFEGDEG
Ein Blick auf die Aminosäuresequenz zeigt, dass das Protein mit insgesamt 30 Histidinresten
extrem histidinreich ist. Die meisten Histidinreste kommen im C-terminalen Bereich des
Proteins gehäuft vor („geclustert“). Der in der Sequenz unterstrichene Bereich entspricht
einem typischen His6-tag, der durch einen Asparagin- und einen Glycinrest unterbrochen
-81-
B ERGEBNISSE UND DISKUSSION
wird. Diese massive Häufung von Histidinresten erklärt, warum das Protein, neben den
rekombinanten Glykosyltransferasen, außerordentlich effizient durch IMAC aufgereinigt
wurde. Der theoretische pI-Wert von 5,53 erklärt des Weiteren, warum das Protein bei der
Anionenaustauschchromatographie nicht abgetrennt werden konnte.
Betrachtet man die Ergebnisse der Entwicklung einer geeigneten Aufreinigungsstrategie für
die rekombinanten, in Sacc. erythraea produzierten Makrolid-Glykosyltransferasen (EryCIII,
EryBV, OleG2 und TylMII) im Kontext, so kann das Fazit gezogen werden, dass es am
Beispiel der Desosaminyltransferase EryCIII gelungen ist eine Aufreinigunsstrategie aus
Anionenaustauschchromatographie, IMAC und Gelfiltration zu entwickeln, um die
Transferasen homogen und katalytisch aktiv zu gewinnen. Die dabei für EryCIII gefundene
spezifische Aktivität nach Gelfiltration betrug 80 mU/mg. Da die bearbeiteten
Glykosyltransferasen eine recht ausgeprägte Homologie untereinander haben ist zu erwarten,
dass sich die entwickelte Aufreinigungsstrategie für alle bearbeiteten Makrolid-
Glykosyltransferasen eignet und nur geringer Modifikationen bedarf. Der Versuche zur
Maßstabsvergrößerung der Aufreinigungsstrategie hat gezeigt, dass die vorgestellte Strategie
erfolgreich an wechselnde Erfordernisse angepasst werden kann. In Bezug auf die maximal
erreichbare Ausbeute an homogenem Enzym ist festzuhalten, dass diese Ausbeute stark vom
jeweiligen Expressionsniveau und dem Aufschluss- bzw. Chromatographieverlauf abhängt.
Insbesondere die Proteinkonzentrierung vor der Gelfiltration stellt einen kritischen Punkt der
Aufreinigungsstrategie dar. Über eine Verbesserung des Konzentrierungsprotokolls, z. B.
durch den Einsatz von Glyzerin, kann der ausgeprägten Aggregationsneigung von EryCIII
vermutlich erfolgreich entgegengewirkt und die präparative Darstellung durch Gelfiltration
erleichtert werden. Bei der präparativen Aufreinigung von EryCIII wurden nach
Anionenaustausch und IMAC aus 80 g gefrorener Biofeuchtmasse 72 mg Protein erhalten.
Unter Berücksichtigung der Fermentationsergebnisse eröffnen die Arbeiten erstmals die
Möglichkeit, die untersuchten Makrolid-Glykosyltransferasen in ausreichender Menge und
Homogenität für Kristallisationszwecke zu gewinnen. Dies zeigt auch ein Vergleich mit der
aktuellen Literatur. Wie bereits in Kap. A 3.3 beschrieben, erfolgten bis dato alle
Enzymproduktion für in vitro Zwecke periplasmatisch in E. coli (Albermann et al. 2003, Fu et
al. 2003, Freel Meyers et al. 2003, Losey et al. 2002). Eine Herausforderung bei
Kristallisationsversuchen stellt jedoch die vergleichsweise schlechte Löslichkeit von EryCIII
dar (Kap. B 2.4.1). Um Proteinkristallisation rational betreiben zu können sind in der Regel
homogene Proteinlösungen mit einer Konzentration von mindestens 10 mg/ml erforderlich.
-82-
B ERGEBNISSE UND DISKUSSION
Eine Alternative bieten Kristallisationsexperimente mit weniger homogenen Proteinlösungen.
Um dies zu testen, wurde mit einer IMAC gereinigten Probe das Fällungsverhalten von
EryCIII in Anwesenheit von verschiedenen PEG4000-Konzentrationen untersucht (Kap. E
3.3). PEG4000 und andere PEG-Derivate sind weit verbreitete Präzipitationsagenzien bei der
Proteinkristallisation und waren daher von besonderem Interesse (Liu et al. 2004; Clancy
1994; Moreno 1997). Bei der Untersuchung zeigte sich, dass EryCIII mit einer PEG4000-
Konzentration von 20% (w/w) quantitativ gefällt werden kann, ohne dass eine nachweisbare
Ausfällung der primären Verunreinigung aus dem Stammhintergrund von Sacc. erythraea
(ExPasy-Zugangsnummer: Q9S1P4) stattfindet (Abbildung 52). Ein qualitativer
Aktivitätstest mit der resuspendierten EryCIII-Probe über DC (Kap. E 6.1) und
Stechagarplattentest (Kap. E 6.5.1) hat zweifelsfrei belegt, dass nach der Resuspendierung
noch aktives Enzym nachweisbar war (Kap. F 11.1 und F 11.2, Abbildung 96 und 97).
Zusammengefasst lassen die Ergebnisse die Möglichkeit erkennen EryCIII auch aus weniger
reinen Proteinlösung in katalytisch aktiver Form zu kristallisieren. Dadurch könnte der
limitierende Gelfiltrationsschritt umgangen werden. Das Laufverhalten der Proben im SDS-
PAGE-Gel ist auf die Anwesenheit des PEG4000 zurückzuführen.
P Ü P Ü P Ü P Ü AT 40 % (w/w) 30 % (w/w) 20 % (w/w) 10 % (w/w)
P Ü P Ü P Ü P Ü AT 40 % (w/w) 30 % (w/w) 20 % (w/w) 10 % (w/w)
EryCIII
Primäre Verunreinigung
Abb. 52: SDS-PAGE-Gel der Proteinfällung von EryCIII durch PEG4000 nach vorhergehender
Reinigung der Probe über Ni2+-NTA. P: Resuspendiertes Pellet, Ü: Überstand, AT: Auftrag
(IMAC Probe).
In Bezug auf das bei den Streptomyceten weit verbreitete, sporulationsrelevante Protein
(ExPasy-Zugangsnummer: Q9S1P4) bleibt festzuhalten, dass dessen Auftreten die Expression
von Proteinen mit His6-tag in Streptomyceten in Frage stellt. Da für katalytische Zwecke
häufig eine vergleichsweise geringe Reinheit nach IMAC ausreichend ist, tritt dieses Frage
-83-
B ERGEBNISSE UND DISKUSSION
jedoch in den Hintergrund. Aufgrund der guten Skalierbarkeit und hohen Kapazität der IMAC
ist eine Expression von „His6-getaggten“ Proteinen in Streptomyceten attraktiv, da
gleichzeitig das enorme Potenzial der Streptomyceten zur Produktion von löslichem Protein
ausgenutzt werden kann. Eine Expression von Streptomyceten-Genen in E. coli führt in der
Regel zu vergleichsweise schlechten Ergebnissen, da durch den hohen GC-Gehalt der
Streptomyceten DNA und durch die von E. coli abweichende Codon-Usage überwiegend
unlösliches Protein im Form von „inclusion-bodies“ gebildet wird.
3 Biochemische Charakterisierung Der biochemischen Charakterisierung der untersuchten Makrolid-Glykosyltransferasen und
der Entwicklung des Enzym-Modul-Systems (EMS) für die kombinatorische Biokatalyse
(Kap. B 4.1) kam eine zentrale Bedeutung in der Arbeit zu, da bis dato noch keine in vitro
Daten für Makrolid-Glykosyltransferasen publiziert wurden. Die ersten biochemischen
Untersuchungen (Kap. B 3.1.1 und B 3.1.2) erfolgten dabei parallel zur Entwicklung der
Aufreinigungsstrategie und stützten sich ausschließlich auf einen qualitativen
Aktivitätsnachweis durch DC (Kap. E 6.1) und auf einen Stechagarplattentest zum Nachweis
der antibiotischen Aktivität (Kap. E 6.5.1). Die Ergebnisse dieser ersten, rein qualitativen
Studien bildeten die Grundlage für die weiteren Untersuchungen (Kap. B 3.1.4 – 3.2) und die
Entwicklung des Aktivitätstests (Kap. E 4.1) zur Quantifizierung der enzymatischen
Umsätze. Die Anzahl der Versuche wurde dadurch eingeschränkt, dass nicht für alle Enzyme,
z. B. EryBV, geeignete nukleotid-aktivierte Desoxyzucker zur Verfügung standen.
3.1 Biochemische Charakterisierung von EryCIII Nach dem erfolgreichen Nachweis der Expression der vier Glykosyltransferasegene durch
Immunoblotting (Kap. B 2) lag es nahe als erstes EryCIII biochemisch zu untersuchen, da für
diese Untersuchungen neben den natürlichen Donor- und Akzeptorsubstraten dTDP-D-
Desosamin und Mycarosyl-EB (MEB) auch eine ganze Reihe anderer Akzeptorsubstrate zur
Verfügung standen. Das Ziel der Arbeiten war sowohl der eindeutige Nachweis der
enzymatischen Aktivität von EryCIII unter in vitro Bedingungen, als auch die gleichzeitige
Untersuchung des in vitro Substratspektrums und die Identifikation eventueller
Transferprodukte durch HPLC-MS (Cambridge University, Cambridge, England) (Kap. E
6.3.1).
-84-
B ERGEBNISSE UND DISKUSSION
3.1.1 Untersuchung des Donorsubstratspektrums von EryCIII Im Vergleich zur Untersuchung des Akzeptorsubstratspektrums von EryCIII (Kap. B 3.1.2)
konnten bei der Untersuchung des Donorsubstratspektrums nur zwei Substrate, nämlich
dTDP-6-Desoxy-4-keto-D-glucose und dTDP-2,6-Didesoxy-4-keto-D-glucose getestet
werden. Dies ist darauf zurückzuführen, dass zum Untersuchungszeitpunkt keine weiteren,
mit dTDP-D-Desosamin verwandten nukleotid-aktivierten Desoxyzucker (z. B. dTDP-D-
Mycaminose) zur Verfügung standen. Den Anlass zu diesen Experimenten gaben Berichte aus
dem Gebiet des Methymycin/Pikromycin Produzenten Streptomyces venezuelea, welche den
Transfer eines Ketozuckerintermediates durch die Desosaminyltransferase DesVII
postulierten, ohne dass dieser Transfer jedoch direkt nachgewiesen werden konnte (Zhao et al.
1998b; Borisova et al. 1999). Die Donorsubstrate hatten jeweils eine Konzentration von 5
mM und das Akzeptorsubstrat (MEB) eine Konzentration von 1 mM. Die Inkubation erfolgte
über Nacht bei 30°C mit einem Sacc. erythraea pEXCIII-Rohextrakt als Enzymquelle. Als
Puffer wurde 50 mM Tris/HCl, pH 7,5 mit 5 mM MgCl2 verwendet. Nach Abschluss der
Inkubation erfolgte die Analytik über DC (Platten nicht gezeigt) (Kap. E 6.1).
Im Ergebnis der Versuche bleibt festzuhalten, dass sich durch die DC-Analyse der Ansätze
kein neuer Produktspot nachweisen ließ, der auf den Transfer eines der eingesetzten
Donorsubstrate hindeutete. Es muss daher davon ausgegangen werden, dass EryCIII unter in
vitro Bedingungen keine Ketozucker übertragen kann. Dies macht auch unter in vivo
Bedingungen Sinn, da ansonsten Intermediate der Biosynthese der Nukleotidzucker
unspezifisch übertragen würden. Unterstützt werden die erzielten Ergebnisse durch neuere
Erkenntnisse zu DesVII, die nahe legen, dass das Enzym trotz seiner großen Flexibilität nicht
in der Lage ist Ketozucker zu übertragen (Remsing et al. 2002). Ein eindeutiger Nachweis für
den Transfer eines Ketozuckers gelang bis heute nur bei der Entstehung von Balhimycin
(Amycolatopsis mediterranei), bei dessen Biosynthese ein 4-Keto-vancosamin durch die
Glykosyltransferase bGtfA übertragen wird (Walsh et al. 2003) und bei der Produktion von
neuartigen Keto(pre)mithramycinen durch kombinatorische Biosynthese (Remsing et al.
2002, Abbildung 28).
3.1.2 Untersuchung des Akzeptorsubstratspektrums von EryCIII Für die Untersuchung des in vitro Akzeptorsubstratspektrums wurden folgende Makrolide
und Aglyka eingesetzt: Mycarosyl-EB (MEB; natürliches Akzeptorsubstrat von EryCIII),
Rhamnosyl-EB (REB), Olivosyl-EB (OEB), Erythronolid B (EB), Narbonolid (NB),
Methynolid (Meth) und Tylacton (Tyl). Bei der überwiegenden Mehrzahl der oben
-85-
B ERGEBNISSE UND DISKUSSION
aufgeführten Makrolide handelt es sich um unterschiedlich glykosylierte bzw. unglykosylierte
Mitglieder der Familie der 14er Makrolide, jedoch wurden mit Methynolid und Tylacton auch
Mitglieder der 12er bzw. 16er Familie untersucht. Als Donorsubstrat fungierte in allen Fällen
dTDP-D-Desosamin. Nach Abschluss des jeweiligen Versuchs wurden die Proben, mit
Ausnahme des Ansatzes mit OEB, durch Festphasenextraktion konzentriert (Kap. E 6.1.1)
und mit DC (Kap. E 6.1.2) analysiert (Abbildung 53) („Primärscreening“). Positive
Kandidaten aus dem „Primärscreening“ wurden im Anschluss durch Stechagarplattentests auf
antibiotische Aktivität hin untersucht (Kap. E 6.5.1) und durch HPLC-MS (Cambridge
University, Cambridge, England) charakterisiert (Kap. E 6.3.1).
T
NBM
NB
T
NBM
NB
1 2 6 74 5
Abb. 53:
(Ausschn
(Standard
rhamnosy
2,5 mM -
(Sacc. er
TA4). Als
h bei 30°C
A1A1
DC-E
itt). N
), Ery
l-EB,
5 mM
ythrae
Puffe
.
TA2TA2
rgebn
B: N
D: Ery
1 – 7:
dTD
a pEX
r dien
3
RNB RNB
isse der U
arbonolid
thromycin
Nummer d
P-D-Desos
CIII) (TA
te 50 mM T
EB
DREB
EB
DREB
ntersuchu
(Standa
D, REB
er Auftr
amin, 0,5
1) bzw.
ris/HCl
TA3TA3
ngen zu
rd), NB
: Rhamn
agsspur,
– 1 mM
300 µl a
mit 5 mM
-86-
MEB T
EryD
MEB T
EryD
m Akzep
M: Narb
osyl-EB (
TA1 – TA
Akzepto
us einer
MgCl2.
A4
REB
MEB
A4
REB
MEB
torsubstratspektrum von EryCIII
omycin, MEB: Mycarosyl-EB
Standard), DREB: Desosaminyl-
4: Jeweiliger Transferansatz mit
rsubstrat und 100 µl Rohextrakt
IMAC-Fraktion (TA2, TA3 und
Die Inkubationen erfolgten für 16
B ERGEBNISSE UND DISKUSSION
Tab. 13: Rf-Werte der durch DC nachgewiesenen und in Abbildung 53 gezeigten Makrolide.
Verbindung MEB EryD REB DREB Narbonolid NBM
Rf-Wert 0,38 0,23 0,53 0,34 0,25 0,40 MEB: Mycarosyl-EB, EryD: Erythromycin D, REB: Rhamnosyl-EB, DREB: Desosaminyl-rhamnosyl-EB,
NBM: Narbomycin.
Wie die Ergebnisse des Akzeptorsubstratscreenings zeigen (Abbildung 53), ließen sich für
die Transferansätze mit MEB (natürlicher Akzeptor), REB und Narbonolid neue Produktspots
durch DC-Analytik nachweisen. Der Transferansatz mit OEB wurde aufgrund der sehr
geringen Ausgangsprobenmenge an OEB (< 1 mg) nicht durch DC analysiert, sondern
ausschließlich durch HPLC-MS und durch den Stechagarplattentest. Die Ergebnisse der
Transferversuche mit EB, Tylacton und Methynolid waren negativ (Platten nicht gezeigt). Die
HPLC-MS Analysen bestätigten in allen Fällen die Identität der jeweiligen Verbindung. Alle
in der Arbeit angefertigten ESI-MS-Spektren sind im Anhang, unter Kap. F 7 verzeichnet.
Tabelle 14 fasst die Daten der MS-Spektren zusammen. Die experimentell ermittelten
Massenwerte (m/z) stimmten in allen Fällen sehr gut mit den theoretisch abgeleiteten bzw.
publizierten Massen überein. Die Strukturen der durch die in vitro Synthesen produzierten
Makrolid-Antibiotika sind in Abbildung 54 dargestellt.
Tab. 14: Vergleich zwischen den experimentell ermittelten und den aus der Struktur
berechneten Massen für die in vitro produzierten Makrolidantibiotika.
Verbindung m/z (MH+) experimentell m/z theoretisch
EryD 704,10 703,45
DREB 706,20 705,43
DOEB 690,10 689,44
NBM 510,30 509,34 EryD: Erythromycin D, DREB: Desosaminyl-rhamnosyl-EB, DOEB: Desosaminyl-olivosyl-EB, NBM:
Narbomycin.
-87-
B ERGEBNISSE UND DISKUSSION
O
O
O
OH
O
O
OH
O
OH
OH
O
N(CH3)2HO
Erythromycin D (EryD)
O
O
O
OH
O
O
OH
O
OH
OH
O
N(CH3)2
HO
Desosaminyl-olivosyl-EB (DOEB)
O
O
O
OH
O
O
OH
O
OH
OH
O
N(CH3)2HO
Desosaminyl-rhamnosyl-EB (DREB)
HO
O
O
O
O O
N(CH3)2
HO
Narbomycin (NBM)
O
Abb. 54.: Strukturen der im Rahmen der Arbeit durch in vitro Synthese produzierten
Makrolid-Antibiotika.
Tab. 15: Zusammenfassung aller Ergebnisse der in vitro Untersuchungen zum
Akzeptorsubstratspektrum von EryCIII.
Akzeptorsubstrat Produkt DC-Nachweis MS-Nachweis Antibiotische
Aktivität
MEB EryD Ja Ja Ja
REB DREB Ja Ja Ja
OEB DOEB N.d. Ja Ja
Narbonolid Narbomycin Ja Ja Ja
EB Kein Produkt Nein N.d. N.d.
Methynolid Kein Produkt Nein N.d. N.d.
Tylacton Kein Produkt Nein N.d. N.d. MEB: Mycarosyl-EB, REB: Rhamnosyl-EB, OEB: Olivosyl-EB, EB: Erythronolid B, EryD: Erythromycin D,
DREB: Desosaminyl-rhamnosyl-EB, DOEB: Desosaminyl-olivosyl-EB, N.d.: Nicht durchgeführt.
-88-
B ERGEBNISSE UND DISKUSSION
Bei Erythromycin D und Narbomycin handelt es sich um natürlich vorkommende Makrolid-
Antibiotika aus Saccharopolyspora erythraea bzw. Streptomyces venezuelae. Desosaminyl-
rhamnosyl-EB und Desosaminyl-olivosyl-EB hingegen stellen neue hybride Makrolid-
Antibiotika dar, die in dieser Arbeit erstmals in vitro hergestellt wurden. Die einzigen bis dato
publizierten Verbindungen mit einer ähnlichen Struktur sind 3-O-Rhamnosyl-Erythromycin B
und 3-O-Rhamnosyl-6-Desoxyerythromycin B (Doumith et al. 1999; Gaisser et al. 2000). Die
Herstellung dieser Erythromycin-Derivate erfolgte jedoch unter in vivo Bedingungen. Alle
Produkte zeigten eine eindeutige antibiotische Aktivität im Plattentest (Abbildung 55 und
56), wenn auch im Fall von Narbomycin keine geeignete fotografische Dokumentation des
sehr schwach ausgeprägten Hemmhofs gelang. Die Tatsache, dass Narbomycin im Vergleich
zur Erythromycin A ein sehr schwach wirksames Makrolidantibiotikum darstellt, ist seit
langem bekannt (Nilius und Ma 2002). Die in der jüngsten Vergangenheit in den Markt
eingeführten, semisynthetischen Ketolide, basieren dennoch auf der Grundstruktur von
Narbomycin, da durch das Fehlen der Cladinose in der C-3 Position des Makrolactonrings ein
wesentlicher Induktor für den, bei Makrolid resistenten Stämmen weit verbreiteten Erm-
Resistenzmechanismus (Ribosomenmethylierung), wie auch für verschiedene Efflux-
Resistenzmechanismen wegfällt (Abbildung 9) (Nilius und Ma 2002; Allen 1977; Pestka et
al. 1976). Unter diesem Gesichtspunkt stellt sich die Frage, ob der Austausch der Cladinose
gegen Rhamnose (DREB) bzw. Olivose (DOEB) eine ähnliche Wirkung auf die Induktion der
beschriebenen Resistenzmechanismen hat, wie die Carbonylfunktion der Ketolide.
-89-
B ERGEBNISSE UND DISKUSSION
MEB REB
EryA
TP 1 TP 2 TP 3
TP 4
MEB REB
EryA
TP 1 TP 2 TP 3
TP 4
Abb. 55: Hemmhofplatte zum Nachweis der antibiotischen Aktivität der in vitro
Transferprodukte EryD (TP 1 und TP 3) und DREB (TP 2 und TP 4). MEB: Mycarosyl-EB
(Standard) [1 mM], REB: Rhamnosyl-EB (Standard) [1 mM], EryA: Erythromycin A
(Standard) [1 mM], TP1 – TP4: Jeweiliger Transferansatz mit 2,5 mM - 5 mM dTDP-D-
Desosamin, 0,5 – 1 mM Akzeptorsubstrat (MEB bzw. REB) und 100 µl Rohextrakt (Sacc.
erythraea pEXCIII) (TP1) bzw. 300 µl aus einer IMAC-Fraktion (TP2, TP3 und TP4). Als
Puffer diente 50 mM Tris/HCl pH 7,5 mit 5 mM MgCl2. Die Inkubationen erfolgten für 16 h
bei 30°C.
-90-
B ERGEBNISSE UND DISKUSSION
EB
EryA
DOEB
MEB
EB
EryA
DOEB
MEB
Abb. 56: Hemmhofplatte zum Nachweis der antibiotischen Aktivität des in vitro
Transferprodukts DOEB. EB: Erythronolid B (Standard) [1 mM], MEB: Mycarosyl-EB
(Standard) [1mM], EryA: Erythromycin A (Standard) [1 mM], DOEB: Desosaminyl-olivosyl-
EB. Als Puffer diente 50 mM Tris/HCl pH 7,5 mit 5 mM MgCl2 und die Inkubation erfolgte
für 16 h bei 30°C. Die Konzentration an dTDP-D-Desosamin betrug 5 mM. Die Konzentration
des OEB war unbekannt.
Wie die Stechagarplatten für EryD, DREB und DOEB (Abbildung 55 und 56) beweisen, ließ
sich die antibiotische Wirksamkeit der neuartigen Makrolid-Antibiotika eindeutig
nachweisen. Kontrollexperimente mit verschiedenen Methanolkonzentrationen und Aglyka
haben im Vorfeld gezeigt, dass in Abwesenheit eines Antibiotikums keine Inhibition des
Wachstums des Teststamms Kocuria rhizophila (ATCC 9341) erfolgt (Platten nicht gezeigt).
Ein Vergleich der einzelnen Ergebnisse der in vitro Untersuchungen zum
Akzeptorsubstratspektrum von EryCIII zeigt, dass EryCIII eine gewisse Flexibilität im
Hinblick auf das Akzeptorsubstrat aufweist. Diese Flexibilität bewegt sich jedoch in einem
engen Rahmen. Alle akzeptierten Makrolide stammen aus der Familie der 14er Makrolide und
unterscheiden sich primär in der Komplexität der Substitution an der C-3 Position des
Makrolactonrings (Mycarose (methylierter 2,6-Didesoxyzucker), Olivose (2,6-
Didesoxyzucker), Rhamnose (6-Desoxyzucker), Carbonylfunktion) (Abbildung 57).
Bemerkerkenswert ist, dass EB unter in vitro Bedingungen kein Akzeptorsubstrat für EryCIII
darstellte, obwohl dies unter in vivo Bedingungen bereits berichtet wurde (Gaisser et al.
-91-
B ERGEBNISSE UND DISKUSSION
2000). Als Fazit der Untersuchungen zum in vitro Akzeptorsubstratspektrum von EryCIII
bleibt festzuhalten, das Makrolide aus der 12er (Methynolid) und 16er Familie (Tylacton)
keine in vitro Akzeptorsubstrate für EryCIII darstellen und das die, im Gegensatz zu EB, für
NB gefundene Akzeptorsubstraterkennung vermutlich auf das Vorhandensein der
Carbonylfunktion in der C-3 Position des NB zurückzuführen ist. Diese Schlussfolgerung
wird durch den direkten Vergleich zwischen EB (Hydroxylgruppe an C-3) und NB
(Carbonylfunktion an C-3) nahe gelegt (Abbildung 57).
O
O
O
OH
OH
OH
OH
EB (-)
O
O
O
OH
O
NB (+) Abb. 57: Strukturvergleich zweier potenzieller in vitro Akzeptoren (EB und NB) für EryCIII
aus Sacc. erythraea. (-): Von EryCIII nicht akzeptiertes Substrat, (+): Von EryCIII
akzeptiertes Substrat.
Ein Vergleich der EryCIII Ergebnisse mit publizierten in vivo Daten für DesVII zeigt, dass
DesVII, im Gegensatz zu EryCIII, in der Lage ist während der Biosynthese vom Methymycin
und Pikromycin sowohl Makrolide der 14er als auch der 12er Familie zu glykosylieren
(Yamase et al. 2000; Borisova et al. 1999). Aufgrund dieser Flexibilität wurde DesVII bereits
im Rahmen der kombinatorischen Biosynthese dazu verwendet, eine Bibliothek von
desosaminylierten, bioaktiven Makroliden zu produzieren, die zum Teil auf stark
modifizierten 6-dEB-Analoga basierten (Abbildung 26) (Tang und McDaniel 2001). Im
Hinblick auf die Akzeptorsubstratflexibilität von verschieden bakteriellen
Glykosyltransferasen gibt es, im Vergleich zur Donorsubstratflexibilität, nur wenige
Untersuchungen. Beispiele dafür sind die in vivo Arbeiten zu UrdGT2, LanGT1, LanGT4
(Trefzer et al. 2002, Hoffmeister et al. 2004, Dürr et al. 2004) und die Arbeiten zu den Mtm-
Glykosyltransferasen (Remsing et al. 2002).
-92-
B ERGEBNISSE UND DISKUSSION
Die hier diskutierten, rein qualitativen Ergebnisse erlauben keine Rückschlüsse auf den
jeweiligen Umsatz oder die Akzeptanz der verschiedenen Akzeptorsubstrate durch EryCIII,
bildeten jedoch die entscheidende Basis für die im weiteren Verlauf der Arbeit erstellten
Michaelis-Menten-Kinetiken (Kap. B 3.1.7), um diese Fragestellungen mit Hilfe der
enzymkinetischen Untersuchungen zu beantworten. Ferner ist es aufgrund des rein
qualitativen Charakters des Stechagarplattentests nicht möglich, die antibiotische Aktivität der
in vitro Produkte mit der antibiotischen Wirksamkeit von Erythromycin A zu vergleichen.
Für die weitere biochemische Untersuchung von EryCIII wurde daher auf den entwickelten
Enzymtest (Kap. E 4.1) zurückgegriffen. Vor Beginn der eigentlichen Messungen erfolgte
jedoch eine ausführliche Charakterisierung des Enzymtests (Kap. B 3.1.3).
3.1.3 Charakterisierung des Enzymtests für die Makrolid-
Glykosyltransferasen Während der Ausarbeitung des Enzymtests für die Makrolid-Glykosyltransferasen (Kap. E
4.1) wurden diverse Kontrollversuche durchgeführt, da die Bestimmung der Enzymaktivität
über die Zunahme des, im Vergleich zu den Makroliden empfindlichen, Nebenprodukts dTDP
erfolgen sollte (Abbildung 58).
O
O
O
O
O
O
O-Zucker
O-Zucker
OH
Makrolacton
GT
hybrides Makrolid
+ dTDP-Zucker + dTDPOH
Abb. 58: Allgemeines Reaktionsschema des Aktivitätstests für die bakteriellen Glykosyltransferasen, GT: Glykosyltransferase.
Daher richtete sich das Hauptaugenmerk der Versuche auf die Stabilität von dTDP-D-
Desosamin bzw. dTDP unter Reaktionsbedingungen (Assaybedingungen) und auf den
Nachweis der direkten Korrelation zwischen dTDP-Freisetzung und Makrolidbildung. Im
wässrigen Milieu ist die Stabilität der nukleotid-aktivierten Desoxyzucker unterschiedlich
stark ausgeprägt, jedoch ist bekannt, dass die Temperatur, der pH-Wert und die Anwesenheit
von Metallionen einen entscheidenden Einfluss auf die Stabilität ausüben. Ein Beispiel dafür
ist die Zersetzung von dTDP-L-Oleandrose (Schulman et al. 1990). Die
-93-
B ERGEBNISSE UND DISKUSSION
Stabilitätsuntersuchungen wurden in Form des unter Kap. E 4.1 beschriebenen Enzymtests
durchgeführt, wobei der jeweilige Ansatz keinen Akzeptor enthielt. Die Proben wurden
zusammenpipettiert, für 2 min bei 95°C (Thermostat 5320, Eppendorf) abgestoppt und danach
mit CE (Kap. E 6.4.1) analysiert. Als Kontrolle dienten Proben ohne Hitzeinaktivierung,
sowie Proben mit und ohne Enzym um einen möglichen Einfluss der Enzympräparation zu
untersuchen. Abbildung 59 zeigt die Stabilitätsuntersuchungen für 0,5 mM dTDP. Die
höchste gefundene Peakfläche für 0,5 mM dTDP wurde zu 100% gesetzt. Alle anderen
Messwerte sind als relative Angaben zu diesem Wert zu verstehen.
0102030405060708090
100
0,5 mMdTDP (-)
0,5 mMdTDP + E (-)
0,5 mMdTDP (+)
0,5 mMdTDP + E (+)
Geh
alt a
n dT
DP
[%]
Abb. 59: Säulendiagramm der Ergebnisse der Stabilitätsuntersuchungen von dTDP unter
Assaybedingungen. (-) = ohne Hitzeinaktivierung, (+) = mit Hitzeinaktivierung, + E = mit 5,8
µg EryCIII aus einer IMAC Aufreinigung. Als Puffer diente 50 mM Glycin/NaCl, pH 8,7 mit
150 mM NaCl und 5 mM MgCl2. Die Analytik erfolgte mit CE (Kap. E 6.4.1).
Die Ergebnisse der Stabilitätsuntersuchungen von dTDP belegen, dass unter den
Reaktionsbedingungen sowohl die Hitzeinaktivierung bei 95°C als auch die An- bzw.
Abwesenheit einer Enzymprobe keinen nennenswerten Einfluss auf die Stabilität des dTDP
hat. Des Weiteren belegen die Untersuchungen, dass die IMAC-Fraktion von EryCIII frei
von nukleotid-spaltenden Aktivitäten (Phosphatasen) war. Die weiteren
Stabilitätsuntersuchungen konzentrierten sich darauf festzustellen, ob unter den
Reaktionsbedingungen nennenswerte Mengen an dTDP durch Hydrolyse des Desoxyzuckers
entstehen können (Abbildung 60).
-94-
B ERGEBNISSE UND DISKUSSION
0102030405060708090
100
1 mM dTDP-Desosamin (-)
1 mM dTDP-Desosamin + E (-)
1 mM dTDP-Desosamin (+)
1 mM dTDP-Desosamin + E (+)
Ant
eil a
n de
r G
esam
tfläc
he [%
]dTDP dTMP Desosamin
Abb. 60: Säulendiagramm der Ergebnisse der Stabilitätsuntersuchungen von dTDP-D-
Desosamin unter Assaybedingungen. (-) = ohne Hitzeinaktivierung, (+) = mit
Hitzeinaktivierung, +E = mit 5,8 µg EryCIII aus einer IMAC Aufreinigung. Als Puffer diente
50 mM Glycin/NaCl, pH 8,7 mit 150 mM NaCl und 5 mM MgCl2. Die Analytik erfolgte mit
CE (Kap. E 6.4.1).
Die Auswertung des Versuchs offenbart, dass sich dTDP-D-Desosamin bei 2minütiger
Hitzebehandlung (95°C) zur Hälfte zu dTMP und zu einer kleinen Menge dTDP zersetzt.
Ähnlich wie bei den Stabilitätsuntersuchungen zuvor mit dTDP (Abbildung 59) scheint
dieser Vorgang unabhängig von der Anwesenheit einer Enzympräparation zu sein. Die
Untersuchung der Korrelation zwischen dTDP-Freisetzung und Makrolidbildung wurden
anhand einer Zeit-Umsatz-Kurve für EryCIII durchgeführt. Der Ansatz wurde bei 30°C
inkubiert und nach 0, 15, 30, 60, 120, 180, 240 bzw. 300 min wurde jeweils ein 100 µl
Aliquot der Reaktion abgenommen und für 5 min bei 95°C abgestoppt (Thermostat 5320,
Eppendorf). Nach dem Abstoppen wurden 50 µl für die HPLC-Analytik (Kap. E 6.2.1)
(Abbildung 61) verwendet und ein Teil der Proben für die DC-Analytik (Kap. E 6.1). Als
Kontrolle für den Versuch diente ein Ansatz ohne Enzym.
-95-
B ERGEBNISSE UND DISKUSSION
0
0,02
0,04
0,06
0,08
0,1
0,12
0,14
0,16
60 120 180 240 300
t [min]
cdT
DP
[mM
]
Abb. 61: Diagramm der Zeit-Umsatz-Kurve für EryCIII zur Überprüfung der Korrelation
zwischen dTDP-Freisetzung und Makrolidbildung. Ansatz: 2,5 mM dTDP-D-Desosamin, 0,25
mM MEB, 100 mM NaH2PO4/10 mM Tris/HCl, pH 8, 5 mM MgCl2, 30°C und 0,2 mg
EryCIII aus einer IMAC-Fraktion. Das Ansatzvolumen betrug 800 µl und die Analytik
erfolgte mit HPLC (Kap. E 6.2.1).
Wie am Säulendiagramm des Korrelationsversuchs zu erkennen ist, ließ sich nach 60 min eine
erste signifikante Freisetzung von dTDP (0,01 mM) nachweisen. Ein Vergleich mit der
entsprechenden DC-Analyse bestätigt (Kap. F 11.3, Abbildung 98), dass die bei der HPLC-
Analyse gefundene Bildung von dTDP mit der Bildung von EryD einhergeht. Wie auf der DC
zu erkennen ist, taucht der erste deutlich sichtbare EryD-Spot nach 60 min auf und nimmt mit
der Zeit in der Intensität zu. Im selben Zeitraum steigt die dTDP-Konzentration im
Reaktionsansatz auf 0,15 mM (t = 300 min) (Abbildung 61).
Abschließend kann zum entwickelten Enzymtest festgehalten werden, dass es gelungen ist,
einen sehr flexiblen Aktivitätstest zur Bestimmung der enzymatischen Aktivität von
(Makrolid-) Glykosyltransferasen zu entwickeln. Dabei können alle Testbestandteile
(Desoxyzucker, Aglyka, Enzym) ausgetauscht werden, ohne dass sich das Prinzip der
Messung ändert. Eine Einschränkung besteht jedoch darin, dass nur Enzymproben vermessen
werden können, die frei von nukleotid-spaltenden Aktivitäten (Phosphatasen) sind und dass
aufgrund der Zersetzung des Nukleotidzuckers das Abstoppen der Reaktion ohne bzw. mit
einer sehr kurzen Hitzeinaktivierung erfolgen muss. Nach der positiven Evaluierung des
Enzymtests war es nun möglich, die weitere Charakterisierung der rekombinanten
-96-
B ERGEBNISSE UND DISKUSSION
Glykosyltransferasen, insbesondere von EryCIII, in die Tat umzusetzen. Vor dem
Hintergrund der kombinatorischen Biokatalyse (EMS) (Kap. B 4.1) spielte dabei sowohl die
Untersuchung des pH- und Temperaturoptimums eine entscheidende Rolle als auch die
Untersuchung der thermischen Inaktivierung von EryCIII und die Erstellung von Michaelis-
Menten-Kinetiken mit verschiedenen Substraten. Um die typischen Bedingungen der
kombinatorischen Biokatalyse im EMS zu berücksichtigen, wurden die Versuche mit IMAC
gereinigten Enzymproben durchgeführt, die direkt aus Sacc. erythraea pEXCIII-Rohextrakt
heraus aufgereinigt wurden.
3.1.4 Bestimmung des pH-Optimums für die Transferreaktion von EryCIII Zu den Kriterien, die einen deutlichen Effekt auf die Enzymaktivität haben, gehört der pH-
Wert der Reaktionslösung. Eine besondere Bedeutung kommt dem pH-Wert dann zu, wenn,
wie im Fall der kombinatorischen Biokatalyse, mehrere Enzyme in einem Topf eingesetzt
werden sollen (Kap. B 4.1). Die Inkubation der Proben erfolgte für jeweils 2 h bei den
angegebenen pH-Werten, wobei alle 15 min eine automatische Probenentnahme in der CE
(Kap. 6.4.1) erfolgte. Aus der jeweiligen Anfangsreaktionsgeschwindigkeit wurde die
Enzymaktivität bestimmt (Kap. E 4.1) (Abbildung 62).
g] ]
Ab
Tra
Ery
erf
Als
0
10
20
30
40
50
6 7 8 9
pH-Wert
Vol
umen
aktiv
ität [
mU
/m
b. 62: Säulendiagramm der Ergebnisse zur Bestimmung des pH-Optimums der
nsferreaktion von EryCIII. Ansatz: 1 mM dTDP-D-Desosamin, 0,5 mM MEB, 4,5 µg
CIII aus einer IMAC Aufreinigung. Die Temperatur betrug 30°C, die Probenentnahme
olgte über 2 h alle 15 min automatisch und die Analytik erfolgte mit CE (Kap. E 6.4.1).
Puffer diente 50 mM HEPES, pH 6 – 9 mit 150 mM NaCl und 5 mM MgCl2.
-97-
B ERGEBNISSE UND DISKUSSION
Wie das Resultat des Versuchs erkennen lässt, ist enzymatische Reaktion von EryCIII stark
pH abhängig (Abbildung 62). Die Reaktionsgeschwindigkeit nahm mit steigender
Alkalisierung zu und erreichte mit 38,7 mU/ml bei pH 9 ihr Maximum. Bereits eine
Erniedrigung des pH-Wertes um eine Einheit auf pH 8, führte zu einer knappen Halbierung
der enzymatischen Aktivität auf 20,2 mU/ml. Bei pH 7 reduzierte sich die enzymatische
Aktivität weiter auf ca. 20 % der Ursprungsaktivität (7,1 mU/ml), um bei pH 6 vollständig
zum Erliegen zu kommen. Die Versuche bei pH 10 und pH 11 haben gezeigt, dass EryCIII bei
pH-Werten bis 11 seine enzymatische Aktivität beibehält, jedoch konnten die entsprechenden
Enzymaktivitäten nicht exakt berechnet werden, da sich unter den alkalischen Bedingungen
eine signifikante Eigenhydrolyse des dTDP-D-Desosamins einstellte. Abschließend bleibt
bzgl. des pH-Optimums der Enzymreaktion von EryCIII festzuhalten, dass das pH-Optimum
im Bereich von pH 9 liegt und das pH-Werte von unter 7 zu einer drastischen
Verschlechterung der Reaktionsgeschwindigkeit führen. Für den Einsatz in der
kombinatorischen Biokatalyse bedeutet dies, dass EryCIII im pH-Bereich von pH 7 – 9
verwendet werden kann, dass aber für einen optimalen Umsatz pH-Werte zwischen 8 und 9
erforderlich sind. Diese Angaben werden auch durch die Ergebnisse der ersten
kombinatorischen Versuche, die bei pH 7,6 stattfanden, unterstützt (Kap. B 4.1). Ein
Vergleich mit publizierten Daten für die pH-Optima anderer Naturstoff-Glykosyltransferasen
zeigt, dass sich das für EryCIII bestimmte pH-Optimum von pH 9 in einem bereits
beschriebenen Rahmen bewegt. Weitere Enzyme mit einem pH-Optimum im Bereich von pH
9 sind die Enzyme GtfB und GtfE aus dem Vancomycin/Teicoplanin Cluster (Losey et al.
2001). Im Gegensatz dazu wurde für NovM ein pH-Optimum von pH 6 (Freel Meyers et al.
2003) bzw. pH 8 (Albermann et al. 2003) berichtet, sowie für GtfA ein pH-Optimum von pH
7,5 (Lu et al. 2004).
3.1.5 Bestimmung des Temperaturoptimums für die Transferreaktion
von EryCIII Ähnlich wie dem pH-Optimum kommt auch dem Temperaturoptimum einer Enzymreaktion
eine entscheidende Rolle für den Einsatz eines Enzyms in der kombinatorischen Biokatalyse
zu. Daher wurde im nächsten Schritt der biochemischen Charakterisierung das
Temperaturoptimum für die enzymatische Reaktion von EryCIII bestimmt. Nach der
2stündigen Inkubation bei den angegebenen Temperaturen wurden die Proben mit CE
analysiert (Kap. E 6.4.1) und die jeweilige Enzymaktivität bestimmt (Kap. E 4.1)
(Abbildung 63).
-98-
B ERGEBNISSE UND DISKUSSION
30l]]
Ab
Tra
Ery
150
Es
lan
bei
20°
(Ab
Zu
ein
Ab
ein
kom
der
mit
Gly
200
akt
bek
0
5
10
15
20
25
25 °C 30 °C 35 °C 40 °C 45 °C
Temperatur [°C]
Vol
umen
aktiv
ität [
mU
/m
b. 63: Säulendiagramm der Ergebnisse zur Bestimmung des Temperaturoptimums der
nsferreaktion von EryCIII. Ansatz: 1 mM dTDP-D-Desosamin, 1 mM MEB, 5,8 µg
CIII aus einer IMAC Aufreinigung. Als Puffer diente 50 mM Glycin/NaCl, pH 8,7 mit
mM NaCl und 5 mM MgCl2. Die Analytik erfolgte mit CE (Kap. E 6.4.1).
zeigte sich, dass die enzymatische Aktivität von EryCIII mit steigender Temperatur
gsam abnahm. Die maximale Reaktionsgeschwindigkeit von 26,3 mU/ml (100%) wurde
einer Reaktionstemperatur von 25°C erreicht. Eine Erhöhung der Reaktionstemperatur um
C auf 45°C resultierte in einem ca. 40%igen Verlust der Enzymaktivität (15,8 mU/mg)
bildung 63). Temperaturen von unter 25°C bzw. über 45°C wurden in diesem
sammenhang nicht untersucht, da sich die bei der kombinatorischen Biokatalyse
gesetzten Temperaturen im untersuchten Rahmen bewegen (Kap. B 4.1).
schließend ist an dieser Stelle festzuhalten, dass EryCIII seine katalytische Aktivität über
en weiten Temperaturbereich entfalten kann, wodurch sich für den Einsatz in der
binatorischen Biokatalyse einen wichtiger Vorteil ergibt. Dies zeigen auch die Ergebnisse
ersten kombinatorischen Versuche, die bei 30°C stattfanden (Kap. B 4.1). Ein Vergleich
Literaturdaten zeigt, dass die bisher publizierten in vitro Versuche mit Naturstoff-
kosyltransferasen typischerweise bei 25°C – 37°C durchgeführt wurden (Losey et al.
1; Freel Meyers et al. 2003; Albermann et al. 2003; Lu et al. 2004), jedoch sind nach
uellem Kenntnisstand keine Untersuchungen zur Bestimmung von Temperaturoptima
annt.
-99-
B ERGEBNISSE UND DISKUSSION
3.1.6 Untersuchung der thermischen Inaktivierung von EryCIII Da Enzyme aufgrund ihres Proteincharakters mehr oder weniger schnell durch
Temperatureinwirkung inaktiviert werden (thermische Inaktivierung), ist es für den Einsatz
eines Enzyms (z. B EryCIII) in der kombinatorischen Biokatalyse (EMS) (Kap. B 4.1) von
großer Bedeutung die Halbwertszeit (t½) zu kennen. Weitere Faktoren die die Halbwertszeit
beeinflussen sind der pH-Wert, die Art des Puffers, die An- oder Abwesenheit von Salzen
bzw. Ko-Faktoren und die Reinheit der Proteinfraktion. Die Untersuchung der thermischen
Inaktivierung von EryCIII erfolgte über einen Zeitraum von 24 h bei 30°C in 50 mM HEPES-
Puffer, pH 8 mit 150 mM NaCl und 5 mM MgCl2. Wie zuvor erwähnt, wurde auch für diesen
Versuch eine IMAC gereinigte Fraktion verwendet, da es sich dabei um eine typische Probe
für einen biokatalytischen Ansatz handelt. Zu den Zeitpunkten 0, 4, 7 und 24 h wurden
Aliquots zur Bestimmung der enzymatischen Aktivität (Kap. E 4.1) abgenommen. Die
Analytik erfolgte mit CE (Kap. E 6.4.1). Zur Bestimmung der der Halbwertszeit (t½) von
EryCIII wurde der natürliche Logarithmus (ln) der spezifischen Aktivität [mU/mg] gegen die
Inkubationszeit [h] bei 30°C aufgetragen und die Inaktivierungskonstante -k über lineare
Regression aus der Steigung der Geraden ermittelt (Abbildung 64).
3,3
3,35
g] ]
Ab
übe
und
mM
y = -0,0129x + 3,303R = 0,999
2,95
3
3,05
3,1
3,15
3,2
3,25
0 5 10 15 20 25 30
Inkubationszeit [h]
ln sp
ez. A
ktiv
ität [
mU
/m
b. 64: Diagramm zur thermischen Inaktivierung einer IMAC gereinigten EryCIII Probe
r 24 h bei 30°C Inkubationstemperatur. Ansatz: 1 mM dTDP-D-Desosamin, 1 mM MEB
11,5 µg EryCIII. Als Puffer diente 50 mM Glycin/NaCl, pH 8,7 mit 150 mM NaCl und 5
MgCl2. Die Analytik erfolgte mit CE (Kap. E 6.4.1).
-100-
B ERGEBNISSE UND DISKUSSION
Erwartungsgemäß zeigte sich beim Verlauf der thermischen Inaktivierung ein linearer
Zusammenhang, so dass von einer Reaktion 1. Ordnung ausgegangen werden konnte
(Abbildung 64). Die Berechnung der Halbwertszeit (t½) ergab für die IMAC gereinigte
EryCIII Probe einen Wert von 54 h. Dabei nahm die spezifische Aktivität innerhalb der 24 h
von 27,4 mU/mg auf 20 mU/mg ab. Durch die Halbwertszeit von mehr als 2 d eignet sich
IMAC gereinigtes EryCIII sehr gut für den Einsatz im Enzym-Modul-System (Kap. B 4.1).
3.1.7 Michaelis-Menten-Kinetiken für EryCIII Voraussetzung für die optimale Auslegung eines kombinatorischen Ansatzes oder einer
enzymatischen Synthese ist das Wissen um die kinetischen Parameter der beteiligten Enzyme.
Eine besondere Rolle spielen dabei die Konstanten Vmax (maximale
Reaktionsgeschwindigkeit), Km (Michaelis-Menten-Konstante bei der die halbmaximale
Reaktionsgeschwindigkeit erreicht wird) und gegebenenfalls Ki (Inhibitionskonstante). Ferner
erlauben umfassende enzymkinetische Untersuchungen die Entwicklung von
Modelvorstellungen zum Reaktions- und/oder Substraterkennungsmechanismus. Die
diesbezüglich mit EryCIII gemachten Untersuchungen wurden mit einer IMAC gereinigten
Probe (Kap. E 2.3.2) durchgeführt, da zum Untersuchungszeitpunkt keine katalytisch aktive,
über Gelfiltration homogen aufgereinigte Probe, zur Verfügung stand. Aus diesem Grund
verstehen sich die angegebenen kinetischen Daten als apparente Werte und es erfolgte keine
Berechnung der Wechselzahl (kcat) bzw. der katalytischen Effizienz (kcat/km). Das Ziel der
Studien war die Bestimmung der kinetischen Konstanten Vmax und Km für die natürlichen
Substrate dTDP-D-Desosamin und Mycarosyl-EB (MEB) und für die nicht natürlichen
Substrate Rhamnosyl-EB (REB) und Narbonolid (NB). Die Arbeiten knüpften dabei direkt an
die qualitativen Untersuchungen zum Akzeptorsubstratspektrum von EryCIII (Kap. B 3.1.2).
Alle kinetischen Messungen wurden so aufgenommen, dass der maximale Umsatz, bezogen
auf dTDP-D-Desosamin, bei 15 % lag. Unter Berücksichtigung des Proteingehalts der Probe
wurde die jeweilige spezifische Aktivität berechnet (Kap. E 4.1).
-101-
B ERGEBNISSE UND DISKUSSION
3.1.7.1 Bestimmung des Vmax- und Km-Werts für dTDP-D-Desosamin
0
spez
. Akt
ivitä
t [m
U/m
g]
0
10
20
30
40
50
60
Abb. 65: M
Km für dTD
µg EryCIII
MgCl2. Die
6.4.1).
Die Berech
ergab für d
von 1,3 ± 0
65). Eine In
Da es sich b
Glykosyltra
Werten für
sich der für
die beiden G
al. 2002) (
dTDP-D-De
R = 0,99
cdTDP-Desosamin
2 4 6
ichaelis-Menten-Diagramm zur Bestim
P-D-Desosamin. Ansatz: 0,5 – 10 mM
. Als Puffer diente 50 mM Glycin/Na
Inkubationstemperatur betrug 25°C u
nung der kinetischen Konstanten üb
TDP-D-Desosamin einen Vmax-Wert v
,14 mM. Der Korrelationskoeffizient (
hibition der Reaktion wurde nicht beob
ei den Ergebnissen um die ersten beka
nsferase handelt, konnte nur ein se
andere Naturstoff-Glykosyltransferas
dTDP-D-Desosamin gefundene Km-W
lucosyltransferasen GtfB (Mulichak e
Tabelle 6) beschriebenen Rahmen b
sosamin ist aufgrund der Publikationsl
-102-
Vmax = 59,9 ± 1,6 mU/mg
Km = 1,3 ± 0,14 mM
[mM]
8 10 12
mung der kinetischen Konstanten Vmax und
dTDP-D-Desosamin, 1 mM MEB und 11,5
Cl, pH 8,7 mit 150 mM NaCl und 5 mM
nd die Analytik erfolgte mit CE (Kap. E
er den Marquardt-Levenberg-Algorithmus
on 59,9 ± 1,6 mU/mg und einen Km-Wert
R) der Regression betrug 0,99 (Abbildung
achtet.
nnten kinetischen Daten für eine Makrolid-
hr eingeschränkter Literaturvergleich mit
en erfolgen. Diese Vergleiche zeigen, das
ert von 1,3 ± 0,14 mM in einem bereites für
t al. 2001) (Tabelle 4) und GtfE (Losey et
ewegt. Ein Vergleich des Vmax-Werts für
age gegenwärtig nicht möglich.
B ERGEBNISSE UND DISKUSSION
3.1.7.2 Bestimmung der Vmax- und Km-Werte für MEB, REB und NB
cMEB [mM
0 2 4 6
spez
. Akt
ivitä
t [m
U/m
g]
0
10
20
30
40
50R = 0,96
Abb. 66: Michaelis-Menten-Diagramm zur Best
und Ki für Mycarosyl-EB (MEB). Ansatz: 0,5 –
11,5 µg EryCIII. Als Puffer diente 50 mM Glyci
MgCl2. Die Inkubationstemperatur betrug 25°C
6.4.1).
-103
Vmax = 98,8 ± 37,6 mU/mg
Km = 1,4 ± 0,96 mM
Ki = 4,0 ± 2,4 mM
]
8 10 12
immung der kinetischen Konstanten Vmax, Km
10 mM MEB, 2 mM dTDP-D-Desosamin und
n/NaCl, pH 8,7 mit 150 mM NaCl und 5 mM
und die Analytik erfolgte mit CE (Kap. E
-
B ERGEBNISSE UND DISKUSSION
cREB [mM
0 2 4 6
spez
. Akt
ivitä
t [m
U/m
g]
0
10
20
30
40 R = 0,98
Abb. 67: Michaelis-Menten-Diagramm zur Best
und Ki für Rhamnosyl-EB (REB). Ansatz: 0,5 –
11,5 µg EryCIII. Als Puffer diente 50 mM Glyci
MgCl2. Die Inkubationstemperatur betrug 25°C
6.4.1).
-104
Vmax = 89,2 ± 35,5 mU/mg
Km = 1,7 ± 1,1 mM
Ki = 2,7 ± 1,5 mM
]
8 10 12
immung der kinetischen Konstanten Vmax, Km
10 mM REB, 2 mM dTDP-D-Desosamin und
n/NaCl, pH 8,7 mit 150 mM NaCl und 5 mM
und die Analytik erfolgte mit CE (Kap. E
-
B ERGEBNISSE UND DISKUSSION
cNB [mM]
0 2 4
spez
. Akt
ivitä
t [m
U/m
g]
0
1
2
3
4
5
R = 0,91
Abb. 68: Michaelis-Menten-Diagramm zur Bestim
Km für Narbonolid (NB). Ansatz: 0,5 – 8 mM N
EryCIII. Als Puffer diente 50 mM Glycin/NaCl, p
Die Inkubationstemperatur betrug 25°C und die A
Tab. 16: Zusammenfassung der kinetischen Daten
EryCIII.
Substrat Vmax [mU/mg] Km [mM
MEB 98,8 ± 37,6 1,4 ± 0,9
REB 89,2 ± 35,5 1,7 ± 1,
NB 3,8 ± 0,18 0,3 ± 0,0MEB: Mycarosyl-EB, REB: Rhamnosyl-EB, NB: Narbono
Michaelis-Menten-Konstante, Ki: Inhibitionskonstante, R: K
Die Anpassung der Messdaten („Fit“) und die B
Hilfe des verwendeten Iterationsverfahrens erg
enzymkinetischen Daten für die untersuchte
Korrelationskoeffizient (R) aller erstellten Reg
ausgegangen werden kann, dass die jeweilige E
Formel hinreichend genau beschrieben wird. Im
-105-
Vmax = 3,8 ± 0,18 mU/mg
Km = 0,3 ± 0,09 mM
6 8 10
mung der kinetischen Konstanten Vmax und
B, 2 mM dTDP-D-Desosamin und 11,5 µg
H 8,7 mit 150 mM NaCl und 5 mM MgCl2.
nalytik erfolgte mit CE (Kap. E 6.4.1).
für die umgesetzten Akzeptorsubstrate von
] Ki [mM] R
6 4,0 ± 2,4 0,96
1 2,7 ± 1,5 0,98
9 Keine Inhibition 0,91 lid, Vmax: maximale Reaktionsgeschwindigkeit, Km:
orrelationskoeffizient der Regressionsanalyse.
erechnung der kinetischen Konstanten mit
ab die in Tabelle 16 zusammengefassten
n Akzeptorsubstrate von EryCIII. Der
ressionen liegt über 0,9, so dass davon
nzymkinetik durch die zugrunde liegende
Vergleich zur Bestimmung der kinetischen
B ERGEBNISSE UND DISKUSSION
Konstanten von dTDP-D-Desosamin (Kap. B 3.1.7.1) fallen jedoch die starken
Schwankungen der einzelnen Vmax-, Km- und Ki-Werte auf. Ursache dafür sind vermutlich
größere Abweichungen bei den einzelnen Messungen. Der direkte Vergleich der
verschiedenen Akzeptorsubstratkinetiken zeigt, dass es große Unterschiede zwischen den
beiden glykosylierten und eng verwandten Akzeptorsubstraten MEB bzw. REB und dem nicht
glykosylierten Akzeptorsubstrat NB gibt. Dies belegen alle kinetischen Konstanten. Wie aus
Tabelle 16 hervorgeht bewegen sich die Vmax- und Km-Werte für MEB und REB in einem
sehr ähnlichen Rahmen, weichen jedoch stark von den Werten für NB ab. Ein Vergleich der
Vmax-Werte offenbart, dass die maximale Reaktionsgeschwindigkeit mit dem natürlichen
Akzeptorsubstrat MEB wie erwartet am höchsten ist (Vmax = 98,8 ± 37,6 mU/mg), knapp
gefolgt von der maximalen Reaktionsgeschwindigkeit mit REB (Vmax = 89,2 ± 35,5 mU/mg).
Gegenüber MEB ist der Vmax-Wert für NB mit 3,8 ± 0,18 mU/mg um den Faktor 26 kleiner.
Die Gegenüberstellung der einzelnen Km-Werte zeigt weiterhin, dass MEB und REB einen
recht ähnlichen Km-Wert besitzen (MEB: Km = 1,4 ± 0,96 mM; REB: Km = 1,7 ± 1,1 mM)
und das die Affinität von EryCIII zum natürlichen Substrat MEB erwartungsgemäß größer ist.
Verglichen dazu stellt der Km-Wert von NB (Km = 0,3 ± 0,09 mM) eine Überraschung dar, da
EryCIII offenbar eine um den Faktor 4,7 höhere Affinität zu NB hat, als zu MEB. Dies
entspricht nicht den Erwartungen, da es sich bei NB um das Akzeptorsubstrat mit dem
geringsten Verwandtschaftsgrad zu MEB handelt. Ein weiterer, sehr bemerkenswerter
Unterschied zwischen MEB bzw. REB und NB ist, dass sich für NB keine
Substratüberschussinhibition (MEB: Ki = 4,0 ± 2,4 mM; REB: Ki = 2,7 ± 1,5 mM)
nachweisen ließ. Ohne weitere kinetische Untersuchungen, z. B. mit anderen Makroliden, ist
eine Interpretation der erzielten Ergebnisse schwierig. Die Ergebnisse für NB könnten
bedeuten, dass ein Zuckerrest in der C-3 Position des Makrolactonrings für die
Akzeptorsubstraterkennung nicht zwingend erforderlich ist, wohl aber für die eigentliche
enzymatische Reaktion von EryCIII und die Freisetzung des Produkts. Ein Vergleich mit den
Ergebnissen der qualitativen Untersuchung des Akzeptorsubstratspektrums von EryCIII
(Kap. B 3.1.2) zeigt, dass EB im Gegensatz zu NB nicht umgesetzt wird. Ob dieser Umstand
auf eine mangelnde Substraterkennung durch EryCIII oder ausschließlich auf das Ausbleiben
der enzymatischen Reaktion zurückzuführen ist, kann jedoch basierend auf den vorliegenden
Daten nicht gesagt werde. Da für die kinetischen Untersuchungen des
Akzeptorsubstratspektrums von EryCIII kein Olivosyl-EB (OEB) zur Verfügung stand, kann
über die kinetischen Konstanten für OEB nur spekuliert werden. Es steht jedoch zu vermuten,
dass sich die Werte im Bereich von MEB und REB bewegen. Hinsichtlich des Umsatzes und
-106-
B ERGEBNISSE UND DISKUSSION
der Akzeptanz der unterschiedlichen Akzeptorsubstrate durch EryCIII bleibt festzuhalten,
dass das natürliche Akzeptorsubstrat MEB die höhere Akzeptanz von beiden untersuchten,
glykosylierten Akzeptorsubstrate besitzt und das die Substratüberschussinhibition durch REB
(REB: 2,7 ± 1,5 mM; MEB: 4,0 ± 2,4 mM) deutlich ausgeprägter ist. Analog wie zuvor für
die kinetischen Konstanten von dTDP-D-Desosamin, ist für kinetischen Parameter von MEB
kein Literaturvergleich mit Daten anderer Makrolid-Glykosyltransferasen möglich. Ein
Vergleich mit Ergebnissen für NovM zeigt, dass sich der Km-Wert für MEB in einem bereits
beschrieben Rahmen bewegt und das im Fall von NovM ebenfalls eine
Substratüberschussinhibition durch das Akzeptorsubstrat (Novobiocinsäure) beobachtet
wurde (Ki = 0,06 mM) (Freel Meyers et al. 2003) (Tabelle 3). Die enzymkinetischen Daten
ermöglichen erstmals eine gezielte Optimierung und Weiterentwicklung des Enzym-Modul-
Systems.
3.2 Biochemische Charakterisierung von EryBV, OleG2 und
TylMII Neben EryCIII, der vorrangig untersuchten Glykosyltransferase, wurden auch die anderen
Transferasen (EryBV, OleG2 und TylMII) so weit als möglich biochemisch untersucht. Wie
bei EryCIII erfolgten die Untersuchungen parallel zur Entwicklung der
Aufreinigungsstrategie und stützten sich ausschließlich auf qualitative Analysen durch DC
(Kap. E 6.1), da der Enzymtest für die Makrolid-Glykosyltransferasen (Kap. E 4.1) noch
nicht zur Verfügung stand. Das vordringlichste Ziel der Arbeiten war der Nachweis der
enzymatischen Aktivität der einzelnen Enzyme und die Untersuchung der in vitro
Substratspektren. Da die natürlichen Donorsubstrate nicht zur Verfügung standen, wurden die
Versuche mit möglichst ähnlichen nukleotid-aktivierten Desoxyzuckern durchgeführt.
-107-
B ERGEBNISSE UND DISKUSSION
3.2.1 Untersuchung des Donorsubstratspektrums von EryBV, OleG2 und TylMII Alle Ansätze wurden über Nacht bei 30°C inkubiert und nach Ablauf der Inkubationszeit
durch Festphasenextraktion konzentriert (Kap. E 6.1.1) und durch DC analysiert (Kap. E
6.1.2).
Tab. 17: Transferversuche zur Untersuchung des Donorsubstratspektrums von EryBV, OleG2 und TylMII.
Enzym Natürliches Donorsubstrat
Verwendete Donorsubstrate Verwendetes Akzeptorsubstrat
EryBV dTDP-L-Mycarose dTDP-L-Rhamnosea EBd
OleG2 dTDP-L-Olivose dTDP-L-Rhamnosea EBd
TylMII dTDP-L-Mycaminose dTDP-3-Amino-3,6-didesoxy-D-glucoseb
dTDP-D-Desosaminc
Tylactone
a = Konzentration 5 mM, b = Konzentration 1 – 2 mM, c = Konzentration 2,5 mM, d = 1 mM, e = 0,5 mM. Bei keinem der Ansätze mit EryBV, OleG2 und TylMII ließ sich ein Produktspot nachweisen,
der auf eine in vitro Enzymaktivität hindeutete (DC-Platten nicht gezeigt). Dieser Umstand
war insofern überraschend, da unter in vivo Bedingungen der Transfer von dTDP-L-
Rhamnose durch EryBV und OleG2 (Gaisser et al. 2000, pers. Mitteilung Prof. Salas, Tabelle
7) bzw. von dTDP-D-Desosamin durch TylMII (Butler et al. 2002) bereits beschrieben wurde.
Die Tatsache, dass es nicht gelungen ist die direkte, unmethylierte Vorstufe des natürlichen
Donorsubstrats für TylMII (dTDP-D-Mycaminose) zu übertragen, deckt sich mit den
Ergebnissen aus in vivo Versuchen mit Streptomyces fradiae, die ebenfalls darauf
hindeuteten, dass die Methylierung der Aminogruppe des Zuckers essentiell für den Transfer
ist (Butler et al. 2002, Gaisser et al. 2000). Unterstützt wurde diese Interpretation durch den
erfolgreichen Transfer von dTDP-D-Desosamin auf Tylacton (Butler et al. 2002), da der
einzige Unterschied zwischen dTDP-D-Mycaminose und dTDP-D-Desosamin darin besteht,
dass die Mycaminose an Position C-4 eine Hydroxylgruppe trägt, die dem Desosamin fehlt.
Die Ergebnisse lassen die Schlussfolgerung zu, dass es signifikante Unterschiede im
Verhalten der Transferasen unter in vivo und in vitro Bedingungen gibt. Für eine genauere
Festlegung der Unterschiede sind jedoch weitere Versuche nötig, um die Bandbreite der in
vitro untersuchten Zucker zu erhöhen. Ein großes Problem stellt dabei die Verfügbarkeit der
geeigneten, komplexen nukleotid-aktivierten Desoxyzucker dar (Rix et al. 2002). Einen
-108-
B ERGEBNISSE UND DISKUSSION
Ausweg aus diesem Problem bietet u. a. das in dieser Arbeit mitentwickelte Enzym-Modul-
System (Kap. B 4.1), das es eine Aufarbeitung der komplexen Zucker überflüssig macht.
Eine unter in vivo Bedingungen häufig gefundene, sehr überraschende Eigenschaft der
Naturstoff-Glykosyltransferasen ist der Transfer eines D- und L-Zuckers durch ein und
dieselbe Transferase (UrdGT2, Hoffmeister et al. 2000, Hoffmeister et al. 2003a; DesVII,
Borisova et al. 1999, Yamase et al. 2000; AvrB, Wohlert et al. 2001). Ein derartiges
Phänomen ist bis dato für eukaryontische Glykosyltransferasen nicht beschrieben worden.
Sehr eindrucksvoll zeigt sich diese Flexibilität am Beispiel der L-Rhamnosyltransferase
(ElmGT) aus dem Elloramycin Biosyntheseweg, die neben einer Reihe von L-Zuckern auch
die korrespondierenden D-Zucker überträgt (Tabelle 7) (Blanco et al. 2001; Mendéz und
Salas 2001). Ein mechanistischer Vorschlag zur Erklärung dieses Phänomens ist in
Abbildung 27 wiedergegeben (Gaisser et al 2002). Unter in vitro Bedingungen wurde ein
derartiges Verhalten für eine bakterielle Glykosyltransferase bis jetzt nur für NovM, der L-
Noviosyltransferase aus dem Novobiocin Biosyntheseweg beschrieben. NovM ist in der Lage
neben dem natürlichen Substrat, der dTDP-L-Noviose, auch verschiedene dTDP-D-Glucose
Derivate zu übertragen (Tabelle 7) (Albermann et al. 2003; Freel Meyers et al. 2003).
Aufgrund der vorliegenden Ergebnisse kann daher zum gegenwärtigen Zeitpunkt die Frage,
ob alle in dieser Arbeit behandelten Makrolid-Glykosyltransferasen funktionell produziert
wurden, nicht abschließend beantwortet werden, da für die Beantwortung dieser Frage
Versuche mit den natürlichen Desoxyzuckern durchgeführt werden müssten.
-109-
B ERGEBNISSE UND DISKUSSION
4.1 Untersuchungen zur kombinatorische Biokatalyse Die kombinatorische Biokatalyse spielt eine immer bedeutsamere Rolle bei der Entwicklung
neuer Leitstrukturen im Bereich der Natur- und Wirkstoffforschung. Das in der dieser Arbeit
mitentwickelte Enzym-Modul-System (EMS) zur kombinatorischen Biokatalyse wurde
bereits in Kap. A 4 ausführlich erläutert. Zur besseren Orientierung ist das Enzym-Modul-
System jedoch nochmals in Abbildung 69 gezeigt.
O
HOHO
OH
HOH2C
OO
HOHO
OH
HOH2C
OdTDP
O
HO
HO
HO
OH
SuSy
O
HOOH
H3C
OdTDP
O
O
O
O
OH
OHO
O
O
O
O
O
O
dTDP +
D- und L-Desoxy-zucker
GT+ dTDP
A
B
C
Saccharose dTDP-D-Glucose
dTDP-6-Desoxy-4-keto-D-glucose
Aglykon/Akzeptor
Hybrides Makrolid
Abb. 69: Enzym-Modul-System (EMS) zur Produktion von neuartig glykosylierten
Antibiotika bzw. Naturstoffen durch kombinatorische Biokatalyse (SuSy: Sucrose Synthase,
GT: Glykosyltransferase).
4.1.1 Einsatz von EryCIII im EMS und Kopplung von Modulen Ziel der nachfolgend beschriebenen Versuche war es in einem ersten Ansatz die in situ
Regeneration von dTDP-aktivierten Desoxyzuckern im Enzym-Modul-System zu
untersuchen. Dabei richtete sich das Hauptaugenmerk auf die Verbindung der Module C und
A durch den Einsatz von EryCIII, sowie auf den nachfolgenden Übergang in Modul B durch
den Einsatz einer Dehydratase (RmlB) (Abbildung 69). Um dieses Ziel zu erreichen, wurde
-110-
B ERGEBNISSE UND DISKUSSION
EryCIII dazu verwendet MEB mit Desosamin zu glykosylieren und das anfallende dTDP mit
SuSy und RmlB zur Synthese von dTDP-6-Desoxy-4-keto-glucose (Ketozucker) genutzt. Um
den Effekt der Kombination mehrerer Enzyme besser beurteilen zu können, wurden zwei
verschiedene kombinatorische Ansätze erstellt. Bei Ansatz A wurden EryCIII und SuSy
kombiniert eingesetzt, bei Ansatz B EryCIII, SuSy und RmlB. Die Ansätze wurden durch
HPLC analysiert (Kap. E 6.2.1). Die folgenden Diagramme spiegeln die Ergebnisse von
Ansatz A (Abbildung 70) und Ansatz B (Abbildung 71) wieder. Aufgrund der zuvor
bestätigten Korrelation zwischen dTDP-Freisetzung und Makrolidbildung (Kap. B 3.1.3),
wurden keine DC-Kontrollen der Ansätze durchgeführt.
0
0,2
0,4
0,6
0,8
1
1,2
1,4
0 1 2 3 4 5 6 7
Zeit [h]
Kon
zent
ratio
n [m
M]
dTDP dTDP-Glucose
Abb. 70: Diagramm der Ergebnisse des kombinatorischen Ansatzes mit EryCIII und SuSy
(Ansatz A). Ansatz: 2,5 mM dTDP-D-Desosamin, 1 mM MEB, 250 mM Saccharose, 1 U
SuSy 1 und 2 mg EryCIII aus einer IMAC-Fraktion in 100 mM HEPES, pH 7,6 mit 10 mM
MgCl2.
Die HPLC-Ergebnisse von Ansatz A beweisen, dass der kombinatorische Ansatz mit EryCIII
und SuSy erfolgreich war und das die Module C (Glykosyltransferase-Modul) und A (SuSy-
Modul) durch den Einsatz von EryCIII verknüpft werden konnten. Dies zeigt sich darin, dass
mit der beginnenden Freisetzung von dTDP und der Spaltung von Saccharose durch SuSy 1
dTDP-Glucose gebildet wurde. Innerhalb der ersten 2 h der Reaktion hielten sich die
Freisetzung von dTDP und die Synthese von dTDP-Glucose die Waage. Nach 2 h zeichnete
-111-
B ERGEBNISSE UND DISKUSSION
sich eine Stagnation der dTDP-Glucose Synthese ab und es erfolgte weiterhin eine
kontinuierliche Bildung von dTDP durch die Glykosylierungsreaktion von EryCIII. Nach 6 h
erreichte die Konzentration des freigesetzten dTDP ein Maximum von etwa 1,2 mM bei einer
dTDP-Glucose Konzentration von ca. 0,5 mM. Die Ergebnisse der ersten 6 h des Versuchs
legen nahe, dass nach 2 h bei einer dTDP-Glucose Konzentration von ca. 0,6 mM eine
Produktüberschussinhibition der SuSy 1 Spaltaktivität durch dTDP-Glucose erfolgte. In
Syntheserichtung ist für SuSy 1 aus Kartoffel eine Substratüberschussinhibition durch UDP-
Glucose von 2,3 ± 0,2 mM beschrieben (Römer 2003). Bezogen auf den Akzeptor MEB (1
mM) bedeutet das Ergebnis der 6 h Messung eine, in der Summe, deutlich höhere
Gesamtkonzentration an dTDP-Verbindungen, als aus einem quantitativen Umsatz von MEB
hervorgehen sollte. Dies ist u. U. auf eine Zersetzung des dTDP-D-Desosamins (2,5 mM im
Ansatz) zurückzuführen, wodurch sich die additiven Werte erklären. Eine weitere denkbare
Fehlerquelle ist eine höhere Akzeptorkonzentration im Ansatz, als angenommen. Dies kann
aufgrund der Angaben zur Reinheit des MEB und der Tatsache, dass es erforderlich war MEB
in 100% Methanol zu lösen und zu pipettieren nicht völlig ausgeschlossen werden.
-0,20
0,20,40,60,8
11,21,41,6
0 5 10 15 20 25 30
Zeit [h]
Kon
zent
ratio
n [m
M]
dTDP-Glucose dTDP-6-Desoxy-4-keto-glucose
Abb. 71: Diagramm der Ergebnisse des kombinatorischen Ansatzes mit EryCIII, SuSy und
RmlB (Ansatz B). Ansatz: 2,5 mM dTDP-D-Desosamin, 1 mM MEB, 250 mM Saccharose,1
U SuSy, 1 U RmlB und 2 mg EryCIII aus einer IMAC-Fraktion in 100 mM HEPES, pH 7,6
mit 10 mM MgCl2.
-112-
B ERGEBNISSE UND DISKUSSION
Die Daten A von Ansatz B belegen, dass der kombinatorische Ansatz mit EryCIII, SuSy 1
und RmlB erfolgreich verlief und die Module C, A und B miteinander verknüpft werden
konnten. Es zeigt sich, dass in den ersten 30 Minuten der Reaktion ausschließlich dTDP-
Glucose durch die SuSy-Reaktion gebildet wurde und dass noch kein Ketoprodukt entstand.
Dies ist u. U. darauf zurückzuführen, dass schon kleinste dTDP-Konzentrationen RmlB stark
inhibieren (Ki = 2,5 µM) (Amann et al. 2001), welches zunächst von SuSy 1 umgesetzt
werden musste. Die durch die SuSy-Reaktion in den ersten 30 Minuten gebildeten
Konzentrationen an dTDP-Glucose entsprachen in etwa den Konzentrationen, die in Ansatz A
in derselben Zeit gebildet wurde (ca. 0,2 mM) (Abbildung 70). Im weiteren Verlauf der
Reaktion setzte nach 30 Minuten eine deutliche Produktion der dTDP-6-Desoxy-4-keto-
glucose eine, die nach 24 h mit etwa 1,4 mM ihr Maximum erreichte. Während dieser Zeit
pendelte sich die Produktion von dTDP-Glucose im Mittel auf 0,15 mM ein. Der direkte
Vergleich zwischen Ansatz A und Ansatz B zeigt, dass die Produktion von dTDP-6-Desoxy-
4-keto-glucose durch RmlB, im Gegensatz zur Produktion von dTDP-Glucose in Ansatz A,
während der gesamten Reaktionszeit ungehindert erfolgt. Dieser Umstand belegt, dass sowohl
SuSy, als auch RmlB und EryCIII durch die nachgewiesenen Konzentrationen an Ketozucker
nicht inhibiert werden. Dadurch ergibt sich die Möglichkeit die in Ansatz A beobachtete
Produktüberschussinhibition von SuSy 1 durch dTDP-Glucose durch den Einsatz größerer
Mengen an RmlB zu überwinden, zumal eine Inhibition von SuSy 1 durch dTDP-6-Desoxy-4-
keto-glucose bisher nicht beschrieben wurde. Durch eine weitere Erhöhung der eingesetzten
Enzymaktivitäten an SuSy 1 und RmlB kann die Umsetzung zum Ketoprodukt weiter
beschleunigt werden, so dass im Ansatz keine dTDP-Glucose mehr nachweisbar wäre.
Bezogen auf den Akzeptor MEB (1 mM) bedeutet das Ergebnis der 24 h Messung eine, in der
Summe, deutlich höhere Gesamtkonzentration an dTDP-Verbindungen, als aus einem
quantitativen Umsatz von MEB hervorgehen sollte. Zurückzuführen ist dies vermutlich auf
dieselben Ursachen wie bei Ansatz A. Der 24 h Wert der Reaktion zeigt des Weiteren, dass
sich das Hauptprodukt, die dTDP-6-Desoxy-4-keto-glucose, unter den Reaktionsbedingungen
erstaunlich stabil verhält.
Im Ergebnis beider Ansätze bleibt festzuhalten, dass es durch die erfolgreiche Verknüpfung
der Modul C, A und B gelungen ist, dass zentrale Intermediat (dTDP-6-Desoxy-4-keto-
glucose) für die nachfolgenden Umsetzungen im Desoxyzucker-Modul (Modul B)
bereitzustellen. Da dTDP-6-Desoxy-4-keto-glucose selbst jedoch kein geeignetes Substrat für
EryCIII darstellt, konnte der Zyklus an dieser Stelle nicht vollständig geschlossen werden.
Weitere Arbeiten mit flexibleren Glykosyltransferasen, sowie die Optimierung der Produktion
-113-
B ERGEBNISSE UND DISKUSSION
und die Vergrößerung der Vielfalt der Desoxyzucker im Modul B werden mit hoher
Wahrscheinlich einen vollständigen Abschluss des Zyklus ermöglichen.
Als Fazit bleibt an dieser Stelle festzuhalten, dass das in dieser Arbeit mitentwickelte Enzym-
Modul-System (EMS) einen sehr viel versprechenden und bis jetzt einzigartigen
kombinatorischen Ansatz zur in vitro Produktion von neuartig glykosylierten Naturstoffen
und Antibiotika für Screeningzwecke darstellt. Ferner ist das EMS auch als Aktivitätstest für
Enzyme anwendbar, die eine ausgeprägte Inhibition durch dTDP zeigen. Das System ist
insbesondere im Vergleich zum „in vitro glycorandomization“ (IVG) Ansatz von Thorson
und Mitarbeitern (Thorson et al. 2004, Albermann et al. 2003, Fu et al. 2003) von großem
Interesse, da es die in situ Regeneration der komplexen Desoxyzucker einschließt und eine
hohe Flexibilität in Bezug auf den produzierten nukleotid-aktivierten Desoxyzucker bietet.
Der Hauptvorteil des EMS im Vergleich zur IVG ist dabei, dass eine chemische oder
enzymatische Aktivierung der Desoxyzucker nicht erforderlich ist, und dass die
verschiedenen Desoxyzucker ausgehend von dTDP-D-Glucose im Desoxyzucker-Modul (B)
aufgebaut werden können. Für eine weitere Optimierung und Vereinfachung der Handhabung
des EMS ist der Einsatz von immobilisierten Enzymen von großem Interesse. Um dieses
Potenzial zu untersuchen wurden daher erste Versuche zur Immobilisierung von EryCIII an
Ni2+-NTA-MagnetoBeads durchgeführt und die katalytischen Nutzung des EryCIII-
Immobilisats untersucht (Kap. B 4.1.2 und B 4.1.3).
4.1.2 Immobilisierung von EryCIII an Ni2+-NTA-MagnetoBeads Für die Immobilisierung von EryCIIII wurden Ni2+-NTA-MagnetoBeads verwendet, weil das
Zusammenspiel von Ni2+-NTA- und His6-tag-Technologie eine spezifische und gerichtete
Immobilisierung eines Enzyms, auch direkt aus Rohextrakt heraus, ermöglicht. Dies trägt
maßgeblich zur Vereinfachung der Enzymimmobilsierung bei. Durch den Versuch sollte der
Nachweis erbracht werden, dass eine auf diese Art und Weise immobilisierte Makrolid-
Glykosyltransferase im EMS in immobilisierter Form genutzt werden kann. Ein weiterer, im
Zusammenhang mit dem EMS ganz entscheidender Vorteil der MagnetoBead-Technologie,
ist die sehr effiziente, schnelle und einfache Separation des Immobilisats und die
Widerverwendbarkeit des Enzyms.
4.1.3 Katalytischer Einsatz der immobilisierten Glykosyltransferase Abbildung 72 zeigt das Ergebnis der DC-Analyse des Versuchs nach Festphasenextraktion
der Proben (Kap. E 6.1). Als Positivkontrolle diente ein Teil des zur Immobilisierung von
-114-
B ERGEBNISSE UND DISKUSSION
EryCIII verwendeten Sacc. erythraea pEXCIII-Rohextrakts und als Referenzprobe zur
Überprüfung des Immobilisierungserfolgs (Negativkontrolle) die 3. Waschfraktion, da diese
Fraktion kein Enzym enthalten sollte.
EryDEryD
Abb. 72:
RE: Rohe
Beadsuspe
kDa (Hers
der Auftra
dTDP-D-D
HEPES-Pu
Probe. Ein
aufgrund d
Das Ergeb
dass es ge
MagnetoB
Rohextrak
Umsatz in
offensichtl
scheinbar
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1
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2
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mit 5 mM
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-Analytik
EryCIII
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MgCl2.
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ein MEB
ryCIII in
dieser Pr
4
W
MEB
W
MEB
er immobilisierten Transferase EryCIII (Ausschnitt).
pEXCIII, MEB: Mycarosyl-EB (Standard), B:
zym (max. 30 µg Protein bei einer Molmasse von 24
Waschfraktion der Immobilisierung, 1 – 4: Nummer
der immobilisierten Transferase wurde mit 2,5 mM
über Nacht bei 30°C durchgeführt. Als Puffer diente
Das Ansatzvolumen betrug jeweils 500 µl mit 250 µl
haltes der Rohextraktprobe (Bradford 1976) erfolgte
ween 20 nicht.
ivitätstests mit der immobilisierten Transferase zeigt,
haltung der enzymatischen Aktivität an Ni2+-NTA-
bbildung 72). Dies belegt der Vergleich der
1) mit der Probe der Beadsuspension (Spur 3). Der
1) und in der Immobilisatprobe (Spur 3) erfolgte
mehr zu erkennen ist. Weiterhin ist zu sehen, dass
der 3. Waschfraktion (Spur 4) der Immobilisierung
obe kleinste Mengen EryD gebildet wurden. Ob die
-115-
B ERGEBNISSE UND DISKUSSION
Aktivität auf mangelnde Separation der MagnetoBeads oder auf lösliches Protein im Ansatz
zurückzuführen ist, kann jedoch ohne weitere Analysen (z B. ELISA) nicht gesagt werden.
Eine Bestimmung der Immobilisierungsausbeute erfolgte bei diesem Versuch aufgrund der
Substratlimitierung für enzymatische Tests nicht, jedoch ist eine Bestimmung der
entsprechenden Ausbeute über ELISA denkbar.
Durch die Immobilisierungsergebnisse für EryCIII ergibt sich die Perspektive einen
kombinatorischen Ansatz durch den Einsatz von immobilisierten Enzymen zu vereinfachen
und ökonomischer zu gestalten. In Kombination mit anderen immobilisierten Enzymen kann
auf diese Art und Weise eine „Toolbox“ für die kombinatorische Biokatalyse aufgebaut und
die praktische Nutzung erheblich erleichtert werden. Für eine abschließende Beurteilung der
Immobilisierungsmethode müssen noch eine Reihe von Untersuchungen zur Stabilität der
Immobilisate, insbesondere zum „Ausbluten“ der immobilisierten Enzyme unter
verschiedenen Bedingungen, durchgeführt werden. Zum gegenwärtigen Zeitpunkt können
keine Angaben zur Langzeitstabilität der Immobilisierung über IMAC gemacht werden,
jedoch ist zu vermuten, dass die Stabilität nicht mit klassischen Immobilisierungsmethoden,
wie z. B. Quervernetzung oder kovalente Kopplung an eine Trägermatrix, zu vergleichen ist.
Nach aktuellem Kenntnisstand stellt die vorgestellte Immobilisierung und katalytisch
Nutzung einer immobilisierten Makrolid-Glykosyltransferase das einzig bekannte Beispiel
seiner Art dar, da alle bis dato publizierten in vitro Arbeiten mit löslichen Enzymen
durchgeführt wurden (Losey et al. 2002; Albermann et al. 2003; Freel Meyers et al. 2003;
Quirós et al. 1998; Hernandéz et al. 1993; Mulichak et al. 2001). Des Weiteren zeigen die
Ergebnisse des Versuchs eindrucksvoll die Bedeutung der Immobilisierung von Enzymen für
die zukünftige kombinatorische Biokatalyse.
-116-
C ZUSAMMENFASSUNG
C Zusammenfassung In der vorliegenden Arbeit wurde ein Fermentationsverfahren entwickelt, um die Makrolid-
Glykosyltransferasen EryCIII (Desosaminyltransferase), EryBV (Mycarosyltransferase),
OleG2 (Olivosyltransferase) und TylMII (Mycaminosyltransferase) für den Einsatz in der
kombinatorischen Biokatalyse rekombinant in Saccharopolyspora erythraea zu produzieren.
Alle produzierten Enzyme trugen zur Vereinfachung der Aufreinigung einen C-terminalen
His6-tag. Dabei wurde z. B. bei einer 30 L-Fermentation von Saccharopolyspora erythraea
pEXCIII auf Minimalmedium eine Ausbeute von 481 g Biofeuchtmasse erreicht. Die lösliche
Produktion aller vier exprimierten Glykosyltransferasegene konnte durch Immunoblotting
bzw. ELISA nachgewiesen, und im Fall von EryCIII und EryBV durch N-terminale Mikro-
Proteinsequenzierung bestätigt werden. Dabei wurden signifikante Unterschiede im
Expressionsniveau zwischen den homolog produzierten Transferasen EryCIII/EryBV und den
heterolog produzierten Transferasen OleG2/TylMII sichtbar.
Aufgrund der eingeschränkten Verfügbarkeit von geeigneten Donorsubstraten (dTDP-
aktivierten Desoxyzuckern) für die verschiedenen Glykosyltransferasen konzentrierten sich
die weiteren Arbeiten auf die Desosaminyltransferase EryCIII, an deren Beispiel eine
skalierbare Aufreinigungsstrategie etabliert wurde. Die entwickelte Aufreinigungsstrategie
setzt sich aus einer Anionenaustauschchromatographie an Q-Sepharose 6 FF, einer
immobilisierten Metallionenaffinitätschromatographie (IMAC) an Ni2+-NTA und einer
Gelfiltration an Superdex G200 zusammen. Ausgehend von 80 g Biofeuchtmasse wurden
über eine präparative Aufreinigung durch Anionenaustausch und IMAC 72 mg EryCIII
dargestellt. Durch die nachfolgende Gelfiltration wurde ein Teil dieser Probe bis zur völligen
Homogenität aufgereinigt und das native Molekulargewicht von EryCIII bestimmt. Dabei
ließen sich sowohl Di- (98,3 kDa) als auch Trimere (130,7 kDa) von EryCIII nachweisen,
aber überraschenderweise keine Monomere. Die Bestimmung der spezifischen Aktivität der
Probe ergab einen Wert von 80 mU/mg.
Eine zu Beginn der Arbeit durchgeführte erste qualitative Untersuchung des
Akzeptorsubstratspektrums von EryCIII, gestützt auf DC- und HPLC-MS-Analytik zeigten,
dass EryCIII nicht nur sein natürliches Akzeptorsubstrat Mycarosyl-Erythronolid B umsetzen
kann, sondern auch eine Reihe anderer Akzeptorsubstrate aus der Familie der 14er Makrolide.
Dazu gehören Olivosyl-Erythronolid B, Rhamnosyl-Erythronolid B und Narbonolid. Die
Produkte (Erythromycin D, Desosaminyl-olivosyl-Erythronolid B, Desosaminyl-rhamnosyl-
Erythronolid B und Narbomycin) wurden über Massenspektrometrie identifiziert und wiesen
eine antibiotische Aktivität gegen den Teststamm Kocuria rhizophila (ATCC 9341) auf. Bei
-117-
C ZUSAMMENFASSUNG
Desosaminyl-olivosyl-Erythronolid B und Desosaminyl-rhamnosyl-Erythronolid B handelt es
sich um neuartige Makrolid-Antibiotika, deren in vitro Produktion zum ersten Mal in dieser
Arbeit beschrieben wurde. Im weiteren Verlauf der Arbeit wurde EryCIII mit Hilfe des auf
HPLC- bzw. CE-Analytik basierenden Enzymtests erstmals einer eingehenden biochemischen
Charakterisierung unterzogen. Dabei zeigte sich, dass das pH-Optimum für die Reaktion von
EryCIII im Bereich von pH 9 und das Temperaturoptimum bei 25°C liegt, und dass das
Enzym seine enzymatische Aktivität über einen weiten pH- (pH 7 – 11) und
Temperaturbereich (25°C – 45°C) entfalten kann. Die Untersuchung der thermischen
Inaktivierung zeigte, dass EryCIII bei 30°C eine Halbwertszeit von mehr als 2 Tagen aufweist
und daher für den Einsatz in der kombinatorischen Biokatalyse gut geeignet ist.
Untersuchungen zur Michaelis-Menten-Kinetik von EryCIII haben offenbart, dass Mycarosyl-
Erythronolid B und Rhamnosyl-Erythronolid B, im Gegensatz zu Narbonolid, zu einer
deutlichen Substratüberschussinhibition führen (MEB: Ki = 4,0 ± 2,4 mM; REB: Ki = 2,7 ±
1,5 mM). Außerdem ergaben weitere Studien, dass sich die Enzymkinetik für Narbonolid
signifikant von den anderen Enzymkinetiken unterscheidet. Dies zeigte sich besonders im
extrem niedrigen Vmax-Wert von 3,8 ± 0,18 mU/mg (MEB: Vmax = 98,8 ± 37,7 mU/mg; REB:
Vmax = 89,2 ± 35,5 mU/mg). Der Vergleich der Km-Werte zeigt weiterhin, dass EryCIII eine
überraschend starke Affinität zu Narbonolid hat (Km = 0,3 ± 0,09 mM) und dass die Affinität
für Mycarosyl-Erythronolid B (Km = 1,4 ± 0,96 mM) erwartungsgemäß größer ist als für
Rhamnosyl-Erythronolid B (Km = 1,7 ± 1,1 mM). Für das Donorsubstrat dTDP-D-Desosamin
wurde ein Vmax-Wert von 59,9 ± 1,6 mU/mg und ein Km-Wert von 1,3 ± 0,14 mM festgestellt.
Die ersten Versuche mit dem Enzym-Modul-System haben am Beispiel von EryCIII gezeigt,
dass das Glykosyltransferase-Modul (C) erfolgreich etabliert und mit dem SuSy-Modul (A)
und dem Desoxyzucker-Modul (B) verbunden werden konnte. Das dabei im
Glykosyltransferase-Modul (C) freiwerdende dTDP wurde mit Hilfe von SuSy 1 und RmlB
zur in situ Regeneration von dTDP-6-Desoxy-4-keto-D-glucose genutzt. Die erfolgreiche
Immobilisierung von EryCIII über den C-terminalen His6-tag an Ni2+-NTA-MagnetoBeads
und die katalytische Nutzung des Immobilisats lässt neue und sehr interessante Perspektiven
im Hinblick auf den zukünftigen Einsatz von immobilisierten Enzymen in der
kombinatorischen Biokatalyse erkennen. Durch diese Arbeiten konnte ein wesentlicher
Beitrag zur Entwicklung einer neuartigen, kombinatorischen Strategie zur in vitro Synthese
von bioaktiven Verbindungen für Screeningzwecke geleistet werden.
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D AUSBLICK
D Ausblick Weiterführende Untersuchungen zum in vitro Substratspektrum der verschiedenen Naturstoff-
Glykosyltransferasen sind von großem Interesse, da der kombinatorischen Biokatalyse in
Zukunft eine noch größere Bedeutung, sowohl bei der Entwicklung neuer Leitstrukturen als
auch bei der Weiterentwicklung bestehender Leitstrukturen zukommen wird. Um dieses Ziel
zu erreichen ist es jedoch essentiell den Zugang zu den komplexen, nukleotid-aktivierten
Desoxyzuckern zu verbessern. Einen wesentlichen Aspekt in diesem Zusammenhang stellte
die Entwicklung neuer Expressionssysteme und die Weiterentwicklung bestehender
Expressionssysteme dar. Dies ist erforderlich, da praktisch alle Enzyme, die zur Synthese der
komplexeren nukleotid-aktivierten Desoxyzucker nötig sind, aus Streptomyceten stammen
und durch den vergleichsweise hohen GC-Gehalt der Gene dazu neigen, unter rekombinanten
Bedingungen überwiegend als inaktive „inclusion bodies“ exprimiert zu werden.
Des Weiteren sind am Beispiel von EryCIII Untersuchungen mit gezielt veränderten
Makrolactonen von Relevanz. Durch derartige Studien, gestützt durch Proteinkristallisation
und weiterführende Enzymkinetiken, eröffnet sich die Möglichkeit weit reichende Einblicke
in die bis dato praktisch unbekannten Mechanismen der Akzeptorsubstraterkennung der
Makrolid-Glykosyltransferasen zu gewinnen. Die enzymkinetischen Daten sind außerdem
sehr wertvoll, um das vorgestellte Enzym-Modul-System, bestehend aus SuSy-Modul,
Desoxyzucker-Modul und Glykosyltransferase-Modul, weiterzuentwickeln und zu
optimieren. In diesem Zusammenhang ist auch eine gezielte oder ungezielte Veränderung der
Makrolid-Glykosyltransferasen von großem Interesse, um das Substratspektrum zu erweitern
und die Produktvielfalt zu vergrößern.
Zusätzliche Untersuchungen sollten Versuche zur Immobilisierung anderer Biokatalysatoren
und zur Charakterisierung der Immobilisierung im Hinblick auf Effizienz und Stabilität der
Immobilisate umfassen, zumal der Einsatz der immobilisierten Enzyme im Enzym-Modul-
System noch aussteht.
Ein neues, sehr interessantes Feld tut sich im Hinblick auf die in vitro produzierten hybriden
Makrolid-Antibiotika Desosaminyl-olivosyl-Erthronolid B und Desosaminyl-rhamnosyl-
Erthronolid B) auf, da eine ganze Reihe von Fragen (Wirksamkeit im Vergleich zu
Erythromycin A, Induktion von Resistenzmechanismen, Bioverfügbarkeit, etc.) offen
geblieben sind.
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E MATERIAL UND METHODEN
E Material und Methoden
1 Kultivierung und Proteinproduktion 1.1 Kultivierung der Actinomyceten Die Kultivierung der verschiedenen Actinomyceten Stämme (Streptomyces spec. und Saccharopolyspora erythraea) wurde auf TSB-Fertigmedium (Oxoid), Sucrose-Succinat-Minimalmedium (Caffrey et al. 1992) oder Maltose-Glutatmat-Medium (Doull und Vining 1989) durchgeführt (Kap. F 2). Die eigentliche Proteinproduktion erfolgte durch Fermentation der Expressionsstämme im 10 – 30 L Maßstab. Alle Medien wurden durch Autoklavieren (20 min, 121°C) sterilisiert und die Antibiotika steril zugesetzt. 1.1.1 Expression der Glykosyltransferasegene in Actinomyceten Die für die Fermentationen erforderlichen Vorkulturen wurden in Erlenmyerkolben mit vier Schikanen und 2 bis 3 Metallspiralen im Kulturmedium (Kontrolle der Mycelbildung) einheitlich bei 28°C, 200 Upm und 25 µg/ml Thiostrepton (Sigma-Aldrich) (Ausnahme S. albus OleG2, kein Selektionsmarker) auf TSB-Medium in einem Infors HT Schüttler (Infors) angezogen. Das Thiostrepton wurde vor der Zugabe zur Kultur in purem DMSO (Roth) gelöst. Die Vorkulturvolumina wurden so gewählt, dass die Fermenterkulturen mit 1% (v/v) (Streptomyces spec. auf TSB-Medium) bzw. 2% (v/v) (Saccharopolyspora erythraea auf Sucrose-Succinat-Medium) ihres Volumens angeimpft werden konnten. Um eine ausreichende Belüftung der Kulturen sicherzustellen, wurden die Vorkulturkolben mit maximal 25% ihres Gesamtvolumens befüllt. Die Vorkulturen wurden ausgehend von DMSO- bzw. Glyzerin-Kryokulturen im Verhältnis 1:1000 angeimpft und für 24 - 36 h bei den angegebenen Bedingungen inkubiert. Im Anschluss wurde die jeweilige Kultur unter der Sterilbank (Mahl) in eine autoklavierte Flasche umgefüllt und zur Inokulation des Fermenters (Modell „Techfors“, 20 L bzw. 40 L Kesselvolumen, Infors) (Institut für Enzymtechnologie, Heinrich-Heine-Universität Düsseldorf) eingesetzt. Die Inokulation erfolgte mittels eines geeigneten Animpfbestecks (Infors) und einer Schlauchpumpe (Watson-Marlow). Über den gesamten Verlauf der Fermentation erfolgten die Steuerung, sowie die Dokumentation PC gestützt mit Hilfe der Steuerungs- und Dokumentationssoftware Iris NT (Infors). Im Folgenden sind die Fermentationsparameter dargelegt: Fermenter: Techfors, 20 L bzw. 40 L Rührkesselvolumen Medium: 10 L bzw. 30 L Komplex- oder Minimalmedium Selektionsmarker: Thiostrepton (25 mg/L) (außer S. albus) Temperatur: 28°C pH-Wert: 6,8 (TSB-Medium) bzw. 6,6 (Sucrose-Succinat- und Maltose- Glutamat-Medium) Lauge: 3 M NaOH (Roth)
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E MATERIAL UND METHODEN Säure: 3 M H3PO4 (Roth) Antischaummittel: Sigma Antifoam 289 (Sigma-Aldrich) (1 - 3 ml pro Fermentation) pO2: >30% < 40%; geregelt Rührerdrehzahl: 200 – 1500 Upm; geregelt Belüftungsrate (Flow): 5 – 40 NL/min; geregelt Um zu gewährleisten, dass die Kulturen zu jedem Zeitpunkt der Fermentation ausreichend mit Sauerstoff versorgt wurden, erfolgte eine Regelung des Sauerstoffpartialdrucks (pO2). Dies geschah mittels einer dynamischen Regelung der Belüftungsrate und der Rührerdrehzahl. Als Schwellwert wurde eine Sauerstoffsättigung von 30% gewählt, wobei die Regulation aktiviert wurde, sobald der pO2 einen Wert von 40% unterschritt. Der pH-Wert wurde während der gesamten Fermentation mit Hilfe der an den Fermenter angeschlossenen Säure und Lauge konstant gehalten. Die Kultivierungsdauer variierte je nach Stamm und Medium. Die auf TSB-Medium kultivierten Streptomyceten-Stämme S. lividans und S. albus wurden für 2 - 3 d kultiviert, die auf Sucrose-Succinat-/Maltose-Glutamat-Medium kultivierten Saccharopolyspora-Stämme für 5 d. Während der Fermentationen wurden zu unterschiedlichen Zeitpunkten in Falcon-Tubes (Falcon) Proben von 10 ml entnommen und die Myzele durch eine 15minütige Zentrifugation bei 5000 Upm und 4°C pelletiert (Rotina 35 R, Hettich). Im Anschluss daran wurden die Pellets ausgewogen und das Feuchtgewicht der Zellen bestimmt. Über diese Messungen wurde die Biomasseentwicklung während der Fermentationen verfolgt. Tab. 18: Übersicht über die Actinomyceten-Fermentationen in der Arbeit.
Nummer Stammbezeichnung Maßstab Medium* 1 Sacc. erythraea pEXCIII 10 L Sucrose-Succinat 2 Sacc. erythraea pEXCIII 10 L Sucrose-Succinat 3 Sacc. erythraea pEXCIII 10 L Maltose-Glutamat 4 Sacc. erythraea pEXCIII 30 L Sucrose-Succinat 5 Sacc. erythraea pEXBV 10 L Sucrose-Succinat 6 Sacc. erythraea pSGOleG2 10 L Sucrose-Succinat 7 Sacc. erythraea pSGTylMII 10 L Sucrose-Succinat 8 S. lividans EryCIII 10 L TSB 9 S. albus OleG2 10 L TSB
*= Bei allen Fermentationen enthielt das Medium 25 mg/L Thiostrepton, außer bei Fermentation Nummer 9. Sacc. erythraea: Saccharopolyspora erythraea, S.: Streptomyces. Nach Abschluss der Fermentationen wurden die Myzele durch Filtration geerntet. Die Ernte erfolgte bei den 10 L Kulturen durch abnutschen der Fermentationsbrühe in 5 L-Vakuumflaschen (Schott) über einen passend zurechtgeschnittenen Tiefenfilter (Typ Seitz K-250, Seitz) in einer geeigneten Keramiknutsche, oder aber bei der 30 L Fermentation über einen Kammerfilter (Typ „Merkur", EF 45/65 CW mit Filter Typ K-250, Seitz) durch anlegen
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E MATERIAL UND METHODEN eine Pressluftdrucks von 1 bar. Nach der Abtrennung der Fermentationsbrühe wurden die geernteten Myzele bei – 20°C gelagert. 1.1.2 Stammhaltung der Actinomyceten Für die Herstellung von Erhaltungskulturen mittels Sporensuspension wurden S. lividans, S. albus und Sacc. erythraea auf ISP-2 Platten (Difco) mit einer Deckschicht von 25 µg/ml Thiostrepton (Sigma-Aldrich) versehen und ca. eine Woche bei 30°C inkubiert. Die Sporen wurden mit einer sterilen 20%igen Glyzerinlösung (ICN) bzw. 5% DMSO-Lösung (Roth) abgeschwemmt und über sterile Watte filtriert. Die erhaltene Sporensuspension wurde zur Kontrolle der Reinheit erneut ausplattiert und unter dem Mikroskop (Zeiss) auf Kontaminationen hin untersucht. Zur Lagerung wurde die Suspension portionsweise bei – 20°C bzw. – 80°C eingefroren.
2 Proteinaufreinigung Alle für die Proteinchromatographie eingesetzten Puffer wurden vor Gebrauch filtriert (0,22 µm, Sartorius) und entgast. Die Säulen wurden vor Beginn der Chromatographie nach Herstellervorschrift gepackt. Die beschriebenen chromatographischen Arbeiten konzentrierten sich auf EryCIII, jedoch wurden vergleichbare Versuche auch zur Aufreinigung von EryBV, TylMII und OleG2 durchgeführt.
2.1 Herstellung des Rohextrakts Die rekombinanten bakteriellen Glykosyltransferasen wurden als intrazelluläre Enzyme in Streptomyceten produziert. Aus diesem Grund wurden für den Zellaufschluss zwei physikalische Verfahren verwendet, der Aufschluss durch Ultraschall und durch Nassvermahlung. 2.1.1 Zellaufschluss durch Ultraschall und Nassvermahlung Für beide Aufschlussarten wurden 20 – 40%ige (w/v) Zellsuspensionen hergestellt. Als Aufschlusspuffer wurde ein Natrium-Phosphatpuffer eingesetzt, der je nach Chromatographiemethode und Anwendung unterschiedliche Mengen an NaCl enthielt. Für die Anionenaustauschchromatographie wurden zwischen 150 mM und 200 mM NaCl verwendet, für die IMAC und die Gelfiltration 300 mM NaCl. Aufschlusspuffer 50 mM NaH2PO4, pH 8 (Merck) 150 mM – 300 mM NaCl (Roth) 5 mM MgCl2 (Roth) 1 U Benzonase/ml Puffer (Calbiochem-Novabiochem) 1 mg Lysozym/ml Puffer (Roche Diagnostics)
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E MATERIAL UND METHODEN Die Einstellung des gewünschten pH-Werts erfolgte mittels NaOH (Roth) (10 M). Für die IMAC (Ni2+-NTA, Qiagen) wurde der Aufschlusspuffer mit bis zu 10 mM Imidazol (Roth) versetzt, um unspezifische Proteinadsorption an die Säulenmatrix zu unterdrücken. Vor dem eigentlichen Zellaufschluss durch Ultraschall bzw. durch Nassvermahlung wurde die Zellsuspension für 5 - 15 min auf Eis inkubiert. Nach dem Aufschluss wurden die Rohextrakte über 5 µm filtriert (Sartorius) und auf die Säule aufgetragen. Zellaufschluss durch Nassvermahlung Die jeweilige Zellsuspension wurde im Verhältnis von 1:2 mit Glasperlen (0,5 mm Durchmesser) versetzt und in vorgekühlte Edelstahl-Mahlbecher (Retsch-Mühle, Typ MM2000, Retsch) bzw. in die Glasperlenmühle (Disintegrator S, IMA) abgefüllt. Der Aufschluss in der Retsch-Mühle erfolgte bei maximaler Schüttelfrequenz für 2 × 10 min. Der Aufschluss wurde in der Glasperlenmühle unter Eiskühlung für 20 min lang bei 4000 Upm durchgeführt. Anschließend wurde der Überstand von den Glasperlen abdekantiert und die Glasperlen mehrmals mit ein wenig Lysispuffer nachgewaschen. Das so erhaltene Homogenat wurde durch Zentrifugation (4°C, 17000 Upm, 40 min, Sorvall RC-5B, Rotor SS34) geklärt, der Rohextrakt abgenommen und weiterverarbeitet. Typische Rohextraktproteingehalte die mit dieser Methode erreicht wurden lagen im Bereich von 5 - 25 mg/ml. Zellaufschluss durch Ultraschall Für den Zellaufschluss wurde die jeweilige Zellsuspension nach der Inkubation mit Lysozym in geeigneten Gefäßen beschallt. Die prozessierten Volumina lagen im Bereich von 1 ml bis 200 ml Zellsuspension. Als Gefäße wurden Eppendorf-Reaktionsgefäße und Bechergläser eingesetzt. Die Beschallung erfolgt unter Wassereiskühlung bei der für die Sonotrode MS 73 vom Hersteller (Bandelin) vorgeschrieben Leistung (50% Cycle und ca. 60-70% Leistung). Die Aufschlusszeiten wurden je nach Probenvolumen variiert, bewegten sich jedoch im Bereich von 2 × 30 s bis 3 × 2 min. Zwischen den Beschallungen wurden jeweils Pausen von 30 s bis 1 min gemacht und die Viskosität, sowie die Klärung der Zellsuspension beobachtet. Das so erhaltene Homogenat wurde durch Zentrifugation (4°C, 17000 Upm, 40 min, Sorvall RC-5B, Rotor SS34) geklärt, der Rohextrakt abgenommen und weiterverarbeitet. Typische Rohextraktproteingehalte die mit dieser Methode erreicht wurden lagen im Bereich von 10 – 40 mg/ml.
2.2 Anionaustauschchromatographie 2.2.1 Chromatographie an Q-Sepharose 6 FF Q-Sepharose Fast Flow Material besteht aus einer stark quervernetzten Agarosematrix, die quartäre Amine als Liganden enthält (-R-CH2N+(CH3)3). Das Material gehört in die Klasse der starken Ionentauscher, da die quartären Ammoniumgruppen über einen pH-Bereich von 3-11 ionisiert vorliegen. Die Chromatographien wurden mit verschiedenen Säulen in unterschiedlichen Dimensionen (XK 50/30-Säule, XK 16/20-Säule) (Amersham Biosciences)
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E MATERIAL UND METHODEN durchgeführt. Das Gelbettvolumen betrug maximal 580 ml bei einer Betthöhe von 29 cm (XK50/30). Die Elution wurde in unterschiedlichen Fraktionsgrößen (1 - 25 ml) gesammelt (Fraction Collector Frac 300, ÄktaPrime, Amersham Biosciences), wobei die Flussrate an die jeweilige Chromatographie angepasst wurde. Als Pumpe wurde eine P1- und/oder P50-Pumpe der Firma Amersham Biosciences verwendet. Aufgrund des nachfolgenden IMAC Schritts und des störenden Einflusses von HEPES bzw. Tris/HCl bei der IMAC an Ni2+-NTA (The QIAexpressionist, 5. Auflage 2003, Qiagen) wurde die Anionenaustauschchromatographie mit EryCIII Rohextrakt ebenfalls mit einem 50 mM NaH2PO4-Puffer bei pH 8 durchgeführt. Im Folgenden ist das Aufreinigungsschema einer semi-präparativen Chromatographie zur Charakterisierung der Aufreinigungsmethode (Schema A) und einer präparative Chromatographie zur Produktion von EryCIII wiedergegeben (Schema B). Nach Abschluss der Chromatographie wurde die jeweilige Aufreinigung durch SDS-PAGE, SDS-PAGE mit Immunoblotting (Kap. E 6.7.2) und gegebenenfalls durch ELISA (Kap. E 6.8.1) analysiert. Schema A (semi-präparativ): - Äqulibrieren der Säule (XK 16/20, Volumen des Gelbetts: 15 ml, Höhe des Gelbetts: 8
cm) mit Puffer A (5faches Gelbettvolumen). Puffer A: 50 mM NaH2PO4, pH 8 (Merck) 200 mM NaCl (Roth) 5 mM MgCl2 (Roth) (lineare Flussrate: 238 cm/h) - Beladen der Säule mit Rohextraktprobe (10 ml). (lineare Flussrate: 238 cm/h) - Spülen der Säule mit Puffer A bis Basislinie wieder auf Null. (lineare Flussrate: 238cm/h) - Elution der Säule durch Anlegen eines linearen Gradienten von 200 mM – 1000 mM NaCl durch Mischen von Puffer A mit Puffer B (10faches Gelbettvolumen) bis Basislinie wieder auf Null. Puffer B: 50 mM NaH2PO4, pH 8 (Merck) 1000 mM NaCl (Roth) 5 mM MgCl2 (Roth) (lineare Flussrate: 238cm/h) - Spülen der Säule mit 1 M NaCl (Roth) bis Basislinie wieder auf Null. (lineare Flussrate: 238cm/h) - Einlegen der Säule in 20% Ethanol (Roth) und Lagerung bei Raumtemperatur. Bedingungen: Schreiber: 10 mV/Range, 1 mm/min (LKB Rec 101, Amersham Biosciences) UV-Messzelle: 280 nm, 2,0 AU (UV1 Single-Path, Amersham Biosciences)
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E MATERIAL UND METHODEN Schema B (präparativ): - Äqulibrieren der Säule (XK 50/30, Volumen des Gelbetts: 580 ml, Höhe des Gelbetts:
29 cm) mit Puffer A (2faches Gelbettvolumen). Puffer A: 50 mM NaH2PO4, pH 8 (Merck) 150 mM NaCl (Roth) 5 mM MgCl2 (Roth) (lineare Flussrate: 122 cm/h) - Beladen der Säule mit Rohextraktprobe (200 ml). (lineare Flussrate: 122 cm/h) - Spülen der Säule mit Puffer A bis Basislinie wieder auf Null. (lineare Flussrate: 122 cm/h) - Elution der Säule durch Anlegen eines linearen Gradienten von 150 mM – 650 mM NaCl durch Mischen von Puffer A mit Puffer B (4faches Gelbettvolumen) bis Basislinie wieder auf Null. Puffer B: 50 mM NaH2PO4, pH 8 (Merck) 650 mM NaCl (Roth) 5 mM MgCl2 (Roth) (lineare Flussrate: 122 cm/h) - Spülen der Säule mit 1 M NaCl (Roth) bis Basislinie wieder auf Null. (lineare Flussrate: 122 cm/h) - Einlegen der Säule in 20% Ethanol (Roth) und Lagerung bei Raumtemperatur. Bedingungen: Gerät: ÄktaPrime mit Datenaufzeichnung durch Äkta- Software (PrimeView, Amersham Biosciences) UV-Messzelle: 280 nm
2.3 Immobilisierte Metallionenaffinitätschromatographie Bei der IMAC (Immobilized Metal Ion Affinity Chromatography) werden die koordinativen Komplexbildungseigenschaften von Metallionen der Übergangsreihe (Cu2+, Ni2+, Zn2+, Co2+, Fe2+, Fe3+) ausgenutzt. Dazu werden Metall chelatierende Gruppen wie z.B. Imidodiessigsäure (IDA), Nitrilotriessigsäure (NTA) oder Tris(carboxymethyl)-ethylendiamin (TED) an ein Säulenmaterial immobilisiert. Die primär bindende Aminosäure ist Histidin, die über den Imidazolring (1,3-Diazol, pKa = 6,04) an die freien Koordinationsstellen der chelatierten Übergangsmetallionen gebunden wird. 2.3.1 Chromatographie an Ni2+-NTA Für die semi-präparative und die präparative Aufreinigung der „His6-getaggten“ Glykosyltransferasen wurde Ni2+-NTA-Chromatographiematerial der Firma Qiagen verwendet. Das NTA-Material besteht aus einer quervernetzten Agarose an die NTA-Liganden (-N(CH2-COOH)3) kovalent gekoppelt sind. Die NTA-Liganden chelatieren Ni2+-Ionen über vier koordinative Bindungsstellen. Die Proteinbeladung des Säulenmaterials
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E MATERIAL UND METHODEN wurde in Anwesenheit von hohen Salzkonzentrationen und geringen Imidazolkonzentrationen durchgeführt um unspezifische Proteinadsorption zu vermeiden. Die Elution der gebundenen Proteine erfolgte in Form einer Stufenelution durch die Verwendung von ansteigenden Imidazolkonzentrationen. Die Chromatographien wurden in verschiedenen Dimensionen (XK16/20-Säule, XK 26/20-Säule) (Amersham Biosciences) durchgeführt. Das Gelvolumen betrug maximal 100 ml bei einer Betthöhe von 20 cm (XK26/40). Die Elution wurde in unterschiedlichen Fraktionsgrößen (1 - 5 ml) gesammelt (Fraction Collector Frac 300, ÄktaPrime, Amersham Biosciences), wobei die Flussrate an die jeweilige Chromatographie angepasst wurde. Als Pumpe wurde eine P1- oder/oder P50-Pumpe der Firma Amersham Biosciences verwendet. Im Folgenden ist das Aufreinigungsschema einer semi-präparativen Chromatographie zur Charakterisierung der Aufreinigungsmethode (Schema A) und einer präparative Chromatographie zur Produktion von EryCIII wiedergegeben (Schema B). Nach Abschluss der Chromatographie wurde die jeweilige Aufreinigung durch SDS-PAGE, SDS-PAGE mit Immunoblotting (Kap. E 6.7.2) und gegebenenfalls durch ELISA (Kap. E 6.8.1) analysiert. Schema A (semi-präparativ): - Äqulibrieren der Säule (XK 26/20, Volumen des Gelbetts: 30 ml, Höhe des Gelbetts: 6 cm) mit Puffer A (5faches Gelbettvolumen). Puffer A: 50 mM NaH2PO4, pH 8 (Merck) 300 mM NaCl (Roth) 5 mM MgCl2 (Roth) 10 mM Imidazol (Roth) (lineare Flussrate: 180 cm/h) - Beladen der Säule mit Probe (Rohextrakt oder Q-Sepharose Pool) (10 ml – 50 ml). (lineare Flussrate: 90 cm/h) - Spülen der Säule mit Puffer A bis Basislinie wieder auf Null. (lineare Flussrate: 180 cm/h) - Waschen der Säule mit Puffer B bis Basislinie wieder auf Null. (lineare Flussrate: 180 cm/h) Puffer B: 50 mM NaH2PO4, pH 8 (Merck) 300 mM NaCl (Roth) 5 mM MgCl2 (Roth) 20 mM Imidazol (Roth) - Waschen der Säule mit Puffer C bis Basislinie wieder auf Null (optionaler Schritt). (lineare Flussrate: 180 cm/h) Puffer C: 50 mM NaH2PO4, pH 8 (Merck) 300 mM NaCl (Roth) 5 mM MgCl2 (Roth) 40 mM Imidazol (Roth) - Elution der Säule mit Puffer D bis Basislinie wieder konstant.
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E MATERIAL UND METHODEN Puffer D: 50 mM NaH2PO4, pH 8 (Merck) 300 mM NaCl (Roth) 5 mM MgCl2 (Roth) 250 mM Imidazol (Roth) (lineare Flussrate: 180 cm/h) - Spülen der Säule mit Millipore-H2O bis Basislinie wieder auf Null . (lineare Flussrate: 180 cm/h) - Einlegen der Säule in 20% Ethanol (Roth) und Lagerung bei Raumtemperatur. Bedingungen: Schreiber: 10 mV/Range, 1 mm/min (LKB Rec 101, Amersham Biosciences) UV-Messzelle: 280 nm, 0,5 A (UV1 Single-Path, Amersham Biosciences) Schema B (präparativ): - Äqulibrieren der Säule (XK 26/20, Volumen des Gelbetts: 50 ml, Höhe des Gelbetts: 10 cm) mit Puffer A (2faches Gelbettvolumen). Puffer A: 50 mM NaH2PO4, pH 8 (Merck) 300 mM NaCl (Roth) 5 mM MgCl2 (Roth) 10 mM Imidazol (Roth) (lineare Flussrate: 226 cm/h) - Beladen der Säule mit Probe (Q-Sepharose Pool) (610 ml). (lineare Flussrate: 226 cm/h) - Spülen der Säule mit Puffer A bis Basislinie wieder auf Null. (lineare Flussrate: 226 cm/h) - Waschen der Säule mit Puffer B bis Basislinie wieder auf Null. (lineare Flussrate: 226 cm/h) Puffer B: 50 mM NaH2PO4, pH 8 (Merck) 300 mM NaCl (Roth) 5 mM MgCl2 (Roth) 20 mM Imidazol (Roth) - Elution der Säule mit Puffer C bis Basislinie wieder konstant. Puffer C: 50 mM NaH2PO4, pH 8 (Merck) 300 mM NaCl (Roth) 5 mM MgCl2 (Roth) 250 mM Imidazol (Roth) (lineare Flussrate: 226 cm/h) - Spülen der Säule mit Millipore-H2O bis Basislinie wieder auf Null. (lineare Flussrate: 226 cm/h) - Einlegen der Säule in 20% Ethanol (Roth) und Lagerung bei Raumtemperatur.
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E MATERIAL UND METHODEN Bedingungen: Gerät: ÄktaPrime mit Datenaufzeichnung durch Äkta- Software (PrimeView, Amersham Biosciences) UV-Messzelle: 280 nm 2.3.2 Nicht-präparative Chromatographie an Ni2+-NTA und Ni2+-TED Um die rekombinanten Glykosyltransferasen für verschiedene Anwendungen (z. B. Expressionsnachweis) schnell und in kleinem Maßstab (µg – mg Bereich) direkt aus Rohextrakt heraus zu präparieren, wurden zwei verschiedene Fertigsysteme eingesetzt. Beide Systeme enthalten unterschiedliche Minisäulen für eine Aufreinigung über Zentrifugation (Qiagen) bzw. durch gravimetrischen Fluss (Macherey-Nagel). Als Matrix dient in beiden Fällen ein Silikat, an das die beiden unterschiedlichen Liganden (NTA (Qiagen) bzw. TED (Macherey-Nagel)) gekoppelt sind. Beide Matrices waren mit Ni2+-Ionen vorbeladen. Puffer siehe Schema B, Kap. E 2.3.1 bzw. angegebene Puffer. Schema der Ni2+-NTA-SpinColumn-Aufreinigung (Ni-NTA Spin Kit, Qiagen): - Äqulibrieren der Mikrosäulen mit 600 µl Puffer A. Zentrifugation bei 2000 Upm (700 × g) für 2 min. - Beladen der Mikrosäulen mit 600 µl Rohextrakt und Zentrifugation bei 2000 Upm (700 × g) für 2 min. - 2 × Waschen der Mikrosäulen mit 600 µl Puffer B. Zentrifugation bei 2000 Upm (700 × g) für 2 min. - Elution der Probe mit 200 µl Puffer C und Zentrifugation bei 2000 Upm (700 × g) für 2 min. Die Zentrifugation erfolgte in einer Tischzentrifuge (Mikro 22R) der Firma Hettich. Schema der Ni2+-TED-Aufreinigung (Protino Ni 1000 Kit, Macherey-Nagel): - Äqulibrieren der Mikrosäulen mit 2 ml LEW-Puffer. LEW-Puffer: 50 mM NaH2PO4, pH 8 (Merck) 300 mM NaCl (Roth) 5 mM MgCl2 (Roth) - Beladen der Mikrosäulen mit 2 ml Rohextrakt. - 2 × Waschen der Mikrosäulen mit 2 ml LEW-Puffer. - Elution der Probe mit 2 ×2 ml Elutionspuffer. Elutionspuffer: 50 mM NaH2PO4, pH 8 (Merck) 300 mM NaCl (Roth) 5 mM MgCl2 (Roth). 250 mM Imidazol Zwischen den einzelnen Schritten wurde so lange abgewartet, bis kein Fluss mehr erkennbar war.
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E MATERIAL UND METHODEN 2.4 Gelfiltration Bei der Gelfiltration (Größenausschlusschromatographie) erfolgt die Auftrennung von Proteinen nach Größe. Die Porengröße der Gelmatrix entspricht dabei in etwa der Größe der zu trennenden Proteine. Die eigentliche Trennung der aufgetragenen Proteinpräparation basiert auf dem Molekularsiebeffekt der Gelmatrix. Wichtige Einsatzgebiete der Gelfiltration sind die präparative Darstellung von hochreinem Protein, die Bestimmung von nativen Molekulargewichten und die Entsalzung von Proben. Bei der Molekulargewichtsbestimmung wird darauf zurückgegriffen, dass zwischen dem Kav-Wert und dem Logarithmus des Molekulargewichts eines Proteins ein linearer Zusammenhang besteht. Durch eine Kalibrierung der Chromatographie mit Proteinen bekannten Molekulargewichts kann das native Molekulargewicht eines unbekannten Proteins bestimmt werden. Bei diesen Betrachtungen ist jedoch zu berücksichtigen, dass die zugrunde liegende Theorie der Gelfiltration streng genommen nur für globuläre Proteine gilt. Der Zusammenhang zwischen dem Kav-Wert und dem nativem Molekulargewicht wird über folgende Formel beschrieben:
(1) 0t
0eav
VVVVK
−
−=
Es bedeuten:Kav: Verteilungskoeffizient [-] Ve: Elutionsvolumen [ml] V0: Ausschlussvolumen [ml] Vt: Gesamtvolumen der Säule [ml] 2.4.1 Chromatographie an Superdex G200 Um das native Molekulargewicht von EryCIII zu bestimmen und um die Gelfiltration im Hinblick auf ihre Eignung zur Gewinnung von homogenem Enzym zu charakterisieren, wurde eine Gelfiltration mit Superdex G200 Prep Grade (Amersham Biosciences) durchgeführt. Das Gelmaterial besteht aus einer quervernetzten Matrix von Agarose und Dextran, die chemisch und physikalisch praktisch innert ist. Der effektive Trennbereich des G200 Materials liegt für globuläre Proteine im Bereich von 10 kDa – 600 kDa (Amersham Bioscience, BioDirectory 2003). Als Probe diente eine zuvor über Q-Sepharose und Ni2+-NTA (Kap. E 2.2.1 und E 2.3.1) aufgereinigte EryCIII Präparation. Nach Abschluss der Chromatographie wurde die Aufreinigung durch SDS-PAGE, SDS-PAGE mit Immunoblotting (Kap. E 6.7.1) und ELISA (Kap. E 6.8.1) analysiert. Für die spätere Berechnung des nativen Molekulargewichts von EryCIII wurden zuvor Kalibrierungsläufe mit Eichproteinen bekannten Molekulargewichts durchgeführt. Die Gelfiltration erfolgte an einem ÄktaPrime System (Amesham Biosciences) und für die Auswertung wurde die Chromatographiesoftware PrimeView (Amesham Biosciences) eingesetzt. Die Eichproteine (Apoferritin, Cytochrom C, Carbonic-Anhydrase, BSA, Alkohol-
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E MATERIAL UND METHODEN Dehydrogenase, β-Amylase) und das Blue Dextran 2000 stammten von Sigma und sind, mit Ausnahme des Apoferritins, Bestandteil eines Sets (MW-GF-200) zur Kalibrierung einer Gelfiltration. Das Ergebnis der Kalibrierung und die dazugehörige Regression sind unter Kap. F 9.5 (Abbildung 94) verzeichnet. Die Auswertung erfolgte mit Microsoft Excel XP. Schema der Gelfiltration: - Äqulibrieren der Säule mit Gelfiltrationspuffer über Nacht. (lineare Flussrate: 22 cm/h) - Beladen der Säule mit 2 ml Probe (2 ml Probenschleife). - Elution der Probe mit Gelfiltrationspuffer. (lineare Flussrate: 113 cm/h) Gelfiltrationspuffer: 50 mM NaH2PO4, pH 8 (Merck) 300 mM NaCl (Roth) 5 mM MgCl2 (Roth) - Einlegen der Säule in 20% Ethanol (Roth) und Lagerung bei Raumtemperatur. Bedingungen: Gerät: ÄktaPrime mit Datenaufzeichnung durch Äkta- Software (PrimeView, Amersham Biosciences) UV-Messzelle: 280 nm
3 Proteinchemische Charakterisierung 3.1 Nachweis der Expression durch Immunoblotting Nach der Anzucht der Actinomycten durch Fermentation im 10 L – 30 L Maßstab (Kap. E 1.1.1) wurden die vier Saccharopolyspora erythraea-Stämme pEXCIII, pEXBV, pSGOleG2 und pSGTylMII durch Gelelektrophorese (SDS-PAGE) und Immunoblotting auf erfolgreiche Expression hin untersucht. 3.1.1 Nachweis der Expression der Glykosyltransferasegene aus Saccharopolyspora erythraea Für den Versuch wurden Rohextrakte der Stämme pEXCIII, pEXBV, pSGOleG2 und pSGTyM2 durch Nassvermahlung hergestellt (Kap. E 2.1.1), der Proteingehalt bei allen Proben einheitlich auf 15 mg/ml eingestellt und mittels eines standardisierten SpinColumn-Aufreingungssystems (Ni-NTA Spin Kit) der Firma Qiagen im 2 ml Maßstab durch IMAC an Ni2+-NTA aufgereinigt (Kap. E 2.3.2). Der Durchlauf, die erste Waschfraktion, sowie die Elution wurden gesammelt, der Proteingehalt nach Bradford (1976) bestimmt (Kap. E 6.6) und die Proben auf zwei SDS-PAGE-Gele aufgetragen und getrennt (Kap. E 6.7.1). Nach der Gelelektrophorese erfolgte der Nachweis der „His6-getaggten“ Glykosyltransferasen durch Immunoblotting (Kap. E 6.7.1). Von den Rohextrakt- und Durchlaufproben wurden jeweils 15 µg Protein pro Spur aufgetragen, von der ersten Waschfraktion und der Elution je 5 µg pro Spur.
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E MATERIAL UND METHODEN 3.1.2 Bestimmung der relativen Molmassen der Glykosyltransferasen Aus den Ergebnissen der Immunoblot und SDS-PAGE Analyse der unterschiedlichen Aufreinigungen wurde unter Einbeziehung des Molekulargewichtsstandards die relativen Molmassen der Glykosyltransferasen bestimmt. Zur Berechnung der relativen Molmassen wurde darauf zurückgegriffen, dass bei der SDS-PAGE zwischen dem Rf-Wert eines Proteins und dem dekadischen Logarithmus seiner Molmasse (logMW) ein linearer Zusammenhang besteht (Rf/logMW), der über eine Regression 1. Ordnung beschrieben werden kann. Die Auswertung erfolgte mit Microsoft Excel XP. Zur Berechnung der relativen Molmassen der verschiedenen Glykosyltransferasen aus Saccharopolyspora erythraea wurde der Immunoblots aus Kap. B 2 herangezogen. Eine exemplarische Auswertung ist unter Kap. F 9.4 (Abbildung 93) verzeichnet.
3.2 Nachweis der Expression von eryCIII und eryBV durch N-terminale Mikro-Proteinsequenzierung nach Edman
Mit einer Mikro-Proteinsequenzierung nach Edman (Edman 1956) ist es möglich, die N- terminale Aminosäuresequenz eines Proteins zu bestimmen. Dabei wird in jedem Zyklus der Sequenzierung die endständige Aminosäure abgespalten, derivatisiert und über HPLC detektiert. Die Identifikation des abgespalteten 3-Phenyl-2-thiohydantoin-Derivats erfolgt anhand der spezifischen Retentionszeit. Ziel des Versuchs war es, die rekombinant produzierten Glykosyltransferasen EryCIII und EryBV eindeutig zu identifizieren. Des Weiteren wurde ein unbekanntes Protein aus dem Stammhintergrund von Saccharopolyspora erythraea ansequenziert. Die Sequenzierung erfolgte durch einen automatisierten Edman-Abbau mit einem Gerät der Firma Applied Biosystems (Protein Sequencer 477A und PTH-Analyser 120A, Institut für Enzymtechnologie, Heinrich-Heine-Universität Düsseldorf). Die Sequenzierungen wurden ausgehend von geblotteten Proben durchgeführt. Um die Proben zu gewinnen, wurden Rohextrakte der Stämme pEXCIII und pEXBV hergestellt (Ultraschall) (Kap. E 2.1.1) und über IMAC (Kap. E 2.3.1) direkt aus dem Rohextrakt heraus aufgereinigt (15 ml Rohextrakt, 10 ml Gelvolumen in adäquater Säule von Amersham Biosciences). Nach der Aufreinigung wurden die Fraktionen mit dem höchsten Proteingehalt auf ein Criterion-Gel aufgetragen und getrennt (Kap. E 6.7.2). Dabei wurde das Gel mit maximal 50 µg Protein pro Spur beladen. Im Anschluss an die Trennung wurde das SDS-PAGE-Gel geblottet (Kyhse-Andersen 1984) und mit Amidoschwarz angefärbt. Nach kurzer Behandlung mit Entfärber (1 – 5 min) wurde der Blot an der Luft getrocknet, die zu sequenzierenden Banden ausgeschnitten und im Sequenator analysiert. Amidoschwarz-Färbelösung 0,1% (w/v) Amidoschwarz (Merck) 40% (v/v) Ethanol (Roth) 10% (v/v) konz. Essigsäure (Roth)
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E MATERIAL UND METHODEN Entfärbelösung für Amidoschwarzfärbung 40% (v/v) Ethanol (Roth) 10% (v/v) konz. Essigsäure (Roth)
3.3 Untersuchung des Fällungsverhaltens von EryCIII in Anwesenheit von PEG4000Im Vorfeld der beabsichtigten Proteinkristallisation wurde das Fällungsverhalten von EryCIII in Anwesenheit von verschiedenen PEG4000-Konzentrationen (DEGUSSA.) untersucht. PEG4000 und andere PEG-Derivate finden weit verbreitet Anwendung bei der Proteinkristallisation als präzipitierende Agenzien (Liu et al. 2004; Clancy 1994; Moreno 1997). Die Fällungsversuche wurden mit maximal 40% (w/w) PEG4000 durchgeführt. Für die Fällung wurden jeweils 2 ml Aliquots einer IMAC (Kap. E 2.3.1) gereinigten EryCIII Präparation in 15 ml Falcon-Tubes (Falcon) abgefüllt und mit der erforderlichen Menge an festem PEG4000 versetzt. Danach wurde das PEG durch Mischen (Vortex) vollständig gelöst und die Proben abzentrifugiert (15 min, 25°C, 4000 Upm, Rotina 35R, Hettich). Nach der Zentrifugation wurden die Überstände der verschiedenen Fällungsansätze abgenommen und die Pellets in 2 ml Puffer (50 mM NaH2PO4, pH 8, 300 mM NaCl, 5 mM MgCl2, 250 mM Imidazol (Merck bzw. Roth)) resuspendiert. Im Anschluss an diese Arbeiten wurden die erhaltenen Fällungsfraktionen (Überstände und resuspendierte Pellets) durch SDS-PAGE analysiert (Kap. E 6.7.1). Im Einzelnen wurden folgende PEG4000-Fällungen untersucht: 0%, 10%, 20%, 30% und 40% (w/w). Nach der Analyse durch SDS-PAGE wurde eine ausgewählte Probe qualitativ auf enzymatische Aktivität getestet, um zu untersuchen, ob EryCIII während der Fällung und Resuspendierung inaktiviert wird. Der Aktivitätstest hatte folgende Zusammensetzung: 2 mM dTDP-D-Desosamin, 1 mM MEB, 5 mM MgCl2 (Roth), 5 U alkalische Phosphatase (Roche Diagnostics). Als Puffer diente 50 mM Tris/HCl, pH 7,5 (Roth). Das Ansatzvolumen betrug 500 µl und das eingesetzte Probevolumen je 300 µl Rohextrakt (Sacc. erythraea pEXCIII) (Kontrolle) und 300 µl resuspendierte Proteinlösung. Der Ansatz wurde über Nacht bei 30°C inkubiert, am nächsten Morgen für 5 min bei 95°C abgestoppt (Thermostat 5320, Eppendorf) und abzentrifugiert (14000 Upm, 25°C, Rotina 35R, Hettich). Die Analytik erfolgte wie unter Kap. E 6.1 und 6.5.1 beschrieben.
4 Biochemische Charakterisierung Die Versuche zur biochemischen Charakterisierung der verschiedenen Makrolid-Glykosyltransferasen, insbesondere für EryCIII, gliedern sich in Untersuchungen mit einem rein qualitativen Nachweis der Enzymaktivität (Kap. E 4.2.1, E 4.2.2 und E 4.3.1) durch DC (Produktnachweis), HPLC-MS (Identifikation des Produkts) und Stechagarplattentest (Nachweis einer antibiotischen Aktivität) und in quantitative Untersuchungen (Kap. E 4.2.3 – 4.2.6.2) mit CE-Analytik zur Bestimmung des jeweiligen enzymatischen Umsatzes. Das für die biochemischen Studien eingesetzte dTDP-D-Desosamin wurde im EU-Projekt
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E MATERIAL UND METHODEN „HYGLIDE“ chemisch synthetisiert und von Dr. M. Raynal (Aventis, Paris, Frankreich) bzw. Prof. Dr. P. F. Leadlay (Cambridge University, Cambridge, England) zur Verfügung gestellt. Alle anderen verwendeten Desoxyzucker stammten von Herrn Dipl.-Chem. C. Rupprath (RWTH Aachen, Lehr- und Forschungsgebiet Biomaterialien). Die Aglyka bzw. Makrolide wurden von Herrn Dr. B. Wilkinson (GlaxoSmithKline, Stevenage, England) im Rahmen des EU-Projektes „GENOVA“ bereitgestellt. Die in angegebenen Konzentrationen sind als Endkonzentrationen zu verstehen. Konzentrationen von Stammlösungen wurden gesondert ausgewiesen.
4.1 Aktivitätstest für die bakteriellen Glykosyltransferasen Zur Bestimmung der enzymatischen Aktivität der Transferasen wurde ein Aktivitätstest entwickelt, der es erlaubt den Substratumsatz zu quantifizieren. Abbildung 73 zeigt das allgemeine Reaktionsschema für die untersuchten und bearbeiteten bakteriellen Makrolid-Glykosyltransferasen.
O
O
O
O
O
O
O-Zucker
O-Zucker
OH
Makrolacton
GT
hybrides Makrolid
+ dTDP-Zucker + dTDPOH
Abb. 73: Allgemeines Reaktionsschema des Aktivitätstests für die bakteriellen Glykosyltransferasen, GT: Glykosyltransferase. Die enzymatische Aktivität kann bei einem derartigen Ansatz sowohl durch die Quantifizierung der Eduktabnahme (Makrolacton und Nukleotidzucker), als auch über die Quantifizierung der (Neben-)Produktzunahme (hybrides Makrolid und Nukleotid) erfolgen. Aufgrund der Tatsache, dass es sich als äußerst schwierig erwies, die Makrolactone und hybriden Makrolide mit hoher Reproduzierbarkeit (>99%) durch die C18-Festphasenextraktion (Kap. E 6.1.1) zu isolieren und sie im kurzwelligen UV-Bereich (215 nm) in geringer Konzentration zu detektieren, konnte die Abnahme des Makrolactons bzw. Zunahme des hybriden Makrolids nicht als Grundlage für die Entwicklung eines HPLC (Kap. E 6.2.2) basierten Aktivitätstest eingesetzt werden. Daher wurde auf die Quantifizierung der Zunahme des Nebenprodukts der Transferreaktion (Nukleotid, dTDP), bzw. der Abnahme des Edukts (Nukleotidzucker) durch geeignete HPLC- bzw. CE-Analytik (Kap. E 6.2.1 und E 6.4.1) zurückgegriffen, da sich mit dieser Analytik Nukleotide und nukleotid-aktivierte Zucker empfindlich nachweisen und quantifizieren lassen. Durch DC Analyse unabhängiger Proben zum Nachweis der glykosylierten Makrolide (Kap. E 6.1) und durch weitere Kontrollen in
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E MATERIAL UND METHODEN Bezug auf die Eigenhydrolyse des dTDP-D-Desosamins und der Stabilität von dTDP wurde der Test abgesichert. Standardansatz: 4 µl Glycin/NaCl-Puffer, pH 8,7 [250 mM] 50 mM Endkonzentration 2 µl MgCl2 [50 mM] 5 mM Endkonzentration 1 µl dTDP-D-Desosamin [20 mM] 1 mM Endkonzentration 1 µl MEB [20 mM] 1 mM Endkonzentration 6 µl Millipore-H2O 5 µl Probe 20 µl Gesamtvolumen Alle Komponenten des Standardansatzes wurden in 1,5 ml Eppendorf-Reaktionsgefäßen zusammenpipettiert, für 0 – 4 h bei 25°C in einem Heizer inkubiert und anschließend für 30 s bei 95°C abgestoppt (Thermostat 5320, Eppendorf). Nach dem Abstoppen wurden die Ansätze für 5 min bei 13000 Upm abzentrifugiert (Mikro 22R, Hettich) und für die Analytik auf Eis aufbewahrt bzw. bei – 20°C eingefroren. Aus der linearen Anfangsreaktionsgeschwindigkeit der enzymatischen Reaktion lässt sich die Aktivität der Glykosyltransferasen über folgende Formel berechnen:
(2) FtcdTDP
mlU
Inkubation
×= mlU
mlmol
=⎥⎦
⎤⎢⎣
⎡×min
µ
Es bedeuten: cdTDP: Konzentration dTDP [µmol/ml] t Inkubation: Inkubationszeit der Probe [min] Faktor F: Verdünnungsfaktor der Probe bezogen auf das
Gesamtvolumen des Assays Unter Berücksichtigung des Proteingehalts der Probe (mg/ml) wurde die spezifische Aktivität (U/mg Protein) gemäß folgender Formel berechnet:
(3) roteincPt
cdTDPmgU
mgmlmlU
Inkubation ×==⎥
⎦
⎤⎢⎣
⎡××
Es bedeuten: cdTDP: Konzentration dTDP [µmol/ml] t Inkubation: Inkubationszeit der Probe [min] cProtein: Proteinkonzentration [mg/ml]
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E MATERIAL UND METHODEN 4.2 Biochemische Charakterisierung von EryCIII 4.2.1 Untersuchung des Donorsubstratspektrums von EryCIII Die zur Untersuchung des Donorsubstratspektrums von EryCIII durchgeführten Versuche beschränkten sich auf Transferversuche mit dTDP-6-Desoxy-4-keto-D-glucose und dTDP-2,6-Didesoxy-4-keto-D-glucose. Als Akzeptor wurde bei diesen Versuchen MEB eingesetzt. Die Ansätze wurden in 1,5 ml Eppendorf-Reaktionsgefäßen zusammenpipettiert, für 16 h bei 30°C inkubiert und danach für 5 min bei 95°C abgestoppt (Thermostat 5320, Eppendorf) und abzentrifugiert (14000 Upm, 25°C, Mikro 22R oder Rotina 35R, Hettich). Ansatz: 5 mM dTDP-6-Desoxy-4-keto-D-glucose bzw. dTDP-2,6-Didesoxy-4-keto-D-glucose 1 mM MEB 5 mM MgCl2 (Roth) 100 µl Rohextrakt Sacc. erythraea pEXCIII Das Gesamtvolumen betrug 1 ml. Als Puffer wurde ein 50 mM Tris/HCl-Puffer, pH 7,5 verwendet (Roth). MEB wurde in 100% Methanol (Roth) gelöst und zum Reaktionsansatz zugegeben. Die Nukleotidzucker wurden in Millipore-H2O gelöst. Die Analytik des Versuchs erfolgte nach vorhergehender Konzentrierung und Reinigung über C18-Festphasenextraktion (Kap. E 6.1.1) mit DC (Kap. E 6.1.2), da der unter Kap. E 4.1 beschrieben Aktivitätstest für die bakteriellen Glykosyltransferasen zum Zeitpunkt der Untersuchungen noch nicht etabliert war. 4.2.2 Untersuchung des Akzeptorsubstratspektrums von EryCIII Die Ansätze wurden in 1,5 ml Eppendorf-Reaktionsgefäßen zusammenpipettiert, für 16 h bei 30°C inkubiert, danach für 5 min bei 95°C abgestoppt (Thermostat 5320, Eppendorf) und abzentrifugiert (14000 Upm, 25°C, Mikro 22R oder Rotina 35R, Hettich). Die einzelnen Ansätze wurden nach folgendem Schema zusammengestellt. Schematischer Ansatz für das Akzeptorsubstratscreening von EryCIII 2,5 mM - 5 mM dTDP-D-Desosamin 0,5 – 1 mM Akzeptor (MEB, REB, OEB, EB, NB, Meth und Tyl) 5 mM MgCl2 (Roth) 100 µl Rohextrakt Sacc. erythraea pEXCIII bzw. 300 µl IMAC-Fraktion Das Gesamtvolumen betrug 0,5 ml - 1 ml. Als Puffer wurde ein 50 mM Tris/HCl-Puffer, pH 7,5 (Roth) verwendet. Die Aglyka wurden in 100% Methanol (Roth) gelöst und zum jeweiligen Reaktionsansatz zugesetzt. Das dTDP-D-Desosamin wurde in den angegebenen Puffer aufgenommen. Die IMAC-Fraktion stammte aus einer Aufreinigung mit dem SpinColumn-System (Qiagen) (Kap. E 2.3.2). Die Analytik des Versuchs erfolgte nach
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E MATERIAL UND METHODEN vorhergehender Konzentrierung und Reinigung über C18-Festphasenextraktion (Kap. E 6.1.1) mit DC (Kap. E 6.1.2) bzw. HPLC-MS (Kap. E 6.3.1) und Stechagarplattentest (Kap. E 6.5.1), da der unter Kap. E 4.1 beschrieben Aktivitätstest für die bakteriellen Glykosyltransferasen zum Zeitpunkt der Untersuchungen noch nicht etabliert war. Dabei vor den durchgeführten HPLC-MS Messungen keine Kalibrierung mit bekannten Makroliden erfolgte und die Messungen ausschließlich der Produktidentifikation dienten, erlauben die Chromatogramme der HPLC-MS Messungen keine Bestimmung des enzymatischen Umsatzes. Alle theoretischen Molekulargewichte bzw. m/z-Werte wurden mit Hilfe der Software ChemDraw Ultra 7.0 (CambridgeSoft) berechnet. 4.2.3 Bestimmung des pH-Optimums für die Transferreaktion von EryCIII Nach der Entwicklung des Enzymtests (Kap. E 4.1) konnten erstmals biochemische Parameter, wie pH-Optimum, Temperaturoptimum, Temperaturstabilität u. a., für EryCIII bestimmt werden. Ansatz: 50 mM Glycin/NaCl bzw. HEPES-Puffer des jeweiligen pH-Werts (Merck bzw. Roth) 150 mM NaCl (Roth) 5 mM MgCl2 (Roth) 1 mM dTDP-D-Desosamin 0,5 mM MEB 2,7 µl EryCIII (Proteingehalt 1,65 mg/ml) Um den Einfluss des pH-Wertes zu ermitteln wurden pH-Werte von pH 6 bis pH 11 getestet. Dabei wurden zwei verschiedene Puffer (HEPES- bzw. Glycin/NaCl-Puffer) verwendet, um den gesamten Pufferbereich abzudecken. Im Einzelnen wurden folgende pH-Werte untersucht: pH 6, 7, 8, 9 in HEPES-Puffer und pH 9, 10 und 11 in Glycin/NaCl-Puffer. Die Proben wurden auf Eis in einem 200 µl PCR-Reaktionsgefäß (Eppendorf) zusammenpipettiert und im Probenraum der CE bei 30°C inkubiert. Das jeweilige Testvolumen betrug 20 µl. Über die Programmierung der Steuerungssoftware (Karat 5.0, Beckman-Coulter) wurde alle 15 min ein Teil der Probe automatisch injiziert und getrennt (Kap. E 6.4.1). Aus der Anfangsreaktionsgeschwindigkeit der enzymatischen Reaktion wurde für jeden pH-Wert die Enzymaktivität berechnet (Kap. E 4.1) (Microsoft Excel XP) und so das pH-Optimum der Transferreaktion bestimmt. Als Kontrolle diente ein Ansatz ohne Enzym, bzw. ohne den Akzeptor MEB. Die IMAC-Fraktion stammte aus einer Aufreinigung mit dem SpinColumn-System (Qiagen) (Kap. E 2.3.2).
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E MATERIAL UND METHODEN 4.2.4 Bestimmung des Temperaturoptimums für die Transferreaktion
von EryCIII Ansatz: 50 mM Glycin/NaCl-Puffer, pH 8,7 (Merck bzw. Roth) 150 mM NaCl (Roth) 5 mM MgCl2 (Roth) 1 mM dTDP-D-Desosamin 1 mM MEB 3,5 µl EryCIII (Proteingehalt 1,65 mg/ml) Die Ansätze wurden in 500 µl PCR-Reaktionsgefäßen (Eppendorf) zusammenpipettiert und für 2 h bei 25°C, 30°C, 35°C, 40°C und 45°C inkubiert Das Volumen für jeden Ansatz betrug 25 µl. Nach Ablauf der 2 h wurden die Proben für 30 s bei 95°C abgestoppt, für 10 min bei 13000 Upm und 4°C abzentrifugiert (Rotina 35R, Hettich) und mit CE (Kap. E 6.4.1) analysiert. Die gesamte Inkubation der Proben erfolgte in einem PCR-Cycler (Mastercycler gradient) der Firma Eppendorf mit einer geeigneten Programmierung. Aus der Anfangsreaktionsgeschwindigkeit der enzymatischen Reaktion wurde für jede Temperatur die Enzymaktivität berechnet (Kap. E 4.1) (Microsoft Excel XP) und das Temperaturoptimum der Transferreaktion ermittelt. Als Kontrolle dienten Ansätze ohne Enzym, bzw. ohne den Akzeptor MEB. Die IMAC-Fraktion stammte aus einer Aufreinigung mit dem SpinColumn-System (Qiagen) (Kap. E 2.3.2). 4.2.5 Untersuchung der thermischen Inaktivierung von EryCIII Die Untersuchung der thermischen Inaktivierung von EryCIII erfolgte über einen Zeitraum von 24 h bei 30°C. Als Probe, für einen typisch biokatalytischen Ansatz, wurde IMAC gereinigtes Enzym (Proteingehalt: 2,3 mg/ml) in 50 mM HEPES, pH 8 mit 150 mM NaCl und 5 mM MgCl2 verwendet (Kap. E 2.3.2), das für 24 h bei 30°C in einem Thermokonstantraum inkubiert wurde. Zu den Zeitpunkten 0, 4, 7 und 24 h wurde jeweils ein 5 µl Aliquots abgenommen und die spezifische Enzymaktivität von EryCIII bestimmt (Kap. E 4.1) (Microsoft Excel XP). Ansatz: 50 mM Glycin/NaCl-Puffer, pH 8,7 (Merck bzw. Roth) 150 mM NaCl (Roth) 5 mM MgCl2 (Roth) 1 mM dTDP-D-Desosamin 1 mM MEB 5 µl EryCIII (Proteingehalt 2,3 mg/ml)
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E MATERIAL UND METHODEN Alle Komponenten wurden in 1,5 ml Eppendorf-Reaktionsgefäßen zusammenpipettiert, für 10 min bei 25°C inkubiert und anschließend für 30 s bei 95°C abgestoppt (Thermostat 5320, Eppendorf). Nach dem Abstoppen wurden die Ansätze für 10 min bei 13000 Upm abzentrifugiert (Rotina 35R, Hettich) und für die Analytik mit CE (Kap. E 6.4.1) auf Eis aufbewahrt bzw. bei - 20°C eingefroren. Als Kontrolle dienten Proben ohne Enzym bzw. ohne Akzeptorsubstrat. Zur Bestimmung der der Halbwertszeit (t½) von EryCIII wurde zunächst der natürliche Logarithmus (ln) der spezifischen Aktivität [mU/mg] gegen die Inkubationszeit [h] bei 30°C aufgetragen und die Inaktivierungskonstante -k aus der Steigung der Geraden ermittelt (lineare Regression, Microsoft Excel XP). Die Abnahme der spezifischen Aktivität über der Zeit folgt dabei einer einfachen logarithmischen Funktion die durch die folgende Gleichung beschrieben wird:
(4) tkt eAA ×−×= 0
Unter Annahme von Gleichung (4) gilt, dass die Halbwertszeit (t½) in umgekehrt proportionaler Beziehung zum Inaktivierungskoeffizienten k steht (Gleichung (5)).
(5) kk
t 2ln5,0ln2
1 =−
=
4.2.6 Michelis-Menten-Kinetiken für EryCIII Um die katalytischen Eigenschaften von EryCIII zu charakterisieren wurden enzymkinetische Untersuchungen durchgeführt. Ziel der Untersuchungen war die Bestimmung der kinetischen Konstanten Vmax und Km für die natürlichen Substrate dTDP-D-Desosamin und Mycarosyl-EB (MEB) und für die nicht natürlichen Substrate Rhamnosyl-EB (REB) und Narbonolid (NB). Alle kinetischen Messungen wurden so aufgenommen, dass der maximale Umsatz, bezogen auf dTDP-D-Desosamin, bei maximal 15 % lag. Der Start der enzymatischen Reaktion erfolgte jeweils mit dem invarianten Substrat. Als Kontrolle dienten Proben ohne Enzym bzw. ohne Akzeptorsubstrat. 4.2.6.1 Bestimmung des Vmax- und Km-Wertes für dTDP-D-Desosamin Ansatz: 4 µl Glycin/NaCl-Puffer, pH 8,7 [250 mM] 50 mM Endkonzentration 2 µl MgCl2 [50 mM] 5 mM Endkonzentration 1 µl MEB [20 mM] 1 mM Endkonzentration 5 µl Probe 12 µl festes Volumen + 8 µl variables Volumen (Millipore-H2O und dTDP-D-Desosamin) 20 µl Gesamtvolumen
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E MATERIAL UND METHODEN Mit Hilfe des variablen Volumens wurden folgende dTDP-D-Desosamin Konzentrationen im Assay eingestellt: 0,5, 1, 2, 4, 6, 8, und 10 mM. Die Proben wurden für 5 min bei 25°C inkubiert (Heizblock, IKA) und danach für 30 s bei 95°C abgestoppt (Heizblock, IKA). Nach dem Abstoppen wurden die Proben für 10 min bei 13000 Upm und 4°C abzentrifugiert (Rotina 35R, Hettich). Die Analytik erfolgte mit CE (Kap. E 6.4.1). Aus der Anfangsreaktionsgeschwindigkeit und unter Berücksichtigung des Proteingehalts (2,3 mg/ml) wurde für jeden Ansatz die spezifische Enzymaktivität berechnet (Microsoft Excel XP). Die Enzymprobe stammet aus einer Ni2+-TED Aufreinigung (Kap. E 2.3.2). Mit Hilfe des Programms „Sigma Plot 8.0.2“ und dem dazugehörigen „Enzymkinetikmodul V. 1.10“ (beide Systat Software) wurden sowohl der Vmax- als auch der Km-Wert für dTDP-D-Desosamin nach Michaelis-Menten über ein Iterationsverfahren (Marquardt-Levenberg-Algorithmus) berechnet. Dabei lag der Berechnung folgende Formel zugrunde:
(6) SKSV
vm +×
= max
Es bedeuten: S: Substratkonzentration [mM] v: Reaktionsgeschwindigkeit [mU/mg] Vmax: maximale Reaktionsgeschwindigkeit [mU/mg] Km: Michaelis-Menten-Konstante [mM] 4.2.6.2 Bestimmung der Vmax- und Km-Werte für MEB, REB und NB Ansatz: 4 µl Glycin/NaCl-Puffer, pH 8,7 [250 mM] 50 mM Endkonzentration 2 µl MgCl2 [50 mM] 5 mM Endkonzentration 1 µl dTDP-D-Desosamin [40 mM] 2 mM Endkonzentration 5 µl Probe 12 µl festes Volumen + 8 µl variables Volumen (Millipore-H2O und MEB, REB und NB) 20 µl Gesamtvolumen Mit Hilfe des variablen Volumens wurden folgende MEB, REB und NB Konzentrationen im Assay eingestellt: 0,5, 1, 2, 4, 6, 8, und 10 mM. Vom NB konnten maximal 8 mM eingesetzt werden, da höhere Konzentration sich als unlöslich erwiesen. Alle Makrolide wurden zur Herstellung einer 100 mM Stammlösung in reinem Methanol aufgenommen. Aus diesen Stammlösungen wurden durch Verdünnung mit Millipore-H2O alle weiteren Lösungen hergestellt. Die Proben wurden für 5 min (MEB), 15 min (REB) und 2 h (NB) bei 25°C inkubiert (Heizblock, IKA) und danach für 30 s bei 95°C abgestoppt (Heizblock, IKA). Nach dem Abstoppen wurden die Proben für 10 min bei 13000 Upm und 4°C abzentrifugiert
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E MATERIAL UND METHODEN (Rotina 35R, Hettich). Die Analytik erfolgte mit CE (Kap. E 6.4.1). Aus der Anfangsreaktionsgeschwindigkeit und unter Berücksichtigung des Proteingehalts der Probe (2,3 mg/ml) wurde für jeden Ansatz die spezifische Aktivität berechnet (Microsoft Excel XP). Die Enzymprobe stammet aus einer Ni2+-TED Aufreinigung (Kap. E 2.3.2). Mit Hilfe des Programms „Sigma Plot 8.0.2“ und dem dazugehörigen „Enzymkinetikmodul V. 1.10“ (beide Systat Software) wurden sowohl die Vmax- als auch der Km-Werte für MEB, REB und NB nach Michaelis-Menten über ein Iterationsverfahren (Marquardt-Levenberg-Algorithmus) berechnet. Dabei lag der Berechnung folgende Formel zugrunde:
(7)
i
m
KS
SKV
v++
=1
max
Es bedeuten: S: Substratkonzentration [mM] v: Reaktionsgeschwindigkeit [mU/mg] Vmax: maximale Reaktionsgeschwindigkeit [mU/mg] Km: Michaelis-Menten-Konstante [mM] Ki: Inhibitionskonstante [mM]
4.3 Biochemische Charaktersierung von EryBV, OleG2 und TylMII 4.3.1 Untersuchung des Donorsubstratspektrums von EryBV, OleG2 und TylMII Die Untersuchung des Donorsubstratspektrums bzw. der Nachweis der Enzymaktivität von EryBV, OleG2 und TylMII erfolgte mit zur Verfügung stehenden, geeigneten dTDP-aktivierten Desoxyzuckern, die strukturell mit den natürlich Donorsubstraten möglichst eng verwandt waren. Versuche mit den natürlichen Donorsubstraten (dTDP-L-Mycarose, dTDP-L-Olivose und dTDP-D-Mycaminose) konnten nicht durchgeführt werden, da diese bis zum Ende der Arbeit nicht vorlagen. Alle Ansätze wurden in 1,5 ml Eppendorf-Reaktionsgefäßen zusammenpipettiert und für 16 h bei 30°C inkubiert (Thermostat 5320, Eppendorf). Als Puffer diente 50 mM Tris/HCl, pH 7,5 mit 5 mM MgCl2.
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E MATERIAL UND METHODEN Tab. 19: Transferversuche zur Untersuchung des Donorsubstratspektrums von EryBV, OleG2 und TylMII.
Enzym Natürliches Donorsubstrat
Verwendete Donorsubstrate Verwendetes Akzeptorsubstrat
EryBV dTDP-L-Mycarose dTDP-L-Rhamnosea EBd
OleG2 dTDP-L-Olivose dTDP-L-Rhamnosea EBd
TylMII dTDP-L-Mycaminose dTDP-3-Amino-3,6-didesoxy-D-glucoseb
dTDP-D-Desosaminc
Tylactone
a = Konzentration 5 mM, b = Konzentration 1 – 2 mM, c = Konzentration 2,5 mM, d = 1 mM, e = 0,5 mM. Der Zucker dTDP-3-Amino-3,6-didesoxy-D-glucose stand nicht in isolierter Form zur Verfügung, sondern wurden zuvor in einem in vitro Ansatz, ausgehend von dTDP-6-Desoxy-4-keto-glucose, in der Größenordnung von 1 – 2 mM hergestellt (Dipl.-Chem. C. Rupprath). Nach 6 - 12 h Inkubation wurde der Ansatz mit 100 µl TylMII-Rohextrakt und 0,5 mM Tylacton versetzt und für weitere 16 h bei 30°C inkubiert. Nach Ablauf der Inkubationszeit wurden alle Reaktionen für 5 min bei 95°C abgestoppt (Thermostat 5320, Eppendorf) und abzentrifugiert (14000 Upm, 25°C, Mikro 22R, Hettich). Die Analytik der Ansätze erfolgte nach vorhergehender Konzentrierung und Reinigung über C18-Festphasenextraktion (Kap. E 6.1.1) mit DC (Kap. E 6.1.2), da der unter Kap. E 4.1 beschrieben Aktivitätstest für die bakteriellen Glykosyltransferasen zum Zeitpunkt der Untersuchungen noch nicht etabliert war.
4.4 Untersuchungen zur kombinatorische Biokatalyse 4.4.1 Einsatz von EryCIII im EMS und Kopplung von Modulen Das Ziel in dieser Arbeit war die Verbindung der Module C und A durch Einsatz einer Glykosyltransferase und der nachfolgende Übergang in Modul B durch den Einsatz einer Dehydratase. Um den Effekt der Kombination mehrere Enzyme besser beurteilen zu können, wurden zwei verschiedene kombinatorische Ansätze erstellt (Ansatz A und B). Das rekombinante Enzym SuSy 1 (Sucrose Synthase 1 [EC 2.4.1.13] (Sucrose-UDP-glucosyltransferase) aus Solanum tuberosum (Kartoffel)) wurde von Frau Dr. U. Römer während ihrer Dissertation produziert, aufgereinigt und für die nachfolgenden Versuche zur Verfügung gestellt. Rekombinantes RmlB (dTDP-Glucose-4,6-dehydratase [EC 4.2.1.46] aus Salmonella enterica LT2) wurde von Herrn Dipl.-Chem. C. Rupprath während seiner Dissertation produziert, aufgereinigt und ebenfalls dankenswerterweise für die Versuche zur Verfügung gestellt.
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E MATERIAL UND METHODEN Kombinatorischer Ansatz mit EryCIII und SuSy 1 (Ansatz A) 2,5 mM dTDP-D-Desosamin 1 mM MEB 10 mM MgCl2 (Roth) 100 mM HEPES, pH 7,6 (Roth) 150 mM NaCl (Roth) 250 mM Saccharose (Roth) 1 U SuSy 1 200 µl EryCIII, IMAC gereinigt (Proteingehalt: 10 mg/ml) Kombinatorischer Ansatz mit EryCIII, SuSy 1 und RmlB (Ansatz B) 2,5 mM dTDP-D-Desosamin 1 mM MEB 10 mM MgCl2 (Roth) 100 mM HEPES, pH 7,6 (Roth) 150 mM NaCl (Roth) 250 mM Saccharose (Roth) 1 U SuSy 1 1 U RmlB 200 µl EryCIII, IMAC gereinigt (Proteingehalt: 10 mg/ml) Die kombinatorischen Ansätze mit jeweils 400 µl Gesamtvolumen wurden in 1,5 ml Eppendorf-Reaktionsgefäßen zusammenpipettiert, durch Zugabe von dTDP-D-Desosamin gestartet und für 24 h bei 30°C inkubiert (Thermostat 5320, Eppendorf). Als Kontrolle wurde jeweils ein Ansatz mit 100 µl Gesamtvolumen, ohne EryCIII inkubiert. Nach 0, 0,5, 1, 2, 3, 4, 5 bzw. 6 und 24 h wurden 50 µl Proben abgenommen, für 5 min bei 95°C abgestoppt (Thermostat 5320, Eppendorf) und abzentrifugiert (5 min, 13000 Upm, 25°C, Mikro 22R, Hettich). Nach der Zentrifugation erfolgte die Analytik mit HPLC (Kap. E 6.2.1). 4.4.2 Immobilisierung von EryCIII an Ni2+-NTA-MagnetoBeads Da der Einsatz von immobilisierten Enzymen von großem Interesse für die kombinatorische Biokatalyse ist wurden erste Versuche zur gerichteten Immobilisierung und katalytischen Nutzung des EryCIII-Immobilisats gemacht. Der Ansatz wurde nach Vorschrift der Firma Qiagen in einem 2 ml Eppendorf-Reaktionsgefäß zusammengestellt, jedoch wurden einige Parameter für den Versuch adaptiert. In Abweichung vom Standardprotokoll wurde für den Zellaufschluss HEPES-Puffer (Roth) eingesetzt, da dieser auch später für den Aktivitätstest mit dem immobilisierten Enzym (Kap. E 4.4.3) verwendet wurde. Für die Herstellung des Rohextraktes wurden 0,4 g Zellen in ein 2 ml Eppendorf-Reaktionsgefäß eingewogen und mit 1 ml HEPES-Lysispuffer eine ca. 40%ige (w/v) Zellsuspension hergestellt. Die Zellsuspension wurde gründlich gemischt (Vortex) und für 15 min auf Eis inkubiert. Nach Ablauf der Zeit wurde die Zellsuspension unter Wassereiskühlung für 2 × 30 s mit einer
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E MATERIAL UND METHODEN Pause von 30 s zwischen den Beschallungen (Sonopuls HD200 mit Spitze MS73, Bandelin) durch Ultraschall aufgeschlossen. Nach der Beschallung wurde das Homogenat für 10 min bei 15000 Upm und 4°C zentrifugiert (Rotina 35R, Hettich) und der Rohextrakt in ein neues 1,5 ml Eppendorf-Reaktionsgefäß überführt. Eine Bestimmung des Proteingehaltes nach Bradford (1976) wurde aufgrund des störenden Einfluss von Tween 20 (Detergens) (Roth) nicht durchgeführt. Ein Teil des so hergestellten Rohextraktes wurde für den Immobilisierungsansatz verwendet. HEPES-Lysispuffer 50 mM HEPES, pH 8 (Roth) 150 mM NaCl (Roth) 1 U Benzonase/ml Puffer (Calbiochem-Novabiochem) 1 mg Lysozym/ml Puffer (Roche Diagnostics) 0,05% Tween 20 (Roth) 10 mM Imidazol (Roth) Der Puffer wurde mit NaOH (Roth) (10 M) auf pH 8 eingestellt und vor der Verwendung filtriert (0,22 µm, Sartorius). Ansatz für die Immobilisierung von EryCIII - Versetzen von 500 µl Rohextrakt mit 100 µl der 5%igen (v/v) Fertigsuspension der MagnetoBeads (Qiagen) und Inkubation für 30 min bei 15°C in einem Laborschüttler bei einer Schüttelfrequenz von 40% (IKA). - Magnetische Separation des Ansatzes in einem magnetischen Separator für Eppendorf-
Reaktionsgefäße (Chemagen) und dreimaliges Waschen der Beads mit je 1 ml Puffer (50 mM HEPES, pH 8, 150 mM NaCl (Roth)) durch wiederholtes Separieren und Mischen (Vortex). Die dritte Waschfraktion wurde als Referenzprobe (Negativkontrolle) für den späteren Aktivitätstest aufgehoben, um den Erfolg der Waschschritte zu untersuchen.
- Magnetische Separation des Ansatzes und Resuspendierung der Beads in 250 µl Puffer (50 mM HEPES, pH 8, 150 mM NaCl (Roth)). Die auf diese Weise immobilisierte Enzympräparation wurde für den nachfolgenden Transferansatz verwendet. Aufgrund der Substratlimitierung für Enzymtests wurde kein Aktivitätstest zur Bestimmung der Immobilisierungsausbeute durchgeführt.
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E MATERIAL UND METHODEN 4.4.3 Katalytischer Einsatz der immobilisierten Glykosyltransferase Um zu zeigen, dass das Enzym katalytisch aktiv immobilisiert werden konnte, wurden unter Berücksichtigung der erforderlichen Kontrollen, verschiedene Transferansätze durchgeführt. Ansatz: 2,5 mM dTDP-D-Desosamin 0,5 mM MEB 5 mM MgCl2 (Roth) 50 mM HEPES, pH 8 (Roth) 150 mM NaCl (Roth) 250 µl Probe 500 µl Gesamtvolumen Die eingesetzten Proben bestanden aus der Beadsuspension mit EryCIII (5 µl Beads absolut), EryCIII-Rohextrakt (Positivkontrolle) und einem Teil der 3. Waschfraktion (Referenzprobe bzw. Negativkontrolle). Alle Ansätze (1,5 ml Eppendorf-Reaktionsgefäße) wurden über Nacht in einem Laborschüttler (IKA) bei 30°C und 40% Schüttelfrequenz inkubiert. Nach 16 h wurden den Ansätzen 1 U alkalische Phosphatase (Roche Diagnostics) zugesetzt und die Ansätze für 1 h weiter inkubiert. Nach Ablauf der Inkubationszeit wurden die MagnetoBeads separiert (Separator, Chemagen) und alle Ansätze für 5 min bei 95°C abgestoppt (Thermostat 5320, Eppendorf). Danach wurden die Ansätze für 10 min zentrifugiert (15000 Upm, 25°C, Rotina 35R, Hettich) und anschließend über Festphasenextraktion aufbereitet (Kap. E 6.1.1) und mit DC (Kap. E 6.1.2) analysiert.
5 Datenbankrecherchen und berechnete Daten Im Verlauf der Arbeit wurde eine Reihe von Datenbankrecherchen durchgeführt, um Informationen über die bakteriellen Glykosyltransferasen zu sammeln. Außerdem wurden verschiedene über die Datenbanken zur Verfügung gestellte Programme eingesetzt, um unterschiedliche Proteinparameter zu berechnen bzw. um die Sequenzen der verschiedenen Glykosyltransferasen zu vergleichen. Im Folgenden wird erläutert, wie die theoretischen Molekulargewichte und pI-Werte der rekombinanten Glykosyltransferasen berechnet wurden.
5.1 Theoretische pI-Werte und Molekulargewichte Für die Berechnung der theoretischen pI-Werte und Molekulargewichte der Glykosyltransferasen wurde die Datenbank „ExPasy - Expert Protein Analysis System“ (www.expasy.org) herangezogen. Dazu wurde über das Suchprogramm der Datenbank die Proteinsequenz der jeweilige Glykosyltransferase herausgesucht und die Proteinsequenz dazu verwendet, mit dem Programm „Compute pI/Mw Tool“ (Wilkins et al. 1998), die theoretischen Werte zu berechnen. Auf diese Weise wurden die theoretischen pI-Werte und die theoretischen Molekulargewichte für EryCIII, EryBV, OleG2 und TylMII ermittelt.
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E MATERIAL UND METHODEN 6 Analytik Im Folgenden (Kap. E 6.1 – 6.8) sind die in der Arbeit verwendeten analytischen Methoden beschrieben. Alle verwendeten Chemikalien, Gerät, Stämme, etc. sind in Kap. F im Detail verzeichnet.
6.1 Dünnschichtchromatographie (DC) 6.1.1 C18-Festphasenextraktion Um die verschiedenen Makrolide aus den in vitro Ansätzen durch DC (Kap. E 6.1), HPLC (Kap. E 6.2.2) und HPLC-MS (Kap. E 6.3.1) direkt nachweisen zu können wurden die Ansätze zuvor durch C18-Festphasenextraktion aufbereitet. Ziel der Extraktion war die Aufreinigung und Konzentrierung der Makrolide. Für den im Verlauf der Arbeit entwickelten Aktivitätstest mit Nachweis des freigesetzten dTDP (Kap. E 4.1) wurde keine Extraktion durchgeführt. Vor der Extraktion der Makrolide wurden die Proben durch Hitzedenaturierung abgestoppt und durch Zentrifugation geklärt. Für die Festphasenextraktion wurden Vakuum-Extraktionsmodule vom Typ Sep-Pak C18, 1 ml der Firma Waters eingesetzt. Die Extraktion wurde nach folgendem Schema durchgeführt: - Äquilibrierung der Kartusche/Befeuchtung der Matrix mit 800 µl Methanol (100%ig, Roth). - Waschen der Kartusche mit mindestens 2 × 800 µl Millipore-H2O. - Beladen der Kartusche mit der Probe. - Waschen der Kartusche mit mindestens 2 × 800 µl Millipore-H2O. - Elution mit mindestens 300 µl Methanol (100%ig, Roth). Mangels einer geeigneten Vakuumanlage wurden die einzelnen Schritte mit einer 100 – 1000 µl Pipette (Eppendorf) durchgeführt und die Lösungen langsam durch die Kartusche gedrückt, bis sich keine Flüssigkeit mehr in der Kartusche befand. Nach der Elution wurden die Proben in einer SpeedVac (UniEquip) im Vakuum bis zur Trockene eingeengt und anschließend in 10 - 50 µl Methanol (100%ig, Roth) aufgenommen und bei – 20°C gelagert. 6.1.2 DC-Verfahren zur Trennung von Makroliden Für die Trennung der Makrolactone, Makrolid-Antibiotika und hybriden Makrolide wurde eine Reversed-Phase-DC-Methode eingesetzt. Als Platten wurden DC-Fertigplatten vom Typ RP18 W/UV254 (10 × 20 cm bzw. 5 × 20 cm) der Firma Macherey-Nagel verwendet. Bei dieser Art von Platte handelt es sich um eine "Zwitter"-DC -Platte, weil sie sowohl für die Reversed-Phase- (RP) als auch für die Normalphasen-(NP)-Chromatographie eingesetzt werden kann. Durch die Verwendung eines teilsilanisierten C-18 Kieselgels mit definierter Zahl an verbleibenden Silanolgruppen kann je nach Laufmittelzusammensetzung eine mehr "RP-ähnliche" oder "NP-ähnliche" Trennung erzielt werden. Die Polarität der Schicht kann
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E MATERIAL UND METHODEN durch relative Variation der Laufmittel-Polarität bestimmt werden. Die mittlere Korngröße des Kieselgels beträgt 9 µm. Als Laufmittel für die DC wurde der unter Kap. E 6.2.2 beschriebene HPLC-Laufpuffer nach Salah-Bey et al. (Salah-Bey et al. 1998) verwendet. Nach der Probenvorbereitung über Festphasenextraktion (Kap. E 6.1.1) wurden die DC-Platten mit einem Teil der Proben, sowie mit den jeweiligen Standards beladen und für 2 -3 h in einer geeigneten DC-Kammer unter dem Abzug inkubiert. Alle Proben wurden in 100% Methanol (Roth) gelöst. Von den Standards (1 mM – 10 mM) wurden mit einer Mikropipette (Eppendorf) zwischen 2 – 5 µl pro Spur aufgetragen, von den Proben maximal 10 µl pro Spur. Nach Abschluss der Chromatographie wurde die Laufmittelfront markiert, die DC unter dem Abzug im Warmluftstrom (Fön) getrocknet und nach dem vollständigen Trocknen wie unter Kap. E 6.1.3 beschrieben weiterbehandelt. Nach der Entwicklung wurden die Rf-Werte der jeweiligen Verbindung nach folgender Formel 8 ermittelt:
(8) frontLaufmitteldereLaufstreck
robePdereLaufstreckR f = [ ][ ] [ ]−=cmcm
6.1.3 Makrolidnachweis durch Anisaldehyd-H2SO4-Reagenz Nach der Trennung per DC wurden die verschiedenen Verbindungen aus den in vitro-Transferansätzen mit Hilfe eines Anisaldehyd-Schwefelsäure-Reagenz (Ekkert’s-Reagenz) (Jork et al. 1989) sichtbar gemacht und nachgewiesen. Anisaldeyd-Schwefelsäure ist ein Universalreagenz für Naturstoffe, das Farbdifferenzierungen ermöglicht. Die Nachweisgrenzen liegen bei Prostaglandinen und Zuckern bei 50 ng Substanz pro Chromatogramm-Zone. Der Reaktionsmechanismus ist nicht geklärt. Im Folgenden sind Herstellung und Anwendung des Reagenz beschrieben. Herstellung: Eine Mischung aus 85 ml Methanol (Roth) und 10 ml konz. Essigsäure (Roth) wurde unter Eiskühlung und konstantem Rühren mit 8 ml konz. Schwefelsäure (Roth) und 0,5 ml p-Anisaldehyd (Sigma-Aldrich) versetzt. Das fertige Reagenz ist bei 4°C mehrere Wochen haltbar. Anwendung: Nach Beendigung der Chromatographie wurden die DC-Platten unter dem Abzug getrocknet und nach dem Trocknen mit dem Reagenz eingesprüht. Dabei wurde darauf geachtet, dass die DC-Platten bis auf den Glasträger durchfeuchtet wurden. Nach dem Einsprühen wurden die Platten im Warmluftstrom (Fön) kurz unter dem Abzug angetrocknet und dann zur Entwicklung für 5 – 10 min bei 100 – 110°C in einen Trockenschrank eingebracht. Nach der Entwicklung wurden die Platten ausgewertet und dokumentiert.
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E MATERIAL UND METHODEN 6.2 Hochleistungsflüssigkeitschromatographie (HPLC) 6.2.1 HPLC-Verfahren zur Trennung von Nukleosiden, Nukleotiden und nukleotid-aktivierten Zuckern Nukleoside, Nukleotide und die jeweiligen nukleotid-aktivierten Zucker können mit Hilfe einer Reversed-Phase-Ionenpaarchromatographie getrennt und anhand von Standards über die spezifische Retentionszeit identifiziert werden (Ryll und Wagner 1991). Aufgrund ihres guten Absorptionsverhaltens im UV können sie bei 254 nm mit einer hohen Empfindlichkeit detektiert werden. Die Quantifizierung der jeweiligen Substanz erfolgte unter Verwendung von zuvor erstellten Kalibrierungsgeraden (Peakfläche/Konzentration) in einem Konzentrationsbereich von 0 bis 2 mM. Ein Beispielchromatogramm für die Trennung von dTMP, dTDP, dTTP und dTDP-Glucose (alle Sigma-Aldrich) und die Kalibrierungsgraden für dTMP, dTDP und dTDP-Glucose sind in Kap. F 9.2 verzeichnet. Säule: Hypersil ODS 5 µ RP-18 Säule, 125 × 4,6 mm mit Vorsäule 10 × 4,6 mm (CS-Chromatographie Service) Einspritzvolumen: 20 µl Laufmittel: Puffer A (100 mM KH2PO4, 8 mM TBA (Serva), mit KOH (Roth) auf pH 5,3 eingestellt) Puffer B (Puffer A mit 30% (v/v) Methanol (Roth), mit KOH (Roth) auf pH 5,9 eingestellt) Gradientenprofil: bis 2,5 min 100% Puffer A bis 16,5 min linearer Gradient von 0 – 40% Puffer B bis 17,5 min linearer Gradient von 40 – 100% Puffer B bis 29 min 100% Puffer B bis 30 min linearer Gradient von 100 – 0% Puffer B bis 35 min 100% Puffer A Flussrate: 1 ml/min Temperatur: 40°C Detektion: 254 nm Alle Puffer wurden mit Millipore-H2O hergestellt, entgast und vor der Verwendung über 0,22 µm Filter (Sartorius) filtriert. Die Trennung erfolgte auf einer HPLC-Anlage der Firma Dionex (Kap. F 3). 6.2.2 HPLC-Verfahren zur Trennung von Makroliden Zur Trennung der verschiedenen Makrolactone und Makrolide wurde die von Salah-Bey et al. (Salah-Bey et al. 1998) beschriebene HPLC-Methode eingesetzt. Zur eindeutigen Identifikation der jeweiligen Substanz und zur Zuordnung des jeweiligen Substanzpeaks im
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E MATERIAL UND METHODEN Chromatogramm wurde die Methode mit einer massenspektroskopischen Analyse (MS-Analyse) gekoppelt (Kap. E 6.3.1). Säule: Kromasil C18 5 µ, 250 x 3 mm mit Vorsäule 10 × 3 mm (CS-Chromatographie Service) Einspritzvolumen: 10 – 50 µl Laufmittel: 50% (v/v) Ammoniumacetat (0,065 M, pH 6,7) (Merck) 35% (v/v) Acetonitril (Roth) 15% (v/v) Methanol (Roth) Flussrate: 1 ml/min Temperatur: 30°C Detektion: 215 nm Der Amoniumacetatpuffer wurde mit Millipore-H2O hergestellt, entgast und vor der Verwendung über 0,22 µm Filter (Sartorius) filtriert. Die Trennung erfolgte auf einer HPLC-Anlage der Firma Dionex (Kap. F 3).
6.3 HPLC-Massenspektrometrie (HPLC-MS) HPLC-MS ist im Bereich der Antibiotikaforschung die Standardmethode zur Zuordnung/Identifikation von neuen Verbindungen. Bei der Massenspektroskopie (MS) werden Molekül-Ionen entsprechend ihrem Verhältnis von Masse/Ladung (m/z) auftrennt und detektiert. Die Registrierung der Ionen erfolgt bei der Massenspektrometrie elektrisch über den Ionenstrom. 6.3.1 HPLC-MS-Verfahren zur Bestimmung der Masse von Makroliden Die im Rahmen dieser Arbeit durchgeführten massenspektroskopischen Untersuchungen wurden auf Basis der im EU-Projekt „GENOVA“ vorgesehenen Kooperation an der Cambridge University am Lehrstuhl für Biochemie (Prof. Dr. P. F. Leadlay, Cambridge University, England) ausgeführt. Die Trennung der Makrolactone, Makrolid-Antibiotika und hybriden Makrolide erfolgte entweder mit der in Kap. E 6.2.2 beschriebenen HPLC-Methode nach Salah-Bey et al. (Salah-Bey et al. 1998) oder mittels einer Acetonitril/Ammoniumacetat-Gradientenmethode. Die HPLC-Messungen erfolgten auf einer Anlage der Firma Hewlett Packard (HP1100 liquid chromatograph, Dioden Array Detektor, Entgaser). Für die Erstellung der Massenspektren wurde ein Massenspektrometer der Firma Finnigan mit einer Standard Elektronenspray-Ionenquelle (MAT-LCQ) eingesetzt. Bei den Massenspektren handelt es sich um ESI-MS-Spektren (Electron Spray Ion). Die Messungen erfolgten im sog. „positiv Ionenmodus“. Säule: Prodigy ODS3 5 µ 100 Å-HPLC Säule (4,6 x 250 mm) (Phenomenex)
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E MATERIAL UND METHODEN Einspritzvolumen: 10 µl Laufmittel: Puffer A: Millipore-H2O Puffer B: Acetonitril/20 mM Ammoniumacetat (pH nicht eingestellt!) Gradientenprofil: für 5 min 25% Puffer B für 20 min linearer Gradient von 25% – 75% Puffer B für 2 min linearer Gradient von 75% – 95% Puffer B für 2 min 95% Puffer B für 1 min linearer Gradient 95 % - 25 % Puffer B Flussrate: 1 ml/min Detektion: 210 nm
6.4 Kapillarelektrophorese (CE) Das Trennprinzip der Kapillarelektrophorese (CE) beruht auf der unterschiedlichen elektrophoretischen Mobilität der analysierten Verbindungen. Der elektrophoretischen Wanderung von Ionen im elektrischen Feld ist eine zweite Bewegung überlagert, die als elektroosmotischer Fluss (EOF) bezeichnet wird. Dieser Fluss verursacht eine Bewegung der gesamten Elektrolytlösung und führt somit zu einer Trennung aller Substanzen in der Probe, unabhängig davon, ob sie eine Ladung besitzen oder nicht. 6.4.1 CE-Verfahren zur Trennung von Nukleosiden, Nukleotiden und nukleotid-aktivierten Zuckern Nukleoside, Nukleosidphosphate und die jeweiligen aktivierten Zucker können ebenfalls mit Hilfe einer geeigneten CE-Methode getrennt und anhand von Standards über die spezifische Migrationszeit zugeordnet werden. Die Messungen wurden mit einem „P/ACE MDQ Carbohydrate Kapillarelektrophoresesystem“ der Firma Beckmann-Coulter durchgeführt (Kap. F 3). Die Quantifizierung der jeweiligen Substanz erfolgte unter Verwendung von Kalibrierungsgeraden (Peakfläche/Konzentration) in einem Konzentrationsbereich von 0 bis 2 mM. Ein Beispielelektropherogramm und Beispielkalibrierungsgraden für Thymidin, dTMP, dTDP und dTDP-Glucose sind in Kap. F 9.3 verzeichnet. Kapillare: Quarzkapillare (fused silica), Innendurchmesser 75 µm, effektive Länge 50 cm, totale Länge 57 cm (Beckmann-Coulter) Elektrolyt: 24 mM Na-Borat (Borax) (Roth) 32 mM Borsäure (Merck) pH 9 Spannung: 25 kV, angelegt über eine Rampe von 30 s Injektion: hydrodynamisch über Druck mit 0,5 psi für 10 s Temperatur: 25°C (Kapillare) Detektion: 254 nm
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E MATERIAL UND METHODEN Programm: 1. Spülen mit 0,1 M NaOH, 20 psi Druck, 2 min Dauer 2. Spülen mit Millipore-H2O, 20 psi Druck, 2 min Dauer 3. Spülen mit Elektrolyt, 20 psi Druck, 2 min Dauer 4. Injektion der Probe, 0,5 psi, 10 s Dauer
5. Trennung bei 25 kV, angelegt über eine Rampe von 30 s, 20 min Dauer
6. Ende des Programms In Abweichung zum obigen Protokoll erfolgte die Trennung der Ansätze aus Kap. E 4.2.1 und Kap. E 4.2.2 unter folgenden Bedingungen: Elektrolyt: 12 mM Na-Borat, 16 mM Borsäure; Injektion: 1 psi für 5 s; Kapillarentemperatur: 37°C; Dauer der Spülschritte je 1 min; Dauer der Trennung 8 – 12 min.
6.5 Nachweis der antibiotischen Aktivität Die zuvor beschriebenen analytischen Methoden (Kap. E 6.1 bis 6.4) weisen das Entstehen einer neuen Verbindung nach, erlauben jedoch keine Aussage im Hinblick auf die antibiotische Wirkung. Um diese Nachzuweisen wurde ein geeigneter Plattentest zum qualitativen Nachweis der antibiotischen Aktivität verwendet. Die Ergebnisse dieses Tests erlauben jedoch aufgrund der eingeschränkten Quantifizierbarkeit der diversen Transferprodukte durch HPLC (Kap. E 6.2.2) keine Aussage im Vergleich zur antibiotischen Wirksamkeit von Erythromycin A. 6.5.1 Plattentest zum Nachweis der antibiotischen Aktivität Der Test auf antibiotische Aktivität wurde anhand eines sog. Stechagarplattentests durchgeführt. Als Teststamm diente Kocuria rhizophila (ATCC 9341; bis Anfang 2003 bei der DSMZ als Micrococcus luteus geführt), der seit den 70er Jahren des letzten Jahrhunderts als sehr empfindlicher Teststamm für den Nachweis von Antibiotika-Kontaminationen in Fleisch oder ähnlichen Produkten eingesetzt wird (Simon und Yin 1970). Für den Test wurden 500 µl einer Glyzerin-Kryokultur des Teststamms in 50 ml M1-Agarmedium aufgenommen und danach unter der Sterilbank (Mahl) in eine viereckige Platte gegossen. Nach dem Stechen und Befüllen wurden die Platten für 24 – 48 h bei 30°C im Brutschrank (Memmert) inkubiert. Da die Proben neben den diversen Makroliden auch unterschiedliche Mengen an Methanol aus der C18-Festphasenextraktion (Kap. E 6.1.1) enthielten wurde untersucht, ob das Methanol in den Proben eine antibakterielle Wirkung besitzt. Dazu wurden methanolische Lösungen von 0 – 100% Methanol (Roth) in den Plattentest eingesetzt und das Wachstum des Teststammes beobachtet Das eingesetzte Probenvolumen des Plattetests betrug je nach Probe zwischen 20 µl und 50 µl.
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E MATERIAL UND METHODEN 6.6 Bestimmung des Proteingehalts nach Bradford Die Proteinbestimmungen in der Arbeit wurden nach der Methode von Bradford (1976) durchgeführt. Herstellung des Bradford-Reagenz: 100 mg Coomassie Brilliant Blue G-250 wurden in 50 ml absolutem Ethanol gelöst. Nach Zugabe von 100 ml konzentrierter o-Phosphorsäure wurde 1 h gerührt und mit Millipore-H2O auf 1 L aufgefüllt. Das Reagenz wurde 15 min gekocht und anschließend über Nacht stehen gelassen. Am nächsten Tag wurde das Reagenz über einen Faltenfilter filtriert und in einer dunklen Flasche gelagert. Für die Quantifizierung des Proteins wurden Kalibrierungsgeraden für BSA (Fraktion V, Roth) von 0 – 0,1 mg/ml (Ansatz A; 1 ml Küvettenmaßstab) bzw. 0 – 0,08 mg/ml (Ansatz B; Mikrotiterplattenmaßstab) erstellt. Die Messungen erfolgten mit einem UV 1602 Spektrophotometer (Shimadzu), oder aber mit dem Mikrotiterplatten-Photometer (SpektraMax-Plus, Molecular Devices). Die Proteinbestimmungen wurden in Form von Dreifachbestimmungen ausgeführt. Ansatz A: 900 µl Bradford-Reagenz 100 µl BSA-Lösung Ansatz B: 90 µl Bradford-Reagenz 10 µl BSA-Lösung Nach gründlichem Mischen wurden die Proben für 7 min bei Raumtemperatur inkubiert und anschließend die Absorption bei 595 nm gemessen. Exemplarische Kalibrierungsgeraden für beide Ansätze sind in Kap. F 9.1 verzeichnet.
6.7 SDS-PAGE, Western- und Immunoblotting Durch SDS-PAGE ist es möglich Proteine und Proteinuntereinheiten im denaturierten und reduzierten Zustand im elektrischen Feld anhand ihres Molekulargewichts zu trennen und zu analysieren. Durch anschließendes Westernblotting können die durch SDS-PAGE getrennten Proteine auf verschiedene Membranen übertragen und immobilisiert werden. Als Membranen kommen beim Westernblotting primär PVDF-, aber auch Nitrozellulose-Membranen zum Einsatz. Nach dem Transfer auf die Membran können die Proteine durch Anfärben sichtbar gemacht werden (z. B. Coomassie-Färbung) oder aber mit einem geeigneten Antikörper spezifisch nachgewiesen werden (Immunoblot). In der vorliegenden Arbeit wurden für diese Arbeiten Fertiggel-Systeme der Firmen Invitrogen (NuPAGE-System) und Bio-Rad (Criterion-System) eingesetzt.
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E MATERIAL UND METHODEN 6.7.1 NuPAGE SDS-PAGE- und Blottingsystem Bei dem NuPAGE-Gelelektrophoresesystem handelt es sich um ein neuartiges diskontinuierliches SDS-PAGE Fertiggel-System das im Gegensatz zum klassischen Laemmli-System (Laemmli 1970) bei neutralem pH-Wert arbeitet und eine hohe elektrophoretische Auflösung mit einer maximalen Artefaktreduktion verbindet. Im Folgenden ist sowohl der Standardansatz für die Probenvorbereitung der NuPAGE Gelelektrophorese unter denaturierenden und reduzierenden Bedingungen, als auch die Herstellung der Puffer und die Standardelektrophoresebedingungen wiedergegeben. Alle Komponenten für die NuPAGE Elektrophorese sind Bestandteil des Fertiggel-Systems der Firma Invitrogen und werden daher hier nicht einzeln aufgeschlüsselt. Weiterführende technischen Details können dem „NuPAGE Technical Guide, Version D, August 2002, Invitrogen“ entnommen werden. Probenvorbereitung für die NuPAGE Gelelektrophorese Probe x µl NuPAGE LDS-Probenpuffer (4 ×) 10 µl NuPAGE Reducing Agent (10 ×) 4 µl Millipore-H2O 26 µl (maximal) Gesamtvolumen 40 µl Die einzelnen Komponenten wurden in 1,5 ml Eppendorf-Reaktionsgefäßen zusammenpipettiert, gemischt (Vortex), kurz abzentrifugiert (Mikro 22R, Hettich) und für 10 min bei 70°C inkubiert (Thermostat 5320, Eppendorf). Das eingesetzte Probenvolumen richtete sich nach dem Proteingehalt der Proben. Von Rohextraktproben wurden bis zu 50 µg Gesamtprotein pro Spur, von aufgereinigten Proteinfraktionen je nach Reinheitsgrad der Probe (Q-Sepharose, Ni2+-NTA, Gelfiltration) 5 bis 15 µg aufgetragen. Das Fertiggel wurde mit je 20 µl der denaturierten Proben beladen und die Elektrophorese gestartet. Die restlichen 20 µl wurden für eventuelle weitere Analysen (Gel oder Blot) bei – 20°C eingefroren. In der Arbeit wurden 10%ige Bis-Tris-Gele (1 mm Dicke, 10ner Probenkamm) verwendet. Als Laufpuffer dienten MOPS- und MES-SDS-Puffer, die für Elektrophorese nach folgender Vorschrift unter Rühren in einem 1 L Standzylinder hergestellt wurden. Herstellung des Laufpuffers MOPS (MES)-SDS-Puffer (20 ×) 50 ml Millipore-H2O 950 ml Gesamtvolumen 1000 ml Vom fertigen Laufpuffer wurden 200 ml abgenommen und mit 500 µl NuPAGE Antioxidant versetzt. Nach Einbau des Gels (Gele) in die Elektrophoresekammer (XCell SureLock Mini-Cell, Invitrogen) und Entfernung des Probenkamms wurde die innere Kammer mit den zuvor abgenommenen 200 ml Laufpuffer befüllt, die äußere Kammer mit den restlichen 800 ml.
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E MATERIAL UND METHODEN Nach dem vollständigen Befüllen wurden die Proben unterschichtend in die Taschen gespritzt und die Elektrophorese gestartet (50 min, 200 V konstant, Raumtemperatur) (PowerEase 500, Invitrogen, bzw. PowerPac 300, Bio-Rad). Parallel zu den Proben wurden 10 µl eines Molekulargewichtsstandards (All blue prestained Precision Plus Protein Molekulargewichtsstandard, bzw. Prestained Precision Protein Molekulargewichtsstandard, Bio-Rad) zur späteren Molekulargewichtsbestimmung der Proteine mit aufgetragen. Nach Abschluss der Elektrophorese wurde das Fertiggel nach Vorschrift geöffnet und angefärbt (Coomassie-Färbung) bzw. geblottet. Zur Färbung der Fertiggele beider SDS-PAGE Systeme wurden zwei sich ähnliche Coomassie-Fertiglösungen verwendet (Bio-Safe Coomassie, Bio-Rad; SimplyBlue SafeStain, Invitrogen). Die Coomassie-Färbung erfolgte mit beiden Färbelösungen analog nach Vorschrift. Coomassie-Färbung von SDS-PAGE Gelen - Waschen des Gels für 3 × 5 min mit Millipore-H2O; Wechsel des Wassers alle 5 min. - Inkubation des Gels für 15 – 30 min mit Coomassie-Färbelösung. - Waschen des Gels mit Millipore-H2O bis der Hintergrund entfärbt ist. Die Färbung/Entfärbung wurde in kleinen Petrischalen mit 20 – 50 ml Lösung unter Schütteln (Laborschüttler, IKA) durchgeführt. Da alle in der Arbeit untersuchten Glykosyltransferasen einen His6-tag zur Affinitätschromatographie an Ni-NTA (IMAC) enthielten, konnten die verschiedenen Glykosyltransferasen durch Immunoblotting nachgewiesen werden. Der Nachweis des gebundenen Antikörpers erfolgte durch die enzymatische Umsetzung eines präzipitierenden DAB-Substrates durch eine mit dem Anti-His6-Antikörper konjugierte Peroxidase. Im Folgenden sind der Ablauf des Westernblots für reduzierte Proben und der Immunonachweises beschrieben, sowie alle Reagenzien und Puffer aufgelistet. Als Blottingpuffer wurde NuPAGE Transferpuffer verwendet, der für den Westernblot nach folgender Vorschrift unter Rühren in einem 1 L Standzylinder hergestellt wurde. Herstellung des NuPAGE Blottingpuffers NuPAGE Transferpuffer (20 ×) 50 ml NuPAGE Antioxidant 1 ml Methanol (100%ig) 100 ml Millipore-H2O 849 ml Gesamtvolumen 1000 ml Für das Blotting von zwei Gelen wurden dem Puffer 200 ml Methanol (Roth) zugesetzt, um einen effizienten Transfer zu erreichen.
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E MATERIAL UND METHODEN NuPAGE Western- und Immunoblotvorschrift - Einweichen der Blottingpads in 700 ml Blottingpuffer und Entfernung von Luftblasen. - Einlegen der zurechtgeschnittenen PVDF-Membran (Immun-Blot PVDF Membran, Bio-Rad) für 30 sec in Methanol (100%ig, Roth), waschen mit Millipore-H2O und für 5 min in 50 ml NuPAGE Transferpuffer (1 ×) äquilibrieren. - Kurzes Äquilibrieren der Filterpapiere in 50 ml NuPAGE Transferpuffer (1 ×). - Zusammenbau der Blottingapparatur (XCell II Blot Module) nach Vorschrift, Einsetzten
des Blotmoduls in die Elektrophoresekammer (XCell SureLock Mini-Cell) und Blot für 1 h bei konstanten 30 V und Raumtemperatur (PowerEase 500, Invitrogen bzw. PowerPac 300, Bio-Rad).
Nach dem Blot wurde die Apparatur auseinander genommen und die Membran für den anschließenden Immunonachweis des „His6-getaggten“ Proteins folgendermaßen weiterbehandelt: - Blockierung/Absättigung der Membran bei Raumtemperatur für 1 h mit einem TBS- Blockierungspuffer. TBS-Blockierungspuffer: 10 mM Tris/HCl; pH 7,2 (Roth) 150 mM NaCl 8Roth) 1% (w/v) Blockierungsreagenz (Roche Diagnostics) (alternativ 3% (w/w) BSA (Roth)) - Inkubation der Membran bei Raumtemperatur für 1 h mit der Antikörperlösung zur Detektion des „His6-getaggten“ Proteins. Antikörperlösung: 10 mM Tris/HCl; pH 7,2 (Roth) 150 mM NaCl (Roth) 1% (w/v) Blockierungsreagenz (Roche Diagnostics) (alternativ 1% (w/w) BSA (Roth)) 100 mU/ml Anti-His6-Peroxidase Konjugat (Roche Diagnostics) - Waschen der Membran für 3 × 5 min mit TBS-Tween-Waschpuffer zur Entfernung des ungebundenen Antikörpers. TBS-Tween-Waschpuffer: 10 mM Tris/HCl; pH 7,2 (Roth) 150 mM NaCl (Roth) 0,1% Tween 20 (v/v) (Roth) - Inkubation der Membran mit 1 × DAB-Substratlösung bei Raumtemperatur bis zur Entwicklung der Banden (1 – 10 min). Nach der Entwicklung Abschütten der Substratlösung und mehrfaches Waschen des Immunoblots mit Millipore-H2O. 1× DAB-Substratlösung (für 20 ml): 2 ml 10 × DAB/Metall-Konzentrat (DAB- Substrat Kit, Roche Diagnostics) 18 ml Peroxid-Puffer (Roche Diagnostics)
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E MATERIAL UND METHODEN Nach Abschluss der Arbeiten wurde der Immunoblot luftgetrocknet. Die Lagerung der Blots erfolgte in Folie eingeschweißt bei 4°C. Alle Arbeitsschritte, mit Ausnahme der Überschichtung mit der DAB-Substratlösung, wurden in geeigneten Petrischalen unter leichtem Schütteln durchgeführt (Laborschüttler, IKA). Die Herstellung der Reagenzien erfolgte, soweit nicht näher erläutert, nach Herstellerangabe. 6.7.2 Criterion SDS-PAGE-System und Blotting nach Khyse- Andersen In der Arbeit wurde, wie zuvor erwähnt, auch mit Tris-HCl Fertiggelen (1mm Dicke, 12,5%iges Trenngel, 18ner Probenkamm) der Firma Bio-Rad gearbeitet. Bei dem System handelt es sich ebenfalls um ein diskontinuierliches SDS-PAGE Fertiggel-System, das sich im Prinzip nicht vom traditionellen Laemmli-System (Laemmli 1970) unterscheidet. Im Folgenden sind sowohl der Standardansatz für die Probenvorbereitung für die Criterion Gelelektrophorese unter denaturierenden und reduzierenden Bedingungen angegeben, als auch die Herstellung der Puffer und die Standardelektrophoresebedingungen. Probenvorbereitung für die Criterion Gelelektrophorese Probe 20 µl Laemmli-Probenpuffer (Bio-Rad) 40 µl Gesamtvolumen 60 µl Die einzelnen Komponenten wurden in 1,5 ml Eppendorf-Reaktionsgefäßen zusammenpipettiert, gemischt (Vortex), kurz abzentrifugiert (Mikro 22R, Hettich), für 5 min bei 95°C inkubiert (Thermostat 5320, Eppendorf) und auf Eis abgekühlt. Von Rohextraktproben wurden bis zu 50 µg Gesamtprotein pro Spur, von aufgereinigten Proteinfraktionen je nach Reinheitsgrad der Probe (Q-Sepharose, Ni-NTA, Gelfiltration) 5 bis 15 µg aufgetragen. Das Fertiggel wurde nach Vorschrift in die Gelkammer eingesetzt, der Probenkamm gezogen und die Kammer mit SDS-Glycin-Laufpuffer (Kap. F 2) befüllt. Nach dem vollständigen Befüllen wurden die Proben unterschichtend (30 µl) in die Taschen gespritzt und die Elektrophorese gestartet (60 min, 200 V konstant, Raumtemperatur) (PowerPac 300, Bio-Rad). Die restlichen 30 µl wurden für eventuelle weitere Analysen (Gel oder Blot) bei –20°C eingefroren. Parallel zu den Proben wurden 10 µl eines Molekulargewichtsstandards (All blue prestained Precision Plus Protein Molekulargewichtsstandard, bzw. Prestained Precision Protein Molekulargewichtsstandard, Bio-Rad) zur späteren Molekulargewichtsbestimmung der Proteine mit aufgetragen. Nach Abschluss der Elektrophorese wurde die Gel-Kassette nach Vorschrift geöffnet und angefärbt (Coomassie-Färbung) bzw. geblottet. Die Coomassie-Färbung erfolgte wie unter Kap. E 6.7.1 beschrieben. Das Westernblotting der Criterion Fertiggele wurde nach der Methode von Khyse-Andersen (Kyhse-Andersen 1984) in Form des Semi-Dry-Blottings (Trans-Blot SD Semi-Dry Transferzelle, Bio-Rad) durchgeführt. Die diskontinuierliche Blottingmethode nach Khyse-Andersen ermöglicht einen gleichzeitigen und quantitativen Transfer sowohl von
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E MATERIAL UND METHODEN großen (ab 200 kDa), als auch kleinen (bis 5 kDa) Proteinen. Die Puffer für das Blotting nach Khyse-Andersen sind in Kap. F 2 verzeichnet. Criterion Western- und Immunoblotvorschrift - Gel aus der Kammer nehmen, gründlich mit Millipore-H2O waschen und im Kathodenpuffer äquilibrieren. - Einlegen der zurechtgeschnittenen PVDF-Membran (Immun-Blot PVDF Membran, Bio-Rad) für 30 sec in Methanol (100%ig, Roth), Waschen mit Millipore-H2O und für 5 min in Anodenpuffer II äquilibrieren. - Zwei Filterpapiere mit Anodenpuffer I befeuchten und auf die Anode legen. - Ein Filterpapier mit Anodenpuffer II und auf die anderen Filterpapiere legen. - Membran auf die Filterpapiere legen und das Gel auf die Membran. - Drei Filterpapiere mit Kathodenpuffer befeuchten und auf das Gel legen. - Aufsetzen des Kathodendeckels und Blot für 45 min, 1,5 mA/cm2 und Raumtemperatur (PowerPac 300, Bio-Rad). Nach Ablauf der 45 min wurde die Blottingapparatur auseinander genommen und die Membran für den anschließenden Immunonachweis des „His6-getaggten“ Proteins wie unter Kap. E 6.7.2 beschrieben durchgeführt.
6.8 Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) Im Verlauf der Arbeit wurde ein ELISA-Verfahren (Schnelltest für „His6-getaggte“ Enzyme) zur spezifischen Detektion der rekombinanten Glykosyltransferasen in Chromatographiefraktionen (Q-Sepharose, IMAC, GF) entwickelt, da die strenge Substratlimitierung es nicht erlaubte Chromatographiefraktionen auf Enzymaktivität zu untersuchen. Der etablierte ELISA-Test ermöglicht einen schnellen und einfachen Nachweis der „His6-getaggten“ Proteine in einem 96-Well-Format und ist aufgrund des höheren Durchsatzes für einen derartigen Nachweis besser geeignet, als Immunoblottingverfahren. Die im Rahmen der Arbeit durchgeführten ELISA-Tests wurde ausschließlich qualitativ eingesetzt, um die rekombinanten Enzyme nachzuweisen. 6.8.1 ELISA-Verfahren zur Detektion der Glykosyltransferasen ELISA-Protokoll zur Detektion der „His6-getaggten“ Glykosyltransferasen - Beladen der Mikrotiterplatte mit je 100 µl Probe pro Napf (Immuno-Module MaxiSorb F16, Nunc) und Abkleben der Platte mit selbst haftender Folie (Roth). - Inkubation der Mikrotiterplatte über Nacht bei 4°C, bzw. für 2 h im Brutschrank bei
37°C (Memmert).
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E MATERIAL UND METHODEN - Ausschlagen der Platte zur Entfernung der Probe und Waschen der Näpfe mit TBS- Tween-Puffer (300 µl pro Napf, 3 × 30 s mit Spülen durch die Mehrkanalpipette). TBS-Tween-Waschpuffer: 10 mM Tris/HCl; pH 7,2 (Roth) 150 mM NaCl (Roth) 0,1% Tween 20 (v/v) (Roth) - Inkubation der Näpfe mit je 300 µl TBS-Blockierungspuffer pro Napf zur Absättigung noch freier Bindungsstellen (1 h, 37°C, 120 Upm, Infors Schüttler HT, Infors). TBS-Blockierungspuffer: 10 mM Tris/HCl; pH 7,2 (Roth) 150 mM NaCl (Roth) 1% (w/v) Blockierungsreagenz (Roche Diagnostics) - Waschen der Näpfe mit TBS-Tween-Waschpuffer (300 µl pro Napf, 3 × 30 s mit Spülen durch die Mehrkanalpipette) (Puffer siehe oben). - Beladen der Näpfe mit je 100 µl Antikörperlösung zur Detektion des „His6-getaggten“
Proteins. Antikörperlösung: 10 mM Tris/HCl; pH 7,2 (Roth) 150 mM NaCl (Roth) 1% (w/v) Blockierungsreagenz (Roche Diagnostics) 100 mU/ml Anti-His6-Peroxidase Konjugat (Roche Diagnostics) - Inkubation der Mikrotiterplatte für 1 h im Brutschrank bei 37°C (Memmert). - Waschen der Wells mit TBS-Tween-Waschpuffer (300 µl pro Well, 3 × 30 s mit Spülen durch die Mehrkanalpipette) (Puffer siehe oben). - Inkubation der Wells mit je 100 µl OPD-Substratlösung (DakoCytomation) pro Well für 1 – 15 min. - Abstoppen der Reaktion durch Zugabe von 100 µl H2SO4 (0,5 M) (Roth). - Messung der Absorption bei 490 nm im Mikrotiterplatten-Photometer (SpektraMax- Plus, Molecular Devices) Die Herstellung der Reagenzien erfolgte, soweit nicht näher erläutert, nach Herstellerangabe.
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F ANHANG
F Anhang
1 Verwendete Chemikalien Amersham Biosciences Europe GmbH Q-Sepharose Fast Flow, Superdex 200 Prep Grade Bio-Rad Laboratories GmbH, München: Criterion™ Tris-HCl Fertigele (1mm, 12,5%iges Trenngel, 18ner Kamm), Laemmli-Probenpuffer ohne 2-Mercaptoethanol, Bio-Safe™ Coomassie, Immun-Blot PVDF Membran, All blue prestained Precision Plus Protein™ Molekulargewichtsstandard, Prestained Precision Protein™ Molekulargewichtsstandard Calbiochem-Novabiochem GmbH (Novagen), Schwalbach/Ts. Benzonase©-Nuklease (90 %ig) DEGUSSA. , Düsseldorf: PEG4000, PEG6000
DakoCytomation GmbH, Hamburg OPD (Orthophenylenediamine) Tabletten für ELISA Difco Laboratories, Detroit, Michigan, U.S.A.: Agar, Fleischextrakt, Hefeextrakt, ISP-2, Pepton, Trypton Fermentas GmbH, St. Leon-Rot 6× LoadingDye Probenpuffer für die Agarose-Gelelektrophorese ICN Biomedicals GmbH, Eschwege: Glyzerin 99,9%ig Invitrogen GmbH, Karlsruhe: NuPAGE® Novex 10% Bis-Tris Gele (1 mm, 10ner Kamm), NuPAGE® Novex 4-12% Bis-Tris Gele (1 mm, 10ner Kamm), NuPAGE® MES-SDS Puffer (20×), NuPAGE® MOPS-SDS Puffer (20×), NuPAGE® Antioxidant, NuPAGE® Transferpuffer (20×), NuPAGE® LDS Probenpuffer (4×), NuPAGE® Sample reducing agent (10×), SimplyBlue™SafeStain Macherey-Nagel, Düren: DC-Fertigplatten RP18 W/UV254, 0,25 mm Kieselgel C18-Fluoreszenz-Indikator UV254 (10 × 20 cm bzw. 5 × 20 cm), Protino® Ni 1000 Kit zur Proteinaufreinigung
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F ANHANG Merk KGaA, Darmstadt: Amidoschwarz, Ammoniumacetat, Ammoniummolybdat · 4 H2O, ε-Aminohexansäure, Borsäure, Calciumchlorid . 2H2O, Eisen(III)-chlorid · 6 H2O, Eisen(II)-sulfat · 7 H2O, Dikaliumhydrogenphosphat, Kaliumdihydrogenphosphat, Kaliumnitrat, Kupfer(II)-chlorid · 2 H2O, Magnesiumsulfat · 7 H2O, Maltose, Mangan(II)-chlorid · 4 H2O, Mangansulfat · H2O, Mononatriumglutamat, Natriumtetraborat · 10 H2O, Orthophosphorsäure (85 %ig), Rifampicin, Zink(II)-chlorid Millipore GmbH, Schwalbach/Ts.: YM 10 Microcon-Ultrafiltrationsmodule Nunc GmbH und Co. KG, Wiesbaden Immuno-Module MaxiSorb™ F16 Mikrotiterplatten, Kryoröhrchen mit 1,8 ml Volumen Oxoid, Basingstoke, UK: Trypton-Soybean-Broth (TSB) Fertigmedium Qiagen GmbH, Hilden: Ni-NTA Spin Kit, Ni-NTA Spin Columns, Ni-NTA Superflow Gelmaterial Roche Diagnostics, Mannheim: Anti-His6-Peroxidase Konjugat, DAB-Substrat, Lysozym Roth GmbH + Co, Karlsruhe: Acetonitril, Agarose (NEEO), Borax, BSA, Dimethylsulfoxid p.a., Ethanol (96 %ig), Ethidiumbromid-Lösung (1 %ig), Essigsäure (99 %ig), HEPES, IPTG, Kaliumhydroxid, Magnesiumchlorid · 6 H2O, Methanol, MOPS, Natriumchlorid, Natriumhydroxid, Phosphorsäure, Saccharose, Salzsäure konz., Schwefelsäure konz., Tris, TWEEN 20, selbst haftende Folie für ELISA-Platten SERVA Electrophoresis GmbH, Heidelberg: TBA Sigma-Aldrich Chemie GmbH, München: p-Anisaldehyd, Antifoam 289, Thiostrepton, Thymidin-5´-diphosphat (Natriumsalz), Thymidin-5´-diphosphat-Glucose (Natriumsalz), Thymidin-5´-monophosphat (Dinatriumsalz), Thymidin-5´-triphosphat (Natriumsalz), Apoferritin (Pferd), MW-GF-200 Kit zur Kalibrierung der Gelfiltration
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F ANHANG Waters GmbH, Eschborn Sep-Pak C18-Cartridge, 1 ml (1cc Vac), 100 mg Material für die Festphasenextraktion der Makrolide/Aglyka EU-Projekt GENOVA – persönliche Gaben Dr. B. Wilkinson, GlaxoSmithKline (GSK), Stevenage, England Aglyka/Makrolide: EB (402 g/mol), MEB (546 g/mol), REB (548 g/mol), Tylacton (394 g/mol), Methonolid (296 g/mol), Narbonolid (352/mol) (Massenangaben inkl. 1 Molekül H2O) EU-Projekt GENOVA – persönliche Gaben Prof. Dr. J.A. Salas, Universidad de Oviedo, Oviedo, Spanien OEB (532 g/mol) (Massenangaben inkl. 1 Molekül H2O) EU-Projekt HYGLIDE – persönliche Gaben Dr. M.C. Raynal, Aventis (HMR), Paris, Frankreich, Prof. Dr. P.F. Leadlay, Cambridge University, Cambridge, England dTDP-D-Desosamin
2 Kultivierungsmedien, Elektrophorese- und Blottingpuffer M1-Medium: (DSMZ-Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, Braunschweig) 5 g/L Pepton 3 g/L Fleischextrakt zur Sporulation von Bacillus zusätzlich: 10 mg/L MnSO4 · H2O M1-Agarmedium: (DSMZ-Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, Braunschweig) 15 g/L Agar in M1-Medium ISP-2 Agarmedium: (Fertigmedium Difco) 38 g/L ISP-2 TSB-Medium: (Fertigmedium Oxoid) 30 g/L TSB Sucrose Succinat-Medium (Minimal Medium) (Caffrey et al. 1992): 200 mM Saccharose 20 mM Dinatriumsuccinat
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F ANHANG 20 mM KH2PO4/K2HPO4 Puffer pH 6,6 5 mM Magnesiumsulfat · 7 H2O 5 mM Magnesiumchlorid · 6 H2O, 100 mM Kaliumnitrat 2 ml/L Spurenelementlösung Maltose-Glutamat-Medium (Doull und Vining 1989): 200 mL/L einer 25%igen Stammlösung Maltose 21 g/L MOPS-Puffer 0,2 g/L Magnesiumsulfat · 7 H2O 1 g/L Magnesiumchlorid · 6 H2O, 9 mg/L Eisen(II)-sulfat · 7 H2O 1 mg/L Calciumchlorid · 2H2O 1 mg/L Natriumchlorid 8,825 g/L Natriumglutamat 4,5 ml Spurenelementlösung 150 ml 0,1 M Phosphatpuffer pH 6,5 Spurenelementlösung (Hopwood et al. 1985): 40 mg/L Zink(II)-chlorid 200 mg/L Eisen(III)-chlorid · 6 H2O 10 mg/L Kupfer(II)-chlorid · 2 H2O 10 mg/L Mangan(II)-chlorid · 4 H2O 10 mg/L Natriumtetraborat · 10 H2O 10 mg/L Ammoniummolybdat · 4 H2O SDS-Glycin-Laufpuffer für Laemmli-/Criterion-Gele (Laemmli 1970) 10× Stammlösung: 30,2 g Tris 96,8 g Glycin 10 g SDS mit Millipore-H2O auf 1 L auffüllen 1× Arbeitslösung: 25 mM Tris,129 mM Glycin, 0,1% SDS Blottingpuffer nach Khyse-Andersen (Kyhse-Andersen 1984) Anodenpuffer I: 300 mM Tris, 10 % Methanol; pH 10,4 Anodenpuffer II: 25 mM Tris, 10 % Methanol; pH 10,4 Kathodenpuffer: 25 mM Tris, 40 mM ε-Aminohexansäure, 10 % Methanol; pH 9,4
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F ANHANG
3 Geräte Amersham Biosciences Europe GmbH Unterschiedliche Chromatographiesäulen der Serien XK und C, GradiFrac™ System mit HiLoadPump P-50, UV-Monitor UV-1 mit Durchflußzelle, Fraktionssammler FRAC-100, Schreiber REC 102, P1 Peristaltikpumpe, ÄKTAprime™ mit eingebauter UV-Durchflußzelle, Fraktionssammler und Software (PrimeView Kontroll- und Dokumentationssoftware) Applied Biosystems, Weiterstadt: Protein Sequencer 477 A, PTH Analyzer 120A Bandelin Electronic GmbH & Co. KG, Berlin Sonopuls HD 60 und Sonopuls HD 200 mit Spitze MS 73 Beckman Coulter GmbH, Krefeld P/ACE MDQ Carbohydrate Kapillarelektrophoresesystem, fused silica Kapillare (Innendurchmesser 75 µm, effektive Länge 50 cm, totale Länge 57 cm) Bio-Rad Laboratories GmbH, München: Criterion™ Gelkammer mit Zubehör, Netzteil PowerPac™ 300, Trans-Blot® SD Semi-Dry Transferzelle mit Zubehör CambridgeSoft Corporation, Cambridge, MA, U.S.A ChemDraw Ultra 7.0 Software Chemagen Biopolymer-Technologie AG, Baesweiler Magnetischer Separator für 1,5 ml und 2 ml Eppendorfgefäße CS - Chromatographie Service GmbH, Langerwehe: Kromasil C18 5 µ, 250 x 3 mm mit Vorsäule 10 × 3 mm Eppendorf AG, Hamburg: Mixer 5432, Thermostat 5320, Pipetten: Modell Research (10 µl, 100 µl, 1000 µl), Eppendorf-Reaktionsgefäße, Taq DNA Polymerase, Mastercycler® gradient, Pipettenspitzen Falcon, Lincoln Park, New York, U.S.A.: Falcon Tubes 15ml und 50 ml Finnigan, San Jose, Kalifornien, U.S.A.: MAT-LCQ
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F ANHANG Dionex GmbH, Idstein: Probengeber GINA 160, HPLC Pumpe Modell 480, UVD-160 S, Säulenofen, Degaser DG1310, Chromeleon Software (Client Version 4.2) Hettich GmbH & Co.KG, Tuttlingen: Rotina 35R, Mikro 22R Hewlett Packard, UK: HP1100 liquid chromatograph H + P Labortechnik GmbH, Oberschleißheim Varioklav® Autoklav IKA-Labortechnik, Staufen i. Br. Vortex®-Mischer VF2, sowie verschieden Laborschüttler, Wasserbad, Heizblöcke IMA, Frankfurt: Disintegrator S zur Nassvermahlung mit Glasperlen Infors AG, Bottmingen, Schweiz Fermenter, Typ: Techfors (Kessel: 20 L bzw. 40 L, Rührer: 3-stufiger Sechsblattscheibenrührer, Begasung: Ringrohrbegasung mit Druckluft, pH-Elektrode der Fa. Mettler Tolledo, pO2-Elektrode: Fa. Ingold), Schüttler HT, Animpfbestecke und weiteres Fermenterzubehör, Iris NT Steuerungs- und Dokumentationssoftware Invitrogen GmbH, Karlsruhe: XCell SureLock™ Mini-Cell mit XCell II™ Blot Module für Tankblotting, PowerEase® 500 Netzteil Kendro Laboratory Products GmbH, Langenselbold Zentrifuge Sorvall® RC-5B mit Rotoren GS3, GSA, SS-34 Knick Elektronische Messgeräte GmbH & Co. KG, Berlin Mikroprozessor-pH-Meter, Typ 763 KSG Sterilisatoren GmbH, Olching: Tischautoklav KSG 25-2-3 Memmert GmbH & Co. KG, Schwabach: Brutschrank Typ U30
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F ANHANG Microsoft Deutschland GmbH, Unterschleißheim Office XP, deutsch Molecular Devices, Menlo Park, Kalifornien, U.S.A.: SpektraMax® Plus384 Hochdurchsatz-Mikroplatten-Spektralphotometer, Multiplate Reader Thermomax, SoftMax 4.0 Software Phenomenex, Macclesfield, UK: 5 µ Prodigy ODS3-HPLC Säule (4,5 x 250 mm) Retsch, Haan: Schwingmühle Typ MM 2000 Rische + Herfurth GmbH, Hamburg Polystar 100 GE-GS Folienschweißgerät Roth GmbH & Co. KG, Karlsruhe Rotilabo®-Abdeckfolien, Rotilabo -Mikrotest-Platten mit F- oder U-Profil®
Sartorius AG, Göttingen: Waage MC 1 laboratory LC 6200 D, Filter 0,22 µm, Celluloseacetat-/Polyethersulfon-Membran Schott Glas, Mainz pH-Messgerät Seitz Enzinger Noll Maschinenbau AG, Mannheim Kammerfilter "Merkur" Typ EF 45/65 CW Seitz Filterwerke GmbH, Bad Kreuznach Filter, Typ Seitz K-250 zur Ernte der Streptomyceten durch Tiefenfiltration Shimadzu Europa GmbH, Duisburg: Spektrophotometer UV-1602 Systat Software GmbH, Erkrath Sigma Plot Software, Version 8.0.2 (Demo) mit Enzymkinetikmodul Version 1.10 (Demo) Systec GmbH, Wettenberg: Tischautoklav Systec 2540 EL
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F ANHANG UniEquip Laborgerätebau & Vertriebs GmbH, München SpeedVac Univapo 150H, Unicryo MC2L mit Vakuumpumpe Vivascience GmbH, Göttingen VivaSpin 20 und VivaCell 250 Ultrafiltrationsmodul mit 10 kDa cut.off Membran Watson-Marlow GmbH, Rommerskirchen Schlauchpumpen, verschiedene Modelle W.H. Mahl Reinraumtechnik, Kaarst Sterilbank
4 Abkürzungen und Symbole ADP Adenosin-5´-diphosphat AGT Teicoplanin-Aglykon AGV Vancomycin-Aglykon Bp DNA Basenpaare BSA Bovine Serum Albumin bzgl. bezüglich bzw. beziehungsweise c Konzentration ca. zirka CDP Cytidin-5‘-diphosphat CE capillary electrophoresis (Kapillarelektrophorese) 6-dEB 6-Desoxyerythronolid B 6-DOH 6-Desoxyhexosen ∆G° freie Energie d Tag DAB Diaminobenzidin DC Dünnschichtchromatographie DEBS 6-Desoxyerythronolid B Synthase DES dTDP-D-Desosamin DMSO Dimethylsulfoxid DnmU Epimerase aus Streptomyces peucetius DOEB 5-β-Desosaminyl-3-α-olivosylerythronolid B DREB 5-β-Desosaminyl-3-α-rhamnosylerythronolid B dTMP 2´-Desoxythymidin-5´-monophosphat dTDP 2´-Desoxythymidin-5´-diphosphat dTDP-Glc 2´-Desoxythymidin-5´-diphosphat-α-D-Glucose dTTP 2´-Desoxythymidin-5´-triphosphat
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F ANHANG E Extinktion EB Erythronolid B E. coli Escherichia coli ELISA Enzyme Linked ImmunoSorbent Assay EMS Enzym-Modul-System EPS Encapsular polysaccharides EryA bis D Erythromycin A bis D EryCIII Desosaminyltransferase aus Saccharopolyspora erythraea EryBV Mycarosyltransferase aus Saccharopolyspora erythraea ff fast flow g Gramm GDP Guanosin-5´-diphosphat GF Gelfiltration GT Glykosyltransferase h Stunde HCl Salzsäure HEPES N-(2-Hydroxyethy)-piperazin-N´-(2-ethansulfonsäure) HPLC high performance liquid chromatography HMR Hoechst-Marion-Roussel IMAC Immobilisierte Metallionen-Affinitätschromatographie IPTG Isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside IUPAC International Union of Pure and Aplied Chemistry IVG „in vitro glycorandomization“ Strategie K.A. Keine Angaben Kap. Kapitel kDa Kilodalton KCl Kaliumchlorid KH2PO4 Kaliumdihydrogenphosphat KOH Kaliumhydroxid L Liter LacNAc N-Acetyllactosamin MEB 3-α-Mycarosylerythronolid B Meth Methynolide MgCl2 Magnesiumchlorid min Minute ml Milliliter NB Narbonolid NBM Narbomycin MW Molekulargewicht NaCl Natriumchlorid NaOH Natriumhydroxid
-166-
F ANHANG NDP Nukleosid-5´-diphosphat Ni2+-NTA Nickel2+-Nitrilotriacetoessigsäure NTP Nukleosid-5´-triphosphat OEB 3-α-Olivosylerythronolid B OleG2 Olivosyltransferase aus Streptomyces antibioticus OPD 1,2-Phenylenediamindihydrochlorid PEG Polyethylenglykol R Korrelationskoeffizient REB 3-α-Rhamnosylerythronolid B Rf-Wert Retentionsfaktor RT Raumtemperatur s Sekunde Sacc. erythraea Saccharopolyspora erythraea SDS Sodiumdodecylsulfat SDS-PAGE Sodiumdodecylsulfat Polyacrylamid-Gelelektrophorese SuSy 1 Saccharose Synthase 1 t Zeit TBA Tetra-N-butylammoniumhydrogensulfat TBS Tris buffered saline TED Tris(carboxymethyl)-ethylendiamin Tris Tris(hydroxymethyl)-aminomethan TSB Trypthon soybean broth TylMII Mycaminosyltransferase aus Streptomyces fradiae Tyl Tylacton U Unit(s) UDP Uridin-5´-diphosphat UV Bereich des ultravioletten Lichts v Testvolumen V Ansatzvolumen z.B. zum Beispiel
-167-
F ANHANG
5 Stämme DSMZ-Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, Braunschweig Kocuria rhizophila ATCC 9341, DSM-Nr. 348 (Bis 2003 bei der DSMZ als Micrococcus luteus geführt.) EU-Projekt GENOVA – persönliche Gaben Prof. Dr. P.F. Leadlay/Dr. S. Gaisser, Cambridge University, Cambridge, England Saccharopolyspora erythraea pEXCIII (eryCIII Gen), Saccharopolyspora erythraea pEXBV (eryBV Gen), Saccharopolyspora erythraea pSGOleG2 (oleG2 Gen), Saccharopolyspora erythraea pSGTylMII (TylMII Gen), alle Proteine tragen einen C-terminalen His6-tag EU-Projekt HYGLIDE – persönliche Gaben Prof. Dr. J.A. Salas, Universidad de Oviedo, Oviedo, Spanien Streptomyces albus OleG2 (oleG2 Gen), kein Affinitätstag EU-Projekt HYGLIDE – persönliche Gaben Dr. M.C. Raynal, Aventis (HMR), Paris, Frankreich Streptomyces lividans EryCIII (eryCIII Gen), kein Affinitätstag
6 Vektorkarten
pSG1428.4 kb
oripUC
eryRHS
PactI
PactIII
tsr
bla
actII-ORF4
eryBV AflII
Bgl IINde I
Xba I
BamH I
BamH I
Nco I
Nco I
EcoR I
EcoR I Eco R I
pSG1428.4 kb
oripUC
eryRHS
PactI
PactIII
tsr
bla
actII-ORF4
eryBV AflII
Bgl IINde I
Xba I
BamH I
BamH I
Nco I
Nco I
EcoR I
EcoR I Eco R I
Abb. X: Vektor pSG142 zur Transformation von Saccharopolyspora erythraea (Gaisser et al. 2000).
-168-
F ANHANG
7 ESI-MS-Spektren der in vitro Transferansätze
7.1 ESI-MS-Spektrum von Erythromycin D
TS01#278 RT: 6.59 AV: 1 NL: 2.46E8T: + c ESI Full m s [ 150.00-1800.00]
200 400 600 800 1000 1200 1400 1600 1800m /z
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
Rel
ativ
e Ab
unda
nce
704.1
1430.4
560.2726.4686.2542.2 1445.0158.0 406.3 845.6 1061.5 1760.71409.5
MH+
M2Na+
DesosaminH+
Abb. 74: ESI-MS-Spektrum von Erythromycin D (EryD). 7.2 ESI-MS-Spektrum von Mycarosyl-Erythronolid B
TS01#563 RT: 13.22 AV: 1 NL: 5.94E8T: + c ESI Full ms [ 150.00-1800.00]
200 400 600 800 1000 1200 1400 1600 1800m/z
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
Rel
ativ
e A
bund
ance
1115.3
1117.2569.3
1110.2529.0 1130.9367.2 592.9 1503.4850.9 1638.6
M2Na+
MNa +
Abb. 75: ESI-MS-Spektrum von Mycarosyl-EB (MEB).
-169-
F ANHANG 7.3 ESI-MS-Spektrum von Desosaminyl-rhamnosyl-Erythronolid B
Ts04#168 RT: 4.11 AV: 1 NL: 1.48E8F: + c ESI Full m s [ 150.00-1800.00]
200 400 600 800 1000 1200 1400 1600 1800m /z
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
Rel
ativ
e A
bund
ance
706.2
1433.3
1411.11436.3542.3 728.5158.1 367.5 1330.81067.1 1611.2892.1
MH+
M2Na+
DesosaminH+
Abb. 76: ESI-MS-Spektrum von Desosaminyl-rhamnosyl-EB (DREB). 7.4 ESI-MS-Spektrum von Rhamnosyl-Erythronolid B
Ts04#252 RT: 6.02 AV: 1 NL: 1.78E8T: + c ESI Full m s [ 150.00-1800.00]
200 400 600 800 1000 1200 1400 1600 1800m /z
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
Rel
ativ
e Ab
unda
nce
1119.3
1114.2 1120.3
531.0
367.1 1078.9 1249.3571.3 842.5251.1 1538.6 1673.4
M2Na+
[M-H2O]H+
Abb. 77: ESI-MS-Spektrum von Rhamnosyl-EB (REB).
-170-
F ANHANG 7.5 ESI-MS-Spektrum von Desosaminyl-olivosyl-Erythronolid B
olivosylEB+des#281-314 RT: 8.49-9.14 AV: 34 NL: 3.97E8T: + c ESI Full m s [ 100.00-1600.00]
200 400 600 800 1000 1200 1400 1600m /z
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
Rel
ativ
e Ab
unda
nce
690.1
1401.3
1402.3
560.2 692.1672.1 1417.0713.4524.1158.1 1379.1384.9 842.2 1221.01110.7
MH+
M2Na+
DesosaminH+
Abb. 78: ESI-MS-Spektrum von Desosaminyl-olivosyl-EB (DOEB). 7.6 ESI-MS-Spektrum von Olivosyl-Erythronolid B
olivos ylEB+des #372-396 RT: 10.48-10.96 AV: 25 NL: 2.74E8T: + c ESI Full m s [ 100.00-1600.00]
200 400 600 800 1000 1200 1400 1600m /z
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
Rel
ativ
e A
bund
ance
1087.2
1088.2
515.0
1082.1 1217.2555.3385.0349.1 1219.21047.1871.2690.2 1368.9 1576.8
M2Na+
[M-H2O]H+
Abb. 79: ESI-MS-Spektrum von Olivosyl-EB (OEB).
-171-
F ANHANG 7.7 ESI-MS-Spektrum von Narbomycin
C3RE+narb#576 RT: 15.45 AV: 1 NL: 2.38E7F: + c ESI Full ms [ 100.00-1600.00]
100 200 300 400 500 600 700 800 900 1000m/z
0
10
510.3
511.2
20
30
40
50
60
70
80
90
100
Rel
ativ
e A
bund
ance
747.5
533.3158.1 773.5 104421.4377.3 737.5608.4 926.0239.0 823.1465.6 971.9293.5 558.1
MH+
DesosaminH+
Abb. 80: ESI-MS-Spektrum von Narbomycin (Desosaminyl-Narbonolid) (NBM).
8 HPLC-Chromatogramme der in vitro Transferansätze
8.1 HPLC-Chromatogramm des Transferansatzes mit EryCIII, dTDP-D-Desosamin und Mycarosyl-Erythronolid B
\\Weis \Exca libur LC Q D ata \...\Ts 01 30 /03/01 14 :17:51
RT : 0 .00 - 2 9 .9 8
0 5 1 0 1 5 2 0 2 5T im e (m in )
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
10 0
Rel
ativ
e A
bund
ance
1 3 .2 2
6 .6 2
2 .3 3
1 4 .0 58 .76 9 .1 65 .5 2 1 6 .0 1 1 9 .2 81 .5 0 2 2 .8 5 2 6 .0 4 2 7 .2 1
NL :1 .3 4 E 9T IC M S T S 0 1
MEB Ery D
Abb. 81: HPLC-Chromatogramm des Transferansatzes mit EryCIII, dTDP-D-Desosamin und Mycarosyl-EB (MEB).
-172-
F ANHANG 8.2 HPLC-Chromatogramm des Transferansatzes mit EryCIII,
dTDP-D-Desosamin und Rhamnosyl-Erythronolid B \\W e is \Exca libu r L C Q D a ta \...\Ts 04 30 /0 3 /0 1 16 :08 :06
RT : 0 .0 0 - 2 9 .9 9
0 5 1 0 1 5 2 0 2 5T im e (m in )
0
1 0
2 0
3 0
4 0
5 0
6 0
7 0
8 0
9 0
1 0 0
Rel
ativ
e A
bund
ance
5 .9 1
3 .9 6
6 .5 2
6 .9 42 .3 3
8 .6 69 .4 5 2 7 .1 41 3 .8 8 1 6 .8 1 2 0 .8 9 2 4 .6 1
NL :9 .8 7 E 8T IC F: + c E S I Fu l l m s [ 1 5 0 .0 0 -1 8 0 0 .0 0 ] M S T s0 4
REB
DREB
Abb. 82: HPLC-Chromatogramm des Transferansatzes mit EryCIII, dTDP-D-Desosamin und Rhamnosyl-EB (REB). 8.3 HPLC-Chromatogramm des Transferansatzes mit EryCIII,
dTDP-D-Desosamin und Olivosyl-Erythronolid B olivos ylEB+des 18/08/01 21:26:12
RT: 0.00 - 25.00
0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24Time (min)
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
Rel
ativ
e Ab
unda
nce
8.62
10.70
13.8924.6611.52 19.1815.402.25 16.073.29 7.72 23.186.321.25
NL:1.70E9TIC MS olivosylEB+des
DOEB
OEB
Abb. 83: HPLC-Chromatogramm des Transferansatzes mit EryCIII, dTDP-D-Desosamin und Olivosyl-EB (OEB).
-173-
F ANHANG 8.4 HPLC-Chromatogramme des Transferansatzes mit EryCIII,
dTDP-D-Desosamin und Narbonolid
Abb. 84a: HPLC-Chromatogramm des Transferansatzes mit EryCIII, dTDP-D-Desosamin und Narbonolid (NAB) (Teil 1).
n
Abb. 84bund Narbo
Narbomyci
: HPLC-Chromatogramm des Transferansatzes mit EryCIII, dTDP-D-Desosamin nolid (NB) (Teil 2).
-174-
F ANHANG
9 Kalibrierungen
9.1 Kalibrierungsgeraden für die Proteingbestimmungen nach Bradford
y = 6,0218xR = 0,9953
0
0,1
0,2
0,3
0,4
0,5
0,6
0,7
0 0,02 0,04 0,06 0,08 0,1 0,12
cBSA [mg/ml]
Abs
orpt
ion
bei 5
95 n
m
Abb. 85: Kalibrierungsgerade für die Proteingehaltsbestimmung nach Bradford (1976). Als Eichprotein diente BSA (Fraktion V, Roth) in Konzentrationen von 0 bis 0,1 mg/ml. Alle Bestimmungen wurden als Dreifachbestimmung ausgeführt. Die Messungen erfolgten in 1 ml Küvetten.
y = 4,6861xR = 0,9986
0
0,05
0,1
0,15
0,2
0,25
0,3
0,35
0,4
0 0,02 0,04 0,06 0,08 0,1cBSA [mg/ml]
Abs
orpt
ion
bei 5
95 n
m
Abb. 86: Kalibrierungsgerade für die Proteingehaltsbestimmung nach Bradford (1976). Als Eichprotein diente BSA (Fraktion V, Roth) in Konzentrationen von 0 bis 0,08 mg/ml. Alle Bestimmungen wurden als Dreifachbestimmung ausgeführt. Die Messungen erfolgten in Mikrotiterplatten.
-175-
F ANHANG 9.2 HPLC-Kalibrierungsgeraden für die Quantifizierung von Nukleotiden und dTDP-Glucose 9.2.1 Beispielchromatogramm für die HPLC-Trennung von Nukleotiden und nukleotid-aktivierten Zuckern
-50
100
200
300
400
550
0,0 2,5 5,0 7,5 10,0 12,5 15,0 17,5 20,0 22,5 25,0 27,5 30,0 32,5 35,0
mAU
min
T-Sachen #4 T 1mM UV_VIS_1
1 - dTMP - 6,579
2 - dTDP-Glc - 11,858
3 - dTDP - 12,633
4 - dTTP - 19,828
5 - 20,9816 - 32,133
WVL:254 nm
Flow: 1,000 ml/min
%B: 0,0 %
40,0
100,0
0,0
%C: 0,0 %
%D: 0,0 %
Abb. 87: Beispielchromatogramm für die HPLC-Trennung von dTMP, dTDP-Glucose, dTDP und dTTP (Konzentration 1 mM). Die Flussrate betrug 1 ml/min und das Einspritzvolumen 20 µl. Die Detektion erfolgte bei 254 nm. 9.2.2 Kalibrierungsgerade für die Quantifizierung von dTDP-Glucose
0
50
100
150
200
250
0,00 0,50 1,00 1,50 2,00 2,50
dTDP-Glc External UV_VIS_1Area [mAU*min]
R =0,998
Abb. 88: Kalibrierungsgerade für Quantifizierung von dTDP-Glucose (Sigma) im Konzentrationsbereich von 0 bis 2 mM.
-176-
F ANHANG 9.2.3 Kalibrierungsgerade für die Quantifizierung von dTMP
0
50
100
150
200
250
300
0,00 0,50 1,00 1,50 2,00 2,50
dTMP External UV_VIS_1Area [mAU*min]
R =0,998
Abb. 89: Kalibrierungsgerade für Quantifizierung von dTMP (Sigma) im Konzentrationsbereich von 0 bis 2 mM. 9.2.4 Kalibrierungsgerade für die Quantifizierung von dTDP
0
25
50
75
100
125
150
175
220
0,00 0,50 1,00 1,50 2,00 2,50
dTDP External UV_VIS_1Area [mAU*min]
R =0,998
Abb. 90: Kalibrierungsgerade für Quantifizierung von dTDP (Sigma) im Konzentrationsbereich von 0 bis 2 mM.
-177-
F ANHANG 9.3 CE-Kalibrierungsgeraden für die Quantifizierung von Nukleotiden und dTDP-Glucose 9.3.1 Beispielelektropherogramm für die Trennung von Nukleotiden und Nukleotidzuckern durch Kapillarelektrophorese (CE)
dTDP-D-DesosamindTDP
dTMP
dTDP-D-DesosamindTDP
dTMP
Abb. 91: Beispielelektropherogramm einer Trennung von dTDP-D-Desosamin, dTMP und dTDP durch Kapillarelektrophorese (CE). 9.3.2 Kalibrierungsgeraden für die Quantifizierung von Thymidin, dTMP, dTDP und dTDP-Glucose durch Kapillarelektrophorese (CE)
y = 44874xR = 0,9961
y = 67965xR = 0,9982
y = 63036xR = 0,9982
y = 52147xR = 0,9992
0
20000
40000
60000
80000
100000
120000
140000
160000
0 0,5 1 1,5 2 2
Konzentration der jeweiligen Verbindung [mM]
Fläc
he [A
U]
,5
Thymidin dTMP dTDP dTDP-GlcLinear (Thymidin) Linear (dTMP) Linear (dTDP) Linear (dTDP-Glc)
Abb. 92: Beispiel Kalibrierungsgeraden für die Quantifizierung von Thymidin, dTMP, dTDP und dTDP-Glucose (alle Sigma) im Konzentrationsbereich von 0 bis 2 mM.
-178-
F ANHANG 9.4 Regressionsanalyse zur Ermittlung der relativen Molmassen von
Proteinen anhand von SDS-PAGE
y = -0,9245x + 5,1157R = 0,99
4,3
4,4
4,5
4,6
4,7
4,8
4,9
5
5,1
0 0,2 0,4 0,6 0,8 1
Rf-Wert
logM
W
Abb. 93: Exemplarische Auswertung eines Immunoblots bzw. SDS-PAGE Gels zur Berechnung der relativen Molmassen anhand des „All blue prestained Precision Plus Protein“ Molekulargewichtsstandards der Firma Bio-Rad. Bei der Auswertung wurden die Molekulargewichte der 100 kDa, 75 kDa, 50 kDa, 37 kDa und 25 kDa Proteine des Standards berücksichtigt. Die Trennung erfolgte auf einem Fertiggel der Firma Invitrogen (NuPAGE-System) (Kap. E 6.7.1).
-179-
F ANHANG 9.5 Regressionsanalyse zur Ermittlung des nativen Molekulargewichts
von Proteinen durch Gelfiltration
y = -3,2177x + 6,2687R = 0,9961
4
4,2
4,4
4,6
4,8
5
5,2
5,4
5,6
5,8
0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6
Kav-Wert
log M
W
0,7
Abb. 94: Auswertung der Kalibrierung der Gelfiltration an Superdex G200 (Amersham Biosciences). Eichproteine: Apoferritin, Alkohol-Dehydrogenase, BSA, Carbonic-Anhydrase, Cytochrom C, alle Sigma. Als Chromatographiepuffer wurde ein 50 mM NaH2PO4-Puffer, pH 8 mit 300 mM NaCl und 5 mM MgCl2 eingesetzt.
-180-
F ANHANG
10 ELISA
10.1 ELISA-Platte eines immunchemischen Nachweises von EryCIII in verschiedenen Chromatographiefraktionen
C
Abbunab(Roc
11 11.1
E
M
E
M
AbbResuProbDeso30°C
Q-Sepharose 6 FF
. 95: Exemplarische Abbildung eineshängigen Q-Sepharose- und IMAC-Frhe).
DC- und Stechagarpla DC-Platte zum Nachweis
nach Präzipitation (PEG4
RE MEB RP
ryD
EB
RE MEB RP
ryD
EB
. 96: DC des Aktivitätstests für EryCspendierung (Ausschnitt). RE: Rohexe des resuspendierten Proteinpellets.samin, 1 mM MEB, 300 µl Probe bz durchgeführt. Als Puffer diente 50 mM
IMA
Platten- Blankqualitativen ELISA-Nachweises von EryCIII in aktionen durch ein Anti-His6-Peroxidase-Konjugat
tten
der enzymatischen Aktivität von EryCIII 000) und Resuspendierung
III nach Fällung mit PEG4000 und anschließender traktprobe, MEB: Mycarosyl-EB (Standard), RP: Der Aktivitätstest wurde mit 2 mM dTDP-D-w. Kontrolle und 5 U alkalische Phosphatase bei Tris/HCl, pH 7,5 mit 5 mM MgCl2.
-181-
F ANHANG 11.2 Stechagarplattentest zum Nachweis der enzymatischen Aktivität von EryCIII nach Präzipitation (PEG4000) und Resuspendierung
MEB
EryA
RE RP
MEB
EryA
RE RP
Abb. 97: Hemmhofplatte zum Nachweis der antibiotischen Aktivität einzelner Fraktionen einer Aufreinigung von EryCIII aus Sacc. erythraea. RE: Rohextraktprobe, RP: Probe des resuspendierten Proteinpellets, MEB: Mycarosyl-EB (Standard) [1 mM], EryA: Erythromycin A (Standard) [1 mM].
-182-
F ANHANG 11.3 DC zum Nachweis der direkten Korrelation zwischen dTDP- Freisetzung und Makrolidbildung bei der enzymatischen Reaktion von EryCIII
Mit Enzym Kontrolle ohne Enzym
MEB
EryD
MEBMEB 0 30 60 180 300 300 180 60 30 0
Mit Enzym Kontrolle ohne Enzym
MEB
EryD
MEBMEB 0 30 60 180 300 300 180 60 30 0
Abb. 98: Nachweis der direkten Korrelation zwischen dTDP-Freisetzung und Makrolidbildung durch DC anhand einer Zeit-Umsatz-Kurve für EryCIII (Ausschnitt). MEB: Mycarosyl-EB, EryD: Erythromycin D, 0 – 300: Zeitpunkte der Probennahme in min. Ansatz: 2,5 mM dTDP-D-Desosamin, 0,25 mM MEB, 100 mM NaH2PO4/10 mM Tris/HCl, pH 8, 5 mM MgCl2, 30°C und 0,2 mg EryCIII aus einer IMAC-Fraktion.
-183-
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Lebenslauf P ersönliche Daten
Thomas Schumacher *20.12.1970 in Wesel
verheiratet, 1 Kind
S
chule und Wehrdienst
07/1977 – 06/1981 Grundschule am Quadenweg, Wesel 07/1981 – 06/1987 Realschule Wesel-Mitte; Realschulabschluss mit Qualifikation 07/1987 – 05/1990 Andreas-Vesalius-Gymnasium; Abitur 10/1990 – 9/1991 Grundwehrdienst S
tudium
10/1991 – 03/1992 Diplomstudium Biologie an der Johann Wolfgang Goethe- Universität Frankfurt am Main 04/1992 – 03/1999 Diplomstudium Biologie an der Heinrich-Heine-Universität Düsseldorf; Studienschwerpunkte: Mikrobiologie,
Biochemie, Enzym- und Biotechnologie Diplomarbeit am Institut für Enzymtechnologie der
Heinrich-Heine-Universität Düsseldorf, Prof. Kula Thema: „Expression, Isolierung und Charakterisierung eines rekombinanten, humanen β1-4Galactosyltransferase- Fusionsproteins aus Escherichia coli“ 04/1999 – 08/2002 Beginn der Doktorarbeit am Institut für Enzymtechnologie der Heinrich-Heine-Universität 09/2002 – 12/2004 Fortsetzung und Abschluss der Doktorarbeit im Lehr- und Forschungsgebiet Biomaterialien, RWTH Aachen, Prof. Elling Dissertation: „Expression, Reinigung und Charakterisierung von Makrolid-Glykosyltransferasen für die Synthese neuartiger Makrolid-Antibiotika“ Tag der mündlichen Doktorprüfung: 24.02.2005