PRÁCTICA N°4

EXTRACCIÓN DE ÁCIDO DESOXIRRIBONUCLEICO

UNIVERSIDAD PRIVADA SAN JUAN BAUTISTAFacultad de Ciencias de la Salud

Escuela de Medicina HumanaCurso : Biología Molecular y Celular

Ciclo I semestre 2015-II

Cromosomas

• Estructuras de varias formas y tamaños formada por nucleoproteínas.

• Nucleoproteínas – combinación de ácido nucléico y proteínas (histonas)

• Formada por una ó dos cromátidas (hermanas), unidas por un centrómero (DNA no está contraído).

Base molecular de la herencia

• Genes: son unidades hereditarias que se transmiten de una generación a otra, estos contienen información codificada para la característica.

Ácido Nucléico

• Polímero de nucleótidos.– RNA– DNA

• Molécula larga filamentosa, estable y con capacidad de autorreplicación.

Nucleótidos

• Unidad estructural básica de DNA y RNA.

• Contiene:– Grupo fosfato - unido al

azúcar por enlace fosfodiéster.

– Azúcar – Pentosa (5 C).• DNA – Desoxiribosa• RNA – Ribosa

– Base nitrogenada – • Purinas: (Adenina y Guanina)

• Pirimidinas:– Citocina– Timina=DNA– Uracilo=RNA

Base Nitrogenada

• Purinas: (A, G)– Formadas por dos

anillos• Pirimidinas: (T, C, U)

– Formadas por un anillo básico que contiene dos moléculas de nitrógeno.

Base Nitrogenada

• Se unen entre si mediante puentes de hidrógeno (¿su función?)• Sólo una purina con una pirimidina, produciendo una doble hélice

simétrica.– Adenina = Timina (DNA)– Adenina = Uracilo (RNA)– Guanina = Citocina

Estructura de DNA

Otras propiedades del DNA

• Las hélices son antiparalelas 5’→→→→3’ 3’←←←←5’

• Medidas– Distancia entre bases nitrogenada –3.4 A°– Diámetro de la hélice – 20 A°– Vuelta de espiral (10 bases nitrogenadas)– 34 A°

Otras propiedades del DNA

• Regla de Apareamiento de Chargaff– Dice que las bases nitrogenadas se aparean de tal manera que el

número total de purinas es igual al número total de pirimidinas. Sin embargo, la cantidad de A+T no es necesariamente igual a la cantidad de C+G.

A+G / C+T = 1 (Purinas) (Pirimidinas)

Ej. 5’ AAATTTCGGCGT 3’ 3’ TTTAAAGCCGCA 5’

7 + 5 / 5 + 7 = 1 A+T= 14 C+G= 10

A.Extracción de ADN: El ADN en las células eucariotas se encuentra en el núcleo disperso y muy replegado unido a proteínas para formar la cromatina. Para extraerlo se requiere homogenizar la muestra para proceder al lisado de membranas , la liberación de ADN el retiro de proteínas asociadas a dicha macromolécula y su posterior obtención bajo la forma de fibras . 1. Colocar en el mortero la muestra ( 3 fresas sin

hojas y/o plátano 3 cm/ ) e incorporar 2 ml de NaCl 0.9% triturar por 1 minuto.

2. Añadir 10ml de la solución de lisis y seguir triturando hasta obtener una masa homogénea y semilíquida (aprox. 5minutos).Solucion de lisis : (EDTA,SDS,NACL)

EDTA : ACIDO ETILENDIAMINTETRACETICO (AGENTE QUELANTE)Atrapa los iones magnesio presentes en el medio para evitar la accion de enzimas que degradan al ADN.SDS: (DODECIL SULFATO DE SODIO ) (DETERGENTE ANIONICO)Solubiliza proteinas y membranas.NACL: (Sal) Solubiliza el ADN

3. Incluir a la preparación 2ml de acetato de sodio, mezclar, para luego dejar reposar por 5 minutos.

Acetato de sodio : (sal) Precipita el ADN

Cuando el detergente entra en contacto con la célula, captura los lípidos y las proteínas.

4..Filtrar la preparación en un tubo de 16x150 con la ayuda de un embudo cubierto con gasa. 5. Transvasar 5-8ml d el filtrado a un beaker pequeño e incorporar 2 volúmenes de etanol frio por las paredes e introducir rápidamente una bagueta delgada y girar sobre su mismo eje a fin para recuperar el ADN bajo la forma de fibras y colocarla en un tubo 16x150mm conteniendo 1 ml de solución salina citratada para su resuspención y uso en la parte experimental B.

6. Obtener más fibra de ADN para reconocer el carácter ácido, para ello dejar caer en las hebras el colorante básico como el azul de metileno,

B. Identificación de Pentosas (reacción de Bial) Las pentosas en solución ácida se deshidratan dando furfural que al reaccionar con el orcinol en presencia de FeCl3, dan un producto de condensación de color verde-azulado

Las pentosas y hexosas (tanto aldosas como cetosas) en presencia deácidos minerales (p.ej., ácido sulfúrico) y a temperaturas elevadas sufren procesos de deshidratación originando furfural(derivadosde pentosas)o hidroximetilfurfural (derivados de hexosas), tal y como se indica en la Fig.1.

Colocar 1 ml de ADN en un tubo 16x150 y en otro tubo de 16x150 colocar 1 ml agua destilada. Agregar 3 ml de Reactivo de Bial a cada tubo; calentar cuidadosamente cada tubo en la llama de un mechero hasta que la solución comience a hervir. Obsérvese y anótese el color que aparece en cada tubo de ensayo.