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1. Tema: Métodos de extracción, aislamiento, purificación e inmovilización enzimáticos

2. Objetivo

Conocer técnicas para la extracción, aislamiento, purificación e inmovilización

enzimáticos.

Aprender de los fundamentos de cada técnica de extracción, aislamiento,

purificación e inmovilización enzimáticos.

3. Justificación

El uso de enzimas en la biotecnología tiene posibilidades ilimitadas, por tal razón la

extracción y uso correcto de las enzimas ayuda a aumentar la velocidad de las reacciones y

la eficiencia energética de las mismas.

4. Marco Teórico

4.1 Extracción Enzimática

La extracción enzimática se basa en medios físicos y medios químicos.

4.1.1 Los Medios Físicos De Extracción Enzimática

4.1.1.1 Sonicación

En esta técnica se utiliza la energía del sonido generalmente se realiza con ultrasonido que

son frecuencias mayores a 20 kHz. La aplicación de ultrasonido en líquidos produce el

fenómenos llamado cavitación produciendo zonas de compresión y rerefacción. Las

burbujas producidas en las cavidades comprimidas poseen presiones de miles de atmósferas

formando ondas de choque que producen la ruptura de las células. En la sonicación se

utiliza osciladores ultrasónicos son los cuales se obtuvieron resultados exitosos siendo

utilizado en paredes celulares bacterianas y en los protozoos Infusoria y Elodea.

Provocando una disrupción selectiva (Wiseman, 1991).

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Fig1: Método de sonicación

Fig2: Aparato de sonicación

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4.1.1.2 Congelación y descongelación

La congelación y descongelación provoca un valor menor al 10% de liberación de proteínas

solubles. Esta técnica se utiliza generalmente con otros métodos ya que las pastas

bacterianas son guardadas a – 20°C antes de la extracción y purificación de las enzimas. La

congelación y descongelación puede dar lugar a una pérdida de la actividad enzimática.

Requiere de periodos prolongados de tiempo (hasta 36 horas) para el congelamiento y

descongelamiento. El líquido al  congelarse a -56° C forma cristales muy finos que rompen

la célula cuando esta se descongela rápidamente a 37°C (Wiseman, 1991).

Fig3: Bombona de almacenaje de nitrógeno líquido

4.1.1.3 Trituración y agitación con abrasivos

Para la trituración se puede utilizar un molino para conseguir la disrupción de las bacterias

per requiere dos horas de funcionamiento. Para esta técnica también se puede utilizar

agitación con perlas de vidrio las cuales son de 0,13 a 0,26 mm, a una velocidad de 300 a

500 sacudidas por minuto. Se emplea la  prensa francesa, consiste en el paso de las células

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a gran presión por un pequeño orificio a una cámara con presión baja, lo cual ocasiona la

ruptura de las células por descompresión. La filtración al pasar las células a través de

orificios a presión de diámetros reducidos que provocan la rotura de las membranas

celulares (Wiseman, 1991).

Fig4: Prensa francesa

Fig5: Método de presión

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4.1.2 Los Medios Químicos De Extracción Enzimática

Los medios químicos son: álcalis, lizosima y EDTA, detergentes, y shock osmótico.

4.1.2.1 Alcalis

El tratamiento para álcalis se utiliza por ejemplo en paredes de plantas, hongos y bacterias,

mientras mayor sea el grado de hidrólisis más enzima será liberada de la membrana. El

éxito del tratamiento depende de la estabilidad de la enzima a pH elevado. También se ha

indicado que este método sirve para inactivar proteasas lo que reduce el nivel de

contaminación ( Wiseman,1991).

4.1.2.2 Lizosima y EDTA

La lisozima es una enzima que se obtiene a partir de la clara de huevo de la gallina. Las

bacterias Gram positivas mucopéptido alrededor de la membrana son más suceptibles a la

lisozima que la Gram negativa. La ruptura final de la envoltura celular depende de la

presión osmótica del medio en suspensión una vez rota la pared celular. En las bacterias

Gram negativas a parte de la lisozima se debe añadir EDTA para producir la liberación de

lipopolisacáridos de la envoltura de la pared. Se ha indicado que el EDTA actua como

agente quelante uniéndose a cationes divalentes esenciales en la pared lo que hace que la

lisozima pueda acceder (Wiseman, 1991).

4.1.2.3 Detergentes

Los detergentes pueden ser compuestos iónicos como el lauril sulfato o no iónicos como el

Tween. En condiciones de fuerza iónica baja y pH apropiado los detergentes se combinan

con lipoproteínas formando micelas. Por tal razón los compuestos lipoproteícos de las

membranas biológicas se pueden solubilizar o hacer permeables. Los detergentes iónicos

son más reactivos que los no iónicos, ocasionando en muchos casos desnaturalización,

precipitación e hidrólisis de proteínas, por tal razón estos detergentes no son los indicados

para la extracción de enzimas (Wiseman, 1991).

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4.1.2.4 Shock Osmótico

El shock osmótico es utilizado para la extracción de enzimas hidrolíticas y proteínas

ligadoras a partir de bacterias Gram negativas. Las células se hacen estallar al someterlas  a

un medio hipotónico, lo cual hace que la membrana no resista la presión osmótica. El

método incluye el lavado de las bacterias con una solución tamponada para liberarlas del

medio de cultivo y posteriormente se introduce en sacarosa el 20% en donde se deja que las

células alcancen el equilibrio y pierdan su agua interna que se elimina de la suspensión por

centrifugación. La pasta de células obtenida se coloca en agua a 4 °C. El repentino aumento

de la presión osmótica del interior de las células hace que exploten liberando constituyentes

celulares entre estos algunas enzimas ( Wiseman,1991)..

4.1.3 Protocolo de Extracción de Enzimas

Se tomó ocho muestras al azar que luego se mezclaron para tener una muestra

representativa. Posteriormente, se guardaron en bolsas plásticas en cava a 8°C hasta el

momento de su uso. Se secó la muestra parcialmente en una estufa de convección forzada a

48°C por 48 h. La muestra se redujo a un tamaño de partícula de 1 mm. La proteína soluble

presente en los extractos y en los sobrenadantes de la precipitación se determinó por el

método de Lowry modificado, en un espectrofotómetro UV-Visible Cary 50 (Mulgrave,

Victoria, Australia) a la longitud de onda de 742 nm y utilizando albúmina de suero de

bovino como proteína estándar(Urribarri,2004 ) .

Se utilizó como agente extractante hidróxido de calcio. Las extracciones se realizaron por

triplicado en Erlenmeyers de 250 mL con 5 g de materia seca en un baño de maría con

agitación constante (100 rpm). Posteriormente, se filtró al vacío empleando una tela

sintética y los sólidos se lavaron con 10 mL de agua destilada. Al extracto y lavado se les

midió el pH. Los extractos se guardaron a 4°C por 24 h. Luego se sometieron a

centrifugación (10000 rpm) por 30 min en una centrífuga Centra NTMP4R, separando así

la fibra y la proteína verde presente en el extracto proteico. En éste se recuperó la proteína

blanca o citoplásmica. Se determinó proteína soluble a los extractos por el método de

Lowry modificado. Posteriormente se calculó el rendimiento de extracción como el

cociente entre los gramos de proteína soluble en el extracto y la proteína cruda inicial

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expresado como porcentaje. Se realizaron extracciones a pH 10 de la solución de hidróxido

de calcio, 60°C, relación sólido – líquido 1:10 en tiempos de 5, 10, 20 y 30 min. Se

realizaron las extracciones a valores de pH de la solución extractante de hidróxido de calcio

de 10, 11, 12 y 12,60 (solución saturada), a 60°C, relación sólido – líquido 1:10 y tiempo

de extracción óptimo determinado en la experiencia anterior. Se efectuaron extracciones a

temperaturas de 30, 45, 60, 75 y 90°C y relaciones sólido – líquido 1:10 y 1:15 (factorial 5

x 2), utilizando el pH óptimo de la solución de hidróxido de calcio y el tiempo óptimo de

extracción. Se evaluó el rendimiento de extracción de proteínas en cada una de las

condiciones planteadas y se seleccionaron como óptimas aquellas condiciones donde se

obtuvo mayor rendimiento (Uriibarri, 2004).

4.2 Aislamiento y Purificación Enzimática

4.2.1 Métodos Basados En Diferencias De Solubilidad

Las enzimas que se encuentran disueltas muestran cambios significativos de solubilidad en

función del pH, fuerza iónica, propiedades dieléctricas del disolvente, la temperatura,

concentración de solutos como por ejemplo sales. Las enzimas precipitan en

concentraciones altas de las sales. Para realizar esto se basan en la precipitación fraccionada

con concentraciones crecientes. Las sales más usadas son el sulfato amónico y el sulfato

magnésico (Primo, 1995).

4.2.2 Precipitación Con Solventes Orgánicos

Los solventes orgánicos polares como el etanol o la acetona permiten la precipitación de

enzimas. El principal efecto es la disminución de la asociación del agua con las enzimas. El

efecto es la disminución de la solubilidad de las enzimas logrando que estas precipiten

(Calvo, 2003).

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4.2.3 Cromatografía De Intercambio Iónico

Generalmente hay tres tipos de intercambiadores de iones las resinas, las celulosas y los

geles de agarosa y dextrano intercambiadores de iones. Las resinas cambiadores de iones

son polímeros insolubles en agua que contienen grupos catiónicos o aniónicos. Las resinas

tienen ventaja de ser estables a los esfuerzos mecánicos, además tienen una gran capacidad

de adsorber proteínas que sedimentan rápidamente. Las celulosa cambiadoras de iones

tienen la propiedad que dentro de ellas puede introducirse gran variedad de grupos cargados

que pueden ser catiónicos o aniónicos. El nivel de sustitución de estás es muy bajo y la

capacidad de las celulosas es la decima parte de la capacidad de las resinas. En esta técnica

se utiliza una columna rellana de un polímero sintético que contiene grupos catiónicos y

grupos aniónicos. Al colocar la solución en la columna los diferentes tipos de enzimas

serán detenidos en la columna por tener una carga opuesta a la de la matriz. En la

cromatografía sobre columnas de intercambio iónico las enzimas se fijan en la parte de

arriba y son eluidas con tampones de pH y aumento de las concentraciones. Aquí se utiliza

normalmente dietilaminoetilcelulosa y carboximetilcelulosa (Primo, 1995; Medina, 2005).

Fig6: Esquema de método de cromatografía de intercambio iónico

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4.2.4 Cromatografía De Filtración En Gel

La cromatografía de filtración en gel emplea matrices formadas por esferas porosas.

Cuando ingresa en la columna la solución que contienen las enzimas las moléculas de

menor o igual tamaño que el de los poros son retenidas a lo largo de la columna, mientras

que las moléculas de mayor tamaño no penetran en los poros y por lo tanto se desplazan

con el flujo que atraviesa la columna. El proceso de cromatografía en gel consiste en el

reparto de las moléculas de soluto entre la fase móvil de solvente y la fase estacionaria

constituido por espacios existentes entre las partículas porosas del gel. La fase móvil es el

líquido que circula por el exterior de las partículas de gel y se conoce como volumen vacío

mientras que la fase estacionaria es el líquido que ocupa el interior de las partículas de gel.

El soluto se distribuye por difusión entre la fase estacionaria y la móvil. (Caballero, et al

2008)

Fig7: Esquema de método de cromatografía de filtración en gel

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4.2.5 Cromatografía de Afinidad

La cromatografía de afinidad se basa en la interacción más o menos específica entre una

proteína y un ligando. El ligando puede ser: específico o inespecífico. El ligando específico

puede ser un anticuerpo, un sustrato, un sustrato análogo o un inhibidor. El ligando

inespecífico es el que reacciona con varias proteínas y puede ser especifico para diferentes

clases de enzimas como 5’AMP ADP o NAD o puede interaccionar con un amplio rango de

proteínas. La reacción dede ser reversible y se puede emplear varios eluyentes para retirar

una proteína de un ligando de afinidad. La matriz a la que el ligando se debe unir debe

poseer las siguientes características: baja reactividad, buenas velocidades de flujo, grupos

químicos modificables y abundantes, deben ser estables mecánicamente y químicamente,

deben ser porosos y formar rede hidrofílicas (Wiseman, 1991).

Fig8: Esquema de método de cromatografía de afinidad

4.2.6 Cromatografía De Interacción Hidrofóbica

La cromatografía de interacción hidrofóbica (HIC) es una de las principales técnicas

utilizadas para la separación y purificación de enzimas en procesos biotecnológicos. Esta

técnica fue desarrollada a partir de la observación de que algunas proteínas eran retenidas

inesperadamente en geles de afinidad que tenían moléculas hidrofobias. En HIC, las

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proteínas se unen reversiblemente a ligandos hidrofóbicos que se encuentran inmovilizados

en el soporte cromatográfico, debido a la presencia de una elevada concentración de sal. La

elución se logra disminuyendo la fuerza iónica en la fase móvil, formando un gradiente

decreciente (Mahn, 2009).

4.2.7 Electroforesis

La electroforesis es una técnica que ayuda a separar biomoléculas con una carga neta a

través de un campo eléctrico. La migración depende de la forma, tamaño, carga y

composición química. Existen diversos tipos de electroforesis cuya diferencia radica en los

diversos tipos de soporte y estos pueden ser: geles de celulosa usados para aminoácidos y

carbohidratos, los geles de acrilamida y agarosa son utilizados para DNA, RNA y proteínas.

La concentración de la poliacrilamida puede variar de acuerdo el tamaño de las de la

molécula a separar por ejemplo 7,5% de poliacrilamida para separar proteínas de mediano

en cambio si se utiliza un concentración del 2,5% sirve para separar moléculas de peso

molecular alto. Para proteínas se utiliza geles en condiciones nativas para que las proteínas

mantengan su conformación y geles desnaturalizantes a los que se agrega un detergente

como el dodecil sulfato de sodio (SDS) y un agente reductor como el 2-mercaptoetanol

ocasionando que la proteína pierda su estructura secundaria, terciaria y cuaternaria

produciendo un polipéptido lineal (Segal, 2005).

Fig9: Esquema de un aparato de electroforesis

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4.2.8 Protocolo de Precipitación de las Proteínas.

Se realizaron tratamientos termoquímicos por triplicado. Se tomaron alícuotas de 20 mL

del extracto resultante de la mejor condición de extracción (mayor rendimiento de

extracción obtenido) en vasos de precipitado y se ajustó el pH a 4 o 4,5 (puntos

isoeléctricos de la proteína foliar) con ácido clorhídrico 1N estandarizado. Posteriormente

se introdujeron en un baño de maría a temperaturas de 50, 65 y 80°C por 30 minutos

(factorial 2 x 3) y se centrifugaron, obteniéndose un precipitado proteico que se llevó a una

estufa a 60°C por 24 h hasta secarse, y luego se le determinó proteína cruda; al

sobrenadante se le determinó proteína soluble. La proteína precipitada se determinó por

diferencia entre la proteína del extracto respectivo y la del sobrenadante. El rendimiento de

precipitación se obtuvo del cociente entre la cantidad en gramos de proteína en el

precipitado y la cantidad en gramos de proteína soluble en el extracto proteico, expresado

como porcentaje. Se pesaron 50 mg de concentrado proteico por triplicado y se llevaron a

tubos de cierre hermético para la hidrólisis de las proteínas con 20 mL de HCl 6 N. Se

desplazó el aire con nitrógeno gaseoso. Los tubos se colocaron en una estufa a 110°C por

22 h. Cumplido el tiempo de hidrólisis, se eliminó el exceso de HCl por neutralización con

20 mL de NaOH 6 N. El pH de las muestras se ajustó a 2,2 con una solución de HCl 0,05

N. Se filtró el contenido de los tubos con papel Whatman 1 y el sobrenadante se colocó en

balones volumétricos de 100 mL y se aforaron con solución de buffer citrato a pH 2,2.

Luego se filtraron con filtros Millipore de 0,2 mm de diámetro de poro. El filtrado se

conservó en congelación a –10°C hasta su uso. Las muestras y los estándares se

derivatizaron precolumna en forma automatizada, utilizando un inyector Shimadzu modelo

SIL6B. A 75 mL de la muestra (mezcla estándar de aminoácidos o hidrolizado) se le

agregaron 300 mL de solución fluorescente de Ortoftaldehido- tiol (OPT). El tiempo

programado para la inyección fue de 2 minutos, después de la derivatización. Análisis de

aminoácidos (Uriibarri, 2004).

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Los aminoácidos se determinaron por cromatografía líquida de alta resolución (HPLC)

mediante la utilización de un cromatógrafo marca Shimadzu, equipado con un detector de

fluorescencia modelo FLD 6A a una longitud de onda de 350 nm, dos bombas de alta

presión modelo LC 6A provistas de una cámara mezcladora de solventes, necesarias para

crear gradientes, y un horno modelo CTO 6A. Se inyectaron 20 mL de muestra utilizando

un inyector automático modelo SIL 6B. La columna utilizada fue tipo Altex Ultrasphere

ODS con partículas esféricas de 5 micras dediámetro y un sistema controlador SCL 6B que

gobierna las funciones del equipo. El tiempo de retención y área bajo la curva se obtuvo

mediante un integrador Chromatopac CR-4A. Se utilizaron dos sistemas de solventes, un

sistema A compuesto por buffer acetato a pH 6,6, metanol y tetrahidrofurano en

proporciones 80:19:1; un solvente B, compuesto por metanol y buffer acetato a pH 6,6, en

proporciones 80:20. Se utilizó un gradiente binario en combinaciones tanto isocráticas

como de incremento lineal del solvente B. El flujo fue constante e igual a 1,2 mL/min y la

temperatura de la columna fue de 33°C. Se usó una estándar SIGMA LAB de

concentración 50 pmol/mL como referencia para la cuantificación de los aminoácidos.

Análisis Estadístico. Los resultados de las extracciones se analizaron usando

procedimientos GLM del SAS (26). Se aplicó un análisis de varianza a cada uno de los

estudios. Se evaluó el efecto de las principales variables, y en el caso de los diseños

factoriales temperatura vs relación sólido - líquido, se evaluaron las interacciones

(Uriibarri, 2004).

4.2.9 Protocolo de Purificación de Enzimas

Las semillas fueron molidas y la harina resultante deslipidada con éter de petróleo,

tamizada a través de una malla número 60 y secada a temperatura ambiente. Se almacenó a

4°C hasta antes de su uso. Para la extracción de la fracción albúmina, se utilizó el método

de Osborne (16), con algunas modificaciones. La harina deslipidada, en una proporción 1:3

con agua desionizada y 0,1 mM de fenilmetilsulfonilfluoruro (PMSF), fue agitada por tres

horas, a 4°C, para así extraer la fracción albúmina. La mezcla fue centrifugada a 3 000 g,

por 10 minutos, y el sobrenadante liofilizado y conservado a 4°C. Unos 60 mg del extracto

de albúmina liofilizado disueltos en el buffer de corrida (Tris HCl 0,1 M pH 8,5) fueron

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aplicados a una columna de Sephadex G-75, con un flujo de 11 mL/h y a temperatura de

4°C. Los eluatos con mayor absorbancia, a 280 nm del pico 1, fueron reunidos y

liofilizados. El siguiente paso consistió en una electroelución, según lo descrito por

Harrington (17), para lo cual se tomó 250 mg del liofilizado del pico 1 y se los sometió a

electroforesis preparativa en gel de acrilamida (Villanueva, sf).

4.3 Inmovilización Enzimática

Una vez obtenidas las enzimas para abaratar costos se puede inmovilizar las enzimas en

soportes sólidos que permita la reutilización de estas en procesos industriales. La

inmovilización consiste en fijar o atrapar la enzima en material insoluble que puede ser gel

membrana, perlas de vidrio etc. La inmovilización puede realizarse por métodos físicos

como la adsorción de la enzima sobre un soporte insoluble la retención o atrapado de la

enzima en un gel poroso que permita el paso del sustrato y evite la pérdida de la enzima

(Castillo, et al, 2005).

4.3.1 Técnica de Inmovilización de Enzimas

4.3.1.1 Unión a un soporte

Son los métodos de inmovilización más utilizados y de los que se dispone de una mayor

información. La elección del soporte y del tipo de enlace resultan determinantes en el

comportamiento posterior del biocatalizador. Se debe procurar que la inmovilización

incremente la afinidad por el sustrato, disminuya la inhibición, amplie el intervalo de pH

óptimo y reduzca las posibles contaminaciones microbianas. Además el soporte debe tener

resistencia mecánica adecuada a las condiciones de operación del reactor y ser fácilmente

separable del medio líquido para que pueda ser reutilizado. Se han utilizado una gran

variedad de materiales como soportes para la inmovilización de numerosas enzimas. La

inmovilización artificial de enzimas se puede subclasificar en función del modo de unión

físico del enzima en inmovilización por adsorción física iónica, quelación o unión metálica

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covalente. En cualquiera de estos métodos la selección de soporte insoluble así como el

método de unión tienen una importancia máxima (Arroyo, sf).

a) Adsorción Física

Este método se basa en la adsorción física de las moléculas de enzima en la superficie de

una matriz sólida poniendo en contacto la solución acuosa del enzima con el soporte

mediante una de las siguientes técnicas: procedimiento estático, electrodeposición, proceso

en reactor, baño con agitación. El método baño de agitación en el más usado en laboratorios

y es en la que el soporte se coloca en la solución de la enzima y se mezcla mediante

agitación continua en un baño vibratorio de agua con el que se obtiene una deposición

uniforme de enzima. El método más utilizado en los procesos comerciales es el reactor en

el que el soporte se carga en el reactor empleado, y el enzima se añade al reactor y se

recircula o agita dentro de él (Arroyo, sf).

b) Unión covalente

La unión covalente de una enzima a un soporte es quizá el método de inmovilización más

interesante desde el punto de vista industrial. La metodología de la unión covalente se basa

en la activación de grupos químicos del soporte para que reaccionen con nucleófilos de las

proteínas. De entre los 20 aminoácidos diferentes que se encuentran en la estructura de las

enzimas, los más empleados para la formación de enlaces con el soporte son principalmente

la lisina, la cisteína, la tirosina y la histidina, y en menor medida la metionina, el triptófano,

la arginina y el ácido aspártico y glutámico. Las ventajas de este método son: manipulación

sencilla, carga constante, una mayor resistencia a la desactivación por efecto de la

temperatura, disolventes orgánicos, pH (Arroyo, sf).

4.3.1.2 Atrapado

Este método de inmovilización dentro de la red espacial de una matriz se basa en la

localización de la enzima dentro de la red espacial de una matriz poilmérica o de una

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membrana de forma que se evite la liberación de la proteína. Es método puede aplicarse

para el atrapado de cualquier tipo de enzimas, células microbianas y orgánulos de diferentes

tamaños (Wiseman, 1991).

a)Atrapado en geles

Este método de atrapado en geles se basa en la localización de las enzimas dentro de los

espacio intersiciales de geles poliméricos. El método para la formación del gel consiste en

polimerizar acrilamida en una solución acuosa del enzima insoluble con un agente de

entrecruzamiento (Wiseman, 1991).

b)Microencapsulado

El microencapsulado de enzimas consiste en atrapar al enzima en membranas poliméricas

semipermeables esféricas. Las enzimas inmovilizadas de esta fprma están contenidos

físicamente dentro de la membrana y las moléculas de producto y substrato deben difundir

a través de ella libremente siempre que sus tamaños sean los suficientemente pequeñas

(Wiseman, 1991).

c) Entrecruzamiento

Este método se basa en la formación de enlaces covalentes entre las moléculas de enzima

mediante reactivos bi o multifuncionales que dan lugar a la formación de agregados

tridimensionales entrecruzados totalmente insolubles en agua pero que no necesitan el uso

de soportes adicionales. Este método necesita la adición de un cantidad apropiada de agente

entrecruzante a la solución del enzima en condiciones tales que se obtengan múltiples

enlaces covalentes (Wiseman, 1991).

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Fig11: Esquema de los métodos de inmovilización enzimática

4.3.2 Protocolo de Inmovilización Enzimática

a) Selección del soporte para la inmovilización

Debido a que no existe un soporte universal para la inmovilización de una enzima, éste

tiene que ser seleccionado con base en algunas de sus características, como tipo de enzima

a inmovilizar y proceso en que se desea usar. Aquí se describe la utilización de Bakerbond

Glutaraldehído-P como ejemplo de soporte inorgánico y del poliestireno-divinilbenceno

(PS/DVB) (al 2.0 % de divinilbenceno, con una malla de 200 a 400, Polisciences, Inc.)

como ejemplo de matriz orgánica insoluble en agua. Éste último fue modificado por

incorporación del péptido glicilglicilglicina o triglicina (PS/DVB- 3G) funcionalizando así

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la matriz original con grupos carboxilo. El soporte funcionalizado se activó con 1,1´-

carbonildiimidazol (CDI, SIGMA). Para esto se agregaron 4 meq (0.646 g) del activador

CDI disueltos en 5 mL de acetona por cada gramo de resina funcionalizada a activar. La

reacción se llevó a cabo durante 2:30 h a 40 °C en un rotavapor (marca Heidolph WB

2000), concluido el tiempo de reacción, el soporte activado se lavó con acetona.

b) Selección de una proteína reportera

Para estimar algunos parámetros que permitieran establecer las condiciones iniciales para la

inmovilización de la peroxidasa de chayote (POCh), se utilizó como proteína reportera a la

meta-mioglobina (m-Mb), con propiedades espectroscópicas y catalíticas conocidas y de

bajo costo, capaz de iniciar con ésta la factibilidad de la inmovilización de enzimas

peroxidasas en ambos soportes. Para la obtención de la m-Mb, se partió de mioglobina,

extraída a partir de carne de res y posteriormente, mediante la adición de ferricianuro de

potasio fue llevada a su forma meta (Bylkas y Andersson 1997).

c) Estimación de los parámetros para la inmovilización de m-Mb

Para estimar algunos parámetros iniciales como velocidad de agitación (V, rpm), tiempo de

reacción de inmovilización (t, h), temperatura (T, oC), cantidad de soporte (mg), volumen

del reactor (Vr) y volumen de la solución de la proteína reportera, para la inmovilización

de la POCh, se llevaron a cabo diferentes experimentos por triplicado utilizando m-Mb,

inicialmente en el soporte comercial Bakerbond Glutaraldehído-P (BBG-P) en reactores

de teflón colocados en un matraz de bola de 100 ml y en un rotavapor. Para determinar la

concentración adecuada de m-Mb se registraron los espectros de absorción ultravioleta-

visible (UV-VIS) (espectrofotómetro UV-VIS-NIR, Shimadzu UV-31000S) a diferentes

diluciones de ésta con amortiguador de fosfato de sodio 100 mM, pH 7.0. También, fueron

probados diferentes reactores en forma y volumen considerando que iban a ser sometidos a

agitación y calentamiento a distintas temperaturas, además, que las cantidades de soporte y

de proteína reportera no fueran muy grandes. La cantidad del soporte BBG-P fue variada

desde 50 a 100 mg. Para estimar los valores de los parámetros de V, T y t, se fijaron dos de

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ellos y se varió el tercero. Concluido cada experimento (3 reactores), el sobrenadante se

separó cuidadosamente del soporte y cada uno se trató de manera independiente. Al

sobrenadante se le realizó su espectro UV-VIS, mientras que el soporte se lavó con una

solución de NaCl 2M para eliminar la m-Mb que no fue inmovilizada. Al sobrenadante y al

soporte con la m-Mb inmovilizada se les realizó el ensayo de actividad tipo peroxidasas

diseñado para hemoglobinas (Everse et al. 1994). Posteriormente, se graficó el parámetro

determinado contra la concentración de la m-Mb en el sobrenadante después de la reacción

de inmovilización. El valor elegido para el parámetro en estudio fue aquel donde la

concentración de m-Mb en el sobrenadante fue menor El experimento de inmovilización de

la m-Mb en BBGP fue realizado con los mejores parámetros seleccionados en su conjunto.

Se estimó el porcentaje de inmovilización a partir de la absorbancia a 409 nm de m-Mb

antes y después del proceso de inmovilización. A la m-Mb inmovilizada se le aplicó la

prueba de actividad tipo peroxidasa como se mencionó anteriormente.

d) Inmovilización de una peroxidasa patrón y la peroxidasa de chayote

Bajo las condiciones utilizadas para la inmovilización de m-Mb en el soporte BBG-P, se

procedió a inmovilizar a la peroxidasa de rábano blanco o rábano picante (Horseradish,

HRP) (ya que esta peroxidasa se usa a nivel industrial y se ha estudiado con más detalle,

tomándose como referencia o patrón para el estudio de peroxidasas obtenidas de nuevas

fuentes) y la peroxidasa de chayote (POCh). Sin embargo, debido a los bajos rendimientos

y a la liberación de sustancias coloridas en el proceso de inmovilización se decidió

descartar este soporte y concentrar el estudio en el soporte PS/DVB-3G activado. La

metodología implementada se transfirió al nuevo soporte y se obtuvieron mejores

resultados bajo las condiciones ya determinadas. Se realizaron pruebas de actividad

enzimática para peroxidasas al soporte PS/DVB-3G sin activar y activado. A continuación

se procedió a inmovilizar en éste a la peroxidasa patrón y la POCh, las cuales presentaron

un índice de pureza o R.Z. (A403nm/A280nm) de 1.0 (SIGMA) y 0.77 (Villegas-Rosas

1993), respectivamente. Se utilizó una masa de 100 mg del soporte al cual se les añadieron

800 μL de solución de enzima (A403nm:~0.8). La HRP y POCh inmovilizadas (HRP-PS/

20

DVB-3G y POCh-PS/DVB-3G, respectivamente), se lavaron con NaCl 2M hasta que la

solución de lavado no presentó actividad de peroxidasa y a las enzimas inmovilizadas se les

realizó el ensayo de actividad para peroxidasas (Villegas, 2003).

5. Conclusiones

Los métodos de extracción físicos de enzimas son útiles en el laboratorio pero pierden

dicha utilidad al ser utilizados a gran escala ya sea por el tamaño de los equipos, aumento

del tiempo, por esta razón la extracción por medios químicos es más eficaz.

Los métodos de purificación y aislamiento más utilizados a gran escala son por ejemplo la

precipitación con solventes orgánicos mientras que la técnica de cromatografía aunque es

muy útil y exacta en laboratorio a gran escala se necesitaría equipos muchos más grandes y

mucho más tiempo e inversión

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