extracción y cuantificación de adn. tecnología básica extracción y cuantificación...
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Extracción y Cuantificación de ADN
Extracción y Cuantificación de ADN
Tecnología Básica
Extracción y Cuantificación
Amplificación: PCR (Polymerase Chain Reaction)
Separación: Electroforesis
Detección
Análisis
Extracción de ADN: Múltiples maneras!!
EXTRACCION DE ADNEXTRACCION DE ADN
ORGANICA CHELEX PAPEL FTA OTRAS
Extracciones basadas en estuches QIAamp, GeneClean, etc.
Pueden depender en Protocolos de LAB Tipo de muestra
ORGANICA CHELEX PAPEL FTA OTRAS
Extracciones basadas en estuches QIAamp, GeneClean, etc.
Pueden depender en Protocolos de LAB Tipo de muestra
Preparación de MuestraPreparación de Muestra
Extracción de ADN Orgánica
Extracción por Chelex
Extracción de ADN utilizando papel FTA
Estuches QIAamp para separar ADN Equipo basados en robótica pueden
requerir otros métodos
Extracción de ADN Orgánica
Extracción por Chelex
Extracción de ADN utilizando papel FTA
Estuches QIAamp para separar ADN Equipo basados en robótica pueden
requerir otros métodos
EXTRACCION ORGANICA DE ADNEXTRACCION ORGANICA DE ADN
PHENOL / CHLOROFORM / ISOAMYL ALCOHOL (PCI)
PRODUCE ADN DE ALTO PESO MOLECULAR
CONSUME MUCHO TIEMPO QUIMICOS PELIGROSOS MULTIPLES TRANSFENCIAS (posibles
errores)
PHENOL / CHLOROFORM / ISOAMYL ALCOHOL (PCI)
PRODUCE ADN DE ALTO PESO MOLECULAR
CONSUME MUCHO TIEMPO QUIMICOS PELIGROSOS MULTIPLES TRANSFENCIAS (posibles
errores)
EXTRACCION ORGANICA DE ADN
EXTRACCION ORGANICA DE ADN
COLOCAR MUESTRA EN EL TUBO
AÑADA SDS (detergente) Y PROTEINASE K ROMPE LAS CELULAS (SDS) ROMPE LAS PROTEINAS (Proteinase K)
AÑADA FCI => Fenol “ disuelve” proteínas y lípidos Particiona macromoléculas basedo en propiedades
hidrofóbicas e hidrofílicas Cloroformo aumenta la densidad de fase del fenol Alcohol Isoamyl disminuye la espuma ADN MAS SOLUBLE => EN FASE ACUOSA
RECUPERACION DE ADN Hay que ‘limpiar’; diferentes maneras de hacer esto
COLOCAR MUESTRA EN EL TUBO
AÑADA SDS (detergente) Y PROTEINASE K ROMPE LAS CELULAS (SDS) ROMPE LAS PROTEINAS (Proteinase K)
AÑADA FCI => Fenol “ disuelve” proteínas y lípidos Particiona macromoléculas basedo en propiedades
hidrofóbicas e hidrofílicas Cloroformo aumenta la densidad de fase del fenol Alcohol Isoamyl disminuye la espuma ADN MAS SOLUBLE => EN FASE ACUOSA
RECUPERACION DE ADN Hay que ‘limpiar’; diferentes maneras de hacer esto
EXTRACCION POR CHELEX EXTRACCION POR CHELEX 1991 Laboratorios Bio-Rad
RESINA QUELANTE
REMUEVE MAGNESIO
(INACTIVA NUCLEASAS DE ADN)
ENLAZA LOS DESPERDICIOS DE LA
CELULA
UTILIZE SOLO CON PCR (cadena sencilla)
1991 Laboratorios Bio-Rad
RESINA QUELANTE
REMUEVE MAGNESIO
(INACTIVA NUCLEASAS DE ADN)
ENLAZA LOS DESPERDICIOS DE LA
CELULA
UTILIZE SOLO CON PCR (cadena sencilla)
EXTRACCION POR CHELEX EXTRACCION POR CHELEX AÑADA MUESTRA AL TUBO
AÑADA AGUA Y SOLUCION AL 5% DE
CHELEX
100°C PARA ROMPER CELULAS DESTRUIR PROTEINAS
ADN ES DENATURADO A CADENAS
SENCILLAS
UTILIZE SOBRENADANTE DIRECTAMENTE
EN PCR
AÑADA MUESTRA AL TUBO
AÑADA AGUA Y SOLUCION AL 5% DE
CHELEX
100°C PARA ROMPER CELULAS DESTRUIR PROTEINAS
ADN ES DENATURADO A CADENAS
SENCILLAS
UTILIZE SOBRENADANTE DIRECTAMENTE
EN PCR
EXTRACCION CON PAPEL FTA™
EXTRACCION CON PAPEL FTA™
PAPEL ALMACENAJE A BASE DE CELULOSA
CONTIENE QUIMICOS PREVIENE ACTIVIDAD DE NUCLEASA E
INHIBE CRECIMIENTO BACTERIANO
ESTABLE A TEMP AMBIENTE POR AÑOS
UTILIZE PARA MUESTRAS DE SANGRE O SALIVA DE VICTIMAS O SOSPECHOSOS
PAPEL ALMACENAJE A BASE DE CELULOSA
CONTIENE QUIMICOS PREVIENE ACTIVIDAD DE NUCLEASA E
INHIBE CRECIMIENTO BACTERIANO
ESTABLE A TEMP AMBIENTE POR AÑOS
UTILIZE PARA MUESTRAS DE SANGRE O SALIVA DE VICTIMAS O SOSPECHOSOS
Tecnología FTA®
Rompe células y membranas de organelos -Físicamente Atrapa Acidos Nucleicos (ADN & ARN)
Preserva y Proteje Acidos Nucleicos-Previene Daño por radicales libres/UV
-Previene Daño Enzimático
-Inhibe crecimiento de hongos y bacterias
Provee Seguridad al Usuario-Inactiva Potenciales Viruses Peligrosos
Preparación de ADN Rápida y Eficiente
FTA: Forma de Archivo Costo Efectiva FTA: Forma de Archivo Costo Efectiva
10 Platos = 240 muestras
Temp de almacenaje = -200C
240 Tarjetas = 240 muestras
Temp de almacenaje = Temp ambiente
Costo$2,000/congelador/año
Costo$75/gabinete de
archivo
240 Tubos = 240 muestras*
Temp de almacenaje= -200C
Convencional versus FTA
Archivado a Temperatura Ambiente
100 120 140 160 180 200 220 240 260 280 300 320 340 360
6 Blue Blood-B-Pro
1000200030004000
6 Green Blood-B-Pro
5001000
1500
6 Yellow Blood-B-Pro
500100015002000
6 Red Blood-B-Pro
200
400
600
Perfil de STR de sangre archivada en 1989 y analizada en 2003
• Muestras archivadas en ambientes diferentes, selladas en sobre de aluminio
• Proceso normal de colección de muestra
• 10 µL de reacciones de Profiler™ añadido a muestras, 24 ciclos
EXTRACCIÓN DE PAPEL FTA™
EXTRACCIÓN DE PAPEL FTA™
Sangre o saliva seca en papel FTA Células se ROMPEN al contacto UTILIZE “rotera” para añadir MUESTRA al
TUBO LAVE para remover HEME y otros inhibidores
de PCR
Añada “roto” DIRECTAMENTE a reacción de PCR
Sangre o saliva seca en papel FTA Células se ROMPEN al contacto UTILIZE “rotera” para añadir MUESTRA al
TUBO LAVE para remover HEME y otros inhibidores
de PCR
Añada “roto” DIRECTAMENTE a reacción de PCR
EXTRACCIÓN DE PAPEL FTA™
EXTRACCIÓN DE PAPEL FTA™
CUANTIFICACIÓN NO es necesaria Cantidad de muestra consistente Resultados consistentes
Posible AUTOMATIZACIÓN
CUANTIFICACIÓN NO es necesaria Cantidad de muestra consistente Resultados consistentes
Posible AUTOMATIZACIÓN
ORGÁNICA Papel FTA CHELEX
Mancha de
sangre
ROTO
LAVAR Múltiples veces con buffer de extracción
PREPARAR PCR
Reactivos de PCR
SDS, DTT, EDTA y
proteinase K
ENCUBAR (56 oC)
Phenol,chloroform,
isoamyl alcohol
CUANTIFICAR ADN
Aplicar sangre al papel y dejar que
se seque Mancha de
sangre
VORTEX
(NO CUANTIFICACIÓN)
Agua
ENCUBAR (ambiente)
5% Chelex
ENCUBAR (100 oC)
REMOVER sobrenadante
ENCUBAR (56 oC)
CUANTIFICAR ADN
PREPARAR PCR
PREPARAR PCR
Centrifugar
Centrifugar
Centrifugar
Centrifugar
REMOVER sobrenadanteTRANSFER aqueous (upper) phase to new tube
CONCENTRAR muestra (Centricon/Microcon-100 or ethanol
precipitation)
Centrifugar
TE buffer
Figure 3.1, J.M. Butler (2005) Forensic DNA Typing, 2nd Edition © 2005 Elsevier Academic Press
CUANTIFICACIÓN DE ADNCUANTIFICACIÓN DE ADN
ESENCIALES PARA ANÁLISIS POR PCR MUY POCO ADN CAUSA TOO DECAIMIENTO DE
ALELOS O FLUCTUACIONES ESTOCÁSTICAS DEMASIADO ADN CAUSA DATA FUERA DE ESCALA
MÉTODOS INICIALES NO MUY SENSITIVOS O ESPECÍFICOS ABSORBENCIA A 260 nm TINCIÓN CON BROMURO DE ETIDIO
Cuantificación comparada a marcador estándar
ESENCIALES PARA ANÁLISIS POR PCR MUY POCO ADN CAUSA TOO DECAIMIENTO DE
ALELOS O FLUCTUACIONES ESTOCÁSTICAS DEMASIADO ADN CAUSA DATA FUERA DE ESCALA
MÉTODOS INICIALES NO MUY SENSITIVOS O ESPECÍFICOS ABSORBENCIA A 260 nm TINCIÓN CON BROMURO DE ETIDIO
Cuantificación comparada a marcador estándar
Cuantificación por "Slot Blot" Cuantificación por "Slot Blot"
Procedimiento Común Específico para primates Ha sido modificado para utilizar
quimioluminiscencia en vez de radioactivida Puede detectar cantidades menores que
nanogramos Puede detectar ADN de cadena doble y
cadena sencilla
Procedimiento Común Específico para primates Ha sido modificado para utilizar
quimioluminiscencia en vez de radioactivida Puede detectar cantidades menores que
nanogramos Puede detectar ADN de cadena doble y
cadena sencilla
CUANTIFICACIÓN DE ADNCUANTIFICACIÓN DE ADN
CUANTIFICACIÓN POR "SLOT BLOT" ESPECÍFICO PARA ADN HUMANO O DE
PRIMATE D17Z1
RADIOACTIVO COLORIMÉTRICO QUIMIOLUMINISCENTE
CUANTIFICACIÓN POR "SLOT BLOT" ESPECÍFICO PARA ADN HUMANO O DE
PRIMATE D17Z1
RADIOACTIVO COLORIMÉTRICO QUIMIOLUMINISCENTE
CUANTIFICACIÓN DE ADNCUANTIFICACIÓN DE ADN
CAPTURAR ADN GENÓMICO EN MEMBRANA DE NILÓN
AÑADIR PRUEBA D17Z1 INTENSIDAD DE LA MUESTRA
COMPARADA A ESTÁNDARES SENSITIVA A ~ 150 pg DE ADN o 50
copias de ADN genómico
CAPTURAR ADN GENÓMICO EN MEMBRANA DE NILÓN
AÑADIR PRUEBA D17Z1 INTENSIDAD DE LA MUESTRA
COMPARADA A ESTÁNDARES SENSITIVA A ~ 150 pg DE ADN o 50
copias de ADN genómico
Slot Blot Ventajas Desventajas
Slot Blot Ventajas Desventajas
Puede ser sensitivo Reemplaza
radioactividad Puede detectar
cadenas sencillas y ADN parcialmente degradado.
Cantidad dada es sólo de ADN humano
Puede ser sensitivo Reemplaza
radioactividad Puede detectar
cadenas sencillas y ADN parcialmente degradado.
Cantidad dada es sólo de ADN humano
Consume tiempo Labor intensiva
Consume tiempo Labor intensiva
20 ng
10 ng
5 ng
2.5 ng
1.25 ng
0.63 ng20 ng
10 ng
5 ng
2.5 ng
1.25 ng
0.63 ng
Estándares de Calibración
Estándares de Calibración
Muestras Desconocidas
~2.5 ng
Figure 3.3, J.M. Butler (2005) Forensic DNA Typing, 2nd Edition © 2005 Elsevier Academic Press
Fluorometría vs Espectrofotometría
Fluorometría vs Espectrofotometría
Fluorometría
*Utilizar un fluorocrome como Hoechst 33258 o PicoGreen
-- aumento en emisión a 458 nm cuandoenlazado a ADN de doble cadena
*Tiene poca afinidad para ADN de cadena sencilla o ARN
--se enlaza al surco menor, rico en A-T
*Muestra es comparada a curva estándar de ADN cuya concentración es conocida
--utilize estándar con composición similar para lecturas más precisas
Cuantificación de ADN por espectrofotometría
Cuantificación de ADN por espectrofotometría
Concentración de ADN puede ser determinada midiendo la absorbancia a 260 nm (A260) en un espectrofotómetro utilizando una cubeta de cuarzo
Medidas tomadas a una A260 deben leer entre 0.1 y 1.0.
Una absorbancia de 1 unidad a 260 nm corresponde a 50 µg de ADN por ml
A260 = 1 ⇒ 50 µg/ml
Concentración de ADN puede ser determinada midiendo la absorbancia a 260 nm (A260) en un espectrofotómetro utilizando una cubeta de cuarzo
Medidas tomadas a una A260 deben leer entre 0.1 y 1.0.
Una absorbancia de 1 unidad a 260 nm corresponde a 50 µg de ADN por ml
A260 = 1 ⇒ 50 µg/ml
Pureza de ADN: Proporción A260/A280
*Proporción indica pureza/presencia de contaminantes que pueden absorber luz UV (proteínas, etc.)
*ADN puro tiene una proporción de ≈ 1.7-2.0 --en buffer ligeramente alcalino, pH 7.5
*Fenol absorbe a 270-275 nm (similar a ADN)--imita alta pureza y producción--aumenta el valor A260
PCR utilizando 'Real time'
(qPCR)Continuará!!Continuará!!