СОФИЙСКИ УНИВЕРСИТЕТ “СВ. КЛИМЕНТ ОХРИДСКИ”

Факултет по химия и фармация

КАТЕДРА ПРИЛОЖНА ОРГАНИЧНА ХИМИЯ

Стефка Стоянова Калоянова

СИНТЕЗ НА НОВИ ФЛУОРЕСЦЕНТНИ ЦИАНИНОВИ БАГРИЛА

ЗА МАРКИРАНЕ НА БИООБЕКТИ

AВТОРЕФЕРАТ

за присъждане на научната и образователна степен “Доктор”

направление : “Химически науки” 4.2.

(Органична химия)

Научен ръководител: проф. дхн Тодор Делигеоргиев

София

март 2012 г

Синтетичните експерименти и спектроскопските изследвания са извършени в

„Лаборатория за синтез на функционални багрила”, Факултет по химия и фармация, СУ

”Св. Климент Охридски”.

Получаването на полупродуктите, описани в Експерименталната част (раздел 1)

е извършено в микровълнов реактор (Biotage 2.5) в Лаборатория по органична химия,

Факултет по фармация, Университет в Алкала де Енарес, Мадрид, Испания.

Част от допълнителните изследвания на новите багрилни структури са

проведени в:

- “Лаборатория по биофизика”, Харковски университет, Украйна от д-р Валерия

Трусова и проф. Галина Горбенко;

- “Лаборатория за изследване взаимодействията на биомакромолекули”, Институт

Ruđer Bošković, Загреб от д-р Ivo Crnolatac и проф. Ivo Piantanida;

- “Лаборатория по имунопатология и експериментлна имунотерапия” към

Института по Микробиология, БАН от д-р Ива Иванова, доц. д-р Андрей

Чорбанов и доц. д-р Петя Димитрова.

Дисертацията е написана на 194 печатни страници и съдържа 54 схеми, 11

таблици и 50 фигури. Библиографската справка обхваща 300 литературни източника.

1

Съдържание

I. Въведение...............................................................................................................................4

II. Цели и задачи на дисертацията...........................................................................................5

III. Литературен обзор..............................................................................................................6

1. Цианинови багрила...................................................................................................6

2. Взаимодействие на малки молекули с нуклеинови киселини..............................6

2.1. Интеркалация..............................................................................................6

2.2. Свързване в малката бразда......................................................................7

3. Връзка между структурата на цианиновите багрила и модела им на свързване

с ДНК..............................................................................................................................8

IV. Резултати и дискусия..........................................................................................................9

1. Синтез на полупродукти...........................................................................................9

1.1. Получаване на хетарилтиоли (1a-1m).....................................................10

1.2. Получаване на S-метилни производни на хетарилтиоли

(2а – 2m).......................................................................................................14

1.3. Кватернизиране на хетероарилни съединения....................................15

1.3.1. Получаване на кватернерни бензазоли 3,3а-3m..................16

1.3.2. Получаване на 4-метилхинолиниеви и

4-метилпиридиниеви кватернерни соли (4а-4n).................18

1.3.3. Получаване на кватернерни пиримидиниеви соли 5а-5е...19

1.3.4. Получаване на кватернерни 2-метилбензотиа(окса)-

золиеви соли 7а-7c…….........................................................20

1.4. Получаване на 4-метилхиназолин и 4-метилцинолин......................... 21

1.4.1. Получаване на 4-метилхиназолин (6a)..................................21

1.4.2. Получаване на 4-метилцинолин (6b) …................................21

1.5. Получаване на други полупродукти 7 – 18.............................................22

1.5.1. Получаване на 1-(3-йодопропил)пиридиниев йодид(7),

N, N, N-триметил-(3-йодопропил)-амониев йодид (8) и

N,N,N-триетил-(3-йодопропил)-амониев йодид (9).........................22

1.5.2. Халогениране на 2-аминопиридини........................................23

1.5.3. Получаване на 2-заместени-4,6-диметилпиримидини

(15-18)..................................................................................23

2

2. Получаване на монометин цианинови багрила....................................................24

2.1. Получаване на бензоилирани производни на ТО (D1-D17).................25

2.1.1. Синтез на багрила D1-D17.......................................................25

2.1.2. Изследване фотофизичните характеристики нa багрила D1-

D17 в разтвори и в присъствие на ДНК............................................27

2.2. Получаване на хиназолинови багрила (Е1-Е13)...................................32

2.2.1. Синтез на изходни багрила Е1-Е3...........................................32

2.2.2. Получаване на багрила Е4-Е13................................................33

2.2.3. Изследване на фотофизичните свойства на багрила Е1-Е13 в

буферен разтвор и в присъствие на двДНК......................................34

2.3. Получаване на тиазоло- и оксазоло[4,5-b]пиридиниеви

багрила......................................................................................................38

2.3.1. Синтез на багрила А1-А16........................................................38

2.3.2. Изследване на фотофизичните свойства на багрила А1-А16 и

взаимодействието им с двДНК..........................................................39

2.4. Получаване на хлорни аналози на „Тиазолово оранжево”(С1-С8).....42

2.4.1. Синтез на багрила С1-С8...........................................................42

2.4.2. Изследване на фотофизичните свойства на багрила С1-С8

в разтвори и в присъствие на двДНК.........................................42

2.4.3. Маркиране на живи клетки с багрила С1,С3,С4,С5 и С6......44

2.5. Нов метод за получаване на монокатионни монометинцианинови

багрила N1-N16...............................................................................................44

V. Изводи................................................................................................................................50

VI. Литературни източници...................................................................................................50

VII. Списък на публикации по темата на дисертацията......................................................55

3

I. Въведение

Изследванията в почти всички области на съвременните високи технологии,

медицината и биологията са пряко свързани с развитието на аналитични техники,

базирани на флуоресценция. Флуоресцентната спектроскопия е разпространен метод за

детекция и количествено определяне на разнообразни обекти, както в класическата

аналитична химия, така и в различните направления на т. нар. „life sciences”[1]. Tя

успешно се прилага в методи за откриване на протеини или нуклеинови киселини, за

локализацията на биомолекули в живи клетки [2] и др. Наред с класическата

флуоресцентна спектроскопия съществуват и се прилагат успешно редица

биоаналитични техники, изискващи флуоресцентно белязане - PCR в реално време

[3,4], флуоресцентната in situ хибридизация (FISH) [5], флуоресцентнaта микроскопия

[6], флоуцитометрията [7] и др. При всички тези подходи задължителен елемент е

маркирането на изследваните обекти с подходящи флуорофори. Това са малки

органични молекули, които придават свойството флуоресценция на биообектите,

свързвайки се с тях ковалентно или нековалентно. Като търговски продукти са

известни и достъпни голям брой флуоресцентни маркери. Въпреки това интересът към

нови такива съединения с подобрени свойства не стихва. Ето защо паралелно с

напредъка на флуоресцентните техники и обслужващата ги апаратура, се развиват

дизайнът и синтезът на нови флуорофори.

През последните години като багрила с отлични свойства за детекция и

визуализация на биообекти се наложиха редица несиметрични и симетрични цианинови

багрила. Техните най-важни предимства са ниската им собствена флуоресценция в

свободно състояние и възможността за структурни модификации. При вариране на

хромофорната част на молекулата и на функционалните групи в заместителите, могат

да се получават разнообразни структури със специфични свойства, да сe модифицира

тяхната активност и селективност към целевите молекули. Получените съединения

могат да абсорбират и флуоресцират в различни диапазони на спектъра, което

позволява избягване или ограничаване до минимум на фоновата флуоресценция на

самите обекти и ги прави подходящи за маркиране на различни молекули.

В зависимост от конкретните приложения и методи, могат да се обобщят някои

важни изисквания за флуорогенните багрила:

- липса на собствена флуоресценция преди свързване или загуба на

4

първоначална флуоресценция в резултат на свързване с биообекта;

- висока моларна абсорбируемост;

- висок флуоресцентен квантов добив на комплекса багрило-маркиран обект;

- абсорбционен максимум в близката УВ, видимата и близката ИЧ част на

спектъра, което позволява използване на евтини и достъпни светлинни източници за

възбуждане (например диодни лазери или светодиоди)

- голямо Стоксово отместване;

- в много случаи добра разтворимост във водни разтвори;

- ниска токсичност спрямо биообектите;

- селективност;

- бързо образуване на стабилни комплекси с целевите обекти;

- фотостабилност.

Разработването на нови маркери с необходимите специфични характеристики е важен и

необходим за практиката процес, изискващ време, усилия и средства и в повечето

случаи от наличното голямо разнообразие от структури само някои отговарят на тези

основни изисквания.

II. Цели и задачи на дисертацията

Цел на настоящата дисертационна работа е синтез на нови флуорогенни

монометинови цианинови багрила за нековалентно маркиране на нуклеинови киселини,

с подобрени свойства, в сравнение с използвани в практиката производни. Във връзка с

осъществяването на тази цел си поставихме следните конкретни задачи: 1. Разработване на подходящи реакционни условия за синтез на нови

полупродукти за получаване на цианинови багрила, съдържащи

бензоиламинови, тиазоло[4,5-b] пиридиниеви и хиназолиниеви заместители.

2. Определяне на оптимални условия за получаване, изолиране и пречистване на

нови моно- и дикатионни асиметрични монометинцианинови багрила, аналози

на Тиазолово оранжево.

3. Изследване на абсорбционните характеристики (моларни екстинкционни

коефициенти и абсорбционни максимуми) на новосинтезираните багрила в

разтворители и в буферни разтвори. Определяне на абсорбционните отнасяния в

присъствие на стандартна двДНК в буферен разтвор.

4. Изследване на флуоресцентните свойства на багрилата в свободно състояние и

след свързване с двДНК в буферен разтвор.

5

III. Литературен обзор

1. Цианинови багрила

Цианиновите багрила са сред най-широко изследваните групи синтетични

багрила. Първите им приложения (50 години след тяхното откриване) са свързани със

сребърнохалогенидната фотография, където полиметинови цианинови багрила са

използвани като сенсибилизатори [9-12]. Значително по-късно представители на този

клас съединения са оценени като лазерни багрила [13,14] и фотореактивни материали в

соларните клетки [15,16]. През последните години важна роля придобиват цианиновите

багрила за детекция и визуализация на биообекти и молекули - багрене на клетъчни

органели [17, 18], маркиране на нуклеинови киселини и белтъци [19, 20, 21].

Цианинови багрила се използват като оптични сонди за определяне на мембранен

потенциал [22, 23], за онагледяване промяната на мембранния потенциал по дължината

на невроните [24], както и за визуализиране на невронни мрежи [25].

2. Взаимодействие на малки молекули с нуклеинови киселини

Централната роля на ДНК в биологичните системи я прави дългогодишна цел

при изследванията за диагностициране и лечение на различни болести. Два са

основните модела за свързване на малки молекули с нуклеиновите киселини:

- Нековалентно свързване – дължи се на слаби електростатични взаимодействия,

образуване на водородни връзки и дипол-диполни взаимодействния;

- Ковалентно свързване – между маркиращатa и целевата молекула се формира

ковалентна връзка.

При нековалентното маркиране са установени три основни типа свързване:

интеркалация, свързване в браздите на двойната спирала и повърхностно свързване

(асоцииране на багрилните молекули на повърхността на нуклеиновите киселини).

Повърхностното свързване се дължи на неспецифично електростатично привличане

между малките органични молекули и отрицателно заредената повърхност на ДНК.

Свързването в голямата бразда се наблюдава при по-големи органични молекули,

например протеини, които не са обект на настоящата дисертационна работа.

2.1. Интеркалация

Като интеркалация се означава вмъкването на малка молекула (лиганд) меджу

съседни двойки азотни бази, което най-често се наблюдава при плоски (планарни)

6

полициклични ароматни и хетероароматни структури [26]. Това свързване обикновено

се дължи на хидрофобно взаимодействие. В резултат на интеркалацията се нарушава

специфичната солватация на водните молекули около основния хромофор и за

взаимодействието и с ДНК допринасят т. нар. Кулонови ефекти на взаимодействие. За

да освободи място за вмъкващия се лиганд фосфодиестерният скелет на ДНК частично

се разплита и осигурява раздалечаване на базите от около 3-4 Å до 7-8 Å [27].

Насищане на изследваната ДНК с интеркалиращия лиганд води до значително цялостно

удължаване на спиралата, което може да се установи чрез измерване на промяната във

вискозитета или в скоростта на утаяване на разтвора на ДНК [28, 29]. С методите,

базирани на електрофореза, това разплитане на спиралната ДНК също може да се

наблюдава [30, 31].

Моделът на интеркалиране е предложен за пръв път от Lerman [32].

Интеркалаторите, състоящи се само от планарни хромофори като цяло не показват

селективност към определена последователност на азотните бази. Най-общо

демонстрират слабо предпочитание към гуанин-цитозин (G-C) нуклеотидни участъци

от веригата.

2.2. Свързване в малката бразда на ДНК

Редица синтетични и природни молекули се ориентират в браздите на ДНК, като

от тях по-обстойно са изследвани тези, които се свързват в малката бразда. Обикновено

лигандите, предпочитащи малката бразда са биологичноактивни молекули с

антибиотични или антитуморни свойства. Освен това значителен брой от тях се

използват като флуоресцентни маркери.

Повечето багрилните молекули, които се свързват в малката бразда притежават

четири структурни особености: (i) положителен заряд, (ii) извита форма, (iii) гъвкавост

на молекулата, (iv) донорна или акцепторна група, която може да участва в

образуването на Н-връзка при взаимодействие с комплементарни групи в браздата.

За разлика от интеркалаторите, такива маркери могат да предоставят частична

информация за последователността на азотните бази чрез образуване на специфични

водородни връзки (и с несдвоени бази), както и чрез измерване на вариациите в

електростатичния потенциал във Ван дер Ваалсовите взаимодействия и в

хидрофобността на разтвора на нуклеиновата киселина

Най-често в изследванията за нековалентно свързване в малката бразда на ДНК е

посочено, че багрилните молекули притежават сърповидна форма, съответстваща на

7

релефа на браздата [33]. Освен това те показват предпочитания към богати на аденин-

тимин (А-Т) участъци. Съществуват няколко факта, които доказват това:

- най-големия отрицателен електростатичен потенциал на ДНК е установен в А-Т

участъците на малката бразда, което благоприятства свързването с катионната

структура на багрилните молекули;

- богатата на А-Т малка бразда е тясна и благоприятства стабилизиращи Ван дер

Ваалсови взаимодействия. Екзоцикличната амино група в структурата на гуанина

създава стерично пречене за свързване на лиганда към G-C участъците;

- в малката бразда, богата на А-Т бази, има самостоятелни акцепторни участъци,

осигуряващи формиране на водородни връзки [34];

- ентропийният принос за афинитета към А-Т участъците е по-висок, тъй като тези

последователности съдържат мрежа от строго подредени водни молекули, които се

заместват след свързване на багрилната молекула;

- в сравнение с интеркалаторите, лигандите, свързващи се в малката бразда внасят

пренебрежимо малко напрежение в спиралата на ДНК и на практика стабилизират

основната й структура.

3. Връзка между структурата на цианиновите багрила, флуоресцентните им свойства и модела на свързване с ДНК

По правило симетричните незаместени в полиметиновата верига бензотиазолни

и бензоксазолни багрила притежават значителен собствен интензитет на

флуоресценция, като се наблюдава слабо повишаване на интензитета при свързването

им с нуклеинови киселини. Въпреки това мезо-метил-заместеното триметиново

бензотиазолно багрило Cyan 2 е било първото предложено симетрично багрило за

откриване на ДНК в гел и в разтвор [35]. Това багрило има нисък интензитет на

собствена емисия, като при свързване с ДНК интензитетът му се увеличава стократно.

Флуоресцентният квантов добив на Cyan 2 в присъствие на ДНК е около 0.33 [36].

Въвеждането на заместители в полиметиновата верига води както до намаляване

интензитета на собствената флуоресценция на несвързаното багрило, така и до

многократно увеличение на емисията му в комплекса с ДНК, в сравнение със

стойностите за незаместените му аналогични багрила.

Малки промени в структурата на основния хромофор или в последователността

на нуклеиновата киселина могат да доведат до промяна в начина на свързване [37]. В

литературата са описани подробни изследвания за взаимодействията на различни

8

несиметрични и симетрични цианинови багрила с нуклеинови киселини във връзка с

техните приложения за визуализиране и количествено определяне на ДНК и РНК [38 -

44].

Освен голямо значение за модела на взаимодействие, съотношението багрило-

ДНК е свързано и с възможностите за образуване на агрегати от различен тип. Във

водни разтвори и в присъствие на бимолекули, както и при по-високи концентрации,

цианиновите багрила формират димери или по-сложни агрегати. В сравнение с

мономерната форма на багрилото агрегатите показват значителни промени в

абсорбционните спектри [45-47]. Димеризацията на цианините във воден разтвор

обикновено е съпроводена с хипсохромно отместване на абсорбционния максимум (Н-

агрегати). При агрегати от по-висок порядък се наблюдава батохромно отместване на

основната ивица в абсорбционния спектър (J-агрегати) [48,49].

Напредъкът в различните области на природните науки през последните

десетилетия нямаше да бъде възможен без реализирането на редица важни методи за

детекция и маркиране на биомолекули, особено за ДНК и ензими. Тези методи

формират един основен набор от инструменти за оценка на резултатите от билогичните

експерименти. Въпреки че към момента се синтезират и са известни значителен брой

нови цианинови багрила за маркиране на биообекти, са необходими много

допълнителни изследвания за определяне на специфичните им характеристики и

отнасяния при различните аналитични техники. С развитието на технологиите при

светлинните източници, които са основен фактор за всички флуоресцентни методи, се

разширяват възможностите за дизайн и създаване на структури с подобрени качества и

свойства.

IV. Резултати и дискусия

1. Синтез на полупродукти

Сред основните полупродукти, необходими за синтеза на целевите багрила са

азот- и сярасъдържащи хетероцикли, за чието получаване сме избрали както утвърдени

в литературата, така и модифицирани или новоразработени от нас процедури. Във

всички случаи целяхме бързо получаване на желаните съединения с високи добиви и

чистота, свеждане до минимум на сложни процедури по изолиране и пречистване,

както и използване на алтернативни на обикновеното нагряване енергийни източници

като микровълново и ултразвуково облъчване. Освен това при синтезите, при които е

9

възможно, се стремяхме да заменим използването на токсични разтворители и реагенти

с алтернативни по-евтини, безопасни или съвместими с околната среда такива.

1.1. Получаване на хетарилтиоли (1a-1m)

В литературата са описани множество синтетични методи за получаване на 2-

меркаптобензазоли и техни производни като повечето се свеждат до нуклеофилна

заместителна реакция с последваща циклизация и могат да бъдат обобщени до две

основни процедури: (I) реакция на 2-халогеноанилини, 1,2 - фенилендиамини или 3-

хидрокси-2-аминопиридини с калиев или натриев O-етил дитиокарбонат [50,51]; (II)

реакция на 2-халоанилини, 2-аминофеноли, 2-аминотиофеноли или 1,2-

фенилендиамини с натриев хидрид и сяровъглерод [52,53]. В повечето от докладваните

процедури като разтворител се използва N,N-диметилформамид (ДМФ) [54-57], но са

използвани и други разтворители, напр. диетиленгликол моноетилов етер [58], 1-метил-

2-пиролидон, 2-метоксиетанол и метанол [59]. Известна е и процедура за получаване на

2-меркапробензимидазоли в среда без разтворител [60]. Експерименталните условия в

този случай включват сравнително дълго реакционно време (от 4 до 24 часа), високи

температури, нагряване в инертна атмосфера, и не на последно място трудоемки

процедури по изолиране на продуктите.

През последните години използването на микровълновото облъчване в

органичния синтез намери редица практически приложения. Тези приложения са доста

привлекателни поради някои основни предимства на този вид алтернативна енергия -

значително редуциране на реакционното време, опростени и лесно възпроизводими

синтетични процедури, които в повечето случаи се считат за щадящи околната среда и

често гарантират по-високи добиви на желаните продукти.

От литературата е известна само една синтетична процедура за получаване на 2-

меркаптобензотиазоли чрез микровълново облъчване [61] с микровълнов реактор, в

затворен съд и при режим на постоянна температура. Синтез на 1,3-тиазолопиридин- и

1,3-оксазолопиридин-2-тиоли от съответните 2-амино-3-халогенопиридини и 2-амино-

3-хидроксипиридини чрез микровълново облъчване не е описано в литературата.

Описаните методи, които включват използването на 2-амино-3-хидроксипиридин като

изходно съединение, включват нагряване в условия на кипене със серовъглерод в

присъствието на база или директна реакция с калиев O-етил дитиокарбонат в подходящ

разтворител [62]. Аналогична реакция, включваща участие на заместени 2-амино-3-

халогенопиридини води до получаването на 1,3-тиазолопиридин-2-тиоли.

10

Тези резултати ни насочиха към по-подробно изследване на тази нуклеофилна

заместителна реакция и последващата циклизация в условията на микровълново

облъчване. Като изходни материали използвахме заместени о-халоанилини, о-

аминофеноли, о-фенилендиамини, заместени 2-амино-3-халогенопиридини и 2-амино-

3-хидроксипиридин и калиев етилксантогенат (Схема 1) [62]. Освен това заменихме

най-често използвания като разтворител за тази реакция – ДМФ с утвърдени зелени

разтворители – глицерол и ПЕГ-400 [63, 64].

Схема 1. Получаване на хетарилтиоли при микровълново облъчване

Синтетичната процедура може да се извърши в обикновен микровълнов уред с

реакционни времена 15-20 минути (при 80-240W) или в микровълнов реактор с

насочено облъчване (Biotage Initiaor 2.5), при който в режим на постоянна мощност (30-

45W) реакционните времена са редуцирани до 3-5 минути. И в двата случая добивите

на целевите продукти са високи (72 – 92 %). По двете реакционни процедури бяха

получени полупродукти 1а-1j (Схема 2).

Cl

NH2

6

54

7

N3

2S1

SH

S

OC2H5SK

PEG-400or glycerol

R = Cl, Br, OHY = CH, N

R1 = H, Cl, CH3

1a-1e

1a: X6 = Cl 1d: X4 = Cl1b: X5 = Cl 1e: X5=X6=Cl1c: X7 = Cl

Y

R

NH2

R16

5 Y4

7

N3

2Z

1

SH

S

OC2H5SK

PEG-400or glycerol

NH

OS

NH

N

ZS

X

X = Cl

R

R1

R1

1f - 1j

1f: R = H, Y = CH, Z = O1g: R6 = Cl, Y = CH, Z = O1h: R = H, Y = N, Z = O1i: R6 = Cl, Y = N, Z = S1j: R6 = CH3, Y = N, Z = S

NH

SS

XX

Схема 2. Синтез на полупродукти 1а-1j

11

В литературата са описани редица методи за получаване на заместени

хиназолини. Кendаll предлага метод, който включва получаване на 4-(3H)-хиназолинон

от антранилова киселина и формамид при загряване при 140-150 оС в продължение на 6

часа [65]. От него под действие на фосфорен оксихлорид и фосфорен пентахлорид за 3

часа при 160 оС се получава 4-хлорхиназолин, който при реакция с натриев хидроген

сулфид дава 4-тиохиназолин.

Схема 3. Получаване на хиназолин-4-(3H)-тион

В друг метод [66] тиопроизводното се получава директно от 4-(3H)-хиназолинон.

Авторите предлагат метод за синтез на 4-меркаптохиназолин от 4-хидроксихиназолин

под действието на фосфорен пентасулфид. От 4-меркаптохиназолин с диметил сулфат е

получен 4-метилмеркаптохиназолин (Схема 4).

Схема 4. Метод за получаване на 4-метилтиохиназолин

Базирайки се на този метод Alexandre и сътрудници [67] предлагат някои

подобрения в синтеза на 4-хиназолинони. Класическият метод предложен от

Niementowski [68] включва дълго нагряване (няколко часа) на антранилова киселина с

излишък от формамид при 130°- 150°C. Получените хиназолини при тези условия са с

нисък добив, като се получават и странични продукти, които трудно се елиминират и се

налага пречистване чрез колонна хроматография. Авторите оптимизират метода на

Niementowski, използвайки микровълново облъчване при сравнително ниска мощност,

за кратко време. Установяват, че при тези условия реакцията тече гладко и води до

получаване хиназолин-4–они с добри добиви, които могат да се използват като

полупродукти при синтез на редица съединения.

В друга своя публикация Alexandre и сътрудници [69], отново използвайки

микровълнов синтез, предлагат получаване на 4-меркаптохиназолин чрез реакция на

получения 4-(3H)-хиназолинон с реагент на Lawesson. S-метилирането на синтезирания

12

хиназолин-4-(3H)-тион е извършено под действието на метилйодид в присъствие на

натриева основа (Схема 5).

Схема 5. Получаване на хиназолин-4-(3H)-тион при микровълново облъчване

За получаване на 4-хидроксихиназолин (1l) от антраниламид и формамид ниe

избрахме методът на Alexandre и сътрудници базиран на микровълнов синтез [67]. 4-

тиохиназолинът (1k) беше синтезиран от 4-хидроксихиназолин по класическата

процедура [66] при нагряване с фосфорен пентасулфид в ксилен (Схема 6).

Схема 6. Получаване на полупродукти 1k и 1l

Друг полупродукт необходим за синтеза на изследваните багрила e 4,6-диметил-2-

меркаптопиримидин (1m) (Схема 7). Класическият метод за получаване на

пиримидинoвия пръстен включва най-общо кондензация на амидини (карбамид,

тиокарбамид, гуанидин) и 1,3-дикарбонилни съединения [70-72]. Заместени

пиримидини са получавани и от о-аминонитрили [73, 74] и β-аминоестери [75].

Публикуван е значително опростен и бърз едностадиен метод за получаване на

заместени пиримидини при микровълново облъчване от ацетофенони, формамид,

хексаметилдисилазан и каталитични количества p-толуенсулфонова киселина [76]. В

условия на микровълново облъчване без разтворител за 5 мин са получени 4,6-

дизаместени-2-хидроксипиримидини от карбамид и 1,3-дикарбонилни съединения [77].

4,6-диметил-2-меркаптопиримидин (1m) може да се получи при нагряване на

тиокарбамид и ацетилацетон в етанол и в присъствие на солна киселина [78] (Схема 7).

H2N

H2NS+

H3C

H3C

O

O

HCl / EtOH

N

N

CH3

H3C SH

1m Схема 7. Получаване на 4,6-диметил-2-тиопиримидин (1m)

13

Реакцията протича за 2 часа, при кипене в етанол и добивът на тиопиримидина е около

80%.

1.2. Получаване на S-метилни производни на хетарилтиоли (2а – 2m)

Реакцията на S-алкилиране на хетарилтиоли е известна и се прилага за различни

хетероцикли. Най-често използваната процедура за алкилиране включва директно

взаимодействие с алкил халиди в присъствие на база (като KOH, Et3N, NaOMe, K2CO3,

пиридин) [79-85]. Реакцията може да се проведе във вода или в друг подходящ

разтворител, при стайна температура [86, 87] или при нагряване [86,88], с реакционни

времена между 1 и 24 часа [79, 83, 86, 89] и ниски [90] до отлични добиви [79, 80, 86,

91]. В някои случаи при по-висока температура на реакционна среда като странични

продукти се получават и N-алкилирани съединения [92-97].

За получаване на S-метилните производни на хетарилтиолите първоначално

беше избрана стандартна процедура – алкилиране във воден разтвор, в присъствие на

натриева основа и диметилсулфат при стайна температура. По този начин бяха

синтезирани съединения 2а, 2е и 2f. Добивите на хлорзаместените бензотиазоли при

тези условия бяха около 60 %. Това ни насочи към разработване на нова процедура в

условията на ултразвуково облъчване и стайна температура [98] (Схема 8).

Схема 8. Получаване на метилтиопроизводини при ултразвуково облъчване

Реакцията на S-алкилиране беше приложена за хетарилтиолите 1а-1m с метил

йодид като алкилиращ агент в ацетон при стайна температура и в присъствие на база N-

диизопропилетиламин. Целевите продукти 2а-2m бяха получени с високи добиви и

чистота за кратко реакционно време (Схема 9).

14

Схема 9. Получаване на метилтиохетарилни производни 2а-2m

1.3. Кватернизиране на хетероарилни съединения

Получаването на кватернерни азотсъдържащи хетероцикли е основен етап в

методите за синтез на цианинови багрила. В повечето случаи това е и основната задача,

чието изпълнение е пряко свързано с успешното протичане на крайните етапи за

получаване на багрилата в многостадийните синтези. Затова при описание синтеза на

нови багрилни структури от особено значение е пълното и подробно описание на

процедурите за получаване на кватернерни полупродукти.

В литературата съществува информация за получаването на редица

азотсъдържащи кватернерни хетроциклени съединения като изолирани или по-често

неизолирани полупродукти за цианинови багрила [99-104]. Основен недостатък при

повечето методи е ниският добив на продуктите, протичането на нежелани странични

реакции, както и получаването на кватернерните съединения във вид на маслообразни

продукти, с които се работи по-трудно.

За получаването на полупродуктите за целевите цианинови багрила беше

проведена реакцията на кватернизация на азотсъдържащи хетероцикли по три основни

метода:

15

– нагряване на изходните компоненти в подходящ разтворител, най-

често при кипене;

– стапяне на изходните съединения без присъствие на разтворител при

температура в интервала 120-150оС;

– смесване на изходните вещества в подходящ разтворител при стайна

температура;

1.3.1. Получаване на кватернерни бензазоли 3 и 3а-3m

За получаване на кватернерните заместени бензотиазоли (3, 3а-3h) и

тиазоло[4,5-b]пиридини (3l, 3m) беше използвана утвърдена процедура на кипене на

изходните 2-метилтиопроизводни с малък излишък от диметилсулфат в

трихлороетилен за около 1 час [105-108]. При тези условия след завършване на

реакцията и охлаждане на реакционната смес, продуктите бяха получени в кристален

вид, което улеснява тяхното изолиране. Добивите са между 60 и 93 % (Схема 10).

16

Схема 10. Получаване на кватернерни бензотиазолиеви и тиазоло

[4,5-b]пиридиниеви соли Полупродуктите 2n-2p са получени чрез бензоилиране на 6-амино-2-

метилтиобензотиазол (2а) със съответните 2-заместени бензоилхлориди по стандартна

процедура в етанол при стайна температура в алкална среда (Схема 10). 6-ацетамидо-2-

метилтиобензотиазол (2r) е получен чрез ацилиране на 6-амино-2-

метилтиобензотиазол (2а).

Като цяло кватернизирането на бензооксазолите и техните производни протича

трудно, а ниските температури на топене на продуктите изисква по-дълги процедури по

тяхното изолиране в кристален вид. Освен това е известно, че подобни кватернерни

соли на бензоксазола са нестабилни в присъствие на влага и в редица разтворители

[109(114)]. Полупродуктите 3i и 3j бяха получени в трихлороетилен при нагряване и

изолирани като перхлорати (Схема 11), тъй като във вид на метосулфатите са

маслообразни и кристализират много бавно.

Схема 11. Получаване на полупродукти 3i и 3j

За кватернизирането на 2-метилтиооксазоло[4,5-b]пиридина също бе използвана

модифицирана процедура, поради трудността да бъде синтезиран при кипене в

разтворител. 2-метилмеркапто-4-метил-оксазоло[4,5-b]пиридиниев метилтозилат може

да се получи чрез метилиране и кватернизация на 2-меркаптооксазоло[4,5-b]пиридин с

метилтозилат [110]. В резултат на предишни изследвания в Лабораторията за синтез на

багрила [111] е разработена нова процедура за получаване на това съединение при

стайна температура, с високи добиви и чистота, в кристален вид. Първоначално се

17

извършва метилиране на 2-меркаптооксазоло[4,5-b]пиридин с метилйодид в ацетон

като разтворител, в присъствието на еквимоларно количество N-диизопропилетиламин.

S-метилирането протича при разбъркване при стайна температура или при

ултразвуково облъчване по описаната по-горе процедура, което значително съкращава

реакционното време. След отстраняване на получения в хода на реакцията N-

диизопропилетиламониев хидройодид, към разтвора на 2-метилмеркаптооксазоло[4,5-

b]пиридина в ацетон се прибавя малък молен излишък от диметилсулфат и

реакционната смес се оставя при стайна температура в продължениe на 1-2 денонощия

(Схема 12).

Схема 12. Получаване на 2-метилмеркапто-4-метилоксазоло

[4,5-b]пиридиниев метосулфат (3k)

1.3.2. Получаване на 4-метилхинолиниеви и 4-метилпиридиниеви кватернерни соли (4а-4n) Получаването на кватернерните лепидиниеви и пиколиниеви соли необходими

за синтеза на целевите багрила извършихме по модифицирана от нас известна

процедура [112-114] чрез стапяне при 120-150оС на 4-метилхинолин (за полупродуки

4а-4i) или 4-метилпиридин (полупродукти 4j-4n) и съответният алкил или заместен

алкил халогенид в еквимоларни отношения (Схема 13). Реакционното време варира от

30 мин до 120 мин. Получените съединения се изолират чрез утаяване с диетилов етер.

18

+

30-120 минN

CH3

X-R1

120-150oC

N

CH3

R1X

4b:

4h: R1 = ; X = Br

4b-4i

4d: R1 = ; X = Br

4e: R1 = ; X = Br

4c: R1 = -(CH2)5COOH ; X = BrR1 = -(CH2)2OH; X = Br

4f: R1 = ; X = Br

(CH2)3 N

O

O

4i: R1 = (CH2)3 S ; X = Br

CH2

(CH2)2 CH2CH2OCONH

+

N

CH3

(CH3)2SO4

стайнатемпература

N

CH3

CH3CH3SO4

4a30 мин

+30-60 минN

CH3

X-R1

120-150oC

N

CH3

R1X

4l : R1 = X = Br

4k-4n

4m : R1 = X = I

N(H2C)3

O

O

S(H2C)3

4k: R1 =

X = Br

(CH2)2 N

O

O

CH2CH2OCONH

X = Br

4n: R1 =

Схема 13. Получаване на полупродукти 4а-4

1.3.3. Получаване на кватернерни пиримидиниеви соли 5а-5е

Необходимият за получаване на целевите багрила 4-метилпиримидин беше

кватернизиран по стандартна процедура с диметилсулфат при кипене в ацетон за

реакционно време 1 час (Схема 14).

Схема 14. Получаване на полупродукт 5а

19

В литературата не бяха открити данни за кватернизиране на 2-заместени-4,6-

диметилпиримидини. Нагряването им в ацетон с диметил сулфат доведе до частично

кватернизиране по азотния атом в положение 1, но добивът на реакцията е

незадоволителен. При кватернизиране на заместените 4,6-диметилпиримидини с

метилйодид в среда от ацетон желаните продукти също не бяха получени с добри

добиви. С цел прилагане на по-твърди условия реакцията бе проведена без разтворител

при стапяне на изходните компоненти при температура 120-130оС. В тези случаи по-

голямата част от изходните пиримидини сублимираха, което отново не доведе до

получаване на кватернерни продукти със задоволителни добиви. Най-добри резултати

(добиви 51-71%) бяха получени при кватернизирането на 2-заместените-4,6-

диметилпиримидини (15-18) с диметил сулфат при кипене в о-дихлоробензен в

продължение на 1.5-2 часа (Схема 15). Продуктите бяха изолирани във вид на масла

чрез утаяване с диетилов етер. Пречистването от некватернизирани изходни

съединения бе извършено чрез двукратно разтваряне в метанол и преутаяване с

диетилов етер.

Схема 15. Получаване на полупродукти 5b-5d

Невъзможността за пълно кватернизиране на азотния атом в положение 1 на

заместените 4,6-метилпиримидини отдаваме на пространствено пречене от обемистата

метилна група в положение 6 и наличието на заместител в положение 2.

1.3.4. Получаване на кватернерни 2-метилбензотиа(окса)золиеви соли 7а-7c

Кватернизирането на 2-метилбензотиазол и 2-метилбензооксазол с

диметилсулфат беше проведено по стандартна процедура [115] като реакцията протича

лесно и сравнително бързо без използване на разтворител – съответно при стайна

температура за синтеза на 2,3-диметилбензотиазолиевия метосулфат и при нагряване за

около 1 час за 2,3-диметилбензооксазолиевия метосулфат (Схема 16).

20

Получаването на 2-метил-3-етилбензотиазолиевия йодид (7b) се извършва при

нагряване в епруветка под налягане(Схема 16). Реакционната смес се нагрява на

маслена баня при 120оС в продължение на 1 час и след охлаждане продуктът

кристализира. Промива се с диетилов етер и се филтрува.

Схема 16. Получаване на полупродукти 7а-7c

1.4. Получаване на 4-метилхиназолин, 4-метилцинолин и кватернерни соли

1.4.1. Получаване на 4-метилхиназолин (6a)

Най-често използваната реакция за получаване на хиназолинова структура

включва кондензация на производни на антраниловата киселина – антраниламид или

аминоацетофенон с формамид [116, 69, 117] (Схема 17).

O

R

NH2

HCONH2

N

N

R1

R = NH2, CH3 R1 = OH, CH3

Схема 17. Получаване на 4-заместени хиназолини

Установено бе, че добивът на реакцията за получаване на 4-метилхиназолин от

аминоацетофенон и формамид се увеличава от 55 % на 75 % в присъствие на борен

трифлуорид етерат като катализатор [118] (Схема 18).

Схема 18. Получаване на 4-метилхиназолин

1.4.2. Получаване на 4-метилцинолин (6b)

Циклизирането на диазотирани 2-алкенил анилини е един от най-широко

използваните методи за получаване на 4-заместени цинолини (Схема 19) [119-121].

21

Схема 19. Получаване на заместени цинолини

4-метилцинолин (6b) беше получен чрез диазотиране и последващо циклизиране на 2-

изопропениланилин в присъствие солна киселина и натриев нитрит (Схема 20) [122].

Схема 20. Получаване на 4-метилцинолин

1.5. Получаване на други полупродукти (7 – 18)

1.5.1. Получаване на 1-(3-йодопропил)пиридиниев йодид (7), N,N,N- триметил-(3-йодопропил)-амониев йодид (8) и N,N,N-триетил-(3- йодопропил)-амониев йодид (9) Други съединения, използвани на различни етапи от синтеза на целевите

монометинцианинови багрила са 1-(3-йодопропил)пиридиниев йодид (7), N,N,N-

триметил-(3-йодопропил)-амониев йодид (8) и N,N,N-триетил-(3-йодопропил)-амониев

йодид (9). Те се получават по обща процедура - при смесване съответно на пиридин (за

полупродукт 7), тримeтиламин (за за полупродукт 8) и триетиламин (за полупродукт 9)

с петкратен молен излишък дийодопропан в ацетон. Реакцията протича за няколко дни

на тъмно при стайна температура (Схема 21).

Схема 21. Получаване на кватернерни полупродукти 7-9

Установено е [123], че при концентрации на дихалогенопроизводното по-ниски

от петкратен молен излишък се получава голям процент бис-кватернизиран страничен

продукт. Той може да се отстрани чрез хроматографско филтруване през силикагел на

разтвор на продукта в подходящ разтворител.

22

1.5.2. Халогениране на 2-аминопиридини

Едни от първите насочени опити за получаване на заместени 2-аминопиридини е

публикуван от Чичибабин през 1920г [124]. Сред най-широко използваните методи за

бромиране на заместени 2-аминопиридини е предложеният от Dunn и сътрудници през

1989г [125]. Те получават серия от заместени аминопиридини чрез бромоводородна

киселина и водороден пероксид (Схема 22). Така бромираният аминопиридин в

повечето случаи се получава с висок добив, а еквимоларните отношения между

заместения пиридин и бромоводорода водят до получаване предимно монобромиран

продукт.

Схема 22. Окислително бромиране на 2-аминопиридини

По този начин чрез хлориране в присъствие на водороден пероксид, с висок

добив (над 70%) е получен 2-амино-3,5-дихлоропиридинът. От нас бе установено че,

бромирането на 2-амино-5-метилпиридина протича с по-висок добив в оцетна киселина

с бром (около 75%) (Схема 23). Полученият хидробромид на 2-амино-3-бромо-5-

метилпиридина се филтрува, разтваря се във вода и се утаява с натриева основа.

N NH2

R HCl или HBr

N NH2

R X

H2O2

R = H, CH3 10: R = X = Cl11: R = CH3, X = Br

N NH2

H3C CH3COOH/Br2

N NH2

H3C Br

Схема 23. Получаване на полупродукти 10 и 11

1.5.3. Получаване на 2-заместени-4,6-диметилпиримидини (15-18)

2-заместени 4,6-диметилпиримидини могат да се получат от съответните диамидини и

ацетилацетон по реакция на Pinner [126], която протича във водна среда, в присъствие

на калиев карбонат, при стайна температура в продължение на 24-48 ч (Схема 24).

23

Схема 24. Получаване на 2-заместени пиримидини

Диамидините 12-14 са получени от съответните амини и S-метилизотиоурониев сулфат

по модифицирана процедура [127, 128] - при кипене в етоксиетнол в продължение на 4

часа (Схема 25). Безнамидин хидрохлорид, необходим за получаването на пиримидина

18 е търговски продукт.

Схема 25. Получаване на диамидини 12-14

2. Получаване на монометинцианинови багрила

В последните години повечето нови несиметрични монометинцианинови

багрила се синтезират по метода, разработен от Brooker [115], включващ реакцията на

2-метилмеркаптобензооксазолиеви или -бензотиазолиеви соли с 1-алкил-4-

метилхинолиниеви соли в присъствие на базичен агент триетиламин (Схема 26).

Съществуват някои недостатъци, свързани с получаване на изходните компоненти,

необходими за този метод - възможността за протичане на обмен между алкиловите

заместители при серния и азотния атом на 2-алкилтиокватернерната сол [129,130].

Схема 26. Получаване на несиметрични монометинцианинови багрила по метода, използван от Brooker и сътрудници

24

Протичането на нежелани странични реакции по време на реакцията се избягва в

голяма степен чрез използването на запречената база на Hünig [131, 132].

За получаването на голяма част от синтезираните голяма част от синтезираните

багрила сме приложили метода на Brooker.

2.1. Получаване на бензоилирани производни на ТО (D1-D17)

С цел да разширим възможностите за получаване на аналози на Тиазолово

оранжево (ТО) и да определим флуоресцентните им характеристики след свързване с

двойноверижна ДНК (двДНК), насочихме усилията си към синтез и охарактеризиране

на нови асиметрични монометинцианинови багрила, съдържащи бензоиламинов

заместител в бензотиазоловия цикъл. От публикувани по-рано резултати на Yarmoluk и

сътрудници е известно, че симетрични триметинцианинови багрила, съдържащи

бензоилирани в позиция 6 и 6’ бензотиазолови остатъци се свързват в малката бразда

на двДНК [133].

За нас интерес предствляваше да се определи влиянието на бензоиламино

заместителите в положение 6 върху модела на свързване несиметрични

монометинцианинови багрила с двДНК. Конкретните задачи, които си поставихме

бяха: i) да се синтезират нови моно- и дикатионни асиметрични аналози на ТО с

бензоиламино заместители в бензотиазоловия остатък; ii) да се охарактеризират

посредством UV/Vis и флуоресцентна спектроскопия новите флуорофори в присъствие

на двДНК и да се определи тяхната чувствителност при различни съотношения

багрило-двойки бази нуклиенова киселина.

В резултат на допълнителни изследвания и проведен термодинамичен анализ на

образуването на комплекса багрило-двДНК, използвайки модел на McGhee & von

Hippеl, в “Лаборатория по биофизика”, Харковски университет, Украйна от наши

колеги бяха определени свързващите константи на багрилата D1-D16. Установeно бе,

че модела на свързването им с двДНК е преобладаващо интеркалативен [134].

2.1.1. Синтез на багрила D1-D17

Серията от нови монометинцианинови багрила е получена с добри до високи

добиви и висока чистота чрез кондензация на кватернерни 4-метилхинолиниеви или 4-

метилпиридиниеви соли (4a-4i, 4l, 4m) с кватернизирани 2-метилтиохетероциклични

съединения (3а-3d), в присъствие на базичен агент (N-етилдиизопропиламин) и

25

подходящ разтворител – етанол или оцетен анхидрид, при стайна температура (Схема

27).

багрило R R1 багрило R R1

D1 C6H5 CH3 D10

CH2Ph

D2 C6H5

D11

D3 C6H5

D12

CH2Ph

D4 CH3

D13 C6H5 (CH2)5COOH

D5 C6H5 CH2Ph D14 CH3

D6 C6H5 CH2CH2Ph D15 C6H5

D7 C6H5 CH2CH2OH D16

D8

D17 C6H5 CH2CH2OCONHPh

D9

CH2CH2OCONHPh

Схема 27. Получаване на багрила D1-D17

26

27

Получените багрила бяха изолирани като твърди продукти чрез филтруване, в

случаите когато са получавани в етанол. При използване на оцетен анхидрид като

разтворител багрилата се изолират след утаяване с диетилов етер и последващо

филтруване. Пробите за анализи са подготвени след дву- и трикратна прекристализация

из етанол. Всички получени багрила са нови, неописани в литературата и структурите

им са доказани с 1Н-ЯМР и елементни анализи.

2.1.2. Изследване фотофизичните характеристики нa D1-D17 в разтвори и в присъствие на ДНК

Определени са абсорбционните максимуми на багрилата в разтори на метанол

при концентрация 1x10-5 М и стайна температура. Съединенията абсорбират в областта

453-519 нм и имат моларни абсорбируемости между 37 900 – 93 100 l.mol−1.cm−1.

Изследвани са абсорбционните и флуоресцентни свойства на серията багрила в

буферен разтвор (TRIS-EDTA, pH 7.4) в отсъствие и в присъствие на двДНК (Salmon

sperm). Абсорбционните максимуми в разтворите с ДНК са отместени батохромно и

хипохромно спрямо тези без ДНК. Почти не се наблюдава собствена флуоресценция на

съединенията в буферния разтвор, докато в разтвор с двДНК флуоресцентната

интензивност на комплекса багрилна молекула – нуклеинова киселина се повишава

многократно. В Tаблица 1 са обобщени данните за спектралните характеристики на

багрилата в буферни разтвори в свободно състояние и след свързване с двДНK.

Най-голямо повишение на флуоресцентната интензивност след свързване с

двДНК се наблюдава при багрилa D9, D10 и D12 (Таблица 1) (Фиг. 1).

Таблица 1. Фотофизични отнасяния на багрила D1-D17 при концентрация 1х10-7М в буферни разтвори преди и след свързване с двДНК

Багрило

λmax (МеОН)

[nm]

ε [l.mol-1.cm-1]

λmax (буфер)

[nm]

λmax (багрило

+ двДНК) [nm]

λem

[nm]

Флуоресцентна интензивност [ I0]

(свободни багрила)

Флуоресцентна интензивност [ I ]

(багрила + двДНК)

I / I0

D1 515 77 400 510 513 543 2.08 494.96 238

D2 464 37 900 458 473 496 7.91 128.06 16

D3 518 81 100 517 530 547 8.35 446.34 53

D4 519 49 900 518 521 545 1.68 74.66 69

D5 519 73 600 500 520 545 1.29 384.22 270

D6 519 77 900 509 520 546 1.31 223.52 170

D7 516 61 900 503 516 546 2.02 695.58 344

D8 519 64 000 504 519 543 0.89 383.41 383

D9 519 75 300 508 519 544 1.12 998.80 892

D10 519 93 100 501 519 545 0.96 992.15 1033

D11 518 68 700 512 525 545 2.09 710.18 340

D12 519 85 600 512 519 543 0.98 817.24 834

D13 517 78 900 509 512 543 2.45 941.71 385

26

27

D14 453 66 400 451 465 496 8.79 770.15 88

D15 521 49 200 509 512 549 0.99 183.86 186

D16 517 58 600 510 516 547 0.80 349.32 437

D17 519 70 300 507 519 547 2.98 832.51 279

540 560 580 600 620 640 660 680 7000

200

400

600

800

флуоресцентна

интензивност

[a.u

.]

[nm]

D12 в ТРИС буфер D12 в присъствие на двДНК

Фигура 1. Флуоресцентна интензивност на багрило D12 в буферен разтвор в свободно състояние и след свързване с двДНК.

Свързващите константи (К) на багрилата са с порядък 104-105, което предполага

стабилно свързване към двДНК. Стойностите на моларната флуоресценция (a) (molar

fluorescence) и изключващият съседните позиции параметър (n) (site exclusion

parameter) – броя на ДНК фрагменти, които се заемат/покриват от една молекула

багрило, също са характеристични за образуването на комплекси ДНК-багрило. Най-

висока стойност на К е изчислена за багрило D14, а най-високи стойности за а и n за

багрило D12.

Детайлното проучване на литературата по отношение на свързването на

флуорофори с двДНК ни насочи към предположението, че предпочетеният модел на

взаимодействие на изследваните от нас бензоилирани монометинцианинови багрила е

интеркалативният. Базираме се на следните съображения:

1. Геометрията на багрилните молекули и двДНК съответстват на това

твърдение. Молекулите на изследваните багрила са с размери около 1.8-2.2 нм, което

съвпада с диаметъра на двДНК, т.е. свободното пространство за интеркалация (около 2

нм).

2. Свързването в браздата изисква определена гъвкавост на взаимодействащата

молекула, която е характерна за полиметиновите багрила [135].

3. Типичните стойностите на свързващите константи за органичните багрила,

взаимодействащи с ДНК чрез интеркалация са в интервала 104-105 М-1 и обикновено са

28

по-ниски от тези, наблюдавани при молекулите, свързващи се в малката бразда (105-106

М-1) [136].

В Таблица 2 са обобщени свързващите константи на багрилата D2-D17.

Стойностите им варират от 2.27×104 до 7.58×105, което е допълнителен аргумент в

подкрепа на интеркалативният модел на свързване.

Таблица 2. Параметри за свързването на багрила D с двДНК, изчислени по модела на McGhee & von Hippel

Dye K, ×105, M-1 n a, ×103, M-1

D1 0.66±0.15 2.49±0.74 1.21±0.36

D2 2.13±0.63 1.49±0.44 0.16±0.04

D3 0.48±0.14 1.95±0.58 1.17±0.35

D4 2.37±0.71 1.81±0.54 0.39±0.11

D5 0.23±0.07 1.05±0.31 8.37±2.51

D6 2.08±0.62 1.51±0.45 0.38±0.11

D7 0.47±0.14 1.05±0.31 8.05±2.41

D8 1.20±0.36 2.49±0.74 1.29±0.38

D9 2.32±0.69 3.24±0.97 1.35±0.40

D10 0.53±0.15 2.99±0.89 5.22±1.56

D11 0.98±0.29 3.00±0.9 1.31±0.39

D12 0.79±0.23 4.79±1.43 10.6±3.1

D13 1.19±0.35 3.19±0.95 1.78±0.53

D14 7.58±2.27 3.13±0.93 3.66±1.09

D15 0.55±0.16 3.19±0.95 1.62±0.48

D16 1.27±0.38 1.57±0.47 2.56±0.76

Освен това за 11 от пробите получените стойности за n са около 2, величина

зависеща от „принципа за изключване на съседа” при интеркалацията, според който

свързването на една багрилна молекула между две двойки бази възпрепятства достъпа

29

до следващoтo място за свързване на друга багрилна молекула [135, 137]. Изключения

са багрила D9, D11, D12, D13 и D14. Параметъра n за тези багрила е със стойности

вариращи от 3 до 4.8. Това може да се разглежда като индикация за друг модел на

свързване или е изключение, но и в двата случая са необходими допълнителни

изследвания.

2.2. Получаване на хиназолинови багрила (Е1-Е13)

2.2.1. Нова синтетична процедура за получаване на изходни багрила Е1-Е3 С цел да получим нековалентни ДНК маркери, съдържащи хиназолинов остатък

и подобрени спектро-луминесцентни характеристики в присъствие на нуклеинови

киселини, синтезирахме серия несиметрични монометинцианинови багрила с един или

два положителни заряда в молекулите. Получаването на фотостабилни багрила е важно

от практическа гледна точка във връзка с аналитичните приложения, за голяма част от

които е необходимо използваните флуорофори да имат дълъг живот при облъчване със

съответния светлинен източник и добри флуоресцентни квантови добиви. Тези

свойства могат да се постигнат чрез модификации в структурата на багрилата. Ето защо

подобряването на известни и разработването на нови синтетични подходи е от

съществено значение за тази област.

На базата на тези известни методи в настоящата дисертационна работа са

разработени две нови синтетични процедури за получаване на монометинцианинови

багрила, съдържащи хиназолинов пръстен (Схема 28).

Схема 28. Получаване на хиназолинови несиметрични монометинцианини

Багрилата Е1-Е3 са получени по нов метод [138], при реакция на съответната

кватернерна 2-метилбензотиазолова (7а,7b) или бензоксазолова сол (7c) с 4-

(метилтио)хиназолин (2l), без използване на базичен агент като са разработени две

процедури:

30

Процедура А: Смесване на еквимоларни количества от изходните компоненти, в среда

от оцетен анхидрид и нагряване при температура 70-100°C, в продължение на 30 мин -

1 час.

Процедура Б: Стапяне на двата изходни компонента при температура 100-110°C в

продължение на 5-15 мин.

Продуктите се изолират чрез утаяване с диетилов етер и филтруване. В случаите на

получаване на багрилата като маслообразни продукти те бяха преутаени чрез

разтрварянето им в минимално количество алкохол и прибавяне на разтвора във воден

разтвор на калиев йодид.

Литературните данните за получаване на асиметрични монометинцианинови

багрила съдържащи пиримидинова и хиназолинова структура са оскъдни [116, 139, 140,

141]. Известен е метод разработен от Yue и сътрудници [142], при който еквимоларни

количества от 3-метил-2-метилтиобензотиазолиев тозилат, лепидин и оцетен анхидрид

се нагряват в присъствие на DMF при 100-110оС в продължение на 4 часа.

При разработването на новите процедурите целяхме да опростим известния

алкилтио метод като избегнем използването на две изходни кватернерни соли, което

редуцира синтетичните стъпки за получаване на изходните съединения. Освен това не е

необходимо използването на базичен агент, който е задължителен при останалите

описани методи. Директното нагряване без разтворител на полупродуктите 7а-7c и 2l

съкращава времето на реакцията и намалява възможността за протичане на странични

реакции [143-145]. Получените изходни монометинцианинови багрила могат

допълнително да се кватернизират по N-атом в положение 1 в хиназолиновия остатък с

различни алкил или алкиларил халогениди и по този начин да се синтезират моно- и

дикатионни несиметрични багрила. В наши предишни изследвания бе показвано, че

флуоресцентната интензивност на цианиновите багрила в присъствие на ДНК нараства

с увеличаване броя на положителните товари в молекулата на багрилото [146].

2.2.2. Получаване на багрила Е4-Е13

Багрилата Е4-Е13 са получени при нагряване на съответните изходни багрила

Е1-Е3 и избраният кватернизиращ агент - алкилхалогениди, бензилбромид, 1-(3-

йодопропил)пиридиниев йодид (7), N,N,N-триметил-(3-йодопропил)-амониев йодид (8),

N,N,N-триетил-(3-йодопропил)-амониев йодид (9), в среда от 2-етоксиетанол, и

присъствие на база N-етилдиизопропиламин в продължение на 3-5 часа (Схема 29).

Синтеза на багрила Е4 и Е5 бе проведена в епруветка под налягане.

31

багрило X R R1 багрило X R R1

Е4 S CH3 CH3 Е9 S CH3

Е5 S CH3 C2H5 Е10 S CH3

Е6 S CH3 C3H7 Е11 S CH3

Е7 S CH3 C4H9 Е12 O CH3 CH2Ph

Е8 S CH3 CH2Ph Е13 S C2H5 CH2Ph

Схема 29. Получаване на багрила Е4-Е13

Синтезираните багрила се получават с висока чистота и са изолирани чрез

утаяване с диетилов етер и филтруване или директно филтруване от използвания

разтворител и промиване с диетилов етер. Пробите за анализи са прекристализирани

двукратно из етанол.

2.2.3. Изследване на фотофизичните свойства на багрила Е1-Е13 в буферен разтвор и в присъствие на двДНК

Изследвани са абсорбционните характеристики на получените багрила в разтвор

на метанол при стайна температура. Данните за абсорбционните максимуми (Λmax) и

моларните абсорбируемости (ε) на багрила Е1-Е13 са представени в Tаблица 3.

32

Таблица 3. Абсорбционни максимуми и моларни абсорбируемости за багрила Е1-Е13 в метанол с концентрация 1х10-5М

багрило λmax1

[nm]

λmax2

[nm]

ε1

[l.mol-1.cm-1]

ε2

[l.mol-1.cm-1]

Е1 442 - 48 100 -

Е2 444 - 43 600 -

Е3 425 - 50 100 -

Е4 453 479 63 300 74 200

Е5 454 481 82 000 102 000

Е6 455 481 44 800 55 500

Е7 455 481 57 800 71 400

Е8 454 481 47 700 55 800

Е9 455 482 54 100 62 600

Е10 455 482 65 300 74 900

Е11 455 482 58 400 67 600

Е12 442 466 57 800 58 100

Е13 454 481 52 500 62 800

При всички кватернизирани по N-атом от хиназолина багрила се наблюдават два

максимума в абсорбционните спектри в разтвор на метанол и в буферен разтвор (Фиг.

2), поради възможността за реализиране на двата вида електронни преходи участието

на хиназолиновия остатък. Интензивнoстта на по-късовълновия максимум нараства в

разтвора на ТРИС буфера, което може да се обясни със стабилизирането на едия от

двата прехода (Фиг. 2).

33

400 450 500 550 600 6500.0

0.1

0.2

0.3

0.4

0.5

0.6

0.7

0.8

абсорбция

[nm]

E1, c = 1x10-5, MeOH

E4, c = 1x10-5, MeOH

E8, c = 1x10-5, MeOH

Фигура 2. Абсорбционни спектри а багрила Е1, Е4 и Е8.

Изследвани са абсорбционните и флуоресцентни свойства на серията багрила в буферен разтвор (TRIS-EDTA, pH 7.4) в отсъствие и в присъствие на двДНК (Salmon sperm). Приготвени са базови разтвори на багрилата в DMSO с концентрация 1х10-3М, а работните разтвори за измерванията с двДНК са с крайна концентрация 1х10-7М. Собствената флуоресценция на съединенията в буферния разтвор е слаба, докато в разтвор с двДНК флуоресцентната интензивност на комплекса багрилна молекула – нуклеинова киселина се повишава, в повечето случаи многократно (Фиг.3).

500 550 600 6500

50

100

150

2

флуоресцентна интензивност

[a.u

.]

[nm]

E1 буфер E1 + 0.19g/ml двДНК (1:1) E1 + 1.9 g/ml двДНК (1:10) E1 + 3.8 g/ml двДНК (1:20) E1 + 5.7 g/ml двДНК (1:30)

Фигура 3. Флуоресцентна интензивност на багрило E1 (с = 1х10-7 М) в буферен разтвор в

свободно състояние и след свързване с двДНК

34

Във флуоресцентните спектри на всички багрила се наблюдава втори максимум,

батохромно отместен, спрямо основния.

Флуоресцентните интензивности на багрилата Е1-Е13 след свързване с двДНК

са сравнявани при концентрация 1х10-7М и съотношение багрило-базови двойки 1-30.

При измерванията с двДНК багрила Е4-Е13, които имат два абсорбционни максимума,

са облъчвани и при двете дължини на вълните – около 455 и 485 нм. След свързването

им с ДНК по-голяма флуоресцентна интензивност се наблюдава при възбуждане в по-

дълговълновия абсорбционен максимум, но като цяло разликата, в сравнение с

облъчване в по-късовълновия максимум, е от порядъка на 10-15 пъти.

Таблица 4. Данни за флуоресцентните отнасяния на багрила Е1-Е13 при концентрация 1х10-7М в буферни разтвори преди и след свързване с двДНК

ТРИСбуфер ТРИС

буфер+двДНК буфер

багрило

max1 [nm]

max2 [nm]

max1 [nm]

max2 [nm]

em [nm]

Флуоресцентна интензивност

[ I0] (свободни багрила)

Флуоресцентна интензивност

[ I ] (багрила+двДНК)

I/I0

Е1 442 - 445 - 494 525

2.61 135.10 52

Е2 447 - 449 - 494 525

3.78 161.94 43

Е3 418 - 425 - 478 510

7.85 802.50 102

Е4 450 477 452 480 502 535

1.41 244.9 174

Е5 451 478 451 478 501 535

3.21 699.48 218

Е6 452 479 453 481 502 536

1.37 381.62 278

Е7 452 480 453 482 501 535

0.82 251.79 307

Е8 451 479 453 481 502 537

4.30 672.50 156

Е9 451 479 453 480 501 535

2.79 362.70 130

Е10 452 480 454 481 502 536

3.14 384.27 122

Е11 451 479 452 480 503 537

3.04 424.2 140

Е12 439 464 441 467 488 518

0.74 53.75 73

Е13 451 479 453 481 502 534

4.82 865.9 180

35

При всички багрила кватернизирани по N-атом от хиназолиновия пръстен се

наблюдава многократно повишение на флуоресценатната интензивност след свързване

с двДНК. При наличие на еквимоларно количество двойки бази в буферния разтвор на

багрилото флуоресцентната интензивност нараства средно между 40 и 80 пъти за

всички производни, което позволява детекция на сравнително ниски концентрации на

нуклеинови киселини (около 0.20 μg/ml двДНК).

2.3. Получаване на тиазоло- и оксазоло[4,5-b]пиридиниеви багрила

Въвеждането на оксазоло- и тиазолопиридиниеви заместители в структурата на

монометинцианинови багрила води до допълнително батохромно отместване на

абсорционните максимуми. При предишни наши изследвания на такива багрила

установихме, че те притежават много високи моларни абсорбируемости – около и над

100 000 l.mol-1.cm-1 [110] и са много чувствителни към ниски концентрации на двДНК

[146].

2.3.1. Синтез на багрила А1-А16

С цел да определим влиянието на тиазолопиридиниеви заместители върху

афинитета и флуоресцентната интезивност на съдържащите ги багрила към двДНК,

синтезирахме серия нови несиметрични монометинцианинови багрила (Схема 30).

36

багрило X R R1

багрило X R R1 R2 R3

А1 S Cl CH3 А9 S Cl

- -

А2 S Cl CH2Ph A10 S Cl

- -

А3 S CH3

А11 S Cl CH2CH2OCONHPh - -

А4 O H

А12 O H - H H

А5 S CH3 CH2CH2OCONHPh А13 S Cl - H H

А6 S Cl

А14 S Cl - CH3

А7 S CH3 (CH2)5COOH А15 S Cl - CH3

А8 O H (CH2)5COOH А16 O H - Ph CH3

Схема 31. Получаване на багрила А1-А17

2.3.2. Изследване на фотофизичните свойства на багрила А1-А16 и д

коефициенти на багрилата са

опреде

иготвени в DMSO.

Собств

взаимодействието им с вДНК

Абсорбционните максимуми и екстинкционните

лени в разтвори на метанол с концентрация 5х10-6М (Таблица 5). Като цяло

производните, съдържащи оксазолопиридиниеви заместители показват по-високи

моларни абсорбируемости, в сравнение с техните тиазолопиридиниеви аналози. В

спектрите на всички багрила, освен основния максимум, се наблюдават и късовълнови

рамена с ниска интензивност, нарастваща в буферен разтвор и присъствие на двДНК,

което може да се обясни с образуването на допълнителни агрегати.

Базовите разтвори на багрилата с концентрация 1х10-3М са пр

ените флуоресцентни интензивности на повечето багрилата в разтвор на ТРИС

37

буфер при концентрация 1х10-7М са ниски, с изключение на багрила А5,А7,А13, А15 и

А16. Стоксовите отмествания на багрилата са със стойности в интервала 17-77 нм.

За определяне на съотношението багрило - двойки бази, при което се наблюдава

максимална флуоресцентна интензивност, багрилните разтвори с работна концентрация

1х10-7М са титрувани с буферен разтвор на двДНК. Най-силно повишение на

флуоресцентната интензивност след свързване с двДНК се наблюдава за разтвора на

багрило А2 (Фиг. 4), въпреки че най-ниска собствена флуоресценция показват багрила

А6 и А9 (Таблица 5).

580 600 620 640 660 6800

100

200

300

400

500

600

700

флуоресцентна

интензивност

[a.u

.]

[nm]

A2, c = 1x10-7M, разтвор в ТРИС буфер A2+11.4 g/ml двДНК (1:60)

Фигура 4. Флуоресцентна интензивност на багрило А2 (с = 1х10-7 М) в разтвор на ТРИС-буфер, в свободно състояние и след свързване с двДНК (1:60)

Багрила А2, А3, А5 и А6 бяха предоставени на наши колеги от “Лаборатория за

изследване взаимодействията на биомакромолекули”, Институт Ruđer Bošković, Загреб,

за допълнителни изследвания. От тях бяха определени свързващите константи на

багрилата, температурата на топене на комплекси на багрилата с двДНК и бяха

проведени спектроскопски измервания на базата на кръгов дихроизъм за изясняване

модела на свързване с двДНК [147]. Проведените експерименти с багрилата А2, А3, А5

и А6 демонстрират, че те имат нисък афинитет на свързване с ctДНК и не стабилизират

синтетични АТ-АТ ДНК или А-U РНК последователности при изследвания за термична

стабилност. Характерът и интензивността на ICD (induced circular dichroism) сигналите,

както и фактът, че последователността на базовите двойки не оказва влияние върху тях,

показват че багрилата се свързват по-скоро неспецифично към скелета на нуклеиновата

киселина.

38

№ λmax (МеОН)

ε [l.mol-1.cm-1]

λmax (буфер)

λmax (багрило +двДНК)

λem

Собствена флуоресцентна

интензивност [ I0]

Флуоресцентна интензивност [ I ](багрила + двДНК)

I / I0

A1 555 71 900 552 550 581 3.98 250.25 63

A2 557 154 600 552 551 581 3.02 647.08 214

A3 550 186 600 548 547 570 4.51 627.97 139

A4 522 145 000 523 525 548 5.68 961.40 169

A5 549 134 600 551 548 568 11.48 798.57 70

A6 560 95 000 551 550 583 1.83 217.58 119

A7 549 147 000 544 544 571 13.33 173.30 13

A8 521 175 000 518 518 544 3.16 538.28 170

A9 517 54 100 510 510 555 1.61 159.25 84

A10 453 55 800 445 446 490 3.34 180.36 54

A11 453 55 800 517 518 556 3.40 130.35 38

A12 445 32 400 442 443 519 8.80 96.81 11

A13 497 31 900 489 493 527 16.91 107.46 6

A14 549 34 500 544 545 573 5.79 370.97 64

A15 500 64 000 494 498 532 17.03 374.66 22

A16 456 32 000 451 454 520 19.24 250.12 13

Таблица 5. Спектро-луминесцентни свойства на серия А в метанол и в ТРИС буфер в свободно състояние и след свързване с двДНК

39

2.4. Получаване на хлорни аналози на „Тиазолово оранжево” (С1-С8)

Едни от най-важните изисквания към багрилата при работа с живи клетки са те

лесно и бързо да проникват през клетъната мембрана, да бъдат селективни, да не бъдат

токсични за клетките и да са високо чувствителни при ниски концентрации. В тази

връзка бяха синтезирани серия хлорoсъдържащи аналози на Тиазолово оранжево, с цел

да се увеличи хидрофобността на молекулите и по-този начин скоростта на проникване

през клетъчната мембрана на живи клетки. Освен това при част от производните

заменихме метилната група в хинолиновия остатък с хидроксиетилна, което

благоприятства разтворимостта на багрилата в полярни разтворители.

2.4.1. Синтез на багрила С1-С8

Багрилата са получени по класическия метод, разработен от Brooker и сътрудници

[148,115], чрез кондензация на две хетероциклични кватернерни соли, съдържащи

съответно тиоаликилова и метилна група (Схема 32).

Схема 32. Получаване на багрила С1-С8

2.4.2. Изследване на фотофизичните свойства на багрила С1-С8 в разтвори и в присъствие на двДНК

Абсорбционните максимуми на багрилата в разтвори на метанол са в областта 498-

503нм с моларни абсорбируемости в диапазона 59 800 – 84 800 l.mol-1cm-1 (Таблица 6).

Tаблица 6. Абсорбционни максимуми и екстинкционни коефициенти за багрила С1-С8 в метанол (1х10-5М)

багрило λmax [nm] ε [l.cm-1.mol-1]

С1 502 75 200

40

С2 503 84 800

С3 500 76 200

С4 501 65 800

С5 500 69 600

С6 501 68 000

С7 500 63 900

С8 498 59 800

Флуоресцентните спектри на серията багрила в буферни разтвори и в

присъствие на двДНК са получени при работна концентрация 1х10-7М. В отсъствие на

нуклеинова киселина всички производни показват незначителна собствена

флуоресценция, която се повишава многократно при прибавяне на двДНК в разтворите.

Увеличението на флуоресцентната интензивност на комплексите багрило-двДНК е

определено при титруване на буферни разтвори с постоянна багрилна концентрация

1х10-7М със съответното количество буферен разтвор на двДНК. За всяко от багрилата

са приготвени разтвори с моларни съотношения багрило-двДНК 1:1, 1:5, 1:10,

1:20....1:100. Повишенията на флуоресцентните интензивности на серията багрила са

сравнявани при съотношение багрило-базови двойки 1:100 (Таблица 7).

Таблица 7. Спектрални данни за багрила С1-С8 в разтвори на ТРИС буфер в свободно състояние и след свързване с двДНК при постоянна багрила концентрация 1х10-7М

ТРИС буфер

ТРИС буфер + двДНК

багрило

λabs [nm]

λabs[nm] λem [nm]

собствена флуоресценция в буфер (I0)

[a.u.]

флуоресценция на комплекса

багрило/двДНК (IF) [a.u.]

IF / I0

С1 500 508 529 2.5 345 138

С2 501 510 530 4.99 670 134

С3 498 506 528 3.7 498 135

С4 500 508 527 3.64 466 128

С5 497 508 527 0.91 265 291

41

С6 500 506 528 2.82 299 106

С7 498 506 527 3.18 460 145

С8 497 506 528 2.44 578 237

Стоксовите отмествания на багрилата в разтвори на ТРИС буфер са около 30 нм.

Като цяло багрилата показват по-ниска чувствителност при по-високи моларни

съотношения багрило-двойки бази. Най-силно изразено повишение на флуоресцентната

интензивност след свързване с двДНК се наблюдава за разтвора на багрило С5.

Предстоят допълнителни изследвания за модела на взаимодействие на багрилата с

уклеи

перименти за

на монокатионни и неутрални монометин цианинови

е върху околната среда и се избягват недостатъците на метода на

Brooke

н нови киселини.

2.4.3. Маркиране на живи клетки с багрила С1,С3,С4,С5 и С6

В „Лаборатория по имунопатология и експериментлна имунотерапия” към

Института по Микробиология, БАН наши колеги изследваха свойствата на някои от

багрилата С (С1, С3, С4, С5 и С6) за маркиране на живи клетки - перитонеални

макрофаги от мишка при концентрации 1х10-11М. Клетките са инкубирани за 15 мин и

резултатите са наблюдавани на флуоресцентен микроскоп [113]. С1 показва интензивно

оцветяване на ядрата на клетките, докато при багрило С3 се наблюдава оцветяване и на

цитоплазмата. С4 прониква в много ниска степен след 15 мин инкубиране и се

наблюдава слаба флуоресценция на макрофагите. Багрилата С5 и С6 също показват

селективно свързване в ядрата на клетките, като при С5 отношението сигнал/шум е по-

високо, което може да се отдаде на по-силната хидрофобност на структурата и по-

лесното преминаване през мембраните. Необходими са допълнителни екс

изследване свойствата на багрилата за количествено определяне на ДНК.

2.5. Получаване багрила N1-N16

Интересът към разразботването на нови щадящи околната среда синтетични

процедури и подобряването на известни методи за получаване на цианинови багрила и

полупродукти за тях, е сред приоритетите на нашата изследователска програма. Сред

методите за синтез на монометинцианини са известни няколко, при които е редуцирано

отрицателно влияни

r [109,149].

42

Разработената при получаването на багрила Е1-Е3 синтетична процедура за

монометинови багрила приложихме и за други хетероциклични съединения и

кватер

) кондензират в отсъствие

на разтворител и базичен агент до съответните багрилни структури (Метод А), което е

основната разлика с познатите в литературата методи [150].

нерни соли и доразвихме в нов метод за получаване на неутрални монометин

цианинови багрила.

Смес от кватернерни S-метилни соли и некватернизирани хетероциклени

съединения, притежаващи активна метилна група (Схема 33

Схема 33. Нова синтетична процедура за получаване на монометин цианинови багрила без разтворител (Метод А)

Директното нагряване на изходните продукти без разтворител съкращава

реакционното време, при което се намалява възможността за странични получаването

на неж

багрилото. Ето защо част от реакциите са проведени и в оцетен анхидрид (Метод Б) при

температури между 70 и 100С (Схема 34). Протичането на реакциите се следи с ТСХ.

елани крайни продукти [129,130, 143]. Багрилата са изолирани чрез прибавяне на

малко количество етанол и филтруване.

При по-детайлно проучване установихме, че този метод е подходящ, когато

едното от изходните вещества е в течно състояние или когато двете имат близки

температури на топене. Голяма разлика в температурите на топене води до частично

протичане на реакцията с нисък добив, поради разлагането на веществото с по-ниска

точка на топене, което в някои случаи е по-бързо от скороста на формиране на

43

Схема 34. Получаване на монометинцианинови багрила в оцетен анхидрид

без базичен агент (Метод Б)

Проведени са допълнителни експерименти за определяне на оптималния

температурен режим за провеждане на реакциите в оцетен анхидрид (Таблица 8). Не

може да се посочи температурна стойност подходяща за всички синтезирани структури,

но най-добри добиви се получават при провеждането на реакциите в интервала 70 -

100С. Нагряването на някои от багрилата до по-високи температури или при кипене в

анхидрида води до нежелани странични продукти, наблюдавани чрез ТСХ – най-

вероятно в резултат на автокондензационни процеси.

Използването на оцетен анхидрид за разтворител не променя значително

добивите на багрилата в сравнение с тези, получени чрез директно стапяне. При всички

случаи, реакционното време при Метод Б е по дълго, в сравнение с Метод А.

Структурите N получени по двете процедури могат да бъдат използвани като

изходни продукти за по-нататъшно кватернизиране с алкилни, заместени алкилни

алкиларилни, алкилхалогенни или други кватернизиращи агенти. Също така могат да

бъдат изолирани като неутрални форми чрез разтварянето им във водно-амонячен

разтвор и филтруване на депротонираните продукти.

По разработените от нас oпростени методи А и Б могат да бъдат получени и

монометинцианинови багрила, съдържащи оксазолопиридиниеви и

тиазолопиридиниеви остатъци при реакция на съответните кватернерни соли с 4-метил

съдържащи хетероцикли (Схема 35).

44

Схема 35. Получаване на багрила от серията N по процедура Б

При стапяне на 2-метилтиотиазолопиридин с кватернерен 4-метил хетероцикъл

и последваща обработка с воден амонячен разтвор се получават багрила в неутралната

им форма (Схема 36).

Схема

Схема 36. Получаване на багрила N15 и N16 по метод А

Реакционните времена и добивите на багрилата N1-N16 са обобщени в Таблица 8.

Синтезираните монометинови багрила N1-N16 могат да се използват в

неутралната им форма след обработване с амоняк или директно като изходни продукти

за синтез на нови багрила в присъствие на базичен агент и подходящ разтворител.

45

Таблица 8. Структури и експериментални условия за получаване на багрила N1-N16 по Метод А или Метод Б

багрило структура метод

реакционно време [min]

t oC добив

[%]

A 10 100 91 N1 N

S

CH

CH3CH3SO4

NH

Б 20 90 79

A 40 55-60 63 N2 N

O

CH

CH3ClO4

NH

Б 20 60 79

A не е изолиран продукт N3 N

S

CH

CH3CH3SO4

NH

Cl

Б 15 70 95

A не е изолиран продукт N4

N N

S

CH

CH3

Cl

I

NH

Б 20 90 49

N5 N N

O

CH

CH3 CH3SO4

NH

Б 60 90 37

A не е изолиран продукт N6 N

S

CH

CH3CH3SO4

NH

Cl

Б

20 90 93

N7

N N

S

CH

CH3

Cl

I

NH

Б 25 70 21

N8 N N

O

CH

CH3 ClO4

NH

Б 60 80 33

N9 N

S

CH

CH3I

NHN

Б 25 80 41

46

A не е изолиран продукт N10 N N

O

CH NHN

C2H5ClO4

Б 60 110 43

A 10 100 57 N11

N

S

CH3

NH

N

I

N

CH3

Б 25 70 45

N12

Б 25 110 49

N13

Б 20 110 34

N14

N N

S

CH

CH3

H3C

NHN

CH3SO4

A 10 100 52

N15 N N

SCH N CH3

Cl

A 25 120 64

N16

N N

SCH N CH3

Cl

A 15 90 57

47

V. Изводи

1. Синтезирани са общо 136 съединения - несиметрични монометинцианинови

багрила и полупродукти за тях, от които 76 нови съединения, неописани до сега в

литературата.

2. Чрез оптимизация на реакционните условия на известни синтетични

процедури и разработване на подобрени такива са получени голям брой кватернерни

хетероциклични соли – бензазолиеви, оксазоло(тиазоло)пиридиниеви, хинолиниеви,

пиридиниеви и пиримидиниеви (3, 3а-3c, 3l, 3m, 4f, 4i, 4m, 4n, 5b-5e), необходими за

синтеза на описаните в дисертационната работа цианинови багрила.

3. Разработена е нова процедура за получаване на 1,3-тиа(окса)золопиридин-2-

тиоли чрез микровълново облъчване в среда от „зелени” разтворители - ПЕГ или

глицерол, с кратки реакционни времена и високи добиви на продуктите.

4. Значително е подобрена известна процедура за получаване на S-метилни

производни на хетероциклични тиоли с използване на ултразвуково облъчване при

стайна температура като многократно са съкратени реакционните времена.

5. Разработени са две нови синтетични процедури за получаване на

несиметрични монометин цианинови багрила, при които не се използва базичен агент и

единият от изходните хетероцикли не е кватернизиран (багрила Е1-Е3 и N1-N16),

които са приложени за голям набор от полупродукти. Чрез двете процедури могат да се

получават разнообразни неутрални монометинцианинови багрила, които да се

кватернизират допълнително (багрила Е4-Е13) или да се използват в непротонираната

им форма. Методът превъзхожда известните до сега процедури за получаване на такива

багрила, както по времетраене, така и по възможността за използване на разнообразни

изходни съединения.

6. Синтезирани са четири серии (общо 54) нови неописани в литературата

несиметрични монометинцианинови багрила (D1-D17, E1-E13, C1-C8, A1-A16),

съдържащи бензотиазолови, заместени бензотиазолови, оксазоло- и заместени

тиазолопиридиниеви хетероцикли и хинолиниеви, хиназолиниеви, пиридиниеви и

пиримидиниеви крайни групи.

48

7. Определено е влиянието на бензоиламино заместителите в бензотиазоловия

остатък на багрилата от серията D върху модела на свързване с двДНК. 11 от

структурите D са интеркалатори, за останалите са необходими допълнителни

изследвания. Най-високи флуоресцентни интензивности на комплексите на багрилата с

нуклеинова киселина са получени за бензилзаместените в хинолиновия хетероцикъл

съединения.

8. За някои от багрилата от серията Е е установена зависимост между дължината

на алкиловия заместител в хиназолиновия остатък и флуоресцентната интензивностна

комплекса им с двДНК. Най-висока флуоресценция в присъствие на двойноверижна

нуклеинова киселина показва бутилзаместеното производно.

9. За багрила от серията А не се установява значително увеличаване на

флуоресцентната интензивност в присъствие на двДНК, при въвеждане на

пиримидинов заместител в структурата.

10. Във връзка с получаване на нови багрила с по-хидрофобна структура за

маркиране на живи клетки е разработена е серия хлорсъдържащи аналози на Тиазолово

оранжево (С1-С8). Багрилата са изследвани за маркиране на спленоцити в лаборатория

на ИМикБ-БАН като за 3 от структурите е установено селективно маркиране на

нуклеиновите киселини в ядрата на живите клетки.

11. След направени първоначални изследвания със стандартни нуклеинови

киселини в разтвори, за голяма част от багрилата е установено многократно нарастване

на флуоресцентната интензивност на комплекса с нуклеиновата киселина. Това заедно

с допълнителните изследвания на част от багрилата върху модела на свързването им с

двДНК и свързващите константи демонстрира, че те могат успешно да се използват в

практиката като нековалентни флуорогенни маркери (серии D1-D17, C1-C8).

49

VI. ЛИТЕРАТУРА

[1] PB Oldham, ME McCarroll, LB McGown, IM Warner, Anal. Chem. 72 (2000) 197R-209R.

[2] MST Goncalves, Chem. Rev. 109 (2009) 190-212.

[3] J Wilhelm, A Pingoud, Chembiochem 7 (2003) 1120-1228.

[4] S Mocellini, CR Rossi, FM Marincola, Arch. Immunol. Ther. Exp 51 (2003) 301-313.

[5] W King, J Proffitt, L Morrison, J Piper, D Lane, S Seelig, Mol. Diagn. 5 (2000) 309-319.

[6] DE Wolf, Methods Cell Biol. 72 (2003) 157-184.

[7] MG Macey, Flow Cytometry – Principles and Applications, 2007 Humana Press Inc., Totowa, New Jersey.

[8] HM Shapiro, Practical Flowcytometry, 2003, John Whiley & Sons Inc., Hoboken, New Jersey.

[9] HW Vogel, Ber. Dtsch. Chem. Ges. (1875) 1635-1636.

[10] JM Lanzafame, AA Muenter, DV Brumbaugh, Chem. Phys. 210 (1996) 79-89.

[11] R Steiger, H Heidiger, P Junod, H Kuhn, D Mobius, Photogr. Sci. Eng. 24 (1980) 185–195.

[12] MRV Sahyun, DK Sharma, N Serpone, J. Imaging Sci. Tech. 39 (1995) 377–385.

[13] J Arden, G Deltau, V Huth, U Kringel, D Peros, KH Drexhage, J. Lumines. 48-9 (1991) 352-358.

[14] JM Lanzafame, L Min, RJD Miller, AA Muenter, BA Parkinson, Mol. Cryst. Liq. Cryst. 194 (1991) 287-

292.

[15] A Ehret, L Stuhl, MT Spitler, J. Phys. Chem. B 105 (2001) 9960–9965.

[16] XM Ма, JL Hua, WJ Wu, YH Jin, FS Meng, WH Zhan, H Tian, Tetrahedron 64 (2008) 345–350.

[17] AJ Koning, PY Lum, JM Williams, R Wright, Cell Motil. Cytoskel. 25 (1993) 111–128.

[18] M Poot, F Mao, US 6291203 (2001).

[19] SM Yarmoluk, VB Kovalska, IA Kocheshev, Dyes Pigm. 50 (2001) 21–28.

[20] L Lee, WO 9717471 (1997).

[21] X Qiao, L Wang, J Ma, Q Deng, Z Liang, L Zhang, X Peng, Y Zhang, Anal. Chim. Acta 640 (2009) 114–

120.

[22] A Waggoner, J. Membrane Biol. 27 (1976) 317–334.

[23] N Nakashima, T Kunitake, J. Am. Chem. Soc. 104 (1982) 4261-4262.

[24] ML Greenberg, D Axelrod, J. Membrane Biol. 131 (1993) 115–127.

[25] MG Honig, RI Hume, Trends Neurosci. 12 (1989) 333–341.

[26] DE Graves, LM Velea, Curr. Org. Chem. 4 (2000) 915-929.

[27] EC Long, JK Barton, Accounts Chem. Res. 23 (1990) 271-273.

[28] KE Reinert, J. Biomol. Struct. Dyn. 9 (1991) 331-352.

[29] MR Mattern, DJ Kerrigan, Y Pommier, Pharmacol. Ther. 34 (1987) 303-319.

[30] MV Keck, SJ Lippard, J. Am. Chem. Soc. 114 (1992) 3386-3390.

[31] GL Cohen, WR Bauer, JK Barton, SJ Lippard, Science 203 (1979) 1014-1016.

[32] LS Lerman, J. Mol. Biol. 3 (1961) 18-30.

[33] DS Goodsell, RE Dickerson, Nucleic Acids Res. 22 (1994) 5497-5503.

[34] AS Zasedatelev, FEBS Lett. 281 (1991) 209-211.

[35] SM Yarmoluk, VB Kovalska, SS Lukashov, YL Slominskii, Bioorg. Med. Chem. Lett. 9 (1999b) 1677-

1678.

50

[36] SM Yarmoluk, MY Losytskyy, VM Yashchuk, J. Photochem. Photobiol. B 67 (2002) 57-63.

[37] BA Armitage, Top. Curr. Chem. 253 (2005) 55–76.

[38] RP Haugland, Handbook of Fluorescent Probes and Research Chemicals, 9-th Ed. Molecular Probes, Inc.,

Eugene, OR, (2002).

[39] SM Yarmoluk, VB Kovalska, TV Smirnova, MP Shandura, YP Kovtun, GK Matuska, Biopolym. Cell 12

(1996) 74-81. [40] GT Hirons, JJ Fawcett, HA Crissman, Cytometry 15 (1994) 129–140.

[41] HS Rye, S Yue, DE Wemmer, MA Quesada, RP Haugland, RA Mathies, AN Glazer, Nucleic Acids Res. 20

(1992) 2803–2812.

[42] SM Yarmoluk, VB Kovalska, IA Kocheshev, Dyes Pigm. 50 (2001) 21-28.

[43] SM Yarmoluk, DV Kryvorotenko, AO Balanda, MY Losytskyy, VB Kovalska, Dyes Pigm. 51 (2001) 41-

49.

[44] AL Mikheikin, AL Zhuze, AS Zasedatelev, J. Biomol. Struct. Dyn. 18 (2000) 59–72.

[45] Herz, Adv. Colloid Interfac. 8 (1977) 237–298.

[46] PJ Sims, AS Waggoner, CH Wang, JF Hoffman, Biochemistry 13 (1974) 3315–3330.

[47] W West, S Pearce, J. Phys. Chem. 69 (1965) 1894–1903.

[48] WJ Harrison, DL Mateer, GJT Tiddy, J. Phys. Chem. 100 (1996) 2310–2321

[49] A Mishra, RK Behera, PK Behera, BK Mishra, GB Behera, Chem. Rev. 100 (2000) 1973–2011.

[50] R Smith, SJ O’Connor, P Coish, D Lowe, RB Clark, J Stebbins, AM Campbell, C Akuche, T Shebkhin,

PCT Int. Appl. 044775 (2006).

[51] K Davidkov, D Simov, Khim. Geterotsikl. Soedin. 5 (1981) 608-610.

[52] AL Goodman, US Pat 3895025 (1975).

[53] ML Wang, BL Liu, J. Chin. Inst. Chem. Eng. 38 (2007) 161-167.

[54] R Handte, L Willms, E Blume, US Pat 4431813 (1984).

[55] R Handte, J Sander, T Tammer, US Pat 4442294 (1984).

[56] L Zhu, M Zhang, M Dai, J. Heterocyclic Chem. 42 (2005) 727-730.

[57] NC Chaudhuri, Synth. Commun. 26 (1996) 3783-3790.

[58] J Easmon, G Heinisch, J Hofmann, T Langer, HH Grunicke, J Fink, G Pürstinger, Eur. J. Med. Chem. 32

(1997) 397-408.

[59] M Leymarie-Beljean, M Pays, JC Richer, J. Heterocyclic Chem. 17 (1980) 1175-1179.

[60] H Thakuira, G Das, ARKIVOC xv (2008) 321-325.

[61] W Huang, Y Tan, MW Ding, GF Yang, Synth. Commun. 37 (2007) 369-376.

[62] M Doise, D Blondeau, H Sliwa, Synth. Commun. 22 (1992) 2891-2901.

[63] TG Deligeorgiev, SS Kaloyanova, NY Lesev, JJ Vaquero, Monatsh. Chem. 142 (2011) 1-6.

[64] J Chen, SK Spear, JG Huddleston, RD Rogers, Green Chem. 7 (2005) 64-82.

[65] Kendаll, BP 425609 (1933)

[66] N Leonard, D Curtin, J. Org. Chem. 2 (1946) 349-352.

[67] FR Alexandre, A Berecibar, A Besson, Tetrahedtron Lett. 43 (2002) 3911-3913.

[68] S Niementowski, J. Prakt. Chem. 51 (1895) 564-572.

[69] FR Alexandre, A Berecibar, A Besson, T. Tetrahedtron 59 (2003) 1413-1419.

[70] WR Sherman, EC Taylor, Org. Synth. 4 (1963) 246-252.

51

[71] GW Kenner, B Lythgoe, AR Todd, A. Topham, J. Chem. Soc. (1943) 388-390.

[72] DM Burgess, J. Org. Chem. 21 (1956) 97-101.

[73] ES Taylor, A McKillop, Adv. Org. Chem. 7 (1970) 79-.

[74] M. Movassaghi, MD Hill, J. Am. Chem. Soc. 128 (2006) 14254-14255.

[75] H. Wamhoff, Adv. Heterocycl. Chem. 38 (1985) 29-.

[76] S Tyagarajan, PK Chakravarty, Tetrahedron Lett. 46 (2005) 7889-7891

[77] S Goswami, S Jana, S Dey, AK Adak, Aust J Chem 60 (2007) 120-123.

[78] RR Hunt, JE McOmie, ER Sayer, J. Chem. Soc. (1959) 525-530.

[79] Y Hu, ZC Chen, ZG Le, QG Zheng, Synth.Commun. 34 (2004) 2039-2046.

[80] A Duarte, W Cunico, CMP Pereira, AFC Flores, RA Freitag, Ultrason. Sonochem. 17 (2010) 281-283.

[81] ML Wang, YC Liu, J. Chin. Inst. Chem. Engrs. 39 (2008) 587-595.

[82] HP Narkhede, UB More, DS Dalal, PP Mahulikar, J. Sci. Ind. Res. 67 (2008) 374-376.

[83] HM Meshram, BC Reddy, PR Goud, Synth. Commun. 39 (2009) 2297-2303.

[84] J Easmon, G Heinisch, J Hofmann, T Langer, HH Grunicke, J Frink, G Purstinger, Eur. J. Med. Chem. 32

(1997) 397-408.

[85] M Yamato, Y Takeuchi, K Hashigaki, T Hirota, Chem. Pharm. Bull. 31 (1983) 733-736.

[86] X Fei, Y Gu, Y Ban, Z Liu, B Zhang, Bioorg. Med. Chem. 17 (2009) 585-591.

[87] E Sidóová, D Loos, H Bujdáková, J Kallová, Molecules 2 (1997) 36-42.

[88] W Huang, GF Yang, Bioorg. Med. Chem. 14 (2006) 8280-8285.

[89] JM Gardiner, CR Loyns, Tetrahedron 51 (1995) 11515-11530.

[90] A Harizi, A Romdhane, Z Mighri, Tetrahedron Lett. 41 (2000) 5833-5838.

[91] HP Narkhede, UB More, DS Dalai, NS Pawar, DH More, PP Mahulikar, Synth. Commun. 37 (2007) 573-

577.

[92] JJ D’Amico, L Suba, PG Ruminski, J. Heterocyclic Chem. 23 (1986) 1629-1635.

[93] AF Halasa, GEP Smith, J. Org. Chem. 36 (1971) 636-641.

[94] Y Postovskii, NN Vereshchagina, Chem. Heterocycl. Comp. 1 (1966) 418-420.

[95] LM Lizunova, NK Rozhkova, Uzb. Khim. Zh. 13 (1969) 24-26.

[96] BR Rani, UT Bhalerao, MF Rahman, Synth. Commun. 20 (1990) 3045-3052.

[97] NA Aliev, MG Levkovich, EL Kristallovich, ND Abdullaev, VG Kartsev, Khim. Geterotsikl. Soedin. 1

(1999) 87-89.

[98] TG Deligeorgiev , SS Kaloyanova, NY Lesev, JJ Vaquero, Ultrasonics. Sonochem. 17 (2010) 783–788.

[99] F Hamer, The Chemistry of Heterocyclic Compounds. In The Cyanine Dyes and Related Compounds, A

Weissberger, , Ed.; Interscience Publishers: New York (1974) Vol. 18.

[100] D Sturmer, D Heseltine, The Theory of the Photographic Process. In Sensitizing and Desensitizing Dyes,

James, T., Ed., Macmillan Co.: New York (1977) 194-234.

[101] ON Chupahin VM Balakin, ZU Kokoshko. Khim. Geterocycl. Soedin., 5 (1968) 859-862.

[102] E Kleinpeter, R Borsdorf, F Dietz, J. Prakt. Chem. 315 (1973) 600-610.

[103] PF Gordon, P Gregory, Organic chemisty in colour, Springer-Verlag (1983).

[104] M Panigrahi, S Dash, S Patel, BK Mishra, Tetrahedron 68 (2012) 781-805.

[105] SI Shul’ga, VA Chuiguk, Ukr. Khim. Zh. 39(11) (1973) 1151-1155.

52

[106] SI Shul’ga, VA Chuiguk, Ukr. Khim. Zh. 36 (1970) 483-485.

[107] AM Khmaruk, YM Volovenko, VA Chuiguk, Ukr. Khim. Zh. 38(3) (1972) 262-264.

[108] VA Chuiguk, YM Volovenko, Khim. Geterotskl. Soedin. 11 (1975) 530-532.

[109] TG Deligeorgiev, DA Zaneva, HE Katerinopoulos, VN Kolev, Dies Pigm. (1999) 41-49.

[110] RP Haugland, ST Yue, WO 0066664 (2000).

[111] AA Vasilev, TT Deligeorgiev, N Gadjev, KH Drexhage, Dyes Pigm. 66 (2005) 135-142.

[112] HS Rye, MA Quesada, K Peck, RA Mathies,. A.N.Glazer, Nucleic Acids Res. 19(2) (1991) 327-333.

[113] TG Deligeorgiev, AA Vasilev, KH Drexhage, Dyes Pigm. 73 (2007) 69-75.

[114] S Kaloyanova, I Ivanova, A Tchorbanov, P Dimitrova, T Deligeorgiev, J. Photochem. Photobiol. B

103 (2011) 215–221.

[115] LGS Brooker, GH Keyes, WW Williams, J. Am. Chem. Soc. 64 (1942) 199-210.

[116] Kendall, BP 425609 (1933).

[117] A Byford, P Goadby, M Hooper, HV Kamath, SN Kulkarani, Ind. J. Chem. 24 (1988) 396-397.

[118] RA Alzogaray, A Fontan, F Camps, H Masuh, P Santo Orihuela, D Fernandes, A Cork, E Zebra,

Molecules 10 (2005) 1190-1196.

[119] DI Haddlesey, PA Mayor, SS Szinai, J. Chem. Soc. (1964) 5269-5274.

[120] JM Bruce, J. Chem. Soc. (1959) 2366-2370.

[121] R Stoermer, H Fincke, Ber. Dtsch. Chem. Ges. 42 (1909) 3115-3122.

[122] H Estreicher, US 4564383 (1986).

[123] BS Jaewook Nam, PhD Thesis (1998).

[124] AE Tschitschibabin J. Russ. Phys. Chem. Soc. 50 (1920) 492-494.

[125] AD Dunn, A Currie, LE Hayes, J. Prakt. Chem. 331(3) (1989) 369-544.

[126] A Pinner, Ber. Dtsch. Chem. Ges. 22 (1889) 1612-1635.

[127] RAB Bannard, AA Casselman, WF Cockburn, GM Brown, Can. J. Chem. 36 (1958) 1541-1549.

[128] AF Crowther, EH Paterson, BP 969851 (1961).

[129] B Beilenson, FM Hamer, J. Chem. Soc. (1939)143-151.

[130] WA Sexton, J. Chem. Soc. (1939) 470-473.

[131] TG Deligeorgiev, AA Vasilev, TT Tsvetkova, KH Drexhage, Dyes Pigm. 75 (2007) 658-663.

[132] TG Deligeorgiev, N Gadjev, AA Vasilev, KH Drexhage, SM Yarmoluk, Dyes Pigm. 70 (2006) 185-191.

[133] SM Yarmoluk, VB Kovalska, MY Losytskyy, Biotech. Histochem. 83(3) (2008) 1-15.

[134] SK Kaloyanova, V Trusova, G Gorbenko, T Deligeorgiev, J. Photochem. Photobiol. A 217 (2011) 147-

156.

[135] BA Armitage, Top. Curr. Chem. 253 (2005) 55–76.

[136] B Valeur, Molecular Fluorescence. Principles and Applications, Wiley-VCH, 328 New York (2002).

[137] H Ihmels, D Otto, Top. Curr. Chem. 258 (2005) 161-204.

[138] T. Deligeorgiev, S Kaloyanova, A Vasilev, Dyes Pigm, 90 (2011) 170-176.

[139] HP Josel., D Heindl, B Irlinger, C Weilke, (Roche Diagnostics GMBH) WO 2008052742 A1 (2008).

[140] G Lee, D Mize, US Pat 4937198 (1990).

[141] CT Wittwer, G Reed, V Dujols, L Zhou, US Pat 20100041044 (2010).

[142] ST Yue, (Molecular Probes, Inc.) US Pat 5656449 (1997).

53

[143] FM Hamer. The cyanine dyes and related compounds. New York: Interscience;

(1964) 58-59.

[144] T Deligeorgiev, I Timtcheva, V Maximova, N Gadjev, A Vasilev, JP Jacobsen, K-H Drexhage, Dyes

Pigm. 61 (2004) 79-84.

[145] DJ Fry, JD Kendall, AJ Morgan, J. Chem. Soc. (1960) 2062-5072.

[146] VB Kovalska, VP Tokar, MY Losytskyy, T Deligeorgiev, A Vassilev, N Gadjev, KH Drexhage, SM

Yarmoluk, J. Biochem. Biophys. Methods 68 (2006) 155-165.

[147] S Kaloyanova, I Crnolatac, N Lesev, I Piantanida, T Deligeorgiev, Dyes Pigm 92 (2012) 1184-1191.

[148] LGS Brooker, GH Keyes, J. Am. Chem. Soc. 57 (1935) 2488-2492.

[149] TG Deligeorgiev, NI Gadjev, KH Drexhage, RW Sabnis, Dye Pigm. 29 (1995) 315-322.

[150] A Mishra, RK Behera, PK Behera, BK Mishra, GB Behera, Chem. Rev. 100 (2000) 1973–2011.

54

55

VII. Списък на публикациите по темата на дисертацията

1. S. Kaloyanova, V.M. Trusova, G.P. Gorbenko, T.G. Deligeorgiev, “Synthesis and

fluorescence characteristics of novel asymmetric cyanine dyes for DNA detection”

J. Photochem. Photobiol. A, 217 (2011) 147–156.

2. T. Deligeorgiev, S. Kaloyanova, A. Vasilev, A novel general method for

preparation of neutral monomethine cyanine dyes, Dyes Pigments, 90 (2011) 170-

176.

3. S. Kaloyanova, I. Ivanova, A. Tchorbanov, P. Dimitrova, T. Deligeorgiev,

“Synthesis of chloro-substituted analogs of Thiazole Orange - fluorophores for

flow cytometric analyses”, J. Photochem. Photobiol. B, 103 (2011) 215–221.

4. S. Kaloyanova, I. Crnolatac, N. Lesev, I. Piantanida, T.Deligeorgiev, Synthesis

and study of nucleic acids interactions of novel monomethine cyanine dyes, Dyes

Pigments 92 (2012) 1184-1191.