Ανάλυση Μοριακών Τεχνικών Γενετικής και...

Ανάλυση Μοριακών Τεχνικών Γενετικής και Βιοτεχνολογίας

Ε.Κ.Π.Α. Βιολογίας_Τομέας Βοτανικής_Κοσμάς Χαραλαμπίδης

Αντιγραφή – Μεταγραφή – Μετάφραση (Central Dogma)

Central Dogma

Prokaryotes Eukaryotes

Replication (bp per sec) 1000 35-50

Transcription(bp per sec) 40-80 20-50

Translation (aa per sec) 20 10-20


DNA pellet

Total DNA

Total RNA

Απομόνωση DNA και RNA από βιολογικά δείγματα

DNA


http://www.jeremiahstokely.com/Gar Flower Web Blue Violet.JPG

Exons vs. Introns…


The hnRNA runs 5' 3' from the top left to lower right, where transcription terminates. [Right] Upon recognition of the AAUAAA signal and the e.g. GGUUUGUUGGUU signal, the 3' end is removed by an enzyme complex [CFI, II] at the cut site. Another enzyme complex [PA] synthesizes a poly(A) tail and ligates it to the free 3' of the pre-message.

mRNA processing (CAP & polyA)


Alternative polyadenylation

1. The poly(A) tail is important for the nuclear export, translation, and stability of mRNA.

2. The tail is shortened over time, and, when it is short enough, the mRNA is enzymatically degraded.

3. In a few cell types, mRNAs with short tails are stored for later activation by re-polyA in the cytosol.

4. In contrast, when polyadenylation occurs in bacteria, it promotes RNA degradation.

5. Polyadenylation also promotes sometimes degradation of non-coding RNAs in eukaryotic cells.


Τεχνικές στη Μοριακή Βιολογία και Βιοτεχνολογία

Η αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης (PCR)

Κατασκευή βιβλιοθηκών γονιδιωματικού υλικού

Δημιουργία διαγονιδιακών φυτών (GMPs)

Τεχνολογία ανασυνδυασμένου DNA


Επιλογή μπλε-άσπρων αποικιών


Κατασκευή γονιδιωματικής βιβλιοθήκης

Γονιδιωματική βιβλιοθήκη σε βακτήρια

Εισαγωγή πλασμιδίων σε βακτήρια

Ανασυνδυασμένα πλασμίδια

Εκατομμύρια τμήματα γονιδιωματικού DNA

Πέψη του DNA με περιοριστική

ενδονουκλεάση

Γονιδιωματική βιβλιοθήκη σε βακτηριοφάγους

Πλάκες ή αποικίες

Ζωϊκό ή φυτικό DNA

Ανασυνδυασμένοι βακτηριοφάγοι


Κατασκευή γονιδιωματικής βιβλιοθήκης σε φάγους


Κατασκευή cDNA βιβλιοθήκης

cDNA βιβλιοθήκη σε βακτήρια

Εισαγωγή πλασμιδίων σε βακτήρια

Ανασυνδυασμένα πλασμίδια

Ανασυνδυασμένοι βακτηριοφάγοι

cDNA βιβλιοθήκη σε βακτηριοφάγους

Υβριδοποίηση του πρωταρχικού τμήματος (εκκινητή)

Πέψη με τη νουκλεάση S1

Σύνθεση της συμπληρωματικής αλυσίδας με ανάστροφη μεταγραφάση

Πέψη με RNaseH για την απομάκρυνση της RNA αλυσίδας

Σύνθεση της δεύτερης αλυσίδας με το Klenow fragment της DNA πολυμεράσης I

AscI

AscI

AscI

AscI AscI

AscI AscI

NotI NotI


Διαφορές μεταξύ γονιδιωματικής και cDNA βιβλιοθήκης

Όλο το γονιδίωμα Ρυθμιστικές περιοχές Τμήματα που δεν κωδικοποιούν Γονίδια που δεν εκφράζονται

Μόνο τα γονίδια που εκφράζονται Άνιση αντιπροσώπευση κλώνων Απουσία ρυθμιστικών περιοχών Έκφραση σε βακτήρια και ζύμες


Η τεχνική της PCR

Kary Mullis 1983 - Nobel Price Chemistry 1993


Η τεχνική της PCR

dH2O Ρυθμιστικό διάλυμα Μήτρα DNA (δείγμα) Πρωταρχικά τμήματα PPP-νουκλεοτίδια Ιόντα Mg++ DNA πολυμεράση

PCR

Ενίσχυση του επιθυμητού τμήματος σε >1.000.000.000 αντίγραφα…


1. Μελέτη της γονιδιακής έκφρασης και λειτουργίας

2. Κλωνοποίηση τμημάτων DNA και γονιδίων

3. Ανίχνευση μολυσμένων με παθογόνα δειγμάτων

4. Εγκληματολογία και ταυτοποίηση πατρότητας

5. Ανίχνευση διαγονιδικών φυτών/προϊόντων

Η χρήση της τεχνικής PCR στη Μοριακή Βιολογία


Η χρήση της PCR στην ανίχνευση μολυσμένων ατόμων

HIV or H1N1 particles


Χρήση της VNTRs-PCR τεχνικής στην εγκληματολογία

VNTR: διαδοχικές επαναλήψεις ποικίλου αριθμού (variable number tandem repeats)


Ενίσχυση με PCR τριών διαφορετικών περιοχών για τη δημιουργία του DNA αποτυπώματος

VNTR: variable number tandem repeats

Probability of two persons

1 VNTR (10 alleles) = 1:65

4 VNTRs (10 alleles) > 1: 18.000.000

5 VNTRs (10 alleles) > 1: 1.000.000.000

Paternity = 1/10.000 (99,9%)

Guilt = 1/10.000.000

Χρήση της VNTR-PCR τεχνικής στην εγκληματολογία / τεστ πατρότητας


Χρήση της VNTR-PCR τεχνικής στην εγκληματολογία


Detecting GMPs


Agrobacterium Biolistics


Biolistic plant transformation methods


Agrobacterium tumefaciens


The Galls Can Be Huge

Gall on stem

Gall on leaf


VirD2

As

EDF

ΒΑ

G

VirG

VirA

LB

RB

T-DNA

Χρωμοσωμικό DNA

Ti-πλασμίδιο


Χημειόταξη

Δικοτυλήδονο φυτικόκύτταρο εκκρίνει

φαινολικά παράγωγαμετά από

τραυματισμό

Αντιγραφή καιμεταφορά του

T-DNA

Εγκοπή στο LB συνοριακό

Σύνθεση νέαςΤ-DNA αλυσίδας

Απελευθέρωσημονόκλωνης

αλυσίδας T-DNA

T-DNA

Πυρήναςφυτικού

κυττάρου


VirG

VirA

LB

RB


ΠροσκόλλησηAgrobacterium στην

επιφάνεια τουφυτικού κυττάρουVirD

Α

Γ

Β

virAs

As

As

As

As

As

As

As

As

As

As

As

As

As

As

As

VirΕ2

VirF VirB/D4 κανάλι

EDF

ΒΑ

GC

C

VirD2

As

EDF

ΒΑ

G

VirG

VirA

LB

RB

T-DNA









T-DNA





T-DNA


κυττάρου


VirG

VirA

LB

RB




Α

Γ

Β

virAs

As

As

As

As

As

As

As

As

As

As

As

As

As

As

As

VirΕ2

VirF VirB/D4 κανάλι

VirD2VirD2

AsAsAs

EDF

ΒΑ

G

VirG

VirA

LB

RB

T-DNA









T-DNA





T-DNA


κυττάρου


VirG

VirA

LB

RB




Α

Γ

Β

virAsAsAs

AsAsAs

AsAsAs

AsAsAs

AsAsAs

AsAsAs

AsAsAs

AsAsAs

AsAsAs

AsAsAs

AsAsAs

AsAsAs

AsAsAs

AsAsAs

AsAsAs

AsAsAs

VirΕ2

VirF VirB/D4 κανάλιVirB/D4 κανάλι

EDF

ΒΑ

GC

EDF

ΒΑ

GC

C


mediated transformation


Agrobacterium tumefaciens mediated tranformation

1


Selection and plant regeneration by tissue culture


Ευχαριστώ


Ανάλυση Μοριακών Τεχνικών Γενετικής και...

Documents