factori transcriptionali

32
Stresul oxidativ şi Stresul oxidativ şi controlul expresiei controlul expresiei genice genice Factori Factori transcripţionali transcripţionali redox-sensibili redox-sensibili

Upload: laura-laury

Post on 21-Dec-2015

282 views

Category:

Documents


6 download

DESCRIPTION

Stresul oxidativ

TRANSCRIPT

Page 1: FACTORI TRANSCRIPTIONALI

Stresul oxidativ şi controlul Stresul oxidativ şi controlul expresiei geniceexpresiei genice

Factori transcripţionali Factori transcripţionali

redox-sensibiliredox-sensibili

Page 2: FACTORI TRANSCRIPTIONALI

Răspunsurile celulare induse de Răspunsurile celulare induse de stresul oxidativstresul oxidativ

– Modularea transcrierii– Modularea mecanismelor de transport ionic– Modularea acţiunii factorilor de creştere, citokinelor şi

hormonilor– Neuromodularea– Iniţierea apoptozei

Modificările majore corelate cu redoxul celular constau în schimbări ale statusului grupărilor –SH.

Cys-SH Cys-SH Cys-SOH Cys-SOH Cys-SO Cys-SO22H H Cys-SO Cys-SO33HH sulfhidril acid sulfenic acid sulfinic acid sulfonic

Cys-SH Cys-SH + + Cys-SHCys-SH Cys-S-S-Cys Cys-S-S-Cys sulfhidril disulfură

Page 3: FACTORI TRANSCRIPTIONALI

Factori transcripţionali redox-sensibili Factori transcripţionali redox-sensibili de la procariotede la procariote

• La PK expresia genică în condiţii de stres oxidativ este reglată de doi factori transcripţionali: OxyROxyR (activat de peroxidul de hidrogen) şi SoxR/SSoxR/S (activat de anionii superoxid)

• Factorul OxyRFactorul OxyR controlează genele oxyR ce codifică o serie de enzime de protecţie: catalaza şi alchilhidroperoxid reductaza.

• Activarea transcrierii este determinată de o modificare conformaţională a proteinei OxyR, care este determinată la rândul ei de oxidarea directă a unui rest de cisteină (Cys199) din situsul redox activ.

• Această modificare conformaţională are ca efect transmiterea directă a semnalului generat de stresul oxidativ către ARN polimerază.

Page 4: FACTORI TRANSCRIPTIONALI

Factorul Factorul transcriptranscripţional OxyRţional OxyR

Page 5: FACTORI TRANSCRIPTIONALI

Factorii transcripţionali SoxR şi SoxSFactorii transcripţionali SoxR şi SoxS

• Controlează expresia a nouă proteine inductibile în prezenţa anionilor superoxid (ex. Mn-SOD)

• Ca răspuns la o concentraţie crescută de superoxid, factorul SoxR activează transcrierea genei soxS, şi implicit sinteza proteinei SoxS.

• La rîndul ei, proteina SoxS induce transcrierea celor 9 gene ţintă.

• Proteina SoxR funcţionează ca senzor pentru superoxid. Ea există în 2 forme: apo-SoxR şi Fe-SoxR, dintre care numai ultima este capabilă să activeze transcrierea.

• Fe-SoxR prezintă un cluster fier-sulf /situsul redox-sensibil) care se modifică în prezenţa anionilor superoxid; acestă modificare determină a o schimbarea a promotorului genei soxS şi implicit activarea transcrierii.

Page 6: FACTORI TRANSCRIPTIONALI

Factorii transcripţionali SoxR şi SoxSFactorii transcripţionali SoxR şi SoxS

Page 7: FACTORI TRANSCRIPTIONALI

Factorii transcripţionali redox-sensibili de Factorii transcripţionali redox-sensibili de la eucariotele superioare: NF-kB şi AP-1la eucariotele superioare: NF-kB şi AP-1

• Mecanismele prin care celulele EK detectează redoxul celular şi răspund la modificările acestuia sunt mult mai complexe şi mai subtile comparativ cu mecanismele de la PK.

Page 8: FACTORI TRANSCRIPTIONALI

Factorul transcripţional NF-kB Factorul transcripţional NF-kB (nuclear factor kB)(nuclear factor kB)

NF-kB (nuclear factor kappa-light-chain-enhancer of activated B cells)

• NF-kB a fost descoperit de către Baltimore şi Sen. Denumirea provine de la faptul că iniţial a fost identificat ca o proteină nucleară specifică limfocitelor B, ce se leagă de regiunea enhancer a genei pentru lanţul imunoglobulinic uşor k.

David L. BaltimorePremiul Nobel pentru Fiziologie si Medicina

Sen R, Baltimore D. Inducibility of kappa immunoglobulin enhancer-binding protein Nf-kappa B by a posttranslational mechanism. Cell. 1986 Dec 26;47(6):921–928.

Page 9: FACTORI TRANSCRIPTIONALI

Rolul NF-kBRolul NF-kB

• Deşi iniţial NF-kB a fost considerat un factor transcripţional specific celulelor B, ulterior a fost evidenţiat în numeroase alte tipuri de celule şi s-a demonstrat că acest factor transcripţional joacă un rol important în procesele inflamatorii, în răspunsul autoimun, în proliferarea celulară şi în apoptoză, reglând activitatea genelor implicate în aceste procese.

Page 10: FACTORI TRANSCRIPTIONALI

Gene reglate de NF-kBGene reglate de NF-kB

Page 11: FACTORI TRANSCRIPTIONALI

Structura NF-kBStructura NF-kB• Factorul nuclear kB în formă activă este un dimer alcătuit din două

subunităţi polipeptidice aparţinând unei familii de proteine înrudite structural.

• Până în prezent au fost identificaţi 5 membrii aparţinând acestei familii: – NF-kB1 (p50/p105) – NF-kB2 (p52/p100) – RelA (p65) – RelB – c-Rel.

• Aceste proteine pot forma homo- sau heterodimeri.• Forma “clasică” a factorului NF-kB este reprezentată de

heterodimerul p50/p65heterodimerul p50/p65. Această formă este prezentă în majoritatea tipurilor de celule.

Homodimer p50/p50

Page 12: FACTORI TRANSCRIPTIONALI

Familia de proteine NF-kB şi Familia de proteine NF-kB şi proteinele inhibitorii IkBproteinele inhibitorii IkB

Class Protein Aliases Gene

Class INF-κB1 p105 → p50 NFKB1

NF-κB2 p100 → p52 NFKB2

Class II

RelA p65 RELA

RelB RELB

c-Rel REL

Page 13: FACTORI TRANSCRIPTIONALI

Homo- şi heterodimerizarea Homo- şi heterodimerizarea membrilor familie Relmembrilor familie Rel

• Forma “clasică” a factorului NF-kB este reprezentată de heterodimerul p50/p65 heterodimerul p50/p65 (p50/RelA)(p50/RelA).

• Există şi alte combinaţii de structuri dimerice formate din membrii familiei de proteine Rel:– p50/RelB– p52/RelB– RelA/RelB– p50/p50

Structura complexului NF-kB (p50/p65) cu secvenţa sepecifică de ADN.

Page 14: FACTORI TRANSCRIPTIONALI

Factori inductori ai NF-kBFactori inductori ai NF-kB

Page 15: FACTORI TRANSCRIPTIONALI

Subunitatea inhibitorie IkBSubunitatea inhibitorie IkB

• Activitatea NF-kB este strâns controlată de interacţiunea cu o subunitate inhibitorie numită IkB.

• În prezent se cunosc mai multe tipuri de molecule inhibitorii: IkB, IkB, IkB, p105 şi p100.

• Acţiunea inhibitorie a IkB se exprimă ca urmare a fixării sale de structura heterodimeră p50/p65, ce are drept consecinţă retenţia în citoplasmă a acestui factor transcripţional.

• Mecanismul inhibitoriu constă în faptul că proteina IkB maschează secvenţa de localizare nucleară NLS din domeniile RHD ale structurilor dimere p50/p65 sau ale celor înrudite.

Page 16: FACTORI TRANSCRIPTIONALI

Activating Stimuli(ROS)

IB kinase/NEMO/IKAP

IB

p65p50

IB

p65p50

PIB

Degradation

p65p50CYTOPLASM

p65p50

NUCLEUS

mRNA

Inflammatory/Immune Proteins

Translocation

Transcription

Target genes

Mecanismul de activare al NF-kBMecanismul de activare al NF-kB

Page 17: FACTORI TRANSCRIPTIONALI

Stresul oxidativ (şi diverşi alţi stimuli intra- şi extracelulari) declanşează activarea factorului de transcriere NF-kB, inducând modificări secvenţiale la nivelul proteinei inhibitorii IkB-Fosforilarea sub acţiunea IkB kinazelor (IKK-1, IKK-2)-Poli-ubiquitinarea-Degradarea proteolitică în proteasomul 26S

PKA

IKK

După eliberarea de IKBactivitatea NF/kB estereglată prin fosforilare sub acţiunea PKA

Acetiltransferaza/deacetilaza

Page 18: FACTORI TRANSCRIPTIONALI

Reglarea NF-kB la nivel nuclearReglarea NF-kB la nivel nuclear

• Odată ajuns în nucleu, NF-kB este supus unor mecanisme de reglaj suplimentare ce condiţionează activarea sau inactivarea.

• În nucleu controlul activării NF-kB este mediat de reacţia de acetilare catalizată de acetiltransferaze.

• Principala ţintă este subunitatea p65(RelA) care este modificată prin acetilare pe resturi specifice de Lys (din poziţiile 218, 221, 310).

• Forma acetilată este activă din punct de vedere transcripţional şi în plus este rezistentă la efectul inhibitoriu al IkB (în felul acesta este prevenită o posibilă asociere cu subunitatea inhibitorie şi inactivarea).

• Forma activă este convertită în formă inactivă de către deacetilaze.

• Deacetilaza funcţionează ca un comutator molecular intranuclear ce controlează activitatea NF-kB.

Page 19: FACTORI TRANSCRIPTIONALI

Reactive OxygenReactive OxygenSpecies (ROS)Species (ROS)

PP

IIB KinaseB Kinase

IIBB

AntioxidantsAntioxidants

--UbiquitinationUbiquitinationProteolysisProteolysis

DNA binding domainDNA binding domain

ModulaModularea activării rea activării NFNFB B de către ade către antioxidanntioxidanţiţi

ModulaModularea activării rea activării NFNFB B de către ade către antioxidanntioxidanţiţi

NUCLEUSNUCLEUS

target target genesgenes

InactiveInactive formform

NFNFBB

DegradationDegradation

Active formActive formNuclear Nuclear

translocationtranslocation

IIBB

p65p65p50p50p50 p65

p65p65p50p50p50IIBB

p65

p65p65p50p50p50 p65 p65p65p50p50p50 p65

Page 20: FACTORI TRANSCRIPTIONALI

Maladii asociate cu activarea Maladii asociate cu activarea aberantă a NF-kBaberantă a NF-kB

• Artrită reumatoidă• Ateroscleroză• Disfuncţie vasculară• Scleroză multiplă• Boli

neurodegenerative• Gastrita asociată cu

Helicobacter pylori• Sindromul

răspunsului inflamator sistemic

• Boala tiroidiană de natură autoimună

• Fibroza chistică• Diabet• Îmbătrânire• Degenerare maculară • HIV/AIDS• Cancer (de origine

limfoidă)• Şoc septic

Page 21: FACTORI TRANSCRIPTIONALI

AplicaAplicaţţii terapeuticeii terapeutice - utilizarea unor agenţi care să blocheze ţintit activitatea NF-kB, ţinând cont de faptul că în majoritatea celulelor tumorale acest factor de transcriere este constitutiv activ şi este rezident în nucleu.

Antioxidants inhibit NF-kB, helping to fight cancers. Cytokine killer cell activity against tumor cells is amplified by NF-

kB inhibitors.

The association between Tumor Necrosis The association between Tumor Necrosis Factor (TNF) and antioxidants in cancer Factor (TNF) and antioxidants in cancer therapy.therapy.

Page 22: FACTORI TRANSCRIPTIONALI

Factorul transcripţional AP-1Factorul transcripţional AP-1((aactivator ctivator pproteinrotein--11))

• AP-1 este un complex proteic cu structură dimerică ce face parte din categoria factorilor transcripţionali cu motiv „leucine zipper”.

c-Fos

c-Jun

ADN

ADNADN

motivul „leucine zipper”

Page 23: FACTORI TRANSCRIPTIONALI

Structura AP-1Structura AP-1Structura Structura AP-1AP-1FosFos (c-Fos, Fra-1, Fra-2, FosB, FosD); (c-Fos, Fra-1, Fra-2, FosB, FosD); JunJun (c-Jun, JunB, JunD); (c-Jun, JunB, JunD);

JDPJDP (JDP-1, JDP-2)(JDP-1, JDP-2); ; ATFATF (ATF-1, ATF-2, ATF-3) (ATF-1, ATF-2, ATF-3)

Page 24: FACTORI TRANSCRIPTIONALI

• AP-1 este o proteină reglatoare implicată în creşterea şi diferenţierea celulară, apoptoză, oncogeneză, declanşarea răspunsului imun sau inflamator.

• Dimerii Jun/Jun şi Jun/Fos se leagă selectiv de secvenţe polinucleotidice (5'-TGAG/CTCA-3') specifice răspunsului la forbol esteri numite secvenţe TRE (TPA responsive element;

TPA - 12-O-tetradecanoilforbol-13-acetat –

diester al forbolului, compus organic vegetal

extras din seminţe de Croton tiglium).

• Dimerii Jun/ATF şi homodimerii ATF/ATF se leagă preferenţial de secvenţe specifice elementului CRE (c-AMP responsive element).

RolulRolul AP-1 AP-1

Page 25: FACTORI TRANSCRIPTIONALI

Organizarea structurală a subunităţilorOrganizarea structurală a subunităţilor

Subunităţile AP-1 sunt organizate pe domenii structurale. Proteina c-Jun conţine următoarele domenii: domeniudomeniull de transactivare de transactivare la capătul N-terminal. Acest

domeniu este implicat în procesul de activare al promotorilor AP-1 ce stimulează transcrierea genelor ţintă.

domeniudomeniull implicat în recunoaşterea specifică a unei implicat în recunoaşterea specifică a unei secvenţe de ADNsecvenţe de ADN din promotorul genelor ţintă, respectiv secvenţele TRE sau secvenţele CRE.

domeniudomeniull de dimerizare de dimerizare ce constă într-o regiune suprarăsucită numită motiv leucine zipper.

Page 26: FACTORI TRANSCRIPTIONALI

Motivul Motivul leucine zipperleucine zipper

Leucine zipper- Motiv structural reprezentat de o structură secundară de ordin superior (o suprarăsucire a unor segmente α-helicoidale) ce crează forţe de adeziune între α-helixuri paralele.

- Fixarea AP-1 la ADN se realizează la nivelul curburii majore prin intemediul unor secvenţe bogate în aminoacizi bazici.

ADNADN

Page 27: FACTORI TRANSCRIPTIONALI

Controlul activităţii AP-1Controlul activităţii AP-1Controlul activităţii AP-1 se realizează prin două modalităţi: 1) modularea nivelului de expresie al diferitelor tipuri de

subunităţi, şi implicit a raportului de dimerizare, 2) modularea activităţii AP-1 prin modificări post-translaţionale

ale subunităţilor preexistente sau nou sintetizate.1) Numeroşi factori inductori de stres oxidativ (peroxidul de

hidrogen, radiaţiile UV şi ionizate) activează factorul transcripţional AP-1. Această activare este mediată de calea MAPK şi are ca rezultat inducerea rapidă a transcrierii genelor de răspuns imediat (timpuriu) c-jun şi c-fos.

2) Controlul activităţii proteinelor AP-1 preexistente are loc prin fosforilarea directă a acestora, sub acţiunea unor kinaze specifice (de ex. activarea proteinei c-Jun este mediată de JNK (kinaze c-Jun NH2 terminale), prin fosforilarea resturilor de serină din poziţiile 63 şi 73 de la capătul N-terminal, domeniu responsabil de activarea transcripţională

Page 28: FACTORI TRANSCRIPTIONALI

Kinazele c-Jun NHKinazele c-Jun NH22 terminale (JNK) terminale (JNK)

c-c-JJun un NN-terminal -terminal kkinasesinases • JNK au denumirea alternativă de MAP kinaze

activate de stress (SAPK, stress-activated protein kinases), pentru că activarea lor se produce ca răspuns la stresul celular indus de anumiţi stimuli: semnale inflamatorii, radiaţii UV, inhibitori ai sintezei proteinelor, şoc osmotic etc.

• Rolul specific al JNK depinde de tipul celular, fiind esenţial în diferenţiere şi proliferare, apoptoză, motilitate celulară, controlul unor căi metabolice, repararea ADN.

• Semnalizarea defectuoasă a cascadei JNK determină inflamaţii, neurodegenerare, cancer, ischemie.

• Până în prezent au fost identificate 10 izoenzime JNK şi peste 50 de proteine ţintă (substrate) ale acestor kinaze activate de stres.

Page 29: FACTORI TRANSCRIPTIONALI

Factorul transcripţional Nrf2Factorul transcripţional Nrf2• Proteina Nrf2 este membru al familiei de factori transcripţionali

‘cap ‘n’ collar’. Numele vine de la faptul că prezintă un motiv structural, localizat în regiunea amino-terminală regăsit şi la factorul transcripţional cap ‘n’ colcap ‘n’ colllarar de la Drosophila melanogaster.

• În mod normal Nrf2 este localizată în citoplasmă ca urmare a interacţiunii cu proteina Keap1.

• Keap1 este o proteină de legare de actină, care represează activitatea transcripţională a factorului Nrf2 ca urmare a interacţiunii cu acesta, sechestrându-l în citoplasmă.

• Keap1 mediază degradarea Nrf2 prin intermediul sistemului ubiquitină-proteazom.

• Keap1 acţionează ca senzor pentru stresul oxidativ (redoxul celular) întrucât este bogată în resturi de Cys.

Page 30: FACTORI TRANSCRIPTIONALI

Mecanismul de activare al Nrf2Mecanismul de activare al Nrf2

• Oxidarea resturilor de Cys din structura Keap1 induce o modificare conformaţională soldată cu eliberarea Nrf2 şi translocarea acestuia în nucleu.

• Evenimentele cheie în activarea Nrf2 sunt modificarea statusului grupărilor tiolice ale proteinei Keap1 şi fosforilarea Nrf2 sub acţiunea protein kinazei C (PKC).

Page 31: FACTORI TRANSCRIPTIONALI

În nucleu, după heterodimerizarea cu proteinele Mafproteinele Maf (sau alte proteine leucine zipper), Nrf2 se leagă de elementele cis al promotorilor genelor ţintă, numite ARE (elemente de răspuns antioxidant, sau element de răspuns electrofil).

Genele ţintă codifică o serie de enzime antioxidante de protecţie, precum glutation S-transferaze, γ-glutamil-cistein sintetaza şi hem-oxigenaza-1.

Page 32: FACTORI TRANSCRIPTIONALI

Hem-oxigenaza 1Efectul antioxidant se bazează pe transformarea hemului în biliverdină şi ulterior în bilirubină (cu proprietăţi antioxidante puternic).