faculdade de engenharia quÍmica de lorena departamento de...
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FACULDADE DE ENGENHARIA QUÍMICA DE LORENA DEPARTAMENTO DE BIOTECNOLOGIA
Dissertação de Mestrado
TRATAMENTO DE POLPAS COM COMPOSTOS DE BAIXA MASSA MOLAR, PRODUZIDOS POR FUNGOS E COMPOSTOS
MODELO DE SIDERÓFOROS
Carmen Lúcia de Medeiros
Lorena - SP - Brasil 1999
FACULDADE DE ENGENHARIA QUÍMICA DE LORENA DEPARTAMENTO DE BIOTECNOLOGIA
PÓS GRADUAÇÃO EM BIOTECNOLOGIA INDUSTRIAL
TRATAMENTO DE POLPAS COM COMPOSTOS DE BAIXA MASSA MOLAR, PRODUZIDOS POR FUNGOS E
COMPOSTOS MODELO DE SIDERÓFOROS
Dissertação de mestrado apresentada como parte das exigências para a obtenção do título de Mestre em Biotecnologia Industrial
Banca examinadora:
Dr2 Adriane M. F. Milagres Dr2 Norma M. L. Erismann Dr. André Luis Ferraz
Estudante:
Carmen Lúcia de Medeiros
Lorena-SP-Brasil 1999
FACULDADE DE ENGENHARIA QUÍMICA DE LORENA DEPARTAMENTO DE BIOTECNOLOGIA
PÓS GRADUAÇÃO EM BIOTECNOLOGIA INDUSTRIAL
TRATAMENTO DE POLPAS COM COMPOSTOS DE BAIXA MASSA MOLAR, PRODUZIDOS POR FUNGOS E
COMPOSTOS MODELO DE SIDERÓFOROS
Este exemplar corresponde a versão
final da dissertação de mestrado
aprovada pela banca examinadora.
Lorena - SP - Brasil
1999
Aos meus pais, Alvaniro e Maria; Às minhas irmãs Cláudia e Andréa;
Ao Weverton.
ii
AGRADECIMENTOS
À Ora. Adriane Maria Ferreira Milagres, pela orientação durante a
realização deste trabalho.
À Ora. Ângela Machuca pelas sugestões imprescindíveis no
desenvolvimento deste trabalho.
Aos amigos Djalma e Ana Lúcia, pelo auxílio durante a realização
deste trabalho.
À amiga Diovana, pelo convívio e auxílio prestado durante o
desenvolvimento deste trabalho.
À CNPQ, pelo apoio financeiro.
À todos os integrantes do Departamento de Biotecnologia, que
colaboraram e tornaram possível a realização deste trabalho.
iii
CONTEÚDO
1 - Introdução 1
2 - Revisão Bibliográfica 5
2.1 - Enzimologia da biodegradação da madeira 5
2.1.1 - Biodegradação da celulose 6
2.1.2 - Biodegradação das hemiceluloses 7
2.1.3 - Biodegradação da lignina 8
. 2.2 - Recentes hipóteses sobre os sistemas enzimáticos e não enzimáticos de
baixa massa molar envolvidos na biodegradação da madeira 9
2.3 - Agentes não enzimáticos envolvidos na degradação de madeira 11
2.3.1 -Agentes quelantes de ferro 13
2.4 - Mecanismos catalíticos propostos para os agentes quelantes de ferro 16
2.5 - Utilização de agentes quelantes de ferro no tratamento de polpas
celulósicas 23
2.6 - Utilização de compostos modelo de sideróforos no tratamento de polpas
celulósicas 24
IV
3. O - Objetivos 27
4.0 - Material e Métodos 28
4.1 - Compostos modelo de sideróforos 28
4.2 - Microrganismos 28
4.3 - Meio de manutenção dos fungos 28
4.4 - Cultivo dos fungos em meio líquido 29
4.5 - Meio de cultivo suplementado 29
4.6 - Separação dos compostos de baixa massa molar das culturas
. fúngicas 29
4.6.1 - Fungos cultivados em extrato de malte 29
4.6.2 - Fungos cultivados em meio Czapeck suplementado com farelo de
~go 30
4. 7 - Cromatografia em Sephadex G-25 32
4.8 - Quantificação da produção de sideróforos pelo método CAS 32
4.9 - Teste de atividade oxidativa 33
4.10 - Ensaio de redução do Fe(III) 34
V
4.11 - Quantificação de ferro na polpa 34
4.12 - Pré-tratamento de polpas celulósicas 35
4.12.1 - Polpa 35
4.12.2 - Pré-tratamento de polpas celulósicas com os compostos de baixa massa
molar dos caldos fúngicos 35
4.12.3 - Pré-tratamento de polpas celulósicas com desferal e compostos modelo
de sideróforos 36
4.12.4 - Pré-tratamento · de polpas com desferal e compostos modelo de
sideróforos e Fe(III) 36
4.12.5 - Estágio de branqueamento com peróxido de hidrogênio em meio
alcalino 37
4.13 - Análise das polpas 37
4.13.1 - Controle dos processos de branqueamento das polpas 37
4.13.1.1 - Determinação do número kappa 38
4.13.1.2 - Determinação da viscosidade 39
4.13.2 - Cálculo da eficiência de deslignificação e seletividade 40
5 - Resultados e Discussão 41
5. 1 - Reação CAS em meio líquido 41
vi.
5.1.1 - Fungos de decomposição parda (Brown-rot) 43
5.1.2 - Fungos de decomposição branca (White-rot) 44
5.1.3 - Produção de reação CAS por T. aurantiacus 47
5.2 - Atividade oxidativa de fungos decompositores de madeira 47
5.2.1 - Fungos de decomposição parda (Brown-rot) 48
5.2.2 - Fungos de decomposição branca (White-rot) 48
5.2.3·- Produção de atividade oxidativa por T. aurantiacus 50
5.3 - Obtenção e análise das frações de baixa massa molar (<3 KDa) dos extratos
. fúngicos 50
5.4 - Cultivo de fungos em meio Czapeck suplementado com serragem ou farelo
de trigo 52
5.5 - Propriedades das frações de baixa massa molar (<5 KDa) obtidos das
culturas fúngicas 57
5. 5. 1 - Reação CAS e atividade oxidativa 57
5.5.2 -Análise de redução de Fe(III) com ferrozina 61
5.6 - Propriedades do sideróforo desferal e de alguns compostos modelo
hidroxamato e catecolato 66
vii
5.6.1 - Reação CAS 66
5.6.2 - Atividade oxidativa 67
5.6.3 - Redução de Fe(III) 69
5.7 - Tratamento das polpas kraft de eucalipto com desferal e compostos modelo
hidroxamato e catecolato 71
5.8 - Tratamento de polpa kraft de eucalipto com desferal e compostos modelo
hidroxamato e catecolato, complexados com Fe(III) 73
6 - Conclusões 77
7 - Referências Bibliográficas 78
Apêndice I
viii
LISTA DE TABELAS
Tabela 1: Detecção de atividade oxidativa (U/L) na fração de baixa massa
molar obtida após ultrafiltração (<10 KDa) 51
Tabela 2: Detecção de atividade oxidativa (U/L) na fração de baixa massa
molar obtida após ultrafiltração ( <3 KDa) 51
Tabela 3: Atividade oxidativa e reação CAS dos caldos liofilizados, obtidos
após 35 dias de cultivo 57
Tabela 4: Atividade oxidativa e reação CAS nas frações de baixa massa molar
obtidas após ultrafiltração ( <5 KDa) 58
Tabela 5: Redução de Fe(III) pelos fungos P_. medula - panis, T. versicolor
e T. aurantiacus, utilizando 1 % de ferrozina em tampão acetato 50 mM, pH
4,5 62
Tabela 6: Efeito do tratamento de polpa kraft de eucalipto com compostos
fúngicos de baixa massa molar ( <5 KDa) num estágio de branqueamento com
peróxido de hidrogênio 64
Tabela 7: Reação CAS do desferal e dos compostos modelo (AHA, DHBA,
DHPAA) 67
Taabela 8: Redução de Fe (Ili) por desferal e os compostos modelo de
sideróforos, utilizando 1 % de ferrozina em tampão acetato 50 mM , pH
4,5 70
Tabela 9: Tratamento de polpa kraft com os compostos modelo AHA, DHBA e
DHPAA e após adição de peróxido de hidrogênio 71
ix
Tabela 1 O: Tratamento de polpa kraft com os compostos modelo (AHA, DHBA
e DHPAA) e desferal complexado com 0,93 mM de Fe(III) e após adição de
peróxido de hidrogênio 7 4
· Tabela 11: Tratamento de polpa kraft com os compostos modelo (AHA, DHBA
e DHPAA) e desferal complexado com 1,86 mM de Fe(III) e após adição de
peróxido de hidrogênio 75
LISTA DE FIGURAS
Figura 1: Estrutura de sideróforos representativos do grupo dos hidroxamatos
· (ferricromo) (A), do grupo dos catecolatos (enteroquelina) (8), e o sideróforo
comercial do tipo hidroxamato, desferrioxamina 8 ou Desferal (C) 15
Figura 2: Mecanismo proposto para a degradação de madeira pelo fungo de
decomposição parda G. trabeum, através da produção de radicais livres (HO• ),
gerados pelo sistema Gt-quelante, na parede da célula vegetal (GOODELL et
ai., 1997) 19
Figura 3: Mecanismo proposto para a geração de espécies ativas de oxigênio
pelos glicopeptídeos isolados de culturas de P. chrysosporium e T. palustris
(ENOKI et ai., 1997) 21
Figura 4: Mecanismo proposto para a oxidação de o-dianisidina pelos
compostos de baixa massa molar obtidos a partir do ascomiceto T. aurantiacus
(MACHUCA, 1995) 22
Figura 5: Estrutura dos compostos modelo de sideróforos: (A) ácido
acetohidroxâmico (AHA) (PM = 75,07), (8) ácido 2,3-dihidroxibenzóico (DH8A)
(PM = 154, 12) e (C) ácido 3,4-dihidroxifenilacético (DHPAA) (PM = 168, 15)
(ALDRICH HAND800K, 1986) 26
Figura 6: Cinética da reação CAS instantânea e após 24 horas dos
sobrenadantes de cultivo dos fungos de decomposição parda 44
Figura 7: Cinética da reação CAS instantânea e após 24 horas dos
sobrenadantes de cultivo dos fungos de decomposição branca 46
Figura 8: Cinética da reação CAS instantânea e após 24 horas dos
sobrenadantes de cultivo dos fungo termfílico T. aurantiacus 47
xi
Figura 9: Cinética de produção de atividade oxidativa (UI/L) dos fungos de
decomposição branca em presença dos substratos ABTS, 2,6 DMF e o-
dianisidina. Os fungos foram inoculados em meio líquido extrato de malte 2% e · incubados sem agitação, a 28 ºC 49
Figura 1 O: Cinética de reação CAS após 1 hora de reação, do sobrenadante
- dos fungos T. versicolor, P. medula-panis e T. aurantiacus, crescidos em meio
Czapeck suplementado com serragem de eucalipto 53
Figura 11: Cinética de produção de atividade oxidativa (UI/L) dos fungos T.
versicolor, P. medula-panis e T. aurantiacus. Os fungos foram inoculados em
mei~ Czapeck modificado, suplementado com 2% de serragem de eucalipto e
incubados sem agitação, a 28 ºC, com excessão do T. aurantíacus, que foi
incubado a 45 ºC 54
Figura 12: Cinética de reação CAS após 1 hora de reação, do sobrenadante
dos fungos T. versicolor, P. medula-panis e T. aurantiacus, crescidos em meio
Czapeck suplementado com farelo de trigo 55
Figura 13: Cinética de produção de atividade oxidativa (UI/L) dos fungos T.
versicolor, P. medula-panis. Os fungos foram inoculados em meio Czapeck
modificado, suplementado com 2% de farelo de trigo e incubados sem
agitação, a 28 ºC 56
Figura 14: Cromatograma em Sephadex G-25 do caldo de T. versicolor
liofilizado (A) e após ser ultrafiltrado em membrana de corte <5 KDa (B). A
coluna foi eluída com água deionizada, com fluxo de 0,9 ml/min e frações de
1,5 mM foram coletadas. A coluna foi calibrada com azul de dextrano (>2.103
Da) (Vo) = 15 ml, cobalamina (1355,4 Da) (V1) = 25,5 ml e riboflavina (376,36
Da) (V2) = 31,5 ml 59
xii
Figura 15: Cromatograma em Sephadex G-25 do caldo de P. medula-panis
liofilizado (A) e após ser ultrafiltrado em membrana de corte <5 KDa (B). A
coluna foi eluída com água deionizada, com fluxo de 0,9 ml/min e frações de
1,5 mM foram coletadas. A coluna foi calibrada como descrito na Figura · 14 60
Figura 16: Cromatograma em Sephadex G-25 do caldo de T. aurantiacus
liofilizado (A) e após ser ultrafiltrado em membrana de corte <5 KDa (B). A
coluna foi aluída com água deionizada, com fluxo de 0,9 ml/min e frações de
1,5 mM foram coletadas. A coluna foi calibrada como descrito na Figura
14 61
Figura 17: Redução de Fe(III) a Fe(II) pelos compostos de baixa massa molar
(<5 KDa) obtidos a partir dos fungos P. medula-panis, T. versicolor e T.
aurantiacus com ferrozina a 1,0% em tampão acetato 50 mM, pH 4,5 62
Figura 18: Redução de Fe(III) pelos compostos modelo de sideróforos (AHA,
DHBA e DHPAA) e desferal com ferozina a 1,0% em tampão acetato 50 mM,
pH 4,5 69
.... ,....
RESUMO
Tratamento de polpas com compostos de baixa massa molar, produzidos por fungos e compostos modelo de sideróforos. Carmen Lúcia de Medeiros. Dissertação de Mestrado. Programa de Pós-Graduação em Biotecnologia Industrial,
. Departamento de Biotecnologia, Faculdade de Engenharia Química de Lorena. Orientadora: Ora Adriane M. F. Milagres (Departamento de Biotecnologia, FAENQUIL, CP 116, 12600-000, Lorena, SP, Brasil). Banca Examinadora: Ora Norma M. L. Erismann e Dr. André L. Ferraz. Agosto de 1999.
Fungos decompositores de madeira foram selecionados visando a obtenção de sideróforos com atividade oxidativa. Os fungos de decomposição parda Poria cocos e Laetiporius sulfureus produziram reação CAS (Cromo Azurol S) correspondente a 68% e 46% de sideróforos, respectivamente. À exceção de Phelinus pini e · Phanerochaete chrysosporium, os demais fungos de decomposição branca apresentaram uma pequena produção de sideróforos, em torno de 20% e atividade oxidativa com ácido 2,2'-azinobis (3 etilb.enzitiazolina 6) sulfônico (ABTS), 2,6-dimetoxifenol e o-dianisidina. Os extratos desses fungos foram filtrados em membranas de corte de 3 KDa e nos ultrafiltrados de Trametes versicolor e Poria medula-panis foi detectada a presença de uma pequena atividade oxidativa. Para estimular a produção de atividade oxidativa foi utilizado o meio Czapeck suplementado com serragem de eucalipto ou farelo de trigo· onde foram inoculados o T. versicolor, P. medula-panis e Thermoascus aurantiacus. Esse último fungo foi utilizado como referência por ter sido anteriormente descrito como produtor de compostos de baixa massa molar com atividade oxidativa. Em meio Czapeck suplementado com farelo obteve-se os melhores resultados de atividade oxidativa com estes três fungos. Os extratos de 35 dias de incubação foram concentrados e ultrafiltrados e os compostos de baixa massa molar (<5 KDa) com capacidade de oxidar ABTS em meio ácido foram novamente detectados nas culturas de T. versicolor, P. medula-panis e T. aurantiacus. Os compostos reduziram lentamente Fe(III) a Fe(II) através da reação com ferrozina e apresentaram reação CAS instantânea para T. versicolor (54,8%), P. medula-panis (78,9%) e T. aurantiacus (71,0%). Após o tratamento de polpas kratt de eucalipto com os extratos fúngicos de baixa massa molar (<5 KDa) obteve-se uma deslignificação de 14,3, 14,4, e 15,5% com os extratos do T. versicolor, P. medula-panis e T. aurantiacus, respectivamente. As mesmas análises foram realizadas com os sideróforos comerciais desferal, ácido 2,3-dihidroxibenzóico (DHBA), ácido 3,4-dihidroxifenilacético (DHPAA) e ácido acetohidroxâmico (AHA). Estes compostos não apresentaram atividade oxidativa com nenhum dos substratos utilizados e a reação CAS foi -13,6, -34,.0, 82,7 e 100% para DHBA, DHPAA, AHA e desferal, respectivamente. A redução de Fe(III) a Fe(II) pelos compostos do tipo catecolato foi maior que a dos hidroxamatos. No tratamento de polpa kraft, os compostos modelo de sideróforo apresentaram- se menos eficientes que os compostos de baixa massa molar produzidos pelos fungos.
Abstract
Treatment of pulps with low molecular weight compounds produced by ·tungi and model siderophores.
Wood-decaying fungi were selected a1mmg the obtention of siderophore prcducticn with phenoloxidase activity. The brown-rot fungi Poria cocos and Laetiporius sulfureus produced a CAS reaction (chromo azurol S) corresponding to 68% and 46% of siderophores, respectively. Except for Phel/inus pini and Phanerochaete chrysosporium, ali the other fungi produced a small arnount of siderophores (about 20%), and had fenoloxidase activity with 2,2'-azinobis (3-ethylbenzothiazoline-6) sulfônic (ABTS}, 2,6-dimetoxyphenol and o-dianisidine. The extracts of these fungi were filtered in membranes with a 3 KDa cut-off. A small phenoloxidase activity was detected in Trametes versicolor and Poria medula-panis ultrafiltrates. Because of these results, both fungi were selected for further studies. ln order to stimulate the phenoloxidase activity, Czapeck medium, supplemented with eucalyptus and wheat bran, was employed. This medium was inoculated with T. versicolor, P. Medula-panis and T. Aurantiacus. This last fungus was used as a reference because it had been previously described as a producer of low molecular weight compounds with low phenoloxidase activity. Concerning this activity, the best results were achieved with the three fungi in Czapeck medium supplemented with bran. The extracts incubated for 35 days were concentrated and ultrafiltrated, and the low molecular weight compounds (<5 KDa) capable of ixidizing ABTS in acid medium were dected again in the T. versicolor, P. medula-panis and T. aurantiacus cultures. The compounds slowly reduced Fe(III) to Fe(II) through the reaction with ferrozine and presented an instantaneous CAS reaction for T. versicolor (54,8%), P. medula-panis (78,9%) and T. aurantiacus (71,0%). After treating the eucaliptus kraft pulps with fungai extracts of low molecular weight (<5 KDa) we obtained a delignification of 14,3, 14,4 and 15,5%, respectively. The sarne analyses were performed with a commerclal siderophore of the hidroxamate-type, with desferrai and with model compounds of cathecol-type: 2,3-dihydroxybenzoic acid (DHBA) and 3,4-dihydroxyphenilacetic acid (DHPAA) and hydroxamate-type: acetohydroxamic acid (AHA). These compounds did not present oxidative activity with any of the substrates utilizaed and the CAS reaction was -13,6, -34,0, 82,7 and 100% for DHBA, DHPAA, AHA and desferrai, respectively. The Fe(III) reduction to Fe(II) by the cathecol-type compounds was higher than that of the hidroxamate-type. ln the treatment of kraft pulps, the model compounds of siderophore prove less efficient than the low molecular weight compounds produced by the fungi.
1 - Introdução
O grande potencial biotecnológico dos fungos que degradam
madeira deriva das propriedades de seus sistemas enzimáticos, sendo que a
. indústria de celulose e papel representa atualmente o principal alvo desta
aplicação.
O processo de obtenção de pastas celulósicas e fabricação de
· papel, é um dos responsáveis pela maior carga poluente que atinge os
ecossistemas, na forma de efluentes ou resíduos sólidos, altamente tóxicos e
muitas vezes biocumulativos. Em razão destes problemas, vem aumentando o
interesse no desenvolvimento de processos alternativos através da
biotecnologia (ERIKSSON et ai., 1990).
A utilização de fungos que degradam madeira e seus sistemas
enzimáticos está sendo cada vez mais aplicado com o objetivo de melhorar a
qualidade de polpas, reduzindo o consumo energético e de reagentes
químicos durante a sua fabricação e consequentemente o caráter tóxico dos
efluentes por elas liberado (MESSNER e SREBOTNIK, 1994; SARIKAYA e
LADISCH, 1997).
Os fungos, entre os microrganismos, são os principais
causadores da decomposição ocorrida em madeiras. Diversas espécies de
fungos provocam diferentes tipos de degradação da madeira. Esses fungos
são classificados em decomposição branda (soft-rot}, decomposição parda
(brow-rot) e decomposição branca (white-rot).
A ação dos fungos de decomposição parda parece se limitar à desmetoxilação, desmetilação e clivagem de cadeias laterais da lignina.
Evidências químicas de despolimerização da lignina por fungos de
decomposição parda são limitadas, no entanto, é aceito que os radicais HO•
podem funcionar tanto despolimerizando, quanto repolimerizando derivados de
lignina (GOODELL et ai., 1997). Uma propriedade comum dos fungos de
decomposição branca é a capacidade de oxidação de compostos fenólicos e
não fenólicos relacionados com lignina, devido à atividade de suas enzimas
ligninolíticas extracelulares (BLANCHETTE, 1991; BLANCHETTE et ai., 1992).
Os fungos de decomposição branda degradam todos os componentes da
2
parede celular, porém, em velocidade baixa. Os fungos desta classe degradam
preferencialmente os polissacarídeos da madeira (KIRK e FARREL, 1987;
BLANCHETTE, 1991 ).
A lignina é o polímero orgânico mais resistente encontrado entre
· os materiais lignocelulósicos existentes na natureza. Condições físico-
químicas severas têm sido aplicadas para atacar ou modificar este composto.
Em princípio, a deslignificação da madeira é baseada ainda, em invenções do
século passado (processos de polpação mecânica, 1848; sulfito, 1857; kraft
(sulfato), 1879). Progressos na tecnologia de polpação se extendem ao
processo de cozimento, baixando o número kappa antes do branqueamento
final (CALL e MÜCKE, 1997).
As tecnologias de branqueamento mudaram na última década,
introduzmdo deslignificação com oxigênio nos anos 80 e estágios de peróxido
e ozônio nos anos 90. Comparando-se as drásticas condições químicas
utilizadas para o branqueamento de polpa de celulose e as suaves condições
da catálise enzimática, não é de se surpreender, que bioquímicos e
enzimologistas tentem encontrar há muito tempo, sistemas que sejam menos
drásticos, como os sistemas enzimáticos (CALL e MÜCKE, 1997).
; -- ,....
A polpação kraft é o processo dominante na produção de polpas
químicas branqueadas. Espera-se aumentar a presente produção mundial de
polpa kraft branqueada de 60 milhões de toneladas/ano para 80 milhões de
toneladas/ano até o ano 201 O (KRAMER, 1992; FOLK et ai., 1993). A polpação
kraft degrada quimicamente e dissolve a lignina da lamela média da parede
primária que se deposita junto às fibras na madeira e degrada ainda a lignina
que está na parede secundária. Durante o cozimento kraft normal, 90 a 95%
de lignina é removida a partir da parede das fibras. A lignina residual é
extensivamente modificada por clivagem das ligações éter, redução das
ramificações e oxidação, e reações de condensação entre moléculas de lignina
e entre lignina e polissacarídeos (GIERER, 1985; HOSOYA, 1992). O
branqueamento convencional realizado nas polpas é baseado na extração
alcalina e cloração da polpa. O uso de reagentes químicos de branqueamento
à base de cloro, resulta em efluentes contendo altos níveis de compostos
organoclorados que são conhecidamente tóxicos (KRINGSTAD et ai., 1984;
,., ·'
REEVE e EARL, 1989). O avanço no conhecimento dos efeitos negativos
destes organoclorados, têm forçado o aumento de pesquisas para o
desenvolvimento de novas tecnologias diretamente ligadas à redução ou
eliminação do uso de reagentes químicos de branqueamento baseados no
. cloro. O uso de processos biotecnológicos no branqueamento de polpa kraft
oferece boas perspectivas para o desenvolvimento de sequências de
branqueamento livres de cloro. Há duas propostas principais de
· branqueamento por via biotecnológica. A primeira é baseada no uso de
xilanases para remover a hemicelulose depositada nas polpas kraft,
melhorando o subsequente passo de extração alcalina da lignina. O pré-
branqueamento de polpas com xilanases já está sendo utilizado com o objetivo
de reduzir as çfosagens de reagentes químicos de branqueamento (VIIKARI et
ai., 1994). A segunda é baseada na utilização de fungos de decomposição
branca ou enzimas ligninolíticas para oxidação seletiva da lignina como passo
principal (REIO e PAICE, 1994; PAICE et ai., 1995). Apesar do uso de fungos
de decomposição branca no biobranqueamento, não ter ainda alcançado uso
em escala industrial, continuam as pesquisas visto que a remoção biológica da
lignina, poderá substituir em grande parte o branqueamento químico
(MOREIRA et ai., 1997).
A degradação da lignina é um processo oxidativo complexo que
ocorre em condições aeróbias. Entre as enzimas ligninolíticas melhor
caracterizadas estão as lacases, lignina peroxidase e peroxidase dependente
de manganês. Embora sem participação direta na degradação e/ou
modificação de lignina destacam-se as enzimas que participam na produção
de H202 e algumas enzimas redutoras (FIECHTER, 1993; HATAKKA, 1994).
Por outro lado, embora os estudos envolvendo xilanases nos
processos de branqueamento de polpas estejam em fase adiantada, alguns
trabalhos têm reportado a utilização de compostos quelantes de baixa massa
molar para branquear polpas celulósicas (JELLISSON et ai., 1990, MACHUCA,
1995). Estudos relacionados a esse processo ainda não esclareceram de
forma definitiva o papel dos compostos quelantes na deslignificação das
polpas. Os compostosquelantes de baixa massa molar produzidos por fungos
4
decompositores de madeira diferem entre si na sua estrutura, nas
propriedades quelantes e oxidativas. Tais propriedades ainda necessitam ser
melhor estudadas no intuito de relacioná-las aos processos de deslignificação
de polpas.
5
2 - REVISÃO BIBLIOGRÁF,ICA
2.1 - Enzimologia da biodegradação da madeira
O processo de degradação de um substrato lignocelulósico como
a madeira ocorre pela ação combinada de uma variedade de sistemas
enzimáticos e alguns agentes não enzimáticos de baixa massa molar,
recentemente descritos na literatura, produzidos extracelularmente por fungos.
Através destes sistemas, os fungos degradam as macromoléculas a
componentes menores e solúveis, os quais podem ser incorporados no
metabolismo do microrganismo (FENGEL e WEGENER, 1989; ERIKSSON et
a/.11990; CALL e MÜCKE, 1997).
Dois sistemas enzimáticos maiores, mecanisticamente diferentes,
participam da degradação dos componentes da matriz lignocelulósica por
funços, um é do tipo hidrolítico e o outro do tipo oxidativo. Enquanto as
celulases e hemicelulases atuam provocando quebras nos polissacarídeos, · as
enzimas ligninolíticas degradam e às vezes mineralizam lignina. O mecanismo
de ação das glicanoidrolases ocorre via formação de um complexo enzima-
substrato, enquanto que para as enzimas oxidativas ocorre via mediadores
não protéicos. Outra diferençà entre ambos os sistemas enzimáticos é que!
enquanto as glicanoidrolases possuem uma estreita faixa de especificidade
pelo substrato, as enzimas ligninolíticas apresentam uma ampla faixa de
especificidade (JOSELEAU et al.1 1994). Resultados de identificação
bioquímica das enzimas secretadas por fungos que decompõem madeira,
indicam que existe alguma correlação entre a natureza das enzimas
secretadas e o tipo de degradação observada na madeira (RUEL ela/., 1994).
A complexidade estrutural da lignina requer a presença de um
sistema altamente diversificado de enzimas ligninolíticas, enzimas produtoras
de H202 e enzimas de natureza redutora. O papel de cada enzima atuando
individualmente é irrelevante no processo global de degradação de lignina,
6
portanto a biodegradação deriva de uma combinação de processos de óxido-
redução.
2.1.1 - Biodegradação da celulose
A celulose é o principal constituinte da madeira, representando
cerca de 40 a 50% do peso seco da maioria das espécies lenhosas. A celulose
constitui-se em um homopolissacarídeo composto de unidades de P-D-
glicopiranose, unidas por ligações P-(1,4) glicosídicas.
A molécula de celulose é completamente linear e forma
microfibrilas. A capacidade de utilização da celulose como fonte de carbono e
energia é encontrada entre variados grupos de microrganismos. Os fungos têm
despertado maior interesse devido ao fato de suas enzimas serem liberadas
para o meio extracelular, enquanto nas bactérias estão ligadas à parede
celular (VICENTE, 1989).
Em diversas ·espécies fúngicas existe um sistema constituído de
três classes de enzimas que atuam sinergisticamente na hidrólise de celulose.
Estas enzimas são: endo-1,4-p-glucanases que clivam as ligações glicosídicas
internas ao acaso; exo-1,4-P-glucanases que clivam as ligações glicosídicas à partir do grupo terminal não redutor, liberando unidades de glicose ou
celobiose, e as 1,4-P-glicosidases, que hidrolisam celobiose e outros
oligossacarídeos de baixa massa molar, oriundos da ação hidrolítica da endo-
1.4-P-glucanase, à glicose (WOOD, 1992).
Adicionalmente, observou-se que enzimas oxidativas também
estão envolvidas na degradação da celulose. Para o fungo Pnenerocheete
chrysosporium, existem duas vias de oxidação da celobiose: quinona redutase
( celobiose desidrogenase) que reduz quinonas a radicais fenólicos na
presença de celobiose e celobiose oxidase que oxida celobiose e
7
oligossacarídeos para seus ácidos correspondentes, usando o oxigênio
molecular (ANDER, 1994 e ANDER e MARZULLO, .1997).
Os fungos de decomposição branca e branda produzem todas as
enzimas extracelulares necessárias (endo-1,4-f3-glucanase, exo-1,4-f3-
glucanase e 1,4-f3-glicosidase) para a degradação da celulose cristalina.
Embora os fungos de decomposição parda não possuam atividade de exo-1 ,4-
f3-glucanase, eles são bons degradadores da celulose na madeira (ENOKI et
ai., 1997). Há evidências que indicam a produção por parte dos fungos de
decomposição parda, de pequenos agentes capazes de difundir pelas
camadas terciária (S3) e secundária (S2), onde são observados inicialmente às
mudanças morfológicas. Entre tais agentes não-enzimáticos destacam-se os
compostos de baixa massa molar, sideróforos, ácido oxálico, glicopeptídeos e
radicais hidroxila (HO•) (JELLISON et ai., 1991, TANAKA et ai., 1993,
SHIMADA et ai., 1994, WOOD, 1994, HIRANO et ai., 1995). Os radicais HO•,
provavelmente produzidos através da reação de Fenton, seriam os
responsáveis pelas modificações observadas na lignina. Devido a seu enorme
poder oxidativo, os radicais HO• são capazes de despolimerizar celulose e
atacar unidades fenólicas e não fenólicas de lignina (BACKA et a/., 1992,
WOOD, 1994).
2.1.2 - Biodegradação das hemiceluloses
As hemiceluloses pertencem a um grupo heterogêneo de
polissacarídeos. Contrariamente à celulose, são heterossacarídeos de baixo
grau de polimerização e cadeias ramificadas que correspondem entre 20 a
30% do peso seco da madeira.
Para hidrólise enzimática da celulose, são exigidas apenas
enzimas que hidrolisam ligações f3-1,4-glicosídicas. Para a
hemicelulose,entretanto, um conjunto enzimático mais complexo é necessário,
8
uma vez que diferentes tipos de ligações e unidades monoméricas estão
presentes na estrutura química das herniceluloses (COUGLAN e
HAZLEWOOD, 1993).
A completa degradação da hemicelulose requer a ação de uma
série de enzimas hidrolíticas; endo-1,4-j3-xilanase, j3-xilosidase, a-
glucuronidase, «-L arabinofuranosidase, acetil esterase, mananases,
galactanases, entre outras.
A enzima fundamental na despolimerização da xilana é a endo-
1,4-j3-xilanase, que ataca o interior da cadeia principal, gerando
xilooligossacarídeos ramificados ou não substituídos. Os substituintes da
cadeia principal são liberados pelas glicosidases e esterases correspondentes.
A j3-xilosidase é a enzima que ataca xilooligossacarídeos, gerados pela ação
da j3-xilanase e outras hidrolases a partir de extremidades não redutoras,
liberando D-xilose como único produto da hidrólise. Em geral, pouco se
conhece à respeito da produção de xilanases pelos fungos de decomposição
parda ou branca, pois a literatura é escassa a este respeito.
2.1.3 - Biodegradação da lignina
A lignina é o polímero aromático mais abundante na biosfera. Isto
compreende de 20 a 30% da parede das células das plantas lenhosas e dá
resistência e proteção contra a biodegradação (ANDER e MARZULLO, 1997).
Trata-se de um produto polimérico natural, formado pela polimerização
desidrogenativa dos precursores primários: álcool transconiferílico (grupo
guaiacila), álcool trans-sinapílico (grupo siringila) e álcool trans-para-
cumarílico (grupo p-hidroxifenila) (ASSUMPÇÃO, 1988).
Em virtude da grande complexidade da estrutura da lignina,
torna-se necessário o ataque de diversos microrganismos para que sua
degradação seja significante (VICENTE, 1989). Os melhores degradadores da
9
lignina na natureza, são os fungos filamentosos. Destes, o sistema lignolítico
do Phanerochaete chrysosporium , um fungo de decomposição branca, têm
sido o mais estudado (ZAPANTA e TIEN, 1997).
As enzimas envolvidas na degradação da lignina são
genericamente denominadas . ligninolíticas e podem ser definidas como
fenoloxidases (lacase, peroxidase dependente de manganês e lignina
peroxidase). Estas enzimas atuam sobre unidades fenólicas e não-fenólicas da
lignina, através de um mecanismo de formação de espécies radicalares, na
presença ou ausência de peróxido de hidrogênio dependendo do tipo de
enzima.
2.2 - Recentes hipóteses sobre os sistemas enzimáticos e não
enzimáticos de baixa massa molar envolvidos na biodegradação da
madeira
Os mecanismos de colonização, invasão do lúmen das células e
secreção de enzimas que degradam a lignina e os polissacarídeos da madeira,
são conhecidos em parte devido a estudos por microscopia eletrônica (DANIEL
et ai., 1989, BARRASA et ai., 1992, DANIEL, 1994, SREBOTNIK e MESSNER,
1994). A degradação fúngica da parede da célula vegetal, geralmente· estende-
se desde o lúmen da célula, atravessando as diferentes camadas da parede
até alcançar a lamela média. Os estudos de microscopia eletrônica revelaram
que o processo de decomposição da parede celular pode ocorrer sem o
contato direto da hifa com a célula, sugerindo a participação de sistemas
enzimáticos e/ou não enzimáticos extracelulares, embora o mecanismo através
do qual isto ocorre não é ainda bem compreendido. O transporte das enzimas
lignocelulolíticas até o substrato (parede celular) pode estar relacionado com a
camada da glucana que rodeia a hifa fúngica e cria um microarnbiente
favorável às enzimas e à ocorrência de diferentes reações (EVANS et ai.,
1991, RUEL et ai., 1994). Atualmente existe muita controvérsia se, devido ao
seu tamanho, as enzimas lignocelulolíticas conseguem penetrar na parede da
célula vegetal para agirem diretamente sobre os diferentes componentes, ou
lO
se a decomposição é iniciada por agentes não enzimáticos de baixa massa
molar que podem difundir facilmente através da parede (EVANS et ai., 1991,
1994, JOSELEAU et ai., 1994).
EVANS et ai (1991 ), utilizando técnicas de imunocitoquímica e
microscopia eletrônica mostraram a localização das enzimas lignocelulolíticas
em madeira degradada por fungos de decomposição branca. Com esses
resultados os autores postularam a hipótese de que nenhuma das enzimas
celulases, lacases ou LiP, iniciariam o processo de degradação da madeira,
uma vez que estas não foram localizadas na parede celular nos estágios
iniciais de decomposição. Os iniciadores do processo provavelmente seriam
moléculas pequenas que podem difundir desde a hifa e penetrar através dos
poros da matriz lignocelulósica. Assim, é proposto que os radicais livres de
H202 iniciariam a quebra da celulose, e o radical catiônico do álcool veratrílico
seria o responsável pelo início da degradação da lignina.
Estudos utilizando técnicas de exclusão de solutos e microscopia
eletrônica, mostraram que o tamanho dos poros da parede celular, tanto em
madeira intacta quanto degradada, não supera os 3,8 nm de diâmetro, o qual
permite a entrada de moléculas com uma massa molar menor que 6.000 Da
(FLUORNOY et ai., 1991, SREBOTNIK e MESSNER, 1991 ).
BLANCHETTE et ai (1997), através de análise estrutural, de
imunocitoquímica e de espectroscopia de absorção no ultra violeta, tentaram
elucidar as mudanças que ocorrem dentro da parede das células dá madeira
de pinus degradada pelo fungo de decomposição branca, C. subvermispora.
Proteínas foram utilizadas como marcadores e as análises demonstraram que
a porosidade da parede celular aumentou com o aumento do tempo de
incubação. Insulina (5. 730 Da), penetrou as regiões mais externas da parede
secundária após 2 semanas de incubação. Mioglobina (17.600 Da) penetrou
na parede celular após 4 semanas de degradação e ovalbumina ( 44.287 Da)
após 8 semanas, quando a madeira já estava em estágios avançados de
decomposição. Nenhuma das proteínas utilizadas, foi localizada dentro da
parede das células não tratadas, que foram utilizadas como controle.
Todos esses antecedentes, e muitos outros existentes na
literatura, reforçam a hipótese de que a degradação da matriz lignocelulósica
11
da madeira não é resultado somente da atividade enzimática, principalmente
nos estágios iniciais, mas também o resultado da· ação de diversos agentes
não-enzimáticos, de baixa massa molar. A degradação não enzimática é
provavelmente de maior significância para os fungos de decomposição parda,
uma vez que estes provocam uma despolimerização muito rápida e eficiente
da matriz lignocelulósica. Em um estágio inicial, observa-se uma degradação
extensa da camada S2 da parede, enquanto a camada S3, adjacente à hifa
fúngica permanece intacta. Embora a degradação por estes fungos seja
extensa, não é acompanhada de uma perda de peso significativa da madeira
(KIM et ai., 1991 ).
2.3 - Agentes não enzimáticos envolvidos na degradação de madeira
Os agentes de baixa massa molar até agora identificados e
relacionados à degradação dos componentes da parede celular da madeira,
por fungos de decomposição branca e parda, são: o álcool veratrílico, o
oxalato, o manganês, o sistema H202'Fe (li) (reação de Fenton) e os agentes
quelantes de ferro - os sideróforos e os glicopeptídeos (GOODELL et ai., 1997;
ENOKI et et., 1997; JORDAN et ai., 1996).
A) Álcool Veratrílico
O álcool veratrílico é sintetizado a partir da L-fenilalanina e pode
agir como um mediador redox na degradação da lignina. Neste mecanismo, o
álcool veratrílico é oxidado pela lignina-peroxidase para formar um radical
catiônico (AV°). Sob a forma deste radical, o álcool veratrílico poderia difundir
através da matriz lignocelulósica e iniciar a despolimerização de lignina
(ZAPANTA e TIEN, 1997).
B) Oxalato
O oxalato é um ácido orgânico com propriedade quelante
produzido pelo metabolismo secundário, tanto por fungos de decomposição
branca quanto parda e diversas das suas funções podem estar relacionadas
com a degradação de celulose e lignina na madeira. O oxalato pode ser
responsável por um ataque direto sobre a celulose e hemicelulose da madeira,
provocando uma hidrólise ácida. Porém, acredita-se que o papel principal do
12
oxalato seja a redução de Fe(III) presente na madeira a Fe(II), na presença de
luz, o qual reage com H202, para produzir radicais HO• e despolimerizar a
celulose, via reação de Fenton (GOODELL et ai., 1997).
Em fungos de decomposição parda, grandes quantidades de
ácido oxálico são produzidos e acumulados na cultura, no entanto, os fungos
de decomposição branca não acumulam o ácido, mas o decompõem a dióxido
de carbono.
C) Manganês
O Mn (Ili) é um oxidante capaz de se difundir na parede celular
vegetal e oxidar substratos fenólicos e é formado a través da oxidação de
Mn(II) pela manganês-peroxidase na presença de H202. Através de
microscopia eletrônica foi possível demonstrar as significativas modificações
produzidas em polpas e madeiras pelos complexos Mn(lll)-ácidos orgânicos.
Porém, parece que os complexos de Mn(III) possuem uma atividade oxidativa
específica e restrita à lignina e seus produtos de degradação, sendo incapazes
de atuar diretamente sobre os polissacarídeos (JOSELEAU et ai., 1994).
D) Sistema H20z/Fe(II)
Os reagentes de Fenton, uma solução de peróxido de hidrogênio
e Fe(II), produzem radicais HO•, através da reação:
H202 + Fe 2+--.; HO• + HO- + Fe3+.
O ferro existe na madeira não degradada numa faixa de 0-2 µM;
enquanto o H202 é um produto da autoxidação de compostos fenólicos livres. É
possível que uma fonte para H202 em fungos de decomposição parda seja a
autoxidação de compostos fenolato produzidos pelos fungos a partir de
compostos oxidados a partir da própria parede da madeira (GOODELL et ai.,
1997).
Embora os radicais HO• produzidos pela reação, possam reagir
mais rapidamente com compostos aromáticos (ex.: lignina) do que com
carboidratos, os radicais HO•, em geral, são altamente reativos e não seletivos
(KREMER e WOOD, 1992).
E) Agentes Quelantes de Ferro
A produção de agentes quelantes com alta afinidade por Fe(III)
foi recentemente descrita para fungos de decomposição branca e parda. Estes
13
agentes de natureza variada, apresentaram uma massa molar que varia entre
500 - 1500 Da, complexam Fe(III) e o reduzem para Fe(II). Na presença de
H202 via reação de Fenton, radicais HO• são produzidos. As espécies
radicalares formadas podem estar implicadas na degradação da parede celular
(GOODELL et ai., 1997, ENOKI et ai., 1997)).
2.3.1 - Agentes quelantes de ferro
O ferro é um elemento essencial no crescimento da maioria dos
microrganismos, e existe na natureza predominantemente como Fe (Ili),
insolúvel e não disponível para a sua assimilação por parte dos
microrganismos. Para solubilizar e retirar o Fe (Ili) e outros metais de
transição, alguns fungos e bactérias sintetizam e secretam compostos de baixa
massa molar (300- 1000 Da), conhecidos como sideróforos (MESSENGER e
RATLEDGE, 1985).
Sideróforos são quelantes específicos com alta constante de
afinidade por metais ( constante de complexação maior que 1030), formando
complexos com alta estabilidade. Estes compostos são produzidos
extracelularmente por microrganismos para sequestrar e transportar o ferro,
onde o ambiente é deficiente neste metal. Compostos tipo sideróforos foram
detectados em vários fungos com capacidade de degradar materiais
lignocelulósicos (FEKETE et ai, 1989, JELLISSON et ai, 1990, DURÁN e
MACHUCA, 1995). Nesses fungos, os sideróforos parecem exercer uma outra
função além de complexar o Fe(III), por exemplo como catalisador na
degradação de derivados de lignina (PARRA et ai., 1997, RODRIGUEZ et ai,
1997; JELLISON et ai., 1993 a,b ).
Grande parte dos estudos com sideróforos está relacionada a
mecanismos de captação de ferro, de transporte até o interior da célula
microbiana, de regulação molecular da produção, principalmente em bactérias
e fungos patógenos de plantas e animais, onde estes sideróforos representam
o agente de patogenecidade ou fator de virulência (PAYNE, 1988; MARTÍNEZ
etal., 1990; WOOLDRIDGE e WILLIAMS,1993).
14
A condição essencial que regula a biossíntese dos sideróforos
por microrganismos é um ambiente pobre em ferro. Muitos microrganismos
somente excretam os complexantes quando a concentração de ferro no
ambiente é inferior a 1 ,O µM (BAGG e NEILANDS, 1987). Segundo NEILANDS
(1984), uma concentração de ferro acima de 10 µM no meio de cultivo produz
um bom crescimento microbiano, porém reprime a produção de sideróforos.
Estruturalmente, é possível diferenciar dois grandes grupos de
sideróforos, os do tipo catecolato e os do tipo hidroxamato. As estruturas dos
sideróforos produzidos por diferentes microrganismos são muito variadas,
podendo apresentar, além do grupo funcional característico, um ou mais
aminoácidos, ou às vezes algum cromóforo. Nesta estrutura, o Fe(III) está
complexado principalmente através dos átomos de oxigênio, formando um
complexo de coordenação termodinamicamente estável. Outros tipos de
estruturas encontradas em sideróforos são hidroxamato-catecolato, a-
hidroxicarboxilatos (derivados de citrato) e oxazolinas (NEILANDS, 1984;
HIDER, 1984; WINKELMANN, 1986, 1992). Na Figura 1, aparecem as
estruturas dos sideróforos mais representativos do grupo dos hidroxamatos
(ferricromo) e dos catecolatos (enteroquelina}, e também é mostrado a
estrutura do sideróforo _ tipo hidroxamato, desferrioxamina 8, produzido
comercialmente sob o nome de Desferal.
15
A
e
Figura 1: Estrutura de sideróforos representativos do grupo dos hidroxamatos
(ferricromo) (A) , do grupo dos catecolatos (enteroquelina) (8), e o sideróforo
comercial do tipo hidroxamato, desferrioxamina B ou Desferal (C).
Recentemente, GOODELL et ai (1995, 1997) e PASZYNSKI et ai
(1998), isolaram e caracterizaram vários compostos do tipo catecolato da
cultura do fungo de decomposição parda Gloeophyl/um trabeum. Os
compostos foram isolados da cultura do fungo por extração com acetato de
etila. Os extratos apresentaram reação positiva com Cromo Azurol - S (CAS).
As estruturas foram caracterizadas por espectroscopia de massa (CG-MS)
através da comparação com um padrão sintético e possuíam composição
fenólica. Quatro grupos de derivados do benzeno foram identificados: ácidos
16
fenilacéticos hidroxilados, ácidos benzóicos hidroxilados, derivados de
benzeno hidroxilados e dihidroxifenilpentanodiol. Estes quelantes
apresentaram alta afinidade por Fe(III) e mediaram a redução deste metal em
valores de pH abaixo da neutralidade. As espécies de oxigênio reativas
· geradas por estes quelantes, puderam mediar a degradação de compostos
celulósicos e fenólicos cloradas.
ENOKI et ai. (1997), utilizando filtração em gel, isolaram
· substâncias extracelulares de baixa massa molar a partir de culturas de fungos
de decomposição parda e branca. O glicopeptídeo obtido através do fungo de
decomposição parda Tyromices. palustris continha O, 12% de Fe(II), 13% de
proteína e 22% de carboidratos, e o obtido a partir do fungo de decomposição
branca Phanerochaete chrysosporium, continha 0,28% de Fe(II), 18% de
proteína e 20% de carboidratos. Os compostos oxidaram o KTBA (ácido 2-
ceto-4-metilbutírico) via tranferência de um elétron na presença de H202 e
mostraram capacidade de reduzir Fe(III) a Fe(II) e adsorver fortemente Fe(II).
Um composto de baixa massa molar (530 Da) foi isolado de
culturas líquidas do fungo Thermoascus aurantiacus, crescidos em farelo de
trigo. A caracterização parcial do composto indicou uma estrutura de
polihidroxamato, contendo ferro. Diferentemente dos outros sideróforos
descritos anteriormente, o composto de T. aurantiacus apresentou uma
atividade catalítica de fenoloxidase com uma ampla variedade de substratos
fenólicos e não fenólicos. A reação de oxidação foi máxima em meio ácido (pH
2-3) e na ausência de H202. (MACHUCA, 1995, DURÁN e MACHUCA, 1995).
'-· -
2.4 - Mecanismos catalíticos propostos para os agentes quelantes de
ferro
A degradação da matriz lignocelulósica da madeira é um
processo dependente da geração de espécies radicalares. Dentro deste
processo o ferro desempenha um papel muito importante, tanto na degradação
por fungos de decomposição branca, quanto parda. O ferro forma parte das
peroxidases produzidas por fungos de decomposição branca, que estão
envolvidas na degradação da madeira, e em fungos de decomposição parda
17
participa do sistema que gera radicais HO•, via reação de Fenton. Portanto,
ambos os grupos de fungos devem manter um controle rigoroso de seus níveis
de ferro, através da produção de agentes quelantes (FEKETE et ai., 1989).
Até o presente momento, poucos estudos relacionam a produção
. destes complexantes por fungos de decomposição branca e parda com o
processo de degradação da madeira ou de outros substratos lignocelulósicos.
Os sideróforos produzidos por G. trabeum foram detectados em
· madeira infestada pelo fungo, através de técnicas de imunocitoquímica e microscopia eletrônica. Os resultados revelaram a presença dos complexantes
na camada de glucana que reveste externamente a hifa fúngica. Nos estágios
iniciais de degradação, os sideróforos apareceram em maior quantidade nas
regiões próximas da hifa, onde a degradação da parede celular é evidente,
porém não foram observados na lamela média (JELLISON et ai., 1991 ).
Segundo os autores, este é o primeiro estudo que mostra a localização in situ
de sideróforos sobre a madeira infestada po_r um fungo de decomposição
parda.
Posteriormente, os compostos produzidos por G. trabeum foram
isolados e caracterizados por GOODELL et ai. (1995, 1997). Esses compostos
mostraram capacidade de complexar o Fe(III) reduzindo-o a Fe(II), produzir
radicais HO• em presença de H202 e catalisar as reações de oxidação via
transferência de um elétron, da mesma forma como acontece com as enzimas
ligninolíticas. A reação de redução de Fe(III) era mais rápida em pH 2,0 do que
nos meios mais básicos, sendo que acima de pH 7,0 não havia redução. Os
autores postulam uma hipótese para o ciclo redox dos compostos, que se inicia
com a liberação do complexante pela hifa fúngica dentro do lúmen da célula
vegetal, onde o meio é fortemente ácido. O sideróforo, a seguir, complexa o
Fe(III) presente na madeira, e o reduz para Fe(II). Em meio ácido, o ferro sob a
forma de Fe(II) é altamente estável, e assim é transportado pelo sideróforo até
as camadas da parede celular. Dentro da parede celular o pH mais alto pode
propiciar um ambiente onde o Fe(II) complexado é facilmente disponível para
reagir com o H202 proveniente de outras vias metabólicas, gerando radicais
HO•·, que iniciam as reações de despolimerização dos materiais
lignocelulósicos (GOODELL et ai., 1997) (Figura 2).
18
Dentro deste esquema, os autores propuseram um papel para o
oxalato produzido pelo fungo. O oxalato atuaria como um agente com
capacidade de sequestrar o Fe(III) desde formas insolúveis e transferi-lo para
o complexante de G. trabeum, através de um mecanismo dependente do pH.
· Desta forma, longe da hifa e no meio mais básico da parede celular, o
complexante de G. trabeum, após redução do Fe(III) poderia reagir com H202,
gerando espécies radicalares.
Embora algumas das vias do mecanismo proposto por GOODELL
et ai. (1997), já foram comprovadas experimentalmente, outras ainda deverão
ser comprovadas e outros agentes, redutores ou oxidantes, deverão ser
identificados para completa compreensão do mecanismo.
Apesar dos compostos produzidos por G. trabeum terem sido
caracterizados como catecolatos, os autores não utilizaram o termo sideróforo
para designá-los, desde que este termo seria reservado para quelantes que
funcionam na captação de metais, especificamente Fe(III), para as funções
metabólicas intracelulares dos microrganismos. Assim, os autores preferem a
utilização do termo "agentes quelantes de ferro de G. trabeum"("Gt -
chelators") (GOODELL et ai., 1997). • I :
. -, ~-, ~:
Felll (hidr)oxidos
19
Meío ácido próximo a hifa fún~ca
Quelante · Gt
??Redutor Agentes quelantes de Fe( Quelante-Gt)
Quelante-Gt (oxidado)
Fe llI +'011
Degradação oxidativa de lignocelulósicos
.Meio levemente alcalino na parede celular
Oxalato (Cp;) ou
1co2 + co; redutor ?l
Frações reduzidas do quelante-Gt ou pollfenóls da parede celular da madeira
Fermas de quinona ou seml-qulnona olidadas
Figura 2: Mecanismo proposto para a degradação de madeira pelo fungo de
decomposição parda G. trsbeum, através da produção de radicais livres (OH•),
gerados pelo sistema Gt-quelante, na parede da célula vegetal (GOODELL et
ai., 1997).
20
Os sideróforos produzidos por G. trabeum foram capazes de
catalisar a reação de oxidação do KTBA. A reação de oxidação ocorre via
transferência de um elétron, depende da concentração de sideróforo, ocorre
· com maior velocidade em meio ácido (pH 3,0), e é estimulada pela adição de
Fe(II) e Mn(II), sendo o efeito de Fe(II) muito maior que o de Mn(II)
(CHANDHOKE et ai., 1992).
ENOKI et ai. (1989}, já haviam tentado relacionar a degradação
de madeira com a produção de oxidases que catalisam reações de oxidação
via transferência de um elétron, em fungos de decomposição parda.
Relacionaram também a produção de etileno a partir de KTBA, com a
degradação de lignina, celulose e madeira. Uma fração parcialmente
purificada, que os autores denominaram de proteína extracelular, obtida dos
diferentes fungos em estudo, oxidava KTBA na presença de H202. A fração
oxidou também NADH, com produção de H202, via radicais superoxiânion
(02º•) na presença de 02. A fração mostrou pouca atividade fenoloxidativa, nas
condições onde a máxima oxidação de KTBA era observada. Para G. trabeum,
um dos fungos estudados por estes autores, a atividade de oxidação era
induzida por glicose, celulose e madeira, porém não por lignina.
Em um trabalho posterior, os autores isolaram as proteínas
extracelulares mencionadas. anteriormente, a partir de culturas de G. trabeum
e outro fungo de decomposição parda, o T. palustris (ENOKI et ai., 1990,
HIRANO et ai., 1995). Os compostos que foram caracterizados como
glicopeptídeos e oxidaram o KTBA, via transferência de um elétron na
presença de H202. No estágio inicial de degradação da madeira pelos fungos
de decomposição parda, a hifa presente no lúmen da célula vegetal excreta os
glicopeptídeos que se combinam com o ferro presente na madeira. Os
glicopeptídeos podem reduzir o Fe(III) para Fe(II) e adsorver fortemente o
Fe(II). Na camada S2 os glicopeptídeos-Fe(II) catalisam a oxidação de
doadores de elétrons produzindo as espécies 02-•, H202 e HO•, e podem
iniciar a degradação de celulose e lignina na matriz lignocelulósica (ENOKI et
ai., 1997) (Figura 3).
21
Os mesmos glicopeptídeos, apresentando idênticas
propriedades, foram isolados do fungo de decomposição branca, lrpex lacteus
(TANAKA et ai., 1991, 1993). O glicopeptídeo de I. lacteus foi mais abundante
extracelularmente em culturas contendo madeira do que em culturas com
· glicose como fonte de carbono. A atividade de oxidação do KTBA foi
correlacionada à atividade de degradação de madeira, porém não com a
atividade fenoloxidativa observada nas culturas do fungo (T ANAKA et et.,
· 1993). Estes glicopeptídeos foram também isolados e caracterizados do
conhecido fungo ligninolítico P. chrysosporium (TANAKA et ai., 1996). Todos
esses glicopeptídeos apresentaram idênticas propriedades estruturais e
oxidaram KTBA através do mesmo mecanismo
Doadores de Aceptor de elétrons (forma elétrons (forma reduzida) como oxidada) como
o NADH Aº NAD+ -
02 "=. ~ > (02º)
i Fe(ll)-glicopeptídeo
HO" ------'>,...HP2 r. v_ . . F e(ll)-gl1copept1deo F e(lll)-gl1copept1deo
~ Glicopeptldeo Glicopeptídeo
(forma oxidada) (forma reduzida)
Figura 3: Mecanismo proposto para a geração de espécies ativas de oxigênio
pelos glicopeptídeos isolados de culturas de P. chrysosporium e T palustris
(ENOKI et ai., 1997).
O composto do tipo polihidroxamato, isolado de culturas do
ascomiceto T aurantiacus, apresentou propriedades diferentes àquelas dos
compostos descritos anteriormente (MACHUCA, 1995).
O composto na sua forma complexada com Fe(III) participa de
reações de oxidação de uma série de substratos típicos de fenoloxidases, na
ausência de H202, em pH 3,0. Em muitos fungos ligninolíticos o oxalato e a
celobiose-desidrogenase podem participar do mecanismo de redução do ferro.
Porém, existem outros sistemas onde o próprio composto complexante
22
apresenta capacidade de reduzir o Fe(III) a Fe(II). A o-dianisidina também
pode ser oxidada pelo composto de T aurantiacus com atividade oxidativa, como proposto na Figura 4, onde a o-dianisidina deve ser substituída por
algum doador de elétron presente na madeira, e as espécies radicalares
geradas durante as diferentes etapas seriam as responsáveis pela degradação
dos componentes da parede da célula vegetal.
CFc(Il) CFc(Il)
Oi> \ -- Oi > "'\ - ·OOH ~
NJiz . ~
C-Fc(U)
~
C-Fc(Il) : Corrp:,sto tipo Sd::róforo ~
C-Fc(U)
C-Fc(lII)
Figura 4: Mecanismo proposto para a oxidação de o-dianisidina pelos
compostos de baixa massa molar obtidos a partir do ascomiceto T. aurantiacus
(MACHUCA, 1995).
23
2.5 - Utilização de agentes quelantes de ferro no tratamento de polpas
celulósicas
Nos últimos anos o interesse crescente pelos problemas de
· contaminação ambiental têm conduzido ao desenvolvimento de processos
industriais alternativos que surgem da combinação de processos químicos com
tratamentos biológicos. Um dos processos industriais responsáveis pela maior
carga contaminante no ambiente é a fabricação de polpa e papel. O alto
conteúdo de reagentes químicos utilizados na deslignificação das madeiras e
posterior branqueamento das polpas de celulose, origina · grandes cargas
poluentes que chegam ao ambiente na forma de efluentes fenólicos,
fortemente coloridos e altamente tóxicos.
Uma variedade de processos de branqueamento têm sido
investigados para produzir polpas de alta alvura e alta qualidade, com mínimo
custo e mínimo impacto ambiental. Dentre estes, estão incluídos a utilização
dos compostos quelantes de baixa massa molar, produzidos por fungos.
JELLISON et ai. (1990), reportaram a utilização de uma fração
parcialmente purificada contendo sideróforos no tratamento de polpa kraft, e
observaram que após 30 minutos de incubação era possível apreciar
(visualmente) uma descoloração da polpa. Porém, os resultados apresentados
são apenas qualitativos, não sendo conduzido nenhum estudo posterior.
Uma fração parcialmente purificada, obtida do extrato de
Ganoderma applanatum, com características de catecol, foi utilizada no
tratamento de polpa kraft de pinus. Essa fração na presença de peróxido de
hidrogênio (0,5%) deslignificou as polpas (5%) e revelou-se bastante eficiente
na proteção da viscosidade, um indicador da integridade da celulose da polpa
(PARRA et ai., 1998).
Os extratos do T. aurantiacus contendo compostos do tipo
hidroxamato, com alta atividade fenoloxidásica, exerceram uma eficiente ação
na descontaminação do efluente kraft (Eucalyptus e pinus), provocando 42%
de mineralização do efluente após 72 horas de tratamento, a 25 ºc e pH 4, O.
Também foi observada uma redução de cor e de fenóis de 61 e 70%,
respectivamente (MACHUCA, 1995).
24
Estes extratos também mostraram-se eficientes no tratamento de
polpa kraft de eucalipto, obtendo-se 39% de deslignificação após 60 minutos à
50 ºC e pH 3,0, seguida de uma etapa de extração alcalina (4% NaOH, 70 ºC,
90 min), porém nestas condições uma redução de viscosidade foi observada
(DURÁN e MACHUCA, 1995).
2.6 - Utilização de compostos modelo de sideróforos no tratamento de
polpas celulósicas
A habilidade das enzimas fúngicas e agentes não enzimáticos
para degradar lignina, têm sugerido o estudo de compostos mais simples para
mimetizar a ação destes sistemas. O estudo dos compostos biomiméticos nos
processos biológicos é um atrativo para a deslignificação de polpas, pois os
compostos biomiméticos são frequentemente pequenos, aumentando a
acessibilidade ao substrato. Para os sistemas de branqueamento biomiméticos
serem considerados comercialmente viáveis, eles devem demonstrar
seletividade para a remoção de lignina. Em muitos casos, observa-se uma
substancial degradação de carboidratos, provavelmete, devido à presença de
radicais HO• gerados a partir de oxidantes adicionados às reações
(usualmente peróxido de hidrogênio) (WALKER et ai., 1995).
A seletividade de três compostos biomiméticos ( sulfato ferroso,
íon ferroso quelado com EDTA (ácido etilenodiaminotetracético) e
hemoglobina) foi investigada por WALKER et ai. (1995), usando lignosulfonato
e hidroxietil celulose (HEC) como substratos. Todos os três compostos
biomiméticos, na presença de peróxido de hidrogênio, foram capazes de
despolimerizar os compostos lignosulfonato e a HEC. Para reações com
lignosulfonatos, quase todo o peróxido de hidrogênio é consumido quando a
degradação ocorre. Por outro lado, pouco peróxido de hidrogênio é consumido
em reações com HEC. Hemoglobina exibiu a maior seletividade na degradação
de lignosulfonatos em relação à degradação de HEC, quando os dois
substratos foram oxidados separadamente. A hemoglobina parece não ser
apenas um composto biomimético seletivo, mas é também um composto
biomimético eficiente · quando utilizado com peróxido de hidrogênio. Quando
25
comparado com a reação controle, a hemoglobina permite que mais peróxido
de hidrogênio seja consumido pela reação, do que decomposto a oxigênio.
Cuidados na seleção dos compostos biomiméticos, podem aumentar a
eficiência do peróxido de hidrogênio, num estágio de deslignificação posterior
com peróxido.
Polpa kraft de eucalipto foi tratada com um sistema
hemina/peróxido de hidrogênio sob condições de refluxo e obteve-se uma
redução do número kappa de 18 para 2 em apenas 2 horas de tratamento.
Entretanto, a perda de peso foi alta e os efeitos do tratamento na característica
da polpa não foram reportados (ERISMANN et ai., 1_990).
SHIMADA et ai. (1989), reportaram um branqueamento
biomimético de polpa conduzido com complexo catalisador Mn/Co na presença
de ácido peracético, que pode ser utilizado pela indústria como uma alternativa
de branqueamento livre de cloro. O tratamento de polpa kraft de madeira dura
não branqueada por este sistema biornimético, aumentou a alvura da polpa
rapidamente, passando de 35 para 80%. No entanto, o sistema controle, sem
catalisador Mn/Co, produziu uma alvura de apenas 53% o que demonstra que
o branqueamento não é completado quando se utiliza apenas ácido peracético
nestas condições experimentais.
PARRA et ai. (1998), utilizaram catecol e um modelo de
sideróforos do tipo 2,3 - dihidroxibenzóico (DHBA) na presença de H202 (0,5%)
no tratamento de polpas kraft de pinus. Os compostos revelaram-se bastante
eficientes na deslignificação das polpas (DHBA - 15% de deslignificação e
catecol - 11 % de deslignificação), porém nessas condições houve uma grande
diminuição da viscosidade. Os resultados obtidos demonstram que o catecol e
o DHBA quelaram o ferro existente na polpa e na presença de H202
produziram o radical HO•, o qual degradou celulose, diminuindo a viscosidade
das polpas.
Também foram feitos estudos sobre a utilização dos compostos
modelo de sideróforos comerciais DHBA, ácido 3,4 dihidroxifenil acético
(DHPAA) e ácido acetohidroxâmico (AHA), em degradação de lignina e
clorolignina de efluentes de indústrias papeleiras. Estes compostos
degradaram lignina numa taxa de 60% (depois de 2 horas), 85% e 65%
:.:·: ~. . . ~' ,·
26
(depois de 24 horas), respectivamente. DHPAA/Fe(III) degradou o efluente do
branqueamento (E1) numa taxa de 80% em 5 minutos nas condições de
estudo. Com base na atividade fenoloxidásica dos complexos DHBA-Fe(III),
DHPAA-Fe(III) e AHA-Fe(III), conclui-se que estes compostos agem com a
vantagem de atuar como quelante e sistema mimético enzimático, no efluente
(PARRA et ai, 1997).
As estruturas dos compostos modelo de sideróforos AHA, DHBA
e DHPAA, estão apresentadas na Figura 5.
H <, -<CH3 N '-. .
Ho/ O A
COOH
B e
Figura 5: Estrutura dos . compostos modelo de sideróforos: (A) ácido
acetohidroxâmico (AHA) (PM = 75,07), (8) ácido 2,3-dihidroxibenzóico (DHBA)
(PM = 154,12) e (C) ácido 3,4 dihidroxifenil acético (DHPAA) (PM = 168,15)
(ALDRICH HANDBOOK, 1986).
27
3 - Objetivos
O objetivo principal deste trabalho foi utilizar compostos de baixa
massa molar produzidos por fungos decompositores de madeira e compostos
modelos de sideróforos para tratar polpas celulósicas, em sequências de
. branqueamento com peróxido.
Para atingir tais objetivos:
- Compostos de baixa massa molar com características de sideróforos foram
obtidos de culturas líquidas de diferentes fungos decompositores de madeira e
a capacidade oxidativa destes compostos foi verificada usando diferentes
substratos.
- Após seleção dos fungos produtores de sideróforos com atividade oxidativa,
as frações de baixa massa molar foram obtidas dos extratos fúngicos através
de ultrafiltração por membrana de corte de 5000 Da. Nessas frações foi
determinada a atividade oxidativa, a presença de sideróforos e a capacidade
de redução de Fe(III).
- A atividade oxidativa e a capacidade de complexar e reduzir Fe(III) pelos
compostos modelo de sideróforos e o sideróforo comercial, Desferal, foram
determinadas.
- Os compostos fúngicos de baixa massa molar e os compostos modelo de
sideróforos e Desferal foram utilizados no tratamento de polpas celulósicas e
algumas propriedades das polpas foram analisadas.
28
4 - Material e Métodos
4.1 - Compostos modelo de sideróforos
Foram utilizados três modelos de sideróforos comerciais diferentes,
sendo dois do tipo catecolato (ácido 2,3 dihidroxibenzóico (DHBA) (Sigma) e
ácldo 3,4 dihidroxifenil acético (DHPAA) (Sigma)) e um do tipo hidroxamato
(ácido acetohidroxâmico (AHA) (Sigma)). O desferal (Desferrioxamina B - Ciba),
um sideróforo comercial com estrutura de ácido hidroxâmico, também foi utilizado
neste trabalho.
4.2 - Microrganismos
Foram utilizadas espécies de fungos da classe Basidiomycotina,
sendo duas espécies de decomposição parda "Brown-rot": Poria cocos (ATCC
62778) e Laetiporus sulfureus (ATCC 52600) e, sete de decomposição branca
"White-rot": Pycnoporus coccineus (ATCC 32258), Poria medula-panis (ATCC
42463), Phellinus pini (ATCC 12240), Merulius tremellosus (ATCC 487 45) e as
cepas do Ceriporiopsis subverminospora, Trametes versicolor e Phanerochaete
chrysosporium, que pertencem à coleção de cultura do DEBIQ. Uma cepa
brasileira do fungo Thermoascus aurantiacus (ATCC 204492) pertencente à classe Ascomycotina, também foi utilizada neste estudo. ·
4.3 - Meio de manutenção dos fungos
Os fungos foram mantidos e repicados em tubos de ensaio e placas
de Petri, contendo meio ágar-extrato de malte, a 2%. A incubação foi realizada a
28 ºC, com exceção do T aurantiacus, que foi incubado a 45 ºC, durante 8 dias,
ou até o máximo crescimento micelial.
29
4.4 - Cultivo dos fungos em meio líquido
Para o preparo do inóculo, quatro discos de ágar-micélio (5,0 mm de
diâmetro) foram transferidos do meio de manutenção para frascos Erlenmeyers
de 250 ml contendo 100 ml de extrato de malte (Merck) 2%. As culturas foram
incubadas numa temperatura de 28 ºC, exceto o T. aurantiacus, que foi incubado
a 45 ºC, por um período de 30 dias, sob condições estacionárias. Amostras foram
retiradas a cada 5 dias sempre do mesmo frasco, e centrifugadas antes de serem
analisadas.
4.5 - Meio de cultivo suplementado
Os fungos T. · versicolor, P. medula-panis e T. aurantiacus, foram
crescidos em meio Czapeck, sem fonte de carbono, suplementado com serragem
de eucalipto ou farelo de trigo, a 2,0%. O meio de cultura Czapek continha (g/L):
NaN03 (Merck), 3,0; MgS04 (Lab), 0,5; KH2P04 (Merck), 1,0; KCI (Merck), 0,5 e o
pH do meio foi ajustado para pH 6,5 antes de ser autoclavado a 121 ºC durante
15 minutos. Todos os reagentes utilizados possuíam grau analítico.
A serragem e o farelo de trigo foram triturados em um moinho
equipado com peneira de 7 mesh, e autoclavados separadamente do meio em
frascos Erlenmeyer de 250 ml, durante 1 hora a 121 ºC. Posteriormente, foram
misturados com 100 mi de meio Czapek antes de serem inoculados.
A inoculação dos fungos e a incubação foram feitas como
anteriormente descritas.
4.6 - Separação dos compostos de baixa massa molar das culturas fúngicas
4.6.1 - Fungos cultivados em extrato de malte
Os caldos de cultura obtidos após 30 dias de crescimento dos
fungos em meio extrato de malte 2%, foram filtrados e concentrados cerca de 1 O
vezes em um liofilizador Edwards Super Modulyo. Estes caldos liofilizados foram
ultrafiltrados através de · uma membrana de colódio de corte 1 O KDa (Ultra
30
Trimbles UH 100/1 O - Schleicher & Schuell). Na fração < 1 O KDa (filtrada),
analisou-se a presença de sideróforos e de atividade oxidativa. Após estas
análises, os filtrados ( < 1 O KDa) que apresentaram atividade, foram ultrafiltrados
numa membrana de ultrafiltração de 3 KDa (Regenerated Cellulose - 3000
NMWT - Millipore) e os ultrafiltrados (< 3 KDa) foram novamente analisados para
a presença de sideróforos e de atividade oxidativa.
4~6.2 - Fungos cultivados em meio Czapeck suplementado com farelo de
trigo
Os caldos de cultura obtidos após 30 dias de crescimento dos
fungos em meio contendo farelo de trigo (2 %), foram utilizados nesta etapa, uma
vez que este substrato induziu as maiores atividades oxidativas. Estes caldos
foram concentrados cerca de 1 O vezes por liofilização e, posteriormente
transferidos para tubos apropriados contendo uma membrana de corte 5 KDa
(Ultrafree - 15 centrifugai Biornax- 3 KNMWL - Milipore ). Os caldos liofilizados
foram centrifugados (centrífuga Jouan - Modelo MR 1812) a 10 ºC e 2400 x g por
30 min. Após separação -dos meios em duas frações, uma de alta e outra de
baixa massa molar analisou-se a presença de sideróforos, da atividade oxidativa
e análise de redução de ferro (Ili) com ferrozina (HIRANO et ai, 1995) (Esquema
1 ).
31
Esquema 1
! (·--•·.w= "";'""-'•• .. ,,.c~ ... ~ .. .'.,,.,K~,.,, .. ,.;;, ... ~.~.,.·m,.~; . .,_..,,r.ll
ll.~~~o de cultu~~~~celul~~ li ;1······· ··.··.····· ... ··.······.·--·~ ............ .....;;...,...,,.;..;_,.;,~1 !I Atividade Oxidativa J· tim .. ,,~u"= Reaç ã .?,.C~S- "'""=~~~~Jl
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. PM < 5KDa j 11 PM > 5 KDa l --· - ----·---·-.,~··-·.! iL- ..... --=---~., _ __j,
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! Atividade oxidativa f 1- l Reação CAS ,·, l . ,J,J•J•N•l"r1'l.;.,i,1-J,I<J•l,f,!~•rli'<•H•l•l•1'f·Ji•1'l·!~l·l·:•J<1'1•!•T•J•t+:·!·.l'Ni•J"l•l'!<:•H•foliio!.ii•Hi•l•l•,s!•l•!·!·i•!•l-l·!•!•f·:·:·J•l•l•:·!>l•,.]
w=·«···"""''""~;,m,. .. ·"''"""'m·c,·,., .. ~,=·~="'"';.,.., ....... ,.,.=,,.,,,,•:;;,11 u Cromatografia em l· li lÍ li Sephadex G-25 :.,1 jl H 11 H
11~~---····cc······--L~=c="_
~,1 i Leitura de Abs a 280 nm !! ·,, Atividade oxidativa H
f: H
f Reaç ã o CAS j! ib:,·1 'Hl'•'•'•HU'IF•'.',•• ·vv ·,·.· .0 -i,:·· ·.· '•F -:+'·1.0 · ...... -·.·,.·.~ •. ; ·,·,·,,::,h·, ··:i:·-,.1.~
32
4. 7 - Cromatografia em Sephadex G-25
Amostras liofilizadas (200 ul.) e ultrafiltradas (200 ul.) (PM<5 kDa)
obtidas no procedimento anterior foram aplicadas a uma coluna de Sephadex G-
25 (1,5· x 25,0 cm) previamente equilibrada com água deionizada. A coluna foi
eluida com água deionizada e frações de 1,5 ml foram coletadas com um fluxo
de O, 15 mUmin, as quais foram monitoradas a 280 nm em espectrofotômetro
Hitachi - Modelo 2001. O volume morto (Vo) desta coluna, determinado com Azul
de Dextrano (PM 2000 Kda) foi de 13,5 ml. As cromatografias foram conduzidas
à temperatura de 25 ºC.
Os picos de A280 eluídos da coluna foram reunidos, liofilizados e
analisados quanto à atividade oxidativa e reação CAS.
4.8 - Quantificação da produção de sideróforos pelo método CAS
Para detecção da presença de sideróforos em cultura líquida dos
fungos, foi empregado o método universal de SCHWYN e NEILANDS (1987).
Esse método consiste no 'preparo de um complexo indicador ternário contendo: 6
ml de uma solução de brometo de hexa-deciltrimetilamônio (HDTMA) 1 O mM, 1,5
mL de solução de cloreto de ferro (1 mM FeCb.6H20, 10 mM HCI) e 7,5 mi de
solução CAS 2 mM. A essa solução foi adicionada 4,307 g de piperazina anidra
dissolvida em água e o pH foi ajustado para 5,6 por adição de 6,25 mi de HCI
O, 12M. O volume final foi acertado para 100 ml. Todas as soluções aquosas
foram preparadas com água bidestilada e deionizada. O reagente CAS
complexado com Fe (Ili) na solução possui uma intensa cor azul com uma
absortividade e = 100.000 M-1 cm" a 630 nm e pH 5,6. O ensaio consistiu na
adição de 1,0 ml da solução de reagente CAS para 1,0 ml de caldo de cultura
ou solução contendo o sideróforo.
Para o controle foi utilizado 1,0 ml da solução de reagente CAS
para 1,0 ml de caldo do controle não inoculado.
As unidades percentuais de sideróforo foram definidas pela seguinte
fórmula (PAYNE, 1994):
33
Unidades % = (Ab - Aa) x 100
Ab
onde: Ab = Absorbância do controle
Aa = Absorbância da amostra
4.9 - Teste de atividade oxidativa
A atividade oxidativa foi determinada utilizando-se três substratos:
3-3' dimetoxibenzidina (o-dianisidina) (Sigma), ácido 2,2'-azinobis (3-
etilbenzitiazolina-6) sulfônico (ABTS) (Sigma) e 2,6-dimetoxifenol (Sigma). A
oxidação da o-dianisidina (e 4so = 29.400 M-1cm-1) foi conduzida numa mistura de
reação contendo 0,6 ml do extrato fúngico, 0,3 ml de tampão citrato-fosfato 0,05
M (pH 3,0) e 0, 1 ml de o-dianisidina 1,0 mM, num volume final de 1,0 ml. A
reação foi iniciada pela adição da o-dianisidina e a velocidade de oxidação
acompanhada durante 1 O minutos a 460 nm (SZKLARZ et ai., 1989, modificado).
Uma unidade de atividade foi definida como a quantidade de enzima necessária
para oxidar 1 µmolde substrato por minuto e por litro de caldo de cultivo (U/L).
A atividade oxidativa do desferal e dos compostos modelo de
sideróforos foi determinada sob diferentes condições de pH na ausência ou
presença de Fe (Ili), utilizando o-dianisidina 1 mM como substrato. A atividade
oxidativa foi ensaiada em ausência e na presença de tampão acetato de sódio 50
mM pH 5,0 e tampão glicina-HCI 50 mM pH 3,0. A mistura de reação continha
100 µL de o-dianisidina 1 mM e 375 µL da solução dos compostos modelo ou
desferal 2,0 mM. O volume final da reação foi de 1,0 mi. Quando o efeito do Fe
(Ili) foi testado na atividade oxidativa dos compostos, 5 ul, de solução de FeCb.6
H20 20 mM foram adicionados ao meio de reação.
A oxidação dos substratos ABTS (s42o = 36.000 M-1cm-1) e 2,6
dimetoxifenol (s469 = 49.600 M-1cm-1) foi acompanhada por uma reação similar à descrita para o-dianisidina, apenas mudando o comprimento de onda para 420
nm e 469 nm, respectivamente.
34
4.1 O - Ensaio de redução do Fe(III)
A redução de Fe(III) foi medida com ferrozina (1,0% em água
deionizada) (HIRANO et ai, 1995, modificado). A mistura de reação continha 0,75
mL da amostra, 0,4 ml de ferrozina, 0,8 ml de tampão acetato 50 mM, pH 4,5 e
0,05 ml de cloreto de ferro (FeCb.6H20) 20 mM, recém preparado. Para zerar o
aparelho, utilizou-se 0,8 ml de água deionizada, 0,8 ml do tampão acetato 50
mM, pH 4,5 e 0,4 ml de ferrozina. A formação de Fe (li) foi seguida durante 1 O
minutos a 562 nm. Após 1, 2 e 4 horas, foi feita novamente a leitura de
absorbância das amostras.
Um controle do meio de cultura foi preparado contendo O, 75 ml do
caldo fúngico, 0,4 ml de ferrozina, 0,85 mi de tampão acetato 50 mM, pH 4,5.
Outro controle contendo 0,4 ml de ferrozina, 1,55 ml de tampão acetato 50 mM,
pH 4,5 e 0,05 ml de cloreto de ferro (FeCb.6H20) 20 mM, também foi preparado.
Foi feita a reação da redução de Fe (IJI) com desferal, AHA, DHBA e
DHPAA, preparados numa concentração de 2,0 mM. O ensaio foi realizado como
anteriormente descrito, exceto que para estas amostras utilizou-se 5 ~ll de
FeCb.6H20 20 mM, para um volume final de 2,0 ml.
Os controles foram analisados pela leitura da Abs em 562 nm da
mesma forma descrita anteriormente.
4.11 - Quantificação de ferro na polpa
Para a análise de absorção atômica foi colocada 1 g de polpa de
celulose em um becker. Adicionou-se 1 O ml de HN03 concentrado, deixando
descansar durante toda a noite. Aqueceu-se a amostra até o total
desprendimento de N02 e após este procedimento, o becker foi esfriado e uma
pequena quantidade de H2S04 (2-4 ml) a 70%, foi adicionada. O becker foi
novamente aquecido até que o volume diminuísse. A amostra foi tranferida para
um balão de 50 ml e o volume foi aferido com água destilada.
Após este procedimento, foi feita a quantificação da quantidade de
ferro existente na amostra em um espectrofotômetro de absorção Perkin-Elmer.
35
4.12 - Pré-tratamento de polpas celulósicas
4.12.1 - Polpa
Utilizou-se uma polpa obtida de madeira de Eucalipto obtida através
do processo kraft, produzida na indústria de Papel e Celulose Bahia Sul, Teixeira
de Freitas, Ba. O número kappa inicial da polpa foi de 14, 1 , a viscosidade de
31,2 cps, a consistência de 15,46 % e a concentração de ferro, analisada por
absorção atômica foi de 9 mg/Kg de polpa. A polpa foi utilizada como recebida,
acertando-se somente o pH para o valor 3,0 com ácido sulfúrico (H2S04), 0, 1 N. A consistência inicial da polpa foi acertada em 1, O % com água
deionizada e o pH foi ajustado em pH 3, O.
4.12.3 - Pré-tratamento de polpas celulósicas com os compostos de baixa
massa molar dos caldos fúngicos.
Os diferentes tratamentos das polpas foram feitos com as frações de
baixa massa molar(< 5 KDa) obtidas das culturas fúngicas e que apresentaram
atividade oxidativa. Foram utilizadas 5,0 gramas de polpa seca e adicionados
volumes de ultrafiltrado correspondentes a O, 05 unidades de atividade oxidativa
por grama de massa seca de polpa. A polpa com pH 3,0 foi filtrada, adicionada
da fração de baixa massa molar no volume necessário e a consistência ajustada
para 3,0 %.
As misturas de polpa e as frações de baixa massa molar, foram
colocadas dentro de sacos de poletileno e incubadas em um banho a 50 ºC
durante 60 minutos. Posteriormente, as polpas foram exaustivamente lavadas
com água deionizada e secas até massa constante sob luz infra-vermelha. Os
controles foram submetidos ao mesmo processo de incubação, porém sem a
adição das frações de baixa massa molar e todos os tratamentos foram feitos em
duplicata. Finalmente, nas polpas tratadas e nas polpas controles, foram
determinados o número kappa e a viscosidade, seguindo as normas TAPPI
(1988).
36
4.12.3 - Pré tratamento de polpas celulósicas com desferal e compostos
modelo de sideróforos
Os tratamentos com os compostos modelo de sideróforos (AHA,
DHBA, DHPAA)e desferal foram realizados utilizando-se 5,0 gramas de massa de
polpa seca e 1, O % do composto biomimético, baseado no peso seco equivalente
da polpa. Após acertar o pH para 3,0, a polpa foi filtrada e a consistência
ajustada para 3,0%, adicionando-se também os compostos.
As misturas de polpa e compostos, foram colocadas dentro de sacos
de poletileno e incubadas em um banho a 50 ºC durante 60 minutos.
Posteriormente, as polpas foram exaustivamente lavadas com água deionizada e
secas até massa constante sob luz infra-vermelha. Controles foram feitos sem a
adição de compostos, porém foram submetidos ao mesmo processo de incubação
e todos os tratamentos foram feitos em duplicata. Finalmente, nas polpas tratadas
e nas polpas controles, foram determinados o número kappa e a viscosidade,
seguindo as normas TAPPI (1988). - ·~
4.12.4 - Pré-tratamento de polpas celulósicas com desferal e compostos
modelo de sideróforos e Fe(III)
Os tratamentos com os compostos modelo de sideróforos (AHA,
DHBA, DHPAA) e desferal foram realizados utilizando-se 5,0 gramas de massa
de polpa seca, 1,0 % do composto modelo ou desferal e 1,0 % ou 0,5% de cloreto
de ferro (FeC'3.6H20) (Merck), baseado no peso seco equivalente da polpa. Após
acertar o pH para 3,0, a polpa foi filtrada e a consistência ajustada para 3,0%,
adicionando-se também os compostos.
Os compostos modelo e o desferal foram complexados com ferro no
momento do tratamento.
As misturas de polpa e compostos complexados com FeCb.6H20,
foram colocadas dentro de sacos de poletileno e incubadas em um banho a 50 ºC
durante 60 minutos. Posteriormente, as polpas foram exaustivamente lavadas
com água deionizada e secas até massa constante sob luz infra-vermelha.
Controles foram feitos sem a adição de compostos, apenas com FeCb.6H20,
37
porém foram submetidos ao mesmo processo de incubação e todos os
tratamentos foram feitos em duplicata. Finalmente, nas polpas tratadas e nas
polpas controles, foram determinados o número kappa e a viscosidade, seguindo
as normas TAPPI ( 1988).
4.12.5 - Estágio de branqueamento com peróxido de hidrogênio em meio
alcalino.
Após o tratamento das polpas com as frações de baixa massa molar
obtida dos extratos fúngicos, com os compostos model? (AHA, DHBA, DHPAA) e
desferal e, com os compostos modelo e desferal complexados, estas foram
submetidas a um tratamento com 4,0 % de peróxido de hidrogênio (H202), 0,05 %
. de sulfato de magnésio hepta-hidratado (MgS04.?H20) e 2,0 % de hidróxido de
'sódío (NaOH), a 80 ºC por 3 horas. A consistência da polpa neste estágio de
tratamento foi ajustada para 1 O % e as porcentaqens dos reagentes foram
baseadas na massa seca da polpa.
Os controles dos estágios de tratamento anteriores também foram
tratados com peróxido de hidrogênio em meio alcalino. Em todas as polpas
tratadas e controles, foram determinados número kappa e viscosidade, de acordo
com a norma TAPPI (1988).
4.13 - Análise das polpas
4.13.1 - Controle dos processos de branqueamento das polpas
Todos os estágios de branqueamento foram controlados seguindo
as normas ditadas pela TAPPI (TAPPI, 1988). Foram realizadas nas polpas, as
análises de determinação de consistência, número kappa por titulação com
KMn04 (TAPPI T-236 os-76) e viscosidade pelo método do tubo capilar (TAPPI T-
230 su-63).
38
4.13.1.1 - Determinação do número kappa
Para avaliação do número kappa foram utilizados entre 0,5 a 1,0 g
de polpa seca. A amostra foi desintegrada com a mão, em 1 O ml de água
destilada, até ficar livre dos grumos e dos feixes de fibras não dispersas. Este
procedimento teve por objetivo evitar corte excessivo das fibras, mas garantir que
todas estejam separadas. Após desintegradas, as polpas foram transferidas para
um Erlenmeyer de 300 ml e sofreram lavagens sucesivas com 140 ml de água
destilada. A temperatura foi ajustada em 25 ºC. O Erlenmeyer contendo as fibras
foi colocado previamente no banho de temperatura constante, assegurando-se
que a temperatura estivesse a 25 ºC ± 0, 1 ºC durante toda a reação. A
suspensão foi agitada continuamente com o auxílio de uma barra magnética até
produzir um vórtice, mas controlado, para não introduzir ar na nistura.
Para celuloses com baixo teor de lignina, nas quais o número de
kappa está entre 2,5 e 35, foi pipetado 25 ml de- solução de permanganato de
potássio (KMn04) O, 1000 ± O, 0005 N em um Erlenmeyer de 125 ml e foi
adicionado 25 ml de ácido sulfúrico 4,0 N. Esta solução foi transferida para o
Erlenmeyer com a polpa e foi cronometrado 1 O minutos. O Erlenmeyer de 125 ml
foi lavado, usando-se 50 ml de água destilada e este volume adicionado à
mistura de reação.
Após 1 O minutos a reação foi interrompida pela adição de 5 ml de
solução de 1 M de iodeto de potássio. O iodo livre na suspensão foi titulado com
tiossulfato de sódio (Na2S203) 0, 1 N ± 0,0005 imediatamente após a mistura, mas
sem filtrar as fibras, até a solução ficar com a tonalidade amarelo claro, após o
que, foi adicionado duas gotas de solução de amido de milho e a titulação foi
continuada até a viragem de cor de azul para branca.
Foi feita uma determinação do branco, usando-se o mesmo
procedimento, mas sem a polpa. Neste caso a mistura foi imediatamente titulada
com Na2S203.
Para calcular o valor de número de kappa foram utilizadas as
seguintes equações:
39
f = 0.0084 p + 0,895
p = (b - a).N
0,1
k = p.f.(1 + 0,013 (25 -t)J
w
onde:
p = ml de permanganato de potássio consumido
a = ml de tiossulfato de sódio consumido pela amostra
b = ml de tiossulfato de sódio consumido pelo branco
N = normalidade da solução de tiossulfato de sódio
f = fator de correção
w = peso da amostra em gramas
k = número de kappa
4.13.1.2 - Determinação da viscosidade
Para a determinação da viscosidade foram utilizadas
aproximadamente 2,0 g de polpa. A amostra foi transferida para um becker de
100 ml, adicionado 50 ml de água destilada, e a temperatura elevada até 70 ºC.
Foram adicionados 0,2 ml de ácido acético glacial e 1,3 ml de nitrito de sódio a
40 %, com agitação constante durante 5 minutos.
A amostra foi peneirada com pressão d'água em peneira de 59 mm
e a fibra retida foi misturada com água destilada e feito filtração à vácuo em funil
de Büchner e, colocada em estufa a 11 O ºC durante 15 minutos.
Da celulose seca, foi pesado exatamente O, 125 g e colocada em um
frasco pequeno e com tampa e, em seguida, foi adicionado 25 ml de
etilenodiamina cúprica, solução 0,5 M em cobre. A mistura foi agitada por 15
minutos com auxílio de uma barra magnética e transferida para uma pipeta de
viscosidade Fenske-Oswald, previamente aferida com óleo "standart' e utilizada
40
dentro dos limites de viscosidade apropriados. O tempo de escoamento foi
cronometrado.
O cálculo de viscosidade da celulose em centipoises foi
determinado pela equação:
V= F.t
onde:
F = fator da pipeta
t = tempo de escoamento em segundos
V = viscosidade da celulose em centipoises
4.13.2 -. Cálculo da eficiência de deslignificação e seletividade.
Determinaram-se a eficiência de deslignificação e a seletividade
pelas relações:
%Eficiência de deslignificação = Nº kappa inicial - No kappa final x 100
Nº kappa inicial
Seletividade = Eficiência de deslignificacão
% de redução da viscosidade da polpa
41
5 - Resultados e Discussão
Trabalhos de diversos autores (JELLISON et ai, 1991, GOODELL et
ai, 1995, DURÁN e MACHUCA, 1995, GOODELL et ai, 1997) demonstraram que
os -sideróforos na forma complexada poderiam oxidar determinados substratos ( o-
dianisidina, KTBA, entre outros) e participar na degradação de materiais
lignocelulósicos. MACHUCA, et ai (1995), encontraram em caldo obtido de
cultura de T. aurantiacus, um composto de baixa massa molar (530 Da) com
estrutura do tipo hidroxamato, que apresentava atividade oxidativa em meio ácido
(pH 2,8 tampão citrato-fosfato) com uma série de substratos fenólicos e não
fenólicos. Esses estudos demonstram a importância de se acompanhar ambas as
cinéticas, de atividade oxidativa e reação CAS, durante o cultivo dos fungos,
podendo, assim, verificar se existe uma relação entre elas. Deste modo,
sideróforos que apresentassem atividade oxidativa, poderiam vir a ser utilizados
em processos relacionados à degradação de materiais lignocelulósicos, tais
como tratamento de efluentes e branqueamento de polpas, que é o interesse final
desse estudo.
Assim, a cinética de produção de atividade oxidativa e de
sideróforos foi acompanhada nas culturas dos fungos de decomposição parda e
branca durante 30 dias de incubação. O ascomiceto termófilo T. aurantiacus foi
utilizado como um microrganismo de referência produtor de compostos de baixa
massa molar, tipo sideróforo com atividade oxidativa.
Os fungos decompositores de madeira foram cultivados, sob
condições estacionárias, em meio extrato de malte a 2%, e a cada 5 dias foram
retiradas alíquotas para a determinação da atividade oxidativa e para análise de
produção de sideróforos através da reação CAS.
5.1 - Reação CAS em meio líquido
Durante o período de cultivo, os sideróforos foram encontrados nos
sobrenadantes das culturas fúngicas na forma livre ou complexada com o ferro.
Na forma livre, o sideróforo teria a capacidade de reagir positivamente com o
42
O ensaio com o reagente CAS detecta a presença de sideróforos do
tipo catecolato ou hidroxamato ( os dois grupos principais produzidos pelos
microrganismos), ou seja, a reação ocorre independente da estrutura do
composto. Essa reação foi realizada com os extratos fúngicos e a absorbância foi
lida logo após a adição do reagente CAS (reação instantânea - O hora) e após
estas amostras serem incubadas por 24 horas (reação após 24 horas). Com esse
procedimento observou-se diferenças nos resultados das análises, independente
do· microrganismo estudado. Com o decorrer do período de incubação a reação
foi intensificada, e para alguns extratos fúngicos, observou-se mudança de cor
instantânea do CAS, de azul para rosa e em outros, apenas uma redução da cor
azul. Em todas as culturas verificou-se a formação de precipitados nos tubos de
reação após 24 horas de incubação.
Segundo SCHWYN e NEILANDS (1987), a velocidade de mudança
de cor do reagente CAS se deve à velocidade com que ocorre a transferência de
Fe (Ili) desde o corante até o sideróforo, a qual seria dependente da estrutura
deste último. Assim, os sideróforos tipo catecolato podem retirar o ferro do CAS
em alguns minutos e desta forma a mudança de cor do azul para o laranja é
quase instantânea. Já os. sideróforos do tipo hidroxamato proporcionam uma
reação lenta que pode demorar desde algumas horas até dias. Quando o Fe (Ili)
é retirado do reagente CAS por um complexante (ex. sideróforo), três efeitos
diferentes podem ser constatados no espectro de absorção (em uma faixa de 300
a 700 nm) da mistura de reação. O primeiro efeito é a diminuição na absorbância
a 630 nm, devido a perda do ferro pelo reagente CAS, o que pode ser observado
visualmente por uma diminuição da cor azul. O segundo efeito é a absorção no
espectro visível do CAS sem o ferro, que possui cor alaranjada. O terceiro efeito
é o aparecimento de uma nova banda de absorção, devido à formação do
complexo sideróforo-Fe, numa região do espectro diferente daquela observada
para o CAS. A intensidade dessa nova banda dependerá do tipo de sideróforo
(hidroxamato ou catecolato) e da concentração deste (PAYNE, 1994).
Resultados prévios obtidos no nosso laboratório, demonstram que o
sideróforo comercial do tipo hidroxamato desferal, quando presente em
concentrações abaixo de 30 ~tM, produz somente uma diminuição na cor azul da
43
solução CAS, porém quando presente em concentrações superiores, a cor final
da solução é vermelha.
5.1.1 - Fungos de decomposição parda (Brown-rot)
O P. cocos apresentou um crescimento rápido em meio extrato de
malte reduzindo o pH da cultura de 5,2 para 2,6 após 1 O dias de cultivo, o qual
permaneceu inalterado até o final da incubação. A reação CAS instantânea
iniciou-se aos 15 dias de cultivo e verificou-se mudança da cor do reagente de
azul para rosa. Após uma queda aos 20 dias, a produção de sideróforos
permaneceu constante (68%) e apresentou uma leve tendência de aumento no
final do cultivo (Figura 6).
O L. sulfureus cresceu rapidamente no meio extrato de malte,
formando uma grande quantidade de massa micelial, acompanhado também, de
um decréscimo no pH da cultura de 5,2 para 2, 9 àpós 1 O dias de cultivo, o qual
permaneceu inalterado até o final da incubação. A reação do L. sulfureus com o
reagente CAS foi instantânea, apresentando uma mudança de cor menos
acentuada até 15 dias de cultivo (mudança de cor de azul para roxo) e, a partir
de 20 dias, alterou a cor de azul para rosa. A produção de sideróforos por este
fungo começou com 1 O dias de cultivo, e continuou aumentando até 20 dias,
quando apresentou o maior valor (46,38%) (Figura 6).
Foi feita a leitura de absorbância após 24 horas de incubação das
culturas de P. cocos e L. sulfureus com o CAS e, apesar da curva diferenciar-se
da obtida na reação instantânea, observou-se reação positiva em alguns
períodos do cultivo dos fungos. Na maioria das vezes, após 24 horas de
incubação observou-se a formação de precipitado, tanto na referência, quanto
nos sobrenadantes fúngicos, o que interfere na quantificação do sideróforo.
44
P.cocos L. sulfureus 100 100
g 80 ~-J ~ 80 j 60
Oh) ,ê 60 !_2~ •O .. .. 41 40 ~ 40 3! Ili .iii 20 ..,. 20 ~
o o o 10 20 30 o 10 20 30
Tempo (dias) Tempo (dias)
Figura 6: Cinética da reação CAS instantânea e após 24 horas dos
sobrenadantes de cultivo dos fungos de decomposição_parda.
5.1.2 - Fungos de decomposição branca (White-rot)
À excessão do P. pini, os demais fungos de decomposição branca
cresceram bem no meio extrato de malte, porém, produziram uma reação CAS
mais discreta que os de decomposição parda, não havendo mudança de cor de
azul para rosa ou alaranjado e apenas um decréscimo no valor de absorbância
das amostras a 630 nm. Na maioria dos fungos, o cálculo da porcentagem de
sideróforos foi inferior a 30%. Esse fato pode estar associado à baixa produção
dos compostos quelantes no meio de cultivo.
Com a maioria dos sobrenadantes fúngicos, a cinética da reação
CAS de 24 horas não apresentou o comportamento esperado. A reação aparece
e desaparece ao longo do tempo de cultivo dos fungos, o que pode ser devido à formação de precipitado nos tubos de reação, que reduz a confiabilidade nos
resultados.
Conforme anteriormente mencionado, o P. pini apresentou um pobre
crescimento em meio extrato de malte e observou-se uma leve alteração no pH
da cultura de 5,2 para 4,4, o qual permaneceu durante todo o cultivo. A reação
instantânea do P. píni com o CAS começou após 20 dias de cultivo e ainda
apresentava uma tendência de aumento de produção no final da incubação
(Figura 7).
P. chrysosporium apresentou um bom crescimento em meio extrato
de malte e manteve o pH em 4,6 durante o período de cultivo. A reação
45
instantânea com CAS do P. chrysosporium começou a partir de 1 O dias de
cultivo, aumentando sua produção até 25 dias, após o qual, começou a
apresentar uma produção praticamente constante até o final da incubação
(Figura 7).
O P. coccineus cresceu rapidamente no meio extrato de malte,
formando uma grande quantidade de massa micelial, e apresentando um pH
constante de 4,6 durante o período de incubação. Este fungo apresentou reação
instantânea com CAS a partir de 1 O dias de cultivo e ainda apresentava
tendência de aumento na produção de sideróforos ao final do período de
incubação (Figura 7). Os fungos de decomposição branca M. tremellosus, P.
medula-panis e C. subvermispora mantiveram o pH entre 4, 1 e 4,5, durante o
período de incubação. A reação instantânea destes fungos com CAS começou a
partir de 1 O dias de cultivo, apresentando um aumento na produção de
· sideróforos, a partir de 20 dias, continuando crescente até o final da incubação
(Figura 7).
O T. versicolor apresentou um bom crescimento no meio extrato de
malte e manteve o pH em 4,8 durante todo o cultivo, sendo o maior valor de pH
encontrado entre os bas.idiomicetos cultivados. A reação instantânea do T. versicolor com o CAS começou a partir de 1 O dias de incubação, apresentando
uma produção constante ( 15, 9%) de sideróforos entre 20 e 25 dias. A partir de 25
dias, houve uma redução da produção de sideróforos por este fungo,
apresentando apenas 4,3% de produção no final do cultivo (Figura 7).
Em geral, pode-se afirmar que os fungos de decomposição branca
não apresentaram uma produção significativa de sideróforos no período de
incubação estudado (30 dias), quando comparado com os resultados obtidos
para os fungos de decomposição parda.
46
P. m edula-panis M. Tremellosus 100 100
Ili 80 Ili 80 e -+-CAS (Oh) o -+-CAS (Oh) .. a 60 ---CAS (24 h) .e 60 -li- CAS (24 h) ~ •O .. GI 40 GI 40 .l! 'ti Ili üi ~ 20 ~ 20
o o o 10 20 30 o 10 20 30
Tempo (dias) Tempo (dias)
100 e. subvermlspora P. coccineus 100
Ili 80 § -+-CAS(Oh) Ili 80 60 e -+-CAS (Oh)
--CAS(24h) ,2 60 l 40 1 --- CAS (24 h) '"O 40 'iii 'ti
20 'ln ..,. ~ 20 o o o 10 20 30
Tempo (dias) o 10 20 30 Tempo (dias)
100 P. chrysosporium 100 P. pinl
· ...
ao Ili 80 ~_.,.., Ili e ! -+-CAS(Oh) -+-CAS(Oh)
60 ~ 60
-11- CAS (24 h) i! -li- CAS (24 h) GI 40
GI 40 l! i Ili 20 ~ 20 .e. o
o o o 10 20 30 o 10 20 30
Tempo (dias) Tempo (dias}
T. versicolor 100
Ili 80 o .§ 60 i! GI 40 'ti üi ~ 20 o
o o
-+-CAS(Oh) -11-CAS(24h)
10 20 30 Tempo (dias)
Figura 7: Cinética de reação CAS instantânea e após 24 horas dos
sobrenadantes de cultivo dos fungos de decomposição branca.
47
5.1.3 - Produção de reação CAS por T. aurantiacus
O ascomiceto T. aurantiacus apresentou um crescimento rápido, no
meio extrato de malte, formando uma grande quantidade de massa micelial, e
mantendo o pH da cultura em 4,2 durante todo o período de incubação. O fungo
produziu uma reação CAS instantânea discreta a partir de 1 O dias de cultivo,
aumentando sua produção até 15 dias, após o qual houve uma redução na
produção de sideróforos até o final do período de incubação.
A cinética de reação CAS de 24 horas começou a aparecer a partir
de 20 dias de incubação, chegando ao valor de 17, 1 % aos 30 dias de cultivo
(Figura 8), diferenciando, dos valores obtidos para o CAS instantâneo (O hora).
20
cn16 o ~12 •O ... ~ 8 ui -;fl. 4
o o
-a- CAS (24 h)
T. aurantiacus
10 20 30 Tempo (dias)
Figura 8: Cinética da reação CAS instantânea e após 24 horas do sobrenadante
de cultivo do fungo termófilo T. aurantiacus.
5.2 - Atividade oxidativa de fungos decompositores de madeira
Os fungos decompositores de madeira quando crescidos em meio
extrato de malte, podem sintetizar e excretar uma série de enzimas, ácidos
orgânicos, compostos não enzimáticos, entre outros metabólitos. Alguns desses
compostos, de natureza enzimática ou não, podem apresentar atividade
oxidativa. A fim de verificar a presença desse tipo de composto nos
sobrenadantes das culturas fúngicas foram determinadas as atividades oxidativas
a pH 3,0 utilizando três substratos diferentes: ABTS, 2,6-0imetoxifenol (OMF) e
o-dianisidina e as cinéticas de produção de atividade oxidativa foram
comparadas.
48
5.2.1 - Fungos de decomposição parda (Brown-rot)
Durante o cultivo dos fungos de decomposição parda, L. sulfureus e
P. cocos, nenhuma atividade oxidativa foi detectada nos seus extratos, mesmo
utflizando-se os três substratos, ABTS, 2,6-DMF e o-dianisidina.
5.2.2 - Fungos de decomposição branca (White-rot)
Entre os fungos de decomposição branca utilizados nesse trabalho,
P. pini e P. chrysosporium não apresentaram atividade oxidativa em seus
sobrenadantes. A ausência de atividade oxidativa para o P. pini pode estar
associada ao reduzido crescimento desse fungo nas condições de cultivo
escolhidas para esse trabalho, no entanto, o mesmo não pode ser dito para o P.
chrysosporium, que apesar de crescer bem não apresentou atividade oxidativa
com nenhum dos três substratos utilizados.
Os demais extratos brutos obtidos de cada fungo oxidaram os três
substratos estudados em velocidades diferentes. Para todos os fungos, a maior
velocidade de oxidação foi observada com o substrato não fenólico ABTS. A
velocidade de oxidação do ABTS foi aproximadamente 3 vezes maior que o 2,6-
DMF. A o-dianisidina foi o substrato que apresentou os menores valores de
oxidação.sendo que alguns fungos não oxidaram esse último substrato (Figura
9).
M. tremellosus e P. medula-panis apresentaram atividade oxidativa
significativa apenas com o substrato ABTS, a qual iniciou-se no décimo dia de
cultivo e teve sua atividade máxima com 20 dias (Figura 9). Os demais fungos P.
coccineus, C. subvermispora e T. versicolor apresentaram as maiores atividades
com ABTS e uma atividade discreta com 2,6-DMF. P. coccineus apresentou uma
pequena atividade com ABTS aos 1 O dias de cultivo, a qual foi crescente até 25
dias. Entre 25 e 30 dias de cultivo, a atividade oxidativa aumentou rapidamente,
dobrando o seu valor.
T. versicolor apresentou atividade com ABTS com 1 O dias de cultivo,
aumentando até 20 dias, quando teve sua máxima atividade. T. versicolor foi o
fungo que apresentou · a maior atividade oxidativa entre todos os fungos
49
cultivados. A atividade com 2,6-DMF começou a partir de 15 dias de cultivo,
tendo um aumento significativo nos 1 O últimos dias e, se comparado com os outros caldos, a atividade obtida com este substrato foi bastante alta. Com o-
dianisidina, a atividade começou a aparecer com 1 O dias de cultivo, aumentando
até 30 dias quase linearmente. Este foi o maior valor de atividade obtido com o-
dianisidina entre os caldos analisados (12,4 U/L) (Figura 9).
M. tremellosus 150
::i' 120 :5 ';;' 90 1 60 J ã! 30
o F--------111--4-----
0 10 20 30 Tempo (dias)
__._ o-dianisidina ---2.6-DMF -.-ABTS
P. medula-panis
e. subvermispora 150
150
::i 120 :i '; 90 "O ~ 60 > i 30
-+- o-dianisidin
--- 2,6-IJM= -.a.-ABTS
-+- o-dianisidina
--- 2,6-ll'vF -.a.-ABTS
10 20 Tempo (dias)
30
O 10 20 30 Tempo (dias)
o
P. coccineus 150
zr 120 :) '; 90 "O 11J 60 i i 30
O 10 20 30 Tempo (dias)
T. versicolor
-+- o-dianisidina ---2.6-DMF --1t-ABTS
o 10 20 Tempo (dias)
30
Figura 9: Cinética de produção de atividade oxidativa (U/L) dos fungos de
decomposição branca em presença dos substratos ABTS, 2,6-DMF e o-
dianisidina. Os fungos foram inoculados em meio líquido extrato de malte 2% e
incubados sem agitação, a 28 ºC.
50
5.2.3 - Produção de atividade oxidativa por T. aurantiacus
O T. aurantiacus não produziu atividade oxidativa durante todo o
cultivo em meio extrato de malte. O extrato fúngico foi analisado com, ABTS, 2,6-
DMF e o-dianisidina e com nenhum dos três substratos obteve-se atividade. A
atividade anteiormente descrita com este fungo é em meio suplementado com
farelo de trigo (MACHUCA, 1995).
5.3 - Obtenção e análise das frações de baixa massa molar (<3 KDa) dos
extratos fúngicos
No final de 30 dias de cultivo, os caldos dos fungos P. coccineus, M.
tremeltosus, P. medula-panis, C.subvermíspora e T. versicolor foram coletados e
procedeu-se à separação de frações de alta e baixa massa molar. Os caldos
foram inicialmente fracionados por membranas de corte 1 O KDa e os permeatos
foram novamente ultrafiltrados por uma membrana de corte 3 KDa. Esses cinco
fungos foram escolhidos entre os dez inicialmente utilizados neste trabalho, por
apresentarem atividade oxidativa em seus sobrenadantes. Essa atividade
apresentada, poderia estar relacionada com enzimas ou outros compostos que
agem em pH 3,0, como já descrito para T. aurantíacus (MACHUCA, 1995).
Após a primeira ultrafiltração (membrana de corte 1 O KDa), a
atividade oxidativa não foi detectada nos filtrados de P. coccíneus, M. tremellosus
e C.subsermíspora (Tabela 1 ). Isto sugere que enzimas ligninolíticas com alta
massa molar (>1 O KDa) foram responsáveis pela atividade oxidativa observada
nestes fungos. Por outro lado, os extratos de P. medula-panís e T. versicolor,
apresentaram atividade oxidativa nos seus filtrados (<10 Kda).
51
Tabela 1: Detecção de atividade oxidativa (U/L) na fração de baixa massa molar
obtida após ultrafiltração (<1 O Kda).
Fungo Filtrado 1 O KDa
o-dianisidina 2,6-DMF ABTS
M. tremellosus n.d. n.d. n.d.
P. coccineus n.d. n.d. n.d.
e. subvermispora n.d. n.d. n.d.
P. medula-panís 1,40 1,60 2,87
T. versicolor 0,15 7,43 22,30
n.d.: não detectado
Os extratos fúngicos que apresentaram atividade oxidativa na fração
- _ de massa molar menor que 1 O KDa, foram submetidas a uma segunda
ultrafiltração ( <3 KDa) e novamente a atividade oxidativa foi detectada nos
filtrados que passaram através desta membrana (Tabela 2). Isto sugere a
presença de compostos de natureza não protéica e de baixa massa molar nos
ultrafiltrados que sejam responsáveis pela atividade oxidativa observada em P.
medula-panis e T. versicolor.
Tabela 2: Detecção de atividade oxidativa (U/L) na fração de baixa massa molar
obtida após ultrafiltração (<3 Kda).
Fungo Filtrado 3 KDa
o-dianisidina 2,6-DMF ABTS
P. medula-panis 0,00 0,97 1,30
T. versicolor N.D. 0,14 0,20
N.D.: não determinado
Devido aos resultados obtidos para T. versicolor e P. medula-panis,
estes fungos foram selecionados para a continuação dos experimentos.
52
5.4 - Cultivo de fungos em meio Czapeck suplementado com serragem ou
farei o de trigo
Os substratos lignocelulósicos farelo de trigo e serragem, foram
adicionados ao meio de cultivo dos fungos T. versicolor e P. medula-panis com o
objetivo de estimular a produção de atividade oxidativa. Em resultados anteriores,
quando esses dois substratos foram adicionados ao meio de cultura Czapeck
para crescimento de T. aurantiacus, a atividade aumentou significantemente, se
comparado com o cultivo em meio Czapeck na ausência de tais substratos
(MACHUCA, 1995). Sendo assim, os fungos T. verslcotor, P. medula-panis e T.
aurantiacus foram cultivados, sob condições estacionárias, em meio Czapeck
sem fonte de carbono suplementado com serragem de eucalipto ou farelo de
trigo. .
Visualmente, os fungos T. versicolor, P. medula-panis e T.
aurantiacus, apresentaram um crescimento no meio Czapeck suplementado com
serragem de eucalipto semelhante ç10 crescimento obtido em extrato de malte,
porém apresentaram baixa produção de sideróforos e de atividade oxidativa.
Tentando-se .evitar problemas de interferência, como precipitados,
os ensaios de reação CAS desta etapa do trabalho foram determinados após 1 e
6 horas de incubação.
A cinética de reação CAS foi acompanhada na cultura de T.
versicolor cultivado em meio Czapeck suplementado com serragem e verificou-se
uma discreta redução na cor do reagente CAS com 5 dias de cultivo ( 19, 15% ).
Nas determinações seguintes a reação CAS desapareceu, não se observando
mudança na cor azul do reagente CAS, ou ainda, um decréscimo no valor da
absorbância das amostras a 630 nm (Figura 1 O).
Os resultados da cinética da reação com CAS de P. medula-panis
revelaram o aparecimento de uma fraca reação após 25 dias de cultivo, o qual
permaneceu até o final do período de incubação (1,02%) (Figura 10).
T. aurantiacus apresentou reação CAS discreta com 5 dias de
cultivo (9,27%), diminuindo de intensidade nas determinações seguintes (Figura
10).
T. versicolor 20
C/1 o 15 .. a 1 10 :!2 5 Ili ~ o o --1
o 10 20 30 40 Tempo (dias)
53
P. medula-panis 20
ctl e 15 a ·O 10 .. CII "C 'iii 5 ~ o ~ o --1
o 10 20 30 40 Tempo (dias)
T. aurantiacus 20
ê 15 ,2 '2 10 GI
1 5 ~
10 20 30 40 Tempo (dias)
Figura 1 O: Cinética da reação CAS após 1 hora de reação, do sobrenadante dos
fungos T. versicolor, P. medula-panis e T. aurantiacus, crescidos em meio
Czapeck suplementado com serrage_m de eucalipto:
Os sobrenadantes obtidos a partir do cultivo dos fungos em meio
Czapeck suplementado com serragem de eucalipto, também foram analisadas
para atividade oxidativa com ABTS.
O P. medula-panís apresentou uma atividade crescente desde 5
dias de cultivo, e aos 35 dias sua atividade estava em 3,51 U/L, sendo o maior
valor alcançado de atividade oxidativa entre estes fungos (Figura 11 ).
O T. versicolor apresentou atividade oxidativa a partir de 5 dias de
cultivo, sendo a maior atividade 2,88 UIL, aos 15 dias de incubação. Após 15
dias, houve uma diminuição na atividade deste fungo (Figura 11 ).
O T. aurantíacus começou a apresentar atividade a partir de 20 dias
de incubação e alcançou uma atividade de 2,51 U/L ao final do cultivo (Figura
11 ).
As atividades foram obtidas através da oxidação do substrato não
fenólico ABTS e as cinéticas das reações mostraram que o P. medula panis e o T.
aurantiacus estavam aumentando sua atividade oxidativa ao término do cultivo.
54
-------------
T. versicolor P. medu/a-panis 4 4
::r 3 ::r 3 - - ::> 2. - CII 2 CII 'O 'O Ili Ili 'O ~ > 1 1
~ ~ o o
o 10 20 30 40 o 10 20 30 40 Tempo (dias) Tempo (dias)
T. aurantiacus 4
:. 3 - 2. GI 2 'O Ili 'O ·s; 1 .. <t
o o 10 20 30 40
Tempo (dias)
Figura 11: Cinética de produção de atividade oxidativa (UI/L) dos fungos T.
versicolor, P. medula-pan_is e T. aurantiacus. Os fungos foram inoculados em
meio líquido Czapeck modificado, suplementado com 2% de serragem de
eucalipto e incubados sem agitação, a 28 ºC, com excessão do T. aurantiacus,
que foi incubado a 45 ºC.
Quando crescidos em meio Czapeck suplementado com farelo de
trigo, os três fungos cresceram rapidamente, formando grande quantidade de
massa micelial. Este crescimento micelial foi melhor do que o obtido em meio
extrato de malte. A produção dessa massa fúngica foi estimada somente de forma
visual, uma vez que a sua quantificação não foi possível devido à dificuldade em
separar a massa micelial do substrato.
A reação CAS do T. versicolor começou a partir de 5 dias de
incubação, apresentando uma produção constante de sideróforos entre 15 e 25
dias. A partir de 25 dias, houve uma redução da produção de sideróforos por este
fungo, apresentando apenas 12% de produção no final do cultivo (Figura 12).
55
P. medula-panis começou a apresentar reação CAS após 20 dias de
cultivo e ainda apresentava uma tendência de aumento da produção de
sideróforos no final da incubação (Figura 12).
O T. aurantíacus apresentou reação CAS a partir de 5 dias de
incubação e continuou aumentando a produção de sideróforos até 20 dias de
cultivo. Após 20 dias, a produção de sideróforos ficou constante (Figura 12).
Com nenhum dos extratos fúngicos, se observou mudança de cor do
meio durante a reação CAS, apenas uma redução no valor da absorbância.
T. versicolor P. medula-panis 40 40
UI UI o 30 o 30 ... ... .e ,g •O 20 •O 20 ... GI ...
GI 'ti 'ti vi. 10 vi 10 ~ ~ o o o
o 10 20 30 40 o 10 20 30 40 Tempo (dias) Tempo (dias)
T.aurantiacus 40
UI e 30 a •O 20 ....
GI 'ti 'iii 10 ~ o o ---!
o 10 20 30 40 Tempo (dias)
Figura 12: Cinética da reação CAS após 1 hora de reação, do sobrenadante dos
fungos T. versicolor, P. medu/a-panís e T. aurantiacus, crescidos em meio
Czapeck suplementado com farelo de trigo.
Os sobrenadantes dos fungos T. versicolor, P. medula-panis e T. aurantiacus obtidos a partir do cultivo destes em meio Czapeck suplementado
com farelo de trigo, apresentaram altos valores de atividade oxidativa, com
excessão do T. aurantiacus.
O P. medula-panis aumentou significantemente seus valores de
atividade em cerca de 4 vezes, se comparada com as obtidas em meio extrato de
malte, obtendo uma atividade máxima com 25 dias de incubação (521 U/L),
56
começando a decrescer logo após esta máxima atividade oxidativa obtida (Figura
13).
O T. versicolor apresentou uma atividade sempre crescente, a partir
de 1 O dias de cultivo, e esta ainda estava aumentando ao final do período de
incubação (236,89 U/L). Os valores obtidos com o meio Czapeck suplementado
com farelo de trigo a 2%, foram semelhantes , daqueles obtidos com extrato de
malte a 2%, onde a máxima atividade foi obtida com 20 dias de incubação (Figura
13).
O T. aurantiacus apresentou baixos valores de atividade (0,3 U/L),
se comparado aos outros fungos, durante todo o período de incubação. Apesar
do meio estar suplementado com farelo de trigo, este fungo não apresentou
melhora na atividade oxidativa.
Quando T. aurantiacus foi cultivado em meio Czapeck suplementado
com farelo de trigo por MACHUCA (1995), o ascomiceto apresentou atividade,
isto deve ser devido à adição de 1 % de glicose ao meio de cultivo, como
substrato.
600 :::; 500 - ::) 400 - 4) 300 i 1 200 i 100
o o 10 20 30
Tempo (dias)
P. medula-panis 600
~ 500 400
cu 300 'O 111 'O 200 's i 100
o o 10 20 30 40 40
Tempo (dias)
T. versicolor
Figura 13: Cinética de produção de atividade oxidativa (UI/L) dos fungos T.
versicolor, P. medula-panis. Os fungos foram inoculados em meio líquido
Czapeck modificado, suplementado com 2% de farelo de trigo e incubados sem
agitação, a 28 ºC.
57
5.5 - Propriedade das frações de baixa massa molar (<5 KDa) obtidos das
culturas fúngicas
5.5.1 - Reação CAS e atividade oxidativa
Após 35 dias de cultivo em meio Czapeck suplementado com farelo
de trigo, os extratos dos fungos selecionados, T. versicolor, P. medula-panis e T.
eúrentiecus, foram coletados e filtrados. Os caldos foram concentrados cerca de
1 O vezes por liofilização e a atividade oxidativa e reação CAS foram
determinadas (Tabela 3).
Tabela 3: Atividade oxidativa e reação CAS dos caldos liofilizados, obtidos após
35 dias de cultivo.
Reação CAS ª
Amostra Atividade (U/L) 1 hora- 6 horas
T. versicolor 962,31 27,11 36,57
P. rriedula-panis 1081,67 25,68 43,75
T. aurantiacus 10,56 34,16 46,03
a - % sideróforos
A reação CAS nos caldos liofilizados de T. aurantiacus e P. medula-
panis, passaram de azul para rosa claro, após 6 horas de reação, enquanto o
caldo do T. versicolor apresentou apenas uma diminuição na absorbância a 630
nm.
Após ultrafiltração ( <5 KDa), verificou-se uma queda na atividade
oxidativa de T. versicolor e P. medula-panis (Tabela 4). No entanto, a atividade
do ultrafiltrado de T. aurantíacus aumentou significantemente. É importante
ressaltar que antes da ultrafiltração, o extrato de T. aurantiacus, apresentava uma
intensa coloração escura, produzida principalmente por pigmentos excretados
durante o metabolismo do fungo. Nos extratos fúngicos, os pigmentos podem
estar formando aglomerados com os compostos de baixa massa molar (<5 KDa),
impedindo desta forma, que os compostos reajam com substratos como o ABTS.
Na etapa de ultrafiltração os extratos do fungo foram centrifugados a uma alta
58
velocidade (2400 x g) e obteve-se um ultrafiltrado muito mais claro. A maior
atividade oxidativa observada no filtrado, poderia estar relacionada à redução no
conteúdo de pigmentos que ficaram retidos no concentrado. Assim, devido à ação
da membrana de ultrafiltração, os compostos de baixa massa molar, separados
dos pigmentos encontram-se no filtrado disponíveis para reagir com ABTS.
Tabela 4: Atividade oxidativa e reação CAS nas frações de baixa massa molar
obtidas após ultrafiltração ( <5 Kda)
Reação CAS ª
Amostra Atividade (U/L) 1 hora 6 horas
T. versicolor 4,02 54,86 62,16
P. medula-panis 21,47 78,90 80,70
T. aurantiacus 115,22 71,00 89,01
a: % de sideróforos
Para confirmar que a· atividade oxidativa e a reação CAS eram
provenientes dos compostos de baixa massa molar, os caldos liofilizados e
ultrafiltrados ( <5 KDa) foram aplicados a uma coluna de Sephadex G-25, a qual
fraciona compostos de massa molar entre 1 e 5 KDa. Dessa forma, não se
esperava obter picos no volume de exclusão da coluna, e esses picos se
existissem seriam provavelmente enzimas. Fez-se então, uma comparação dos
perfis cromatográficos dos extratos liofilizados e dos ultrafiltrados (<5 KDa) de
cada fungo.
O perfil cromatográfico. do caldo de T. versicolor liofilizado
apresentou picos de absorbância em 280 nm. O primeiro pico eluiu próximo ao
volume morto da coluna (Vo ), constituindo a fração de massa molar superior a 5
KDa. Esta fração apresentou atividade oxidativa de 3,27 U/L. O outro pico eluiu
na região de fracionamento da coluna, e após análise, detectou-se baixa
atividade oxidativa na fração obtida no volume de 27 ml (0,03 U/L) e uma massa
molar maior que 1 KDa (Figura 14).
A fração de baixa massa molar ( <5 KDa) do T. versicolor, foi
aplicada à coluna de Sephadex G-25 e um único pico com atividade oxidativa foi
evidenciado. Este pico apresentou um máximo de absorbância a 280 nm na
59
fração obtida no volume de 28,5 mL e atividade oxidativa baixa (0,06 U/L) com
uma massa molar menor que 1 KDa (Figura 14 ).
T. versicolor (A) T. versicolor (B)
0,3 >6KOa 0,3
3,27UL
- 0.2 ! 0,2
!3 ~ >1 KDa li) Ê >1 KDa
<( i 0,03UL '~ 0,06 LVL N ~ 0,1 - 0,1
o.o o.o o 10 20 30 40 50 o 10 20 30 40 50
Volume(ml) Volume (mL)
.. Figura ·14: Cromatograma em Sephadex G-25 do caldo de T. versicolor liofilizado
(A) e após ser ultrafiltrado em membrana de corte <5 KDa (8). A coluna foi eluída
com água deionizada, com fluxo de 0,9 mUmin e frações de 1,5 mL foram
coletadas. A coluna foi calibrada com azul de dextrano (> 2.106 Da) (Vo) = 15 mL,
cobalamina (1355,4 Da) (V1) = 25,5 mL e riboflavina (376,36 Da} (V2) = 31,5 ml.
O extrato de P. medula-panis foi aplicado a uma coluna de
Sephadex G-25 e dois picos eluíram desta coluna, um próximo ao volume morto
· (Vo), constituindo a fração de massa molar superior a 5 Kda e outro com massa
molar aproximada de 1350 Da (Figura 15}. Após análise das frações
correspondente aos picos, detectou-se uma pequena atividade oxidativa em
ambos os picos.
A fração de baixa massa molar (<5 KDa) de P. medula-panis obtida
após a ultrafiltração, também foi aplicada à coluna Sephadex G-25 e identificou-
se um pico largo, com baixo valor de absorbância a 280 nm, porém com atividade
oxidativa (2, 7 4 U/L) e uma massa molar de cerca de 1350 Da. Na região próxima
ao volume morto da coluna, eluiu um pico bem discreto, sem atividade oxidativa
(Figura 15).
60
P. medula-pants (A) P. medula-panls (B) 0,3 >6 l<Da 0,3
0,39 lYL -1350Da
0,2 0,2 -1350 Da
1! fll Ê 2,74 U1. lll e <i ~ !::!.
- 0,1 0,1
o.o o.o o 10 20 30 40 50 o 10 20 30 40 50
Volume(mL) Volume(mL)
Figura 15: Cromatograma em Sephadex G-25 do caldo de P. medula-panis
liofilizado (A) e após ser ultrafiltrado em membrana de corte <5 KDa (8) A coluna
foi eluída com água deionizada, com fluxo de 0,9 ml/min e frações de 1,5 mL
foram coletadas. A coluna foi calibrada como descrito na Figura 14.
O caldo liofilizado de T. eurentiecus, apresentou um perfil
cromatográfico parecido ao obtido com o caldo do P. medula-panis, após filtração
em Sephadex G-25. O gráfico mostra um pico de absorbãncia a 280 nm próximo
ao volume vazio da coluna (Vo ), constituindo a fração de massa molar superior a
5 KDa, um na região de fracionamento em 28, 5 mL com massa molar maior que 1
KDa e um terceiro, encontrado na fração obtida no volume de 36,0 mL. O
primeiro e o segundo picos, apresentaram uma baixa atividade oxidativa de 0,03
e 0,01 U/L e no terceiro pico não foi detectada atividade oxidativa (Figura 16).
Após ultrafiltração, parte dos compostos que absorvem a 280 nm,
desaparecem na fração de baixa massa molar, apresentando um perfil
cromatográfico distinto, com um pico de absorbância a 280 nm pouco definido,
entre 22,5 e 30,0 ml e uma atividade oxidativa de 1, 13 U/L na fração que eluiu
em 25,5 ml (Figura 16).
Neste passo, após ultrafiltração por membrana de corte SKDa, foram
obtidas as frações de baixa massa molar com atividade oxidativa das culturas dos
fungos T. versicolor, P. medula-panis e T. aurantiacus, que serão utilizadas na
etapa de branqueamento de polpas kraft.
61
0,8 -u,Ê !1l:; 0,6
co N - 0.4
0,2
o.o ........ M------1--+------l!'IL---t O 10 20 30 40 50
Volume(ml)
1.2 >1 l<Da 0,01 U'L
T. aurantiacus (B) T. auranrtacus(A) · >5KDa
1,0
1,2
1,0
(1) ê 0,8
~ e'.; 0,6 CX)
~ 0,4
0,2
o.o o
<1 KDa O,Otl U'L
0,01 UL
10 20 30 40 50
Volume(ml)
Figura 16: Cromatograma em Sephadex G-25 do · caldo de T aurantiacus
liofilizado (A) e após ser ultrafiltrado em membrana de corte <5 KDa (B). A coluna
foi eluída com água deioni;zada, com fluxo de 0,9 ml/min e frações de 1,5 ml
· . foram coletadas. A coluna foi calibrada como descrito na Figura 14.
5.5.2 - Análise de redução de Fe (Ili) com ferrozfna
A redução de Fe (Ili) a Fe (li) pelos extratos, foi determinada com
ferrozina, um reagente colorimétrico que forma um complexo avermelhado
estável com Fe (li), e que tem sido largamente utilizado por causa da sua
sensibilidade e sua solubilidade em sistemas biológicos tamponados (HIRANO et
ai., 1995).
Os resultados obtidos com os compostos de baixa massa molar ( <5
KDa) do P. medula-panis, T versicolor e do T. aurantiacus, indicam que a
redução de Fe (Ili) para Fe (li) ocorreu após a formação do complexo do
composto fúngico de baixa massa molar-Fe (Ili). Esta capacidade de redução de
Fe(III), foi diferente para os três compostos de baixa massa molar estudados. O
composto de baixa massa molar de T. versicolor apresentou os menores valores
de redução de Fe(III), os quais ficaram praticamente constantes durante o
período de reação de 1 O minutos (Figura 17).
62
0,15
0,12
E 0,09 e N e.o .,, CII 0,06 J:I <
0,03
0,00 o
--.- P. medula-panis
......_ T. aurantiac us
-4- T. versicolor
2 4 6 Time (minutes)
8 10
Figura 17: Redução de Fe (Ili) a Fe (li) pelos compostos de baixa massa molar
(<5 KDa) obtidos a partir dos fungos P. medula-panis. T. versicolor e T.
aurantiacus com ferrozina a 1,0% em tampão acetato 50 mM, pH 4,5.
A reação de redução de Fe(III) foi lenta com os três compostos
fúngicos e após 4 horas de reação, ainda era possível observar aumento da
absorbâncla em 562 nm, devido à formação do complexo ferrozina-Fe(II) (Tabela
5). O composto de baixa massa molar de T. aurantiacus, demonstrou ser o
melhor redutor de Fe(III)
Télbela 5: Redução de Fe(III) pelos fungos P. medula-panis, T. versicolor e T.
aurantiacus, utilizando 1 % de ferrozina em tampão acetato 50 mM, pH 4,5.
Abs 562 nm em função do tempo de incubação (min)
Amostra 10 60 120 240
T. versicolor 0,046 0,198 0,301 0,416
P. medula-panis 0,127 0,225 0,320 0,451
T. aurantiacus 0,136 0,269 0,391 0,579
5.6 - Tratamento das polpas kraft de eucalipto com compostos fúngicos de
baixa massa molar (<5 KDa).
Todos os três fungos selecionados, T. versicolor, P. medula-panis e
T. aurantiacus, produziram compostos de baixa massa molar ( <5 KDa), com
63
atividade oxidativa, com valores correspondentes a 4,0, 21,5 e 115,2 U/L,
respectivamente. O tratamento das polpas foi conduzido em meio ácido (pH 3,0),
utilizando uma quantidade de composto equivalente a 0,046 U por grama de
polpa seca para cada fungo. As modificações ocorridas nas polpas foram
avaliadas através de análises do número kappa e da viscosidade.
Apesar dos compostos de baixa massa molar (<5 KDa)
apresentarem atividade oxidativa com o substrato ABTS, nesta primeira etapa os
compostos não foram capazes de promover modificação nas polpas. Os
compostos fúngicos não reduziram o número kappa das polpas, ou modificaram a
celulose, cuja viscosidade não diminuiu em relação à polpa controle. O fato dos
compostos fúngicos não terem deslignificado a polpa pode ser atribuído à baixa
quantidade de compostos utilizados no tratamento (0,046 U/g de polpa seca).
Resultados obtidos por MACHUCA (1995), utilizando 1 U/g (20
vezes mais atividade), demostraram o efeito positivo da adição de compostos de
baixa massa molar produzidos por T. aurantiacus na eficiência de deslignificação
das polpas (14%). Porém, nestas condições uma diminuição da viscosidade
também foi observada (25% ). Após uma etapa posterior de extração alcalina,
observou-se um aumento adicional na deslignificação (16%) acompanhado de
uma redução da viscosidade ( 10% ).
As polpas pré-tratadas com compostos fúngicos foram submetidas a
uma etapa posterior de branqueamento com H202 em meio básico, combinado
com MgS04. Os resultados médios apresentados na Tabela 6, demonstram o
efeito do branqueamento com H202 no número kappa e na viscosidade.
É interessante notar que o uso dos compostos fúngicos de baixa
massa molar anteriormente à etapa de peroxidação, resultou em aumentos de
deslignificação final da polpa. Esse fato sugeriu-nos que o tratamento somente
com compostos de baixa massa molar (<5 KDa) não deslignificou as polpas kraft,
mas essa etapa foi importante para prepará-las para o subsequente
branqueamento com peróxido de hidrogênio.
Provavelmente, os compostos fúngicos podem ter agido na lignina
residual da polpa provocando modificações que aumentaram sua reatividade ao
H202 utilizado na etapa posterior.
64
Tabela 6: Efeito do tratamento de polpa kraft1 de eucalipto com compostos
fúngicos de baixa massa molar ( < 5kDa) num estágio de branqueamento com
peróxido de hidrogênio (P)2 Nºkappa Viscosidade Eficiência de Seletividade
· Sequência (cps) deslignificação
(%)
Controle/ P 9,8 ±0,98 29,5 ± 0,77
T. versicolor/ P 8,4 ± 0,98 28,4 ± 0,77
Controle/ P 9,0 ± 0,91 26,7 ±0,84
P. medula-panisl P 7,7 ± 0,91 25,5 ±0,84
Controle/ P 11,2 ± 1,20 24,8 ± 1,76
T. aurantiacusl P 9,5±1,20 22,3 ± 1,76
14,3 3,8
. 14,4 3,2
15,2 1,5 1-Polpa kraft com kappa inicial de 14, 1 e viscosidade inicial de 31,2 cps. 2 Peroxidação: 0,5% H202, 10% consistência, estabilizante: MgS04 0,05 % 3Beletividade = Eficiência de deslignificação/ % de redução da viscosidade da
polpa
Através desses tratamentos, ficou demonstrado que não houve
quedas acentuadas da viscosidade das polpas. mesmo quando obtivemos a
maior redução de número kappa.
Após o estágio de branqueamento com H202, os compostos
produzidos pelos basidiomicetos apresentaram um comportamento diferente do
ascomiceto, sendo que os fungos de decomposição branca diminuíram o nº
kappa e em menor proporção a viscosidade. O T. aurantiacus provocou uma
redução maior de número kappa que a dos fungos de decomposição branca,
porém ao mesmo tempo, a diminuição da viscosidade foi proporcionalmete maior.
Deste modo, a seletividade dos compostos de decomposição branca foi maior
que a do ascomiceto (Tabela 6).
A capacidade dos compostos de baixa massa molar de oxidar uma
série de substratos fenólicos e não fenólicos e de reduzir Fe(III) para Fe(II) em
meio .ácido devem ser responsáveis pelos efeitos de deslignificação das polpas
observados após o estágio P. Ao mesmo tempo, esta capacidade oxidativa deve
65
estar relacionada à presença de metal na estrutura dos compostos produzidos
por T. versicolor e P. medula-panis, da mesma forma como descrito para T.
aurantiacus (MACHUCA, 1995). Embora os resultados de atividade oxidativa
sugerem a presença de metal na estrutura . dos compostos fúngicos, esses
compostos ainda possuem capacidade de complexar Fe(III), como demonstrado
pela reação positiva com CAS. Desta forma os compostos fúngicos podem reagir
com ferro ou outros metais presentes na polpa (Mn, Cu), catalisando reações que
conduzem à modificações na lignina residual. Os íons metálicos Fe3+, Mn2+ e
Cu2+, são comumente encontrados em polpas e são os responsáveis pela
decomposição catalítica do H202 durante estágios de branqueamento (PRASAKIS
et ai, 1996). O Fe(III) pode estar presente na polpa associado a carboidratos ou
pode também formar complexos coloridos com subestruturas da lignina
(WILLl".'MS, 1998).
Desta forma, acredita-se que os compostos fúngicos de baixa
massa molar, com atividade oxidativa, provocaram uma modificação nas polpas
durante a primeira etapa de tratamento, que afetou a lignina residual sem
provocar uma perda desta, uma vez que não foi observada uma redução do
número kappa neste estágio. Ao mesmo tempo, a viscosidade das polpas não foi
afetada.
Na etapa subsequente, estágio P, foi possível observar uma
deslignificação juntamente com uma leve diminuição da viscosidade das polpas
pré-tratadas com os compostos obtidos dos três fungos, sendo observada uma
maior seletividade com os compostos dos fungos de decomposição branca, que
com os do ascomiceto.
Recentemente, PARRA et ai (1998), realizaram estudos em polpa
kraft de madeira mole utilizando uma fração parcialmente purificada de um
extrato obtido de G. applanatum com características de catecol e os resultados
obtidos, demonstraram que uma deslignificação de 9,5% foi alcançada, ao
mesmo tempo que uma queda acentuada da viscosidade foi verificada, após um
estágio de extração alcalina.
66
5.6 - Propriedades do sideróforo Desferal e de alguns compostos modelo
hidroxamato e catecolato
Um sideróforo comercial do tipo hidroxamato, Desferal, e três
compostos modelo de sideróforo, ácido acetohidroxâmico (AHA}, ácido 2,3-
dihidroxibenzóico (DHBA) e ácido 3,4-dihidroxifenilacético (DHPAA}, foram
utilizados neste estudo. Estes compostos modelo e o desferal foram escolhidos
por apresentarem uma estrutura conhecida e para comparar a ação dos catecóis
e hidroxamatos, durante o tratamento em polpas kraft. As propriedades de
complexação de Fe (Ili), atividade oxidativa com substratos típicos de
fenoloxidases e redução de Fe (Ili) também foram investigados com estes
compostos.
5.6.1 - Reação CAS
A capacidade dos diferentes compostos de complexar Fe(III) foi
determinada através da reação com o reagente universal de detecção de
sidróforos, CAS. De acordo com o mencionado anteriormente (item 5.1 }, quando
ocorre a reação entre CAS e um composto complexante, o qual possui a
capacidade de retirar o Fe(III) presente no CAS, observa-se uma mudança na
coloração da mistura de reação. A mudança de cor pode ser relacionada à perda
da cor azul do reagente CAS e ao aparecimento de . cor do novo complexo
(hidroxamato- ou catecol-Fe(III)) formado. A reação é expressa como
porcentagem de sideróforos capazes de complexar Fe(III) presentes na amostra
estudada em relação a uma amostra controle.
O Desferal e o modelo AHA, quando complexam Fe(III), formam complexos
coloridos que absorvem fortemente entre 400-500 nm, produzindo soluções de
cor alaranjada, com uma intensidade que depende da concentração do composto.
Os modelos de sideróforos catecolatos, DHBA e DHPAA, formam complexos com
Fe(III) que absorvem entre 600-800 nm, produzindo soluções de cor azul ou
verde-azulado (Apêndice 1). Assim, no caso dos compostos do tipo catecol, o
reagente CAS não foi apropriado para determinar a capacidade de complexação,
uma vez que os compostos complexados absorvem na mesma região onde
67
deveria ser observada a diminuição da absorbância do CAS, devido à perda do
Fe(III).
Na Tabela 7 são apresentados os resultados da reação CAS com os
compostos e pode-se notar que as máximas reações expressas como
porcentagem de sideróforos, são obtidas com os hidroxamatos, principalmente
com Desferal. No caso do DHBA, após 1 hora de incubação foi possível observar
uma pequena diminuição na absorbância em 630 nm e logo, com 6 horas, um
aumento, resultando em um valor negativo de porcentagem quando calculado em
relação ao controle. O aumento de absorbância foi maior com DHPM, sugerindo
uma maior reação com este composto.
Assim, os hidroxamatos e catecolatos utilizados neste trabalho
possuem capacidade de complexar Fe(III) e formar complexos coloridos, que
absorvem em diferentes regiões. Nas concentrações utilizadas (2mM de cada
composto), tanto hidroxamatos quanto catecolatos reagiram rapidamente com o
CAS.
Tabela 7: Reação CAS do Desferal e dos compostos modelo (AHA, DHBA,
DHPAA)
Reação CASª
Composto 1 hora 6 horas
Oesferal 88,2 100
AHA 77,8 82,7
DHBA 7,16 -(13,6)*
DHPAA1 -(6,8)* -(34,0)*
a: Porcentagem de sideróforos, calculado em relação a um controle
* Valor negativo indica que houve um aumento na absorbância em relação ao
controle.
1 - Desferal - 2 mM, AHA - 2mM, DHBA - 2 mM, DHPAA - 2 mM
5.6.2 - Atividade oxidativa
A capacidade do Desferal e dos compostos modelo de sideróforos
de oxidar substratos típicos de fenoloxidases, tais como o-dianisidina, ABTS e
69
Os mesmos ensaios foram repetidos nos diferentes valores de pH,
na presença ou ausência de tampão. Porém, nenhuma atividade foi observada
com qualquer um dos compostos.
Desta forma, diferentemente dos compostos de baixa massa molar
obtidos a partir das culturas fúngicas, o Desferal e os compostos modelo de
sideróforo, não apresentaram atividade oxidativa com substratos típicos de
fenoloxidases, sob condições semelhantes de reação.
5.6.3 - Redução de Fe(III)
A redução de Fe (Ili) para Fe (li) usando ferrozina, também foi
medida para os compostos modelo de sideróforos e o desferal, e os resultados
estão apresentados na Figura 18.
1,00
1,40
1,2)
E 1,00 e N I oso CII ~ 0,ffi
0,40
0,2)
0,00 o IF'---1---l---f--------+--·-l
2 4 6 8 10 Tefl1)0 (mnta;)
'----------------------------
Figura 18: Redução de Fe (Ili) pelos compostos modelo de sideróforos (AHA,
DHBA e DHPAA) e desferal com ferrozina a 1,0% em tampão acetato 50 mM, pH
4,5.
O DHPAA mostrou a maior velocidade de redução de Fe(III), nas
condições do ensaio. O Fe(III) presente no meio de reação foi complexado pelo
70
DHPAA e logo completamente reduzido para Fe(II), o qual reage com ferrozina,
após ser liberado pelo DHPAA, para formar o complexo que absorve em 562 nm.
Toda a reação aconteceu em aproximadamente um minuto, à temperatura
ambiente (Figura 18). Depois deste tempo, a absorbância manteve-se constante,
indicando que não há mais formação de complexo ferrozina-Fe(II) (Tabela 8). O
outro modelo de catecol DHBA, também foi muito eficiente na redução de Fe(III).
A reação foi mais lenta quando comparada com a produzida pelo DHPAA,
alcançando um patamar após 1 O minutos de reação.
O composto modelo de hidroxamato, AHA, apresentou a menor
velocidade de redução de Fe(III) e até 4 horas de reação ainda foi possível
observar aumento na absorbância em 562 nm, devido à formação do complexo
ferrozina-Fe(II). O sideróforo do tipo hidroxamato, desferal, não apresentou um
aumento significativo de Abs 562 nm, sugerindo que este composto não reduz
- Fe(III) para Fe(II) (Tabela 8).
Tabela 8: Redução de Fe(III) por Desferal e os compostos modelo de
síderóforos, utilizando 1 % de ferrozina em tampão acetato 50 mM, pH 4,5.
Abs 562 nm em função do tempo de incubação (min)
Composto (2 mM) 1 O 60 120 240
Desferal 0,081 0,087 0,104
AHA 0,153. 0,384 0,594
DHBA 1,518 1,610 cte.ª
DHPAA 1,309 1,328 cte.
a - valor de Abs se manteve constante
0,100
0,890
cte.
cte.
Desta forma, os compostos modelo de catecol utilizados neste
estudo, reduziram o Fe(III) para Fe(II) com uma velocidade significativamente
maior que os compostos do tipo hidroxamato.
71
5. 7 - Tratamento das polpas kraft de eucalipto com desferal e compostos
modelo hidroxamato e catecolato
Foi avaliado o efeito dos compostos modelo AHA, DHBA, DHPAA e
o desferal no branqueamento de polpas kraft de eucalipto. Os compostos foram
utilizados na concentração de 1 % em massa nas polpas, correspondendo a uma
concentração molar de 3,40, 1, 95, 1, 78 e 0,46 mM, respectivamente.
Os resultados médios da deslignificação provocada pelos
compostos AHA, DHBA e DHPAA estão apresentados nas Tabela 9
Tabela 9: Tratamento de polpa kraft com os compostos modelo AHA, DHBA e
DHPAA e após adição de peróxido de hidrogênio (P)1
Nºkappa Viscosidade
Sequência (cps)
Eficiência de
deslignificação (%)
Seletividade
Controle
DHBA
11,7 ± 0,78 33,4 ± 1,01
11,5 ±0,78 31,3 ± 1,01
12,6 ± 0,78 31,3 ± 1,01
10,7± 0,78 31,6 ± 1,01
9,3 ± 0,31 25,7 ± 0,70
8,6 ± 0,31 24,2 ±0,70
8,7 ± 0,31 24,2 ± 0,70
9,0 ± 0,31 24,6 ± 0,70
1,7 0,3 AHA
DHPAA2 8,6 1,6
p
AHA/P 7,5 1,3
DHBA/ P 6,5 1,1
DHPAA/ P 3,2 1,3
1- Peroxidação: 0,5% H202, 10% consistência, estabilizador: Mg 0,05
2-AHA - 3,40 mM, DHBA - 1,95 mM, DHPAA - 1,84 mM
Pelos resultados de eficiência de deslignificação apresentados,
observa-se que o melhor resultado ocorreu após o tratamento com o composto
DHPAA (8,6 %), sem que houvesse uma redução significativa da viscosidade.
Este catecol deve agir modificando e degradando a lignina residual presente,
sem apresentar ação sobre a celulose.
A partir desse resultado, pode-se sugerir que o DHPAA estaria
complexando o Fe(III) presente na polpa (9 mg/Kg de polpa - determinado por
72
absorção atômica) e desta forma estar catalisando reações com a lignina
residual. Esta ação poderia estar relacionada com a capacidade de complexação
e redução de Fe(III), pois o DHPAA apresentou a maior velocidade de redução de
Fe(III) a Fe(II). O efeito de deslignificação pode estar relacionado à formação de
espécies radicalares da mesma forma como sugerido para os compostos
fúngicos.
Após o tratamento com H202 em meio básico, os três compostos
apresentaram um efeito de deslignificação sem modificação na viscosidade das
polpas. Os maiores efeitos de deslignificação foram obtidos com o AHA e DHBA.
Isso pode sugerir que esses compostos modificariam a lignina no primeiro estágio
de tratamento, deixando uma lignina residual mais reativa ao peróxido. O DHPAA
produziu a menor deslignificação nas polpas, provavelmente devido à maior
remoção da lignina residual durante o primeiro estágio do tratamento, restando
· · uma menor quantidade para reagir com o peróxido.
Os dois catecóis foram utilizados no tratamento das polpas em
concentrações semelhantes (1,8-1,9 mM), porém obteve-se resultados de
deslignificação diferentes. Tal fato pode estar relacionado a diferenças em seus
mecanismos de redução de Fe(III) (Figura 18). No entanto, verificou-se que o
hidoxamato (AHA), apesar da baixa capacidade de reduzir Fe(III), apresentou
uma deslignificação semelhante ao DHBA, provavelmente devido à concentração
em que foi utilizado na polpa (3,4 mM).
O sideróforo do tipo hidroxamato, desferal, não produziu nenhuma
modificação no número kappa e na viscosidade das polpas, antes ou depois do
estágio P. Este resultado pode estar relacionado a características do composto,
tais como, ausência de atividade oxidativa e de redução de Fe(III) para Fe(II).
Provavelmente a baixa concentração deste composto em relação aos outros
(0,46 mM), também pode estar contribuindo com este resultado.
ERISMANN et ai (1990), trataram polpa kraft de eucalipto com um
sistema hemina/peróxido de hidrogênio sob condições de refluxo durante 2 horas
obtendo uma redução significativa do número · kappa de 18 para 2. Este
tratamento também apresentou uma perda de peso alta, o que demonstra que o
processo é pouco seletivo.
73
Em estudos realizados recentemente, PARRA et ai (1998),
utilizaram no tratamento de polpa kraft de pinus (madeira mole) o modelo de
sideróforo DHBA na ausência e na presença de H202, com o qual uma
deslignificação de 6 e 15% foram alcançadas, respectivamente. Porém, quando
na presença de H202, a viscosidade da polpa foi afetada, o que demonstrou que
o DHBA quelou o ferro existente na polpa e produziu radical HO• na presença de
H202, o qual degradou a celulose e diminuiu a viscosidade da polpa.
5.8 - Tratamento de polpas kraft de eucalipto com desferal e compostos
modelo hidroxamato e catecolato, complexados com Fe(III)
Na etapa anterior (item 5. 7), os compostos modelo e o sideróforo
desferal foram adicionados· à polpa na sua forma não complexada. Desta forma,
propôs-se que tais compostos estariam complexando metais presentes na polpa,
tais como ferro, cobre ou manganês, causando a forrnação de estruturas reativas
que provocariam a degradação da lignina. De tato. após o tratamento das polpas
com AHA, DHBA e DHPAA, foi obtido um efeito de deslignificação, antes ou
depois do estágio P, dependendo do composto.
Nesta etapa o efeito do tratamento de polpas kraft de eucalipto com
o desferal e os compostos modelo AHA, DHBA e DHPAA, foi verificado na
presença de cloreto de ferro, nas concentrações de 0,5 (0,93 mM de Fe(III)) e
1,0% (1,86 mM de Fe(III)).
Os compostos modelo e o desferal, na presença de 0,93 mM e 1,86
mM de Fe(III), apresentam coloração. Os catecóis DHBA e DHPAA ficaram
esverdeados, enquanto os do tipo hidroxamato, desferal e AHA, apresentaram
coloração avermelhada. Estes complexos coloridos, quando utilizados no
tratamento coloriram a polpa, a qual continuou a apresentar coloração mesmo
após o tratamento com peróxido e de exaustivas lavagens. Isto sugere que parte
destes complexos coloridos ainda permanecem adsorvidos pela celulose ao
término do tratamento.
A Tabela 1 O apresenta os resultados obtidos com o desferal e os
compostos modelo na presensa de 0,5% de FeCb.6H20 (0,93 mM de Fe(III)).
74
Tabela 10: Tratamento de polpa kraft com os compostos modelo (AHA, DHBA e
DHPAA) e desferal complexado com 0,93 mM de Fe(III) e após adição de
peróxido de hidrogênio (P) 1
Nºkappa Viscosidade Eficiência de Seletividade
·sequência (cps) deslignificação (%)
Controle 12,9±0,13 33,0 ± 0,80
Desfera(2 12,8±0,13 30,9 ± 0,80 0,8 0, 1
AHA 12,9±0,13 32,2 ±0,80
DHBA 12,9±0,13 31,7 ± 0,80
DHPAA:! 12,6 ± 0, 13 31,4 ± 0,80 2,4 0,5
p 9,8 ± 0,26 26,7 ± 0,61
Desferal/ P 9,1 ± 0,26 25,3 ± 0,61 7, 1 1,4
AHA/P 9,4 ± 0,26 25,8 ± 0,61 4,1 1,2
DHBA/ P 9,4 ± 0,26 26, 1 ± 0,61 4,1 1,8
DHPAA/ P 9,2 ± 0,26 25,2 ± 0,61 6,1 1,1
1- Peroxidação: 0,5% H20f, 10% consistência, estabilizador: Mg 0,05 %
2- Desferal - 0,46 mM, AHA- 3,4 mM, DHBA- 1,95 mM, DHPAA- 1,78 mM
O AHA, o DHBA e o desferal não modificaram as características da
polpa nesta primeira etapa, quando utilizados na forma complexada. No entanto,
o DHPAA provocou uma menor redução no número kappa, quando comparado
com o resultado obtido em que foi utilizado em sua forma não complexada
(Tabela 9).
Provavelmente o fato desse composto ter sido adicionado na forma
complexada, impediu que reagisse diretamente com o ferro ou outros metais
presentes na polpa, diminuindo assim, o efeito de deslignificação anteriormente
observado.
Após o tratamento das polpas com H202 todos os compostos
mostraram um efeito de deslignificação.
No tratamento da polpa kraft com os compostos modelo
complexados com 0,93. mM de Fe(III), obteve-se resultados menores de
deslignificação, se compararmos com os resultados obtidos sem a adição de
75
ferro. Pode-se propor que isto ocorreria pelo fato dos compostos complexarem o
Fe(III) livre no meio, diminuindo assim a capacidade de complexar o ferro que
está ligado à lignina e em função desta ausência de redução de ferro pelo
desferal, não se esperava um efeito de deslignificação das polpas. Desta forma
não é possível explicar o efeito de deslignificação obtido (7%) através do mesmo
mecanismo sugerido para os outros compostos modelo.
Outro experimento foi realizado com o desferal e os compostos
modelo, na presença de 1,0% de FeC'3.6 H20. Na primeira etapa de tratamento
não se observou modificações no número kappa e na viscosidade das polpas.
Porém, após o tratamento com peróxido verificou-se um efeito de deslignificação
com todos os compostos, indicando que a lignina havia sido modificada na
primeira etapa, mas foi retirada da polpa somente após o tratamento com H202
(Tabel~ 11 ).
Tabela 11: Tratamento de polpa kraft com os compostos modelo (AHA, DHBA e
DHPAA) e desferal complexado com 1,86 mM de Fe(III) e após adição de
peróxido de hidrogênio (P) 1
Nº kappa Viscosidade
Sequência (cps)
p 9,9 ± 0,40 26,1 ±0,52
Desferal2/ P 9,6 ± 0,40 26,0 ±0,52
AHA/P 9,3 ± 0,40 26,2 ±0,52
DHBA2/ P 9,3 ± 0,40 25,9 ±0,52
DHPAA2/ P 8,8 ± 0,40 24,9 ±0,52
Eficiência de
deslignificação (%)
Seletividade
3,0 7,9
6,1
6,1 7,9
11, 1 2,4
1- Peroxidação: 0,5% H202, 10% consistência, estabilizador: Mg 0,05 %
2- Desferal - 0,46 mM, AHA- 3,40 mM, DHBA-1,95 mM, DHPAA - 1,78 mM
Ao aumentar a concentração de Fe(III) de 0,93 mM para 1,86mM, a
eficiência de deslignificação aumentou para AHA, DHBA e DHPAA, sendo o
maior efeito observado para DHPAA. Na presença de excesso de Fe(III) os
compostos poderiam realizar sucessivos ciclos redox e com isto, haveria a
76
possibilidade da formação de maior quantidade de espécies radicalares que
poderiam modificar a lignina residual presente nas polpas.
77
6 - Conclusões
- Quando estes basidiomicetos foram cultivados em meio extrato de malte,
foi possível detectar a produção de sideróforos pelos fungos de decomposição
parda e de atividade oxidativa pelos fungos de decomposição branca.
- P. medula-panis e T. versicolor produziram compostos de baixa massa
molar (<3 KOa) com atividade oxidativa.
- Quando cultivados em meio Czapeck suplementado com farelo de trigo,
T. versicolor, P. medula panis e T. aurantiacus produziram compostos de baixa
massa molar (1000-5000 Da) com atividade oxidatíva, capacidade de complexar e
reduzir o Fe(III).
- Um efeito de deslignificação das polpas foi observado após o tratamento
com os compostos fúngicos seguido por um tratamento com H202. A lignina
residual deve estar sendo modificada durante a primeira etapa, a qual é retirada
após o tratamento com peróxido.
- Os compostos modelo de sideróforos tipo catecolato apresentaram maior
velocidade de redução de Fe(III) a Fe(II) que os compostos modelo de
sideróforos tipo hidroxamato.
- O modelo de sideróforo DHPAA mostrou ser o mais eficiente no
tratamento de polpas com ou sem adição de Fe(III).
- Os compostos fúngicos mostraram-se mais eficientes que os compostos
modelo de sideróforos na deslignificação de polpas.
- Os compostos fúngicos e os compostos modelo, parecem agir sobre a
lignina residual presente na polpa através da formação de espécies radicalares,
na pressença de metal e 02. As espécies radicalares geradas parecem não ser
inespecíficas, uma vez que não foram detectadas quedas acentuadas na
viscosidade da polpa.
78
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,1 ::i" F, tl.ENOUIL -c, ,,
APÊNDICE I
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(: .- (, , r, ,li! ·-· :J '. nrn
Espectros de absorção do sideróforo comercial Desferal (2) e dos compostos
modelo de sideróforó AHA (3), DHBA (4) e DHPAA (5) complexados com ferro
numa concentração 1 :1 e do FeCb (1) (2mM)_
·:-· , .. ·. -.....: ·-