facultad de farmacia - universidad de navarra
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FACULTAD DE FARMACIA
DISENtildeO SIacuteNTESIS Y EVALUACIOacuteN
BIOLOacuteGICA DE NUEVOS DERIVADOS DE
ARILAMINOALCOHOLES CON POTENCIAL
ACTIVIDAD CONTRA LA MALARIA
ADELA MENDOZA LIZAacuteLDEZ
FACULTAD DE FARMACIA
DISENtildeO SIacuteNTESIS Y EVALUACIOacuteN BIOLOacuteGICA DE
NUEVOS DERIVADOS DE ARILAMINOALCOHOLES
CON POTENCIAL ACTIVIDAD CONTRA LA MALARIA
Memoria presentada por Adela Mendoza Lizaacuteldez para aspirar al
grado de doctor por la Universidad de Navarra
El presente trabajo ha sido realizado bajo mi direccioacuten en la Unidad de I+D
de Medicamentos y autorizo su presentacioacuten ante el Tribunal que lo ha de
juzgar
Pamplona a 18 de junio de 2012
Dra Silvia Peacuterez Silanes
Este trabajo ha sido desarrollado en la Unidad de I+D de Medicamentos
del Centro de Investigacioacuten de Farmacobiologiacutea Aplicada (CIFA) de la
Universidad de Navarra perteneciente a uno de los proyectos de
investigacioacuten que dirigen el Dr Antonio Monge Vega y el Dr Ignacio
Aldana Moraza Doctores en Ciencias Quiacutemicas
El trabajo presentado en esta memoria ha sido realizado gracias a la
concesioacuten de la ldquoAyuda para la Formacioacuten de Tecnoacutelogosrdquo concedida por el
Gobierno de Navarra y la ldquoAyuda al Personal Investigador en Formacioacutenrdquo
concedida por la Asociacioacuten de Amigos de la Universidad de Navarra
A mis padres y mi hermana
A Javi y Julen
ldquoPuede que los ideales que albergamos
nuestros suentildeos maacutes anhelados y nuestras maacutes fervientes esperanzas
no lleguen a cumplirse mientras vivimos
Pero eso no importa
Saber que en tu diacutea cumpliste con tu deber y
estuviste a la altura de las expectativas de tus congeacuteneres
es por siacute misma una experiencia gratificante y un logro magniacuteficordquo
Nelson Mandela
Agradecimientos
La realizacioacuten de esta tesis doctoral no hubiese podido llevarse a cabo sin la ayuda y
el apoyo de las personas que han compartido conmigo estos uacuteltimos antildeos A todos
ellos que han hecho posible hoy la presentacioacuten de este trabajo deseo expresar mi maacutes
sincero agradecimiento
Mi agradecimiento especial al Dr Antonio Monge la persona de referencia durante
el desarrollo de todo este trabajo Por apostar por miacute y mi trabajo en momentos en que
todo pareciacutea que no llegariacutea a teacutermino Por ensentildearme que todo el trabajo merece la
pena que la contribucioacuten de todos es igual de vaacutelida que somos una familia Gracias
por su apoyo en los buenos y malos momentos personales
Mi gratitud a la Dra Silvia Peacuterez Silanes por estar siempre dispuesta a ayudarme en
todo lo que fuese necesario en todos los planos de la vida durante estos antildeos por su
gran implicacioacuten en este proyecto por transmitirme tesoacuten orden correccioacuten y sobre
todo optimismo durante todo este tiempo que he tenido el honor de trabajar a su lado
Gracias al Dr Ignacio Aldana la persona que me ofrecioacute la oportunidad de
introducirme en el mundo de la investigacioacuten por ayudarme y apoyarme en todo
momento y transmitirme que en investigacioacuten tambieacuten es importante la tranquilidad
I wish to express my gratitude to Dr Valerie Jullian for being such a splendid host
during my first few days in Toulouse and for considering my small contribution to his
magnificent work to be of importance
I would also like to thank Dr Michel Sauvain for introducing me into the world of in
vivo biological research He accepted the challenge of introducing a chemist into his
specialized area of experimentation with live rodents showing a great amount of
patience with me
I want to give a special thanks to Dr Eric Deharo who had faith in this work and
whose collaboration was immensely helpful He provided the necessary contacts of
other researchers outside the University of Navarras RampD department and
coordinated the project contributing to the success of this work
I would also like to give a special mention to Adriana Pabon from Colombia and to
German Gonzalez Giovanni Garavito and Miguel Quiliano from Peru for their active
participation in this project
A todos los compantildeeros de laboratorio con los que he trabajado estos antildeos
A mi familia por animarme a seguir siempre adelante al hacerme sentir en todo
momento que todo este trabajo es algo de gran importancia y valor humano
ABREVIATURAS
ABS Porcentaje de absorcioacuten
ADN Aacutecido desoxirribonucleico
AMREF African Medical and Reserch Foundation
ARN Aacutecido ribonucleico
ASP 214 Aspartato 214
ASP 34 Asptartato 34
ATP Adenosin trifosfato
BZN Benceno
BZT Benzotiofeno
CCF Cromatografiacutea en capa fina
CDCl3 Triclorometano deuterado
CI50 Concentracioacuten Inhibitoria al 50
COSY Correlated Espectroscopy H-H
CQ Cloroquina
CSP Proteina circumsporozito
DDT Dicloro-difenil-Tricloroetano
DEET NN-dimetil-meta-toluamida
DEPT 90 Distorsionless Enhancement by Polarization Transfer (CH)
DEPT-135 Distorsionless Enhancement by Polarization Transfer
DMEN F-12 Medio de cultivo con mezcla de nutrientes
DMSO Dimetilsulfoacutexido
DOXP Enzima 1-desoxi-D-xilulosa-5-fosfato
DT50 Dosis Toacutexica al 50
ECDC European Centre for Disease Prevention and Control
EMP-1 Proteiacutena de la membrana epitelial
FM Foacutermula Molecular
FAS II Siacutentesis de aacutecidos grasos II
FBZT Fluoro-benzotiofeno
FCR-3 Cepas Plasmodium Falciparum Cloroquino-resistente
FNFT Fluoro-naftaleno
FRP Asociacioacuten de la lucha contra el Paludismo
Hb Hemoglobina
HMBC Heteronuclear Multiple Bond Correlation
HMQC Heteronuclear Multiple Quantum Correlation
HPLC High Performance Liquid Chromatography
HRP-2 Proteiacutena Rica en Histidina
IC50 Concentracioacuten Inhibitoria del 50
IR Espectroscopia Infrarroja
IS Iacutendice de Selectividad
J Constante de Acoplamiento
K Lisina (coacutedigo de una letra)
LDH Lactato Deshidrogenasa
MSP-1 Proteiacutena de superficie del merozoiacuteto
MTT Bromuro de 3-(45- dimetiltiazol-2-ilo)-25-difeniltetrazol
NaOH Hidroacutexido de sodio
NEAA Nonessential amino-acids
NFT Naftalenos
OMS Organizacioacuten Mundial de la Salud (en ingleacutes WHO)
PM Peso Molecular
PENUD Programa de Naciones Unidas para el Desarrollo
PfCRT Proteiacutena Transportadora del Plasmodium falciparum causante
de la resistencia a la Cloroquina
PIPR Piperidina
PIPZ Piperazina
PIRD Tertrahidropiridina
PIRR Pirrolidina
R Arginina (coacutedigo de una letra)
RMN Resonancia Magneacutetica Nuclear
RMSD (Root-mean-square derivation) Desviacioacuten de la media
cuadraacutetica
S Serina (coacutedigo de una letra)
S163R Mutacioacuten arginina-serina en posicioacuten 163 que invierte la
resistencia a la Cloroquina
T Treonina (simplificacioacuten para codificacioacuten en aminoaacutecidos)
TCA Terapias Combinadas de Artemisina
THR Treonina
TNFα Factor de Necrosis tumoral
TPSA Aacuterea superficial Topoloacutegica
TYR Tirosina
UNICEF Fondo de Naciones Unidas para la Infancia
Iacutendice
INTRODUCCIOacuteN 1
I MALARIA 3
I1 Definicioacuten 5
I2 Historia de la enfermedad 5
I3 Epidemiologiacutea 7
I31 Situacioacuten global de la enfermedad 7
I32 Factores epidemioloacutegicos 11
I33 Tipologiacutea de aacutereas endeacutemicas 11
I34 Zonas endeacutemicas e inmunidad 12
II MALARIA Y PLASMODIUM 13
II1 El Plasmodium 15
II11 Caracteriacutesticas morfoloacutegicas 15
II12 Mecanismo de movilidad 16
II13 Mecanismo de invasioacuten celular 16
II14 Metabolismo para el crecimiento 17
II2 Ciclo de la malaria 18
II21 Ciclo de vida del paraacutesito 18
II22 Desarrollo de los esquizontes 20
II3 Especies de Plasmodium 22
II4 Sintomatologiacutea 25
II5 Deteccioacuten y diagnoacutestico 26
III PREVENCIOacuteN Y TRATAMIENTO 29
III1 Medidas preventivas 31
III2 Tratamiento 32
III21 Historia del tratamiento 32
III22 Clasificacioacuten de los compuestos antimalaacutericos 33
III23 Aparicioacuten de resistencias 38
III24 Tratamientos actuales 40
III3 Estrategias mundiales en la lucha contra la malaria 43
III4 Liacuteneas de investigacioacuten actual 44
III41 Buacutesqueda de nuevas dianas 44
III42 Productos naturales 46
III43 Desarrollo de vacunas 47
ANTECEDENTES 49
OBJETIVOS Y PLAN DE TRABAJO 53
IV OBJETIVOS 55
V PLAN DE TRABAJO 59
V1 Disentildeo de nuevos arilaminoalcoholes 61
V2 Siacutentesis de los compuestos disentildeados 63
V3 Caracterizacioacuten de los compuestos 63
Iacutendice
V4 Evaluacioacuten bioloacutegica ldquoin vitrordquo 64
V5 Evaluacioacuten bioloacutegica ldquoin vivordquo 64
V6 Estudios computacionales 64
MATERIAL Y MEacuteTODOS 65
VI QUIacuteMICA TEOacuteRICA 67
VI1 Esquema general de siacutentesis 69
VI2 Siacutentesis de precursores 70
VI21 Siacutentesis de (benzo[b]tiofen-3-il)-3-cloropropan-1-ona 70
VI22 Siacutentesis de arilaminas 70
VI3 Siacutentesis de derivados carboniacutelicos (Serie 0) 73
VI31 Condensacioacuten de 1-(benzo[b]tiofen-3-il)-3-cloropropan-1-ona y de 2-bromo-2acute-acetonaftona
con la amina (Viacutea 1) 73
VI32 Reaccioacuten de Mannich Condensacioacuten de metilcetonas con aminas en medio aacutecido (Viacutea 2) 74
VI4 Siacutentesis de derivados hidroxiacutelicos (Series 1-7) 75
VI5 Siacutentesis de oximas (Serie 8) 78
VII QUIacuteMICA EXPERIMENTAL 81
VII1 Instrumental y reactivos 83
VII2 Meacutetodos de elucidacioacuten estructural 83
VII3 Denominaciones de compuestos 85
VII4 Descripcioacuten general de meacutetodos de siacutentesis 86
VII41 Meacutetodo A procedimiento general para la obtencioacuten de las arilaminas protegidas 86
VII42 Meacutetodo B procedimiento general para la desproteccioacuten de aminas 87
VII43 Meacutetodo C procedimiento general para condensacioacuten de aminas (Viacutea 1) 87
VII44 Meacutetodo D procedimiento de condensacioacuten de aminas (Viacutea 2) 87
VII45 Meacutetodo E procedimiento general para la reduccioacuten de cetonas 88
VII46 Meacutetodo F procedimiento general para siacutentesis de oximas desde carbonilos 88
VII5 Purificacioacuten por cromatografiacutea flash 89
VIII ENSAYOS BIOLOacuteGICOS 91
VIII1 Ensayos in vitro 93
VIII2 Ensayos toxicoloacutegicos 94
VIII3 Ensayos in vivo 94
VIII31 Instrumental y reactivos 95
VIII32 Metodologiacutea 95
IX ESTUDIOS COMPUTACIONALES 105
IX1 Propiedades fisicoquiacutemicas de los compuestos 107
IX2 Optimizacioacuten geomeacutetrica 107
IX3 Estudios de Acoplamiento Molecular (Docking) 108
RESULTADOS Y DISCUSIOacuteN 111
X DESCRIPCIOacuteN DE COMPUESTOS 113
Iacutendice
X1 Siacutentesis de precursores 115
X2 Siacutentesis de derivados carboniacutelicos (Serie 0) 120
X3 Siacutentesis de derivados hidroxiacutelicos 143
X4 Siacutentesis de Oximas (Serie 8) 165
X5 Purificacioacuten de compuestos por cromatografiacutea flash 167
X6 Elucidacioacuten estructural de compuestos por RMN 168
X61 Elucidacioacuten estructural para los derivados de piperazina 168
X62 Elucidacioacuten estructural para los derivados de piperidina 175
X63 Elucidacioacuten estructural para los derivados de tetrahidropiridina 180
XI ENSAYOS BIOLOacuteGICOS 187
XI1 Ensayos de actividad antiplasmoacutedica in vitro 189
XI2 Ensayos de actividad antiplasmoacutedica in vivo 191
XI3 Discusioacuten de ensayos bioloacutegicos 192
XII ENSAYOS COMPUTACIONALES 195
XII1 Propiedades fisicoquiacutemicas de los compuestos 197
XII2 Discusioacuten de propiedades fisicoquiacutemicas 199
XII3 Estudios de Modelizacioacuten y Acoplamiento Molecular 200
XII4 Discusioacuten de resultados de modelizacioacuten 207
CONCLUSIONES 209
BIBLIOGRAFIacuteA 219
ANEXOS 231
INTRODUCCIOacuteN
II MMAALLAARRIIAA
Malaria
5
I1 Definicioacuten
La malaria fiebre paluacutedica o tambieacuten llamada paludismo es una enfermedad
infecciosa causada por el paraacutesito protozoario del filo Apicomplexa clase
Aconoidasida orden Haemosporididae de la familia Plasmodiidae del geacutenero
Plasmodium1 y es transmitido por la hembra del mosquito del geacutenero Anopheles
La malaria es una de las enfermedades tropicales maacutes importante del mundo
que provoca la muerte de miles personas Estaacute estrechamente ligada a la
pobreza y a la evolucioacuten y el desarrollo del hombre
Los mayores problemas en la lucha contra la enfermedad ademaacutes de la crisis
actual que reduce los fondos destinados a los paiacuteses en viacuteas de desarrollo (que
son los maacutes afectados) son la constante aparicioacuten de resistencias por el uso de
monoterapias en tratamientos y debido a los insecticidas utilizados
I2 Historia de la enfermedad
La historia de la malaria es tan antigua como la historia de la civilizacioacuten ya
que se tiene constancia de la presencia de la enfermedad en manuscritos
originarios de China la India o el Antiguo Egipto
Teniendo en cuenta esto se puede entender de donde proviene el nombre de
la enfermedad La palabra malaria proviene de las palabras ldquomal ndashairerdquo que
fueron empleadas en Italia para describir las fiebres intermitentes asociadas a la
exposicioacuten al ambiente de las marismas o cieacutenagas El otro nombre por el que
nos referimos a la enfermedad proviene del latiacuten ldquopalusrdquo que significa pantano
cieacutenaga de ahiacute la denominacioacuten de fiebres paluacutedicas o paludismo
Aunque su nombre tiene su origen en Europa se cree que los paraacutesitos se
desarrollaron en el oeste y centro oeste de Aacutefrica y en el sudeste asiaacutetico Es
importante tener en cuenta su estrecha relacioacuten con la historia natural Ha sido
la evolucioacuten del hombre la que ha expandido la enfermedad de ahiacute que hay
que ser muy conscientes de que durante la historia de la humanidad ha habido
picos de enfermedad ocasionados por la accioacuten del hombre y su desarrollo No
es de extrantildear dicha variacioacuten en la incidencia cuando en China hace maacutes de
5000 antildeos que se conoce la enfermedad2 y los textos egipcios dejan constancia
1httpwwwncbinlmnihgovTaxonomy 2 httpwwwmalariasitecommalariahistory_literaturehtm
Malaria
6
de ella desde hace ya 4000 antildeos Se puede saber por textos antiguos que la
enfermedad se extiendioacute por el mar Mediterraacuteneo hace 2000 antildeos y que al Norte
de Europa llegoacute hace aproximadamente 1000 antildeos Podemos darnos cuenta de
que la malaria ha avanzado unida a la historia del hombre si se tiene en cuenta
que cada vez es mayor la intercomunicacioacuten de sociedades alejadas
geograacuteficamente las continuas guerras e invasiones las rutas comerciales el
comercio de esclavos la profundizacioacuten y especializacioacuten de cultivos propensos
a la criacutea del paraacutesito como arrozales (humedales) el desarrollo de los medios de
transporte que permiten viajar a grandes distancias el aumento y la lejaniacutea de
las migraciones la democratizacioacuten de las vacaciones el comercio-intercambio
de grandes cantidades de alimentos el cada vez mayor trasiego de animales
vivos
Alrededor de 400 aC en la antigua Roma Hipoacutecrates fue el primero en
describir las manifestaciones tiacutepicas de la malaria que la diferenciaba de otras
enfermedades estudioacute la eacutepoca del antildeo donde aumentaba la enfermedad y el
lugar de vida de los enfermos Con ello establecioacute una relacioacuten enfermedad-
agua estancada que dio lugar a los primeros programas de drenaje de agua en
Roma y a la primera intervencioacuten contra la malaria
La escuela hipocraacutetica sosteniacutea que la enfermedad era el resultado de un
desequilibrio en el cuerpo de los cuatro humores unos fluidos que en las
personas sanas se encontraban naturalmente en una proporcioacuten semejante
Cuando los cuatro humores (sangre bilis negra bilis amarilla y flema) se
desequilibraban (laquodyscrasiaraquo mala mezcla) el individuo enfermaba y
permaneciacutea enfermo hasta que se recuperaba el equilibrio La terapia
hipocraacutetica se concentraba en restaurar este equilibrio El tratamiento maacutes
administrado era la purga de la sangre
No seriacutea hasta el antildeo 100 dC cuando se pensoacute que la enfermedad se
transmitiacutea por inhalacioacuten de vapores de la enfermedad el ldquomal airardquo italiano
No era tan errado el diagnoacutestico ya que por el aire vuelan los responsables de
transmitir los paraacutesitos que ocasionan la enfermedad Del otro sinoacutenimo de
malaria se deriva una confusioacuten semejante que llega tambieacuten indirectamente
del aire el paludismo rdquopalusrdquo en latiacuten designa a los pantanos que se creiacutean
responsables de la dolencia pero en realidad era donde proliferaban los
mosquitos Habraacute que esperar hasta 1898 en que se demostroacute que la malaria era
Malaria
7
transmitida por estos cuando ya se relacionaba la enfermedad con larvas del
moquito y microorganismos involucrados en la infeccioacuten
El nacimiento y desarrollo de la microbiologiacutea supuso un salto importante en
el conocimiento de las ciencias y como no podiacutea ser menos impulsoacute el
conocimiento de la enfermedad Asiacute en el antildeo 1880 el cirujano franceacutes Charles
Louis Alphonse Laveran (disciacutepulo de Pasteur) observoacute en Argelia los paraacutesitos
dentro de los gloacutebulos rojos de personas infectadas Planteoacute entonces que la
enfermedad era causada por protozoos siendo esta la primera vez que se
asociaba un protozoo con una enfermedad humana Posteriormente sus
estudios sobre protozoos le reportaron el Nobel de Medicina en 1907 aunque
fueron los cientiacuteficos italianos Ettore Marchiafava y Angelo Celli los que
bautizaron a estos protozoos con el nombre de ldquoPlasmodiumrdquo Carlos Finlay
meacutedico cubano sugirioacute por sus conocimientos sobre la fiebre amarilla que la
malaria podiacutea ser transmitida tambieacuten por mosquitos Hipoacutetesis confirmada en
el antildeo 1898 por Sir Ronald Ross en la India por lo que le fue concedido el
premio Nobel de medicina en 1902 Desde ese momento los estudios
protozoarios fueron avanzando y al poco tiempo en el antildeo 1899 Grassi
Bignami y Basianelli descubrieron el ciclo completo de la enfermedad el ciclo
celular protozoario y su transmisioacuten3
Desde entonces hasta la actualidad se han desarrollado diferentes
conocimientos y modos de prevencioacuten y tratamiento Un caso muy interesante
y uacutetil de estos avances fue el hecho de que los trabajos realizados por Finlay y
Ross sirvieron para crear las primeras guiacuteas de salud muy uacutetiles en eventos tan
importantes para el mundo como la construccioacuten del Canal de Panamaacute
I3 Epidemiologiacutea
I31 Situacioacuten global de la enfermedad
Seguacuten el informe de 2011 de la OMS4 sobre malaria son 106 paiacuteses los que
incluyen esta enfermedad como endeacutemica Se estima en 216 millones los casos
registrados a nivel mundial de los que se han producido 266 mil muertes Los
esfuerzos en la lucha contra la enfermedad de los diferentes organismos
3 httpwwwmedicinamcom 4httpwwwwhointmalariaes
Malaria
8
internacionales han dado como resultado un descenso de un 25 de las tasas de
mortalidad por malaria en la uacuteltima deacutecada5
Figura 1 Distribucioacuten mundial de la malaria paiacuteses libres endeacutemicos y en tratamiento6
En la figura 1 se observa coacutemo la malaria es una enfermedad asociada a la
pobreza y a los climas tropicales El 81 de los casos detectados provienen de
Aacutefrica subsahariana aunque a nivel mundial el 86 de las viacutectimas de la
malaria son nintildeos menores de cinco antildeos
De los 3300 millones de personas en riesgo de contraer la malaria 2100
millones se encuentran en situacioacuten de alto riego de los que el 47 pertenecen
al continente africano y el 37 al asiaacutetico De los 1200 millones restantes que
estaacuten en bajo riesgo de contraer malaria el 94 no son africanos En Aacutefrica
seguacuten los datos del informe de la Fundacioacuten para la investigacioacuten y la medicina
africana (AMREF) de 20117 se concentra la mayor poblacioacuten en riesgo donde el
apoyo externo es mayor y donde por el contrario se invierte el menor gasto
puacuteblico El 90 de los casos de malaria los produce el plasmodio maacutes agresivo
el P falciparum Seguacuten la OMS muchos paiacuteses de la regioacuten africana han
registrado desde el antildeo 2000 hasta 2010 un descenso mayor del 50 de casos
confirmados ingresos y muertes Esto se debe a los cada vez maacutes eficaces
sistemas de vigilancia Del 25 de la disminucioacuten mundial de las muertes
causadas por la malaria un 33 corresponde a Aacutefrica8 En el continente
americano la malaria se centra en la zona amazoacutenica y de Centroameacuterica En
5 Centro de prensa de la OMS (dic 2011) 6 Disponible en httpwwwwhointmalariaworld_malaria_report_2009 7httpwwwamrefesuploadsdocumento 8 Diez datos sobre el paludismo (OMS abril 2012)
Malaria
9
estas zonas se dan menos casos de malaria que en la regioacuten africana pero la
inversioacuten del gasto puacuteblico para erradicarla es mucho mayor La mayoriacutea de los
casos son producidos por el P vivax aunque tambieacuten se dan casos de P
falciparum Del 25 de la disminucioacuten mundial el 55 corresponde a este
continente
En Asia la situacioacuten es maacutes complicada de definir porque depende mucho de
la zona geograacutefica En la zona del sudeste asiaacutetico la situacioacuten es maacutes grave
maacutes parecida a Aacutefrica donde predominan los casos de P falciparum En el resto
de Asia predomina sin embargo el P vivax como en centro y Sudameacuterica En
Oceaniacutea la situacioacuten es muy parecida a la zona de Asia donde la malaria no es
tan grave La disminucioacuten de las muertes supone un 42 de la disminucioacuten de
mortalidad por malaria en este continente
El continente europeo se consideraba libre de malaria desde hace unos antildeos
pero en la actualidad se han registrado nuevos datos El 80 de los casos de la
Europa Occidental se registran en Francia Inglaterra Italia y Alemania Son
zonas donde la malaria se produce de forma ocasional estacional o por razones
de migraciones humanas (ECDC 20119) La zona de Oriente medio concentran
el mayor nuacutemero de casos ocasionados por P vivax La tasa de mortalidad por
malaria en Europa ha disminuido hasta el 1 de los casos
I311 La malaria en Espantildea
La lucha antipaluacutedica fue la primera intervencioacuten sanitaria espantildeola que se
basoacute en criterios epidemioloacutegicos es decir se planificoacute en base a datos de
prevalencia de la enfermedad En 1920 se realizoacute una organizacioacuten de Lucha
Antiplasmoacutedica que consiguioacute con la creacioacuten de dispensarios antipaluacutedicos el
estudio del vector con la participacioacuten y asesoramiento de entomoacutelogos
especialistas en saneamiento ambiental dieron como resultado en los antildeos 30
una disminucioacuten de los datos endeacutemicos en Espantildea En la guerra civil espantildeola
por el debilitamiento socioeconoacutemico y las circunstancias propias de una guerra
se produjo un recrudecimiento de la malaria
9 ECDC European Centre for Disease Prevention and Control Centro de la Unioacuten Europea creado en 2005 para el control de las enfermedades infecciosas con sede en Suecia
Malaria
10
Figura 2 Distribucioacuten de la malaria en Espantildea en el antildeo 193310
En el antildeo 1943 ante la evidente gravedad sanitaria del paiacutes se produce una
reactivacioacuten del Dispensario y un uso masivo de insecticidas A esto se le suma
la firma del convenio con la OMS para potenciar la erradicacioacuten de la malaria
en Espantildea
En 1943 se da por finalizada la campantildea entrando en fase de mantenimiento
que da paso en 1964 a la declaracioacuten de paiacutes libre de malaria por la OMS
siempre teniendo en cuenta que se han de mantener los sistemas de vigilancia
de la enfermedad
En 1961 se registra el uacuteltimo caso de malaria autoacutectona en Espantildea aunque desde
la declaracioacuten de zona libre se han descrito por parte de la Red nacional de
vigilancia epidemioloacutegica varios casos de malaria En el antildeo 2001 se registraron
466 casos diagnosticados en Espantildea asociados a inmigrantes y turistas ademaacutes
se debe tener en cuenta la posibilidad de producirse casos por transfusiones
sanguiacuteneas trasiego de jeringuillas de pacientes drogadictos o malaria de
aeropuerto (Bueno Mari R y Jimenez Peydro R 2008)
El uacuteltimo caso de malaria en Espantildea se diagnosticoacute en una mujer en Aragoacuten en
2009 Por esto se incrementaron las alertas pero no han quedado registrados
maacutes casos (Santa Olalla et alts 201011)
10 Disponible en httpscieloisciiiesscielophppid=s1135-57272008000500003ampscript=sci_arttext 11 httpwwweurosurveillanceorgViewArticleASPxArticleId=19684
Malaria
11
I32 Factores epidemioloacutegicos
La epidemiologiacutea de esta enfermedad depende principalmente de dos
factores
- Primarios
o Hueacutesped o fuente de infeccioacuten hombre portador
o Vector hembras de ciertas especies de mosquito Anopheles
o Susceptibilidad humana este es el factor maacutes variable ya que
depende de factores de inmunidad natural o adquirida factores
geneacuteticos edad (los nintildeos estaacuten maacutes expuestos) migraciones
ocupacioacuten y caracteriacutesticas socioeconoacutemicas
- Secundarios son los que ayudan a la transmisioacuten de la enfermedad como
los factores geograacuteficos (altura sobre el nivel del mar) o climatoloacutegicos
(temperatura humedad atmosfeacuterica o lluvias)
I33 Tipologiacutea de aacutereas endeacutemicas
Seguacuten la proporcioacuten de poblacioacuten que se encuentre afectada las aacutereas donde
la enfermedad estaacute considerada como endeacutemica se dividen en cuatro12
- Aacutereas hipo-endeacutemicas son aquellas donde la malaria afecta a menos del
10 de la poblacioacuten
- Aacutereas meso-endeacutemicas aquellas donde la poblacioacuten afectada estaacute entre el
11 y el 50
- Aacutereas hiper-endeacutemicas son las aacutereas donde el porcentaje de poblacioacuten
afectada estaacute entre el 51 y el 75
- Aacutereas holo-endeacutemicas aquellas donde maacutes del 75 de la poblacioacuten es
portadora de la enfermedad Estas aacutereas estaacuten asociadas a malaria latente
Las hiper y holo-endeacutemicas se caracterizan por alta mortalidad infantil y
juvenil pero los adultos suelen ser asintomaacuteticos por la inmunidad especiacutefica
que generan algunos humanos al sufrir maacutes de una picadura por mosquito
infectado al diacutea
12httpwwwmonografiascomtrabajos77paludismo-enfermedad-tercer-mundopaludismo-enfermedad-tercer-mundo2shtml
Malaria
12
I34 Zonas endeacutemicas e inmunidad
El ciclo de vida del paraacutesito es complejo e involucra distintos medios lo que
demuestra su capacidad para entrar y salir de diferentes ceacutelulas tanto del
hueacutesped como del vector Para ello el paraacutesito debe cambiar su forma la
constitucioacuten y el modo de presentacioacuten de sus proteiacutenas y receptores asiacute se
pone de manifiesto que su respuesta inmune a los tratamientos es muy
compleja A su vez la respuesta inmune del hueacutesped debe generar respuestas
especiacuteficas para las diferentes formas del paraacutesito lo que se denomina
Inmunidad adaptada
Los tipos de inmunidad consideradas para la enfermedad son tres
- Natural ciertos grupos de poblacioacuten poseen alguacuten grado de resistencia
conferida por factores geneacuteticos como la deficiencia de la G6PDH que
confiere resistencia al paraacutesito o la mutacioacuten Hemoglobina E (Hb E la
mutacioacuten del gen que codifica la cadena β-globina que compone la Hb
tambieacuten conocido como talasemia) Hb S (anemia drepanociacutetica) o Hb
fetal
- Adquirida con este tipo de infeccioacuten se produce premunicioacuten13 Se da en
personas de exposicioacuten prolongada como los habitantes de zonas holo-
endeacutemicas El problema estaacute en que la inmunidad adquirida es una
inmunidad parcial y relativa y no garantiza la inmunidad esterilizante
Es una inmunidad especiacutefica a un lugar determinado que en muchos
casos se pierde tras el cambio de haacutebitat a zonas donde la malaria no es
endeacutemica Esto conlleva que el individuo sea vulnerable si vuelve
posteriormente a zonas endeacutemicas
- Pasiva es la que suele relacionarse con el embarazo La conferida por la
madre al feto en muchos lugares donde la enfermedad es endeacutemica
13 (Edm Sergent L Parrot y A Donatien 1924) (Del latiacuten prae antes y munire fortificar) Sinoacutenimo inmunidad de infeccioacuten o de sobreinfeccioacuten (R Debreacute y Bonnet 1927) inmunidad no esterilizante inmunidad relativa (Pasteur 1881 Plehn 1901 von Wasielewski 1901-1908) inmunidad parcial (J Bordet 1920) inmunidad- tolerancia premunidad (Ch Nicolle) laquoEstado de resistencia a toda sobreinfeccioacuten de un organismo ya infectado La premunicioacuten que es simultaacutenea a la infeccioacuten y cesa con ella es conferida por diversas enfermedades infecciosas croacutenicas (paludismo piroplasmosis tuberculosis siacutefilis brucelosis etc) Se opone a la inmunidad verdadera que caracteriza la resistencia del organismo curado a toda reinfeccioacuten es generalmente durable y consecutiva a ciertas infecciones agudas (sarampioacuten escarlatina viruela carbunco fiebre tifoidea etc)raquo (Edm Sergent)
IIII MMAALLAARRIIAA YY PPLLAASSMMOODDIIUUMM
Malaria y Plasmodium
15
II1 El Plasmodium
El Plasmodium es un protozoo eucariota unicelular esporozoario que se
caracteriza por un estilo de vida intracelular obligado con orgaacutenulos
especializados en las diferentes funciones vitales La proliferacioacuten se produce
por invasioacuten celular crecimiento y divisioacuten celular hasta que las reacuteplicas
destruyen la ceacutelula hueacutesped Ademaacutes es el miembro maacutes importante de los
Apicomplexa grupo de clasificacioacuten al que pertenecen tambieacuten otros paraacutesitos
como el toxoplasma o el criptosporium De las 175 especies de Plasmodium son 4
especies las que pueden infectar a humanos P vivax P ovale P falciparum y P
malariae Las tres primeras son las que afectan en mayor grado al hombre
siendo el P falciparum el maacutes violento y resistente Existe una quinta P
knowlesi que afecta maacutes a los grandes simios pero desde hace pocos antildeos se ha
registrado alguacuten caso de infeccioacuten humana por este tipo de paraacutesitos (Figtree et
alts 2010)
El paludismo es causado por paraacutesitos del geacutenero Plasmodium que se
transmiten al ser humano por la picadura de mosquitos infectados de las 20
especies del geacutenero Anopheles los llamados vectores del paludismo que pican
sobre todo entre el anochecer y el amanecer en zonas con climas tropicales
II11 Caracteriacutesticas morfoloacutegicas
El Plasmodium es un protozoo con orgaacutenulos especializados suspendidos en el
citoplasma que se encargan de sus diferentes necesidades como movimiento
invasioacuten celular penetracioacuten de membranas celulares expulsioacuten enzimas
eliminacioacuten de metabolitos o nutricioacuten por fagocitosis
Los trofozoiacutetos son las formas vegetativas moacuteviles que constan de membrana
citoplasma y nuacutecleo La membrana limita el contorno celular protege y permite
el intercambio de sustancias Aquiacute se produce el metabolismo de fosfoliacutepidos y
el mecanismo de transporte de protones y sodio El citoplasma es un sistema
coloidal que representa el cuerpo donde se desarrollan funciones como siacutentesis
de folatos y glicoacutelisis ademaacutes de biosiacutentesis de nucleoacutetidos necesarios para la
reproduccioacuten El nuacutecleo eucarionte contiene el ARN y ADN del paraacutesito
Malaria y Plasmodium
16
II12 Mecanismo de movilidad
Una de las principales caracteriacutesticas del paraacutesito es que no tiene sistema de
locomocioacuten (cilios ni flagelos) su movilidad se produce por deslizamiento Se
ha estudiado (Casanova Morales 2010) que la membrana del paraacutesito tiene dos
dimensiones citoesqueleto y submembrana El movimiento se produce gracias
al citoesqueleto en concreto al sistema actina-miosina que actuacutea como motor
molecular La miosina se transporta a lo largo de los filamentos de la actina con
la energiacutea obtenida de la hidroacutelisis de ATP e interacciona con las adhesinas
transmembrana de la superficie de la ceacutelula hueacutesped Por medio de una
trayectoria helicoidal generada con estas interacciones se produce el
desplazamiento
II13 Mecanismo de invasioacuten celular
Uno de los organelos funcionales maacutes caracteriacutesticos es el orgaacutenulo o
complejo apical que se localiza en un extremo del paraacutesito y estaacute involucrado en
la interaccioacuten hueacutesped paraacutesito durante la invasioacuten celular Su funcioacuten se
relaciona con la adherencia y perforacioacuten de membrana eritrociacutetica ya que
excreta una sustancia que facilita la penetracioacuten celular imprescindible para la
supervivencia del paraacutesito Este orgaacutenulo estaacute presente en las formas
esporozoiacuteto merozoiacuteto y ookinete
La invasioacuten de un eritrocito induce un proceso controlado y transitorio de
rotura de la membrana y reorganizacioacuten de la ceacutelula Es un proceso complicado
(Gratzer y Dluzewski 1993) que conlleva un contacto inicial reorientacioacuten y
deformacioacuten del eritrocito unioacuten de formacioacuten y entrada del paraacutesito Las
interacciones con el eritrocito se piensa que son al azar y que son interacciones
reversibles entre proteiacutenas de superficie del paraacutesito y del gloacutebulo rojo
Son muchas las proteiacutenas implicadas en estos procesos como la proteiacutena de
superficie del merozoiacuteto 1 (MSP-1) que participa directamente en el paso de
invasioacuten y es una de las dianas terapeacuteuticas planteadas actualmente Otra
proteiacutena diana es la proteiacutena circumsporozoiacuteto (CSP) que estaacute implicada en los
procesos de reorientacioacuten del complejo apical En la invasioacuten se producen
cambios en la composicioacuten lipiacutedica de la membrana El paraacutesito una vez
realizada la invasioacuten exporta proteiacutenas como la proteiacutena de membrana epitelial
(EMP) a la membrana eritrociacutetrica que evita que se produzca la depuracioacuten de
los eritrocitos infectados en el bazo Durante la invasioacuten de la membrana
Malaria y Plasmodium
17
diferentes orgaacutenulos del paraacutesito van introducieacutendose en el eritrocito y
producen la unioacuten con la ceacutelula hueacutesped
II14 Metabolismo para el crecimiento
La caracteriacutestica principal del paraacutesito es la dependencia total del hueacutesped
para la supervivencia Como consecuencia de la invasioacuten aumenta la tasa
metaboacutelica de los eritrocitos infectados con cambios en la permeabilidad de
membrana que permiten por fagocitosis el ingreso de solutos necesarios para el
desarrollo del Plasmodium Este cambio de permeabilidad da preferencia al paso
de aniones y solutos como monosacaacuteridos aminoaacutecidos nucleoacutesidos lactato
acido pantoteacutenico y amonio cuaternario La composicioacuten ioacutenica del paraacutesito
depende del proceso de transporte a traveacutes de tres membranas la membrana
plasmaacutetica del eritrocito la vacuola digestiva y la membrana digestiva del
paraacutesito
Las alteraciones proteicas de la membrana intervienen en el transporte de
nutrientes y productos de desecho ademaacutes de evitar la accioacuten del sistema
inmune del hueacutesped Mediante endocitosis el Plasmodium retiene porciones del
citoplasma del eritrocito dentro de vesiacuteculas que se fusionan con la vacuola
digestiva El paraacutesito tiene mitocondria pero carece de ciclo de aacutecido ciacutetrico
funcional por lo que se piensa que es totalmente dependiente de la glucoacutelisis
para su abastecimiento energeacutetico (Dario Mendez 2010) Durante el periodo de
maduracioacuten del paraacutesito se produce un aumento en el uso de glucosa y la
produccioacuten de aacutecido laacutectico en la ceacutelula hueacutesped en detrimento de la capacidad
de la ceacutelula de sintetizar macromoleacuteculas Para su crecimiento y replicacioacuten en
el eritrocito requiere purinas y pirimidinas Las purinas provenientes del
eritrocito son recicladas por el propio paraacutesito para su uso En cambio las
pirimidinas han de ser sintetizadas a partir de sustancias como carbonatos o
adenosiacuten trifosfato (ATP) y mediante la accioacuten de enzimas como dihidrofolato
reductasa o dihidrooroato dihidrogenasa (DHOD) que se convierten asiacute en
dianas terapeacuteuticas La atovaquona es un ejemplo de inhibidor de la DHOD
En la vacuola digestiva del paraacutesito se producen enzimas digestivas y
residuos que se eliminan a traveacutes de la membrana celular Dentro de los
gloacutebulos rojos los paraacutesitos se alimentan de la Hb En primer lugar se produce
la endocitosis de la moleacutecula hasta la vacuola digestiva donde las
endopeptidasas cisteiacutenicas y aspaacuterticas continuacutean con la degradacioacuten de la Hb
Malaria y Plasmodium
18
hasta pequentildeos aminoaacutecidos que el paraacutesito requiere para sus muacuteltiples
funciones de desarrollo En la ruptura celular se produce la liberacioacuten de los
residuos generados durante los diferentes procesos del metabolismo de
nutrientes Algunos siacutentomas de la enfermedad se ocasionan por esta liberacioacuten
En todos estos procesos de cambio de permeabilidad celular necesarios para
la supervivencia del paraacutesito el pH juega un papel fundamental El Plasmodium
desarrolla diferentes sistemas de control y autorregulacioacuten que estaacuten siendo
estudiados y propuestos como diana terapeacuteutica (Loacutepez y Segura 2008)
II2 Ciclo de la malaria
II21 Ciclo de vida del paraacutesito
Para referirnos al ciclo de la enfermedad hablaremos en todo momento del
ciclo de vida del paraacutesito (Figura 5) El Plasmodium falciparum es un organismo
eucariota que cuenta con 14 cromosomas y es transmitido como hemos
comentado al comienzo por los mosquitos Anopheles hembra Pero no son los
mosquitos los que tienen el paraacutesito inicialmente ya que en la picadura a un ser
humano infectado adquieren los paraacutesitos presentes en las sangre (en forma de
gametocitos) dando comienzo la fase Esporogoacutenica (fase sexual) del ciclo de
vida del paraacutesito en el mosquito
En esta sangre infectada hay microgametocitos (macho) y macrogametocitos
(hembra) Los gametocitos macho fertilizan a los hembra formando un cigoto
que recibe el nombre de ookinete el cual penetra en la pared celular de los
mosquitos para desarrollarse hasta formar un oocito Los oocitos desarrollados
se almacenan en sus glaacutendulas salivares Es ahiacute donde estaacuten listos para infectar
a otro humano con su picadura liberando esporozoiacutetos a traveacutes de la saliva
Esta fase esporogoacutenica se da a gran velocidad y se completa en dos semanas si
las condiciones son las idoacuteneas Queda claro de esta forma que el mosquito es el
vector que transporta la enfermedad y los humanos son los hueacutespedes
En este punto la enfermedad se desarrolla en el hombre por medio de dos
viacuteas Exo-eritrociacutetica (hepaacutetica) y Endo-eritrociacutetica La viacutea exo-eritrociacutetica es la
fase del ciclo de vida del paraacutesito que comienza en el momento que el mosquito
infectado pica a un humano y transfiere en la saliva ademaacutes de los esporozoiacutetos
del paraacutesito otros compuestos anti hemostaacuteticos y vasodilatadores al torrente
sanguiacuteneo humano
Malaria y Plasmodium
19
Los esporozoiacutetos son formas alargadas que miden
11 microm de ancho por 1 microm de largo con extremidades
afiladas (Figura 3) Se mueven por deslizamiento y
poseen una gruesa membrana cuya extremidad
anterior se transforma en una caacutepsula apical provista
de anillos polares y de un conoide que favorece la
penetracioacuten celular
Figura 3 Imagen de un esporozoiacuteto14
En treinta minutos los esporozoiacutetos llegan al hiacutegado humano e infectan los
hepatocitos Asiacute durante un periodo de 6 a 15 diacuteas se van a multiplicar
asexualmente (en este periodo de latencia de la enfermedad se llaman
hipnozoiacutetos) Estos daraacuten lugar a miles de merozoiacutetos que rompen las ceacutelulas
hepaacuteticas e para invadir el torrente sanguiacuteneo
En la viacutea endo-eritrociacutetrica los merozoiacutetos del torrente sanguiacuteneo invaden
los eritrocitos (gloacutebulos rojos o hematiacutees) para convertirse en trofozoiacutetos
(formas paraeritrociacuteticas Figura 4) Esta forma madura
y se multiplica asexualmente para formar los
esquizontes Estos a su vez se rompen liberando de
nuevo merozoiacutetos (en su forma endo-eritrociacutetica) que
repetiraacuten el ciclo de los hematiacutees Es la formacioacuten de
los esquizontes la que causaraacute la aparicioacuten de los
siacutentomas cliacutenicos A la vez que esto ocurre unos pocos
merozoiacutetos sufren gametocitogeacutenesis dando lugar a los
gametocitos que infectaraacuten nuevos mosquitos
Figura 4 Imagen de trofozoiacutetos15
En el caso de Plasmodium vivax y ovale se producen hipnozoiacutetos en la fase exo-
eritrociacutetica que permanecen en estado latente y durante un periodo de hasta
tres antildeos sin manifestarse siacutentomas En liacuteneas generales la duracioacuten del ciclo
eritrociacutetico del P ovale es de 50 horas el de P malarie de 72 horas y el de P vivax
y falciparum de 48 horas
14 Disponible en wwwfabaorg 15 Disponible en wwwdfarmaciacom
Malaria y Plasmodium
20
Figura 5 Ciclo de vida completo del plasmodio El mosquito Anopheles infectado en su picadura transmite los
esporocitos del parasito Plasmodio Esporocitos infectan ceacutelulas hepaacuteticas que maduran hasta esquizontes y
que liberaran despueacutes merozoitos Fase exo-eritrociacutetica y fase endo-eritrociacutetica Los merozoitos infectan los
hematiacutees Los trofozoiacutetos maduros daraacuten esquizontes que se rompen para dar maacutes merozoitos Algunos
merozoitos pasan a ser nuevos gametocitos Los gametocitos sexuados son ingeridos por el mosquito La Fase
esporogoacutenica Microgametos y macrogametos forman cigotos que evolucionan hasta ookinete Estos a su vez se
desarrollan hasta Los oocitos se rompen dando esporocitos que se almacenan en las glaacutendulas salivares del mosquito
esperando a ser inoculadas a otro humano 16
II22 Desarrollo de los esquizontes
Los merozoiacutetos provenientes de las ceacutelulas hepaacuteticas viajan al torrente
sanguiacuteneo para infectar a los eritrocitos que contienen la Hb En concreto es la
degradacioacuten de la Hb el factor fundamental para el desarrollo de los
esquizontes ya que este proceso conlleva la obtencioacuten de ldquonutrientesrdquo como
aminoaacutecidos esenciales para el desarrollo de las nuevas formas del paraacutesito En
el citoplasma de los eritrocitos se encuentra la Hb que es ingerida por
endocitosis al citostoma del paraacutesito y comprimida en vesiacuteculas transportadoras
que la conducen hasta las vacuolas digestivas del merozoiacuteto (Figura 6)
16 Citado de wwwdpdcdcgovdpdxHTMLMalariahtm
Malaria y Plasmodium
21
Figura 6 Transporte de membrana de la Hb a la vacuola del merozoiacuteto
Una vez dentro de la vacuola comienza su digestioacuten o degradacioacuten en un
proceso en el que intervienen varias proteasas y peptidasas que generan
diferentes subproductos Del conocimiento de estas enzimas surgen las
muacuteltiples dianas terapeacuteuticas para combatir este proceso y por tanto la
enfermedad ya que el proceso es clave para la supervivencia del paraacutesito Una
vez que la moleacutecula de Hb es introducida en la vacuola digestiva se produce la
ruptura de la estructura (Figura 7) en porcioacuten proteica la globina y en el
producto de degradacioacuten el grupo hemo La globina a su vez se degrada por
medio de peptidasas especiacuteficas (cisteiacutenas y aspartatos) que generan peacuteptidos
maacutes pequentildeos que seraacuten transportados en forma de aminoaacutecidos (los α-Aa) al
citoplasma del paraacutesito (citosol del merozoiacuteto)
Figura 7 Proceso de digestioacuten de la Hb en la vacuola digestiva del paraacutesito
Otro producto de dicha reaccioacuten de degradacioacuten es el grupo hemo libre que
se oxida hasta formar hematina (Figura 8) compuesto muy toacutexico debido a que
puede generar especies reactivas de oxiacutegeno como peroacutexido de hidroacutegeno
(H2O2) radicales superoacutexido y radicales hidroxilo Estos radicales son
mediadores directos de ciertos procesos bioquiacutemicos que ocasionan la ruptura
Malaria y Plasmodium
22
celular y en uacuteltima instancia la muerte del paraacutesito De este modo la siguiente
reaccioacuten es el proceso de detoxificacioacuten de dicho compuesto Esta reaccioacuten
consiste en una biomineralizacioacuten o biocristalizacioacuten donde la hematina
cristaliza como diacutemero cristalino llamado β-hematina (la unioacuten por puentes de
hidroacutegeno de los cristales recibe el nombre de hemozoiacutena) que no es toacutexica para
el paraacutesito
Figura 8 Compuestos obtenidos en la degradacioacuten de la Hb
Para el final del estado trofozoiacutetico del ciclo han sido consumidas muchas
unidades de Hb
II3 Especies de Plasmodium
Son muchas las variables de las que depende el desarrollo de la enfermedad
comenzando por la especie de paraacutesito que infecta
Plasmodium vivax esta especie estaacute presente en casi todas las zonas donde el
paludismo es endeacutemico y su aacuterea de distribucioacuten se extiende
principalmente en Ameacuterica Central y la India La duracioacuten de su ciclo exo-
eritrociacutetico variacutea seguacuten la cepa desde 20 diacuteas a 9 meses Los paraacutesitos
pueden permanecer en el hiacutegado en estado latente maacutes de 2 antildeos y ser
responsable de recaiacuteda La parasitemia raramente excede de 2 paraacutesitos en
100 gloacutebulos rojos y el proceso de formacioacuten de esquizontes dura 48 horas
P vivax parasita sobre todo los hematiacutees joacutevenes (reticulocitos) el hematiacutee
parasitado es maacutes grande que los hematiacutees normales y contiene numerosos
graacutenulos de Schuumlffner que resultan de la degradacioacuten de la Hb y le dan un
aspecto punteado Las formas endo-eritrociacuteticas son grandes (llegan a
ocupar hasta 23 partes del eritrocito) y estaacuten provistas de movimientos
ameboides vivaces (de ahiacute el nombre vivax) los esquizontes presentan
Malaria y Plasmodium
23
hasta 16 merozoiacutetos los gametocitos son redondos frecuentemente
exceacutentricos y con pigmento abundante
Figura 9 Formas endo-eritrociacuteticas del P vivax17
Plasmodium ovale es muy proacuteximo a P vivax con el cual fue confundido por
mucho tiempo Su incubacioacuten variacutea de 15 diacuteas a varios meses P ovale
parasita los hematiacutees joacutevenes el
hematiacutee parasitado es de talla grande
ovalado (es el porqueacute del nombre
ovale) sus bordes estaacuten recortados y
contiene tempranamente numerosos
graacutenulos de Schuumlffner El poli-
parasitismo es posible Los trofozoiacutetos
son ovalados los esquizontes son
irregulares y tienen de 8 hasta 16
merozoiacutetos
Figura 10 Formas endo-eritrociacuteticas del P ovale
Plasmodium malariae es menos frecuente que P vivax o P falciparum y se
encuentra principalmente en zonas como Aacutefrica subsahariana o sudeste
asiaacutetico Su incubacioacuten dura alrededor de 3 a 4 semanas Puede permanecer
en estado latente hasta 20 antildeos El ciclo de maduracioacuten eritrociacutetica dura 72
horas Parasita los hematiacutees viejos (1 a 2) los que son de tamantildeo normal o
retractado y monocromaacutetico Morfoloacutegicamente P malariae estaacute
caracterizado por la disposicioacuten en banda cuadrilaacutetera o ecuatorial de los
17 Imaacutegenes extraiacuteda de wwwgefor4tcom
Malaria y Plasmodium
24
trofozoiacutetos con esquizontes que presentan 8 merozoiacutetos y con gametocitos
semejantes a los de P vivax pero maacutes pequentildeos
Figura 11 Formas endo-eritrociacuteticas del P malariae
Plasmodium falciparum es la especie maacutes temible y mortal Se encuentra en
las regiones tropicales y subtropicales de Aacutefrica en Nueva Guinea y Haitiacute
El desarrollo de su ciclo en el mosquito necesita una temperatura superior a
los 18 degC a esto se debe su ausencia en las montantildeas tropicales y en las
regiones templadas Su ciclo exo-eritrociacutetico es el periodo maacutes corto dura
solamente de 7 a 15 diacuteas de promedio La longevidad del paraacutesito no pasa
habitualmente de 2 meses aunque puede llegar a un antildeo P falciparum
parasita todos los hematiacutees por esto maacutes del 10 de los gloacutebulos rojos
pueden ser parasitados En el frotis de sangre se observa la presencia
uniforme de trofozoiacutetos anulares (los esquizontes se encuentran en
capilares profundos y presentan hasta 16 merozoiacutetos) el poliparasitismo de
un gloacutebulo rojo es frecuente Los gametocitos tienen la forma de banana o
pequentildea hoz (del latino falx falcis) a esto se debe el nombre de esta especie
Figura 12 Formas endo-eritrociacuteticas del P falciparum
Malaria y Plasmodium
25
II4 Sintomatologiacutea
La infeccioacuten por malaria se puede confundir faacutecilmente con un catarro o gripe
comuacuten ya que como se describe en apartados anteriores es el desarrollo de los
esquizontes y la posterior ruptura de los hematiacutees (Figura 13) para seguir
infectando hematiacutees sanos lo que causa la aparicioacuten de sintomatologiacutea cliacutenica
Aunque en la liberacioacuten de nuevos merozoiacutetos tambieacuten se produce la liberacioacuten
de otras sustancias que producen la
sintomatologiacutea caracteriacutestica como los dolores
musculares dolor de cabeza naacuteuseas y voacutemitos
fiebres sudoraciones secuenciales y escalofriacuteos
La sintomatologiacutea observada en la infeccioacuten por
Plasmodium variacutea seguacuten el tipo de malaria que
desarrolla el enfermo
Figura 13 Ruptura de los Eritrocitos infectados18
En Malaria no complicada los siacutentomas caracteriacutesticos son acceso malaacuterico
anemia19 esplenomegalia20 (por la funcioacuten de limpieza de la sangre de
geacutermenes e impurezas por fagocitosis y la produccioacuten de linfocitos la funcioacuten
inmune produce este marcador interno de la infeccioacuten) y en ocasiones
ictericia21 Los picos de fiebre se correlacionan con altos niveles seacutericos de TNF-
α por la liberacioacuten de proteiacutenas del paraacutesito en la ruptura de los eritrocitos que
crea la anemia Ademaacutes de esto se asocia una creacioacuten de anticuerpos contra los
hematiacutees diseritropoyesis22 y secuestro espleacutenico23
18 Imagen extraida de wwwimmuninforu 19 Patologiacutea general Empobrecimiento de la sangre por disminucioacuten de su cantidad total o cantidad de hemoglobina [a(n)- ἀ-ἀν- gr no + -haimiacuteā -αιμία gr sangre] httpDicciomedeusales 20 Patolgiacutea general Aumento de volumen o hipertrofia del bazo[ splēn(o)- σπλή-ν-νός gr bazo + -megalia μεγαλ-ία gr cient tamantildeo excesivo] httpDicciomedeusales 21 Patologiacutea digestiva y hepatoloacutegica Enfermedad producida por acumulacioacuten de pigmentos biliares en la sangre cuya sentildeal exterior maacutes visibles es la amarillez de la piel y las conjuntivas [ikter(o)- ἴκτερος gr ictericia (amarillo) + -ik-os-ik-ē gr + -ia(m) lat cualidad] httpDicciomedeusales 22 (Del griego an- privacioacuten y haima sangre) Sinoacutenimo OLIGOHEMIA ESPANEMIA Empobrecimiento de la sangre caracterizado por la disminucioacuten de uno de varios o de todos sus elementos (anemia total anemias parciales) Esta palabra se aplica generalmente cuando se emplea sin epiacuteteto a una anemia parcial caracterizada por la disminucioacuten del nuacutemero de gloacutebulos rojos o maacutes exactamente por la disminucioacuten de la cantidad de hemoglobina contenida en la unidad de volumen de sangre no estando aumentado el volumen plasmaacutetico (Jean Bernard) Se emplea tambieacuten para designar el estado del organismo privado de sangre y desde este punto de vista la anemia puede ser general o local Se dice que la anemia es hemotiacutesica cuando obedece a la destruccioacuten exagerada de los hematiacutees y mielotiacutesica cuando resulta de la detencioacuten de su formacioacuten por insuficiencia del tejido mieloide (Pappenheim) wwwportalesmedicoscom
Malaria y Plasmodium
26
En Malaria croacutenica se produce esplenomegalia y hepatomegalia24 asiacute como
accesos febriles irregulares y de baja intensidad La piel se torna amarillo-
terrosa se producen palpitaciones somnolencia y fatiga Una caracteriacutestica muy
comuacuten es la baja parasitemia que presentan los pacientes
En el embarazo la malaria produce alta mortalidad materna por anemia
partos prematuros por insuficiencia cardiacuteaca palpitaciones mareos y disnea25
Esto repercute en el bebeacute de forma que producen muertes neonatales y dantildeos
cerebrales
La Malaria severa es producida por Plasmodium falciparum que ocasiona
disfuncioacuten de oacuterganos vitales altas parasitemias imposibilidad de tratamiento
por viacutea oral y hemoacutelisis intravascular
Los casos maacutes graves son los de Malaria cerebral Los nintildeos son el grupo maacutes
susceptible de contraer este tipo de malaria Los hematiacutees infectados se tornan
maacutes adhesivos y se pegan a las paredes de los vasos capilares entre otros a los
del cerebro Se produce anemia grave fallos renales y pulmonares agudos
convulsiones trastornos de movilidad y neuroloacutegicos El paciente entra en
coma pudiendo fallecer en 24 horas Si se logra un retorno del coma los dantildeos
cerebrales residuales son permanentes
II5 Deteccioacuten y diagnoacutestico
Es relativamente sencillo diagnosticar malaria pero lo realmente complicado
y uacutetil es el diagnostico concreto del tipo de malaria Ejemplo de ello es que una
caracteriacutestica de la infeccioacuten por P falciparum es la alta parasitemia donde
hasta 3 trofozoiacutetos se encuentran invadiendo un eritrocito o la aparicioacuten de
gametocitos con forma alargada que no se da en otros tipos de plasmodio
El diagnoacutestico de la malaria se realiza basaacutendose en una serie de criterios
cliacutenicos epidemioloacutegicos y de laboratorio que con una adecuada anamnesis y
examen fiacutesico pueden orientar con alto grado de certeza sobre el tipo de malaria
23 Un gran nuacutemero de ceacutelulas falciformes quedan atrapadas en el bazo y producen su agrandamiento repentino Los siacutentomas pueden incluir debilidad repentina palidez en los labios respiracioacuten raacutepida sed extrema dolor abdominal (del estoacutemago) o en el costado izquierdo del cuerpo y palpitaciones raacutepidas wwwcdcgov 24 Patologiacutea digestiva y hepatoloacutegica Aumento de volumen o hipertrofia del hiacutegado [hēpat(o)- ἧπα-ρ-τος
gr hiacutegado + -megalia μεγαλ-ία gr cient tamantildeo excesivo] httpDicciomedeusales 25 Patologiacutea neumoloacutegica dificultad para respirar [dys- δυσ- gr dificultad + -pnoi(a) -πνοια gr respiracioacuten] httpDicciomedeusales
Malaria y Plasmodium
27
contraiacuteda Las pruebas maacutes concluyentes son la visualizacioacuten del paraacutesito o
deteccioacuten de antiacutegenos en pruebas raacutepidas
Criterios cliacutenicos Se tendraacuten en cuenta tanto episodios malaacutericos anteriores
del paciente como fiebres actuales o recientes (en menos de un mes) escalofriacuteos
intensos sudoracioacuten profusa naacuteuseas y voacutemitos mialgias siacutentomas
gastrointestinales anemia o esplenomegalia
Criterios epidemioloacutegicos El estudio de antecedentes aporta mucha
informacioacuten para el diagnoacutestico Antecedentes como los de exposicioacuten en los
uacuteltimos quince diacuteas en aacutereas de transmisioacuten activas antecedentes hospitalarios
transfusioacuten sanguiacutenea de medicacioacuten antimalaacuterica o relacioacuten con personas que
hayan sufrido malaria
Criterios de laboratorio La forma maacutes sencilla de detectar la enfermedad
incluyendo casos donde todaviacutea estaacute en estado latente es el Meacutetodo de la Gota
gruesa La toma de muestra se realiza mediante la puncioacuten con una lanceta
esteacuteril normalmente en la yema del dedo Se recogen 3 oacute 4 gotas sobre un
portaobjetos y con la esquina de otro se unen en movimientos raacutepidos
extendieacutendose hasta formar una capa gruesa y uniforme Se usa para la
determinacioacuten de la parasitemia y tiene una sensibilidad del 80 y 100 de
especificidad
Se mide mediante la ecuacioacuten
(Nordm paraacutesitos x 8000) Parasitemia (paraacutesitosμL) =
200 eritrocitos (hematiacutees)
La gota gruesa permite analizar una mayor cantidad
de sangre facilitando la deteccioacuten de parasitemias
bajas menores del 1 (Figura 14) y un ahorro de
tiempo en el examen aunque al romperse los
eritrocitos resulta difiacutecil la identificacioacuten de especie
Figura 14 Vista al microscopio de los eritrocitos26
26 Disponible en
httpdpdcdcgovdpdxhtmlFramesMRMalariaovalebody_malariadfovaringhtm
Malaria y Plasmodium
28
Es una prueba sencilla y poco costosa que muestra los casos positivos En
zonas de alta trasmisioacuten esta prueba no es determinante ya que la deteccioacuten de
paraacutesitos en sangre no significa que la posible fiebre que presente una persona
sea por malaria
Como se ha indicado antes es importante la determinacioacuten de la especie de
Plasmodium y se consigue tambieacuten de una manera sencilla con el Meacutetodo de
frotis donde la muestra se colecta de la misma forma que la gota gruesa pero en
este caso se recoge una gota de sangre en un portaobjetos y con otro se realiza
la extensioacuten en capa fina de la misma El inconveniente para realizar estas dos
teacutecnicas sencillas es que se necesita un laboratorio y personal cualificado no
disponible en muchas de las zonas endeacutemicas
Hay otras teacutecnicas de deteccioacuten maacutes desarrolladas como el sistema QBC
(Quantitative Buffy Coat test) que es un meacutetodo de screening para la deteccioacuten
raacutepida de paraacutesitos en sangre centrifugada en un microcapilar Es un meacutetodo
gravimeacutetrico que usa la fluorescencia para la determinacioacuten Aunque es un
meacutetodo raacutepido son necesarias infraestructuras y es difiacutecil distinguir la especie
Existen tambieacuten otros meacutetodos basados en teacutecnicas inmunocromatograacuteficas
en la deteccioacuten de antiacutegenos parasitarios La HRP-2 y la LDH son proteiacutenas
secretadas por el paraacutesito y por tanto indicadoras de su presencia Son pruebas
raacutepidas y no precisan microscopio Tambieacuten son faacuteciles de interpretar ya que
son test en tiras o tarjetas donde se pone una muestra de sangre y se revelan
Son usados como examen de autodiagnoacutestico y en lugares donde no hay
laboratorios como examen preliminar El problema es que dan falsos negativos
y no es un meacutetodo cuantitativo del grado de infeccioacuten
Por uacuteltimo las teacutecnicas de biologiacutea molecular usadas en casos de baja
parasitemia infecciones mixtas o mutaciones entre otras Aunque presentan
muchas ventajas son teacutecnicas laboriosas caras y poco accesibles ya que se
necesitan medios y personal muy cualificado
Es por tanto la combinacioacuten de los criterios explicados la forma maacutes
concluyente de diagnosticar que tipo de malaria estaacute afectando a un enfermo
IIIIII PPRREEVVEENNCCIIOacuteOacuteNN YY TTRRAATTAAMMIIEENNTTOO
Prevencioacuten y Tratamiento
31
III1 Medidas preventivas
La malaria es una enfermedad que puede prevenirse desde sus dos frentes
principales el vector mosquito y el hospedador humano Las medidas de
prevencioacuten se centran en objetivos distintos como evitar el desarrollo de la
enfermedad con proteccioacuten individual en aacutereas endeacutemicas erradicacioacuten del
mosquito prevencioacuten de la picadura o desarrollo de medicamentos
profilaacutecticos
En lo que a la lucha antivectorial se refiere el uso de mosquiteras en las
camas ha reducido mucho el caso de nuevos contagios de la enfermedad Es
una medida que a simple vista parece muy sencilla pero que en realidad no lo
es El problema estaacute en que en muchos de los paiacuteses endeacutemicos la pobreza es
elevada y por tanto el coste de las mosquiteras no es asumible por las personas
En otras ocasiones no es el coste de dichas mosquiteras lo que impide la
prevencioacuten sino que las redes son usadas con otros fines prioritarios como la
pesca En la actualidad la OMS recomienda el uso de insecticidas como
piretroides para impregnar las mosquiteras
Otra forma eficaz de reducir raacutepidamente la transmisioacuten del paludismo es la
fumigacioacuten de interiores con insecticidas de accioacuten residual Los mejores
resultados se consiguen cuando se fumiga al menos el 80 de las viviendas de
la zona en cuestioacuten La fumigacioacuten de interiores es eficaz de tres a seis meses
dependiendo del insecticida utilizado y del tipo de superficie sobre la que se
aplica En algunos casos el DDT puede ser eficaz de nueve a doce meses
Actualmente se estaacuten desarrollando insecticidas con accioacuten residual maacutes
prolongada para la fumigacioacuten de interiores Se ha comprobado la eficacia de
insecticidas como el DDT que aunque fue prohibido su uso por su alto grado de
toxicidad en plantas y su efecto acumulativo sigue siendo ampliamente
utilizado en la lucha contra la malaria Tambieacuten se cuenta con la ayuda de los
repelentes para la piel (DEET) o tiras insecticidas Finalmente no se deberiacutea
olvidar como arma vaacutelida y primaria para la lucha la educacioacuten en prevencioacuten
y gestioacuten del medio ambiente
En lo que al factor humano se refiere el uso de medicamentos especiacuteficos en
bajas dosis durante largo tiempo es la forma actual de profilaxis En esta liacutenea
se estaacuten desarrollando vacunas y tratamientos actualmente en el campo de la
genoacutemica
Prevencioacuten y Tratamiento
32
III2 Tratamiento
III21 Historia del tratamiento
La malaria es una de las enfermedades mejor estudiadas de la medicina
occidental hasta mediados del siglo XX a pesar de
que no se haya encontrado solucioacuten para su
erradicacioacuten A principios del siglo XVIII el
primer tratamiento conocido se basoacute en el uso de
la corteza de un aacuterbol originario de Sudameacuterica
la Cinchona (Figura 15) En 1820 se consiguioacute
aislar e identificar la quinina como compuesto
activo
Figura 15 Aacuterbol de la Cinchona pubescens
En 1891 el azul de metileno se usoacute para tratar a dos pacientes enfermos de
malaria Asiacute se convierte este compuesto en el primer ldquomedicamento sinteacuteticordquo
Actualmente se conoce que su mecanismo de accioacuten implica la inhibicioacuten de la
glutatioacuten reductasa y posteriormente la interrupcioacuten de la homeostasis redox
del paraacutesito
En 1925 se desarrolloacute la mepraquina para combatir estadios del P falciparum
en sangre Es un compuesto que pertenece al grupo de derivados de acridina
usados en el sudeste asiaacutetico durante la II Guerra Mundial Ya en 1934 se
sintetizoacute la cloroquina (CQ) aunque no es hasta el antildeo 1946 cuando comienza
su uso porque se consideraba demasiado toacutexica Con esta estructura comienza a
desarrollarse el grupo de las 4-aminoquinolinas Desde entonces ha sido el
antimalaacuterico maacutes utilizado En 1969 la guerra del Vietnam conlleva el uso de la
mefloquina y halofantrina que son aminoalcoholes derivados de la quinina
Sin embargo el antimalaacuterico maacutes antiguo puede ser la artemisina descubierta
en el antildeo 1596 a partir de un compuesto de origen natural de China La
Artemisina Annua es una planta originaria oriental que constaba ya siglos atraacutes
en los manuales de procedimientos para el tratamiento de fiebres Aunque no
fue hasta el antildeo 1972 cuando se consiguioacute aislar e identificar Este compuesto es
utilizado en la actualidad y resulta eficaz y poco toacutexico
Prevencioacuten y Tratamiento
33
III22 Clasificacioacuten de los compuestos antimalaacutericos
A lo largo de la historia se han usado diferentes tratamientos derivados del
desarrollo de nuevas estructuras y del mejor conocimiento de la enfermedad y
del paraacutesito
De este modo las estructuras pueden clasificarse por
Actividad antimalaacuterica
o Hombre
Estados pre-eritrociacuteticos profilaxis eventual pero poco praacutecticos
Hipnoticidas para P vivax y P ovale actuacutean a nivel hepaacutetico
Esquizonticidas en sangre para estados eritrociacuteticos asexuales
o Mosquito
Gametocidas destruccioacuten de las formas eritrociacuteticas de la fase
sexual del mosquito Prevencioacuten de la transmisioacuten
Esporonticidas previene el crecimiento de los oocitos en el
mosquito tambieacuten se usa para prevenir transmisioacuten
Mecanismo de accioacuten
o Accioacuten sobre la vacuola digestiva del Plasmodium accioacuten sobre la
degradacioacuten de la Hb detoxificacioacuten de la hematina (por ejemplo la
CQ)
o Enzimas involucradas en la siacutentesis y metabolismo de
macromoleacuteculas
o Accioacuten sobre procesos de membrana
o Siacutentesis de purinas y pirimidinas
o Glucoacutelisis y siacutentesis de ATP mitocondrial
Forman familias de compuestos con actividades diferentes en muacuteltiples aacutereas
y niveles
Metanolquinolinas y arilaminoalcoholes
La metanolquinolinas y arilaminoalcoholes forman una familia de
compuestos de gran importancia Este grupo engloba desde
estructuras con gran relevancia histoacuterica como la quinina hasta
compuestos como la lumefantrina que se usa en terapias combinadas
en la actualidad
Prevencioacuten y Tratamiento
34
Estas dos familias de compuestos estaacuten relacionadas entre siacute Como
primera correspondencia destacar su gran efectividad como
esquizonticidas sanguiacuteneos Intervienen en la digestioacuten de la Hb en
concreto en la detoxificacioacuten especiacutefica de la hemozoiacutena
Pertenecientes a la familia de metanolquinolinas son la quinina y
quinidina (que son isoacutemeros L y D) y mefloquina (Figura 16)
Figura 16 Estructura de metanolquinolinas
El problema de la quinina y la quinidina es sus efectos adversos sin
embargo siguen siendo ampliamente usados debido a su faacutecil acceso
La mefloquina es muy uacutetil en malarias resistentes pero tiene efectos
neurosiquiaacutetricos adversos
Los arilaminoalcoholes como halofantrina y lumefantrina (Figura
17) son estructuras de gran capacidad esquizonticida siendo el
mecanismo de accioacuten en la mayor parte de ellos la intervencioacuten en los
procesos de degradacioacuten de la Hb
Figura 17 Estructura de arilaminoalcoholes
Estas estructuras actuacutean en los paraacutesitos maacutes maduros pero no tienen
capacidad hipnoticida Se desarrollaron tras la aparicioacuten de
resistencias a la quinina y CQ
Prevencioacuten y Tratamiento
35
Aminoquinolinas
En este grupo se engloban compuestos como la familia de las 4-
aminoquinolinas y las 8-aminoquinolinas Las 4ndashaminoquinolinas
actuacutean en las fases endo-eritrociacuteticas del paraacutesito La gran ventaja de
esta familia es que los compuestos son faacuteciles de sintetizar
econoacutemicos y bien tolerados A este grupo pertenecen compuestos tan
relevantes como la cloroquina efectiva en profilaxis pero que en la
actualidad presenta problemas de resistencias o la amodiaquina que
es mejor que la CQ para eliminar parasitemias aunque es
hepatotoacutexica (Figura 18)
Figura 18 Estructura quiacutemica de la cloroquina y la amodiaquina
Al grupo de las 8-aminoquinolinas pertenecen la pamaquina la
primaquina y la tafenoquina (Figura 19) que son el uacutenico grupo de
gametocidas y tambieacuten son usadas como profilaxis El gran problema
de estos compuestos es su alta toxicidad
Figura 19 Estructuras de 8-aminoquinolinas
Prevencioacuten y Tratamiento
36
Derivados de acridina
Son compuestos de relevancia histoacuterica como la mepraquina
compuesto sucesor y de origen muy similar a la CQ que fue el primer
compuesto sinteacutetico usado cliacutenicamente como esquizonticida La
pironaridina que tambieacuten pertenece a esta familia (estructuralmente
relacionado con la amodiaquina) se usa en casos de malaria por P
falciparum resistente pero tiene baja biodisponibilidad oral y su precio
es elevado (Figura 18)
Figura 18 Estructura de derivados de acridina
Antifolatos e inhibidores de la siacutentesis de folatos
El aacutecido foacutelico obtenido mediante la dieta es convertido por el
paraacutesito en aacutecido tetrahidrofoacutelico necesario para su superviviencia
Los antifolatos inhiben el metabolismo del aacutecido foacutelico actuando como
coenzimas de la siacutentesis de ADN y pirimidinas Estos compuestos
actuacutean sobre los estados de crecimiento del paraacutesito en el hiacutegado y
detienen la reinfeccioacuten del mosquito
Pertenecen a esta familia sulfonamidas como sulfadoxina o sulfonas
como dapsona y compuestos como proguanil y pirimetamina (Figura
19)
Figura 19 Estructura de antifolatos
Prevencioacuten y Tratamiento
37
Antibioacuteticos
Son familias de compuestos que actuacutean a nivel celular y de
genoma Una de sus dianas es la inhibicioacuten de la siacutentesis de
proteiacutenas con funciones metaboacutelicas importantes para la
supervivencia del paraacutesito Este es el caso de la inhibicioacuten de la
funcioacuten del apicoplasto que interviene en la siacutentesis del grupo
hemo o liacutepidos Para ello estaacuten los antibioacuteticos del grupo de
tetraciclinas como la doxiciclina (Vibramycinreg) (Figura 20)
Figura 20 Estructura de la doxiciclina
Artemisinas y terapias combinadas de artemisinas (TCA)
Esta familia proviene del compuesto aislado del la planta Artemisia
Annua La artemisina (Figura 21) se obtiene solo por viacutea natural y el
resto de derivados son semisinteacuteticos El mecanismo de accioacuten es el
mismo que el de las 4-Aminoquinolinas solo que en esta ocasioacuten viacutea
radicales libres
Son compuestos muy activos en malaria y aunque sus tiempos de vida
son cortos ofrecen actividad aguda El punto negativo es que en su
tiempo de accioacuten no son capaces de eliminar toda la parasitemia y son
necesarias terapias combinadas con otros compuestos En la
actualidad se ha detectado la aparicioacuten de resistencias debido al uso
de monoterapias
Figura 21 Estructura de la artemisina
Prevencioacuten y Tratamiento
38
III23 Aparicioacuten de resistencias
La OMS ha definido resistencia como la capacidad de una cepa parasitaria de
sobrevivir yo multiplicarse a pesar de la administracioacuten y absorcioacuten de un
medicamento dada a dosis iguales o mayores que aquellas usualmente
recomendadas pero dentro de los liacutemites de tolerancia del sujeto La resistencia
a los antimalaacutericos es un serio problema desde hace antildeos En 1973 la CQ fue
reemplazada por la combinacioacuten de sulfadoxina + pirimetamina (Fansidarreg)
Pero en 1985 eacutesta tambieacuten se volvioacute inefectiva en algunas cepas de P falciparum
Estaacute demostrado que la resistencia a algunos antimalaacutericos se desarrolla cierto
tiempo despueacutes de la introduccioacuten de los mismos como tratamiento uacutenico
Seguacuten la OMS se describen tres grados de resistencia in vivo a las drogas
antimalaacutericas
- Grado I (bajo grado) recurrencia a los 7 y 28 diacuteas del tratamiento completo
siguiendo a una inicial solucioacuten de los siacutentomas y reduccioacuten de la
parasitemia
- Grado II (grado intermedio) reduccioacuten de la parasitemia asexuada en maacutes
de un 75 dentro de las 48 h del tratamiento pero con aumento a los siete
diacuteas
- Grado III (alto grado) el nivel de la parasitemia asexuada no cae en maacutes del
75 dentro de las 48 h despueacutes del tratamiento
En la actualidad uno de los compuestos maacutes utilizados es la quinina que a
pesar de los efectos adversos que tiene es uno de los compuestos maacutes accesibles
en los paiacuteses pobres lo que facilita su uso actual Tambieacuten la artemisina y sus
derivados son ampliamente utilizados ya que estudios recientes demuestran la
gran capacidad antiplasmoacutedica Pero en su contra estaacute la baja vida del
compuesto la parasitemia residual y la aparicioacuten de resistencias Ademaacutes de
estos puntos negativos se une el hecho de que la uacutenica viacutea de obtencioacuten de este
compuesto es por medio natural no es viable su obtencioacuten por siacutentesis quiacutemica
lo que conlleva encarecimiento del producto por su limitada accesibilidad
Estudios actuales han conseguido explicar el origen de alguna de estas
resistencias La CQ es un compuesto que accede a la vacuola digestiva del
paraacutesito para interferir en la detoxificacioacuten de la hemozoiacutena El pH de la
vacuola estaacute en torno a 5 lo que produce una protonacioacuten de la CQ hasta su
forma diproacutetica (CQH2+2) En esta forma protonada la QC queda atrapada
Prevencioacuten y Tratamiento
39
dentro de la vacuola porque no se puede difundir y es asiacute como produce su
accioacuten
El Plasmodium falciparum que ha desarrollado resistencia a la CQ se caracteriza
por la proteiacutena PfCRT (Plasmodium Falciparum Chloroquine Resistance
Transporter) modificada Esta proteiacutena adopta la funcioacuten de unirse a la CQ para
realizar su transporte fuera de la vacuola evitando asiacute la acumulacioacuten y la
realizacioacuten de la funcioacuten del faacutermaco Los primeros estudios realizados en este
tema (Fidock DA et alts 2000) mostraron los primeros datos sobre la relacioacuten
entre las mutaciones el pH de la vacuola digestiva y las concentraciones del
faacutermaco dentro de la vacuola digestiva En un principio se pensoacute que las
mutaciones en los genes del Plasmodium provocaban la acidificacioacuten del medio
interior de la vacuola digestiva alterando la concentracioacuten del faacutermaco o
reduciendo la fijacioacuten a la hematina
Estudios posteriores (Martin R et alts 2009) han llegado a concretar el
mecanismo por el cual se producen resistencias a la CQ La mutacioacuten que le
confiere resistencia a la CQ es el cambio de una lisina (K) por una treonina (T)
en la posicioacuten 76 de la serie de aminoaacutecidos Esta mutacioacuten K76T se da en la
regioacuten de la proteiacutena que se cree involucrada en la unioacuten con la moleacutecula Estaacute
siendo objeto de estudio la creacioacuten de nuevos derivados que favorezcan la
inversioacuten de las mutaciones asiacute como favorecer de nuevo la formacioacuten de la
conformacioacuten T76K Ocurre lo mismo con el intercambio de posicioacuten arginina-
serina (R163S confiere resistencia a la CQ y el cambio a S163R la vuelve
sensible) Este cambio confiere carga positiva al sitio de unioacuten e imposibilita por
repulsioacuten de cargas la unioacuten de la PfCRT con la CQ lo que confiere
sensibilidad a la cepa resistente
La aparicioacuten de resistencias a la artemisina queda registrada en el sudeste
asiaacutetico durante estos uacuteltimos antildeos Se han descrito evidencias cliacutenicas que
concluyen que existen en la actualidad casos de resistencias a la artemisina y a
los TCA promovida principalmente por el extendido uso de las monoterapias
de artemisina pero todaviacutea estaacute en estudio el mecanismo por el que se producen
estas resistencias (OMS Informe 2011) En la actualidad la posibilidad de
estudiar el genoma de los paraacutesitos y los mecanismos de accioacuten de los
diferentes tratamientos da como resultado el conocimiento de las resistencias y
la oportunidad de mejorar los tratamientos existentes
Prevencioacuten y Tratamiento
40
Dentro de las medidas de lucha contra la malaria estaacuten como se ha
comentado las referentes al control de vectores La uacutenica clase de insecticidas
empleados en las mosquiteras actualmente recomendadas incluidos los de
accioacuten prolongada actualmente recomendados son los piretroides En este
aacutembito tambieacuten se han desarrollado resistencias en la actualidad Se carece por
ahora de insecticidas alternativos que sean seguros y con una aceptable relacioacuten
costo-eficacia El desarrollo de nuevos insecticidas alternativos es una tarea de
alta prioridad pero tambieacuten larga y costosa Mientras la deteccioacuten de las
resistencias debe ser un componente esencial de todos los esfuerzos por
controlar el paludismo (OMS 2012)27
III24 Tratamientos actuales
Los regiacutemenes terapeacuteuticos en malaria son muy diversos ya que ademaacutes de
las caracteriacutesticas del paciente dependen del tipo de Plasmodium que infecta y la
zona donde se contrae la enfermedad
Cloroquina
Se usa a dosis maacutexima de 25 mgkg viacutea oral en P ovale y P malariae y cepas
sensibles de P vivax y P falciparum Actuacutea en la vacuola digestiva del
paraacutesito interfiriendo en la detoxificacioacuten de la hematina La alternativa
terapeacuteutica es gluconato de quinidina o quinina
Los efectos adversos que se producen son nauseas irritacioacuten con picor o
desoacuterdenes neuropsiquiaacutetricos La sobredosis se ha de tratar con diazepam
En caso de cepas P vivax resistentes se usa mefloquina halofantrina o
sulfato de quinina combinado con tetraciclinas o sulfonamidas Para tratar
recaiacutedas por hipnozoiacutetos se usa el fosfato de primaquina Para tratar
infeccioacuten por P falciparum resistente se usa sulfato de quinina 250 mgkg
combinado con pirimetamina-sulfadoxina o combiando con doxiclina Para
el tratamiento de nintildeos y embarazadas la quinina se combina con
clindamicina
Quinina
Es usada para el tratamiento de P falciparum resistente a la CQ Actuacutea como
esquizonticida sanguiacuteneo Como alternativa se usa el gluconato de
quinidina que es maacutes potente Las alternativas terapeacuteuticas son mefloquina
27 httpwwwwhointmalariadiagnosis_treatment
Prevencioacuten y Tratamiento
41
halofantrina atovaquona artemisinina y pirimetamina-sulfadoxina Para P
falciparum resistente se usa la artemisina IV combinada con tetraclicina o
mefloquina
Los efectos adversos son sabor metaacutelico tinnitus28 y peacuterdida de audicioacuten
reversible
Pirimetamina-sulfadoxina (Fansidarreg)
Es inhibidor de la siacutentesis de aacutecido foacutelico del ciclo vital del paraacutesito Se
utiliza en paiacuteses en desarrollo por su bajo coste sin embargo el incremento
de la resistencia a los antifolatos lo colocan como agente de segunda liacutenea
Mefloquina (Lariamreg)
Puede administrarse a dosis uacutenica de 25 mg baseKg y actuacutea como
esquizonticida sanguiacuteneo No debe administrarse en nintildeos con menos de 15
Kg de peso ni en pacientes que reciban quimioprofilaxis ni halofantrina
para evitar la resistencia cruzada Puede combinarse con doxiciclina
quinina y derivados de la artemisinina
Los efectos adversos son voacutemitos y toxicidad neuroloacutegica manifiestada en
forma de mareos delirio ataxia29 y convulsiones
Halofantrina
Se administra en dosis de 24 mgKg para intervenir en la degradacioacuten de la
Hb El faacutermaco tiene absorcioacuten oral variable y estaacute contraindicado en
enfermos con afecciones cardiacuteacas embarazadas y durante la lactancia Los
efectos adversos se han asociado con toxicidad cardiacuteaca y arritmias30
Atovaquona ndashproguanil (Malaronereg)
La dosis empleada es de 250 mg atovaquona100 mg proguanil Interviene
en la siacutentesis de aacutecido foacutelico del paraacutesito y en la cadena de transporte
electroacutenico mitocondrial (principal accioacuten de la atovaquona) El faacutermaco se
usa generalmente en profilaxis pero tambieacuten en el tratamiento de malaria
28 Patologia Otorrinolaringologa Estomatologa Percepcioacuten de golpeos o pitidos en el oiacutedo que no proceden de ninguna fuente [ claacutes tinnītus es tintineo] httpdicciomedeusales 29 Patologiacutea Neuroloacutegica Perdida de la capacidad de ejecutar movimientos de manera voluntaria ordenada y suavemente Puede afectar a tronco extremidades faringe laringe etc Se debe a la afectacioacuten de algunas estructuras del sistema nervioso [gr ataxiacuteā ἀταξία [a(n)- ἀ-ἀν- gr no + tag- τάξις gr orden formacioacuten + -siacuteā gr] httpdicciomedeusales 30 Patologiacutea cardiovascular Irregularidad y desigualdad en las contracciones del corazoacuten [gr arrythmiacuteā ἀρρυθμία [a(n)- ἀ-ἀν- gr no + rhythm(o)- ῥυθμός gr cadencia ritmo + -iacuteā gr cualidad] wwwdicciomedeusales
Prevencioacuten y Tratamiento
42
por P falciparum resistente a otros medicamentos No presenta efectos
adversos destacables
Derivados de la artemisina o TCA
La dosis de administracioacuten es de 12 mgKg pero es conveniente que se
combinen preferiblemente con mefloquina tetraciclina o clindamicina
Son el tratamiento de eleccioacuten para P falciparum resistente a quinina ya que
estos eliminan la parasitemia maacutes raacutepidamente que la quinina No se ha
descrito toxicidad severa en humanos aunque algunos estudios
demuestran neurotoxicidad en animales Auacuten no se ha determinado la
seguridad del uso de estos compuestos durante el embarazo
Artemeter-lumefantrina (Coartemreg y Riametreg)
Es una combinacioacuten fija de artemeter (20 mg) y lumefantrina (120 mg) con
accioacuten esquizonticida sanguiacutenea La combinacioacuten es eficaz contra las cepas
de P falciparum resistentes a otros tratamientos sin artemisina
Prevencioacuten y Tratamiento
43
III3 Estrategias mundiales en la lucha contra la malaria
En el antildeo 2008 se formoacute un grupo de estudio y control sobre la malaria
mundial integrado por la OMS Fondo de Naciones Unidas para la infancia
(UNICEF) el Programa de Naciones Unidas para el desarrollo (PNUD) el
Banco Mundial y la Asociacioacuten de la lucha contra el paludismo (FRP) Se crean
una serie de frentes de lucha para combatir y reducir la malaria mundial en un
plazo de 7 antildeos incluiacutedo en los Objetivos de Desarrollo del Milenio propuestos
por la ONU
La estrategia mundial tiene cuatro elementos baacutesicos
o Asegurar el diagnoacutestico precoz y el tratamiento inmediato
o Planificar y aplicar las medidas selectivas y sostenibles de prevencioacuten
incluiacuteda la lucha antivectorial
o Detectar a tiempo contener o prevenir las epidemias
o Reforzar la capacidad local en materia de investigacioacuten baacutesica y aplicada
a fin de permitir y promover la evaluacioacuten regular de la situacioacuten del
paludismo en el paiacutes en particular los factores ecoloacutegicos sociales y
econoacutemicos que influyen en la enfermedad
En el antildeo 2010 se realizoacute una revisioacuten del estado del plan y se propusieron
una serie de adaptaciones para mejorar los buenos resultados obtenidos
teniendo en cuenta la situacioacuten actual de aparicioacuten de resistencias
- Cobertura universal de los programas de prevencioacuten y tratamiento
- En prevencioacuten se proponen
mayores esfuerzos en proporcionar mosquiteras y principalmente un
haacutebito en su uso ya que se habiacutean obtenidos datos concluyentes que
relacionan directamente la disminucioacuten de muertes sobre todo
infantiles con el uso de mosquiteras
mantenimiento del rociado de exteriores con insecticidas de accioacuten
residual aprobadas por la OMS
administracioacuten de tratamiento preventivo intermitente a embarazadas
en zonas endeacutemicas
- En tratamientos se propone
priorizar las confirmaciones parasitoacutelogas de la enfermedad en
pacientes Es decir en la medida de lo posible no administrar
Prevencioacuten y Tratamiento
44
tratamientos sin confirmacioacuten de la enfermedad al microscopio o con
pruebas de diagnostico raacutepido
priorizar al uso de las TCA proponieacutendose la retirada de las
monoterapias orales de artemisina (OMS 2011)
III4 Liacuteneas de investigacioacuten actual
III41 Buacutesqueda de nuevas dianas
En la actualidad la aparicioacuten de resistencias por las mutaciones en el ADN del
paraacutesito obliga a un esfuerzo mayor por encontrar compuestos o asociaciones
de compuestos que sigan siendo efectivos contra el Plasmodium ademaacutes de a la
buacutesqueda de nuevos medicamentos Gracias a los avances de las ciencias
quiacutemicas y tecnologiacuteas actuales y el desarrollo de la Bioquiacutemica y la Genoacutemica
en la lucha contra la malaria posibilitan la determinacioacuten de nuevas dianas Ya
desde hace tiempo se conoce la viacutea de accioacuten de la detoxificacioacuten de la Hb pero
el continuo avance de la ciencia ha llevado al conocimiento del ADN y de las
macromoleacuteculas necesarias para la vida del paraacutesito conocimiento de las
mutaciones que llevan a las resistencias enzimas y otras moleacuteculas que
participan en el desarrollo del paraacutesito
Actualmente diferentes proyectos se encuentran en la fase de identificacioacuten de
cabezas de serie con actividad antimalaacuterica o en periodo de optimizacioacuten con el
fin de generar compuestos con propiedades terapeacuteuticas adecuadas como
inhibidores de proteasas de aacutecidos grasos inhibidores de la ruta de siacutentesis de
isoprenoides o del transporte y metabolismo de fosfoliacutepidos del metabolismo
mitocrondial o pirimidiacutenico
En lo que a inhibidores de proteasas se refiere las hemo-polimerasas como
cistein-proteasas (falcipainas) o aspartil-proteasas (plasmepsinas) son objetivos
primordiales de estudio Es el caso del conocimiento de las proteasas aspaacuterticas
del Plasmodium en los procesos de degradacioacuten de la hemoglobina de los
eritrocitos infectados Se ha determinado bioloacutegicamente que participan 4 tipos
de proteasas en concreto las plasmepsinas I II y IV y la histoaspaacutertica
(Ersmark K et alts 2006)
El mecanismo de accioacuten propuesto es la ruptura inicial de las cadenas α de la
Hb en el enlace peptiacutedico entre Phe-33 y Leu-34 Por meacutetodos computacionales
Prevencioacuten y Tratamiento
45
se genera la estructura tridimensional detallada de las enzimas y se estudia si
los compuestos pueden interaccionar inhibiendo su actividad
En relacioacuten con la siacutentesis de aacutecidos grasos hay que destacar las peculiares
caracteriacutesticas que reviste este proceso en bacterias y en cloroplastos Contienen
un sistema denominado tipo II (FASII) en el que cada reaccioacuten en el proceso de
biosiacutentesis estaacute catalizada por una proteiacutena independiente monofuncional al
contrario que en las ceacutelulas de mamiacutefero donde la siacutentesis estaacute mediada por una
proteiacutena multifuncional conocida como la aacutecido graso sintetasa de tipo I Los
inhibidores de enzimas de la ruta son el triclosan y la tiolactomicina un
metabolito secundario de hongos y estaacuten en desarrollo nuevos compuestos con
potencial terapeacuteutico
En faacutermacos dirigidos a la ruta de biosiacutentesis de isoprenoides vale la pena
destacar que el P falciparum depende de la viacutea 2C-metil-D-eritrol 4-fosfato
(MEP) para la siacutentesis de sus isoprenoides La fosmidomicina un antibioacutetico
natural producido por Streptomyces lavendulae ha demostrado ser un buen
tratamiento en el control de la malaria resistente porque inhibe de manera
especiacutefica la actividad de la enzima DOXP reductoisomerasa y porque controla
el segundo paso de la viacutea MEP
Otro proceso que tiene lugar durante las fases endo-eritrociacuteticas del paraacutesito
es la siacutentesis activa de estructuras de membrana Uno de los componentes
principales de las membranas del paraacutesito es el fosfoliacutepido fosfatidil-colina cuya
siacutentesis a su vez depende de la incorporacioacuten de colina exoacutegena a partir de la
sangre Distintos anaacutelogos de la colina exhiben una potente actividad
antimalaacuterica y se asume que inhiben el transporte de colina que tiene lugar a
traveacutes de un transportador especiacutefico localizado en la membrana del paraacutesito
(Vial HJ et alts 2004)
Existen un conjunto de compuestos que interfieren con la actividad
mitocondrial del paraacutesito Las fases endo-eritrociacuteticas tienen un metabolismo
mitocondrial activo estando presentes todas las enzimas implicadas en el ciclo
de los aacutecidos tricarboxiacutelicos y determinados componentes de la cadena de
transporte electroacutenico Asiacute la cadena respiratoria del paraacutesito constituye un
blanco de accioacuten para los faacutermacos Un ejemplo de desarrollo de faacutermacos por
esta viacutea es el Malaronereg donde la atovaquona se une al sitio de oxidacioacuten del
coenzima Q en el citocromo B del complejo III La accioacuten estaacute complementada
por la combinacioacuten con Proguanilo 45 (antifolato)
Prevencioacuten y Tratamiento
46
III42 Productos naturales
Los productos naturales han sido y son de gran intereacutes en el tratamiento de la
malaria La sociedad apuesta por lo natural y se plantean buacutesquedas de
compuestos activos en diferentes plantas de diferentes regiones africanas
(Magadula JJ y Erasto P 2009) o americanas (Mariath IR et alts 2009) ya
consideradas anteriormente como medicinales
La artemisina y sus derivados es el ejemplo a conseguir con estos
compuestos pero evitando en este caso el inconveniente de que solo puede
obtenerse por viacutea natural o semisinteacutetica
En esta liacutenea se siguen desarrollando derivados de artemisina y peroacutexidos que
tienen el mismo mecanismo de accioacuten que la artemisina viacutea radicales libres
(Muraleedharan KM and Mitchell A 2009) Uno de los muchos resultados de
esta variacioacuten de la estructura base son los compuestos hiacutebridos artemisinas-
quinolinas actualmente en desarrollo que dan lugar a los TCA recomendados
por la OMS Las benzo[c]fenantridinas son un grupo de compuestos
provenientes de extractos de plantas que pueden ser sintetizados y
modificados en un laboratorio (Rivaud M et alts 2012) Su mecanismo de
accioacuten estaacute todaviacutea por confirmar pero se cree que tienen actividad sobre la
inhibicioacuten de la ADN topoisomerasa que participa en la degradacioacuten de la Hb
Siguiendo con la liacutenea de productos naturales un objetivo que no se puede
pasar por alto son los compuestos marinos provenientes de esponjas algas
coraleshellip que contienen compuestos con estudiada actividad antimalaacuterica
(Gademann K y Kobyliska J 2009) Un ejemplo son las esponjas que
contienen diferentes familias de compuestos antimalaacutericos como las
pirroloquinolinas o las manzaminas A (Figura 23) de funcioacuten similar a la CQ y
mejor que la artemisina a igual dosis
Figura 23 Estructuras de compuestos naturales de origen marino
Prevencioacuten y Tratamiento
47
III43 Desarrollo de vacunas
Atendiendo a las observaciones sobre inmunidades que llegan a expresar las
personas que habitan zonas con altas tasas de malaria se van desarrollando las
vacunas Se ha comprobado que los esporozoiacutetos inactivos son muy eficaces
como inductores de la inmunidad en el ser humano Desafortunadamente no es
posible producir esporozoiacutetos inactivos en las enormes cantidades requeridas
para utilizarlos como meacutetodo viable de vacunacioacuten Por otro lado los avances
en materia de genoacutemica permiten identificar prometedoras moleacuteculas
inmunogeacutenicas con una rapidez mucho mayor y eso ampliacutea considerablemente
el nuacutemero de vacunas potenciales (Rojas Rivero L et alts 2005)
Las vacunas experimentales estaacuten basadas en diversos antiacutegenos derivados
de las diferentes formas que adopta el paraacutesito durante su ciclo de desarrollo
Los tipos de vacunas actualmente se clasifican en
Vacunas pre-eritrociacuteticas impiden que los esporozoiacutetos penetren o se
desarrollen en las ceacutelulas hepaacuteticas Estas vacunas prevendriacutean las
consecuencias graves y potencialmente mortales del paludismo en las
personas no inmunizadas Hasta la fecha se han ultimado unos 20 ensayos
cliacutenicos en el hombre con diversas proto-vacunas pre-eritrociacuteticas de
Plasmodium falciparum Una proto-vacuna muy prometedora es la RTS S
que promueve la activacioacuten del sistema inmunitario para que actuacutee contra
el P falciparum (Aponte JJ et alts 2007)
Vacunas contra las formas hemaacuteticas asexuadas son aquellas que impiden
que los merozoiacutetos penetren o se desarrollen en el interior de los hematiacutees
Se han desarrollado varios candidatos Sin embargo la mayoriacutea de esos
preparados se encuentra en estudios precliacutenicos y muy pocos han llegado a
estudios cliacutenicos de fase I debido en parte a la gran variabilidad que
manifiestan estas moleacuteculas en diferentes cepas
Vacunas bloqueadoras de la transmisioacuten son aquellas que estimulan la
produccioacuten de anticuerpos contra antiacutegenos de la fase sexuada del paraacutesito
que puedan impedir el desarrollo de esporozoiacutetos infecciosos en las
glaacutendulas salivales del mosquito Anopheles Teoacutericamente estas vacunas
podriacutean interrumpir el ciclo de transmisioacuten del paraacutesito al paso de este por
el vector y seriacutean de gran utilidad para reducir la diseminacioacuten de paraacutesitos
de cepas resistentes a otros tipos de vacunas El problema es que seriacutea
Prevencioacuten y Tratamiento
48
necesaria una vacunacioacuten masiva durante un largo periodo de tiempo
Actualmente hay algunas en estudios cliacutenicos de fase I
A pesar de todas las prometedoras vacunas que estaacuten en desarrollo
actualmente hay que tener en cuenta que los paraacutesitos desarrollan ingeniosos y
complejos mecanismos para soslayar la respuesta inmunitaria del hueacutesped Por
ejemplo son capaces de expresar diferentes antiacutegenos en cada una de las fases
de su ciclo de vida y a menudo modificar esos antiacutegenos cuando el hueacutesped
activa contra ellos su sistema inmunitario Ademaacutes se ha de vigilar la
complejidad inherente a la realizacioacuten de los propios ensayos cliacutenicos sobre el
terreno por cuanto no es faacutecil para los investigadores determinar la reduccioacuten
de la morbilidad y la mortalidad atribuible a la vacuna experimental
ANTECEDENTES
Antecedentes
51
La Unidad de I+D de Medicamentos de la Universidad de Navarra ha estado
trabajando durante varios antildeos en la siacutentesis de nuevos compuestos duales con
afinidad por los receptores 5-HT1A que fuesen a su vez inhibidores de la
recaptacioacuten de 5-HT para el tratamiento de la depresioacuten (Martinez- Esparza J
et alts 2001 Oruacutes L et alts 2002a Oruacutes L et alts 2002c Perez-Silanes S et
alts 2004)
Se llevaron a cabo estudios de modelizacioacuten molecular (Oruacutes L et alts
2002b) que definieron como farmacoacuteforo la estructura de la figura 24
Figura 24 Elementos farmacofoacutericos para la afinidad por los receptores 5-HT1 e inhibicioacuten del transportador de 5-HT
Los compuestos sintetizados podriacutean definirse como arilaminopropanoles
estructuralmente proacuteximos a las metanolquinolinas y arilaminoalcoholes
usados desde hace antildeos como antimalaacutericos Tal y como se como se ha tratado
en el apartado de introduccioacuten quinina y CQ (metanolquinolinas y
arilaminoalcoholes respectivamente) y halofantrina y lumefantina
(arilaminoalcoholes desarrollados tras la aparicioacuten de resistencias a las
anteriores) son compuestos de gran capacidad esquizonticida
Desde el punto de vista estructural la quinina y cloroquina pueden
considerarse farmacoacuteforos polivalentes ya que a partir de sus estructuras se han
desarrollado muchos de los compuestos que se usan como tratamiento de la
malaria en la actualidad La relacioacuten estructura-actividad de estos farmacoacuteforos
con base de quinolina se puede estudiar en la figura 25 (Konznetsov VV et
alts 2008)
Figura 25 Relacioacuten estructura actividad de la CQ
Antecedentes
52
Viendo la similitud estructural de los compuestos con estas estrucutras y los
aminoalcoholes utilizados en el tratamiento actual se decidioacute ensayar la posible
actividad antiplasmoacutedica de los mismos con buenos resultados en cepas
sensibles a la CQ (Perez-Silanes S et alts 2009)
Figura 26 Estructuras de los arilaminoalcoholes sintetizados como antidepresivos con mejor actividad antimalaacuterica Valores de CI50 en microM La CQ tiene un valor de 008 microM en cepas 3D7 sensibles a la CQ
Surgen asiacute las estructuras a desarrollar en este proyecto enfocado a la siacutentesis
de nuevos derivados de arilamino alcoholes para el tratamiento de la malaria
resistente a la CQ
OBJETIVOS Y
PLAN DE TRABAJO
IIVV OOBBJJEETTIIVVOOSS
Objetivos
57
El presente trabajo tiene como objetivo la buacutesqueda de nuevos derivados para
el tratamiento de la malaria resistente Teniendo en cuenta la estructura de los
aminoalcoholes derivados de la quinina y tomando como referencia la CQ se
propone la siacutentesis de nuevos derivados de arilaminoalcoholes con actividad
antimalaacuterica
El objetivo para llevar a cabo este proyecto estaacute basado en el trabajo detallado
a continuacioacuten
Revisioacuten bibliograacutefica de los faacutermacos con actividad antimalaacuterica
publicada hasta la fecha y planteamiento de un farmacoacuteforo
Disentildeo y siacutentesis de nuevos compuestos derivados de
arilaminoalcoholes con potencial actividad antimalaacuterica
Caracterizacioacuten estructural y evaluacioacuten bioloacutegica y computacional de
cada uno de los nuevos compuestos obtenidos
Estudio de la posible relacioacuten estructura-actividad de los compuestos
sintetizados que permita identificar liacutederes y una optimizacioacuten en el
disentildeo de nuevos derivados
Refinamiento estructural de nuevos compuestos con afinidad mejorada
por las dianas del plasmodio en base a los resultados obtenidos
VV PPLLAANN DDEE TTRRAABBAAJJOO
Plan de Trabajo
61
V1 Disentildeo de nuevos arilaminoalcoholes
Tal y como se ha comentado anteriormente se puede observar en la figura 27
que muchos de los compuestos antimalaacutericos de las diferentes subfamilias
tienen su base de desarrollo en la quinolina De ella surgen los dos compuestos
antimalaacutericos por excelencia
Figura 27 Esquema general del proceso de disentildeo de las moleacuteculas a desarrollar
Teniendo en cuenta todo esto se propone como estructura general de este
proyecto la mostrada en la figura 28
Figura 28 Esquema general de las nuevas estructuras
El proceso de disentildeo estructural de las nuevas moleacuteculas fue el siguiente
1 GRUPO AR1
En muchos de los compuestos antimalaricos mas relevantes como quinina o
cloroquina una constante en la estructura es la presencia del anillo de
quinolina aunque ya en los derivados de la familia de arilaminoalcoholes este
grupo es variable como en la halofantrina donde el grupo quinolina es
Plan de Trabajo
62
sustituido por el grupo fenantreno o el Benflumetol (lumefantrina) que cuenta
con un fluoreno sustituido
De este modo se plantea la posibilidad de la sustitucioacuten de la quinoleiacutena por el
benzo[b]tiofeno (basanda en estudios previos) el naftaleno (bioisoacutemero de la
quinoleiacutena) e incluso se plantea la simplificacioacuten a benceno (por motivos de
reduccioacuten estructurural) Se ha tenido en cuenta tambieacuten que en la familia de las
4-aminoquinolinas asociado a esa quinolina se presenta un grupo
electroatrayente (CF3) Asiacute se propone la introduccioacuten de un aacutetomo de fluacuteor
que es maacutes electronegativo y de menor tamantildeo
2 GRUPO Y
Si bien en la bibliografiacutea el grupo alcohol se considera esencial para la
actividad antimalaacuterica se quiso probar si en nuestros compuestos seguiacutea siendo
grupo esencial en la actividad Se estudioacute la actividad de los carbonilos
precursores de siacutentesis sustituyeacutendolos por un grupo oxima en posicioacuten 1 de la
cadena alifaacutetica en los nuevos derivados
3 CADENA ALIFAacuteTICA (CH2)n
En la familia de las aminoquinolinas y dentro del grupo de
arilaminoalcoholes se observa la presencia de una cadena alifaacutetica como puente
de unioacuten entre el grupo Ar1 y el resto de la moleacutecula De este modo los nuevos
derivados que desarrollar contaraacuten con una variacioacuten de uno a dos carbonos en
la cadena carbonada para determinar la longitud oacuteptima para la actividad
4 AMINA CENTRAL
El grupo amino es constante en todas las familias tomadas como referencia
Del mismo modo las aminoquinolinas tienen como similitud estructural entre
otras un grupo amino unido a la cadena alifaacutetica En este trabajo se plantea el
uso de piperazina homopiperazina (S)-aminopirrolidina aminopiperidina e
tetrahidropiridina para evaluar el efecto del cambio y determinar queacute tipo de
estructuras resulta maacutes conveniente
5 GRUPO AR2
En los compuestos tomados como referencia estructural de partida se observa
la presencia de las cadenas alifaacuteticas en el extremo amino Los nuevos
derivados combinan la amina ciacuteclica con un anillo aromaacutetico sustituido por
grupos electroatrayentes como CF3 (presentes en metanolquinolinas y
Plan de Trabajo
63
arilaminoalcoholes y de efecto positivo deducible para la actividad) el grupo
NO2 o el aacutetomo de F
Figura 29 Disentildeo de nuevas series de derivados de arilaminoalcoholes como nuevos agentes antimalaacutericos
V2 Siacutentesis de los compuestos disentildeados
Una vez disentildeados los compuestos y antes de empezar el trabajo de siacutentesis
se debe dejar claro cuaacutel va a ser el proceso elegido De forma general se puede
definir la siacutentesis de todos los derivados como siacutentesis lineal
La reaccioacuten de Mannnich que se usa para condensar metilcetonas con aminas
y las reacciones de condensacioacuten por sustitucioacuten nucleoacutefila alifaacutetica son
reacciones lineales La posterior reduccioacuten a hidroxilos u oximas se realiza en
un solo paso de reaccioacuten De esta forma nos aseguramos el menor nuacutemero de
pasos de reaccioacuten simplificacioacuten de la siacutentesis disminucioacuten del tiempo
invertido en el mismo y reduccioacuten del coste
V3 Caracterizacioacuten de los compuestos
Todas las reacciones seraacuten seguidas y controladas por cromatografiacutea en capa
fina Una vez obtenidos los compuestos se identificaraacuten por cromatografiacutea en
capa fina espectroscopia infrarroja resonancia magneacutetica nuclear de protoacuten
anaacutelisis elemental y punto de fusioacuten
Plan de Trabajo
64
V4 Evaluacioacuten bioloacutegica ldquoin vitrordquo
Los compuestos finales obtenidos seraacuten enviados a la Universidad de
Antioquiacutea (Medelliacuten Colombia) para la evaluacioacuten in vitro de su actividad
antimalaacuterica Los ensayos de toxicidad de los mismos se realizaraacuten en el
Laboratorio de Farmacologiacutea para el Desarrollo (IRD) de la Universidad Paul
Sabatier en Toulouse (Francia)
V5 Evaluacioacuten bioloacutegica ldquoin vivordquo
Aquellos compuestos que sean seleccionados por sus caracteriacutesticas de
estructura actividad in vitro y toxicidad seraacuten enviados a la Universidad Paul
Sabatier de Toulouse (Francia) para su evaluacioacuten in vivo
V6 Estudios computacionales
Todos los compuestos se someteraacuten a estudios computacionales sobre sus
propiedades fisicoquiacutemicas para obtener datos aproximados de su
comportamiento en solucioacuten (Log P) lipofilia o caraacutecter polar-apolar (presencia
de grupos polares y capacidad de formar enlaces donadores o aceptores) que
aporten datos teoacutericos sobre su absorcioacuten en el organismo A partir de los datos
conformacionales teoacutericos se plantea la unioacuten con una diana Los estudios
computacionales se realizaraacuten en la Unidad de I+D de Medicamentos de la
Universidad de Navarra
MATERIAL Y
MEacuteTODOS
VVII QQUUIacuteIacuteMMIICCAA TTEEOacuteOacuteRRIICCAA
VI1 Esquema general de siacutentesis
Figura 30 Reactivos y condiciones Viacutea 1 Carbonato potaacutesico en tetrahidrofurano a reflujo
Viacutea 2 Dioxolano con aacutecido clorhiacutedrico a reflujo 130-140ordmC
Quiacutemica Teoacuterica
70
VI2 Siacutentesis de precursores
VI21 Siacutentesis de (benzo[b]tiofen-3-il)-3-cloropropan-1-ona
Figura 31 Esquema general de siacutentesis de (benzo[b]tiofen-3-il)-3-cloropropan-1-ona
La siacutentesis de este derivado se lleva a cabo usando tricloruro de aluminio a
temperatura ambiente durante 48 horas (Peacuterez-Silanes S et alts 2001) En vez
de emplear cloroformo como disolvente tal y como describen los autores se
empleoacute diclorometano ya que es menos toacutexico y resulta igualmente efectivo
VI22 Siacutentesis de arilaminas
VI221 Siacutentesis de arilaminas protegidas
Los compuestos sintetizados se ajustan a la estructura general que se muestra
en la figura 32
Figura 32 Estructura general de las arilaminas intermedias sintetizadas
Las arilaminas sintetizadas tienen un extremo amino protegido con un grupo
tert-butiloxicarbonilo (BOC) voluminoso que evita que estas diaminas
reaccionen por ambos extremos con el fluoruro de arilo
Figura 33 Esquema general para la siacutentesis de arilaminas
Este tipo de reacciones raramente transcurren por un mecanismo de
sustitucioacuten nucleofiacutelica aromaacutetica (SNA) Normalmente la SNA dan bajos
rendimientos debido a que el enlace C (sp2)-X es maacutes corto y fuerte que el de un
carbono con hibridacioacuten sp3 La SN2 estaacute impedida por dificultades esteacutericas del
anillo para que se aproxime el nucleoacutefilo y la SN1 estaacute impedida por la
inestabilidad del catioacuten fenilo intermedio
Tras revisar la bibliografiacutea se propone que este tipo de SNA transcurren
seguacuten un mecanismo llamado Sustitucioacuten nucleofiacutelica aromaacutetica viacutea complejos
Quiacutemica teoacuterica
71
de meisenheimer (Figura 34) consistente en una adicioacuten-eliminacioacuten (Bruckner
et alts 2002)
En la primera fase la adicioacuten el nucleoacutefilo ataca al compuesto aromaacutetico en la
que es la etapa lenta de la reaccioacuten Se produce un carbanioacuten que es llamado
Complejo de Meisenheimer La carga negativa queda deslocalizada sobre los
cinco carbonos aromaacuteticos con hibridacioacuten sp2 del anillo pero no lo hace
uniformemente sino que se distribuye tal y como se indica en la figura 34
Figura 34 Primera Etapa Etapa lenta del mecanismo de reaccioacuten de sustitucioacuten nucleofiacutelica viacutea complejos de
Meisenheimer
El aacutetomo unido al nucleoacutefilo tiene hibridacioacuten sp3 ya que tambieacuten se
encuentra unido al sustituyente X que se elimina en una segunda etapa la fase
raacutepida de la reaccioacuten (Figura 35)
Figura 35 Segunda Etapa Etapa raacutepida del mecanismo de reaccioacuten de sustitucioacuten nucleofiacutelica viacutea complejos de
Meisenheimer
Independientemente del haloacutegeno X y del sustituyente R empleados en la
posicioacuten para respecto del aacutetomo de carbono al que ataca el nucleoacutefilo aparece
una carga parcial de -030 del mismo modo en las posiciones orto esta carga
parcial es de -025 y en la posiciones meta la carga es de -010 Como
consecuencia de esto uno de los requisitos maacutes importantes para que se de la
reaccioacuten es que alguacuten grupo electroatrayente estabilice el complejo La mayor
densidad de carga negativa se encuentra en para por lo que los grupos
electroatrayentes en esta posicioacuten estabilizan mucho el compuesto formado Por
esta razoacuten se han empleado grupos nitro o fluacuteor en dicha posicioacuten
El empleo de fluoruros de arilo para la formacioacuten de los intermedios de
aminas protegidas tambieacuten se explica por esta razoacuten El fluacuteor tiene un fuerte
efecto inductivo lo que estabiliza el complejo formado
Quiacutemica Teoacuterica
72
Tras una revisioacuten bibliograacutefica se observoacute que esta reaccioacuten esta favorecida
llevaacutendose a cabo en un medio de acetonitrilo (CH3CN) a reflujo en lugar del
dimetilsulfoacutexido (DMSO) anteriormente descrito usando carbonato potaacutesico
(K2CO3) (Blizzard et alts 2005) lo que facilita el trabajo por el bajo punto de
ebullicioacuten del medio y simplificando la extraccioacuten de los compuestos en este
medio
VI222 Desproteccioacuten de aminas
Las arilaminas sintetizadas tienen un extremo amino protegido con un grupo
BOC asiacute una vez formados los intermedios protegidos el paso siguiente para
continuar con la siacutentesis de los compuestos deseados consiste en eliminar este
grupo protector
Figura 36 Generacioacuten del carbocatioacuten t-butilo y del aacutecido carbaacutemico
La reaccioacuten de las aminas protegidas con aacutecidos acuosos como aacutecido
clorhiacutedrico y aacutecido aceacutetico (HCl y HAc) en condiciones de temperatura
ambiente rinde la consiguiente amina desprotegida en forma de hidrocloruro
Para esta reaccioacuten la amina protegida se disuelve en una disolucioacuten (11) de
HClHAc a temperatura ambiente generaacutendose un aacutecido carbaacutemico (Figura 36)
que es inestable y se descarboxila in situ (Figura 37) dando lugar a la amina
desprotegida en forma de hidrocloruro debido la presencia de HCl en el medio
Figura 37 Descarboxilacioacuten espontaacutenea del aacutecido carbaacutemico
Los hidrocloruros son compuestos poco solubles en muchos de los
disolventes orgaacutenicos y en ocasiones impiden los siguientes pasos de siacutentesis
Asiacute los intermedios se convierten a su forma de base libre por medio de su
disolucioacuten en agua y posterior adicioacuten de una disolucioacuten de hidroacutexido soacutedico
Quiacutemica teoacuterica
73
(NaOH) 2M de forma gradual hasta pH baacutesico para asegurar una completa
eliminacioacuten de HCl de la moleacutecula La disolucioacuten baacutesica se deja en agitacioacuten
durante dos horas aproximadamente Normalmente se observa como al antildeadir
la base se obtiene un precipitado debido a la insolubilidad de la amina en forma
de base libre en el medio acuoso mientras que en forma de hidrocloruro
resultaba soluble
Como uacuteltimo paso de reaccioacuten se procede a la extraccioacuten de la amina con un
disolvente orgaacutenico que suele ser diclorometano En general las aminas
precipitan faacutecilmente en hexano friacuteo como soacutelido Si fuese necesario purificar el
aceite impuro se realiza una cromatografiacutea en columna no flash con
diclorometano basificado con unas gotas de amoniacuteaco
VI3 Siacutentesis de derivados carboniacutelicos (Serie 0)
VI31 Condensacioacuten de 1-(benzo[b]tiofen-3-il)-3-cloropropan-1-ona y
de 2-bromo-2acute-acetonaftona con la amina (Viacutea 1)
En este caso los productos finales se obtienen a traveacutes de una reaccioacuten de
sustitucioacuten nucleofiacutelica alifaacutetica (Figura 38) a partir del 1-(benzo[b]tiofen-3-il)-3-
cloropropan-1-ona o del 2-bromo-2acute-acetonaftona y la correspondiente amina
Al tratarse de un cloruro de alquilo primario el mecanismo maacutes probable de
reaccioacuten es el de una sustitucioacuten nucleofiacutelica de segundo orden (SN2)
Figura 38 Esquema de siacutentesis de cetonas
La mayoriacutea de las veces los reactivos de partida no se llegan a consumir
completamente y se obtienen productos secundarios que no se eliminan con
facilidad Ha sido especialmente costosa la purificacioacuten de algunos compuestos
los que han requerido la purificacioacuten por medio dos columnas cromatograacuteficas
tradicionales consdecutivas columna tradicional seguida de una preparativa o
purificarlos dos veces consecutivas en el equipo de cromatografiacutea flash Todos
estos intentos de purificacioacuten ldquoparcialrdquo hacen disminuiacuter notablemente el
rendimiento de la reaccioacuten Otras veces los compuestos se precipitan como
hidrocloruro consiguiendo al mismo tiempo ser purificados
Quiacutemica Teoacuterica
74
VI32 Reaccioacuten de Mannich Condensacioacuten de metilcetonas con aminas
en medio aacutecido (Viacutea 2)
La reaccioacuten de Mannich consiste en la condensacioacuten de un compuesto que
posea aacutetomos de hidroacutegeno activos (sustrato) con formaldehiacutedo y una amina
para formar una moleacutecula conocida como ldquoBase de Mannichrdquo
En la mayor parte de las reacciones se usoacute el 13-dioxolano que es una amina
secundaria como compuesto generador de formaldehido El sustrato son
arilmetilcetonas donde el anillo aromaacutetico es fluorobenzo[b]tiofeno naftaleno
4-fluoronaftaleno o bencenos para-sustituidos El 13-dioxolano es ademaacutes el
disolvente y como catalizador el aacutecido clorhiacutedrico aporta al medio los protones
necesarios para la reaccioacuten
Las arilmetilcetonas utilizadas presentan hidroacutegenos aacutecidos en posiciones α
con respecto al grupo carboniacutelico (Figura 40) En medio aacutecido la acidez de estos
se debe a la estabilizacioacuten de la base conjugada (forma enoacutelica) por resonancia
La presencia del anillo en α con respecto al carbonilo provoca una situacioacuten de
deslocalizacioacuten electroacutenica π del sistema en su forma enoacutelica que se ve
favorecida por los sustituyentes electroatrayentes unidos al anillo La
reactividad aumenta debido a la retirada de carga del sistema π por estos
sustituyenes que acidifican asiacute los hidrogenos α
El mecanismo de reaccioacuten propuesto transcurre en dos etapas
En una primera etapa la amina reacciona con el formaldehiacutedo generando el
catioacuten iminio El 13 dioxolano es un acetal que en medio aacutecido genera
formaldehiacutedo ldquoin siturdquo para producirse entonces una adicioacuten nucleoacutefila de
la amina al carbonilo del compuesto no enolizable como es el recieacuten
generado formaldehiacutedo (Figura 39) (Tramontini et alts 1973)
Figura 39 Primera etapa del mecanismo de reaccioacuten propuesto para la formacioacuten de la base de Mannich
En la segunda etapa de reaccioacuten la metilcetona en medio aacutecido se protona
dando lugar a un equilibrio ceto-enoacutelico desplazado hacia la forma enoacutelica
(Figura 40)
Quiacutemica teoacuterica
75
Figura 40 Equilibrio ceto-enoacutelico en medio aacutecido
El ion iminio formado en la primera etapa es un buen electroacutefilo que
reacciona con la forma enolica nucleoacutefila obtenieacutendose como resultado la sal del
compuesto final (Figura 41) Asiacute el uacuteltimo paso de reaccioacuten es la basificacioacuten del
medio con una disolucioacuten acuosa de NaOH para la obtencioacuten de la sal
inorgaacutenica y compuesto orgaacutenico libre
Figura 41 Segunda etapa del mecanismo de reaccioacuten de Mannich
Se ha determinado experimentalmente que en la obtencioacuten de la base se
produce la misma reaccioacuten usando como generador de formaldehido el
paraformaldehido Para ella ha de usarse como medio de reaccioacuten un medio
proacutetico como el alcohol etiacutelico y HCl Despueacutes de varios experimentos y
optimizacioacuten de la temperatura necesaria para la reaccioacuten se comproboacute que la
viacutea oacuteptima por rapidez y rendimiento era la del 13 dioxolano
VI4 Siacutentesis de derivados hidroxiacutelicos (Series 1-7)
Los derivados hidroxiacutelicos se sintetizan a traveacutes de la reduccioacuten de las
correspondientes intermedios carboniacutelicos con borohidruro soacutedico (BH4Na) en
metanol a 0ordmC
Figura 42 Esquema general para la siacutentesis de alcoholes desde cetonas
En todas las reducciones que se han realizado se utiliza como agente
reductor el BH4Na que es probablemente el agente reductor maacutes usado en este
tipo de siacutentesis Se trata de un hidruro de reactividad media que presenta alta
quimioselectividad y un manejo sencillo en comparacioacuten con otros hidruros
El disolvente empleado es metanol con el que se logra una buena solubilidad
del BH4Na La temperatura de reaccioacuten se ha de mantener en torno a 0ordmC por
Quiacutemica Teoacuterica
76
tres motivos primero para evitar que la reaccioacuten se deacute demasiado raacutepida lo que
conlleva la aparicioacuten de productos secundarios en segundo lugar para evitar
que sea demasiado lenta lo que favorece la reaccioacuten secundaria entre el
borohidruro y el metanol El tercer motivo es impedir que tenga lugar la
reaccioacuten inversa a la reaccioacuten de Mannich
En general la reaccioacuten entre el BH4Na y el compuesto se da por completo
durante la primera hora de reaccioacuten antes de que tenga lugar la reaccioacuten
inversa de descomposicioacuten del compuesto cetoacutenico El mecanismo de reaccioacuten
no se ha descrito de forma totalmente definitiva aunque siacute que parece seguro el
hecho de que la estequiometriacutea de la reaccioacuten es de cuatro moleacuteculas de cetona
por una de BH4Na
La reaccioacuten transcurre siguiendo una transferencia secuencial de hidruros
desde la moleacutecula de BH4Na hasta cada una de las cuatro cetonas a traveacutes de
sendos ataques nucleofiacutelicos a los carbonos carboniacutelicos que tras estas
transferencias forman la sal soacutedica del tetraborato Este complejo sufre con
posterioridad una hidroacutelisis dando lugar finalmente a la formacioacuten del alcohol
(Figura 43)
Figura 43 Mecanismo de reaccioacuten propuesto para la siacutentesis de los alcoholes
Quiacutemica teoacuterica
77
El disolvente utilizado es el metanol que al ser un disolvente proacutetico cumple
la misioacuten de reducir la energiacutea de activacioacuten que es demasiado grande para que
la reaccioacuten se produzca de forma espontaacutenea a pesar de que el proceso neto es
exoteacutermico Esta cataacutelisis de la reaccioacuten se debe a la estabilizacioacuten que el
disolvente aporta al estado de transicioacuten ademaacutes de estabilizar el borano y el
anioacuten alcoacutexido cuando eacutestos no se hayan unido
Todos los derivados hidroxiacutelicos se han purificado por cromatografiacutea en capa
fina cromatografiacutea de columna cromatografiacutea preparativa o cromatografiacutea
flash Algunos se han precipitado en forma de hidrocloruro mediante la
adicioacuten de eacuteter saturado de aacutecido clorhiacutedrico
Estereoquiacutemica de la reaccioacuten
Las cetonas asimeacutetricas empleadas en estas reacciones son productos
proquirales por lo que dan lugar a las dos configuraciones posibles del
derivado hidroxiacutelico R y S La reaccioacuten rinde una mezcla raceacutemica ya que el
borohidruro soacutedico no es agente estereoselectivo y el grupo carbonilo es plano
con lo que el ion hidruro puede atacar por ambos lados del grupo con igual
probabilidad Ademaacutes estas moleacuteculas no poseen grupos voluminosos que
favorezcan la aparicioacuten de un mayor porcentaje de uno de los enantioacutemeros
Dado que es muy costoso el aislamiento de los isoacutemeros por separado se
replanteariacutea este trabajo en caso de encontrar una moleacutecula especialmente
activa
Reacciones secundarias
Una de las reacciones secundarias maacutes frecuentes es la rotura de la base de
Mannich formada a traveacutes de una desaminacioacuten o de una desaminometilacioacuten
que recibe el nombre de ldquoretro-Mannichrdquo (Tramontini y Angiolono 1990) La
reaccioacuten tiene como productos los reactivos de partida de la condensacioacuten
carboniacutelica
Todaviacutea no queda claro el porqueacute de estas reacciones pero podriacutea deberse a
un aumento de la temperatura del medio provocada por una adicioacuten
demasiado raacutepida de BH4Na o por una excesiva basificacioacuten del medio
ocasionada por un exceso del agente reductor
Quiacutemica Teoacuterica
78
VI5 Siacutentesis de oximas (Serie 8)
La siacutentesis de estos derivados se abordoacute a partir de los derivados carboniacutelicos
mediante una condensacioacuten de estos con hidroxilamina usando etanol (EtOH)
como disolvente (Figura 44)
Figura 44 Esquema general de reduccioacuten de carbonilo a oxima
El mecanismo de la reaccioacuten transcurre en dos etapas a traveacutes de un
intermedio cuya existencia ha sido verificada mediante el uso de teacutecnicas de
espectroscopia de IR (Martinez J 1999)
La primera etapa consiste en la formacioacuten del intermedio de reaccioacuten para lo
cual es necesaria la presencia de hidroxilamina en su forma libre (la forma
protonada no posee caraacutecter nucleofiacutelico) por lo que esta etapa de la reaccioacuten se
veraacute favorecida a pH baacutesico
Figura 45 Mecanismo de reaccioacuten propuesto para la formacioacuten del intermedio de reaccioacuten en la formacioacuten de oximas
La segunda etapa consiste en la deshidratacioacuten del intermedio que estaraacute
favorecida por un pH aacutecido La velocidad de la reaccioacuten dependeraacute del pH de la
misma y asiacute mientras que en un pH baacutesico la adicioacuten de hidroxilamina es un
proceso raacutepido y es la segunda etapa la que controla la velocidad de reaccioacuten lo
contrario ocurre a pH aacutecido siendo entonces la primera etapa la que controla la
velocidad de reaccioacuten
Figura 46 Mecanismo propuesto para la formacioacuten de la oxima por deshidratacioacuten del intermedio de reaccioacuten en media aacutecido
Quiacutemica teoacuterica
79
Estereoquiacutemica de la reaccioacuten
La formacioacuten de oximas puede producir dos isoacutemeros posibles el Z o cis y el
E o trans
Figura 47 Isomeriacutea cis-trans de los derivados oxima31
Se observoacute que seguacuten el derivado carboxiacutelico del que se partiacutea se obteniacutea
mayoritariamente un isoacutemero u otro pero aunque no se ha encontrado
explicacioacuten a esta selectividad
31 El estudio espectroscoacutepico de ambos isoacutemeros se encuentra desarrollado en la tesis del Dr J Martinez Esparza (1999)
VVIIII QQUUIacuteIacuteMMIICCAA EEXXPPEERRIIMMEENNTTAALL
Quiacutemica experimental
83
VII1 Instrumental y reactivos
Los reactivos quiacutemicos utilizados en siacutentesis fueron adquiridos en E Merck
(Darmstadt Alemania) Scharlau (FEROSA Barcelona Espantildea) Panreac
Quiacutemica SA (Montcada i Reixac Barcelona Espantildea) Sigma-Aldrich Quiacutemica
SA (Alcobendas Madrid) Acros Organics (Janssen Pharmaceuticalaan 3a
2440 Geel Beacutelgica) Maybridge (Cornwall Reino Unido) Lancaster (Bischheim-
Strasbourg Francia) y Prolabo (Leuven Belgica)
Las cromatografiacuteas de capa Fina se desarrollan sobre gel de siacutelice de 02 mm de
espesor (Alugram SIL GUV254 [ref 818133] Macherey-Nagel Alemania) Las
placas se desarrollan en diclorometanometanol en diferentes proporciones y
se revelan bajo una laacutempara ultravioleta a longitud de onda 254 y 365 nm
La cromatografiacutea en columna se desarrolla en columnas de vidrio
empaquetadas con siacutelica gel 60 (0040-0063 mm y 0063-0200 mm de tamantildeo
de partiacutecula Merck) con fases moacuteviles diclorometanometanol o
hexanoacetato en diferentes proporciones
La cromatografiacutea preparativa se desarrolla en placas de vidrio rectangulares
sobre las cuales se preparan laacuteminas de siacutelica gel (Siacutelica Gel 60 PF254
cromatografiacutea en capa fina (ref 1077472500) Merck KGaA Darmstadt
Alemania) de 1 mm de grosor La fase moacutevil utilizada en esta metodologiacutea es
diclorometanometanol 973
La cromatografiacutea flash se realiza en un equipo de cromatografiacutea Combiflashreg
Rf 200 (Teledyne Isco Lincoln USA) Se desarrolla en columnas flash de fase
normal de 12 gramos RediSepreg Rf Columns (Teledyne Isco USA) con un
gradiente binario hasta 991 diclorometanometanol (pureza de siacutentesis SDS-
Carlo Erba Reactifs Francia)
Formacioacuten de hidrocloruro algunos de los compuestos fueron purificados o
precipitados en forma de sales Para ellos se utilizoacute eacuteter saturado de HCl
preparado en el laboratorio
VII2 Meacutetodos de elucidacioacuten estructural
Todos los compuestos sintetizados han sido caracterizados quiacutemicamente por
cromatografiacutea en capa fina (CCF) punto de fusioacuten espectroscopia infrarroja
(IR) resonancia magneacutetica nuclear (RMN) anaacutelisis elemental de carbono
Ensayos Bioloacutegicos
84
hidroacutegeno y nitroacutegeno (CHN) y cromatografiacutea liacutequida de alta resolucioacuten
(HPLC)
Los puntos de fusioacuten han sido determinados en un equipo Mettler FP82 +
FP80 (Greifense Suiza) y no han sido corregidos La temperatura de fusioacuten se
muestra en grados centiacutegrados (0C)
Los espectros de IR han sido registrados en un equipo Thermo Nicolet FTIR
Nexus Euro (Madison USA) con el programa informaacutetico OMNIC 60
empleando pastillas de bromuro potaacutesico Las frecuencias se expresan en cm-1 y
las intensidades de sentildeal se representan como md (media deacutebil) d (deacutebil) m
(media) f (fuerte) y mf (muy fuerte)
Los espectros de RMN-1H han sido registrados en un equipo Brucker 400
UltrasieldTM (Brucker BioSpin GmbH Rheinstelten Alemania) utilizando como
referencia interna tetrametilsilano en una concentracioacuten aproximada de 01
gmL de TMS y dimetilsulfoacutexido-d6 (DMSO-d6) o cloroformo deuterado
(CDCl3) como disolventes La concentracioacuten de las muestras ha sido
aproximadamente 20 mgmL Para la deteccioacuten de los protones laacutebiles se
emplean unas gotas de agua deuterada Los desplazamientos quiacutemicos (δ) han
sido expresadas en ppm relativas a tetrametilsilano y las multiplicidades de
sentildeal se han representado como se indican en las siguientes abreviaturas sa
(sentildeal ancha) s (singlete) d (doblete) t (triplete) c (cuadruplete) m
(multiplete) dd (doble doblete) y ddd (doble doblete desdoblado) Las
constantes de acoplamiento J han sido expresadas en Hz Los experimentos
HMBC (espectros en 2D para determinar los acoplamientos de protones a larga
distancia) HMQC (espectros en 2D para observar los acoplamientos C-H en la
moleacutecula) DEPT-135 (espectros en 1D donde los CH y CH3 salen positivos y
los CH2 negativos) DEPT-90 (espectros en 1D donde solo aparecen los grupos
CH) RMN-13C y COSY (espectro 2D para determinar los acoplamientos de los
protones con los protones vecinos) se han registrado en el mismo equipo
empleado para la resonancia de protoacuten utilizando los mismos disolventes
deuterados
Los CHN han sido obtenidos en un microanalizador LECO CHN-900(Tres
cantos Espantildea) a partir de muestras previamente secadas con pentoacutexido de
foacutesforo durante 24-48 horas a vaciacuteo (3-4 mm Hg) y temperatura ambienteEl
intervalo de error admitido para cada producto es de plusmn04 para cada tipo de
aacutetomo determinado
Quiacutemica experimental
85
Los tiempos de retencioacuten y longitudes maacuteximas de absorcioacuten para la
determinacioacuten de pureza y caracterizacioacuten han sido obtenidos en un equipo de
HPLC Los experimentos fueron realizados en un cromatoacutegrafo Ultimate 3000
(DIONEX) controlado por el software Cromeleon versioacuten 68 Las medidas se
obtuvieron con una columna RP18 (LICHROSPHER 100 RP18 EC 5 microm
10x046 TEKNOKROMA) como fase estacionaria y un flujo de 1 mL minuto
con metanolagua (8020) como fase moacutevil Los tiempos de retencioacuten (tR) se
expresan en minutos y las longitudes de onda maacuteximas en nm
VII3 Denominaciones de compuestos
El criterio elegido para la asignacioacuten de las referencias ha sido el siguiente En
primer lugar se dividen los compuestos obtenidos en carbonilos hidroxilos y
oximas Los derivados carboniacutelicos son considerados como intermedios en la
reaccioacuten global asiacute que se les asigna el nombre de Serie 0 Los compuestos
hidroxiacutelicos son los que corresponden estructuralmente con los
arilaminoalcoholes antimalaacutericos objeto central de este trabajo que se divide en
subgrupos En el caso de las oximas se ha denominado al grupo de compuestos
como Serie 8
La primera divisioacuten se realiza seguacuten la naturaleza del Ar1 y de la longitud de la
cadena alifaacutetica
Figura 48 Estructura general de los derivados hidroxiacutelicos sintetizados
Serie 1 2 3 4 5 6 7
Ar1
n 2 2 2 1 2 2 2
Tabla 1 Distribucioacuten de compuestos en series por Ar1
Ademaacutes de la serie numeacuterica una letra diferenciaraacute cada compuesto seguacuten la
amina y los sustituyentes Ra y Rb del benceno de Ar2 que conforman cada
derivado De esta forma
Ensayos Bioloacutegicos
86
a b c d e f g
Amina
RaRb CF3N
O2 NO2CF3 HCF3 CF3NO2 CF3NO2 CF3NO2 HF
Tabla 2 Denominacioacuten de compuestos
Siguiendo este orden alfabeacutetico los derivados que forman la Serie 0 son
numerados seguacuten el mismo criterio
Ejemplo un compuesto hidroxiacutelico que presenta un aacutetomo de fluacuteor en Ar1
unido a un grupo naftaleno con una piperidina central y grupo fenil con Ra
trifluorometil y Rb nitro se denomina como compuesto 5f
Referencia Serie 5f
Ar1= FNFT
(CH2) n n=2
Amina= PIPR
Ar2 Ra=CF3 ndash Rb= NO2
VII4 Descripcioacuten general de meacutetodos de siacutentesis
VII41 Meacutetodo A procedimiento general para la obtencioacuten de las
arilaminas protegidas
En 30 mL de acetonitrilo (CH3CN) se disuelven 1 equivalente de la amina
comercial protegida y 12 equivalentes del halogenuro de arilo correspondiente
seguacuten la arilamina que se desee sintetizar en cada caso Se antildeaden tambieacuten 15
equivalentes de carbonato potaacutesico (K2CO3) para neutralizar el medio de
reaccioacuten Se hace reaccionar a reflujo un maacuteximo de 24 horas tras lo cual se
elimina el CH3CN en el rotavapor El residuo obtenido se disuelve en
diclorometano y se extrae tres veces con agua La fase orgaacutenica obtenida se seca
con sulfato soacutedico anhidro se filtra y se elimina el disolvente a sequedad en el
rotavapor obtenieacutendose la correspondiente BOC-arilamina
Quiacutemica experimental
87
VII42 Meacutetodo B procedimiento general para la desproteccioacuten de
aminas
Se disuelve la amina protegida en 40 mL de disolucioacuten HClAcH (11)
observaacutendose ligera efervescencia por el desprendimiento de H2 Se deja
agitando 2 horas a temperatura ambiente Transcurrido el tiempo se elimina el
disolvente en el rotavapor El clorhidrato obtenido se disuelve en agua y se
antildeade NaOH 2M hasta conseguir pH baacutesico Se agita 2 horas y la mezcla de
reaccioacuten se extrae con DCM La fase orgaacutenica se seca con sulfato soacutedico anhidro
se filtra y se elimina el disolvente a sequedad en el rotavapor obtenieacutendose la
correspondiente arilamina desprotegida
VII43 Meacutetodo C procedimiento general para condensacioacuten de aminas
(Viacutea 1)
Se disuelven en 40 mL de tetrahidrofurano (THF) las cantidades indicadas en
cada caso de 1-(benzo[b]tiofen-3-il)-3-cloropropan-1-ona o 2-bromo-2acute-
acetonaftona y la amina deseada en proporciones 11 Se antildeade la cantidad
equimolecular de carbonato potaacutesico Se deja agitando un maacuteximo de 24 horas a
temperatura ambiente y en el transcurso de ese tiempo se sigue el desarrollo de
la reaccioacuten por CCF Se elimina el THF en el rotavapor a presioacuten reducida y el
residuo obtenido se disuelve en diclorometano para lavarlo tres veces con agua
La fase orgaacutenica se seca con sulfato soacutedico se filtra y se elimina el disolvente en
el rotavapor El residuo obtenido se purifica por el meacutetodo descrito en cada
caso
Esta viacutea se siacutentesis se aplica a la obtencioacuten de los derivados de la Serie 0 1 2
3 14 y 15 que son los intermedios para la obtencioacuten las Series 1 y 4
VII44 Meacutetodo D procedimiento de condensacioacuten de aminas (Viacutea 2)
En un matraz se ponen las cantidades indicadas de 1-(5-fluorobenzo[b]tiofen-
3-il)etanona 2-acetonaftona 4-fluoro-1acute-acetonaftona 4-fluoroacetofenona o 4-
(trifluorometil)acetofenona y la amina deseada en proporciones
equimoleculares Se antildeade 13 dioxolano en una proporcioacuten 14 molar y se
antildeaden varias gotas HCl concentrado Se lleva a reflujo a una temperatura de
bantildeo de 130-140 ordmC siguiendo la reaccioacuten por CCF Finalizada la reaccioacuten se
enfriacutea a temperatura ambiente y se antildeade agua y NaOH 2M hasta pH baacutesico en
agitacioacuten El compuesto se extrae con diclorometano y se seca la fase orgaacutenica
con sulfato soacutedico anhidro Se filtra y elimina el disolvente en el rotavapor a
Ensayos Bioloacutegicos
88
sequedad El residuo obtenido puede precipitar puro o necesitar posterior
purificacioacuten por los meacutetodos descritos en cada caso
Esta viacutea de siacutentesis se aplica para la obtencioacuten de la mayor parte de los
compuestos de la Serie 0 intermedios para la obtencioacuten de las Series 2 35 6 7
y 8
VII45 Meacutetodo E procedimiento general para la reduccioacuten de cetonas
En un bantildeo de hielo a 0 ordmC se pone un matraz con 10 mL de metanol a
enfriar Una vez friacuteo se antildeade el compuesto carboniacutelico al matraz y se deja en
agitacioacuten Se le antildeade a la disolucioacuten enfriada aproximadamente 200 mg de
BH4Na observaacutendose efervescencia Se deja en agitacioacuten un maacuteximo de una
hora manteniendo la temperatura del bantildeo siguiendo la evolucioacuten por CCF
Transcurrido el tiempo se antildeaden 5 mL de agua que inactivan el BH4Na y se
elimina a vaciacuteo el disolvente Se extrae con DCM y la fase orgaacutenica se seca con
sulfato soacutedico anhidro Se filtra y se elimina el disolvente a vaciacuteo El residuo
puede precipitar puro o necesitar purificacioacuten por cromatografiacutea en columna
flash o mediante formacioacuten del correspondiente hidrocloruro
Se obtienen por este meacutetodo los compuestos de las Series 1 a 7
VII46 Meacutetodo F procedimiento general para siacutentesis de oximas desde
carbonilos
En un matraz se pone la cantidad de carbonilo obtenido deseada y se antildeade
el clorhidrato de hidroxilamina en proporcioacuten 1 55 molar respectivamente Por
uacuteltimo se antildeaden 15 mL de EtOH y se lleva a reflujo durante 90 minutos
Pasado el tiempo se retira el reflujo y se deja enfriar unos minutos A
continuacioacuten se antildeaden 30 mL de una disolucioacuten previamente preparada de
NaOH 2M en EtOH hasta que el pH es baacutesico y se lleva media hora maacutes a
reflujo Se deja enfriar la reaccioacuten se antildeade un poco de agua al matraz y se hace
una extraccioacuten acetato de etiloagua Se seca y se elimina el disolvente en el
rotavapor obteniendo un soacutelido impuro que se purifica solubilizando las
impurezas en diclorometano puesto que la oxima no es soluble en ese
disolvente El soacutelido que se obtiene se lava con eacuteter etiacutelico para su purificacioacuten
Se obtienen por este meacutetodo los compuestos de la Serie 8
Quiacutemica experimental
89
VII5 Purificacioacuten por cromatografiacutea flash
La cromatografiacutea manual en columna de vidrio tradicional ha sido uno de los
meacutetodos de purificacioacuten maacutes usados en quiacutemica orgaacutenica por ser un meacutetodo
praacutectico de bajo coste y controlado por el operario Por otro lado lleva asociado
algunos inconvenientes como la baja resolucioacuten y reproducibilidad teacutecnica
costosa en tiempo opciones de tipo de elucioacuten limitadas baja utilidad en
separacioacuten de muestras complejas y baja estandarizacioacuten del sistema por la falta
de automatizacioacuten La evolucioacuten para mejorar todos estos puntos deacutebiles pasa
por la automatizacioacuten del sistema que va desde la inyeccioacuten de la muestra hasta
la coleccioacuten automaacutetica que permite la realizacioacuten de otros trabajos durante la
separacioacuten de los compuestos Ademaacutes aumenta la reproducibilidad y la
productividad Seguacuten la muestra que purificar y sus caracteriacutesticas
fisicoquiacutemicas se ha de seleccionar las condiciones de trabajo del equipo de
cromatografiacutea flash
Fase estacionaria Existen disponibles comercialmente una gran variabilidad
de columnas con distintas fases estacionarias La maacutes usual que es tambieacuten la
empleada en este trabajo es la columna de siacutelica de fase normal Pero tambieacuten
se dispone de columnas C18 fase reversa columnas de aminas aluacutemina baacutesica
aluacutemina neutra ciano diol de intercambio anioacutenico y de intercambio catioacutenico
Las columnas de siacutelica de fase normal estaacuten formadas por un poliacutemero de oacutexido
de silicio entrecruzado tetraeacutedricamente En medio acuoso las valencias libres
de los aacutetomos de silicio adsorben grupos hidroxilos formando grupos silanol
polares en la superficie
Claacutesicamente para cada gramo de compuesto que va a ser purificado se pone
100 g de siacutelica gel (1 de carga) pero en el nuevo sistema las columnas estaacuten
preparadas para el 10 de carga En este trabajo se ha usado columnas de siacutelica
de 12 g de tamantildeo (tamantildeo de partiacutecula 35-70 microm y tamantildeo de poro 60 Aring con
una capacidad de muestra de 12 a 1200 mg con flujo oacuteptimo 25-40 mLmin y
volumen 168 mL
Fase moacutevil Al igual que la fase estacionaria la eleccioacuten de la fase moacutevil
depende de la muestra a purificar Existen diferentes gradientes de elucioacuten
siendo el gradiente binario el maacutes utilizado en la separacioacuten de compuestos
Controlando el gradiente se pueden obtener tiempos de elucioacuten menores
menor dependencia de los factores oacuteptimos de separacioacuten y mayor eficacia
repetitividad y pureza El gradiente elegido en este caso para la purificacioacuten de
compuestos es el isocraacutetico lineal donde se alternan periodos donde las
Ensayos Bioloacutegicos
90
proporciones de mezcla de solventes permanecen constantes en el tiempo con
otros periodos donde aumenta la proporcioacuten del solvente maacutes polar
Para la eleccioacuten del solvente adecuado se realiza un estudio previo del
desarrollo de los componentes en CCF ya que esto da una aproximacioacuten del
comportamiento de los componentes de la muestra en la columna durante la
purificacioacuten Se ha seleccionado la mezcla DCMmetanol en todos los casos de
purificacioacuten de compuestos por la buena separacioacuten de componentes que ha
mostrado No es posible la utilizacioacuten de metanol al 100 ya que se podriacutean
producir dantildeos en las columnas de fases estacionarias Ademaacutes la estabilidad
de las bombas tambieacuten podriacutea verse afectada por tanto ha de utilizarse como
fase moacutevil polar una mezcla DCMmetanol 8020
Longitud de onda de deteccioacuten La longitud de onda de deteccioacuten oacuteptima ha
de ser elegida seguacuten la estructura quiacutemica de la muestra En el caso de
arilaminoalcoholes se ha seleccionado como longitud de onda de deteccioacuten 254
nm que es la oacuteptima para aromaacuteticos En el caso de los derivados de las Series
3 4 y 5 (naftalenos) como el equipo ofrece la posibilidad de detectar dos
longitudes de onda se seleccionoacute la deteccioacuten a 365 nm como complementaria
Teacutecnicas de carga de muestra Las muestras son cargadas en el sistema en
estado soacutelido o en disolucioacuten dependiendo de la solubilidad que presenten a la
fase menos polar con la que se inicia la purificacioacuten En el caso de muestras
solubles al diclorometano se realiza una disolucioacuten con la miacutenima cantidad de
solvente posible y se inyectan en el equipo Si la muestra no es soluble al
diclorometano se realiza una disolucioacuten soacutelida en siacutelica gel 60 (0040-0063 nm
de tamantildeo de poro) Para ello se disuelve la muestra en un solvente adecuado y
se antildeade siacutelica Se elimina el disolvente a sequedad a vaciacuteo y se pone la muestra
en un cartucho vaciacuteo especial para este tipo de muestras desde donde el equipo
inyectaraacute automaacuteticamente la muestra
VVIIIIII EENNSSAAYYOOSS BBIIOOLLOacuteOacuteGGIICCOOSS
Ensayos bioloacutegicos
93
VIII1 Ensayos in vitro
Los compuestos descritos han sido ensayados por el Grupo Malaria de la
Universidad de Antioquiacutea en Medelliacuten (Colombia)
Los ensayos in vitro han sido realizaron en cepas sensibles a la CQ NF-54 y
Colombian FCR-3 de Plasmodium falciparum resistentes a la CQ Los cultivos se
desarrollaron a 37ordmC en una atmoacutesfera de CO2 al 5 y en un medio de glucosa
enriquecida RPMI 1640 con gentamicina a una concentracioacuten de 01 mgmL y
suero humano al 10 inactivado por calor como se describe en la bibliografiacutea
(Trager y Jensen 1976) Los compuestos se disuelven en dimetilsulfoacutexido
(DMSO) hasta completar un rango de concentraciones entre 200 y 01 microM La
concentracioacuten final de DMSO nunca es superior al 01
La actividad antimalaacuterica in vitro se mide utilizando el ensayo de
incorporacioacuten de hipoxantina tritiada (MP Biomedicals USA) seguacuten el meacutetodo
de Desjardins (Desjardins et alts 1979) El meacutetodo consiste en una medicioacuten
indirecta de la actividad metaboacutelica del paraacutesito por medio de la incorporacioacuten
de un precursor de aacutecidos nucleicos marcado radiactivamente El Plasmodium es
incapaz de sintetizar las purinas que necesita para su replicacioacuten obtenieacutendolas
de una fuente externa La utilizacioacuten del precursor de purinas marcadas
permitiraacute determinar la incorporacioacuten del material geneacutetico del paraacutesito y por
tanto se comportaraacute como marcador de la regeneracioacuten del mismo
Los ensayos se realizan por triplicado y los resultados se obtienen por
interpolacioacuten lineal (Huber y Koella 1993) Finalmente se expresan como CI50
(concentracioacuten que produce una inhibicioacuten del 50 del crecimiento plusmn la
desviacioacuten estaacutendar) siendo
Log (IC50) = log (X1) + (50-Y1)(Y2-Y1) [log (X2) ndash log (X1)]
Siendo X1 Concentracioacuten del compuesto que da un de inhibicioacuten de la
parasitemia Y1gt50 X2 Concentracioacuten de compuesto que da un de
inhibicioacuten de la parasitemia Y2lt50
El porcentaje de incorporacioacuten de hipoxantina unida al paraacutesito se calcula con la siguiente ecuacioacuten
hipoxantina incorporada = 100 ndash (PTx100)
Siendo P cuentas por minuto (cpm) para cada concentracioacuten T control
negativo (eritrocitos sin tratar)
Ensayos bioloacutegicos
94
VIII2 Ensayos toxicoloacutegicos
Los ensayos de citotoxicidad de los compuestos se realizaron en dos etapas
Inicialmente se llevaron a cabo en la Universidad Cayetano Heredia (UPCH) en
Lima Peruacute y posteriormente en la Universidad Paul Sabatier (Toulouse III) en
Toulouse Francia
La toxicidad de todos los compuestos se evaluaron en ceacutelulas epiteliales de
rintildeoacuten de mono African (Vero) Estas ceacutelulas fueron cultivadas con medio
DMEN F-12 (Cat Nordm BE12-719F) suplementado con 10 de suero fetal bovino
inactivado por calor NEAA piruvato de Na y mantenidas en una incubadora a
37 ordmC con una atmoacutesfera de 5 de CO2 La evaluacioacuten toxicoloacutegica se realiza en
placas de 96 pocillos de fondo plano adicionando 100 microL de cultivo de ceacutelulas
Vero a cada pocillo a una concentracioacuten de 10x105 ceacutelulaspocillo Los
compuestos se antildeadieron a diferentes concentraciones 100 microgmL 10 microgmL 1
microgmL y 01 microgmL y el efecto se evaluacutea 48 horas despueacutes de haber adicionado
el compuesto
El efecto se determinoacute usando el ensayo de viabilidad celular del MTT que
consiste en adicionar 10 microL de MTT a una concentracioacuten de 10 microgmL en las
placas que son colocadas nuevamente en la incubadora cubiertas con papel
aluminio durante el periodo de incubacioacuten Cuatro horas despueacutes de finalizado
el periodo de incubacioacuten se antildeade 100 microL de una solucioacuten de lisis que contiene
50 de isopropanol 10 de SDS y se deja reposar las placas a temperatura
ambiente en un orbital a 150 rpm durante 30 minutos
Finalmente se lee la densidad oacuteptica con un escaacutener de 96 pocillos a 590 nm
en un equipo Bio-Rad Todos los experimentos se realizan por triplicado
El dato de inhibicioacuten de crecimiento GI50 se determina por anaacutelisis de
regresioacuten linear definido como la concentracioacuten de compuesto que produce el
50 de reduccioacuten de absorbancia comparaacutendola con los controles
VIII3 Ensayos in vivo
Los procedimientos se desarrollaron siguiendo el manual de Teacutecnicas de
laboratorio para la seleccioacuten de sustancias antimalaacutericas (Deharo et alts 2000)
en el Laboratorio de Farmacologiacutea para el Desarrollo perteneciente al Instituto
para el Desarrollo (IRD) de la Universidad Paul Sabatier (Toulouse III) de
Toulouse (Francia)
Ensayos bioloacutegicos
95
VIII31 Instrumental y reactivos
Los estudios in vivo se llevaron a cabo seguacuten la legislacioacuten francesa sobre
cuidado y uso de animales de laboratorio vigente (Ndeg 008430) Se utilizaron
ratones macho IOPF Swiss de 4-6 semanas de vida con un peso de 20 2 g con
certificado negativo para Encephalitozoom cuniculi (Janvier Saint Berthevin
Francia) El animalario-bioterio de la Facultad de Farmacia de la Universidad
Paul Sabatier se encargoacute del cuidado de animales mantenimiento condiciones
ambientales de las instalaciones y eliminacioacuten del material bioloacutegico
Las cepas usadas tanto para los ensayos de virulencia como para los estudios
provienen de la reserva de material bioloacutegico del IRD De ahiacute se descongelaron
una cepa Plasmodium berghei NK65 y otra Plasmodium petteri que se encontraban
bien identificadas dentro de tanques de nitroacutegeno liacutequido en caacutemaras
refrigeradas del IRD
Los materiales empleados en el manejo animal fueron agujas Neolus de 05
mm y jeringas de 1 mL U100 Insulin de Tarumo Europe NV (Beacutelgica) Ademaacutes
se usoacute heparina Sigma H6263 (Alemania) suero fisioloacutegico esteacuteril Baxter
(Francia) y viales de plaacutestico con tapoacuten no esteacuteriles Para los frotis se usaron
laacuteminas portaobjetos de vidrio (Tarumo Europe NV Belgica) y metanol de
calidad HPLC Fisher Chemicals (Leicestershine Reino Unido) Para la
coloracioacuten se usoacute el reactivo Giemsa en polvo con glicerol de Sigma Ultra
(Steinheim Alemania) disolucioacuten tampoacuten de fosfato soacutedico dibaacutesico
heptahidratado y fosfato potaacutesico monobaacutesico anhidro de Sigma Aldrich
(Steinheim Alemania) en agua miliQ
Para la lectura de los frotis y conteo de hematiacutees se ha usado un microscopio
Leica DME (USA)
VIII32 Metodologiacutea
VIII321 Preparacioacuten de disolucioacuten Giemsa
La Giemsa es un colorante neutro compuesto de un colorante aacutecido (azul de
eosinato) y otro baacutesico (azul de metileno) que precipita con agua Lo que se
obtiene es un colorante neutro que no es soluble al agua pero si al alcohol
metiacutelico De forma inversa no es activo en solucioacuten metiacutelica pero siacute en
disolucioacuten acuosa Las ceacutelulas protozoarias disocian el colorante neutro el ADN
se tintildee de rojo y el citoplasma de azul Por las caracteriacutesticas comentadas ha de
Ensayos bioloacutegicos
96
ser utilizado con un tampoacuten para evitar que el pH de los medios de trabajo lo
precipite o inactive y con agua destilada calidad miliQ
Se pesan 076 g de polvo de Giemsa en un erlenmeyer y se pone suavemente
en agitacioacuten con 50 mL de glicerina y se deja hasta completa disolucioacuten a 60 ordmC
Una vez disuelto se deja enfriar y se le antildeaden 50 mL de metanol dejando la
disolucioacuten en agitacioacuten 12 horas Transcurrido el tiempo se deja reposar
protegido de la luz 7 diacuteas para finalizar con una filtracioacuten eliminando asiacute los
restos no disueltos Mientras se prepara una disolucioacuten tampoacuten fosfato con 02 g
de fosfato potaacutesico monobaacutesico anhidro y 05 g de fosfato soacutedico dibaacutesico
heptahidratado en un litro de agua MiliQ ajustaacutendose el pH a 74
Estas dos disoluciones no se mezclaraacuten hasta el momento de ser utilizadas
manteniendo la de Giemsa protegida de la luz Para su utilizacioacuten en un tubo
coacutenico de 50 mL se colocan 45 mL de la disolucioacuten tampoacuten de tampoacuten fosfato
y 5 mL de Giemsa y se homogenizan cuidadosamente dos veces por inversioacuten
Se cubre la muestra con el preparado y lo sobrante se desecha
Las disoluciones preparadas de Giemsa tienen un tiempo de vida corto ya
que con el paso del tiempo van precipitando y formaacutendose cristales que dantildean
la tincioacuten Debido a esto se recomienda preparar perioacutedicamente un nuevo
stock de colorante y nunca mezclar dos tipos diferentes puesto que cada
preparado tiene caracteriacutesticas propias que afectan el resultado en la coloracioacuten
VIII322 Tincioacuten con Panoacuteptico Raacutepido
Esta es una teacutecnica de tincioacuten por inmersioacuten a diferencia de la tincioacuten por
Giemsa que es por cobertura La ventaja es que es maacutes raacutepida y faacutecil de trabajar
cuando no se cuenta con un gran nuacutemero de laacuteminas para colorear El meacutetodo
consiste en la inmersioacuten sucesiva de la laacutemina que tentildeir en tres colorantes
consecutivamente En una primera cubeta Wertheim se pone una solucioacuten
alcohoacutelica de triarilmetano en la segunda cubeta se pone una solucioacuten
tamponada de xanteno y en la tercera una tamponada de tiazina
Las laacuteminas con las muestras fijadas se sumergen verticalmente y en el mismo
sentido que se ha extendido la muestra en la primera cubeta realizando
movimientos regulares verticales durante unos segundos Se sacan de la cubeta
y se espera que escurran el colorante sobrante Este procedimiento se repite en
las tres cubetas teniendo especial cuidado en la uacuteltima donde se debe asegurar
la homogeneidad de la tincioacuten sin exceso de coloracioacuten Finalmente se lava con
agua se dejan secar al aire para ser analizadas al microscopio
Ensayos bioloacutegicos
97
VIII323 Realizacioacuten de un frotis
Se denomina frotis a la extensioacuten de una muestra o cultivo que se realiza
sobre un portaobjetos con objeto de separar lo maacutes posible los microorganismos
o componentes sanguiacuteneos y para obtener de ellos una imagen clara y niacutetida al
microscopio
La muestra ha de ser fijada al vidrio del portaobjetos sin que la muestra sea
arrastrada en los lavados para poder aplicar despueacutes sobre eacutel meacutetodos de
tincioacuten que permiten la observacioacuten al microscopio de las ceacutelulas En la
actualidad los portaobjetos utilizados se comercializan limpios y esterilizados
para su uso inmediato
En primer lugar se toma un portaobjetos nuevo y se rotula adecuadamente
Con unas tijeras esterilizadas se hace un pequentildeo corte en la punta de la cola
del ratoacuten y se presiona para conseguir una gota de sangre que es recogida en el
centro de un extremo del portaobjetos Raacutepidamente con el filo de otro
portaobjetos se extiende la gota arrastraacutendola suavemente por la superficie del
primer portaobjetos para conseguir una peliacutecula lo maacutes homogeacutenea posible
tratando de cubrir toda la superficie de la laacutemina Posteriormente se pone el
portaobjetos horizontal y se cubre con metanol se deja secar con cuidado al aire
y se guarda la muestra hasta la tincioacuten el tiempo que sea necesario
Asiacute tentildeida la muestra se puede proceder a su lectura para calcular el
porcentaje de parasitemia ( parasitemia paraacutemetro que indica el nivel de
infeccioacuten de la sangre de un ratoacuten) mediante el conteo manual de los hematiacutees
sanos y los parasitados Se hace un conteo de veinte campos elegidos de forma
que los hematiacutees no se solapen y aproximadamente contengan la misma
cantidad de unidades El tanto por ciento de parasitemia se calcula aplicando la
siguiente foacutermula
Siendo H infectados hematiacutees infectados H sanos hematiacutees sanos
Ensayos bioloacutegicos
98
iquestQueacute se puede ver en un frotis al microscopio
En un frotis de ratoacuten sano se pueden ver
Trozos de cristales de colorante si el vidrio no ha sido lavado lo
suficiente
Hematiacutees o gloacutebulos rojos o eritrocitos
Leucocitos o gloacutebulos blancos Estos se colorean con la tincioacuten
porque tiene carga geneacutetica y los hematiacutees no En ocasiones puede
confundirse un hematiacutee joven y un leucocito porque los hematiacutees
joacutevenes conservan restos de nuacutecleo pero se diferencian en nuacutemero
y tamantildeo Los leucocitos son menos numerosos y de mayor
tamantildeo ademaacutes en la tincioacuten quedan anteriormente tentildeidos de
morado con una aureola azul
En un ratoacuten infectado se puede observar
Hematiacutees sanos
Hematiacutee joven
Esquizonte joven que puede confundirse con un hematiacutee joven
Esquizonte desarrollado
Esquizonte agotado Es el momento previo a la ruptura del
espacio y la liberacioacuten de trofozoiacutetos libres que continuaran con la
infeccioacuten
Trofozoiacutetos libres que pueden confundirse con plaquetas
Hematiacutees en invasioacuten
Figura 49 Vista al microscopio de un frotis de sangre infectada por Plasmodium32
32 Disponible en httpwwwelrincondelamedicinainternacom2011_05_16_archivehtml
Ensayos bioloacutegicos
99
VIII324 Preparacioacuten y lectura en la caacutemara Malassez
La caacutemara se usa para hacer el conteo de hematiacutees totales Se cubre la
cuadriacutecula de la caacutemara con la muestra de sangre heparinizada con la ayuda de
una micropipeta y por capilaridad se llena la cuadriacutecula de conteo Como la
disolucioacuten tiene caraacutecter tridimensional y en el microscopio las lecturas son
bidimensionales se pone la ceacutelula en una caacutemara huacutemeda durante diez minutos
para que la muestra sedimente y no se deshidrate durante el proceso Pasado el
tiempo se pone la caacutemara de Malassez al microscopio y con cuarenta aumentos
y se hace el recuento manual de hematiacutees por mm3 de sangre Con el valor
promedio y teniendo en cuenta la dilucioacuten y el volumen de la caacutemara es posible
calcular la densidad de gloacutebulos rojos (GR) en la sangre de un ratoacuten sano
mediante la siguiente ecuacioacuten
GRmm3= GR promedio x dilucioacuten muestra x volumen celda
Siendo GR promedio promedio de hematiacutees dilucioacuten muestra valor fijo de
200 (10 microL en 2 mL) volumen volumen de la celda valor fijo 100 mm3
EL valor medio de hematiacutees de un ratoacuten sano es 5 millones de hematiacutees por
mm3
Una caracteriacutestica de la enfermedad es la anemia asiacute un ratoacuten infectado que
ha desarrollado la enfermedad presenta una disminucioacuten aproximada de un 75
en el nuacutemero de hematiacutees con respecto al ratoacuten sano por conteo en caacutemara
Malassez
VIII325 Ensayos de virulencia
Para este estudio es necesario tener al paraacutesito y al hueacutesped En este caso se
utilizaraacuten dos especies diferentes de paraacutesito que producen la enfermedad de la
malaria como son Plasmodium berghei NK65 y Plasmodium vinckei petteri
provenientes de la reserva del IRD Estas dos especies son capaces de infectar
roedores por lo que el hueacutesped seraacute un grupo de veinte ratones machos IOPF
Swiss
Descongelacioacuten de cepas y activacioacuten de paraacutesitos
Cuando se descongela una cepa no tiene mucha capacidad de infeccioacuten
(virulencia) sino que esta va en aumento con el paso de los diacuteas Por otro lado
es probable que los ratones inoculados no lleguen a desarrollar la enfermedad
porque la muestra haya sido mal conservada o se haya degradado demasiado
Ensayos bioloacutegicos
100
en el friacuteo que es lo que ocurrioacute experimentalmente con la cepa de P vinckei
petteri En este caso se esperan 10 diacuteas despueacutes de la inoculacioacuten y se
monitoriza al ratoacuten para observar si hay progresioacuten de la infeccioacuten de no ser
asiacute debe realizarse una revisioacuten de los tanques de almacenamiento para
descartar las muestras anteriores a la fecha de congelacioacuten de la muestras que
presentaron problemas ya que pueden estar en igual o en peores condiciones
El estudio comienza con la descongelacioacuten de una cepa de Plasmodium berghei
NK65 a temperatura ambiente mientras se extraen 10-20 microL (45 gotas) de sangre
de cola de ratoacuten sano Este volumen se mezcla inmediatamente con una gota de
heparina con el fin de evitar la coagulacioacuten de la sangre extraiacuteda La sangre
heparinizada se diluye 1200 en un vial esteacuteril con tapoacuten con 4 mL de suero
fisioloacutegico para devolver las ceacutelulas sanguiacuteneas a un medio parecido al normal
y que no se produzcan procesos de oacutesmosis que destruyan la muestra Cerrar el
vial y guardar la muestra
Cuando este descongelado el vial con la cepa se toma con una jeringa el
volumen contenido en el vial y se divide en dos para ser inyectado viacutea
intraperitoneal en dos ratones separados previamente del grupo Estos ratones
se separan del grupo en una celda identificada con la fecha de infeccioacuten la cepa
y la especie que contiene para observar la progresioacuten de la infeccioacuten La sangre
heparinizada se usa para un primer conteo del nuacutemero de hematiacutees en
ejemplares sanos cuyo recuento se realiza con cuadriacutecula doble en la ceacutelula o
caacutemara de Malassez A los tres diacuteas de la inoculacioacuten se hace un control del
estado de los dos ratones infectados tanto visual como sanguiacuteneo Los siacutentomas
externos de la enfermedad son peacuterdida de coloracioacuten en los ojos y orejas pelo
erizado ademaacutes de peacuterdida de peso y aglomeracioacuten entre ellos por causa de la
fiebre Tambieacuten se realiza un frotis para calcular la parasitemia
Cuando los ratones infectados desarrollen la enfermedad se infecta con su
sangre a otros dos ratones sanos de forma que ademaacutes de conocer coacutemo se
desarrolla el paraacutesito se garantice que tendraacuten la fuerza suficiente para
comenzar los ensayos de actividad De esta forma no es necesario conocer la
parasitemia basta con saber que la cepa estaacute viva Asiacute se realiza un frotis
control positivo con sangre de la cola del ratoacuten y del mismo sitio se obtendraacuten
20 microL de sangre que se hepariniza y disuelve en 1 mL de suero Se puede
conocer el buen estado de esta disolucioacuten visualmente si se observa un color
rojo muy claro ya que indica que no se ha producido hemoacutelisis Este nuevo
grupo de ratones infectados son los ratones fuente
Ensayos bioloacutegicos
101
El volumen de la disolucioacuten anterior se pone en una jeringa para ser
inyectado en dos ratones sanos que tambieacuten se aiacuteslan para controlar coacutemo
evoluciona la infeccioacuten
Diariamente se realiza un frotis control a los diferentes grupos de ratones
infectados para registrar la evolucioacuten de la parasitemia ya que algunos
evolucionaraacuten muy raacutepido y moriraacuten mientras que otros no mostraraacuten la
enfermedad
Ensayos de virulencia
El quinto diacutea desde la inoculacioacuten del paraacutesito vivo en los ratones fuente se
procede a calcular la parasitemia En este momento se infecta a un nuevo grupo
de 5 ratones En esta ocasioacuten la infeccioacuten seraacute controlada y se procederaacute a una
infeccioacuten con un nuacutemero de paraacutesitos determinado Para estos ensayos
normalmente se inoculan 107 paraacutesitos por ratoacuten por tal motivo es necesario
conocer previamente el nuacutemero de paraacutesitos en la sangre del ratoacuten fuente
sabiendo esto se puede calcular la cantidad de paraacutesitos necesarios para
inocular a todos los grupos de ratones experimentales seguacuten la siguiente
ecuacioacuten
Para preparar las cantidades necesarias de sangre infectada heparina y suero
fisioloacutegico necesarias para desarrollar el ensayo de virulencia se deben tener en
cuenta los cinco ratones disponibles a los que se antildeade un sexto ratoacuten hipoteacutetico
con el que se tienen en cuenta las peacuterdidas de disoluciones durante los
procedimientos experimentales Seraacuten necesarios 10 microL de sangre del ratoacuten
fuente para inyectar a cada ratoacuten del ensayo El procedimiento de extraccioacuten de
sangre e infeccioacuten del grupo es el mismo
Durante todo este proceso es preciso llevar un seguimiento diario de la
parasitemia para observar el grado de virulencia del paraacutesito Los resultados
del comportamiento del paraacutesito son aproximados debido al aumento de la
parasitemia en los sucesivos ensayos
Por queacute un seguimiento previo del desarrollo de la infeccioacuten
El desarrollo de los paraacutesitos en individuos infectados no se produce siempre
de igual forma por lo que si se parte de cepas congeladas es necesaria una
primera activacioacuten del paraacutesito (primera infeccioacuten) y una posterior reactivacioacuten
del paraacutesito (infecciones sucesivas) a partir de la primera infeccioacuten
Ensayos bioloacutegicos
102
Las diferencias de desarrollo se deben a tres factores principalmente
1- Viacutea intraperitoneal Es una viacutea menos precisa que la viacutea intravenosa
porque no hay una localizacioacuten exacta de la inyeccioacuten de la sangre
infectada Todos los ratones tienen la misma capacidad de respuesta pero
no se puede controlar la respuesta del ratoacuten por esta viacutea de inoculacioacuten
Por viacutea intravenosa se asegurariacutea su introduccioacuten en el hiacutegado pero por
las por las caracteriacutesticas aproximativas de los ensayos y queda
descartada
2- Raza Swiss Este tipo de ratoacuten no es monoclonal por tanto todos los
individuos son diferentes entre siacute De ahiacute se deduce que la respuesta seraacute
distinta en cada uno de ellos El objetivo de los ensayos realizados es
encontrar un nuevo compuesto que revierta cualquier tipo de
parasitemia como hace la CQ de manera que la variabilidad del sistema
no sea influyente
3- Enzephalitozoom Cuniculli Es un paraacutesito de roedor que puede interferir
cruzadamente con el Plasmodium lo que hace que los ensayos no sean
fiables En la actualidad este factor no se tiene en cuenta ya que todos los
lotes de ratones adquiridos traen consigo el certificado de anaacutelisis de la
empresa que los suministra
Una vez conocido coacutemo se desarrolla el paraacutesito de la cepa elegida se
comienza con la infeccioacuten de otro grupo de ratones Esta infeccioacuten se realiza con
el objetivo de tener ratones fuente disponibles el diacutea que se ha de comenzar el
ensayo Del mismo modo la sangre de los ratones infectados es usada para la
congelacioacuten de nuevas cepas
VIII326 Ensayos de actividad Test de Peters
El test claacutesico de supresioacuten de 4 diacuteas (Peters y Robinson 1999) da comienzo
una vez que se conoce coacutemo se va a desarrollar previsiblemente la cepa elegida
En este ensayo dicha cepa es Plasmodium berghei NK65 inoculada en 100 ratones
macho tipo Swiss con un peso de 20 2 g Se distribuyen en 10 grupos de 10
individuos identificados de la siguiente manera
-Grupo Negativo 10 ratones que seraacuten tratados con el medio de dilucioacuten de
los compuestos que ensayar En esta ocasioacuten el medio de dilucioacuten es DMSO
utilizado a una dosis maacutexima de 100 microL por ratoacuten y diacutea
Ensayos bioloacutegicos
103
-Grupo Positivo 10 ratones que seraacuten tratados con 40 microg de CQ en 100 microL
DMSO (2 mg por kg)
-Grupos de A1 al A4 Cuatro grupos de 10 ratones que seraacuten tratados con uno
de los compuestos que ensayar a dosis de 40 20 10 y 5 mgkg respectivamente
-Grupos del B1 al B4 Cuatro grupos de 10 ratones que seraacuten tratados con el
otro compuesto que ensayar a dosis 40 20 10 y 5 mgkg respectivamente
El ensayo parte de la determinacioacuten de la parasitemia y de un conteo de
hematiacutees por ceacutelula Malassez de ratones fuente para conocer queacute cantidad de
sangre se necesita para realizar una infeccioacuten controlada y simultaacutenea de los
cien ratones con ceacutelulas parasitadas con 107 ceacutelulas parasitadasratoacuten en una
solucioacuten salina al 09 por viacutea intraperitoneal
La extraccioacuten se realiza por puncioacuten seno retro-orbital ya que el volumen de
sangre que se necesita es superior al que se puede obtener por puncioacuten de la
vena de la cola La muestra se trata de la misma forma que lo explicado
anteriormente y se procede a la infeccioacuten de la totalidad de los individuos
Trascurridas dos horas se comienza con la administracioacuten del tratamiento
especiacutefico de cada grupo en lo que se denomina Diacutea 0 En dicho momento se
realiza la administracioacuten del tratamiento todos los diacuteas siguientes a la misma
hora y con el mismo procedimiento El tratamiento se aplica viacutea subcutaacutenea en
la parte interna de las patas traseras Con esto evitamos que se produzca
toxicidad o necropsia de alguacuten oacutergano del peritoneo Tambieacuten se alterna la pata
donde se inyecta el tratamiento para asegurarse de que no se produzca una
necrosis por toxicidad debida a la acumulacioacuten del producto por una mala
difusioacuten Si un producto no es toacutexico podriacutea acumularse pero no necrosar y
esto tambieacuten podriacutea observarse como un bulto debajo de la piel
Durante el transcurso del test se ha de llevar a cabo un seguimiento visual de
la posible respuesta externa de los ratones a la administracioacuten de los
compuestos anotando cambios en el comportamiento de los ratones
irritaciones deacutermicas en diferentes zonas prestando especial atencioacuten a la zona
donde se produce la inyeccioacuten del tratamiento falta de movilidad y cambios
morfoloacutegicos como disminucioacuten de la temperatura peacuterdida de peso o pelo
cambios en la pigmentacioacuten de la piel
Pasados cinco diacuteas o Diacutea 4 se realiza un frotis a todos los ratones
supervivientes para calcular la parasitemia en sangre perifeacuterica Se comprueba
la inhibicioacuten de la parasitemia para calcular la dosis letal (DL50) determinada
Ensayos bioloacutegicos
104
por anaacutelisis de regresioacuten lineal de miacutenimos cuadrados Una vez pasado el
tiempo del Test de Peters los ratones supervivientes seguiraacuten siendo
observados en los siguientes diacuteas lo que se denomina Test Rane Esto sirve para
la determinacioacuten de la actividad esquizonticida en vivo comparando de la
mortalidad de los ratones del grupo negativo con el resto de grupos
Durante la realizacioacuten de los ensayos los ratones que mueren son desechados
seguacuten los protocolos normalizados del animalario (bioterio) en el que se
realizan todos los procedimientos experimentales
IIXX EESSTTUUDDIIOOSS CCOOMMPPUUTTAACCIIOONNAALLEESS
Estudios Computacionales
107
IX1 Propiedades fisicoquiacutemicas de los compuestos
Para los caacutelculos de las propiedades fisicoquiacutemicas de los compuestos se
utilizoacute el Laboratorio de Quiacutemica Computacional Virtual33 (Tetko et alts 2005)
y la herramienta de caacutelculo de propiedades online Molinspiration34 (Ertl et alts
2000)
Los datos obtenidos fueron utilizados para establecer una aproximacioacuten
teoacuterica del comportamiento de los compuestos en tratamientos orales Los
estudios se centraron en la obtencioacuten de las caracteriacutesticas de absorcioacuten de cada
compuesto que depende de otros factores como liposolubilidad fuerzas polares
moleculares y caracteriacutesticas propias de la estructura molecular
El coeficiente de particioacuten octanolagua estaacute asociado a la solubilidad y se
calculoacute desde MLog P miLogP AlogP KOWLogP y ABlogP Las
caracteriacutesticas estructurales de la moleacutecula como tamantildeo y posibilidad de giro
de enlaces tambieacuten influyen en la absorcioacuten Las caracteriacutesticas polares son
importantes para la absorcioacuten porque intervienen en la lipofilia de los
compuestos asiacute se desprende del estudio de los enlaces aceptores y receptores
de enlaces polares y del TPSA Se puede obtener asiacute una aproximacioacuten al
porcentaje de absorcioacuten (Zhao et alts 2002) de los compuestos en la membranas
celulares
Los compuestos que a su vez cumplen las Reglas de Lipinski (Lipinski et alts
1997) son buenos candidatos para ofrecer buenas cualidades en la
administracioacuten oral
IX2 Optimizacioacuten geomeacutetrica
Los estudios computacionales de Modelizacioacuten y Docking35 se llevaron a
cabo para compuestos liacutederes en los Laboratorios de Investigacioacuten y Desarrollo
de la Facultad de Ciencias y Filosofiacutea de la Universidad Peruana Cayetano
Heredia (UPCH) Lima (Peruacute)
33 httpwwwvcclaborg 34 httpwwwmolinspirationcomservicespropertieshtml 35 Docking (del ingleacutes anclarse) En el campo del Modelado molecular este es un meacutetodo que predice la conformacioacuten preferida de un moleacutecula al estar unida a otra con el fin de formar un complejo estable1 El conocimiento de la orientacioacuten preferida a su vez puede ser usada para predecir la fuerza de la asociacioacuten o la afinidad de enlace entre dos moleacuteculas usando por ejemplo las funciones de puntuacioacuten (o funciones de scoring)
Estudios Computacionales
108
El compuesto maacutes activo se sometioacute a estudios de modelizacioacuten para
optimizar la geometriacutea y determinar los potenciales electrostaacuteticos de la
moleacutecula Para esto se usoacute el caacutelculo mecaacutenico Quantum en concreto el
programa Gaussian36 de quiacutemica cuaacutentica y el set baacutesico HF3-21G El Potencial
molecular electrostaacutetico (MEP) fue computerizado por la densidad electroacutenica
y fue calculado a partir de datos del software Molekel37 (Fluumlckigel et alts 2008)
IX3 Estudios de Acoplamiento Molecular (Docking)
El programa ICM38 de modelizacioacuten se usoacute para determinar el potencial
modo de unioacuten entre los compuestos maacutes activos y la enzima diana
previamente estudiada en estudios anteriores la plasmepsina II del Plasmodium
Ensayos anteriores mostraban la cristalizacioacuten de la enzima plasmepsina II con
un compuesto denominado EH58 (N-(3-[(2-benzo[13]dioxol-5-yl-ethyl)[3-(1-
methyl-3-oxo-13-dihydro-isoindol-2-yl)-propionyl]-amino]-1-benzyl-2-
(hydroxypropyl)-4-benzyloxy-35-dimethoxy-benzamide Figura 50) (Asojo et
alts 2003)
Figura 50 Imagen de la interaccioacuten del compuesto EH-58 y la plasmepsina II39
Seguacuten datos publicados posteriormente se demostroacute que la enzima presenta
un hueco activo donde pueden introducirse diferentes moleacuteculas y establecer
interacciones que inhiben su actividad En el caso de los derivados estudiados
se planteoacute la posible unioacuten de estos al resto polar del aminoaacutecido aspartato
(ASP) de las posiciones 214 y 34 de sitio activo de la enzima (Bjelic et alts
36 Gaussian Inc Pittsburg PA 2003 37 httpwwwcscschmolekel 38 versioacuten3 4-8 La Jolla CA Molsoft LLC 2006 39 Disponible en Asojo et alts 2003
Estudios Computacionales
109
2007) En primer lugar para validar la metodologiacutea y comprobar la capacidad
del programa ICM para estudiar los modos de enlace de los inhibidores en el
sitio de unioacuten de la enzima el complejo EH50-plasmepsina II40 fue reacoplado
mediante caacutelculos computacionales De acuerdo con la bibliografiacutea (Cunico et
alts 2009a b y Mendoza et alts 2011) en los estudios de acoplamiento se
considera como vaacutelidos los valores de desviacioacuten de la media cuadraacutetica
(RMSD) entre 30 a 40 Aring
Las estructuras se prepararon siguiendo la metodologiacutea ICM (Abagyan et
alts 1994) y se dibujaron con el editor molecular del software41 Asiacute las
estructuras de los compuestos y la proteiacutena fueron convertidas a objetos ICM
Durante este proceso de conversioacuten de la proteiacutena se antildeadieron hidroacutegenos
para proceder despueacutes con una optimizacioacuten geomeacutetrica Ademaacutes las
representaciones en dos dimensiones fueron convertidas a tres dimensiones
asignando cargas parciales y asignando enlaces rotatorios
De acuerdo con estudios previos (Mendoza et al 2011 y Cunico et al 2009b)
los aminoaacutecidos que conforman el sitio activo son la ASP 34 y la ASP 214
El programa buscador de cavidades del sistema ICM42 se usoacute para identificar
el sitio activo con un valor de tolerancia de 46 Aring La posicioacuten y orientacioacuten
inicial del ligando y el tamantildeo y posicioacuten del hueco fueron escogidos de
acuerdo con los valores sugeridos por el sistema
Los modos de unioacuten calculados con al menos un enlace por puentes de
hidroacutegeno con alguno de los aspartatos que conforman el sitio cataliacutetico se
consideraron como los maacutes representativos y tomados en cuenta para su
anaacutelisis (Kasam et alts 2007 y Aringqvist et alts 1994) El acoplamiento planteado
para cada ligando fue analizado estudiaacutendose su energiacutea total relativa La
conformacioacuten maacutes favorable energeacuteticamente se seleccionoacute como mejor
posicioacuten espacial
40 Protein Data Bank PDB code 1LF3 wwwrcsborg 41 Molecular Editor versioacuten 25 La jolla CA Molsoft LLC 2006 42 ICM Pocket Finder An et alts 2005
RESULTADOS Y
DISCUSIOacuteN
XX DDEESSCCRRIIPPCCIIOacuteOacuteNN DDEE CCOOMMPPUUEESSTTOOSS
Descripcioacuten de Compuestos
115
X1 Siacutentesis de precursores
(Benzo[b]tiofen-3-il)-3-cloropropan-1-ona
Procedimiento experimental
Sobre 205 g de AlCl3 (015 mmol) disueltos en 150 mL de diclorometano seco y
en atmoacutesfera de N2 se antildeade gota a gota una disolucioacuten de 1878 g de
benzo[b]tiofeno (140 mmol) y 159 mL de cloruro de 3-cloropropionilo (140
mmol) disueltos en 50 mL de diclorometano seco A continuacioacuten se antildeaden
tambieacuten gota a gota 95 mL de aacutecido sulfuacuterico en 150 mL de agua Se realiza
extracciones con diclorometano La fase orgaacutenica se seca con trazas de sulfato
soacutedico anhidro y se elimina el disolvente a presioacuten reducida Se obtiene un
aceite que se purifica por cromatografiacutea en columna empleando una mezcla de
hexanoacetato de etilo como fase moacutevil en gradiente hasta (955) El producto
se precipita con hexano friacuteo
Punto de fusioacuten 55-57ordmC
IR (cm-1) 1655 (mf CO)
RMN-1H (CDCl3 400 MHz) δ (ppm) 343 (m 2H CH2-CO) 386 (c 2H CH2-
Cl) 732-748 (m 2H H5 + H6) 780 (d 1H H4 J45= 76 Hz) 824 (s 1H H2 ) 847
(d 1H H7 J76= 73 Hz)
Anaacutelisis elemental (CHN)
Calculado Hallado
C 5879 5845
H 400 396
N 000 000
FM C11H9 ClOS PM 2245 APARIENCIA Soacutelido blanco RENDIMIENTO 86
Descripcioacuten de Compuestos
116
Tert-butil 4-(4-nitro-2-trifluorometilfenil)piperazin-1-carboxilato
Procedimiento experimental
Seguacuten el meacutetodo A a partir de 2 g de 2-fluacuteor-5-nitro-1-(trifluorometil)benceno
(956 mmol) y 25 g de tert-butil piperacin-1-carboxilato (1342 mmol) se obtiene
un residuo que se lava con hexano y se usa en la reaccioacuten siguiente sin maacutes
purificaciones
Punto de fusioacuten 136ndash138 ordmC
IR (cm-1) 2982-2751 (m C-H alifaacuteticos) 1685 (mf CO) 1530 y 1350 (m NO2)
1280 y 1155 (mf CF3)
RMN-1H (CDCl3 400 MHz) δ (ppm) 150 (s 9H C(CH3)3) 308 (dd 4H H3+H5
PIPZ) 362 (dd 4H H2+H6 PIPZ) 732 (d 1H H6 FENIL J65= 90 Hz) 837 (dd
1H H5 FENIL J56= 90 Hz J53= 28 Hz) 855 (d 1H H3 FENIL J35= 27 Hz)
(4-nitro-2-trifluorometilfenil)piperazina
Procedimiento experimental
Seguacuten el meacutetodo B usando amina protegida se obtiene un aceite que precipita
con hexano en friacuteo obtenieacutendose un polvo amarillo intenso
Punto de fusioacuten 97-99ordmC
IR (cm-1) 3380 (f NH) 2982-2751 (m C-H alifaacuteticos) 1685 (mf CO) 1530 y 1350
(m NO2) 1280 y 1155 (mf CF3)
RMN-1H (CDCl3 400 MHz) δ (ppm) 212 (s 1H NH) 306-308 (m 4H H2+H6
PIPZ) 313-315 (m 4H H3+H5 PIPZ) 730 (d 1H H6 FENIL J65= 90 Hz) 835
(dd 1H H5 FENIL J56= 90 Hz J53= 26 Hz) 853 (d 1H H3 FENIL J35= 26 Hz)
FM C16H20N3F3O4
PM 3751 Apariencia Soacutelido amarillo Rendimiento 75
FM C11H12N3F3O2
PM 2751 Apariencia Soacutelido amarillo Rendimiento 75
Descripcioacuten de Compuestos
117
Tert-butil 4-(4-nitro-2-trifluorometilfenil)-14-diazepan-1-carboxilato
Procedimiento experimental
Seguacuten el meacutetodo A a partir de 2 g de tert-butil 14-diazepan-1-carboxilato (999
mmol) y 108 g de 1-fluacuteor-2-nitro-4-(trifluorometil)benceno (516 mmol) se
obtiene un residuo que se lava con eacuteter etiacutelico y se usa en la reaccioacuten siguiente
sin maacutes purificacioacuten
Punto de fusioacuten 197ndash198 ordmC
IR (cm-1) 2982-2751 (m C-H alifaacuteticos) 1694 (mf CO) 1524 y 1346 (m NO2)
1283 y 1154 (mf CF3)
RMN-1H (DMSO-d6 400 MHz) δ (ppm) 208-211 (q 2H H6 DZP) 324 (sa
2H H2 DZP) 330 (sa 2H H7 DZP) 344 (t 2H H5 DZP) 363 (t 2H H3 DZP)
756 (d 1H H6 FENIL J65= 99Hz) 839-845 (m 2H H3+H5 FENIL)
(4-nitro-2-trifluorometil)fenil)-14-diazepan
Procedimiento experimental
Seguacuten el meacutetodo B usando amina protegida se obtiene un aceite que precipita
con eacuteter etiacutelico en friacuteo
Punto de fusioacuten 121ndash123 ordmC
IR (cm-1) 3352 (m NH) 2938-2850 (m C-H alifaacuteticos) 1581 y 1331 (mf CF3)
RMN-1H (CDCl3 400 MHz) δ (ppm) 174 (sa 1H NH) 192-197 (m 2H H6
DZP) 303-309 (m 4H H3+H5 DZP) 350-357 (m 4H H2+H7 DZP) 721 (d 1H
H6 FENIL J65= 93 Hz) 825 (dd 1H H5 FENIL J56= 92 Hz J53= 28 Hz) 853
(d 1H H3 FENIL J35= 28 Hz)
FM C17H22N3F3O4
PM 3893 Apariencia Soacutelido amarillo Rendimiento 77
FM C12H14N3F3O2
PM 2893 Apariencia Soacutelido amarillo Rendimiento 75
Descripcioacuten de Compuestos
118
Tert-butil 1-(4-nitro-2-trifluorometilfenil)-(S)-pirrolodin-3-ilcarbamato
Procedimiento experimental
Seguacuten el meacutetodo A a partir de 127 g (686 mmol) de tert-butil-(S)-pirrolidin-3-ilcarbamato y
072 g (343 mmol) de 2-fluor-5-nitro-1-(trifluorometil) benceno El residuo obtenido se precipita
y se lava con hexano
Punto de fusioacuten 115 ndash 117 ordmC
IR (cm-1) 3349 (f NH) 2981-2880 (d C-H alifaacuteticos) 1680 (mf CO) 1507 y 1326 (m NO2) 1273 y
1120 (f CF3)
RMN-1H (CDCl3 400 MHz) δ (ppm) 148 (s 9H C(CH3)3) 199-207 (m 1H H4ec PIRR) 226-
235 (m 1H H4ax PIRR) 342(c 1H H2ec PIRR) 359-365 (m 1H H5ax PIRR) 368-374 (m 1H
H5ec PIRR) 384 (c 1H H2ax PIRR) 438 (sa 1H NH) 470 (sa 2H H3 PIRR) 683 (d 1H H6
FENIL J65 = 95 Hz) 820 (dd 1H H5 FENIL J56 = 94 Hz J53 = 27Hz) 856 (d 1H H3 FENIL
J35= 27 Hz)
1-(4-nitro-2-trifluorometilfenil)-(S)-pirrolidin-3-il amina
Procedimiento experimental
Seguacuten el meacutetodo B usando la amina protegida se obtiene un aceite que precipita
con hexano en friacuteo Se identifica y se usa sin maacutes purificaciones en la siguiente
reaccioacuten
Punto de fusioacuten 64ndash66 ordmC
IR (cm-1) 3359 (d NH) 2943-2851 (d C-H alifaacuteticos) 1505 y 1317 (mf NO2) 1105 (mf CF3)
RMN-1H (CDCl3 400 MHz) δ (ppm) 149 (sa 2H NH2) 183-191 (m 1H H4ec
PIRR) 219-226 (m 1H H4ax PIRR) 327-330 (m 1H H2ec PIRR) 358-363 (m
1H H5ax PIRR) 375-381 (m 4H H2ax+H3+H5ec PIRR) 683 (d 1H H6 FENIL
J65= 95 Hz) 819 (dd 1H H5 FENIL J56= 95 Hz J53= 27 Hz) 856 (d 1H H3
FENIL J35= 27 Hz)
FM C16H20N3F3O4
PM 37521 Apariencia Soacutelido amarillo Rendimiento 71
FM C11H12N3F3O2
PM 2751 Apariencia Soacutelido marroacuten claro Rendimiento 83
Descripcioacuten de Compuestos
119
Tert-butil 1-(4-nitro-2-trifluorometilfenil)piperidin-4-ilcarbamato
Procedimiento experimental
Seguacuten el meacutetodo A a partir de 241 g de tert-butil piperidin-4-ilcarbamato (1203 mmol) y 214 g
de 1-fluacuteor-4-nitro-2-(trifluorometil)benceno (1023 mmol) El residuo obtenido se lava con
hexano
Punto de fusioacuten 120ndash122 ordmC
IR (cm-1) 3431 (m NH) 2979-2798 (m C-H alifaacuteticos) 1707 (mf CO) 1500 y 1341 (mf NO2)
1118 (f CF3)
RMN-1H (CDCl3 400 MHz) δ (ppm) 147 (s 9H C(CH3)3) 162 (dd 2H H3ax+H5ax PIPR J3ax3ec
= J5ax5ec = 113 Hz J3ax2ax = J5ax6ax = 35 Hz) 209 (d 2H H3ec+H5ec PIPR J3ec3ax = J5aec5ax = 121 Hz)
296 (td 2H H2ax+H6ax PIPR J2ax2ec = J6ax6ec = J2ax3ax = J6ax5ax = 125 Hz J2ax3ec = J6ax5ec = 19 Hz) 335
(d 2H H2ec+H6ec PIPR J2ec2ax = J6ex6ac =125 Hz) 366 (sa 1H H4 PIPR) 456 (sa 1H HN) 728 (d
1H H6 PIPR J65= 90 Hz) 832 (dd 1H H5 FENIL J56= 90 Hz J53 = 27 Hz) 851 (d 1H H3
FENIL J35 = 27 Hz)
1-(4-nitro-2-trifluorometilfenil)piperidin-4-il amina
Procedimiento experimental
Seguacuten el meacutetodo B usando la amina protegida se obtiene un aceite que precipita con
hexano en friacuteo Se identifica y se usa sin maacutes purificaciones en la siguiente reaccioacuten
Punto de fusioacuten 24-25 ordmC
IR (cm-1) 2938-2847 (m C-H alifaacuteticos) 1499 y 1334 (mf NO2) 1119 (mf CF3)
RMN-1H (CDCl3 400 MHz) δ (ppm) 152 (sa 1H NH2) 151-162 (m 2H H3ax+H5ax
PIPR) 195 (d 2H H3ec+H5ec PIPR J3ax3ec = J5ax5ec = 126 Hz) 287-296 (m 3H
H2ax+H6ax+H4 PIPR) 339 (d 2H H2ec+H6ec PIPR J2ec2ax = J6ec6ax = 127 Hz) 725 (d 1H
H6 FENIL J65= 91 Hz) 830 (dd 2H H5 FENIL J56= 90 Hz J53= 25 Hz) 851 (d 1H H3
FENIL J35= 26 Hz)
FM C17H22N3F3O4
PM 3892 Apariencia Soacutelido amarillo Rendimiento 93
FM C12H14N3O2F3
PM 2891 Apariencia Soacutelido amarillo Rendimiento 88
Descripcioacuten de Compuestos
120
X2 Siacutentesis de derivados carboniacutelicos (Serie 0)
1-(benzo[b]tiofen-3-il)-3-[4-(4-nitro-2-trifluorometilfenil)piperazin-1-
il]propan-1-ona
Procedimiento experimental
Seguacuten el meacutetodo general C a partir de 104 g (378 mmol) de (4-nitro-2-
trifluorometilfenil)piperazina y 085 g (370 mmol) de 1-(benzo[b]tiofen-3-il)-3-
cloropropan-1-ona Se elimina el disolvente a presioacuten reducida y se precipita el
soacutelido con hexanoeacuteter en friacuteo El soacutelido obtenido se purifica en columna
cromatograacutefica usando como fase moacutevil diclorometanometanol (991) Se
elimina el disolvente de las fracciones adecuadas a presioacuten reducida
obtenieacutendose el compuesto de forma soacutelida
Punto de fusioacuten 153-154ordmC
IR (cm-1) 2952-2815 (m C-H alifaacuteticos) 1673 (mf CO) 1457 y 1332 (mf NO2)
1281 y 1131 (m CF3)
RMN-1H (CDCl3 400 MHz) δ (ppm) 276-277 (m 4H H3+H5 PIPZ) 298-312
(m 2H CO-CH2-CH2) 319-321 (t 4H H2+H6 PIPZ) 327-330 (m 2H CO-CH2-
CH2) 729 (dd 1H H5rsquo FENIL J5acute6acute= 94 Hz J5acute3acute= 25 Hz) 746 (t 1H H6 BZT
J65= 80 Hz) 752 (t 1H H5 BZT J56= J54= 81 Hz) 790 (d 1H H4 BZT J45= 80
Hz) 833-836 (m 2H H6rsquo FENIL+ H7 BZT) 853 (s 1H H2 BZT) 878 (d 1H H3rsquo
FENIL J3acute5acute= 26 Hz)
Anaacutelisis elemental (CHN)
HPLC (RP-18 1 mLmin metanol-agua (8020)) tr 713 min ʎmax 2196 nm
Calculado Hallado
C 5720 5677
H 432 457
N 916 908
FM C22H20N3F3O3S PM 4635 Apariencia Soacutelido amarillo
Rendimiento 13
01
Descripcioacuten de Compuestos
121
Hidrocloruro de 1-(benzo[b]tiofen-3-il)-3-[4-(2-nitro-4-
trifluorometilfenil)piperazin-1-il]propan-1-ona
Procedimiento experimental
Seguacuten el meacutetodo general C a partir de 147 g (534 mmol) de 4-(2-nitro-4-
trifluorometilfenil) piperazina comercial y 104 g (445 mmol) de 1-
(benzo[b]tiofen-3-il)-3-cloropropan-1-ona Se elimina el disolvente a presioacuten
reducida y precipita con hexano El soacutelido obtenido no es del todo puro por lo
que se purifica por columna cromatograacutefica usando como fase moacutevil
diclorometanometanol (991) Se elimina el disolvente de las fracciones
adecuadas a presioacuten reducida obteniendo un aceite claro que se precipita como
hidrocloruro
Punto de fusioacuten 207-209 ordmC
IR (cm-1) 2970-2930 (d C-H alifaacuteticos) 1657 (mf CO) 1447 y 1332 (mf NO2)
1253 y 1120 (m CF3)
RMN-1H (DMSO 400 MHz) δ (ppm) 326 (d 2H CO-CH2-CH2 JCHCH= 98
Hz) 351 (d 2H H3ax + H5ax PIPZ Jaxec= 128 Hz) 355 (d 4H
H3ec+H5ec+H2ax+H6ax PIPZ Jaxec= 129 Hz) 367 (d 2H H2ec+H6ec PIPZ Jecec=
122 Hz) 377 (t 2H CO-CH2 JCHCH= 100 Hz) 749 (ddd 1H H5 BZT J54= 84
Hz J56= 68 Hz) 754 (ddd 1H H6 BZT J67= 82 Hz J65= 70 Hz) 758 (d 1H
H6rsquo FENIL J6acute5acute= 88 Hz) 797 (dd 1H H5rsquo FENIL J5acute6acute= 89 Hz J5acute3acute= 21 Hz)
812 (d 1H H4 BZT J45= 79 Hz) 830 (sa 1H H3rsquo FENIL) 862 (d 1H H7 BZT
J76= 78 Hz) 909 (sa 1H H2 BTZ) 1145 (sa 1H HCl)
Anaacutelisis elemental (CHN)
HPLC (RP-18 1 mLmin metanol-agua (8020)) tr 523 min ʎmax 2181 nm
Calculado Hallado
C 5285 5301
H 400 416
N 841 831
FMC22H20N3F3O3SHCl PM 4999 Apariencia Soacutelido beige Rendimiento 60
02
Descripcioacuten de Compuestos
122
1-(benzo[b]tiofen-3-il)-3-[4-(4-fluorofenil)-36-dihidropiridin-
1(2H)-il]propan-1-ona
Procedimiento experimental
Seguacuten el meacutetodo general C a partir de 1 g (567 mmol) de 4-(4-fluorofenil)-
1236-tetrahidropiridina y 12 g (534 mmol) de 1-(benzo[b]tiofen-3-il)-3-
cloropropan-1-ona Se elimina el disolvente a presioacuten reducida y se precipita el
soacutelido con eacuteter El soacutelido obtenido se purifica por cromatografiacutea flash usando
como fase moacutevil diclorometanometanol (991) Se elimina el disolvente de las
fracciones adecuadas a presioacuten reducida obtenieacutendose el compuesto de forma
soacutelida
Punto de fusioacuten 79-80 ordmC
IR (cm-1) 2780-2775 (d C-H alifaacuteticos) 1664 (mf CO)
RMN-1H (CDCl3 400 MHz) δ (ppm) 261 (sa 2H H6 PIRD) 285 (t 2H H2
PIRD J2ec3ec= J2ax3ax= 57 Hz) 306 (t 2H CO-CH2-CH2 JCHCH= 74 Hz) 330 (sa
2H H5 PIRD) 335 (t 2H CO-CH2 JCHCH= 73 Hz) 603 (t 1H H3 PIRD J56ec=
J56ax= 40 Hz) 702 (dd 2H H3rsquo+ H5rsquo FENIL J3acute2acute= J5acute6acute= 87 Hz) 736 (dd 2H
H2rsquo+ H6rsquo FENIL J3acute2acute= J6acute5acute= 86 Hz) 745 (t 1H H6 BZT J65= J67= 76 Hz) 752 (t
1H H5 BZT J56= J54= 77 Hz) 790 (d 1H H4 BZT J45 = 73 Hz) 839 (s H2 BZT)
879 (d 1H H7 BZT J76= 75 Hz)
Anaacutelisis elemental (CHN)
HPLC (RP-18 1 mLmin metanol-agua (8020)) tr 561 min ʎmax 2196 nm
Calculado Hallado
C 7232 7214
H 548 549
N 383 369
FM C22H20NFOS PM 3655 Apariencia Soacutelido amarillo Rendimiento 15
03
Descripcioacuten de Compuestos
123
1-(5-fluorobenzo[b]tiofen-3-il)-3[4-(4-nitro-2-
(trifluorometilfenil)piperazin-1-il]propan-1-ona
Procedimiento experimental
Seguacuten el meacutetodo general D a partir de 048 g (174 mmol) de 4-(4-nitro-2-
trifluorometilfenil) piperazina y 035 g (179 mmol) de 1-(5-fluorobenzo[b]tiofen-
3-il) etanona se elimina el disolvente a presioacuten reducida y se precipita el soacutelido
con hexanoeacuteter en friacuteo
IR (cm-1) 2976-2832 (d C-H alifaacuteticos) 1671 (mf CO) 1330 (f NO2) 1281 y 1127
(m CF3)
RMN-1H (CDCl3 400 MHz) δ (ppm) 296 (sa 4H H3+H5 PIPZ) 320 (sa 2H
CO-CH2-CH2) 331 (sa 4H H2+H6 PIPZ) 346 (sa 2H CO-CH2) 723 (dt 1H
H6 FBZT J65= J67= 86 Hz J64= 25 Hz) 739 (d 1H H6acute FENIL J6acute5acute= 88 Hz)
783 (dd 1H H7 FBZT J76= 88 Hz J75= 48 Hz) 837 (dd 1H H5acute FENIL J5acute6acute=
89 Hz J5acute3acute= 26 Hz) 848 (dd 1H H4 FBZT J4F= 104 Hz J46= 25 Hz) 853 (s
1H H2 FBZT) 854 (d 1H H3rsquo FENIL)
Anaacutelisis elemental (CHN)
HPLC (RP-18 1 mLmin metanol-agua (8020)) tr 703 min ʎmax 2159 nm
Calculado Hallado
C 5101 5055
H 387 390
N 811 786
FM C22H19N3F4O3S PM 4815 Apariencia Soacutelido amarillo Rendimiento 35
04
Descripcioacuten de Compuestos
124
1-(5-fluorobenzo[b]tiofen-3-il)-3-[4-(2-nitro-4-
(trifluorometilfenil)piperazin-1-il]propan-1-ona
Procedimiento experimental
Seguacuten el meacutetodo general D a partir de 058 g (209 mmol) de 4-(2-nitro-4-
trifluorometilfenil) piperazina y 043 g (222 mmol) de 1-(5-fluorobenzo[b]tiofen-
3-il) etanona Se elimina el disolvente a presioacuten reducida y el residuo se
precipita con eacuteter en friacuteo
RMN-1H (CDCl3 400 MHz) δ (ppm) 280 (sa 4H H3+H5 PIPZ) 303 (t 2H
CO-CH2-CH2 JCHCH= JCHCH= 74 Hz) 323 (sa 4H H2+H6 PIPZ) 328 (t 2H
CO-CH2 JCHCH= JCHCH = 73 Hz) 719 (d 1H H6rsquo FENIL J6acute5acute= 84 Hz) 722-725
(m 1H H6 FBZT) 769 (dd 1H H5acute FENIL J5acute6acute= 87 Hz J5acute3acute= 20 Hz) 782 (dd
1H H7 FBZT J76= 89 Hz J7F= 49 Hz) 843 (s 1H H2 FBZT) 808 (d 1HH3acute
FENIL J3acute5acute= 16 Hz) 850 (dd 1H H4 FBZT J4F= 104 Hz J46= 26 Hz)
Anaacutelisis elemental (CHN)
HPLC (RP-18 1 mLmin metanol-agua (8020)) tr 542 min ʎmax 2196 nm
Calculado Hallado
C 5101 5102
H 386 384
N 811 798
FM C22H19N3F4O3S PM 4815 Apariencia Soacutelido naranja Rendimiento 51
05
Descripcioacuten de Compuestos
125
1-(5-fluorobenzo[b]tiofen-3-il)-3-[4-(4-(trifluorometilfenil)
piperazin-1-il]propan-1-ona
Procedimiento experimental
Seguacuten el meacutetodo general D a partir de 036 g (130 mmol) de 4-(4-
trifluorometilfenil) piperazina y 033 g (170 mmol) de 1-(5-fluorobenzo[b]tiofen-
3-il)etanona Se elimina el disolvente a presioacuten reducida y se precipita el soacutelido
con hexanoeacuteter El soacutelido obtenido no es del todo puro por lo que se purifica
por cromatografiacutea flash usando como fase moacutevil diclorometanometanol (991)
Se elimina el disolvente de las fracciones adecuadas a presioacuten reducida
obtenieacutendose un aceite claro
Debido al bajo rendimiento de la reaccioacuten el aceite puro obtenido se identifica
por CCF y se usa en su totalidad para la siacutentesis del derivado hidroxiacutelico 2c
FM C22H20N2F4OS PM 4815 Apariencia Aceite incoloro Rendimiento 15
06
Descripcioacuten de Compuestos
126
Hidrocloruro de 1-(5-fluorobenzo[b]tiofen-3-il)-3-[4-(4-nitro-2-
(trifluorometilfenil)-14-diazepan-1-il]propan-1-ona
Procedimiento experimental
Seguacuten el meacutetodo general D a partir de 051 g (177 mmol) de 4-(2-nitro-4-
trifluorometilfenil) piperazina comercial y 035 g (179 mmol) de 1-(5-
fluorobenzo[b]tiofen-3-il)etanona se elimina el disolvente a presioacuten reducida y
se precipita con hexanoeacuteter etiacutelico
IR (cm-1) 2938 (d C-H alifaacuteticos) 1663 (m CO) 1449 y 1332 (mf NO2) 1281 y
1120 (m CF3)
RMN-1H (DMSO-d6 400 MHz) δ (ppm) 290-297 (m 6H H3+H5+H6 DZP)
310 (t 2H CO-CH2-CH2 JCHCH= 69 Hz) 322 (t 2H CO-CH2 JCHCH= 71 Hz)
353 (d 2H H7 DZP J76= 78 Hz) 356 (d 2H H2 DZP J23= 81 Hz) 712 (d 1H
H6acute FENIL J6acute5acute= 90 Hz) 722 (dd 1H H6 FBZT J67= 83 Hz J64= 23 Hz) 781
(dd 1H H5acute FENIL J5acute6acute= 93 Hz J5acute3acute= 28 Hz ) 820 (d 1H H7rsquo FBZT J76= 80
Hz) 841 (sa 1H H2 FBZT) 848 (d 1H H3acute FENIL J3acute5acute= 26 Hz) 850 (d 1H H4
FBTF J4F= 102 Hz)
Anaacutelisis elemental (CHN)
HPLC (RP-18 1 mLmin metanol-agua (8020)) tr 239 min ʎmax 2235 nm
Calculado Hallado
C 519lt3 5094
H 414 413
N 790 760
FM C23H21N3F4O3SHCl PM 5320 Apariencia Soacutelido amarillo
Rendimiento 80
07
Descripcioacuten de Compuestos
127
1-(5-fluorobenzo[b]tiofen-3-il)-3-[1-(4-nitro-2-
(trifluorometilfenil)piperidin-4-ilamino]propan-1-ona
Procedimiento experimental
Seguacuten el meacutetodo general D a partir de 030 g (155 mmol) de 1-(4-nitro-2-
trifluorometilfenil) piperidin-4-il amina y 033 g (172 mmol) de 1-(5-
fluorobenzo[b]tiofen-3-il) etanona se elimina el disolvente a presioacuten reducida y
se purifica el aceite impuro por cromatografiacutea flash usando como fase moacutevil
diclorometanometanol (991) Se elimina el disolvente de las fracciones
adecuadas a presioacuten reducida obtenieacutendose un aceite claro aacutembar intenso
Debido al bajo rendimiento de la reaccioacuten el intermedio obtenido se identifica
por CCF y se usa en su totalidad para la siacutentesis del derivado hidroxiacutelico 2f
FM C23H21N3F4O3S PM 4955 Apariencia Aceite aacutembar Rendimiento 20
08
Descripcioacuten de Compuestos
128
Hidrocloruro de 1-(2-naftil)-3-[4-(4-nitro-2-trifluorometilfenil)
piperazin-1-il] propan-1-ona
Procedimiento experimental
Seguacuten el meacutetodo general D partiendo de 031 g (181 mmol) de 2-acetonaftona
comercial y 050 g (181 mmol) de 4-(4-nitro-2-trifluorometilfenil) piperazina
Despueacutes de la extraccioacuten y eliminacioacuten a presioacuten reducida del disolvente se
obtiene un aceite impuro El compuesto se purifica y precipita con eacuteter saturado
de clorhiacutedrico para la obtencioacuten del hidrocloruro
Punto de fusioacuten 181-183ordmC
IR (cm-1) 2922-2844 (d C-H alifaacuteticos) 1680 (mf CO) 1521 y 1347 (mf NO2)
1279 y 1151 (m CF3)
RMN-1H (DMSO-d6 400 MHz) δ (ppm) 321 (d 2H H3ax+H5ax PIPZ) 327 (d
2H H3ec+H5ec PIPZ) 364 (sa 2H H2ax+H6ax PIPZ) 367 (sa 2H H2ec+H6ec PIPZ)
390 (t 2H CO-CH2-CH2 JCH-CH= 118 Hz) 403 (t 2H CO-CH2 JCH-CH= 64 Hz)
765-759 (m 3H H6+H7 NFT+H6acute FENIL) 792 (d 1H H4 NFT J43= 79 Hz)
795 (d 1H H5 NFT J56= 87 Hz) 804 (d 1H H8 NFT J87= 83 Hz) 806 (d 1H
H3 NFT J34= 79 Hz) 846 (dd 1H H5acute FENIL J5acute6acute= 88 Hz J5acute3acute= 25 Hz) 858
(d 1H H3acute FENIL J3acute5acute= 25 Hz) 862 (sa 1H H1 NFT)
Anaacutelisis elemental (CHN)
HPLC (RP-18 1 mLmin metanol-agua (8020)) tr 252 min ʎmax 2134 nm
Calculado Hallado
C 5434 5410
H 434 455
N 790 765
FM C24H22N3F3O3HCl PM 4940 Apariencia Soacutelido beige Rendimiento 17
09
Descripcioacuten de Compuestos
129
Hidrocloruro de 1-(2-naftil)-3-[4-(2-nitro-4-
trifluorometilfenil)piperazin-1-il]propan-1-ona
Procedimiento experimental
Seguacuten el meacutetodo general D partiendo de 062 g (363 mmol) de 2-acetonaftona
comercial y 100 g (363 mmol) de 4-(2-nitro-4-trifluorometilfenil) piperazina
Despueacutes de extraer y eliminar a presioacuten reducida el disolvente se obtiene un
aceite impuro El compuesto se purifica y precipita con eacuteter saturado de
clorhiacutedrico para la obtencioacuten del hidrocloruro
Punto de fusioacuten 152ndash153 ordmC
IR (cm-1) 2953-2838 (md C-H alifaacuteticos) 1672 (mf CO) 1535 y 1329 (mf NO2)
1278 y 1169 (m CF3)
RMN-1H (DMSO-d6 400 MHz) δ (ppm) 324ndash331 (m 2H CO-CH2-CH2)
345ndash361(m 6H H3+H5+H2ax+H2ax PIPZ) 371 (d 2H H2ec+H6ec PIPZ Jec-ax=
1148 Hz) 387 (t 2H CO-CH2 JCH-CH= 111 Hz) 756 (d 1H H6acute FENIL J6acute5acute=
87 Hz) 767 (ddd 1H H6 NFT J65= 82 Hz J67= 68 Hz J68= 13 Hz) 771 (ddd
1H H7 NFT J78= 83 Hz J76= 71 Hz J75= 13 Hz) 797 (dd 1H H5acute FENIL J5acute6acute=
89 Hz) 803 (d 1H H4 NFT J43= 84 Hz) 804 (d 1H H5 NFT J56= 85 Hz) 808
(d 1H H8 NFT J87= 85 Hz) 815 (d 1H H3 NFT J34= 80 Hz) 828 (d 1H H3acute
FENIL J3acute5acute= 13 Hz) 877 (sa 1H H1 NFT) 1135 (sa 1H HCl)
Anaacutelisis elemental (CHN)
HPLC (RP-18 1 mLmin metanol-agua (8020)) tr 528 min ʎmax 2475 nm
Calculado Hallado
C 5836 5842
H 466 471
N 850 843
FM C24H22N3F3O3HCl PM 4940 Apariencia Soacutelido amarillo Rendimiento 41
010
Descripcioacuten de Compuestos
130
Hidrocloruro de 1-(2-naftil)-3-[1-(4-nitro-2-
trifluorometilfenil)pirrolidin-3-ilamino]propan-1-ona
Procedimiento experimental
Seguacuten el meacutetodo general D partiendo de 067 g (394 mmol) de 2-acetonaftona y
095 g de 1-(4-nitro-2-(trifluorometilfenil)-(S)-pirrolidin-3-amina Despueacutes de
extraer con acetato de etilo y eliminar a presioacuten reducida el disolvente se
obtiene un soacutelido fino que se lava con eacuteter
Punto de fusioacuten 170-171ordmC
IR (cm-1) 2942-2716 (m C-H alifaacuteticos) 1681 (m CO) 1504 y 1324 (mf NO2)
1285 y 1121 (m CF3)
RMN-1H (DMSO-d6 400 MHz) δ (ppm) 238 (dd 1H H4ec PIRR) 245 (dd 1H
H4ax PIRR) 342 (d 2H CO-CH2-CH2) 364 (dd 1H H2ec PIRR) 375 (t 2H CO-
CH2) 381- 386 (m 2H H5ec+ H2ax PIRR) 394 (dd 1H H5ax PIRR) 408 (s 1H
H3 PIRR) 712 (d 1H H6acute FENIL J6acute5acute= 96 Hz) 765 (dd 1H H6 NFT J67= 78
Hz J65= 68 Hz) 769 (dd 1H H7 NFT J78= 83 Hz J76= 78 Hz) 800 (d 1H H4
NFT J43= 65 Hz) 802 (d 1H H3 NFT J34= 65 Hz) 806 (d 1H H5acute FENIL
J5acute6acute= 86 Hz) 816 (d 1H H5 NFT J56= 68 Hz) 825 (d 1H H8 NFT J87= 84
Hz) 839 (sa 1H H3acute FENIL) 869 (sa 1H H1 NFT) 980 (sa 2H NH+ HCl)
Anaacutelisis elemental (CHN)
HPLC (RP-18 1 mLmin metanol-agua (8020)) 25 min ʎmax= 2141 nm
Calculado Hallado
C 5836 5794
H 466 475
N 851 837
FM C24H22N3F3O3HCl PM 4935 Apariencia Soacutelido anaranjado
Rendimiento 38
011
Descripcioacuten de Compuestos
131
3-[4-(4-fluorofenil)-36-dihidropiridin-1(2H)-il]-1-(naftalen-2-
il)propan-1-ona
Procedimiento experimental
Seguacuten el meacutetodo general D a partir de 082 g (463 mmol) de 4-(4-fluorofenil)-
1236-tetrahidropiridina y 070 g (411 mmol) de 2-acetonaftona Se elimina el
disolvente a presioacuten reducida y se precipita el soacutelido con eacuteter El soacutelido
obtenido se purifica por cromatografiacutea flash usando como fase moacutevil
diclorometanometanol (991) Se elimina el disolvente de las fracciones
adecuadas a presioacuten reducida obtenieacutendose un soacutelido
Punto de fusioacuten 172ndash175 ordmC
IR (cm-1) 2780-2775 (d C-H alifaacuteticos) 1677 (f CO) 1510 (f C=C)
RMN-1H (CDCl3 400 MHz) δ (ppm) 161 (sa 2H H6 PIRD) 214 (sa 2H H2
PIRD) 272 (sa 2H CO-CH2-CH2) 292-299 (m 2H H5 PIRD) 345 (d 2H CO-
CH2) 602 (sa 1H H3 PIRD) 705 (t 2H H3rsquo+ H5rsquo FENIL J3acute2acute= J5acute6acute= 86 Hz)
735 (d 1H H6acute FENIL J6acute5acute= 86 Hz) 739 (sa 1H H2acute FENIL) 748-751 (m 3H
H5+H6+H7 NFT) 784-786 (m 3H H3+H4+H8 NFT) 791 (s 1H H1 NFT)
Anaacutelisis elemental (CHN)
HPLC (RP-18 1 mLmin metanol-agua (8020)) tr 557 min ʎmax 2455 nm
Calculado Hallado
C 7182 7125
H 581 573
N 354 350
FM C24H22NFO PM 3595 Apariencia Soacutelido beige Rendimiento 24
012
Descripcioacuten de Compuestos
132
3-[4-(4-fluorofenil)-36-dihidropiridin-1(2H)-il]-1-(4-
trifluorometilfenil)propan-1-ona
Procedimiento experimental
Seguacuten el meacutetodo general D a partir de 054 g (293 mmol) de 4-(4-fluorofenil)-
1236-tetrahidropiridina y 052 g (276 mmol) de 1-(4-trifluorometilfenil)
etanona se elimina el disolvente a presioacuten reducida y el aceite se purifica por
cromatografiacutea flash usando como fase moacutevil diclorometanometanol (991) Se
elimina el disolvente de las fracciones adecuadas a presioacuten reducida obteniendo
el compuesto puro
RMN-1H (DMSO-d6 400 MHz) δ (ppm) 284 (sa 2H H6 PIRD) 355 (t 2H H2
PIRD) 382 (t 4H CO-CH2 +CO-CH2-CH2) 406 (sa 2H H5 PIRD) 621 (sa 1H
H3 PIRD) 723 (t 2H H2+ H6 TFBZN J23= J65= 88 Hz) 756 (dd 2H H3acute+ H5acute
FENIL J3acute2acute= J5acute6acute= 87 Hz J3acute5acute= J5acute3acute= 54 Hz) 797 (d 2H H2acute+ H6acute FENIL J2acute3acute=
J6acute5acute= 83 Hz) 823 (d 2H H3+H5 TFBZN J32= J56= 86 Hz)
FM C21H19NF4O
PM 3774 Apariencia Aceite beige Rendimiento 13
013
Descripcioacuten de Compuestos
133
1-(2-naftil)-2-[4-(4-nitro-2-trifluorometilfenil)piperazin-1-il]etan-1-
ona
Procedimiento experimental
Seguacuten el meacutetodo general C a partir de 070 g (254 mmol) de 4-(4-nitro-2-
trifluorometilfenil) piperazina y 053 g (211 mmol) de 2-bromo-2acute-acetonaftona
Se elimina el disolvente a presioacuten reducida obteniendo un aceite que se purifica
por columna cromatograacutefica usando como fase moacutevil diclorometanometanol
(973) Se elimina el disolvente de las fracciones adecuadas a presioacuten reducida
obteniendo compuesto puro en forma soacutelida
Punto de fusioacuten 167-168ordmC
IR (cm-1) 2925-2873 (d C-H alifaacuteticos) 1669 (mf CO) 1499 y 1334 (mf NO2)
1281 y 1124 (m CF3)
RMN-1H (DMSO-d6 400 MHz) δ (ppm) 309 (sa 4H H2+H6 PIPZ) 336 (sa
4H H3+H5 PIPZ) 428 (sa 2H COCH2) 739 (d 1H H6acute FENIL J6acute5acute= 88 Hz)
760-765 (m 1H H6 NFT) 766-771 (m 1H H7 NFT) 792 (d 1H H3 NFT J34=
81 Hz) 794 (d 1H H5acute FENIL J5acute6acute= 89 Hz) 800 (d 1H H4 NFT J43= 81 Hz)
805 (dd 1H H5 NFT J56= 85 Hz J57= 12 Hz) 837 (dd 1H H8 NFT J87= 90
Hz J86= 19 Hz) 856 (sa 2H H2 NFT+ H3acute FENIL)
Anaacutelisis elemental (CHN)
HPLC (RP-18 1 mLmin metanol-agua (8020)) tr 69 min ʎmax 2477 nm
Calculado Hallado
C 6225 602
H 451 421
N 948 925
FM C23H20N3F3O3 PM 4434 Apariencia Soacutelido beige Rendimiento 13
014
Descripcioacuten de Compuestos
134
1-(2-naftil)-2-[4-(2-nitro-4-trifluorometilfenil)piperazin-1-il]etan-1-
ona
Procedimiento experimental
Seguacuten el meacutetodo general C a partir de 135 g (481 mmol) de 4-(2-nitro-4-
trifluorometilfenil) piperazina y 104 g (417 mmol) de 2-bromo-2acute-acetonaftona
Se elimina el disolvente a presioacuten reducida obteniendo un aceite que se
precipita con una mezcla de hexanoeacuteter etiacutelico en frio
Punto de Fusioacuten 105-106ordmC
IR (cm-1) 2943-2854 (d alifaacuteticos) 1686 (f CO) 1532 y 1329 (m NO2) 1295 y
1118 (m CF3)
RMN-1H (CDCl3 400 MHz) δ (ppm) 290 (t 4H H3+H5 PIPZ) 331 (t 4H
H2+H6 PIPZ) 410 (sa 2H CO-CH2) 721 (d 1H H6acute FENIL J6acute5acute= 86 Hz) 760
(dd 1H H7 NFT J78= 85 Hz J75= 84 Hz) 764 (dd 1H H4 NFT J43= 81 Hz
J45= 14 Hz) 769 (ddd 1H H6 NFT J65= 95 Hz J67= 84 Hz J68= 16 Hz) 791
(d 1H H5 NFT J56= 95 Hz) 794 (d 1H H8 NFT J87= 84 Hz) 800 (d 1H H3
NFT J34= 81 Hz) 806 (dd 1H H5acute FENIL J5acute6acute= 86 Hz J5acute3acute= 16 Hz) 809 (d
1H H3acute FENIL J3acute5acute= 16 Hz) 856 (sa 1H H1 NFT)
Anaacutelisis elemental (CHN)
Calculado Hallado
C 6230 6173
H 451 481
N 948 933
FM C23H20N3F3O3 PM 44340 Apariencia Soacutelido naranja Rendimiento 60
015
Descripcioacuten de Compuestos
135
1-(4-fluoronaftil)-3-[4-(4-nitro-2-trifluorometilfenil)piperazin-1-
il]propan-1-ona
Procedimiento experimental
Seguacuten el meacutetodo general D a partir de 063 g (229 mmol) de 4-(4-nitro-2-
trifluorometilfenil) piperazina y 056 g (299 mmol) de 4acute-fluoro-1acute-acetonaftona
comercial se elimina el disolvente a presioacuten reducida obteniendo un aceite que
se purifica por cromatografiacutea flash usando como fase moacutevil
diclorometanometanol (955) Se elimina el disolvente de las fracciones
adecuadas a presioacuten reducida obtenieacutendose el compuesto en forma de aceite
que se usa en su totalidad despueacutes de su identificacioacuten por CCF para la siacutentesis
del derivado hidroxiacutelico 5a
FM C24H21N3F4O3 PM 4754 Apariencia Aceite amarillo Rendimiento 53
016
Descripcioacuten de Compuestos
136
1-(4-fluoronaftil)-3-[4-(2-nitro-4-trifluorometilfenil) piperazin-1-il]
propan-1-ona
Procedimiento experimental
Seguacuten el meacutetodo general D partiendo de 144 g (523 mmol) de 4-(2-nitro-4-
trifluorometilfenil) piperazina y 098 g (522 mmol) de 4acute-fluoro-1acute-acetonaftona
comercial Despueacutes de extraer y eliminar a presioacuten reducida el disolvente se
obtiene un aceite que al antildeadir hexano friacuteo precipita el compuesto puro como
soacutelido fino
Punto de fusioacuten 106ndash107 ordmC
IR (cm-1) 2924-2854 (f C-H alifaacuteticos) 1675 (mf CO) 1531 y 1326 (m NO2)
1278 y 1123 (m CF3)
RMN-1H (DMSO 400 MHz) δ (ppm) 270 (sa 4H H3+H5 PIPZ) 304 (sa 2H
CO-CH2-CH2) 319 (sa 4H H2+H6 PIPZ) 335 (sa 2H CO-CH2) 717 (d 1H H6acute
FENIL J6acute5acute= 88 Hz) 720 (dd 1H H7 FNFT J78= 90 Hz J76= 80 Hz) 763 (ddd
1H H6 FNFT) 768 (dd 1H H5acute FENIL J5acute6acute= 88 Hz J5acute3acute= 16 Hz) 769 (dd 1H
H5 FNFT J56= 73 Hz J5F= 27 Hz) 794 (dd 1H H3 FNFT J32= 79 Hz J3F= 54
Hz) 807 (d 1H H3acute FENIL J3acute5acute= 15 Hz) 819 (d 1H H2 FNFT J23= 79 Hz)
873 (d 1H H8 FNFT J87= 90 Hz)
Anaacutelisis elemental (CHN)
HPLC (RP-18 1 mLmin metanol-agua (8020)) 243 min ʎmax= 2200 nm
Calculado Hallado
C 6063 6100
H 442 459
N 884 867
FM C24H21N3F4O3 PM 4754 Apariencia Soacutelido anaranjado Rendimiento 73
017
Descripcioacuten de Compuestos
137
1-(4-fluoronaft-1-il)-3-[4-(4-trifluorometilfenil)piperazin-1-
il]propan-1-ona
Procedimiento experimental
Seguacuten el meacutetodo general D a partir de 037 g (187 mmol) de 4-(4-
trifluorometilfenil) piperazina y 032 g (169 mmol) de 4acute-fluoro-1acute-acetonaftona
se elimina el disolvente a presioacuten reducida y precipita un soacutelido impuro con
hexanoeacuteter Se purifica por cromatografiacutea flash usando como fase moacutevil
diclorometanometanol (991) y se elimina el disolvente de las fracciones
adecuadas a presioacuten reducida obtenieacutendose el compuesto en forma de aceite
que despueacutes de su identificacioacuten por CCF se usa en su totalidad para la siacutentesis
del derivado hidroxiacutelico 5c
FM C24H22N2F4O PM 4305 Apariencia Aceite beige Rendimiento 23
018
Descripcioacuten de Compuestos
138
1-(4-fluoronaft-1-il)-3-[1-(4-nitro-2-trifluorometilfenil)piperidin-4-
ilamino]propan-1-ona
Procedimiento experimental
Seguacuten el meacutetodo general D a partir de 085 g (293 mmol) de 1-(4-nitro-2-
trifluorometilfenil)piperidin-4-il amina y 100 g (531 mmol) de 4acute-fluoro-1acute-
acetonaftona Se elimina el disolvente a presioacuten reducida y se purifica el aceite
impuro por cromatografiacutea flash usando como fase moacutevil
diclorometanometanol (991) Se elimina el disolvente de las fracciones
adecuadas a presioacuten reducida obtenieacutendose un soacutelido amarillo
IR (cm-1) 2950-2732 (d C-H alifaacuteticos) 1673 (mf CO) 1508 y 1334 (m NO2)
1284 y 1119 (m CF3)
RMN-1H (DMSO 400 MHz) δ (ppm) 180 (d 2H H3ax+ H5ax PIPR J3ax5ax=
J5ax3ax= 116 Hz) 224 (d 2H H3ec+H5ec PIPR J3ec5ec= J5ec3ec= 116 Hz) 300 (t 2H
CO-CH2-CH2 JCHCH= 118 Hz) 336-343 (m 5H H2+H4+H6 PIPR) 366 (t 2H
CO-CH2 JCHCH= 62 Hz) 753 (ddd 1H H3 FNFT J3F= 106 Hz J32= 85 Hz J35=
157 Hz) 760 (d 1H H6acute FENIL J6acute5acute= 89 Hz) 774 (ddd 1H H6 FNFT J65= 79
Hz J67= 69 Hz J68= 12 Hz) 779 (ddd 1H H7 FNFT J78= 85 Hz J76= 70 Hz
J75= 14 Hz) 818 (d 1H H2 FNFT J23= 81 Hz) 826 (dd 1H H5 FNFT J56= 74
Hz J5F= 56 Hz J57= 14 Hz) 840 (d 1H H3acute FENIL J3acute5acute= 24 Hz ) 844 (dd 1H
H5acute FENIL J5acute6acute= 87 Hz J5acute3acute= 26 Hz) 880 (d 1H H8 FNFT J87= 83 Hz)
FM C25H23N3F4O3 PM 4895 Apariencia Soacutelido amarillo Rendimiento 52
019
Descripcioacuten de Compuestos
139
1-(4-fluoronaft-1-il)-3-[4-(4-fluorofenil)-36-dihidropiridin-1(2H)-
il]propan-1-ona
Procedimiento experimental
Seguacuten el meacutetodo general D a partir de 143 g (669 mmol) de 4-(4-fluorofenil)-
1236-tetrahidropiridina y 097 g (518 mmol) de 4acute-fluoro-1acute-acetonaftona Se
elimina el disolvente a presioacuten reducida y el aceite se purifica por cromatografiacutea
flash usando como fase moacutevil diclorometanometanol (955) Se elimina el
disolvente de las fracciones adecuadas a presioacuten reducida obteniendo un soacutelido
puro
Punto de fusioacuten 127-128ordmC
IR (cm-1) 2536 (d C-H alifaacuteticos) 1672 (f CO)
RMN-1H (DMSO-d6 400 MHz) δ (ppm) 263 (s 2H H5 PIRD) 314-335 (m
6H H2+ H6 PIRD+ CO-CH2-CH2) 361 (s 2H CO-CH2) 616 (s 1H H3 PIRD)
719 (t 2H H3acute+ H5acute FENIL J3acute2acute= J6acute5acute= 89 Hz) 749 (d 1H H3 FNFT J32= 80
Hz) 751 (d 2H H2acute+H6acute FENIL J2acute3acute= J6acute5acute= 87 Hz) 773 (t 2H H6+H7 FNFT
J67= J76= 71 Hz) 815 (d 1H H5 FNFT J56= 75 Hz) 828 (dd 1H H2 FNFT J23=
78 Hz J2F= 43 Hz) 868 (d 1H H8 FNFT J87= 81 Hz)
FM C24H21NF2O
PM 3775 Apariencia Soacutelido blanco Rendimiento 44
020
Descripcioacuten de Compuestos
140
1-(4-fluorofenil)-3-[4-(4-nitro-2-trifluorometilfenil) piperazin-1-il]
propan-1-ona
Procedimiento experimental
Seguacuten el meacutetodo general D a partir de 026 g (093 mmol) de 4-(4-nitro-2-
trifluorometilfenil) piperazina y 025 g (180 mmol) de 1-(4-fluorofenil) etanona
se elimina el disolvente a presioacuten reducida obtenieacutendose un aceite que se
purifica por cromatografiacutea flash usando como fase moacutevil
diclorometanometanol (991) Se elimina el disolvente de las fracciones
adecuadas a presioacuten reducida obteniendo el compuesto en forma de aceite que
se usa en su totalidad despueacutes de su identificacioacuten por CCF para la siacutentesis del
derivado hidroxiacutelico 6a
FM C20H19N3F4O3 PM 4254 Apariencia Aceite amarillo Rendimiento 63
021
Descripcioacuten de Compuestos
141
1-(4-fluorofenil)-3-[1-(4-nitro-2-trifluorometilfenil)piperidin-4-il-
amino]propan-1-ona
Procedimiento experimental
Seguacuten el meacutetodo general D a partir de 025 g (853 mmol) de 1-(4-nitro-2-
trifluorometilfenil) piperidin-4-il amina y 022 g (160 mmol) de 1-(4-
fluorofenil)etanona Se elimina el disolvente a presioacuten reducida y se purifica el
aceite impuro por cromatografiacutea flash usando como fase moacutevil
diclorometanometanol (991) Se elimina el disolvente de las fracciones
adecuadas a presioacuten reducida obtenieacutendose un aceite
RMN-1H (DMSO-d6 400 MHz) δ (ppm) 250 (sa 1H H4 PIPR) 263-256 (m
4H H3+ H5 PIPR) 275 (t 2H CO-CH2-CH2) 314-309 (m 4H H2 +H6 PIPR)
324 (t 2H CO-CH2) 736 (t 2H H2 +H6 FBZN J23= J65=80 Hz) 754 (d 1H H6acute
FENIL J6acute5acute= 79 Hz) 808 (d 1H H5 FBZN J56= 79 Hz) 810 (d 1H H3 FBZN
J32= 76 Hz) 838 (s 1H H3acute FENIL) 839 (sa 1H H5acute FENIL)
FM C21H21N3F4O3 PM 4394 Apariencia Aceite amarillo Rendimiento 12
022
Descripcioacuten de Compuestos
142
1-(4-fluorofenil)-3-[4-(4-fluorofenil)-36-dihidropiridin-1(2H)-il]
propan-1-ona
Procedimiento experimental
Seguacuten el meacutetodo general D a partir de 050 g (288 mmol) de 4-(4-fluorofenil)-
1236-tetrahidropiridina y 034 g (245 mmol) de 1-(4-fluorofenil)etanona Se
elimina el disolvente a presioacuten reducida y el aceite se purifica por cromatografiacutea
flash usando como fase moacutevil diclorometanometanol (991) Se elimina el
disolvente de las fracciones adecuadas a presioacuten reducida obteniendo un aceite
amarillo
Despueacutes de identificar el compuesto por CCF debido al bajo rendimiento se usa
todo el aceite obtenido para la siacutentesis del derivado hidroxiacutelico 6g
FM C20H19NF2O
PM 32740 Apariencia Aceite amarillo Rendimiento 10
023
Descripcioacuten de Compuestos
143
X3 Siacutentesis de derivados hidroxiacutelicos
1-(benzo[b]tiofen-3-il)-3-[4-(4-nitro-2-
trifluorometilfenil)piperazin-1-il] propan-1-ol
Procedimiento experimental
Seguacuten el meacutetodo general E partiendo de 050 g (107 mmol) de 1-
(benzo[b]tiofen-3-il)-3-[4-(4-nitro-2-trifluorometilfenil)piperazin-1-il]propan-1-
ona se obtiene tras la eliminacioacuten del disolvente un soacutelido que se purifica por
columna cromatograacutefica de fase moacutevil diclorometanometanol (991) y se
obtiene el compuesto puro
Punto de fusioacuten 157ndash158 ordmC
IR (cm-1) 3365 (m OH) 2998-2830 (m C-H alifaacuteticos) 1524 y 1349 (mf NO2)
1282 y 1128 (f CF3)
RMN-1H (CDCl3 400 MHz) δ (ppm) 214-216 (m 2H CHOH-CH2) 277-287
(m 6H CHOH-CH2-CH2+H3+H5 PIPZ) 320-329 (m 4H H2 +H6 PIPZ) 538
(dd 1H CHOH) 733-742 (m 3H H6rsquo FENIL +H6+H5 BZT) 745 (s 1H H2
BZT) 782 (d 1H H4 BZT J45 = 84 Hz) 788 (d 1H H7 BZT J76= 80 Hz) 837
(dd 1H H5rsquo FENIL J5rsquo6rsquo = 92 Hz J5rsquo3rsquo = 28 Hz) 855 (d 1H H3rsquo FENIL)
Anaacutelisis elemental (CHN)
HPLC (RP-18 1 mLmin metanol-agua (8020)) 54 min ʎmax= 2281 nm
Calculado Hallado
C 5677 5701
H 473 485
N 903 853
FM C22H22N3F3O3S PM 4655 Apariencia Soacutelido amarillo Rendimiento 13
1a
Descripcioacuten de Compuestos
144
Hidrocloruro de 1-(benzo[b]tiofen-3-il)-3-[4-(2-nitro-4-
trifluorometilfenil)piperazin-1-il]propan-1-ol
Procedimiento experimental
Seguacuten el meacutetodo general E se parte de 041 g (082 mmol) de 1-(benzo[b]tiofen-
3-il)-3-[4-(2-nitro-4-trifluorometilfenil)piperazin-1-il]propan-1-ona Tras la
eliminacioacuten del disolvente se obtiene un aceite impuro que se purifica por
cromatografiacutea flash con diclorometanometanol (991) El aceite puro precipita
con eacuteter clorhiacutedrico como hidrocloruro
Punto de fusioacuten 176-178ordmC
IR (cm-1) 3185 (d OH) 2924-2851 (f C-H alifaacuteticos) 1509 y 1346 (mf NO2) 1279
y 1119 (f CF3)
RMN-1H (DMSO-d6 400 MHz) δ (ppm) 223ndash232 (m 2H CHOH-CH2) 317
(sa 2H CHOH-CH2-CH2) 335 (sa 2H H3ax+H5ax PIPZ) 349 (sa 4H
H2ax+H6ax+ H3ec+H5ec PIPZ) 359 (d 2H H2ec+H6ec PIPZ) 501 (m 1H CH-OH)
743ndash736 (m 2H H5+H6 BZT) 754 (d 1H H6acute FENIL J6acute5acute = 80 Hz) 764 (sa
1H H2 BZT) 794 (dd 1H H5acute FENIL J5acute6acute = 81 Hz J5acute3acute = 16 Hz) 798-801 (m
2H H7+ H4 BZT) 825 (sa 1H H3acute FENIL) 1111 (sa 1H HCl)
Anaacutelisis elemental (CHN)
HPLC (RP-18 1 mLmin metanol-agua (8020)) 433 min ʎmax= 2290 nm
Calculado Hallado
C 5264 5253
H 439 428
N 838 826
FM C22H22N3F3O3SHCl PM 502 Apariencia Soacutelido camel Rendimiento 16
1b
Descripcioacuten de Compuestos
145
Hidrocloruro de 1-(benzo[b]tiofen-3-il)-3-[4-(4-fluorofenil)-36-
dihidropiridin-1(2H)-il)propan-1-ol
Procedimiento experimental
Seguacuten el meacutetodo general E partiendo de 015 g (041 mmol) de 1-
(benzo[b]tiofen-3-il)-3-[4-(4-fluorofenil)-36-dihidropiridin-1(2H)-il] propan-1-
ona Despueacutes se elimina el disolvente y se obtiene un soacutelido impuro que se
purifica precipitando el hidrocloruro con eacuteter clorhiacutedrico
Punto fusioacuten 204-206ordmC
IR (cm-1) 3385 (d OH) 2924-2851 (f C-H alifaacuteticos)
RMN-1H (DMSO 400 MHz) δ (ppm) 229-30 (m 2H CHOH-CH2) 274- 281
(m 2H CHOH-CH2-CH2) 337-340 (m 2H H6 PIRD) 366-377 (m 3H
H2+H5ax PIRD) 40 (d 1H H5ec PIRD) 509 (sa 1H CHOH) 620 (s 1H H3
PIRD) 723 (d 2H H3rsquo+ H5rsquo FENIL J3acute2acute= J5acute6acute= 90 Hz) 738-74 (m 2H H2rsquo+ H6rsquo
FENIL) 750 (dd 2H H6+H5 BTF J65= J56= 80 Hz J54= J67= 71 Hz) 760 (s 1H
H2 BTF) 800 (dd 2H H4 +H7 BTF J45= J76= 70 Hz J6= J75= 18 Hz) 105 (sa
1H HCl)
Anaacutelisis elemental (CHN)
HPLC (RP-18 1 mLmin metanol-agua (8020)) tr 426 min ʎmax 2282 nm
Calculado Hallado
C 640 6389
H 551 575
N 339 325
FM C22H22NFOSHCl PM 4405 Apariencia Soacutelido blanco
Rendimiento 65
1g
Descripcioacuten de Compuestos
146
1-(5-fluorobenzo[b]tiofen-3-il)-3-[4-(4-nitro-2-
trifluorometilfenil)piperazin-1-il]propan-1-ol
Procedimiento experimental
Seguacuten el meacutetodo general E partiendo de 040 g (092 mmol) de 1-(5-
fluorobenzo[b]tiofen-3-il)-3-[4-(4-nitro-2-trifluorometilfenil)piperazin-1-
il]propan-1-ona Despueacutes de eliminar el disolvente se obtiene un soacutelido marroacuten
impuro que purificamos por cromatografiacutea flash en diclorometanometanol
(991)
Punto fusioacuten 140-142ordmC
IR (cm-1) 3426 (d OH) 2826 (d C-H alifaacuteticos) 1507 y 1329 (mf NO2) 1283 (mf
F-BZT)1240 y 1122 (f CF3)
RMN-1H (CDCl3 400 MHz) δ (ppm) 206-215 (m 2H CHOH-CH2) 274-283
(sa 3H H3ax+H5ax PIPZ+ CHOH-CH2-CH2) 292-386 (m 3H H3ec+H5ec PIPZ+
CHOH-CH2-CH2) 324 (t 4H H2+H6 PIPZ) 530 (dd 1H CHOH JCH-OH = 74
Hz JCH-CH = 39 Hz) 713 (dt 1H H6 FBZT J67 = 87 Hz J6F = 83 Hz J64 = 25
Hz) 735 (d 1H H6acute FENIL J6acute5acute= 90 Hz) 752 (dd 1H H4 FBZT J4F = 95 Hz J46
= 28 Hz) 751 (s 1H H2 FBZT) 780 (dd 1H H7 FBZT J76 = 88 Hz J7F = 49
Hz) 838 (dd 1H H5rsquo FENIL J5acute6acute = 89 Hz J5acute3acute = 27 Hz) 855 (d 1H H3rsquo FENIL
J3acute5acute = 27 Hz)
Anaacutelisis elemental (CHN)
HPLC (RP-18 1 mLmin metanol-agua (8020)) 554 min ʎmax= 2283 nm
Calculado Hallado
C 5446 5483
H 434 444
N 869 920
FM C22H21N3F4O3S PM 4835 Apariencia Soacutelido amarillo Rendimiento 21
2a
Descripcioacuten de Compuestos
147
Hidrocloruro de 1-(5-fluorobenzo[b]tiofen-3-il)-3-[4-(2-nitro-4-
trifluorometilfenil)piperazin-1-il]propan-1-ol
Procedimiento experimental
Seguacuten el meacutetodo general E partiendo de 031 g (086 mmol) de 1-(5-
fluorobenzo[b]tiofen-3-il)-3-[4-(2-nitro-4-trifluorometilfenil)piperazin-1-
il]propan-1-ona se obtiene tras la eliminacioacuten del disolvente un aceite impuro
que se purifica por cromatografiacutea flash con diclorometanometanol (991) El
aceite puro precipita como hidrocloruro con eacuteter clorhiacutedrico
Punto de fusioacuten 196-198ordmC
IR (cm-1) 3408 (d OH) 2968-2814 (d C-H alifaacuteticos) 1533 y 1329 (mf NO2)
1230 y 1112 (f CF3)
RMN-1H (DMSO-d6 400 MHz) δ (ppm) 206 (sa 2H CHOH-CH2) 292 (sa
4H H2+H6 PIPZ) 324 (sa 4H H3+H5 PIPZ) 37 (sa 2H CHOH-CH2-CH2) 50
(sa 1H CHOH) 726 (dt 1H H6 FBZT J6F = 91 Hz J67 = 88 Hz J64 = 22 Hz)
749 (d 1H H6acute FENIL J6acute5acute= 85 Hz) 772 (s 1H H2 FBZT) 777 (d 1H H4
FBZT J4F = 102 Hz) 790 (d 1H H5acute FENIL J5acute6acute = 84 Hz) 802 (dd 1H H7
FBZT J76 = 89 Hz J7F = 51 Hz ) 820 (s 1H H3acute FENIL)
Anaacutelisis elemental (CHN)
HPLC (RP-18 1 mLmin metanol-agua (8020)) 445 min ʎmax=2308 nm
Calculado Hallado
C 5081 5121
H 423 375
N 808 811
FM C22H21N3F4O3S HCl PM 5195 Apariencia Soacutelido amarillo Rendimiento 20
2b
Descripcioacuten de Compuestos
148
1-(5-fluorobenzo[b]tiofen-3-il)-3-[4-(4-
trifluorometilfenil)piperazin-1-il]propan-1-ol
Procedimiento experimental
Seguacuten el meacutetodo general E partiendo de 053 g de 1-(5-fluorobenzo[b]tiofen-3-
il)-3-[4-(4-trifluorometilfenil)piperazin-1-il]propan-1-ona se obtiene en la
eliminacioacuten del disolvente un aceite impuro que se purifica por cromatografiacutea
flash con diclorometanometanol (991)
Punto de fusioacuten 158-160ordmC
IR (cm-1) 2961-2831 (d C-H alifaacuteticos) 1248 y 1115 (f CF3)
RMN-1H (CDCl3 400 MHz) δ (ppm) 221 (sa 2H CHOH-CH2) 282 (sa 3H
H3ax+H5ax PIPZ +CHOH-CH2-CH2) 293-294 (m 3H H3ec+H5ec PIPZ + CHOH-
CH2-CH2) 345 (sa 4H H2+H6 PIPZ) 532 (dd 1H CHOH JCH-OH = 41 Hz JCH-
CH = 67 Hz) 696 (d 2H H6+H7 FBZT J67 = J76 = 84 Hz) 710-715 (m 1H H4
FBZT) 750-754 (m 4H H2acute+H3acute+H5acute+H6acute FENIL) 780 (sa 1H H2 FBZT)
Anaacutelisis elemental (CHN)
HPLC (RP-18 1 mLmin metanol-agua (8020)) tr 466 min ʎmax 2005 nm
Calculado Hallado
C 6027 5930
H 502 495
N 639 624
FM C22H22N2F4OS
PM 4385 Apariencia Soacutelido blanco Rendimiento 15
2c
Descripcioacuten de Compuestos
149
1-(5-fluorobenzo[b]tiofen-3-il)-3-[4-(4-nitro-2-trifluorometilfenil)-
14-diazepan-1-il]propan-1-ol
Procedimiento experimental
Seguacuten el meacutetodo general E partiendo de 039 g (080 mmol) de 1-(5-
fluorobenzo[b]tiofen-3-il)-3-[4-(4-nitro-2-trifluorometilfenil)-14-diazepan-1-
il]propan-1-ona se obtiene tras la eliminacioacuten del disolvente un aceite impuro
que se purifica por cromatografiacutea flash en diclorometanometanol (991)
Punto de fusioacuten 110-111ordmC
IR (cm-1) 3425 (m OH) 1500 y 1338 (mf NO2) 1280 (mf F-BZT)1257 y 1106 (f
CF3)
RMN-1H (CDCl3 400 MHz) δ (ppm) 208 (sa 4H CHOH-CH2+H6 DZP) 287-
293 (m 4H H2+H7 DZP) 298-299 (m 2H CHOH-CH2-CH2) 354 (sa 2H H5
DZP) 562 (sa 2H H3 DZP) 530 (t 1H CHOH JCH-OH = JCH-CH = 57 Hz) 712
(dd 1H H7 BZT J76= 88 Hz J7F= 24 Hz) 722 (d 1H H6acute FENIL J65acuteacute= 92 Hz)
750 (s 1H H2 FBZT) 751 (dd 1H H4 FBZT J4F= 98 Hz J46= 15 Hz) 780 (dd
1H H6 FBZT J67= 88 Hz J6F= 50 Hz) 828 (dd 1H H5acute FENIL J5acute6acute= 92 Hz
J5acute3acute= 27 Hz) 854 (s 1H H3acute FENIL)
Anaacutelisis elemental (CHN)
HPLC (RP-18 1 mLmin metanol-agua (8020)) 557 min ʎmax= 2308 nm
Calculado Hallado
C 5548 5515
H 462 464
N 844 826
FM C23H23N3O3F4S PM 4975 Apariencia Soacutelido amarillo Rendimiento 25
2d
Descripcioacuten de Compuestos
150
1-(5-fluorobenzo[b]tiofen-3-il)-3-[1-(4-nitro-2-
trifluorometilfenil)piperidin-4-il]amino propan-1-ol
Procedimiento experimental
Seguacuten el meacutetodo general E partiendo de 017 g (034 mmol) de 1-(5-
fluorobenzo[b]tiofen-3-il)-3-[1-(4-nitro-2-trifluorometilfenil)piperidin-4-
il]aminopropan-1-ona se obtiene tras la eliminacioacuten del disolvente un aceite
impuro que se purifica por cromatografiacutea flash en diclorometanometanol
(991)
Punto de fusioacuten 140-142ordmC
IR (cm-1) 3425 (m OH) 1498 y 1334 (mf NO2) 1283 (mf F-BTF)1283 y 1106 (f
CF3)
RMN-1H (CDCl3 400 MHz) δ (ppm) 156-171 (m 2H H3ax+H5ax PIPR) 195-
197 (m 2H CHOH-CH2) 211 (sa 2H H3ec+H5ec PIPR) 275 (sa 1H H4 PIPR)
295 (t 2H H2ax+H6ax PIPR J2ax2ec= J6ax6ec= 97 Hz) 313 (sa 2H CHOH-CH2-
CH2) 342 (d 2H H2ec+H6ec PIPR J2ec2ax= J6ec6ax= 90 Hz) 530 (d 1H CHOH JCH-
OH = 77 Hz) 712 (t 1H H6 FBZT J6F = J67 = 77 Hz) 729 (d 1H H6acute FENIL J6acute5acute=
86 Hz) 750 (dd 1H H4 FBZT J4F = 85 Hz J46 = 49 Hz) 752 (s 1H H2 FBZT)
779 (dd 1H H7 FBZT J76 = 82 Hz J7F = 31 Hz) 833 (dd 1H H5rsquo FENIL J5acute6acute =
85 Hz J5acute3acute = 18 Hz) 853 (sa 1H H3rsquo FENIL)
Anaacutelisis elemental (CHN)
HPLC (RP-18 1 mLmin metanol-agua (8020)) 443 min ʎmax= 2299 nm
Calculado Hallado
C 5548 5555
H 481 462
N 826 844
FM C23H23N3O3F4S PM 49751 Apariencia Soacutelido amarillo Rendimiento 37
2f
Descripcioacuten de Compuestos
151
Hidrocloruro de 1-(2-naftil)-3-[4-(4-nitro-2-
trifluorometilfenil)piperazin-1-il]propan-1-ol
Procedimiento experimental
Seguacuten el meacutetodo general E partiendo de 033 g (066 mmol) de 1-(2-naftil)-3-[4-
(4-nitro-2-trifluorometilfenil)piperazin-1-il]propan-1-ona tras la eliminacioacuten del
disolvente se obtiene un aceite que precipita en forma de hidrocloruro con eacuteter
saturado de HCl
Punto de fusioacuten 183-185ordmC
IR (cm-1) 3185 (d OH) 2924-2851 (f C-H alifaacuteticos) 1509 y 1346 (mf NO2) 1279
y 1119 (f CF3)
RMN-1H (DMSO-d6 400 MHz) δ (ppm) 214 (sa 2H CHOH-CH2) 317 (sa
2H CHOH-CH2-CH2) 329-335 (m 6H H3ax+ H5ax+ H2+H6 PIPZ) 360 (sa 2H
H3ec+ H5ec PIPZ) 483-485 (m 1H CHOH) 749-752 (m 3H H6rsquo FENIL + H6+H7
NFT) 764 (d 1H H3 NFT J34 = 91 Hz) 786 (sa 1H H1 NFT) 788-792 (m 3H
H4+H5+H8 NFT ) 841 (d 1H H3acute FENIL J3acute5acute = 21 Hz) 846 (dd 1H H5rsquo FENIL
J5rsquo6rsquo = 92 Hz J5rsquo3rsquo = 19 Hz)
Anaacutelisis elemental (CHN)
HPLC (RP-18 1 mLmin metanol-agua (8020)) 762 min ʎmax= 2236 nm
Calculado Hallado
C 5812 5770
H 484 520
N 847 801
FM C24H24N3F3O3HCl PM 5325 Apariencia Soacutelido amarillo Rendimiento 50
3a
Descripcioacuten de Compuestos
152
Hidrocloruro de 1-(2-naftil)-3-[4-(2-nitro-4-trifluorometilfenil)
piperazin-1-il] propan-1-ol
Procedimiento experimental
Seguacuten el meacutetodo general E partiendo de 036 g (083 mmol) de 1-(2-naftil)-3-[4-
(2-nitro-4-trifluorometilfenil)piperazin-1-il]propan-1-ona tras la eliminacioacuten del
disolvente se obtiene un aceite que precipita en forma de hidrocloruro con eacuteter
saturado de HCl
Punto de fusioacuten 165ndash166 ordmC
IR (cm-1) 3250 (m OH) 2927-2873 (d C-H alifaacuteticos) 1534 y 1327 (mf NO2)
1280 y 1123 (f CF3)
RMN-1H (DMSO-d6 400 MHz) δ (ppm) 219-222 (m 2H CHOH-CH2) 316
(sa 4H H3+H5 PIPZ) 348 (sa 4H H2+H6 PIPZ) 358 (d 2H CHOH-CH2-CH2)
484-487 (m 1H CHOH) 574 (sa 1H OH) 747-752 (m 2H H6acuteFENIL+H3
NFT) 754 (sa 1H H7 NFT) 756 (sa 1H H6 NFT) 788-795 (m 5H
H1+H4+H5+H8 NFT+H5acute FENIL) 825 (sa 1H H3acute FENIL) 1110 (sa 1H HCl)
Anaacutelisis elemental (CHN)
HPLC (RP-18 1 mLmin metanol-agua (8020)) 457 min ʎmax= 2220 nm
Calculado Hallado
C 5663 5682
H 469 458
N 821 813
FM C24H24N3F3O3HCl PM 4960 Apariencia Soacutelido camel Rendimiento 63
3b
Descripcioacuten de Compuestos
153
Hidrocloruro de 1-(2-naftil)-3-[3-(4-nitro-2-trifluorometilfenil)-
pirrolidin-3-ilamino]propan-1-ol
Procedimiento experimental
Seguacuten el meacutetodo general E partiendo de 025 g (0546 mmol) de 1-(2-naftil)-3-[3-
(4-nitro-2-trifluorometilfenil)pirrolidin-3-ilamino]propan-1-ona tras la
eliminacioacuten del disolvente se obtiene un aceite que se precipita en forma de
hidrocloruro con eacuteter saturado de HCl
Punto de fusioacuten 180-182ordmC
IR (cm-1) 3422 (m OH) 2951-2793 (d C-H alifaacuteticos) 1580 y 1327 (mf NO2)
1286 y 1122 (f CF3)
RMN-1H (DMSO-d6 400 MHz) δ (ppm) 207-214 (m 2H CHOH-CH2) 229-
231 (m 1H H4ax PIRR) 236-241 (m 1H H4ec PIRR) 311 (sa 2H CHOH-CH2-
CH2) 357-364 (m 1H H2ax PIRR) 375-379 (m 2H H5ax+ H2ec PIRR) 385-389
(m 1H H5ec PIRR) 397 (sa 1H H3 PIRR) 590 (sa 1H CHOH) 576 (s 1H
OH) 710 (d 1H H6rsquo FENIL J6rsquo5rsquo = 87 Hz) 747-755 (m 3H H3 + H6+ H7 NFT)
786 (sa 1H H1 NFT) 790-792 (m 3H H4+ H5+ H8 NFT) 824-890 (d 1H H5rsquo
FENIL J5rsquo6rsquo = 89 Hz) 840 (sa 1H H3rsquo FENIL) 949 (sa 1H NH)
Anaacutelisis elemental (CHN)
HPLC (RP-18 1 mLmin metanol-agua (8020)) 115 min ʎmax= 2238 nm
Calculado Hallado
C 5631 5650
H 492 523
N 821 821
FM C24H24N3F3O3HCl PM 4961 Apariencia Soacutelido anaranjado
Rendimiento 38
3e
Descripcioacuten de Compuestos
154
3-[4-(4-fluorofenil)-36-dihidropiridin-1(2H)-il]-1-(naftalen-2-
il)propan-1-ol
Procedimiento experimental
Seguir el meacutetodo general E partiendo de 030 g (084 mmol) de 3-[4-(4-
fluorofenil)-36-dihidropiridin-1(2H)-il)]-1-(naftalen-2-il)propan-1-ona se
obtiene tras la eliminacioacuten del disolvente un aceite impuro que puede
purificarse por cromatografiacutea flash en diclorometano-metanol (991)
Punto de fusioacuten 127-129ordmC
IR (cm-1) 3510 (d OH) 2833 (m C-H alifaacuteticos)
RMN-1H (CDCl3 400 MHz) δ (ppm) 199-212 (m 2H CHOH-CH2) 264 (s
2H H6 PIRD) 272-296 (m 4H H2+H5 PIRD) 331 (d 2H CHOH-CH2-CH2 JCH-
CH= 167 Hz) 517 (sa 1H CH-OH) 602 (s 1H H3 PIRD) 704 (t 2H H3acute+ H5acute
FENIL J3acute2acute= J5acute6acute= 87 Hz) 737 (dd 2H H2acute+ H6acute FENIL J2acute3acute= J6acute5acute= 87 Hz
J2acuteF= J6acuteF= 54 Hz) 745-750 (m 2H H6 + H7 NFT) 751 (dd 1H H8 NFT J87= 74
Hz J86=16 Hz) 785 (d 2H H3+ H4 NFT J34acute= J43acute=83 Hz) 787 (dd 1H H5
NFT J56= 78 Hz J57=23 Hz) 791 (s 1H H1 NFT)
Anaacutelisis elemental (CHN)
HPLC (RP-18 1 mLmin metanol-agua (8020)) tr 468 min ʎmax 2196 nm
Calculado Hallado
C 7783 7787
H 662 682
N 378 330
FM C24H24NFO PM 3615 Apariencia Soacutelido blanco Rendimiento 23
3g
Descripcioacuten de Compuestos
155
1-(2-naftil)-2-[4-(2-nitro-4-trifluorometilfenil)piperazin-1-il]etan-1-
ol
Procedimiento experimental
Seguacuten el meacutetodo general E partiendo de 038 g (086 mmol) de 1-(2-naftil)-2-[4-
(2-nitro-4-trifluorometilfenil)piperazin-1-il]propan-1-ona se obtiene tras la
eliminacioacuten del disolvente un aceite impuro que se puede purificar
precipitando el compuesto con hexano
Punto de fusioacuten 134ndash135 ordmC
IR (cm-1) 3408 (d OH) 2968-2814 (d C-H alifaacuteticos) 1533 y 1329 (mf NO2)
1230 y 1112 (f CF3)
RMN-1H (DMSO-d6 400 MHz) δ (ppm) 275-281 (m 4H H3+H5 PIPZ) 303
(sa 2H CHOH-CH2) 326-331 (m 2H H2+H6 PIPZ) 504 (dd 1H CHOH) 721
(d 1H H6acute FENIL J6acute5acute = 87 Hz) 749-752 (m 3H H3+H6+H7 NFT) 771 (dd
1H H5acute FENIL J5acute6acute = 87 Hz J5acute3acute = 19 Hz) 786 (sa 1H H1 NFT) 787 (dd 1H
H8 NFT J87 = 79 Hz J86 = 15 Hz) 788 (d 1H H4 NFT J43 = 55 Hz) 790 (sa
1H H5 NFT) 811 (d 1H H3acute FENIL J3acute5acute = 19 Hz)
Anaacutelisis elemental (CHN)
HPLC (RP-18 1 mLmin metanol-agua (8020)) 566 min ʎmax= 2228 nm
Calculado Hallado
C 6202 6226
H 494 512
N 944 914
FM C23H22N3F3O3 PM 4454 Apariencia Soacutelido amarillo Rendimiento 78
4b
Descripcioacuten de Compuestos
156
1-(4-fluoronaftil)-3-[4-(4-nitro-2-trifluorometilfenil)piperazin-1-
il]propan-1-ol
Procedimiento experimental
Seguacuten el meacutetodo general E partiendo de 053 g (107 mmol) de 1-(4-
fluoronaftil)-3-[4-(4-nitro-2-trifluorometilfenil)piperazin-1-il]propan-1-ona se
obtiene tras la eliminacioacuten del disolvente un aceite impuro que se purifica por
cromatografiacutea flash usando como fase moacutevil diclorometanometanol (991)
Punto de fusioacuten 183-184ordmC
IR (cm-1) 3447 (d OH) 2931-2836 (d C-H alifaacuteticos) 1513 y 1338 (f NO2) 1283
y 1119 (f CF3)
RMN-1H (CDCl3 400 MHz) δ (ppm) 206-214 (m 2H CHOH-CH2) 274-280
(m 3H H5 PIPZ+ CHOH-CH2-CH2) 288-294 (m 3H H3 PIPZ+ CHOH-CH2-
CH2) 327 (t 4H H2+H6 PIPZ J23= J65= 467 Hz) 571 (dd 1H CHOH JCH-CH =
81 Hz JCH-CH = 27 Hz) 718 (dd 1H H3 FNFT J3F = 102 Hz J32= 80 Hz) 735
(d 1H H6acute FENIL J6acute5acute = 89 Hz) 767-771 (m 2H H6+H7 FNFT) 769 (dd 1H
H2 FNFT J23 = 79 Hz J2F= 56 Hz) 804 (d 1H H8 FNFT J87 = 80 Hz) 817 (dd
1H H5 FNFT J56 = 76 Hz J5F = 21 Hz) 838 (dd 1H H5acute FENIL J5acute6acute = 89 Hz
J5acute3acute = 27 Hz) 855 (d 1H H3acute FENIL J3acute5acute = 27 Hz)
Anaacutelisis elemental (CHN)
HPLC (RP-18 1 mLmin metanol-agua (8020)) 703 min ʎmax= 2217 nm
Calculado Hallado
C 6038 6015
H 482 486
N 880 878
FM C24H23N3F4O3 PM 4775 Apariencia Cristales amarillos Rendimiento 51
5a
Descripcioacuten de Compuestos
157
1-(4-fluoronaftil)-3-[4-(2-nitro-4-trifluorometilfenil)piperazin-1-
il]propan-1-ol
Procedimiento experimental
Seguacuten el meacutetodo general E partiendo de 049 g (102 mmol) de 1-(4-
fluoronaftil)-3-[4-(2-nitro-4-trifluorometilfenil)piperazin-1-il]propan-1-ona se
obtiene tras la eliminacioacuten del disolvente un aceite impuro que se purifica al
lavarlo con hexano
Punto de fusioacuten 147ndash148 ordmC
IR (cm-1) 3430 (m OH) 2957-2835 (d C-H alifaacuteticos) 1533 y 1330 (mf NO2)
1278 y 1125 (f CF3)
RMN-1H (DMSO-d6 400 MHz) δ (ppm) 208-218 (m 2H CHOH-CH2) 283
(sa 3H H5 PIPZ+ CHOH-CH2-CH2) 295 (sa 3H H3 PIPZ+ CHOH-CH2-CH2)
332 (sa 4H H2+H6 PIPZ) 571 (dd 1H CHOH) 718 (dd 1H H3 FNFT J3F =
102 Hz J32 = 81 Hz) 723 (d 1H H6acute FENIL J6acute5acute = 87 Hz) 754-762 (m 2H
H6+H7 FNFT) 768 (dd 1H H2 FNFT J23 = 80 Hz J2F = 56 Hz) 774 (dd 1H
H5acute FENIL J5acute6acute = 87 Hz J5acute3acute = 19 Hz) 805 (dd 1H H5 FNFT J56 = 82 Hz J5F =
17 Hz) 811 (d 1H H3acute FENIL J3acute5acute = 19 Hz) 817 (dd 1H H8 FNFT J87 = 86
Hz J86 = 29 Hz)
Anaacutelisis elemental (CHN)
HPLC (RP-18 1 mLmin metanol-agua (8020)) 556 min ʎmax= 2222 nm
Calculado Hallado
C 6038 6012
H 482 505
N 881 862
FM C24H23N3F4O3 PM 4775 Apariencia Soacutelido amarillo Rendimiento 90
5b
Descripcioacuten de Compuestos
158
Hidrocloruro de 1-(4-fluoronaft-1-il)-3-[4-(4-trifluorometilfenil)
piperidin-1-il] propan-1-ol
Procedimiento experimental
Seguacuten el meacutetodo general E partiendo de 010 g de 1-(4-fluoronaftalen-1-il)-3-[1-
(4-trifluorometilfenilpiperidin-4-il)amino]propan-1-ona se obtiene tras la
eliminacioacuten del disolvente un aceite impuro que se purifica por cromatografiacutea
flash en diclorometanometanol (991) y se precipita como hidrocloruro con
eacuteter saturado de HCl
Punto de fusioacuten 174-175ordmC
IR (cm-1) 3436 (m OH) 2983 (d C-H alifaacuteticos) 2396 (d HCl) 1333 (f N-C)
1118 (mf CF3)
RMN-1H (DMSO-d6 400 MHz) δ (ppm) 221 (d 2H CHOH-CH2) 320-360
(m 6H CHOH-CH2-CH2+ H3+H5 PIPZ) 355 (sa 2H H2ax+H6ax PIPZ) 397 (sa
2H H2ec+H6ec PIPZ) 541 (d 1H CH-OH JCH-CH=75 Hz) 590 (sa 1H OH) 713
(d 2H H6acute+H2acute FENIL J6acute5acute= J2acute3acuteacute= 81 Hz) 736 (dd 1H H3 FNFT J32= 82 Hz
J3F= 97 Hz) 756 (d 2H H6+H7 FNFT J67= J76acute= 84 Hz) 767 (sa 3H H2
FNFT+H3acute+H5acute FENIL) 810 (d 1H H5 FNFT J56 = 66 Hz) 829 (d 1H H8
FNFT J87= 88 Hz) 1112 (sa 1H HCl)
Anaacutelisis elemental (CHN)
HPLC (RP-18 1 mLmin metanol-agua (8020)) 850 min ʎmax= 2266 nm
Calculado Hallado
C 6147 6135
H 539 482
N 598 596
FM C24H24N2F4OHCl PM 4690 Apariencia Soacutelido blanco Rendimiento 45
5c
Descripcioacuten de Compuestos
159
1-(4-fluoronaft-1-il)-3-[1-(4-nitro-2-trifluorometilfenilpiperidin-4-
il)amino]propan-1-ol
Procedimiento experimental
Seguacuten el meacutetodo general E partiendo de 04106 g (084 mmol) de 1-(4-
fluoronaft-1-il)-3-[1-(4-nitro-2-trifluorometilfenilpiperidin-4-il)amino] propan-1-
ona se obtiene tras la eliminacioacuten del disolvente un aceite impuro que se
purifica por cromatografiacutea flash en diclorometanometanol (991)
Punto de fusioacuten 93-95ordmC
IR (cm-1) 3352 (m OH) 1524 y 1318 (mf NO2) 1280 y 1171 (f CF3)
RMN-1H (CDCl3 400 MHz) δ (ppm) 168-183 (m 2H H3ax+ H5ax PIPR) 186-
201 (m 2H CHOH-CH2) 215-223 (m 2H H3ec+H5ec PIPR) 212 (d 1H CH-
OH JCH-CH= 127 Hz) 275-284 (m 1H H4 PIPR) 298 (t 2H H2ax+ H6ax PIPR
J2ax2ec = J6ax6ec = 115 Hz) 300-303 (m 1H CHOH-CH2-CH2) 308-315 (m 1H
CHOH-CH2-CH2) 342 (d 2H H2ec+H6ec PIPR) 571 (dd 1H CHOH JCHCH =
82 Hz JCH-CH2 = 23 Hz) 717 (dd 1H H3 FNFT J3F = 102 Hz J32 = 81 Hz)
727-730 (m 1H H6acute FENIL) 753-761 (m 2H H6+H7 FNFT) 767-772 (m 1H
H2 FNFT) 804 (d 1H H8 FNFT J87 = 78 Hz) 816 (dd 1H H5 FNFT J56 =72 Hz
J5F = 33 Hz ) 833 (dd 1H H5acute FENIL J5acute6acute = 90 Hz J5acute3acute = 27 Hz ) 853 (d 1H
H3acute FENIL J3acute5acute = 27 Hz)
Anaacutelisis elemental (CHN)
HPLC (RP-18 1 mLmin metanol-agua (8020)) tr 464 min ʎmax 2230 nm
Calculado Hallado
C 6111 6077
H 543 543
N 855 830
FM C25H25N3O3F4 PM 4910 Apariencia Soacutelido amarillo Rendimiento 90
5f
Descripcioacuten de Compuestos
160
1-(4-fluoronaftalen-1-il)-3-[4-(4-fluorofenil)-36-dihidropiridin-
1(2H)-il]propan-1-ol
Procedimiento experimental
Seguacuten el meacutetodo general E partiendo de 043 g (114 mmol) de 1-(4-
fluoronaftalen-1-il)-3-[4-(4-fluorofenil)-36-dihidropiridin-1(2H)-il]propan-1-
ona se obtiene tras la eliminacioacuten del disolvente un soacutelido blanco que precipita
con hexanoeacuteter
Punto de fusioacuten 162-163ordmC
IR (cm-1) 2828 (d C-H alifaacuteticos) 1509 (f F-BZN) 1227 (mf F-NFT)
RMN-1H (DMSO-d6 400 MHz) δ (ppm) 214-220 (m 2H CHOH-CH2) 273
(sa 2H H6 PIRD) 284-312 (m 4H CHOH-CH2-CH2+H5 PIRD) 341 (d 1H
H2ax PIRD J2ax 2ec=164 Hz) 347 (d 1H H2ec PIRD J2ec2ax=161 Hz) 574 (sa 1H
CHOH) 600-605 (m 1H H3 PIRD) 700-708 (m 2H H2acute+H6acute FENIL) 718 (dd
1H H3 FNFT J3F= 102 Hz J32 = 81 Hz) 735-740 (m 2H H6+H7 FNFT) 754-
761 (m 2H H5acute+H3acute FENIL) 770 (dd 1H H2 FNFT J23= 80 Hz J2F = 56 Hz)
807 (d 1H H5 FNFT J56 = 82 Hz) 82 (dd 1H H8 FNFT J87= 70 Hz J86 = 25
Hz)
Anaacutelisis elemental (CHN)
Calculado Hallado
C 7595 7525
H 606 645
N 369 350
FM C24H23NF2O PM 3792 Apariencia Soacutelido blanco Rendimiento 82
5g
Descripcioacuten de Compuestos
161
Hidrocloruro de 1-(4-fluorofenil)-3-[4-(4-nitro-2-
trifluorometilfenilpiperazin-1-il]propan-1-ol
Procedimiento experimental
Seguacuten el meacutetodo general E partiendo de 036 g (107 mmol) de 1-(4-fluorofenil)-
3-[4-(4-nitro-2-trifluorometilfenil)piperazin-1-il]propan-1-ona se obtiene tras la
eliminacioacuten del disolvente un aceite impuro que se precipita con hexanoeacuteter
El soacutelido que se obtiene se lava con eacuteter saturado de HCl
Punto de fusioacuten 163-165ordmC
IR (cm-1) 3348 (m OH) 2928-2848 (d C-H alifaacuteticos) 1519 y 1352 (f NO2) 1284
y 1120 (f CF3)
RMN-1H (DMSO-d6 400 MHz) δ (ppm) 209 (sa 2H CHOH-CH2) 315-320
(m 4H H3+H5 PIPZ) 335-344 (m 4H H2+H6 PIPZ) 360 (sa 2H CHOH-CH2-
CH2) 469 (s 1H CHOH) 565 (s 1H OH) 718 (t 2H H3+H5 FBZN J32 = J56=
81 Hz) 742 (dd 2H H2+H6 FBZN J23 = J65= 80 Hz J2Facute= J6F= 66 Hz) 764 (d
1H H6acute FENIL J6acute5acute = 90 Hz) 842 (s 1H H3acute FENIL) 847 (d 1H H5acute FENIL
J5acute6acute = 88 Hz) 1120 (sa 1H HCl)
Anaacutelisis elemental (CHN)
HPLC (RP-18 1 mLmin metanol-agua (8020)) tr 206 min ʎmax 2011 nm
Calculado Hallado
C 4984 4950
H 477 476
N 872 863
FM C20H21N3F4O3HCl PM 4659 Apariencia Soacutelido amarillo Rendimiento 20
6a
Descripcioacuten de Compuestos
162
Hidrocloruro de 1-(4-fluorofenil)-3-[1-(4-nitro-2-
trifluorometilfenil)piperidin-4-il)amino]propan-1-ol
Procedimiento experimental
Seguacuten el meacutetodo general E partiendo de 010 g (021 mmol) de 1-(4-fluorofenil)-
3-[1-(4-nitro-2-trifluorometilfenilpiperidin-4-il)amino]propan-1-ona se obtiene
en la eliminacioacuten del disolvente un aceite impuro que se purifica como
hidrocloruro lavando con eacuteter saturado de HCl
Punto de fusioacuten 185-187ordmC
IR (cm-1) 3425 1498 y 1334 (mf NO2) 1283 (mf F BZN)1283 y 1106 (f CF3)
RMN-1H (DMSO-d6 400 MHz) δ (ppm) 138 (sa 2H H3ax+ H5ax PIPR) 170
(sa 2H H3ec+H5ec PIPD) 190 (d 2H CHOH-CH2 JCH-CH= 110 Hz) 258 (sa 1H
H4 PIPR) 263-264 (m 2H H2ax+ H6ax PIPR) 295 (t 2H H2ec+H6ec PIPR J2ec2ax =
J6ec6ax = 121 Hz) 320-330 (m 2H CHOH-CH2-CH2) 469 (t 1H CHOH JCHOH-
CHCH = 90 Hz) 713 (t 2H H3+H5 FBZN J32 = J56= 81 Hz) 736 (sa 2H H2+H6
FBZN) 750 (d 1H H6acute FENIL J6acute5acute = 80 Hz) 837 (sa 2H H3acute+H5acute FENIL)
Anaacutelisis elemental (CHN)
HPLC (RP-18 1 mLmin metanol-agua (8020)) tr 1977 min ʎmax 2011 nm
Calculado Hallado
C 5251 5213
H 503 491
N 880 849
FM C21H23N3F4O3HCl PM 4799 Apariencia Soacutelido amarillo Rendimiento 11
6f
Descripcioacuten de Compuestos
163
1-(4-fluorofenil)-3-[4-(4-fluorofenil)-36-dihidropiridin-1(2H)-
il]propan-1-ol
Procedimiento experimental
Seguir el meacutetodo general E partiendo de 090 g (027 mmol) de 1-(4-fluorofenil)-
3-(4-(4-fluorofenil)-56-dihidropiridin-1(2H)-il)propan-1-ona y se obtiene tras la
eliminacioacuten del disolvente un aceite impuro que se purifica por cromatografiacutea
flash en diclorometanometanol (991) El soacutelido obtenido se recristaliza de
hexano para su total purificacioacuten
Punto de fusioacuten 199-201ordmC
RMN-1H (DMSO-d6 400 MHz) δ (ppm) 176-180 (m 2H CHOH-CH2) 245
(sa 4H CHOH-CH2-CH2+H5 PIRD) 257-262 (m 2H H6 PIRD) 306 (sa 2H
H2 PIRD) 466 (t 1H CHOH JCH-OH=63 Hz) 549 (sa 1H OH) 612 (sa 1H H3
PIRD) 714 (dd 4H H3acute+H5acute FENIL+ H3+H5 FBZN J3acuteF= J5acuteF= J3F= J5F = 126 Hz
J3acute2acute= J5acute6acute= J32= J56 = 80 Hz) 737 (dd 2H H2+H6 FBZN J23= J65= 79 Hz J2F=
J6F= 60 Hz) 746 (dd 2H H2acute+H6acute FENIL J2acute3acute= J6acute5acute= 77 Hz J2acuteF= J6acuteF= 55 Hz)
Anaacutelisis elemental (CHN)
Calculado Hallado
C 7242 7196
H 634 633
N 422 403
FM C20H21NF2O PM 3314 Apariencia Soacutelido blanco Rendimiento 2
6g
Descripcioacuten de Compuestos
164
3-[4-(4-fluorofenil)-36-dihidropiridin-1(2H)-il]-1-(4-
trifluorometilfenil)propan-1-ol
Procedimiento experimental
Seguacuten el meacutetodo general E partiendo de 013 g (034 mmol) de 1-(4-
fluoronaftalen-1-il)-3-[1-(4-nitro-2-trifluorometilfenilpiperidin-4-
il)amino]propan-1-ona se obtiene tras la eliminacioacuten del disolvente se obtiene
un soacutelido blanco que se lava con hexano eacuteter y se recristaliza de hexano
Punto de fusioacuten 116-117ordmC
IR (cm-1) 2912- 2761 (C-H alifaacuteticos) 1511 (f F) 1328 y 1127 (f CF3)
RMN-1H (DMSO-d6 400 MHz) δ (ppm) 181 (dd 2H CHOH-CH2 JCH-CH=
137 Hz JCH-CHOH= 73 HZ) 245-250 (m 4H CHOH-CH2-CH2+H5 PIRD) 262 (t
2H H6 PIRD JCH-CH= JCH-CH=55 Hz) 308 (s 2H H2 PIRD) 475-480 (m 1H
CHOH) 570 (sa 1H OH) 612 (s 1H H3 PIRD) 715 (t 2H H5acute+H3acute FENIL
J5acuteF=J3acuteF= 88 Hz J5acute6acute= J3acute2acute =88 Hz) 747 (dd 2H H6acute+H2acute FENIL J6acute5acute=J2acute3acute= 84
Hz J6acuteF= J2acuteF =56 Hz) 757 (d 2H H2+H6 TFBZN J23acute=J65= 79 Hz) 768 (d 2H
H3+H5 TFBZN J32acute=J56= 81 Hz)
Anaacutelisis elemental (CHN)
HPLC (RP-18 1 mLmin metanol-agua (8020)) tr 1027 min ʎmax 2418 nm
Calculado Hallado
C 6649 6601
H 554 567
N 370 381
FM C21H21NF4O
PM 379 Apariencia Agujas blancas Rendimiento 40
7g
Descripcioacuten de Compuestos
165
X4 Siacutentesis de Oximas (Serie 8)
1-(naftalen-2-il)-3-[4-(2-nitro-4-trifluorometilfenil)piperazin-1-
il]propan-1-oxima
Procedimiento experimental
Seguacuten el meacutetodo general F partiendo de 023 g (050 mmol) de 1-(2-naftil)-3-[4-
(2-nitro-4-trifluorometilfenil)piperazin-1-il]propan-1-ona se obtiene tras la
eliminacioacuten del disolvente un aceite impuro que se purifica por columna
cromatograacutefica con diclorometanometanol (973)
Punto de fusioacuten 185-187 ordmC
IR (cm-1) 1560 y 1328 (mf NO2) 1283 y 1120 (f CF3)
RMN-1H (DMSO-d6 400 MHz) δ (ppm) 254-264 (m 6H CNOH-CH2-
CH2+H3+H5 PIPZ) 303-309 (m 2H CNOH-CH2) 311-317 (m 4H H2+H6
PIPZ) 743 (d 1H H6acuteFENIL J6acute5acute= 88 Hz) 751-756 (m 2H H6+H7 NFT) 784
(dd 1H H5acute FENIL J5acute6acuteacute= 88 Hz J5acute3acuteacute= 17 Hz) 788-793 (m 3H H4+H5+H8
NFT) 798-802 (m 1H H3 NFT) 814 (sa 2H H1 NFT+H3acute FENIL) 1140 (sa
1H OH)
Anaacutelisis elemental (CHN)
HPLC (RP-18 1 mLmin metanol-agua (8020)) tr 464 min ʎmax 2391 nm
Calculado Hallado
C 6102 6114
H 487 521
N 1186 1163
FM C24H23N4F3O3 PM 4720 Apariencia Soacutelido camel Rendimiento 54
81
Descripcioacuten de Compuestos
166
1-(2-naftil)-3-[3-(4-nitro-2-trifluorometilfenil)pirrolidin-3-
ilamino]propan-1-oxima
Procedimiento experimental
Seguir el meacutetodo general F partiendo de 0350 g (0769 mmol) de 1-(2-naftil)-3-
[3-(4-nitro-2-trifluorometilfenil)pirrolidin-3-ilamino]propan-1-ona se obtiene
tras la eliminacioacuten del disolvente un soacutelido anaranjado que se lava con
diclorometano y eacuteter etiacutelico obtenieacutendose el compuesto puro
Punto de fusioacuten 129 - 130ordfC
IR (cm-1) 3441 (d OH) 2951-2834 (d C-H alifaacuteticos) 1503 y 1323 (mf NO2)
1285 y 1112 (f CF3)
RMN-1H (DMSO-d6 400 MHz) δ (ppm) 178-185 (m 1H H4ax PIRR) 202-209
(m 1H H4ec PIRR) 221 (sa 1H -NH-) 270-282 (m 2H CNOH-CH2-CH2) 300
(t 2H CNOH-CH2) 325 (dd 1H H3 PIRR) 343-351 (m 2H H2ax+ H2ec PIRR)
358-361 (m 2H H5 PIRR) 697 (d 1H H6acute FENIL J6acute5acute = 96 Hz) 751 (d 1H
H5 NFT J56 = 61 Hz) 752 (d 1H H8 NFT J87 = 61 Hz) 786 (sa 2H H3+H4
NFT) 788-794 (m 2H H6+H7 NFT) 813 (sa 1H H1 NFT) 815 (dd 1H H5acute
FENIL J5acute6acute = 94 Hz J5acute3acute = 27 Hz) 835 (d 1H H3acute FENIL J3acute5acute = 27 Hz)
Anaacutelisis elemental (CHN)
HPLC (RP-18 1 mLmin metanol-agua (8020)) 365 min ʎmax= 2360 nm
Calculado Hallado
C 5987 5954
H 502 474
N 1164 1157
FM C24H23N4O3F3 PM 472 Apariencia Soacutelido amarillo Rendimiento 45
82
Descripcioacuten de Compuestos
167
X5 Purificacioacuten de compuestos por cromatografiacutea flash
La cromatografiacutea flash ha sido utilizada como meacutetodo de purificacioacuten de
muchos de los compuestos de este trabajo Las condiciones elegidas para la
purificacioacuten han sido
- Fase Estacionaria Columnas de Siacutelica gel Rf RediSepreg de tamantildeo de
partiacutecula entre 35 y 70 micras y tamantildeo de poro 60 Aring
- Fase Moacutevil Diclorometanometanol de flujo isocraacutetico linear (Figuras 51 y
52) con un volumen de equilibrado de 20 mL
- Longitud de onda de deteccioacuten 254 nm en todas las muestras y 365 nm en
los compuestos que contienen el grupo naftaleno
- Tipo de muestra Liacutequidas cuando no
son muy complejas y soacutelidas cuando se
trata de purificacioacuten de mezclas
complejas e hidrocloruros
Figura 51 Informe graacutefico de la purificacioacuten compuesto 023
Figura 52 Informe graacutefico de la purificacioacuten compuesto 5f
De los 47 compuestos sintetizados 23 han sido purificados mediante
cromatografiacutea flash Este meacutetodo ha supuesto una mejora y simplificacioacuten del
proceso de siacutentesis asiacute como un ahorro de costes por la reduccioacuten de tiempos
solventes y residuos La purificacioacuten del resto ha sido realizada por
precipitacioacuten como hidrocloruros lavado del compuesto con hexanoeacuteter o
recristalizacioacuten con hexano
Tabla 3
Condiciones de trabajo empleadas en la figuras 51 y 52
Tiempo (min)
Metanol (B)
Teacutecnica de flujo
Compuesto 023
10 00 Isocraacutetico
1 25 Linear
15 25 Isocratico
1 5 Linear
30 5 isocraacutetico
Compuesto 5f
5 0 Isocraacutetico
1 25 Linear
15 25 Isocratico
1 5 Linear
30 5 isocraacutetico
Descripcioacuten de Compuestos
168
X6 Elucidacioacuten estructural de compuestos por RMN
Todos los compuestos sintetizados han sido identificados a traveacutes de teacutecnicas
de CCF IR y RMN-1H Los compuestos finales han sido caracterizados ademaacutes
mediante anaacutelisis elemental de CHN De este modo se ha podido determinar
inequiacutevocamente las estructuras orgaacutenicas de las moleacuteculas obtenidas y formar
un ldquoficha de identidadrdquo de cada compuesto
X61 Elucidacioacuten estructural para los derivados de piperazina
En el caso de que las teacutecnicas anteriores fueran insuficientes para la
caracterizacioacuten exacta de la moleacutecula se han empleado teacutecnicas
complementarias de RMN como RMN-13C 2D 1H-1H COSY y 2D HMQC Este
ha sido el caso del compuesto 5a (figura 53)
Figura 53 Estructura molecular del compuesto 5a ejemplo escogido para un anaacutelisis maacutes exhaustivo mediante experimentos de RMN
La espectroscopia de RMN revela el nuacutemero de hidroacutegenos o carbonos de la
moleacutecula y su posible posicioacuten A traveacutes de los distintos experimentos esta
teacutecnica permite identificar y asignar los distintos protones y carbonos presentes
en la moleacutecula mediante el anaacutelisis de los desplazamientos y multiplicidades
que muestra cada uno de ellos
Figura 54 RMN-1H del compuesto 5a
Descripcioacuten de Compuestos
169
Zona alifaacutetica
En la zona de hidroacutegenos alifaacuteticos se observan cuatro sentildeales
Figura 55 Regioacuten alifaacutetica de la RMN-1H
Los hidroacutegenos alifaacuteticos aparecen a desplazamientos bajos porque estaacuten
muy apantallados
El C1 es un carbono terciario y por tanto tiene un hidroacutegeno muy
desapantallado por el efecto del grupo OH dando una sentildeal a altos ppm como
queda sentildealada en naranja en la figura 55 Esta asignacioacuten facilita el poder
asociar los picos sentildealados en morado (Figura 55) con el metileno vecino C2 ya
que aparece a bajos ppm debido a su aumentado caraacutecter alifaacutetico El multiplete
obtenido integrado por dos hidroacutegenos aparece a 210 ppm Mediante el
espectro COSY (Figura 56) se puede comprobar siguiendo el trazado naranja
coacutemo siendo la sentildeal de CHOH la de 571 ppm se acopla con ella uacutenicamente la
de su vecino CHOH-CH2
Los hidroacutegenos pertenecientes al ciclo de piperazina se diferencian entre siacute por
el desplazamiento de las sentildeales seguacuten esteacuten maacutes o menos cercanos al grupo
fenilo Asiacute los protones H3p y H5p son los que aparecen a menores ppm A 277
ppm y a 291 ppm aparecen dos multipletes (sentildealados con azul en la figura 55)
que integran a tres hidroacutegenos cada uno lo cual resulta extrantildeo ya que en la
moleacutecula no hay ninguacuten CH3 Esto se debe a la diastereotopiacutea del carbono
hidroxiacutelico que hace que los 4 hidroacutegenos salgan divididos en dos sentildeales que
integran a dos hidroacutegenos cada una y a ambas se les suma uno de los
hidroacutegenos del C3 alifaacutetico Esto hace que aparezcan dos sentildeales que integran a
tres hidroacutegenos correspondientes a 2H3p 2H5p y los dos hidroacutegenos alifaacuteticos
Descripcioacuten de Compuestos
170
de C3 Si se siguen ahora las
liacuteneas moradas de la figura
55 se corrobora la
informacioacuten de que los
protones del C3 salen unidos
a las sentildeales de los protones
de H3 y H5 porque hay un
acoplamiento entre el C2 y
esas sentildeales
Figura 56 Espectro COSY Acoplamientos entre metilenos
Por uacuteltimo a 327 ppm se encuentra la sentildeal marcada con verde (figura 55)
correspondiente a 2H2 y 2H6 que integra por cuatro hidroacutegenos y aparece como
triplete debido a los acoplamientos con 2H3 y 2H5
Zona aromaacutetica
En esta moleacutecula se encuentran 9 hidroacutegenos aromaacuteticos no equivalentes lo
que dificulta la asignacioacuten de las sentildeales Como en el apartado anterior se
recurriraacute para estudiar los acoplamientos protoacuten-protoacuten y protoacuten-carbono a la
resonancia magneacutetica nuclear en dos dimensiones con el fin de asignar
inequiacutevocamente cada sentildeal
Figura 57 Resonancia magneacutetica nuclear de protoacuten de la zona aromaacutetica de la moleacutecula 5a
La dificultad de la asignacioacuten en esta moleacutecula se ve aumentada por la
presencia de un aacutetomo de fluacuteor en la parte del naftaleno En el espectro de
Descripcioacuten de Compuestos
171
RMN-1H el aacutetomo de fluacuteor no produce sentildeal pero siacute acoplamientos con los
hidroacutegenos vecinos obtenieacutendose constantes de acoplamiento (J) bastantes altas
y sentildeales desdobladas no esperadas en protones de su entorno
En la figura 57 lo primero que se observa son los altos desplazamientos de los
hidroacutegenos aromaacuteticos debido al menor apantallamiento de estos por su
naturaleza aromaacutetica
Teoacutericamente el espectro deberiacutea tener un singlete claro perteneciente a H3acute
pero no se encuentra ninguno en la figura 57 Asiacute que se puede pensar en un
desdoblamiento de la sentildeal por acoplamiento deacutebil a larga distancia con el H5acute
lo que mostrariacutea un doblete con acoplamiento muy bajo
En el espectro se encuentran tres dobletes sencillos Con las constantes de
acoplamiento a 850 ppm se ve este doblete que integra por uno y que tiene
una J = 27 Hz El otro doblete se encuentra a 804 ppm con una J = 80 Hz y el
maacutes bajo estaacute en 735 ppm con una J = 89 Hz Por el razonamiento inicial la
sentildeal a 850 ppm es la que deberiacutea asociarse con un acoplamiento a larga
distancia y por tanto con H3acute Esta informacioacuten puede ser contrastada con el
COSY
En el espectro bidimensional COSY se ha marcado en rojo el uacutenico
acoplamiento de H3acute que solo
pueda asociarse con la sentildeal
de H5acute Por tanto el doble
doblete a 838 ppm sentildealado
en la figura 56 de azul se
corresponde con H5acute
(informacioacuten verificada por
su constante de acoplamiento
menor J = 27Hz igual a la de
H3acute)
Figura 58 Espectro COSY de la zona aromaacutetica de la moleacutecula
Si ahora se sigue la liacutenea azul de la figura 58 donde se sentildealan los
acoplamientos de H5acute se puede ver un acoplamiento mayor con su uacutenico
hidroacutegeno vecino H6acute Asiacute tambieacuten queda asignada la sentildeal de este uacuteltimo que
se puede comprobar por comparacioacuten de las constantes de acoplamiento
(J5acute6acute=89 Hz y J6acute5acute=90 Hz)
Descripcioacuten de Compuestos
172
Para asignar los hidroacutegenos del naftaleno se debe tener en cuenta la presencia
del aacutetomo de fluacuteor De esta forma para los hidroacutegenos H2 H3 y H5 se puede
establecer teoacutericamente
que no se veraacuten como
dobletes sino dobles
dobletes en el espectro
de protoacuten En el COSY
(Figura 58) para una
primera aproximacioacuten
se seleccionan los tres
dobles dobletes de
protoacuten que solo tengan
un acoplamiento
Figura 59 Espectro COSY Zona aromaacutetica de la moleacutecula
Seguacuten la posicioacuten de H2 y H3 con por efecto del fluacuteor de la moleacutecula ademaacutes de
ser dobles dobletes el espectro COSY (Figura 58) debe mostrar dos sentildeales que
se acoplan entre ellas Por lo que se deduce que estos protones seraacuten los
sentildealados en azul y morado (figura 57) Si se recurre ahora a los valores de
acoplamiento se justifica la asignacioacuten ya que la sentildeal morada a 770 ppm
tiene una J = 79 Hz que se corresponde con la J = 81 Hz de la sentildeal azul a 720
ppm Ademaacutes estas sentildeales por la proximidad del fluacuteor tienen un segundo
valor de acoplamiento que en el caso de H3 seraacute muy alto y en H2 menor De
este modo se concluye que la sentildeal a 770 ppm corresponde a H2 y la sentildeal a
720 ppm a H3
La continuacioacuten de la asignacioacuten se centra en H6 y H7 Estos dos protones
teoacutericamente produciraacuten sentildeales como miacutenimo con multiplicidad de triplete ya
que son los uacutenicos que presentan tres protones diferentes en su entorno Como
no hay ninguacuten triplete en el espectro podemos pensar que sus sentildeales pudieran
aparecer juntas en el multiplete que se observa sentildealado en verde en la figura
57 a 750 ppm
Por otro lado queda por asociar las sentildeales a 817 ppm y a 804 ppm (Figura
57) correspondientes a un doble doblete y un doblete respectivamente Los
protones que quedan por asignar son H5 y H8 Se podriacutea pensar que H8 seriacutea un
doblete y H5 un doble doblete por efecto del fluacuteor como el caso de H2 Si se
estudian las J se verifica esta informacioacuten ya que la sentildeal a 817 ppm tiene una
constante de acoplamiento de 21 Hz muy pequentildea para pertenecer a un
Descripcioacuten de Compuestos
173
acoplamiento protoacutenndashprotoacuten aromaacutetico Por tanto se asigna a un acoplamiento a
larga distancia del H5 con
el fluacuteor sustituido en
posicioacuten 4 del NFT
Recurriendo al espectro
COSY (Figura 60) se
puede visualizar y
verificar estas cuatro
asignaciones ya que en
caso de ser correctas
deben acoplarse las
sentildeales doblete con el
uacutenico multiplete
Figura 60 Espectro COSY para la asignacioacuten de los H del naftaleno
Identificados todos los hidroacutegenos de la moleacutecula si se recurre ahora al
espectro HMQC (Figura 61) se pueden asignar directamente los carbonos no
cuaternarios presentes en la estructura esto se debe a que este experimento
bidimensional muestra el acoplamiento entre cada carbono y los protones
directamente unidos al mismo
Lo anterior se realiza siguiendo las liacuteneas de unioacuten entre el eje horizontal
espectro de RMN- 1H y el vertical que es el espectro de RMN-13C
Figura 61 Espectro HMQC Acoplamientos protoacuten-carbono
Descripcioacuten de Compuestos
174
Las asignaciones quedan de la siguiente forma
Zona aromaacutetica
C2
FNFT
C3
FNFT
C5
FNFT
C6
FNFT
C7
FNFT
C8
FNFT
C3
FENIL
C5
FENIL
C6
FENIL
RMN-
13C
(ppm)
12320 10912 12840 12725 12611 12311 12180 12491 12332
RMN-
1H
(ppm)
770 720 817 750 750 804 805 838 735
Zona alifaacutetica
C1
alifaacutetico
C2
alifaacutetico
C3
alifaacutetico C2 PIPZ C3 PIPZ C5 PIPZ C6 PIPZ
RMN-13C
(ppm) 7232 3295 5743 5350 5310 5310 5350
RMN-1H
(ppm) 571 210
Ha 290
Hb 278 291 327 327 270
De esta forma queda correctamente determinada la estructura de la moleacutecula
Con el anaacutelisis elemental (CHN) en uacuteltimo lugar se verifica el compuesto y se
determina la pureza del mismo
Descripcioacuten de Compuestos
175
X62 Elucidacioacuten estructural para los derivados de piperidina
El compuesto que se ha tomado como referencia en este caso es el 5f Se trata
de un derivado de FNFT que tiene como amina central una amino piperidina
En la figura 62 se muestra la estructura plana de la moleacutecula con los carbonos
alifaacuteticos diferenciados
Figura 62 Estructura del compuesto 5f con los diferentes carbonos alifaacuteticos coloreados
El espectro de protoacuten del compuesto se muestra en la figura 62
Figura 63 Resonancia de protoacuten del compuesto 5f
Por pertenencia al mismo grupo estructural el derivado 5f y el 5a tienen en
comuacuten los grupos aromaacuteticos de la estructura en consecuencia la zona
aromaacutetica de la moleacutecula ya ha quedado elucidada en el apartado anterior En
este apartado los estudios se centran en la descripcioacuten y asignacioacuten de sentildeales
de la regioacuten alifaacutetica que corresponden a la aminopiperidina En la figura 64 se
han destacado en distintos colores las diferentes sentildeales correspondientes a los
carbonos alifaacuteticos de la moleacutecula 5f
Descripcioacuten de Compuestos
176
Figura 64 Ampliacioacuten zona alifaacutetica de la resonancia de protoacuten del compuesto 5f
Para comenzar con la explicacioacuten de la asignacioacuten se revisa en primer lugar el
espectro DEPT-135 (Figura 65) de resonancia de la zona alifaacutetica donde quedan
diferenciados los carbonos terciarios que dan lugar a sentildeales positivas de los
secundarios que dan lugar a sentildeales negativas
Figura 65 DEPT 135 de la regioacuten aromaacutetica del compuesto 5f Coloreados los carbonos terciarios
En el espectro quedan sentildealados los carbonos terciarios que corresponden al
C1 y a C4p Los
desplazamientos se
mantienen en el espectro de
RMN-13C simple por lo que
en el espectro de HMQC se
puede obtener a queacute
hidroacutegenos van asociadas
las sentildeales de esos carbonos
(Figura 66)
Figura 66 HMQC alifaacutetica asignacioacuten de los carbonos terciarios
Descripcioacuten de Compuestos
177
Al trazar las liacuteneas de unioacuten se observa que la sentildeal de carbono a mayores ppm
corresponde con la de un H que integra a uno y que corresponde a la sentildeal que
aparece a mayores ppm Los H de C1 estaacuten muy desapantallados por el efecto
del OH asiacute la sentildeal a 571 ppm del espectro de protoacuten (Figura 64) corresponde al
CHOH De esta forma la otra sentildeal del C terciario corresponde con el H4 asiacute
trazando una liacutenea amarilla en el HMQC se puede asignar con seguridad la
sentildeal de ese H
Seguacuten el DEPT-135 (Figura 65) en torno a 30 ppm se pueden ver dos singletes
muy proacuteximos que corresponden a dos C secundarios y en torno a 50 ppm
aparece un singlete que integra dos sentildeales Seguacuten la estructura del compuesto
hay cuatro carbonos equivalentes dos a dos los CH2 y CH2 de la piperidina
que aparecen como singletes muy proacuteximos
Los carbonos C2p y C6p (H2+H6) aparecen a desplazamientos mayores como
C4p En el espectro de carbono el desplazamiento a 5230 ppm cumple estas
especificaciones y por tanto puede ser asignado a los CH2 En el HMQC
(Figura 67) al trazar una liacutenea verde desde RMN-13C al RMN-1H para unir las
sentildeales de acoplamiento C-H se comprueba que hay dos acoplamientos de
protoacuten con el mismo carbono Esta situacioacuten se produce porque los hidroacutegenos
de los metilenos no son equivalentes ya que espacialmente se disponen en
planos axiales y ecuatoriales seguacuten se representa en la figura 67
Figura 67 HMQC del compuesto 5f asignacioacuten H piperidina
Descripcioacuten de Compuestos
178
En la disposicioacuten espacial de miacutenima energiacutea en el vaciacuteo (Figura 68) los
hidroacutegenos de los carbonos de piperazina se disponen en diferentes planos Los
H axiales se encuentran
perpendiculares al plano del ciclo de
amina y los H ecuatoriales se
disponen en el mismo plano lo que
produce cambios en el entorno
quiacutemico que quedan reflejados en el
espectro de protoacuten (Figura 64)
Figura 68 Imagen 3D del compuesto 5f obtenida con Chemdraw 3D
La disposicioacuten adoptada hace que los H axiales esteacuten maacutes cerca entre siacute y se
produzcan acoplamientos fuertes con los H axiales vecinos y deacutebiles con los H
ecuatoriales del carbono al que pertenecen En el caso de los H ecuatoriales los
acoplamientos que se generan son deacutebiles con el H en axial del carbono propio
y en ocasiones acoplan muy deacutebilmente con los H ecuatoriales de carbonos
vecinos ya que se encuentran maacutes alejados Por esto en el espectro de esta
moleacutecula no se obtiene una uacutenica sentildeal que integra por cuatro hidroacutegenos sino
que se obtienen dos sentildeales que integran a dos H y que tienen distintas
multiplicidades
En el espectro de protoacuten en HMQC (Figura 67) siguiendo la liacutenea verde que
muestra el acoplamiento de C2p y C6p con los H se ven dos sentildeales a 342 ppm
y 291 ppm La sentildeal a 342 ppm es un doblete ancho con una J =121Hz que
seguacuten lo explicado corresponde a los CH2 (H2+H6) ecuatoriales El H2ec (y por
analogiacutea H6ec) se acopla solo con H2ax la amplitud de la sentildeal podriacutea explicarse
por el acoplamiento deacutebil con H3ec La sentildeal a 291 ppm es un triplete que se
asocia a H2 Y H6 axial ya que H2ax de acoplamientos fuertes con H3ax y H2ec
Las sentildeales de carbonos en 3274 ppm y 3303 ppm corresponden a los CH2 (H3
y H5) Por el razonamiento seguido para los metilenos 2 y 6 las sentildeales a 210
ppm y 160 ppm en el espectro de protoacuten corresponden a los H ecuatoriales y
axiales respectivamente
Los carbonos de la cadena alifaacutetica quedan asignados tambieacuten en base a los
desplazamientos del RMN-13C El C2 estaacute maacutes apantallado por el caraacutecter
alifaacutetico del entorno por lo que de las dos sentildeales que quedan por asignar la
que se obtiene a 3676 ppm corresponde al CHOH-CH2
Descripcioacuten de Compuestos
179
En el espectro HMQC (Figura 69) se obtiene para esta sentildeal CHOH-CH2
varios acoplamientos
correspondientes a
diferentes sentildeales
muacuteltiples a 200 ppm
y 212 ppm en el
espectro de protoacuten
Esto se debe tambieacuten
a la disposicioacuten
espacial de ambos H
como ocurre en el
caso de los H de la
amina
Figura 69 HMQC Asignacioacuten de los carbonos del puente de metilenos
Las sentildeales que quedan sin asignar pertenecen a C3 (sentildealado en rosa en la
figura CH2) a 4575 ppm que seguacuten el HMQC corresponde a los dos protones
que dan sentildeales como multipletes a 310 ppm y 300 ppm
La asignacioacuten de las sentildeales queda de la siguiente manera
Zona aromaacutetica
C2
FNFT
C3
FNFT
C5
FNFT
C6
FNFT
C7
FNFT
C8
FNFT
C3
FENIL
C5
FENIL
C6
FENIL
RMN-13C
(ppm) 12320 10912 12840 12725 12611 12311 12180 12491 12332
RMN-1H
(ppm) 770 720 817 750 750 804 805 838 735
Zona alifaacutetica
C1
alifaacutetico
C2
alifaacutetico
C3
alifaacutetico C2 PIPR C3 PIPR
C4
PIPR C5 PIPR C6 PIPR
RMN-13C
(ppm) 7259 3676 4575 5230 3303 5456 3274 5230
RMN-1H
(ppm) 571
Ha 212
Hb 200
Ha 319
Hb 300
Ha 342
Hb 298
Ha 210
Hb 160 280
Ha 210
Hb 160
Ha 342
Hb 298
De esta forma queda correctamente identificada la estructura del compuesto
5f
Descripcioacuten de Compuestos
180
X63 Elucidacioacuten estructural para los derivados de tetrahidropiridina
En este apartado se describen los compuestos 6g y 7g derivados de benceno
que tienen como amina central una tetrahidropiridina y como resto Ar2 un
benceno para-fluacuteor-sustituido En estos derivados la diferencia estructural que
cabe destacar estaacute en el resto Ar1 donde el 6g presenta un p-fluorobenceno
sustituido y el 7g un p-trifluorometileno (Figura 70)
Figura 70 Estructuras del compuesto 7g y 6g
Para la determinacioacuten estructural de estos compuestos se toma como punto
de partida la RMN-1H asignando las posibles sentildeales con sus correspondientes
protones El espectro de protoacuten de los compuestos se muestra en la figura 71
pudieacutendose comprobar su similitud
Figura 71 Espectro de RMN 1H del compuesto 6g y 7g respectivamente
Descripcioacuten de Compuestos
181
Zona Alifaacutetica
La regioacuten alifaacutetica de estas dos moleacuteculas son ideacutenticas por tanto las sentildeales
estaacuten a desplazamientos similares Estas moleacuteculas cuentan con cinco metilenos
de caraacutecter alifaacutetico y dos carbonos terciarios de los cuales C1 y C3p estaacuten muy
desapantallados por efecto tanto del OH
como por la pertenencia a una insaturacioacuten
como es el doble enlace de la
tetrahidropiridina Por las descripciones de
las zonas alifaacuteticas anteriores se puede
aproximar que el H perteneciente al C1
tendraacute un desplazamiento en torno a 500
ppm En la figura 72 queda sentildealada en
amarillo esta sentildeal a 470 ppm la otra sentildeal
de H sentildealada en naranja a un
desplazamiento 61 ppm corresponde al
protoacuten H3 de la tetrahidropiridina
Figura 72 Ampliacioacuten de RMN- 1H
La sentildeal pequentildea y ancha de entre ambas
sentildeales desaparece con agua deuterada por lo
que se identifica con el protoacuten del OH
El resto de sentildeales corresponden a la
tetrahidropiridina y el puente alifaacutetico En la
figura 73 se muestra ampliada la zona alifaacutetica
del espectro El estudio del espectro COSY
(Figura 74) ayudaraacute en la asignacioacuten de las
sentildeales
Figura 73 Ampliacioacuten RMN- 1H zona alifaacutetica
Habiendo asociado las sentildeales de C1 y C3p seguacuten los acoplamientos
mostrados se puede asignar las sentildeales de los carbonos contiguos con los que se
acopla De esta manera en la figura 74 puede observarse seguacuten los
acoplamientos cuaacuteles son los H contiguos al grupo hidroxilo que son los
pertenecientes a C2
Descripcioacuten de Compuestos
182
Figura 74 Asignacioacuten de las sentildeales de la cadena alifaacutetica
Se asigna la sentildeal que se observa a
180 ppm a C2 (CH2) puesto que es de
los dos el de mayor caraacutecter alifaacutetico
Integrado en el multiplete de 250 ppm
queda la sentildeal del otro CH2
correspondiente a C3 Si se traslada
esta asignacioacuten al HMQC (Figura 75) se
pueden asignar por las sentildeales a queacute C
pertenecen
Figura 75 Espectro HMQC- 1H-13C alifaacuteticos
Tomando como referencia el CH
de C3p (Figura 76) seguacuten los
acoplamientos mostrados en el
espectro COSY se determina
claramente cuaacutel es la sentildeal del CH2
de C2p
Figura 76 Ampliacioacuten zona alifaacutetica del espectro COSY
Si se continuacutea analizando los acoplamientos desde la sentildeal de H2 sentildealados
en morado se corresponde con el multiplete de 260 ppm de la RMN de protoacuten
Descripcioacuten de Compuestos
183
Como se ha explicado en el apartado anterior la posicioacuten espacial de la
moleacutecula genera acoplamientos deacutebiles de los H entre carbonos que no estaacuten
contiguos pero si espacialmente proacuteximos Por ello el multiplete genera
acoplamiento deacutebil con el hidroacutegeno del doble enlace y con los H2 y con una
tercera sentildeal que
pertenece a los H que
quedan por describir
Si se recurre al
espectro HMQC
(Figura 77) de esa
parte de la moleacutecula se
puede asignar las
sentildeales con seguridad
teniendo en cuenta los
desplazamientos
quiacutemicos de los
carbonos
Figura 77 Ampliacioacuten del espectro HMQC en la parte de la piridina
Habieacutendose asignado el H2 de C2p se puede ver el acoplamiento con el
carbono correspondiente Los dos carbonos que quedan por asignar
corresponden a las posiciones C5p y C6p El C5p teoacutericamente deberaacute aparecer a
desplazamientos menores pero la presencia del doble enlace hace que aparezca
a mayores desplazamientos Por tanto trazando las liacuteneas de unioacuten con la RMN
de protoacuten quedan justificadas todas las asignaciones realizadas al comienzo
sobre la resonancia de protoacuten
Zona aromaacutetica
Los protones aromaacuteticos de los compuestos 6g y 7g muestran diferentes
desplazamientos en la RMN- 1H (Figura 78)
Figura 78 Zona aromaacutetica de las RMN- 1H de los compuestos 6g y 7g respectivamente
Descripcioacuten de Compuestos
184
Sin embargo en una primera aproximacioacuten se puede comprobar que hay
sentildeales que se mantienen de una moleacutecula a otra La diferencia estructural entre
los dos compuestos estaacute en el sustituyente Ar1 donde se intercambian un fluacuteor y
un trifluorometil Por tanto las sentildeales que se conservan con desplazamientos a
710 ppm y 740 ppm pertenecen al benceno para sustituido de Ar2 (unido a la
amina) comuacuten en las dos estructuras Se recurre a los espectros bidimensionales
para la asignacioacuten de las sentildeales
En el espectro COSY del compuesto 7g (Figura 79) se puede determinar queacute
hidroacutegenos pertenecen a carbonos del mismo ciclo por sus acoplamientos
vecinales En la RMN- 1H del compuesto 7g a 710 ppm hay un triplete que
integra por dos hidroacutegenos Teoacutericamente la sentildeal obtenida deberiacutea ser un
doblete ya que los hidroacutegenos del los anillos solo se ven afectados por un
hidroacutegeno vecino La explicacioacuten de esta multiplicidad es la presencia del
aacutetomo de fluacuteor que no genera sentildeal pero si influencia en los hidroacutegenos vecinos
De esta forma se asigna esa sentildeal a 710 ppm a los hidroacutegenos 3acute y 5acute del anillo
de Ar2 Con el espectro COSY quedan descritos los correspondientes vecinos
H2acute y H6acute a 740 ppm
Figura 79 Espectro COSY del compuesto 6g
De esta manera queda claro que las otras dos sentildeales pertenecen a Ar1 Si se
recurre de nuevo a la RMN- 1H del compuesto 6g se puede observar una sentildeal
intensa que integra cuatro protones a 710 ppm Conociendo que dos
hidroacutegenos son H3acute y H5acute que pertenecen a Ar2 los otros dos seraacuten H3 y H5
pertenecientes al benceno unido al hidroxilo Ar1 que en este compuesto
tambieacuten tienen un aacutetomo de fluacuteor contiguo
Descripcioacuten de Compuestos
185
En el espectro COSY del compuesto 7g la sentildeal a 750 ppm se ha asignado a
H2acute y H6acute de Ar2 El compuesto 6g tiene los mismos protones H2acute y H6acute de Ar2 a
igual desplazamiento por lo que la sentildeal a 740 ppm perteneceraacute a los protones
H2 y H6 que faltaban por designar en el compuesto 6g Los uacutenicos protones que
no comparten 6g y 7g son H3 y H5 Por RMN- 1H del compuesto 6g se ha deduce
que estos hidroacutegenos dan una sentildeal a 71 ppm En el espectro del compuesto 7g
a 770 ppm hay una sentildeal que por lo explicado se asigna a estos hidroacutegenos
vecinos del grupo trifluorometil de Ar1
Las asignaciones son
Zona aromaacutetica
6g C2
FBZN
C3
FBZN
C5
FBZN
C6
FBZN
C2
FENIL
C3
FENIL
C5
FENIL
C6
FENIL
RMN-13C
(ppm) 12730 11580 11580 12730 12730 11580 11580 12730
RMN-1H
(ppm) 740 710 710 740 750 710 710 750
7g C2
TBZN
C3
TBZN
C5
TBZN
C6
TBZN
C2
FENIL
C3
FENIL
C5
FENIL
C6
FENIL
RMN-13C
(ppm) 12730 12570 12570 12730 12730 11580 11580 12730
RMN-1H
(ppm) 750 770 770 750 740 710 710 740
Zona alifaacutetica comuacuten
C1
alifaacutetico
C2
alifaacutetico
C3
alifaacutetico
C2
PIRD
C3
PIRD
C5
PIRD
C6
PIRD
RMN-13C
(ppm) 7149 3696 2836 5360 12280 5531 5074
RMN-1H
(ppm) 470 180 250 306 610 245 260
XXII EENNSSAAYYOOSS BBIIOOLLOacuteOacuteGGIICCOOSS
Ensayos Bioloacutegicos
189
XI1Ensayos de actividad antiplasmoacutedica in vitro
Se determinoacute como se describe en el apartado de material y meacutetodos la
actividad antimalaacuterica in vitro y la citotoxicidad de la mayor parte de los
compuestos obtenidos y los resultados se muestran en las siguiente tablas
(Tabla 4 5 y 6)
Compuesto Ar1 n Amina RaRb CI50
NF54 microM
CI50 FCR3 microM
DT50
Vero microM
IS VeroFCR3
1
2 PIPZ CF3NO2 1250 10310 3610 035
2 2 PIPZ NO2CF3 ND 090 490 544
9
2 PIPZ CF3NO2 830 4205 1890 045
11 2 PIRR CF3NO2 390 4605 7040 150
14
1 PIPZ CF3NO2 23260 19020 gt100 065
15 1 PIPZ NO2CF3 10320 18615 gt100 053
17
2 PIPZ NO2CF3 1700 7300 949 013
Referencia QC 004 013 gt50 gt350
Tabla 4 Tabla de resultados de actividad y citotoxicidad de los compuestos de la Serie 0 derivados carboniacutelicos CQ Cloroquina CI50 valores medios del ensayo realizado por triplicado expresados en microM de la inhibicioacuten del 50 del
crecimiento celular de cepas FCR-3 de Plasmodium falciparum DT50 concentracioacuten citotoacutexica media de los compuestos en ceacutelulas Vero IS Iacutendice de Selectividad de los compuestos obtenido del cociente de DT50 de ceacutelulas Vero y la CI50 en
cepas FCR3 ND No determinado
Ensayos Bioloacutegicos
190
Series Ar1 Comp n Amina RaRb CI50
NF54 microM
CI50
FCR3 microM
DT50 Vero microM
IS VeroFCR3
Serie 1
1a 2 PIPZ CF3NO2 230 400 2420 605
1b 2 PIPZ NO2CF3 420 645 gt100 gt100
1g 2 PIRD HF ND 1689 1790 106
Serie 2
2a 2 PIPZ CF3NO2 ND 130 gt200 gt100
2b 2 PIPZ NO2CF3 ND 223 gt150 8598
2c 2 PIPZ HCF3 ND 105 gt250 gt100
2d 2 DZP CF3NO2 ND 075 133 1770
2f 2 PIPR CF3NO2 ND 070 660 670
Serie 3
3b 2 PIPZ NO2CF3 1670 3615 gt100 380
3e 2 PIRR CF3NO2 610 1050 2970 190
3g 2 PIRD HF ND 1403 2460 175
Serie 4
4b 1 PIPZ NO2CF3 2170 10225 7460 070
Serie 5
5a 2 PIPZ CF3NO2 130 050 2090 4180
5b 2 PIPZ NO2CF3 170 490 7570 1540
5c 2 PIPZ HCF3 ND 093 gt200 gt100
5f 2 PIPR CF3NO2 ND 015 550 5500
5g 2 PIRD HF ND 040 3430 8590
Serie 6
6a 2 PIPZ CF3NO2 ND 036 8798 gt100
6f 2 PIPR CF3NO2 ND 048 3000 gt100
6g 2 PIRD HF ND 066 gt1000 gt1000
Serie 7
7g 2 PIRD HF ND 560 gt300 gt100
Referencia CQ 004 013 gt50 gt300
Tabla 5 Tabla de resultados de actividad y citotoxicidad de los compuestos hidroxiacutelicos CQ Cloroquina CI50 valores medios del ensayo realizado por triplicado expresados en microM de la inhibicioacuten del 50 del crecimiento celular de cepas FCR-3 de Plasmodium falciparum DT50 concentracioacuten citotoacutexica media de los compuestos en ceacutelulas Vero IS Iacutendice de
Selectividad de los compuestos obtenido del cociente de DT50 de ceacutelulas Vero y la CI50 en cepas FCR3 ND No determinado
Ensayos Bioloacutegicos
191
Serie 8
Ar1 Amina RaRb IC50
NF54 microM
IC50
FCR3 microM
DT50 Vero
microM
DT50 MCF7
microM
IS VeroFCR3
1
PIPZ NO2CF3 ND SA 150 471 ND
2 PIRR CF3NO2 214 465 101 ND 022
Referencia CQ 004 013 gt50 ND gt400
Tabla 6 Tabla de resultados de actividad y citotoxicidad de los compuestos de la Serie 8 derivados oxima CQ Cloroquina CI50 valores medios del ensayo realizado por triplicado expresados en microM de la inhibicioacuten del 50 del
crecimiento celular de cepas FCR-3 de Plasmodium falciparum DT50 concentracioacuten citotoacutexica media de los compuestos en ceacutelulas Vero IS Iacutendice de Selectividad de los compuestos obtenido del cociente de DT50 de ceacutelulas Vero y la CI50 en
cepas FCR3 ND No determinado SA sin actividad
XI2 Ensayos de actividad antiplasmoacutedica in vivo
Los ensayos in vivo comenzaron con los ensayos de virulencia para obtener
una aproximacioacuten del comportamiento de la cepa elegida Fueron desarrollados
como se muestra en la figura 80
Figura 80 Desarrollo del ensayo de virulencia previo al ensayo de actividad in vivo de los compuestos
En ratones parasitados al 50 hay 24x106 hematiacutees infectados por microL y son
necesarios 107 hematiacutees totales por ratoacuten Para el test de Peters se dispuso de
Ensayos Bioloacutegicos
192
100 ratones pero en los caacutelculos teniendo en cuenta las posibles peacuterdidas se
contoacute con 110 ratones en total Asiacute fueron necesarios 110x107 paraacutesitos para
comenzar la experimentacioacuten El volumen maacuteximo que inyectar es 100 microL de
solucioacuten lo que supone preparar 11 mL de solucioacuten de sangre parasitada al
comienzo del ensayo
Teniendo en cuenta estos tres datos fueron necesarios 458 microL de sangre
infectada al 50 en un volumen de 11 mL de suero fisioloacutegico Con la
inoculacioacuten de los ratones da comienzo el Test de Peters
Los resultados a lo largo del test se ofrecen en la Tabla 7
Test de Peters (respuesta visual externa) P Supervivencia
Grupo Diacutea 0 Diacutea 1 Diacutea 2 Diacutea 3 Diacutea 4 Diacutea 5 Diacutea 7 Diacutea 9 Diacutea 11 Diacutea 12
Control negativo - - + AC + AC + AC 23 910 35 13 11 1
Control positivo - - + AC + AC + AC 19 1010 68 44 44 2
Grupo 2a1 - - + AC + AC + AC 24 710 34 12 - -
Grupo 2a2 - - + AC + AC + AC 32 810 22 22 - -
Grupo 2a3 - - + AC + AC + AC 14 1010 66 55 13 1
Grupo 2a4 - - + AC + AC + AC 31 910 45 22 12 1
Grupo 5f1 - +AC +AC
ID
+AC
BMBO
+AC
BMBO 6 510 35 33 23 2
Grupo 5f2 - +AC + AC +AC
BMBO
+AC
BMBO 15 1010 67 45 23 -
Grupo 5f3 - +AC + AC + AC + AC 32 910 44 23 - -
Grupo 5f4 - +AC + AC + AC + AC 18 1010 67 44 - -
Tabla 7 Resultados de los ensayos in vivo para los compuestos 2a y 5f P porcentaje de parasitemia (-) sin respuesta visual externa (+) respuesta externa AC alteracioacuten momentaacutenea del comportamiento en el momento de la inyeccioacuten del tratamiento BM baja movilidad BO baja oxigenacioacuten principios de cianosis parasitemia medida al cuarto diacutea
Supervivencia expresada en ratones supervivientes con respecto al grupo el diacutea determinado
XI3 Discusioacuten de ensayos bioloacutegicos
Los resultados bioloacutegicos obtenidos ofrecen datos de estructura-actividad
suficientemente consistentes como para proseguir con un refinamiento
estructural de los compuestos El estudio del comportamiento de los
compuestos de las diferentes series en el ensayo de actividad antiplasmoacutedica in
vitro en la cepa FCR3 ha sido suficiente para comprobar que (Series 1-7) son
mucho maacutes activos en todos los casos los derivados hidroxiacutelicos (CHOH) que
un reducido nuacutemero de derivados carboniacutelicos (Serie 0) Por esto no fueron
ensayados el resto de compuestos de la Serie 0
Ensayos Bioloacutegicos
193
Los mismos resultados se obtuvieron para las dos oximas de la Serie 8 por lo
que se paroacute su siacutentesis Sin embargo esto no es extensible a los datos de
toxicidad que se ve influenciada por otros sustituyentes en la moleacutecula Por esto
se centraraacute el estudio en los resultados de las modificaciones estructurales de
los derivados hidroxiacutelicos pertenecientes a las Series 1 a 7
En referencia al sustituyente en la posicioacuten Ar1 comparando series como 1 vs
2 y 3 vs 5 se puede destacar que las series con un grupo fluacuteor en Ar1 aumentan
significativamente su actividad sin ser extensible este dato a la toxicidad (veacutease
compuestos 1a vs 2a 1b vs 2b 3b vs 5b y 3g vs 5g) La siguiente comparativa se
basa en la naturaleza de los anillos condensados (benzo[b]tiofeno y naftaleno)
respecto del benceno sustituido que forman el nuacutecleo del sustituyente Ar1 En
una primera aproximacioacuten se puede ver que la actividad desciende en orden
derivados de FNFTgtderivados de FBZNgtderivados de FBTF Comparando
ahora la actividad de los compuestos 1a vs 2a vs 3a vs 5a vs 6a puede verse que
el compuesto 5f (derivado de FNFT) tiene el mejor dato de CI50 pero el
compuesto 6a (derivado de FBZN) es el que mejor actividad in vitro ha
mostrado siendo soacutelo 3 veces menos activo que la CQ usada como referencia Si
se comparan los derivados de FBTF (Serie 2) y FNFT (Serie 5) en general los
compuestos de la Serie 5 son maacutes activos que sus homoacutelogos de la Serie 2
excepto en el caso de los compuestos 2b vs 5b
En cuanto a toxicidad aunque de forma menos marcada se observa un
aumento en los derivados de FNFT respecto de sus homoacutelogos de FBTF
Centrando el estudio en la variacioacuten de la longitud de la cadena alifaacutetica se
comparan los compuestos 3b y 4b La mayor parte de los compuestos
sintetizados contienen dos carbonos en la cadena alifaacutetica La disminucioacuten en
un aacutetomo de carbono en esta cadena (Compuestos de la Serie 0 14 y 015 y Serie
4) supone una peacuterdida muy considerable de la actividad de los compuestos
Este dato de menor actividad condujo a cerrar esta serie
La naturaleza de la amina central ademaacutes de influir claramente en la
actividad tiene gran influencia en la toxicidad in vitro de los derivados De
forma que se puede ver como la mayoriacutea de derivados de piperazina muestran
una toxicidad bastante baja en comparacioacuten con compuestos derivados de otras
aminas Por el contrario exceptuando el compuesto 6a estos derivados tienen
menor actividad que sus anaacutelogos con otras aminas como homopiperazinas
(compuestos 2a vs 2d) o piperidinas (compuestos 2a vs 2f o 5a vs 5f)
Ensayos Bioloacutegicos
194
Se puede plantear como hipoacutetesis que la presencia de un grupo NH libre en la
estructura aumenta considerablemente la toxicidad de los compuestos Este
caso se observa en los derivados de la Serie 2 y Serie 3 donde los compuestos
con piperazina no son toacutexicos pero al introducir una amina con un NH libre
aumenta su toxicidad a la vez que lo hace la actividad Esto no es de aplicacioacuten
en los anaacutelogos de la Serie 5 (ya que el compuesto 5a contiene el anillo de
piperazina y muestra toxicidad) por lo que se podriacutea deducir que el grupo FNFT
confiere por si mismo cierta toxicidad Con respecto a los derivados de
tetrahidropiridina no se tienen suficientes datos como para extraer conclusiones
claras en la relacioacuten estructura-actividad
Por uacuteltimo se estudia la variacioacuten de la actividad y citotoxicidad en relacioacuten a
los sustituyentes en Ar2 Si se comparan los compuestos a y b de las diferentes
series se deduce que es conveniente para la actividad que el grupo CF3 esteacute en
posicioacuten orto con respecto a la amina (compuestos ldquoardquo de las diferentes series)
Los compuestos con CF3 en para (compuestos ldquobrdquo) son menos activos pero
tambieacuten menos toacutexicos Los anaacutelogos que carecen de grupo NO2 (compuestos 2c
y 5c) aumentan la actividad y cabe destacar el descenso en la toxicidad por lo
que se deduce que el grupo NO2 confiere toxicidad no ligada a la actividad
como el caso de los grupos NH libres Los datos obtenidos permiten una
aproximacioacuten al comportamiento de los compuestos in vivo Para estos ensayos
de los compuestos disponibles se seleccionaron dos el 5f el maacutes activo
(proacuteximo al compuesto de referencia) y 2a el de mejor perfil de toxicidad
En la Tabla 4 se muestran los datos experimentales obtenidos durante la
realizacioacuten del Test de Peters El compuesto 5f disminuye en gran medida la
parasitemia a altas concentraciones pero por acumulacioacuten en el tratamiento
diario provoca diferentes muestras de toxicidad como mala oxigenacioacuten o
alteraciones de conducta de los ratones A concentraciones menores los
resultados desafortunadamente no son tan relevantes como cabiacutea esperar ni en
cuanto a parasitemias ni a supervivencia
El compuesto 2a si bien no muestra indicios de toxicidad no mejora los
resultados con respecto a la CQ en datos de parasitemia ni de supervivencia
XXIIII EENNSSAAYYOOSS CCOOMMPPUUTTAACCIIOONNAALLEESS
Ensayos Computacionales
197
XII1 Propiedades fisicoquiacutemicas de los compuestos
Todos los valores obtenidos en relacioacuten a las propiedades fisicoquiacutemicas de
los compuestos sintetizados se exponen en la tabla siguiente (Tabla 8)
ABS TPSA (Ǻ2)
n-ROTB
PM miLogP KOWLogP ALogPS
21 MLogP
n-OHNH n-ON aceptores
Lipinskis violations ID donadores
rule
gt500 lt5 lt5 lt5 lt415 lt5 lt10 le1
01 8506 6940 7 46350 503 486 480 414 0 6 1
02 8507 6937 7 gt500 503 486 476 414 0 6 1
03 10000 2031 5 36450 481 548 52 442 0 2 0
04 8507 6937 7 48151 419 506 476 424 0 6 0
05 8507 6937 7 48151 419 506 476 424 0 6 0
06 10000 2355 6 43651 431 525 502 451 0 3 0
07 8703 6368 7 49554 401 543 504 485 0 5 0
08 8203 7816 8 49554 448 576 463 445 1 6 0
09 8506 6940 7 4940 532 504 479 448 0 6 1
010 8507 6937 8 gt500 489 504 520 448 0 6 0
011 8202 7820 8 4940 533 525 435 448 1 6 1
012 10000 2031 5 35947 510 566 507 477 0 2 1
013 10000 2031 6 37741 481 544 461 487 0 2 0
014 8506 6940 6 44340 505 531 458 427 0 6 1
015 8506 6940 6 44340 505 531 461 427 0 6 1
016 8507 6937 7 47548 541 524 457 458 0 6 1
017 8506 6940 7 47540 541 524 458 458 0 6 1
018 10000 2355 6 43048 552 543 504 485 0 3 1
019 8203 7816 8 48951 463 594 461 478 1 6 0
020 10000 2031 5 37746 519 580 490 514 0 2 1
021 8507 6937 7 42542 430 407 372 390 0 6 0
022 8203 7816 8 43945 458 477 373 411 1 6 0
023 10000 2031 5 32740 408 468 422 411 0 2 0
81 7971 8489 7 47247 538 468 463 395 1 7 1
82 7668 9368 8 47247 469 458 463 395 1 6 0
CQ 9930 2820 8 31990 501 450 528 352 1 3 1
Tabla 8 Datos computacionales de las propiedades fisicoquiacutemicas de los derivados de la Serie 0 y Serie 8 ABS porcentaje de absorcioacuten calculado como 109 ndash (0345 x TPSA) siendo TPSA el Aacuterea Superficial Polar Topoloacutegica n-
ROTB es el nuacutemero de enlaces de giro permitido Log P es el coeficiente de particioacuten del compuesto en octanol-agua n-OHNH es nuacutemero de enlaces de hidrogeno donadores n-ON es el nuacutemero de enlaces de hidroacutegeno aceptores CQ
cloroquina
ID ABS TPSA (Ǻ2) n-ROTB PM miLogP KOWLogP ALogPS 21 MLogP n-OHNH n-ON
aceptores Lipinskis violations donadores
rule
gt500 lt5 lt5 lt5 lt415 lt5 lt10 le1
1a 8398 7253 7 46550 469 468 463 395 1 6 0
1b 8398 7253 7 gt500 469 458 463 395 1 6 0
1g 10000 2347 5 40399 447 530 461 423 1 2 0
2a 8398 7253 7 48349 407 488 499 432 1 6 0
2b 8398 7253 7 gt500 478 488 499 432 1 6 0
2c 9979 2670 6 43849 397 507 509 432 1 3 0
2d 8398 7253 7 49751 413 538 505 453 1 6 0
2f 8095 8132 8 49751 414 558 461 453 2 6 0
3b 8398 7253 7 49600 498 486 483 429 1 6 0
3e 8095 8132 8 49607 499 506 439 429 1 6 0
3g 10000 2347 5 36146 476 548 466 457 1 2 0
4b 8399 7250 6 44540 471 415 477 408 1 6 0
5a 8399 7250 7 47750 507 506 503 466 1 6 1
5b 8399 7250 7 47750 507 424 384 546 1 6 1
5c 9979 2670 6 46896 519 525 514 466 1 3 1
5f 8095 8132 8 49147 536 576 465 486 2 6 1
5g 10000 2347 5 37945 485 568 488 495 1 2 0
6a 8398 7253 7 46591 337 389 413 398 1 6 0
6f 8095 8132 8 47994 424 459 374 419 2 6 0
6g 10000 2347 5 329 39 374 450 395 425 1 2 0
7g 10000 2347 6 37974 447 526 469 468 1 2 0
CQ 9930 2820 8 31990 501 450 528 352 1 3 1
Tabla 9 Datos computacionales de las propiedades fisicoquiacutemicas de los derivados hidroxiacutelicos ABS porcentaje de absorcioacuten calculado como 109 ndash (0345 x TPSA) siendo TPSA el Aacuterea Superficial Polar Topoloacutegica n- ROTB es el nuacutemero de enlaces de giro permitido Log P es el coeficiente de particioacuten del compuesto en octanol-agua n-OHNH es nuacutemero de enlaces de hidrogeno donadores n-
ON es el nuacutemero de enlaces de hidroacutegeno aceptores CQ cloroquina
Ensayos Computacionales
199
XII2 Discusioacuten de propiedades fisicoquiacutemicas
Los estudios teoacutericos de los paraacutemetros fiacutesico-quiacutemicos muestran que los
compuestos cumplen las Reglas de Lipinski ya que tienen un peso molecular
menor de 500 Daltons los coeficientes de particioacuten octanolagua estaacuten dentro
de los liacutemites admitidos (entre -04 y 56) lejos de los cinco enlaces donadores
de hidroacutegeno (suma de los OH y NH) y de los 10 aceptores (suma de O y N)
Las caracteriacutesticas estructurales han de ser tenidas en cuenta para predecir la
solubilidad de los compuestos
El tamantildeo de las estructuras influye de manera directa en la absorcioacuten de un
compuesto puesto que los de bajo peso molecular difunden mejor pasivamente
Todos los compuestos de este trabajo presentan bajos pesos moleculares
La polaridad de las estructuras tambieacuten juega un papel importante en las
caracteriacutesticas farmacocineacuteticas Las moleacuteculas apolares difunden con mayor
facilidad que las polares ya que son maacutes lipoacutefilas Los coeficientes de reparto
octanolagua determinan esta caracteriacutestica de la moleacutecula teniendo en cuenta
el medio Es decir los compuestos con altos coeficientes de particioacuten son maacutes
hidroacutefobos y por tanto tendraacuten buena difusioacuten Los valores obtenidos para los
distintos compuestos en las diferentes aplicaciones utilizadas no muestran una
tendencia clara que permita distinguir entre estructuras Lo que siacute cabe destacar
es que todos cuentan con valores altos proacuteximos a 5 que les confiere buena
difusioacuten
Los aacutetomos que conforman las moleacuteculas estaacuten cargados y confieren
polaridad a la estructura Esta caracteriacutestica estaacute distribuida en el espacio de
diferente forma seguacuten los aacutetomos de O N y F que posea la moleacutecula dando
lugar al TPSA (suma de superficie de todos los aacutetomos polares) La bibliografiacutea
(Palm et alts 1997) demuestra que la liposolubilidad estaacute relacionada con los
valores de TPSA Los valores de TPSA entre 63 y 139 Aring2 predicen una buena
absorcioacuten de los compuestos La mayoriacutea de las estructuras del trabajo estaacuten
dentro de esos paraacutemetros incluso hay estructuras que como la CQ tienen
TPSA menores de 63 Aring2 que indican que el porcentaje de absorcioacuten de los
compuestos seraacute oacuteptimo
Todos los paraacutemetros fisicoquiacutemicos proponen unas buenas cualidades de
absorcioacuten de los compuestos de este trabajo
Ensayos computacionales
200
XII3 Estudios de Modelizacioacuten y Acoplamiento Molecular
Se realiza una primera aproximacioacuten para la validacioacuten de la diana propuesta
usando el programa Autodock donde se analizan los modos de unioacuten maacutes
representativos de las diez conformaciones calculadas del compuesto EH58 y del
5a con al menos un enlace de hidroacutegeno con uno de los aspartatos del sitio
cataliacutetico Las energiacuteas de unioacuten y los valores de RMSD de EH58 y las energiacuteas de
unioacuten del compuesto 5a para esas diez conformaciones se muestran en la
siguiente tabla
EH58 5a
Confa Energiacutea
b RMSD
c Energiacutea
b
1 -406 453 -616
2 -250 361 -607
3 -245 559 -585
4 -230 393 -584
5 -232 299 -570
6 -232 632 -556
7 -209 551 -556
8 -197 557 -545
9 -162 556 -525
10 -121 733 -478
Tabla 10 Datos de energiacutea de las distintas conformaciones de los compuestos EH58 y 5a a Mejores conformaciones obtenidas por docking ordenadas seguacuten la energiacutea b energiacutea de unioacuten en in Kcalmol calculadas con el programa
Autodock c Valores RMSD en Aring
Los resultados de los ensayos computacionales realizados al compuesto 5a
producen representaciones graacuteficas tridimensionales del MEP (Figura 81) de la
conformacioacuten de miacutenima energiacutea obtenida seguacuten los datos mostrados en la
anterior Tabla 10
En el MEP se observa una red de potencial electronegativo alrededor del fluacuteor
los grupos OH y los NO2 Asiacute se puede deducir que los compuestos maacutes activos
los derivados hidroxiacutelicos tendraacuten un potencial electronegativo y un modo de
accioacuten similar
Ensayos Computacionales
201
Figura 81 MEP de la mejor conformacioacuten del compuesto 5g
Los estudios de docking se orientaron a la unioacuten entre el compuesto liacuteder y la
plasmepsina II como se ha explicado anteriormente Se llegoacute a la conclusioacuten que
se forma un puente de hidroacutegeno con el sitio activo de la aspartato cataliacutetica de
la enzima (ASP 214 y ASP 34) Esta interaccioacuten se da sobre el uacutenico grupo
hidroxilo de la moleacutecula y el residuo ASP 214
Todo esto nos aporta representaciones graacuteficas como la obtenida para la mejor
conformacioacuten encontrada para el compuesto 5a dentro del sitio activo de la
plasmepsina II (figura 82)
Figura 82 Representacioacuten de la unioacuten del compuesto 5a y la Plasmepsina Sentildealado con raya discontinua amarilla la unioacuten del OH y la ASP 214 Tambieacuten se puede ver dibujadas en rama otras terminaciones de la enzima
En base al resultado obtenido en la primera aproximacioacuten con el programa
Autodock que valida como diana la plasmepsina se realiza una segunda
aproximacioacuten con el programa ICM que emplea menos tiempo para sus caacutelculos
una vez conocidos los paraacutemetros de buacutesqueda base
Ensayos computacionales
202
Para este segundo estudio se emplearon las estructuras de los derivados 5a 5c
5g 6a 6g y 6f Una de las hipoacutetesis base del estudio es que partiendo de que
habiacutea comprobado que el compuesto 5a encaja en el sitio activo los demaacutes
derivados deberaacuten encajar tambieacuten Esto se confirma en la figura 83 donde se
muestra como los diferentes derivados solapan estructuralmente en el hueco del
sitio activo de la moleacutecula
Figura 83 Imagen de la plasmepsina donde se muestra el solapamiento de las diferentes estructuras estudiadas
El programa ICM realizoacute caacutelculos para obtener las energiacuteas de las mejores
conformaciones de las moleacuteculas propuestas (Tabla 11)
Compuesto Energiacutea
(Kcalmol) Actividad
uM
5f -917627 015
5a -867278 05
6f -815261 048
6a -764088 036
5c -751448 093
6g -681119 066
Tabla 11 Energiacutea de las conformaciones oacuteptimas de los diferentes compuestos estudiados
Teniendo en cuenta los datos de energiacutea y las configuraciones espaciales maacutes
estables para el sitio de unioacuten de las moleacuteculas se obtuvo la representacioacuten de las
interacciones que realiza cada moleacutecula en el sitio activo de la enzima
plasmepsina (Figuras 84 a 89)
En la figura 84 se puede ver la representacioacuten de las interacciones del
compuesto 5a en el sitio activo En amarillo quedan sentildealadas las interacciones
hidrofoacutebicas (interacciones de Van der Waals) entre restos apolares de la
Ensayos Computacionales
203
moleacutecula y de los restos de la enzima
En verde se sentildeala el puente de
hidroacutegeno entre el grupo OH y la
ASP 214 En este compuesto el
programa plantea otra posible unioacuten
con el resto THR 217 En azul se
resalta la regioacuten ionizable la amina
Los restos libres que podriacutean
interaccionar con las moleacuteculas
propuestas se plantean en recuadros
alrededor de ella
Figura 84 Representacioacuten de las interacciones de 5a
En la figura 85 se puede estudiar la
variacioacuten en las interacciones con el
cambio de posicioacuten del grupo CF3 y la
desaparicioacuten del grupo NO2 del
compuesto 5c Ahora el programa
plantea la posibilidad de la interaccioacuten
del OH con ASP 34 ademaacutes de la
interaccioacuten con ASP 214
Figura 85 Representacioacuten de las interacciones de 5c
En la figura 86 se muestra el compuesto 5f y se aprecia el cambio los aacutengulos de
conformacioacuten de la estructura
cuando la amina PIPZ central se
cambia por PIPR Se observa como
se establecen muchas maacutes
interacciones apolares del grupo
FNFT y del CF3 en orto pero
disminuyen las del ciclo de la amina
con respecto a la piperazina
Ademaacutes se plantea una nueva unioacuten
por puente de hidroacutegeno entre el
NH libre y la ASP 34
Figura 86 Representacioacuten de las interacciones de 5f
Ensayos computacionales
204
En la figura 87 el compuesto 6f se
diferencia del anterior en que en lugar de
un FNFT se tiene un FBZN que plantea
una unioacuten con el resto TYR 192 Se ve a
simple vista la disminucioacuten en la cantidad
de interacciones apolares que hay en la
moleacutecula
Figura87 Representacioacuten de las interacciones de 6f
En la figura 88 se representa el
compuesto 6a Se puede ver como de
nuevo el anillo de PIPZ vuelve a dar
interacciones apolares y aporta
regiones ionizables aunque se pierde
el puente de hidroacutegeno con ASP 34
Figura 88 Representacioacuten de las interacciones de 6a
En esta uacuteltima figura 89 se
representa el compuesto 6g que se
diferencia del anterior en que la
amina central es la PIRD Este ciclo
posibilita una interaccioacuten con TYR 77
y VAL 78 La distribucioacuten de
interacciones apolares se asemeja a la
de la moleacutecula 5c ya que el
sustituyente tambieacuten de caraacutecter
electro-atrayente se encuentra en
posicioacuten para del anillo
Figura 89 Representacioacuten de las interacciones de 6g
En este estudio se incluyoacute una seacuteptima moleacutecula el derivado 4b Este
compuesto se diferencia del resto de los sintetizados en que su cadena alifaacutetica
cuenta con dos aacutetomos de carbono lo que significa que la separacioacuten entre el OH
y la amina es de un uacutenico carbono Los caacutelculos sobre energiacuteas y configuraciones
espaciales de maacutexima estabilidad para una correcta interaccioacuten con la diana
Ensayos Computacionales
205
propuesta mostraron que el compuesto 4b puede adoptar una conformacioacuten que
le permitiriacutea acceder al hueco activo de la plasmepsina pero no se produciriacutea la
interaccioacuten caracteriacutestica del grupo OH y la ASP 214
Estos datos ofrecen la posibilidad de un farmacoacuteforo que se muestra en la
figura 90
Figura 90 Farmacoacuteforo propuesto para los derivados de arilaminoalcoholes con actividad antimalaacuterica que tienen como diana propuesta la plasmepsina II
En la imagen del farmacoacuteforo quedan destacadas en amarillo las zonas
apolares que establecen interacciones hidrofoacutebicas con los aminoaacutecidos del sitio
activo de la plasmepsina y que se corresponden con la zona aromaacutetica Ar1 Las
flechas granate sentildealan las posibles interacciones que establece el aacutetomo de fluacuteor
Las flechas verdes sentildealan las interacciones polares entre los grupos polares y la
ASP 214 Asiacute de la zona azul correspondiente a las interacciones de la amina se
destaca una segunda interaccioacuten de los NH libres con la enzima en el resto ASP
34 El resto del ciclo de amina establece interacciones apolares
En la imagen la parte de Ar2 por su naturaleza aromaacutetica tambieacuten plantea
interacciones apolares con la enzima propuesta
Con los datos obtenidos y tomando como diana la enzima plasmepsina se puede
proponer un nuevo esquema para seguir con el refinamiento estructural
Ensayos computacionales
206
Figura 91 Estructura general planteada para el refinamiento estructural
Las nuevas estructuras deberaacuten contar con un grupo hidroxilo separado por un
espaciador alifaacutetico de una longitud miacutenima de dos carbonos con una amina A
ambos lados de la moleacutecula se dispondraacuten las zonas de interaccioacuten apolar
formadas por sistemas aromaacuteticos sencillos o conjugados sutituidos por grupos
de caraacutecter electroatrayente como haloacutegenos metoxi o trifluorometoxi
Ensayos Computacionales
207
XII4 Discusioacuten de resultados de modelizacioacuten
Los estudios computacionales proponen como diana de los compuestos
desarrollados en este trabajo la plasmepsina II Seguacuten los datos obtenidos para
las diferentes estructuras estudiadas se pueden establecer relaciones
estructura-actividad Estos resultados se ven confirmados por las distintas
interacciones de los compuestos en su conformacioacuten maacutes estable dentro de
hueco activo de la enzima
Al estudiar los resultados de las diferentes interacciones por zonas de las
moleacuteculas en las figuras 84 a 89 se podriacutea dar una explicacioacuten de la diferente
actividad mostrada por los compuestos ensayados
Queda evidenciado desde la primera aproximacioacuten computacional que el
puente de hidroacutegeno entre el grupo OH y la ASP 214 es el punto clave en la
validacioacuten de la plasmepsina II como diana de los compuestos Esta interaccioacuten
confirma que es requisito indispensable para la actividad de los derivados la
presencia de un grupo OH en la estructura
Los sistemas aromaacuteticos conjugados o anillo aromaacutetico que conforman Ar1
son sistemas completamente apolares que ejercen interacciones hidrofoacutebicas
con los restos apolares del bolsillo activo de la enzima como isoleucina (ILE)
fenilalanina (PHE) o leucina (LEU) Cuanto mayor es la nube de electrones π del
sistema Ar1 mayores son las interacciones con los sistemas π de los
aminoaacutecidos que explica porqueacute los derivados de la Serie 5 tienen maacutes
actividad que los de la Serie 6 Varias representaciones plantean una posible
unioacuten polar del aacutetomo de fluacuteor con tirosina (TYR) que aumentariacutea la interaccioacuten
global de la moleacutecula y aclara el porqueacute los derivados fluorados son maacutes afines
que los no fluorados
La longitud de la cadena alifaacutetica tambieacuten juega un papel importante en la
actividad de los derivados la disminucioacuten de tres aacutetomos de carbono a dos de
la cadena alifaacutetica ha supuesto una disminucioacuten draacutestica de la actividad (veacuteanse
los compuestos 3b y 4b) Los estudios realizados al compuesto 4b podriacutean
explicar esta disminucioacuten Los carbonos de la cadena alifaacutetica tienen capacidad
de rotar lo que confiere a la estructura mayor capacidad para adoptar
diferentes conformaciones que le permiten llegar a la disposicioacuten de miacutenima
energiacutea Los derivados ensayados con un carbono alifaacutetico menos seguacuten las
previsiones teoacutericas adoptan una conformacioacuten que les permite acceder al
Ensayos computacionales
208
hueco activo de la plasmepsina II pero no permite la unioacuten del grupo OH con
el resto ASP 214 que se predice como esencial para la actividad de los
compuestos presentados en este trabajo Se puede predecir que teoacutericamente la
plasmepsina II no es la diana adecuada para los derivados de la Serie 0 14 y 15
y 4b
La naturaleza de la amina central juega un papel muy importante en este tipo
de estudios Puede verse en las representaciones que seguacuten sea la amina
piperazina o amino-piperidina las interacciones con el entorno son muy
diferentes Centrando la atencioacuten en los derivados de PIPZ se observa que el
ciclo por completo da lugar a una regioacuten ionizable por el efecto del N y las
interacciones electrostaacuteticas del ciclo debidas al plegamiento espacial que
confiere estabilidad Si ahora se estudian las PIPR lo que se puede ver es que el
ciclo pierde interaccioacuten apolar con el medio ya que se plantea un nuevo puente
de hidroacutegeno del grupo NH libre con el resto ASP 34 Esta segunda unioacuten polar
hace que la moleacutecula adquiera menos energiacutea y maacutes estabilidad dentro del
hueco activo que justifica por queacute los derivados de amino-piperidina muestran
maacutes actividad (compuestos 2a y 2f 5a y 5f 6a y 6f)
Los grupos CF3 y NO2 presentes en Ar2 y OH seguacuten el mapa MEP de
potenciales electrostaacuteticos son restos que aportan polaridad a las moleacuteculas La
posibilidad de establecer nuevas interacciones polares maacutes fuertes con sitios del
hueco de la plasmepsina podriacutea explicar por queacute son maacutes activos los
compuestos con estos restos
Con los datos obtenidos en los estudios computacionales se puede proponer
un posible farmacoacuteforo para la plasmepsina II En la figura 89 se ve como las
interacciones maacutes importantes son las descritas teoacutericamente para los enlaces
polares del OH con la ASP214 NH libre con ASP 34 y la posible interaccioacuten del
aacutetomo de fluacuteor de Ar1 con otros restos como tirosina lo que justifica los datos de
actividad de los derivados El resto de interacciones con el sitio activo son
producidas por los restos apolares de la estructura lo que sugiere que es
necesaria la presencia de zonas aromaacuteticas terminales como son los NFT o BZN
en Ar1 y Ar2 Los datos disponibles no permiten establecer una hipoacutetesis sobre
la influencia del tamantildeo de las zonas aromaacuteticas ni de los sustituyentes
presentes en la zona aromaacutetica de Ar2
CONCLUSIONES
Conclusiones
211
El objetivo de este trabajo ha sido la obtencioacuten de nuevos arilaminoalcoholes
como agentes antimalaacutericos para el tratamiento de la malaria resistente al
tratamiento con cloroquina
En las paacuteginas de esta memoria se han presentado los antecedentes del tema
los objetivos fijados y el plan de trabajo para su desarrollo Se ha realizado la
parte experimental correspondiente y ha sido descrito el trabajo realizado en la
preparacioacuten de los compuestos asiacute como en los ensayos bioloacutegicos y
computacionales Finalmente se ha realizado la discusioacuten de los diferentes
resultados obtenidos para obtener unas conclusiones estructura actividad de los
compuestos que se presentan
Desde el punto de vista quiacutemico las aportaciones son las siguientes
1 Se ha sintetizado cuarenta y siete nuevos compuestos derivados de
arilaminas identificados mediante teacutecnicas claacutesicas de elucidacioacuten
estructural como cromatografiacutea de capa fina espectroscopia infrarroja
resonancia magneacutetica nuclear de protoacuten anaacutelisis elemental y punto de
fusioacuten
2 Se ha logrado optimizar rutas sinteacuteticas anteriormente utilizadas para
obtener derivados con mejores rendimientos En el caso de la siacutentesis de
aminas sustituidas se ha comprobado que una relacioacuten molar de amina
protegida-halogenuro de arilo 151 mejora considerablemente los tiempos
de reaccioacuten El uso de esta proporcioacuten de reactivos de partida favorece que
la reaccioacuten finalice en una hora En la obtencioacuten de los derivados
carboniacutelicos por siacutentesis de Mannich la reaccioacuten se optimiza cuando la
temperatura de reflujo se mantiene entre 130 y 140 ordmC De esta forma el
tiempo necesario para completar la reaccioacuten se reduce a un maacuteximo de tres
horas
3 La aplicacioacuten de la cromatografiacutea en columna flash para la purificacioacuten de
23 de los 47 compuestos ha supuesto un notable avance en la obtencioacuten de
los derivados Las condiciones de trabajo se han adaptado a las necesidades
de cada reaccioacuten reducieacutendose asiacute los tiempos globales de siacutentesis
aumentando los rendimientos y disminuyendo los costes
Desde el punto de vista bioloacutegico las aportaciones son las siguientes
1 Diez de los treinta compuestos evaluados in vitro frente a cepas de
Plasmodium falciparum FCR-3 cloroquino resistentes presentan un valor de
CI50 inferior a 1 microM Quince derivados muestran un nivel de citotoxicidad
en ceacutelulas VERO menor de 50 microM Estos resultados permiten confirmar que
la hipoacutetesis de trabajo planteada fue bien dirigida hacia los objetivos
establecidos
2 Los compuestos 2a y 5f fueron seleccionados para desarrollar ensayos in
vivo Los resultados obtenidos no superan los datos de parasitemia y
supervivencia obtenidos en el tratamiento con CQ
3 Los datos obtenidos en los estudios realizados a la totalidad de los
compuestos presentados en este trabajo indican buenas propiedades
fisicoquiacutemicas de solubilidad y distribucioacuten de cargas electrostaacuteticas Con
estos datos teoacutericos se predice un buen perfil de absorcioacuten en el caso de
tratamientos por viacutea oral
4 Los estudios computacionales proponen como diana de los compuestos
desarrollados en este trabajo la enzima Plasmepsina II que interviene en
los procesos de degradacioacuten de la Hb Quedando pendiente su validacioacuten
experimental
5 Siete de los veintiuacuten derivados hidroxiacutelicos que mostraron buenas
actividades in vitro fueron seleccionados para los estudios de acoplamiento
(docking) con la enzima diana plasmepsina II Se obtuvieron buenos
resultados de acoplamiento de los derivados seleccionados en el sitio activo
de la enzima debido a la unioacuten por puente de hidroacutegeno del grupo
hidroxilo con el resto ASP 214 reforzado por el resto de interacciones
electrostaacuteticas de las zonas apolares de la moleacutecula y restos apolares del
hueco activo de la plasmepsina II
De los resultados bioloacutegicos obtenidos se puede establecer la siguiente
relacioacuten estructura-actividad
1 El estudio de la actividad antimalaacuterica ha demostrado que es esencial la
presencia de un grupo hidroxilo en la estructura Queda demostrado que
los compuestos de las Series 1 a 7 muestran actividad significativa frente al
Plasmodium falciparum resistente a la CQ Los derivados cetona (Serie 0) y
oxima (Serie 8) carecen de intereacutes seguacuten los datos de actividad
Conclusiones
213
2 Entre los derivados hidroxiacutelicos los compuestos de las Series 2 5 y 6 son
los que muestran mejores actividades debido a la presencia de un aacutetomo de
fluacuteor en la posicioacuten 5 del benzo[b]tiofeno en la posicioacuten 4 del naftaleno y
para del benceno respectivamente A su vez son los derivados de las Series
5 y 6 (naftalenos y bencenos) los que han mostrado mejores potenciales
antimalaacuterico
3 La longitud miacutenima de la cadena alifaacutetica debe ser tres unidades que
permitan la libre rotacioacuten estructural Los estudios computacionales
plantean que la disminucioacuten de un aacutetomo de carbono de la cadena alifaacutetica
imposibilita la unioacuten esencial de la estructura a la diana propuesta
4 La amina central juega un papel importante en la actividad-toxicidad de las
estructuras Los resultados obtenidos apuntan a que las piperazinas y
tetrahidropiridinas (compuestos 5a 5b 5c 5g 6a y 6g) son las aminas maacutes
adecuadas para formar parte de los compuestos antimalaacutericos por su buena
relacioacuten toxicidad y actividad in vitro Las piperidinas han resultado maacutes
activas (5f y 6f) pero a su vez mas toacutexicas
5 Los sustituyentes o-trifluorometil y p-nitro benceno (compuestos 5a 5f 6a y
6f) confieren en general buena actividad a los derivados estudiados Los
derivados de aril-tetrahidropiridinas sustituidos con un fluacuteor en para
(compuestos 5g y 6g) tambieacuten demuestran buena actividad antimalaacuterica
Con los datos obtenidos del estudio de los derivados sintetizados se ha
establecido un farmacoacuteforo que permite continuar con el refinamiento
estructural de estos nuevos arilaminoalcoholes Queda abierta la viacutea a la
optimizacioacuten de las estructuras la profundizacioacuten en ensayos bioloacutegicos y en el
mecanismo de accioacuten propuesto para la validacioacuten de la diana plasmepsina II
Conclusions
215
CONCLUSIONS
The objective of this work was to obtain new arylamino alcohols as
antimalarial agents for treating chloroquine-resistant malaria
This thesis presents general background information the proposed objectives
and the plan established for developing the work The experimental part was
carried out and a description of the work involved in preparing the
compounds and in performing biological assays and computational analysis
has also been provided Finally this thesis includes a discussion of the all
results obtained and the structure-activity conclusions reached regarding the
compounds presented here
From a chemical standpoint the work carried out made the following
contributions
1 Forty-seven new arylamino-derived compounds (identified by classical
structural elucidation techniques such as thin layer chromatography
infrared spectroscopy proton nuclear magnetic resonance elemental
analysis and melting point) were synthesized
2 Previously used synthetic routes were optimized so as to obtain derivatives
with better yields In the case of the synthesis of substituted amines a molar
ratio of protected amine to aryl halide 151 improves the reaction times
considerably The use of this proportion of starting reagents helps the
reaction to finish in just one hour In obtaining the carbonyl derivatives by
Mannich reaction the reaction is optimized when the reflux temperature is
maintained between 130 and 140 ordmC Therefore time needed to complete the
reaction is reduced to a maximum of three hours
3 Applying flash column chromatography for the purification of 23 out of the
47 compounds has made a notable advance in obtaining the derivatives
The work conditions have been adapted to the specific needs of each
reaction thereby reducing the time needed for syntheses increasing the
yields and bringing down the costs involved
From a biological point of view contributions from this work included the
following
4 Ten out of the thirty compounds evaluated in vitro against chloroquine-
resistant Plasmodium falciparum strain FCR-3 presented an IC50 value less
Conclusions
216
than 1 microM Fifteen derivatives showed a toxicity level in VERO cells that is
less than 50 microM These results show that the established work hypothesis
was a good approach for attaining the proposed objectives
5 Compounds 2a and 5f were selected for developing in vivo assays The
results obtained do not improve the parasitemia and survival data obtained
in treatment with CQ
6 The data obtained from the assays that were performed on all the
compounds presented in this work indicate good physicocochemical
properties of solubility and good electrostatic charge distribution With this
theoretical data a good absorption profile is predicted in the case of orally
administered treatments
7 The computational studies propose the enzyme plasmepsin II as the target
of the compounds that were developed in this study this enzyme is
involved in the degradation processes of Hb although experimental
validation is still pending
8 Seven out of the twenty-one hydroxyl derivatives which showed good in
vitro activity were chosen for docking studies with the target enzyme
plasmepsin II Good docking results were obtained from the selected
derivatives in the active site of the enzyme due to the bonding of the
hydroxyl group with the ASP 214 by means of a hydrogen bridge
reinforced by the rest of the electrostatic interactions from the nonpolar
areas of the molecule and nonpolar rests from the active gap of plasmepsin
II
The following structure-activity relationship has been established from the
biological results that were obtained in the study
9 The antimalarial activity study has demonstrated that the presence of a
hydroxyl group is essential in the study It has been demonstrated that the
compounds from Series 1 to 7 show significant activity against CQ-resistant
Plasmodium falciparum Based on their activity data the ketone (Series 0)
and oxime (Series 8) derivatives are not of interest
10 From among the hydroxyl derivatives compounds from the Series 2 5 and
6 show the best activity due to the presence of a fluorine atom in position 5
of the benzo[b]thiophene in position 4 of the naphthalene and in para
position of the benzene respectively In addition derivatives from the
Conclusions
217
Series 5 and 6 (naphthalenes and benzenes) have shown better antimalarial
potential
11 The minimum length of the aliphatic chain should be three units that
permit free rotation The computational studies suggest that a decrease of
one carbon atom from the aliphatic chain impedes the essential linking of
the structure to the proposed target
12 The central amine plays an important roll in the toxicity-activity of the
structures The obtained results appear to indicate that the piperazines and
tetrahydropyridines (compounds 5a 5b 5c 5g 6a and 6g) are the most
adequate amines for forming part of the antimalarial compounds due to
their good activity-toxicity relationships in vitro The piperidines were more
active (5f and 6f) but they were also more toxic
13 In general the o-trifluoromethyl y p-nitro benzene substituents (compounds
5a 5f 6a and 6f) give good activity to the derivatives that were studied The
aryl-tetrahydropyridine derivatives that are substituted with fluorine in
para position (compounds 5g and 6g) also show good antimalarial activity
With the data obtained from the study carried out on the synthesized
derivatives a pharmacophore has been established which permits continuing
with the structural refinement of these new arylamino alcohols The road for
optimizing structures and advancing in biological testing and in the mechanism
of action proposed for validating the target plasmepsin II remains wide open
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ANEXOS
FACULTAD DE FARMACIA
DISENtildeO SIacuteNTESIS Y EVALUACIOacuteN BIOLOacuteGICA DE
NUEVOS DERIVADOS DE ARILAMINOALCOHOLES
CON POTENCIAL ACTIVIDAD CONTRA LA MALARIA
Memoria presentada por Adela Mendoza Lizaacuteldez para aspirar al
grado de doctor por la Universidad de Navarra
El presente trabajo ha sido realizado bajo mi direccioacuten en la Unidad de I+D
de Medicamentos y autorizo su presentacioacuten ante el Tribunal que lo ha de
juzgar
Pamplona a 18 de junio de 2012
Dra Silvia Peacuterez Silanes
Este trabajo ha sido desarrollado en la Unidad de I+D de Medicamentos
del Centro de Investigacioacuten de Farmacobiologiacutea Aplicada (CIFA) de la
Universidad de Navarra perteneciente a uno de los proyectos de
investigacioacuten que dirigen el Dr Antonio Monge Vega y el Dr Ignacio
Aldana Moraza Doctores en Ciencias Quiacutemicas
El trabajo presentado en esta memoria ha sido realizado gracias a la
concesioacuten de la ldquoAyuda para la Formacioacuten de Tecnoacutelogosrdquo concedida por el
Gobierno de Navarra y la ldquoAyuda al Personal Investigador en Formacioacutenrdquo
concedida por la Asociacioacuten de Amigos de la Universidad de Navarra
A mis padres y mi hermana
A Javi y Julen
ldquoPuede que los ideales que albergamos
nuestros suentildeos maacutes anhelados y nuestras maacutes fervientes esperanzas
no lleguen a cumplirse mientras vivimos
Pero eso no importa
Saber que en tu diacutea cumpliste con tu deber y
estuviste a la altura de las expectativas de tus congeacuteneres
es por siacute misma una experiencia gratificante y un logro magniacuteficordquo
Nelson Mandela
Agradecimientos
La realizacioacuten de esta tesis doctoral no hubiese podido llevarse a cabo sin la ayuda y
el apoyo de las personas que han compartido conmigo estos uacuteltimos antildeos A todos
ellos que han hecho posible hoy la presentacioacuten de este trabajo deseo expresar mi maacutes
sincero agradecimiento
Mi agradecimiento especial al Dr Antonio Monge la persona de referencia durante
el desarrollo de todo este trabajo Por apostar por miacute y mi trabajo en momentos en que
todo pareciacutea que no llegariacutea a teacutermino Por ensentildearme que todo el trabajo merece la
pena que la contribucioacuten de todos es igual de vaacutelida que somos una familia Gracias
por su apoyo en los buenos y malos momentos personales
Mi gratitud a la Dra Silvia Peacuterez Silanes por estar siempre dispuesta a ayudarme en
todo lo que fuese necesario en todos los planos de la vida durante estos antildeos por su
gran implicacioacuten en este proyecto por transmitirme tesoacuten orden correccioacuten y sobre
todo optimismo durante todo este tiempo que he tenido el honor de trabajar a su lado
Gracias al Dr Ignacio Aldana la persona que me ofrecioacute la oportunidad de
introducirme en el mundo de la investigacioacuten por ayudarme y apoyarme en todo
momento y transmitirme que en investigacioacuten tambieacuten es importante la tranquilidad
I wish to express my gratitude to Dr Valerie Jullian for being such a splendid host
during my first few days in Toulouse and for considering my small contribution to his
magnificent work to be of importance
I would also like to thank Dr Michel Sauvain for introducing me into the world of in
vivo biological research He accepted the challenge of introducing a chemist into his
specialized area of experimentation with live rodents showing a great amount of
patience with me
I want to give a special thanks to Dr Eric Deharo who had faith in this work and
whose collaboration was immensely helpful He provided the necessary contacts of
other researchers outside the University of Navarras RampD department and
coordinated the project contributing to the success of this work
I would also like to give a special mention to Adriana Pabon from Colombia and to
German Gonzalez Giovanni Garavito and Miguel Quiliano from Peru for their active
participation in this project
A todos los compantildeeros de laboratorio con los que he trabajado estos antildeos
A mi familia por animarme a seguir siempre adelante al hacerme sentir en todo
momento que todo este trabajo es algo de gran importancia y valor humano
ABREVIATURAS
ABS Porcentaje de absorcioacuten
ADN Aacutecido desoxirribonucleico
AMREF African Medical and Reserch Foundation
ARN Aacutecido ribonucleico
ASP 214 Aspartato 214
ASP 34 Asptartato 34
ATP Adenosin trifosfato
BZN Benceno
BZT Benzotiofeno
CCF Cromatografiacutea en capa fina
CDCl3 Triclorometano deuterado
CI50 Concentracioacuten Inhibitoria al 50
COSY Correlated Espectroscopy H-H
CQ Cloroquina
CSP Proteina circumsporozito
DDT Dicloro-difenil-Tricloroetano
DEET NN-dimetil-meta-toluamida
DEPT 90 Distorsionless Enhancement by Polarization Transfer (CH)
DEPT-135 Distorsionless Enhancement by Polarization Transfer
DMEN F-12 Medio de cultivo con mezcla de nutrientes
DMSO Dimetilsulfoacutexido
DOXP Enzima 1-desoxi-D-xilulosa-5-fosfato
DT50 Dosis Toacutexica al 50
ECDC European Centre for Disease Prevention and Control
EMP-1 Proteiacutena de la membrana epitelial
FM Foacutermula Molecular
FAS II Siacutentesis de aacutecidos grasos II
FBZT Fluoro-benzotiofeno
FCR-3 Cepas Plasmodium Falciparum Cloroquino-resistente
FNFT Fluoro-naftaleno
FRP Asociacioacuten de la lucha contra el Paludismo
Hb Hemoglobina
HMBC Heteronuclear Multiple Bond Correlation
HMQC Heteronuclear Multiple Quantum Correlation
HPLC High Performance Liquid Chromatography
HRP-2 Proteiacutena Rica en Histidina
IC50 Concentracioacuten Inhibitoria del 50
IR Espectroscopia Infrarroja
IS Iacutendice de Selectividad
J Constante de Acoplamiento
K Lisina (coacutedigo de una letra)
LDH Lactato Deshidrogenasa
MSP-1 Proteiacutena de superficie del merozoiacuteto
MTT Bromuro de 3-(45- dimetiltiazol-2-ilo)-25-difeniltetrazol
NaOH Hidroacutexido de sodio
NEAA Nonessential amino-acids
NFT Naftalenos
OMS Organizacioacuten Mundial de la Salud (en ingleacutes WHO)
PM Peso Molecular
PENUD Programa de Naciones Unidas para el Desarrollo
PfCRT Proteiacutena Transportadora del Plasmodium falciparum causante
de la resistencia a la Cloroquina
PIPR Piperidina
PIPZ Piperazina
PIRD Tertrahidropiridina
PIRR Pirrolidina
R Arginina (coacutedigo de una letra)
RMN Resonancia Magneacutetica Nuclear
RMSD (Root-mean-square derivation) Desviacioacuten de la media
cuadraacutetica
S Serina (coacutedigo de una letra)
S163R Mutacioacuten arginina-serina en posicioacuten 163 que invierte la
resistencia a la Cloroquina
T Treonina (simplificacioacuten para codificacioacuten en aminoaacutecidos)
TCA Terapias Combinadas de Artemisina
THR Treonina
TNFα Factor de Necrosis tumoral
TPSA Aacuterea superficial Topoloacutegica
TYR Tirosina
UNICEF Fondo de Naciones Unidas para la Infancia
Iacutendice
INTRODUCCIOacuteN 1
I MALARIA 3
I1 Definicioacuten 5
I2 Historia de la enfermedad 5
I3 Epidemiologiacutea 7
I31 Situacioacuten global de la enfermedad 7
I32 Factores epidemioloacutegicos 11
I33 Tipologiacutea de aacutereas endeacutemicas 11
I34 Zonas endeacutemicas e inmunidad 12
II MALARIA Y PLASMODIUM 13
II1 El Plasmodium 15
II11 Caracteriacutesticas morfoloacutegicas 15
II12 Mecanismo de movilidad 16
II13 Mecanismo de invasioacuten celular 16
II14 Metabolismo para el crecimiento 17
II2 Ciclo de la malaria 18
II21 Ciclo de vida del paraacutesito 18
II22 Desarrollo de los esquizontes 20
II3 Especies de Plasmodium 22
II4 Sintomatologiacutea 25
II5 Deteccioacuten y diagnoacutestico 26
III PREVENCIOacuteN Y TRATAMIENTO 29
III1 Medidas preventivas 31
III2 Tratamiento 32
III21 Historia del tratamiento 32
III22 Clasificacioacuten de los compuestos antimalaacutericos 33
III23 Aparicioacuten de resistencias 38
III24 Tratamientos actuales 40
III3 Estrategias mundiales en la lucha contra la malaria 43
III4 Liacuteneas de investigacioacuten actual 44
III41 Buacutesqueda de nuevas dianas 44
III42 Productos naturales 46
III43 Desarrollo de vacunas 47
ANTECEDENTES 49
OBJETIVOS Y PLAN DE TRABAJO 53
IV OBJETIVOS 55
V PLAN DE TRABAJO 59
V1 Disentildeo de nuevos arilaminoalcoholes 61
V2 Siacutentesis de los compuestos disentildeados 63
V3 Caracterizacioacuten de los compuestos 63
Iacutendice
V4 Evaluacioacuten bioloacutegica ldquoin vitrordquo 64
V5 Evaluacioacuten bioloacutegica ldquoin vivordquo 64
V6 Estudios computacionales 64
MATERIAL Y MEacuteTODOS 65
VI QUIacuteMICA TEOacuteRICA 67
VI1 Esquema general de siacutentesis 69
VI2 Siacutentesis de precursores 70
VI21 Siacutentesis de (benzo[b]tiofen-3-il)-3-cloropropan-1-ona 70
VI22 Siacutentesis de arilaminas 70
VI3 Siacutentesis de derivados carboniacutelicos (Serie 0) 73
VI31 Condensacioacuten de 1-(benzo[b]tiofen-3-il)-3-cloropropan-1-ona y de 2-bromo-2acute-acetonaftona
con la amina (Viacutea 1) 73
VI32 Reaccioacuten de Mannich Condensacioacuten de metilcetonas con aminas en medio aacutecido (Viacutea 2) 74
VI4 Siacutentesis de derivados hidroxiacutelicos (Series 1-7) 75
VI5 Siacutentesis de oximas (Serie 8) 78
VII QUIacuteMICA EXPERIMENTAL 81
VII1 Instrumental y reactivos 83
VII2 Meacutetodos de elucidacioacuten estructural 83
VII3 Denominaciones de compuestos 85
VII4 Descripcioacuten general de meacutetodos de siacutentesis 86
VII41 Meacutetodo A procedimiento general para la obtencioacuten de las arilaminas protegidas 86
VII42 Meacutetodo B procedimiento general para la desproteccioacuten de aminas 87
VII43 Meacutetodo C procedimiento general para condensacioacuten de aminas (Viacutea 1) 87
VII44 Meacutetodo D procedimiento de condensacioacuten de aminas (Viacutea 2) 87
VII45 Meacutetodo E procedimiento general para la reduccioacuten de cetonas 88
VII46 Meacutetodo F procedimiento general para siacutentesis de oximas desde carbonilos 88
VII5 Purificacioacuten por cromatografiacutea flash 89
VIII ENSAYOS BIOLOacuteGICOS 91
VIII1 Ensayos in vitro 93
VIII2 Ensayos toxicoloacutegicos 94
VIII3 Ensayos in vivo 94
VIII31 Instrumental y reactivos 95
VIII32 Metodologiacutea 95
IX ESTUDIOS COMPUTACIONALES 105
IX1 Propiedades fisicoquiacutemicas de los compuestos 107
IX2 Optimizacioacuten geomeacutetrica 107
IX3 Estudios de Acoplamiento Molecular (Docking) 108
RESULTADOS Y DISCUSIOacuteN 111
X DESCRIPCIOacuteN DE COMPUESTOS 113
Iacutendice
X1 Siacutentesis de precursores 115
X2 Siacutentesis de derivados carboniacutelicos (Serie 0) 120
X3 Siacutentesis de derivados hidroxiacutelicos 143
X4 Siacutentesis de Oximas (Serie 8) 165
X5 Purificacioacuten de compuestos por cromatografiacutea flash 167
X6 Elucidacioacuten estructural de compuestos por RMN 168
X61 Elucidacioacuten estructural para los derivados de piperazina 168
X62 Elucidacioacuten estructural para los derivados de piperidina 175
X63 Elucidacioacuten estructural para los derivados de tetrahidropiridina 180
XI ENSAYOS BIOLOacuteGICOS 187
XI1 Ensayos de actividad antiplasmoacutedica in vitro 189
XI2 Ensayos de actividad antiplasmoacutedica in vivo 191
XI3 Discusioacuten de ensayos bioloacutegicos 192
XII ENSAYOS COMPUTACIONALES 195
XII1 Propiedades fisicoquiacutemicas de los compuestos 197
XII2 Discusioacuten de propiedades fisicoquiacutemicas 199
XII3 Estudios de Modelizacioacuten y Acoplamiento Molecular 200
XII4 Discusioacuten de resultados de modelizacioacuten 207
CONCLUSIONES 209
BIBLIOGRAFIacuteA 219
ANEXOS 231
INTRODUCCIOacuteN
II MMAALLAARRIIAA
Malaria
5
I1 Definicioacuten
La malaria fiebre paluacutedica o tambieacuten llamada paludismo es una enfermedad
infecciosa causada por el paraacutesito protozoario del filo Apicomplexa clase
Aconoidasida orden Haemosporididae de la familia Plasmodiidae del geacutenero
Plasmodium1 y es transmitido por la hembra del mosquito del geacutenero Anopheles
La malaria es una de las enfermedades tropicales maacutes importante del mundo
que provoca la muerte de miles personas Estaacute estrechamente ligada a la
pobreza y a la evolucioacuten y el desarrollo del hombre
Los mayores problemas en la lucha contra la enfermedad ademaacutes de la crisis
actual que reduce los fondos destinados a los paiacuteses en viacuteas de desarrollo (que
son los maacutes afectados) son la constante aparicioacuten de resistencias por el uso de
monoterapias en tratamientos y debido a los insecticidas utilizados
I2 Historia de la enfermedad
La historia de la malaria es tan antigua como la historia de la civilizacioacuten ya
que se tiene constancia de la presencia de la enfermedad en manuscritos
originarios de China la India o el Antiguo Egipto
Teniendo en cuenta esto se puede entender de donde proviene el nombre de
la enfermedad La palabra malaria proviene de las palabras ldquomal ndashairerdquo que
fueron empleadas en Italia para describir las fiebres intermitentes asociadas a la
exposicioacuten al ambiente de las marismas o cieacutenagas El otro nombre por el que
nos referimos a la enfermedad proviene del latiacuten ldquopalusrdquo que significa pantano
cieacutenaga de ahiacute la denominacioacuten de fiebres paluacutedicas o paludismo
Aunque su nombre tiene su origen en Europa se cree que los paraacutesitos se
desarrollaron en el oeste y centro oeste de Aacutefrica y en el sudeste asiaacutetico Es
importante tener en cuenta su estrecha relacioacuten con la historia natural Ha sido
la evolucioacuten del hombre la que ha expandido la enfermedad de ahiacute que hay
que ser muy conscientes de que durante la historia de la humanidad ha habido
picos de enfermedad ocasionados por la accioacuten del hombre y su desarrollo No
es de extrantildear dicha variacioacuten en la incidencia cuando en China hace maacutes de
5000 antildeos que se conoce la enfermedad2 y los textos egipcios dejan constancia
1httpwwwncbinlmnihgovTaxonomy 2 httpwwwmalariasitecommalariahistory_literaturehtm
Malaria
6
de ella desde hace ya 4000 antildeos Se puede saber por textos antiguos que la
enfermedad se extiendioacute por el mar Mediterraacuteneo hace 2000 antildeos y que al Norte
de Europa llegoacute hace aproximadamente 1000 antildeos Podemos darnos cuenta de
que la malaria ha avanzado unida a la historia del hombre si se tiene en cuenta
que cada vez es mayor la intercomunicacioacuten de sociedades alejadas
geograacuteficamente las continuas guerras e invasiones las rutas comerciales el
comercio de esclavos la profundizacioacuten y especializacioacuten de cultivos propensos
a la criacutea del paraacutesito como arrozales (humedales) el desarrollo de los medios de
transporte que permiten viajar a grandes distancias el aumento y la lejaniacutea de
las migraciones la democratizacioacuten de las vacaciones el comercio-intercambio
de grandes cantidades de alimentos el cada vez mayor trasiego de animales
vivos
Alrededor de 400 aC en la antigua Roma Hipoacutecrates fue el primero en
describir las manifestaciones tiacutepicas de la malaria que la diferenciaba de otras
enfermedades estudioacute la eacutepoca del antildeo donde aumentaba la enfermedad y el
lugar de vida de los enfermos Con ello establecioacute una relacioacuten enfermedad-
agua estancada que dio lugar a los primeros programas de drenaje de agua en
Roma y a la primera intervencioacuten contra la malaria
La escuela hipocraacutetica sosteniacutea que la enfermedad era el resultado de un
desequilibrio en el cuerpo de los cuatro humores unos fluidos que en las
personas sanas se encontraban naturalmente en una proporcioacuten semejante
Cuando los cuatro humores (sangre bilis negra bilis amarilla y flema) se
desequilibraban (laquodyscrasiaraquo mala mezcla) el individuo enfermaba y
permaneciacutea enfermo hasta que se recuperaba el equilibrio La terapia
hipocraacutetica se concentraba en restaurar este equilibrio El tratamiento maacutes
administrado era la purga de la sangre
No seriacutea hasta el antildeo 100 dC cuando se pensoacute que la enfermedad se
transmitiacutea por inhalacioacuten de vapores de la enfermedad el ldquomal airardquo italiano
No era tan errado el diagnoacutestico ya que por el aire vuelan los responsables de
transmitir los paraacutesitos que ocasionan la enfermedad Del otro sinoacutenimo de
malaria se deriva una confusioacuten semejante que llega tambieacuten indirectamente
del aire el paludismo rdquopalusrdquo en latiacuten designa a los pantanos que se creiacutean
responsables de la dolencia pero en realidad era donde proliferaban los
mosquitos Habraacute que esperar hasta 1898 en que se demostroacute que la malaria era
Malaria
7
transmitida por estos cuando ya se relacionaba la enfermedad con larvas del
moquito y microorganismos involucrados en la infeccioacuten
El nacimiento y desarrollo de la microbiologiacutea supuso un salto importante en
el conocimiento de las ciencias y como no podiacutea ser menos impulsoacute el
conocimiento de la enfermedad Asiacute en el antildeo 1880 el cirujano franceacutes Charles
Louis Alphonse Laveran (disciacutepulo de Pasteur) observoacute en Argelia los paraacutesitos
dentro de los gloacutebulos rojos de personas infectadas Planteoacute entonces que la
enfermedad era causada por protozoos siendo esta la primera vez que se
asociaba un protozoo con una enfermedad humana Posteriormente sus
estudios sobre protozoos le reportaron el Nobel de Medicina en 1907 aunque
fueron los cientiacuteficos italianos Ettore Marchiafava y Angelo Celli los que
bautizaron a estos protozoos con el nombre de ldquoPlasmodiumrdquo Carlos Finlay
meacutedico cubano sugirioacute por sus conocimientos sobre la fiebre amarilla que la
malaria podiacutea ser transmitida tambieacuten por mosquitos Hipoacutetesis confirmada en
el antildeo 1898 por Sir Ronald Ross en la India por lo que le fue concedido el
premio Nobel de medicina en 1902 Desde ese momento los estudios
protozoarios fueron avanzando y al poco tiempo en el antildeo 1899 Grassi
Bignami y Basianelli descubrieron el ciclo completo de la enfermedad el ciclo
celular protozoario y su transmisioacuten3
Desde entonces hasta la actualidad se han desarrollado diferentes
conocimientos y modos de prevencioacuten y tratamiento Un caso muy interesante
y uacutetil de estos avances fue el hecho de que los trabajos realizados por Finlay y
Ross sirvieron para crear las primeras guiacuteas de salud muy uacutetiles en eventos tan
importantes para el mundo como la construccioacuten del Canal de Panamaacute
I3 Epidemiologiacutea
I31 Situacioacuten global de la enfermedad
Seguacuten el informe de 2011 de la OMS4 sobre malaria son 106 paiacuteses los que
incluyen esta enfermedad como endeacutemica Se estima en 216 millones los casos
registrados a nivel mundial de los que se han producido 266 mil muertes Los
esfuerzos en la lucha contra la enfermedad de los diferentes organismos
3 httpwwwmedicinamcom 4httpwwwwhointmalariaes
Malaria
8
internacionales han dado como resultado un descenso de un 25 de las tasas de
mortalidad por malaria en la uacuteltima deacutecada5
Figura 1 Distribucioacuten mundial de la malaria paiacuteses libres endeacutemicos y en tratamiento6
En la figura 1 se observa coacutemo la malaria es una enfermedad asociada a la
pobreza y a los climas tropicales El 81 de los casos detectados provienen de
Aacutefrica subsahariana aunque a nivel mundial el 86 de las viacutectimas de la
malaria son nintildeos menores de cinco antildeos
De los 3300 millones de personas en riesgo de contraer la malaria 2100
millones se encuentran en situacioacuten de alto riego de los que el 47 pertenecen
al continente africano y el 37 al asiaacutetico De los 1200 millones restantes que
estaacuten en bajo riesgo de contraer malaria el 94 no son africanos En Aacutefrica
seguacuten los datos del informe de la Fundacioacuten para la investigacioacuten y la medicina
africana (AMREF) de 20117 se concentra la mayor poblacioacuten en riesgo donde el
apoyo externo es mayor y donde por el contrario se invierte el menor gasto
puacuteblico El 90 de los casos de malaria los produce el plasmodio maacutes agresivo
el P falciparum Seguacuten la OMS muchos paiacuteses de la regioacuten africana han
registrado desde el antildeo 2000 hasta 2010 un descenso mayor del 50 de casos
confirmados ingresos y muertes Esto se debe a los cada vez maacutes eficaces
sistemas de vigilancia Del 25 de la disminucioacuten mundial de las muertes
causadas por la malaria un 33 corresponde a Aacutefrica8 En el continente
americano la malaria se centra en la zona amazoacutenica y de Centroameacuterica En
5 Centro de prensa de la OMS (dic 2011) 6 Disponible en httpwwwwhointmalariaworld_malaria_report_2009 7httpwwwamrefesuploadsdocumento 8 Diez datos sobre el paludismo (OMS abril 2012)
Malaria
9
estas zonas se dan menos casos de malaria que en la regioacuten africana pero la
inversioacuten del gasto puacuteblico para erradicarla es mucho mayor La mayoriacutea de los
casos son producidos por el P vivax aunque tambieacuten se dan casos de P
falciparum Del 25 de la disminucioacuten mundial el 55 corresponde a este
continente
En Asia la situacioacuten es maacutes complicada de definir porque depende mucho de
la zona geograacutefica En la zona del sudeste asiaacutetico la situacioacuten es maacutes grave
maacutes parecida a Aacutefrica donde predominan los casos de P falciparum En el resto
de Asia predomina sin embargo el P vivax como en centro y Sudameacuterica En
Oceaniacutea la situacioacuten es muy parecida a la zona de Asia donde la malaria no es
tan grave La disminucioacuten de las muertes supone un 42 de la disminucioacuten de
mortalidad por malaria en este continente
El continente europeo se consideraba libre de malaria desde hace unos antildeos
pero en la actualidad se han registrado nuevos datos El 80 de los casos de la
Europa Occidental se registran en Francia Inglaterra Italia y Alemania Son
zonas donde la malaria se produce de forma ocasional estacional o por razones
de migraciones humanas (ECDC 20119) La zona de Oriente medio concentran
el mayor nuacutemero de casos ocasionados por P vivax La tasa de mortalidad por
malaria en Europa ha disminuido hasta el 1 de los casos
I311 La malaria en Espantildea
La lucha antipaluacutedica fue la primera intervencioacuten sanitaria espantildeola que se
basoacute en criterios epidemioloacutegicos es decir se planificoacute en base a datos de
prevalencia de la enfermedad En 1920 se realizoacute una organizacioacuten de Lucha
Antiplasmoacutedica que consiguioacute con la creacioacuten de dispensarios antipaluacutedicos el
estudio del vector con la participacioacuten y asesoramiento de entomoacutelogos
especialistas en saneamiento ambiental dieron como resultado en los antildeos 30
una disminucioacuten de los datos endeacutemicos en Espantildea En la guerra civil espantildeola
por el debilitamiento socioeconoacutemico y las circunstancias propias de una guerra
se produjo un recrudecimiento de la malaria
9 ECDC European Centre for Disease Prevention and Control Centro de la Unioacuten Europea creado en 2005 para el control de las enfermedades infecciosas con sede en Suecia
Malaria
10
Figura 2 Distribucioacuten de la malaria en Espantildea en el antildeo 193310
En el antildeo 1943 ante la evidente gravedad sanitaria del paiacutes se produce una
reactivacioacuten del Dispensario y un uso masivo de insecticidas A esto se le suma
la firma del convenio con la OMS para potenciar la erradicacioacuten de la malaria
en Espantildea
En 1943 se da por finalizada la campantildea entrando en fase de mantenimiento
que da paso en 1964 a la declaracioacuten de paiacutes libre de malaria por la OMS
siempre teniendo en cuenta que se han de mantener los sistemas de vigilancia
de la enfermedad
En 1961 se registra el uacuteltimo caso de malaria autoacutectona en Espantildea aunque desde
la declaracioacuten de zona libre se han descrito por parte de la Red nacional de
vigilancia epidemioloacutegica varios casos de malaria En el antildeo 2001 se registraron
466 casos diagnosticados en Espantildea asociados a inmigrantes y turistas ademaacutes
se debe tener en cuenta la posibilidad de producirse casos por transfusiones
sanguiacuteneas trasiego de jeringuillas de pacientes drogadictos o malaria de
aeropuerto (Bueno Mari R y Jimenez Peydro R 2008)
El uacuteltimo caso de malaria en Espantildea se diagnosticoacute en una mujer en Aragoacuten en
2009 Por esto se incrementaron las alertas pero no han quedado registrados
maacutes casos (Santa Olalla et alts 201011)
10 Disponible en httpscieloisciiiesscielophppid=s1135-57272008000500003ampscript=sci_arttext 11 httpwwweurosurveillanceorgViewArticleASPxArticleId=19684
Malaria
11
I32 Factores epidemioloacutegicos
La epidemiologiacutea de esta enfermedad depende principalmente de dos
factores
- Primarios
o Hueacutesped o fuente de infeccioacuten hombre portador
o Vector hembras de ciertas especies de mosquito Anopheles
o Susceptibilidad humana este es el factor maacutes variable ya que
depende de factores de inmunidad natural o adquirida factores
geneacuteticos edad (los nintildeos estaacuten maacutes expuestos) migraciones
ocupacioacuten y caracteriacutesticas socioeconoacutemicas
- Secundarios son los que ayudan a la transmisioacuten de la enfermedad como
los factores geograacuteficos (altura sobre el nivel del mar) o climatoloacutegicos
(temperatura humedad atmosfeacuterica o lluvias)
I33 Tipologiacutea de aacutereas endeacutemicas
Seguacuten la proporcioacuten de poblacioacuten que se encuentre afectada las aacutereas donde
la enfermedad estaacute considerada como endeacutemica se dividen en cuatro12
- Aacutereas hipo-endeacutemicas son aquellas donde la malaria afecta a menos del
10 de la poblacioacuten
- Aacutereas meso-endeacutemicas aquellas donde la poblacioacuten afectada estaacute entre el
11 y el 50
- Aacutereas hiper-endeacutemicas son las aacutereas donde el porcentaje de poblacioacuten
afectada estaacute entre el 51 y el 75
- Aacutereas holo-endeacutemicas aquellas donde maacutes del 75 de la poblacioacuten es
portadora de la enfermedad Estas aacutereas estaacuten asociadas a malaria latente
Las hiper y holo-endeacutemicas se caracterizan por alta mortalidad infantil y
juvenil pero los adultos suelen ser asintomaacuteticos por la inmunidad especiacutefica
que generan algunos humanos al sufrir maacutes de una picadura por mosquito
infectado al diacutea
12httpwwwmonografiascomtrabajos77paludismo-enfermedad-tercer-mundopaludismo-enfermedad-tercer-mundo2shtml
Malaria
12
I34 Zonas endeacutemicas e inmunidad
El ciclo de vida del paraacutesito es complejo e involucra distintos medios lo que
demuestra su capacidad para entrar y salir de diferentes ceacutelulas tanto del
hueacutesped como del vector Para ello el paraacutesito debe cambiar su forma la
constitucioacuten y el modo de presentacioacuten de sus proteiacutenas y receptores asiacute se
pone de manifiesto que su respuesta inmune a los tratamientos es muy
compleja A su vez la respuesta inmune del hueacutesped debe generar respuestas
especiacuteficas para las diferentes formas del paraacutesito lo que se denomina
Inmunidad adaptada
Los tipos de inmunidad consideradas para la enfermedad son tres
- Natural ciertos grupos de poblacioacuten poseen alguacuten grado de resistencia
conferida por factores geneacuteticos como la deficiencia de la G6PDH que
confiere resistencia al paraacutesito o la mutacioacuten Hemoglobina E (Hb E la
mutacioacuten del gen que codifica la cadena β-globina que compone la Hb
tambieacuten conocido como talasemia) Hb S (anemia drepanociacutetica) o Hb
fetal
- Adquirida con este tipo de infeccioacuten se produce premunicioacuten13 Se da en
personas de exposicioacuten prolongada como los habitantes de zonas holo-
endeacutemicas El problema estaacute en que la inmunidad adquirida es una
inmunidad parcial y relativa y no garantiza la inmunidad esterilizante
Es una inmunidad especiacutefica a un lugar determinado que en muchos
casos se pierde tras el cambio de haacutebitat a zonas donde la malaria no es
endeacutemica Esto conlleva que el individuo sea vulnerable si vuelve
posteriormente a zonas endeacutemicas
- Pasiva es la que suele relacionarse con el embarazo La conferida por la
madre al feto en muchos lugares donde la enfermedad es endeacutemica
13 (Edm Sergent L Parrot y A Donatien 1924) (Del latiacuten prae antes y munire fortificar) Sinoacutenimo inmunidad de infeccioacuten o de sobreinfeccioacuten (R Debreacute y Bonnet 1927) inmunidad no esterilizante inmunidad relativa (Pasteur 1881 Plehn 1901 von Wasielewski 1901-1908) inmunidad parcial (J Bordet 1920) inmunidad- tolerancia premunidad (Ch Nicolle) laquoEstado de resistencia a toda sobreinfeccioacuten de un organismo ya infectado La premunicioacuten que es simultaacutenea a la infeccioacuten y cesa con ella es conferida por diversas enfermedades infecciosas croacutenicas (paludismo piroplasmosis tuberculosis siacutefilis brucelosis etc) Se opone a la inmunidad verdadera que caracteriza la resistencia del organismo curado a toda reinfeccioacuten es generalmente durable y consecutiva a ciertas infecciones agudas (sarampioacuten escarlatina viruela carbunco fiebre tifoidea etc)raquo (Edm Sergent)
IIII MMAALLAARRIIAA YY PPLLAASSMMOODDIIUUMM
Malaria y Plasmodium
15
II1 El Plasmodium
El Plasmodium es un protozoo eucariota unicelular esporozoario que se
caracteriza por un estilo de vida intracelular obligado con orgaacutenulos
especializados en las diferentes funciones vitales La proliferacioacuten se produce
por invasioacuten celular crecimiento y divisioacuten celular hasta que las reacuteplicas
destruyen la ceacutelula hueacutesped Ademaacutes es el miembro maacutes importante de los
Apicomplexa grupo de clasificacioacuten al que pertenecen tambieacuten otros paraacutesitos
como el toxoplasma o el criptosporium De las 175 especies de Plasmodium son 4
especies las que pueden infectar a humanos P vivax P ovale P falciparum y P
malariae Las tres primeras son las que afectan en mayor grado al hombre
siendo el P falciparum el maacutes violento y resistente Existe una quinta P
knowlesi que afecta maacutes a los grandes simios pero desde hace pocos antildeos se ha
registrado alguacuten caso de infeccioacuten humana por este tipo de paraacutesitos (Figtree et
alts 2010)
El paludismo es causado por paraacutesitos del geacutenero Plasmodium que se
transmiten al ser humano por la picadura de mosquitos infectados de las 20
especies del geacutenero Anopheles los llamados vectores del paludismo que pican
sobre todo entre el anochecer y el amanecer en zonas con climas tropicales
II11 Caracteriacutesticas morfoloacutegicas
El Plasmodium es un protozoo con orgaacutenulos especializados suspendidos en el
citoplasma que se encargan de sus diferentes necesidades como movimiento
invasioacuten celular penetracioacuten de membranas celulares expulsioacuten enzimas
eliminacioacuten de metabolitos o nutricioacuten por fagocitosis
Los trofozoiacutetos son las formas vegetativas moacuteviles que constan de membrana
citoplasma y nuacutecleo La membrana limita el contorno celular protege y permite
el intercambio de sustancias Aquiacute se produce el metabolismo de fosfoliacutepidos y
el mecanismo de transporte de protones y sodio El citoplasma es un sistema
coloidal que representa el cuerpo donde se desarrollan funciones como siacutentesis
de folatos y glicoacutelisis ademaacutes de biosiacutentesis de nucleoacutetidos necesarios para la
reproduccioacuten El nuacutecleo eucarionte contiene el ARN y ADN del paraacutesito
Malaria y Plasmodium
16
II12 Mecanismo de movilidad
Una de las principales caracteriacutesticas del paraacutesito es que no tiene sistema de
locomocioacuten (cilios ni flagelos) su movilidad se produce por deslizamiento Se
ha estudiado (Casanova Morales 2010) que la membrana del paraacutesito tiene dos
dimensiones citoesqueleto y submembrana El movimiento se produce gracias
al citoesqueleto en concreto al sistema actina-miosina que actuacutea como motor
molecular La miosina se transporta a lo largo de los filamentos de la actina con
la energiacutea obtenida de la hidroacutelisis de ATP e interacciona con las adhesinas
transmembrana de la superficie de la ceacutelula hueacutesped Por medio de una
trayectoria helicoidal generada con estas interacciones se produce el
desplazamiento
II13 Mecanismo de invasioacuten celular
Uno de los organelos funcionales maacutes caracteriacutesticos es el orgaacutenulo o
complejo apical que se localiza en un extremo del paraacutesito y estaacute involucrado en
la interaccioacuten hueacutesped paraacutesito durante la invasioacuten celular Su funcioacuten se
relaciona con la adherencia y perforacioacuten de membrana eritrociacutetica ya que
excreta una sustancia que facilita la penetracioacuten celular imprescindible para la
supervivencia del paraacutesito Este orgaacutenulo estaacute presente en las formas
esporozoiacuteto merozoiacuteto y ookinete
La invasioacuten de un eritrocito induce un proceso controlado y transitorio de
rotura de la membrana y reorganizacioacuten de la ceacutelula Es un proceso complicado
(Gratzer y Dluzewski 1993) que conlleva un contacto inicial reorientacioacuten y
deformacioacuten del eritrocito unioacuten de formacioacuten y entrada del paraacutesito Las
interacciones con el eritrocito se piensa que son al azar y que son interacciones
reversibles entre proteiacutenas de superficie del paraacutesito y del gloacutebulo rojo
Son muchas las proteiacutenas implicadas en estos procesos como la proteiacutena de
superficie del merozoiacuteto 1 (MSP-1) que participa directamente en el paso de
invasioacuten y es una de las dianas terapeacuteuticas planteadas actualmente Otra
proteiacutena diana es la proteiacutena circumsporozoiacuteto (CSP) que estaacute implicada en los
procesos de reorientacioacuten del complejo apical En la invasioacuten se producen
cambios en la composicioacuten lipiacutedica de la membrana El paraacutesito una vez
realizada la invasioacuten exporta proteiacutenas como la proteiacutena de membrana epitelial
(EMP) a la membrana eritrociacutetrica que evita que se produzca la depuracioacuten de
los eritrocitos infectados en el bazo Durante la invasioacuten de la membrana
Malaria y Plasmodium
17
diferentes orgaacutenulos del paraacutesito van introducieacutendose en el eritrocito y
producen la unioacuten con la ceacutelula hueacutesped
II14 Metabolismo para el crecimiento
La caracteriacutestica principal del paraacutesito es la dependencia total del hueacutesped
para la supervivencia Como consecuencia de la invasioacuten aumenta la tasa
metaboacutelica de los eritrocitos infectados con cambios en la permeabilidad de
membrana que permiten por fagocitosis el ingreso de solutos necesarios para el
desarrollo del Plasmodium Este cambio de permeabilidad da preferencia al paso
de aniones y solutos como monosacaacuteridos aminoaacutecidos nucleoacutesidos lactato
acido pantoteacutenico y amonio cuaternario La composicioacuten ioacutenica del paraacutesito
depende del proceso de transporte a traveacutes de tres membranas la membrana
plasmaacutetica del eritrocito la vacuola digestiva y la membrana digestiva del
paraacutesito
Las alteraciones proteicas de la membrana intervienen en el transporte de
nutrientes y productos de desecho ademaacutes de evitar la accioacuten del sistema
inmune del hueacutesped Mediante endocitosis el Plasmodium retiene porciones del
citoplasma del eritrocito dentro de vesiacuteculas que se fusionan con la vacuola
digestiva El paraacutesito tiene mitocondria pero carece de ciclo de aacutecido ciacutetrico
funcional por lo que se piensa que es totalmente dependiente de la glucoacutelisis
para su abastecimiento energeacutetico (Dario Mendez 2010) Durante el periodo de
maduracioacuten del paraacutesito se produce un aumento en el uso de glucosa y la
produccioacuten de aacutecido laacutectico en la ceacutelula hueacutesped en detrimento de la capacidad
de la ceacutelula de sintetizar macromoleacuteculas Para su crecimiento y replicacioacuten en
el eritrocito requiere purinas y pirimidinas Las purinas provenientes del
eritrocito son recicladas por el propio paraacutesito para su uso En cambio las
pirimidinas han de ser sintetizadas a partir de sustancias como carbonatos o
adenosiacuten trifosfato (ATP) y mediante la accioacuten de enzimas como dihidrofolato
reductasa o dihidrooroato dihidrogenasa (DHOD) que se convierten asiacute en
dianas terapeacuteuticas La atovaquona es un ejemplo de inhibidor de la DHOD
En la vacuola digestiva del paraacutesito se producen enzimas digestivas y
residuos que se eliminan a traveacutes de la membrana celular Dentro de los
gloacutebulos rojos los paraacutesitos se alimentan de la Hb En primer lugar se produce
la endocitosis de la moleacutecula hasta la vacuola digestiva donde las
endopeptidasas cisteiacutenicas y aspaacuterticas continuacutean con la degradacioacuten de la Hb
Malaria y Plasmodium
18
hasta pequentildeos aminoaacutecidos que el paraacutesito requiere para sus muacuteltiples
funciones de desarrollo En la ruptura celular se produce la liberacioacuten de los
residuos generados durante los diferentes procesos del metabolismo de
nutrientes Algunos siacutentomas de la enfermedad se ocasionan por esta liberacioacuten
En todos estos procesos de cambio de permeabilidad celular necesarios para
la supervivencia del paraacutesito el pH juega un papel fundamental El Plasmodium
desarrolla diferentes sistemas de control y autorregulacioacuten que estaacuten siendo
estudiados y propuestos como diana terapeacuteutica (Loacutepez y Segura 2008)
II2 Ciclo de la malaria
II21 Ciclo de vida del paraacutesito
Para referirnos al ciclo de la enfermedad hablaremos en todo momento del
ciclo de vida del paraacutesito (Figura 5) El Plasmodium falciparum es un organismo
eucariota que cuenta con 14 cromosomas y es transmitido como hemos
comentado al comienzo por los mosquitos Anopheles hembra Pero no son los
mosquitos los que tienen el paraacutesito inicialmente ya que en la picadura a un ser
humano infectado adquieren los paraacutesitos presentes en las sangre (en forma de
gametocitos) dando comienzo la fase Esporogoacutenica (fase sexual) del ciclo de
vida del paraacutesito en el mosquito
En esta sangre infectada hay microgametocitos (macho) y macrogametocitos
(hembra) Los gametocitos macho fertilizan a los hembra formando un cigoto
que recibe el nombre de ookinete el cual penetra en la pared celular de los
mosquitos para desarrollarse hasta formar un oocito Los oocitos desarrollados
se almacenan en sus glaacutendulas salivares Es ahiacute donde estaacuten listos para infectar
a otro humano con su picadura liberando esporozoiacutetos a traveacutes de la saliva
Esta fase esporogoacutenica se da a gran velocidad y se completa en dos semanas si
las condiciones son las idoacuteneas Queda claro de esta forma que el mosquito es el
vector que transporta la enfermedad y los humanos son los hueacutespedes
En este punto la enfermedad se desarrolla en el hombre por medio de dos
viacuteas Exo-eritrociacutetica (hepaacutetica) y Endo-eritrociacutetica La viacutea exo-eritrociacutetica es la
fase del ciclo de vida del paraacutesito que comienza en el momento que el mosquito
infectado pica a un humano y transfiere en la saliva ademaacutes de los esporozoiacutetos
del paraacutesito otros compuestos anti hemostaacuteticos y vasodilatadores al torrente
sanguiacuteneo humano
Malaria y Plasmodium
19
Los esporozoiacutetos son formas alargadas que miden
11 microm de ancho por 1 microm de largo con extremidades
afiladas (Figura 3) Se mueven por deslizamiento y
poseen una gruesa membrana cuya extremidad
anterior se transforma en una caacutepsula apical provista
de anillos polares y de un conoide que favorece la
penetracioacuten celular
Figura 3 Imagen de un esporozoiacuteto14
En treinta minutos los esporozoiacutetos llegan al hiacutegado humano e infectan los
hepatocitos Asiacute durante un periodo de 6 a 15 diacuteas se van a multiplicar
asexualmente (en este periodo de latencia de la enfermedad se llaman
hipnozoiacutetos) Estos daraacuten lugar a miles de merozoiacutetos que rompen las ceacutelulas
hepaacuteticas e para invadir el torrente sanguiacuteneo
En la viacutea endo-eritrociacutetrica los merozoiacutetos del torrente sanguiacuteneo invaden
los eritrocitos (gloacutebulos rojos o hematiacutees) para convertirse en trofozoiacutetos
(formas paraeritrociacuteticas Figura 4) Esta forma madura
y se multiplica asexualmente para formar los
esquizontes Estos a su vez se rompen liberando de
nuevo merozoiacutetos (en su forma endo-eritrociacutetica) que
repetiraacuten el ciclo de los hematiacutees Es la formacioacuten de
los esquizontes la que causaraacute la aparicioacuten de los
siacutentomas cliacutenicos A la vez que esto ocurre unos pocos
merozoiacutetos sufren gametocitogeacutenesis dando lugar a los
gametocitos que infectaraacuten nuevos mosquitos
Figura 4 Imagen de trofozoiacutetos15
En el caso de Plasmodium vivax y ovale se producen hipnozoiacutetos en la fase exo-
eritrociacutetica que permanecen en estado latente y durante un periodo de hasta
tres antildeos sin manifestarse siacutentomas En liacuteneas generales la duracioacuten del ciclo
eritrociacutetico del P ovale es de 50 horas el de P malarie de 72 horas y el de P vivax
y falciparum de 48 horas
14 Disponible en wwwfabaorg 15 Disponible en wwwdfarmaciacom
Malaria y Plasmodium
20
Figura 5 Ciclo de vida completo del plasmodio El mosquito Anopheles infectado en su picadura transmite los
esporocitos del parasito Plasmodio Esporocitos infectan ceacutelulas hepaacuteticas que maduran hasta esquizontes y
que liberaran despueacutes merozoitos Fase exo-eritrociacutetica y fase endo-eritrociacutetica Los merozoitos infectan los
hematiacutees Los trofozoiacutetos maduros daraacuten esquizontes que se rompen para dar maacutes merozoitos Algunos
merozoitos pasan a ser nuevos gametocitos Los gametocitos sexuados son ingeridos por el mosquito La Fase
esporogoacutenica Microgametos y macrogametos forman cigotos que evolucionan hasta ookinete Estos a su vez se
desarrollan hasta Los oocitos se rompen dando esporocitos que se almacenan en las glaacutendulas salivares del mosquito
esperando a ser inoculadas a otro humano 16
II22 Desarrollo de los esquizontes
Los merozoiacutetos provenientes de las ceacutelulas hepaacuteticas viajan al torrente
sanguiacuteneo para infectar a los eritrocitos que contienen la Hb En concreto es la
degradacioacuten de la Hb el factor fundamental para el desarrollo de los
esquizontes ya que este proceso conlleva la obtencioacuten de ldquonutrientesrdquo como
aminoaacutecidos esenciales para el desarrollo de las nuevas formas del paraacutesito En
el citoplasma de los eritrocitos se encuentra la Hb que es ingerida por
endocitosis al citostoma del paraacutesito y comprimida en vesiacuteculas transportadoras
que la conducen hasta las vacuolas digestivas del merozoiacuteto (Figura 6)
16 Citado de wwwdpdcdcgovdpdxHTMLMalariahtm
Malaria y Plasmodium
21
Figura 6 Transporte de membrana de la Hb a la vacuola del merozoiacuteto
Una vez dentro de la vacuola comienza su digestioacuten o degradacioacuten en un
proceso en el que intervienen varias proteasas y peptidasas que generan
diferentes subproductos Del conocimiento de estas enzimas surgen las
muacuteltiples dianas terapeacuteuticas para combatir este proceso y por tanto la
enfermedad ya que el proceso es clave para la supervivencia del paraacutesito Una
vez que la moleacutecula de Hb es introducida en la vacuola digestiva se produce la
ruptura de la estructura (Figura 7) en porcioacuten proteica la globina y en el
producto de degradacioacuten el grupo hemo La globina a su vez se degrada por
medio de peptidasas especiacuteficas (cisteiacutenas y aspartatos) que generan peacuteptidos
maacutes pequentildeos que seraacuten transportados en forma de aminoaacutecidos (los α-Aa) al
citoplasma del paraacutesito (citosol del merozoiacuteto)
Figura 7 Proceso de digestioacuten de la Hb en la vacuola digestiva del paraacutesito
Otro producto de dicha reaccioacuten de degradacioacuten es el grupo hemo libre que
se oxida hasta formar hematina (Figura 8) compuesto muy toacutexico debido a que
puede generar especies reactivas de oxiacutegeno como peroacutexido de hidroacutegeno
(H2O2) radicales superoacutexido y radicales hidroxilo Estos radicales son
mediadores directos de ciertos procesos bioquiacutemicos que ocasionan la ruptura
Malaria y Plasmodium
22
celular y en uacuteltima instancia la muerte del paraacutesito De este modo la siguiente
reaccioacuten es el proceso de detoxificacioacuten de dicho compuesto Esta reaccioacuten
consiste en una biomineralizacioacuten o biocristalizacioacuten donde la hematina
cristaliza como diacutemero cristalino llamado β-hematina (la unioacuten por puentes de
hidroacutegeno de los cristales recibe el nombre de hemozoiacutena) que no es toacutexica para
el paraacutesito
Figura 8 Compuestos obtenidos en la degradacioacuten de la Hb
Para el final del estado trofozoiacutetico del ciclo han sido consumidas muchas
unidades de Hb
II3 Especies de Plasmodium
Son muchas las variables de las que depende el desarrollo de la enfermedad
comenzando por la especie de paraacutesito que infecta
Plasmodium vivax esta especie estaacute presente en casi todas las zonas donde el
paludismo es endeacutemico y su aacuterea de distribucioacuten se extiende
principalmente en Ameacuterica Central y la India La duracioacuten de su ciclo exo-
eritrociacutetico variacutea seguacuten la cepa desde 20 diacuteas a 9 meses Los paraacutesitos
pueden permanecer en el hiacutegado en estado latente maacutes de 2 antildeos y ser
responsable de recaiacuteda La parasitemia raramente excede de 2 paraacutesitos en
100 gloacutebulos rojos y el proceso de formacioacuten de esquizontes dura 48 horas
P vivax parasita sobre todo los hematiacutees joacutevenes (reticulocitos) el hematiacutee
parasitado es maacutes grande que los hematiacutees normales y contiene numerosos
graacutenulos de Schuumlffner que resultan de la degradacioacuten de la Hb y le dan un
aspecto punteado Las formas endo-eritrociacuteticas son grandes (llegan a
ocupar hasta 23 partes del eritrocito) y estaacuten provistas de movimientos
ameboides vivaces (de ahiacute el nombre vivax) los esquizontes presentan
Malaria y Plasmodium
23
hasta 16 merozoiacutetos los gametocitos son redondos frecuentemente
exceacutentricos y con pigmento abundante
Figura 9 Formas endo-eritrociacuteticas del P vivax17
Plasmodium ovale es muy proacuteximo a P vivax con el cual fue confundido por
mucho tiempo Su incubacioacuten variacutea de 15 diacuteas a varios meses P ovale
parasita los hematiacutees joacutevenes el
hematiacutee parasitado es de talla grande
ovalado (es el porqueacute del nombre
ovale) sus bordes estaacuten recortados y
contiene tempranamente numerosos
graacutenulos de Schuumlffner El poli-
parasitismo es posible Los trofozoiacutetos
son ovalados los esquizontes son
irregulares y tienen de 8 hasta 16
merozoiacutetos
Figura 10 Formas endo-eritrociacuteticas del P ovale
Plasmodium malariae es menos frecuente que P vivax o P falciparum y se
encuentra principalmente en zonas como Aacutefrica subsahariana o sudeste
asiaacutetico Su incubacioacuten dura alrededor de 3 a 4 semanas Puede permanecer
en estado latente hasta 20 antildeos El ciclo de maduracioacuten eritrociacutetica dura 72
horas Parasita los hematiacutees viejos (1 a 2) los que son de tamantildeo normal o
retractado y monocromaacutetico Morfoloacutegicamente P malariae estaacute
caracterizado por la disposicioacuten en banda cuadrilaacutetera o ecuatorial de los
17 Imaacutegenes extraiacuteda de wwwgefor4tcom
Malaria y Plasmodium
24
trofozoiacutetos con esquizontes que presentan 8 merozoiacutetos y con gametocitos
semejantes a los de P vivax pero maacutes pequentildeos
Figura 11 Formas endo-eritrociacuteticas del P malariae
Plasmodium falciparum es la especie maacutes temible y mortal Se encuentra en
las regiones tropicales y subtropicales de Aacutefrica en Nueva Guinea y Haitiacute
El desarrollo de su ciclo en el mosquito necesita una temperatura superior a
los 18 degC a esto se debe su ausencia en las montantildeas tropicales y en las
regiones templadas Su ciclo exo-eritrociacutetico es el periodo maacutes corto dura
solamente de 7 a 15 diacuteas de promedio La longevidad del paraacutesito no pasa
habitualmente de 2 meses aunque puede llegar a un antildeo P falciparum
parasita todos los hematiacutees por esto maacutes del 10 de los gloacutebulos rojos
pueden ser parasitados En el frotis de sangre se observa la presencia
uniforme de trofozoiacutetos anulares (los esquizontes se encuentran en
capilares profundos y presentan hasta 16 merozoiacutetos) el poliparasitismo de
un gloacutebulo rojo es frecuente Los gametocitos tienen la forma de banana o
pequentildea hoz (del latino falx falcis) a esto se debe el nombre de esta especie
Figura 12 Formas endo-eritrociacuteticas del P falciparum
Malaria y Plasmodium
25
II4 Sintomatologiacutea
La infeccioacuten por malaria se puede confundir faacutecilmente con un catarro o gripe
comuacuten ya que como se describe en apartados anteriores es el desarrollo de los
esquizontes y la posterior ruptura de los hematiacutees (Figura 13) para seguir
infectando hematiacutees sanos lo que causa la aparicioacuten de sintomatologiacutea cliacutenica
Aunque en la liberacioacuten de nuevos merozoiacutetos tambieacuten se produce la liberacioacuten
de otras sustancias que producen la
sintomatologiacutea caracteriacutestica como los dolores
musculares dolor de cabeza naacuteuseas y voacutemitos
fiebres sudoraciones secuenciales y escalofriacuteos
La sintomatologiacutea observada en la infeccioacuten por
Plasmodium variacutea seguacuten el tipo de malaria que
desarrolla el enfermo
Figura 13 Ruptura de los Eritrocitos infectados18
En Malaria no complicada los siacutentomas caracteriacutesticos son acceso malaacuterico
anemia19 esplenomegalia20 (por la funcioacuten de limpieza de la sangre de
geacutermenes e impurezas por fagocitosis y la produccioacuten de linfocitos la funcioacuten
inmune produce este marcador interno de la infeccioacuten) y en ocasiones
ictericia21 Los picos de fiebre se correlacionan con altos niveles seacutericos de TNF-
α por la liberacioacuten de proteiacutenas del paraacutesito en la ruptura de los eritrocitos que
crea la anemia Ademaacutes de esto se asocia una creacioacuten de anticuerpos contra los
hematiacutees diseritropoyesis22 y secuestro espleacutenico23
18 Imagen extraida de wwwimmuninforu 19 Patologiacutea general Empobrecimiento de la sangre por disminucioacuten de su cantidad total o cantidad de hemoglobina [a(n)- ἀ-ἀν- gr no + -haimiacuteā -αιμία gr sangre] httpDicciomedeusales 20 Patolgiacutea general Aumento de volumen o hipertrofia del bazo[ splēn(o)- σπλή-ν-νός gr bazo + -megalia μεγαλ-ία gr cient tamantildeo excesivo] httpDicciomedeusales 21 Patologiacutea digestiva y hepatoloacutegica Enfermedad producida por acumulacioacuten de pigmentos biliares en la sangre cuya sentildeal exterior maacutes visibles es la amarillez de la piel y las conjuntivas [ikter(o)- ἴκτερος gr ictericia (amarillo) + -ik-os-ik-ē gr + -ia(m) lat cualidad] httpDicciomedeusales 22 (Del griego an- privacioacuten y haima sangre) Sinoacutenimo OLIGOHEMIA ESPANEMIA Empobrecimiento de la sangre caracterizado por la disminucioacuten de uno de varios o de todos sus elementos (anemia total anemias parciales) Esta palabra se aplica generalmente cuando se emplea sin epiacuteteto a una anemia parcial caracterizada por la disminucioacuten del nuacutemero de gloacutebulos rojos o maacutes exactamente por la disminucioacuten de la cantidad de hemoglobina contenida en la unidad de volumen de sangre no estando aumentado el volumen plasmaacutetico (Jean Bernard) Se emplea tambieacuten para designar el estado del organismo privado de sangre y desde este punto de vista la anemia puede ser general o local Se dice que la anemia es hemotiacutesica cuando obedece a la destruccioacuten exagerada de los hematiacutees y mielotiacutesica cuando resulta de la detencioacuten de su formacioacuten por insuficiencia del tejido mieloide (Pappenheim) wwwportalesmedicoscom
Malaria y Plasmodium
26
En Malaria croacutenica se produce esplenomegalia y hepatomegalia24 asiacute como
accesos febriles irregulares y de baja intensidad La piel se torna amarillo-
terrosa se producen palpitaciones somnolencia y fatiga Una caracteriacutestica muy
comuacuten es la baja parasitemia que presentan los pacientes
En el embarazo la malaria produce alta mortalidad materna por anemia
partos prematuros por insuficiencia cardiacuteaca palpitaciones mareos y disnea25
Esto repercute en el bebeacute de forma que producen muertes neonatales y dantildeos
cerebrales
La Malaria severa es producida por Plasmodium falciparum que ocasiona
disfuncioacuten de oacuterganos vitales altas parasitemias imposibilidad de tratamiento
por viacutea oral y hemoacutelisis intravascular
Los casos maacutes graves son los de Malaria cerebral Los nintildeos son el grupo maacutes
susceptible de contraer este tipo de malaria Los hematiacutees infectados se tornan
maacutes adhesivos y se pegan a las paredes de los vasos capilares entre otros a los
del cerebro Se produce anemia grave fallos renales y pulmonares agudos
convulsiones trastornos de movilidad y neuroloacutegicos El paciente entra en
coma pudiendo fallecer en 24 horas Si se logra un retorno del coma los dantildeos
cerebrales residuales son permanentes
II5 Deteccioacuten y diagnoacutestico
Es relativamente sencillo diagnosticar malaria pero lo realmente complicado
y uacutetil es el diagnostico concreto del tipo de malaria Ejemplo de ello es que una
caracteriacutestica de la infeccioacuten por P falciparum es la alta parasitemia donde
hasta 3 trofozoiacutetos se encuentran invadiendo un eritrocito o la aparicioacuten de
gametocitos con forma alargada que no se da en otros tipos de plasmodio
El diagnoacutestico de la malaria se realiza basaacutendose en una serie de criterios
cliacutenicos epidemioloacutegicos y de laboratorio que con una adecuada anamnesis y
examen fiacutesico pueden orientar con alto grado de certeza sobre el tipo de malaria
23 Un gran nuacutemero de ceacutelulas falciformes quedan atrapadas en el bazo y producen su agrandamiento repentino Los siacutentomas pueden incluir debilidad repentina palidez en los labios respiracioacuten raacutepida sed extrema dolor abdominal (del estoacutemago) o en el costado izquierdo del cuerpo y palpitaciones raacutepidas wwwcdcgov 24 Patologiacutea digestiva y hepatoloacutegica Aumento de volumen o hipertrofia del hiacutegado [hēpat(o)- ἧπα-ρ-τος
gr hiacutegado + -megalia μεγαλ-ία gr cient tamantildeo excesivo] httpDicciomedeusales 25 Patologiacutea neumoloacutegica dificultad para respirar [dys- δυσ- gr dificultad + -pnoi(a) -πνοια gr respiracioacuten] httpDicciomedeusales
Malaria y Plasmodium
27
contraiacuteda Las pruebas maacutes concluyentes son la visualizacioacuten del paraacutesito o
deteccioacuten de antiacutegenos en pruebas raacutepidas
Criterios cliacutenicos Se tendraacuten en cuenta tanto episodios malaacutericos anteriores
del paciente como fiebres actuales o recientes (en menos de un mes) escalofriacuteos
intensos sudoracioacuten profusa naacuteuseas y voacutemitos mialgias siacutentomas
gastrointestinales anemia o esplenomegalia
Criterios epidemioloacutegicos El estudio de antecedentes aporta mucha
informacioacuten para el diagnoacutestico Antecedentes como los de exposicioacuten en los
uacuteltimos quince diacuteas en aacutereas de transmisioacuten activas antecedentes hospitalarios
transfusioacuten sanguiacutenea de medicacioacuten antimalaacuterica o relacioacuten con personas que
hayan sufrido malaria
Criterios de laboratorio La forma maacutes sencilla de detectar la enfermedad
incluyendo casos donde todaviacutea estaacute en estado latente es el Meacutetodo de la Gota
gruesa La toma de muestra se realiza mediante la puncioacuten con una lanceta
esteacuteril normalmente en la yema del dedo Se recogen 3 oacute 4 gotas sobre un
portaobjetos y con la esquina de otro se unen en movimientos raacutepidos
extendieacutendose hasta formar una capa gruesa y uniforme Se usa para la
determinacioacuten de la parasitemia y tiene una sensibilidad del 80 y 100 de
especificidad
Se mide mediante la ecuacioacuten
(Nordm paraacutesitos x 8000) Parasitemia (paraacutesitosμL) =
200 eritrocitos (hematiacutees)
La gota gruesa permite analizar una mayor cantidad
de sangre facilitando la deteccioacuten de parasitemias
bajas menores del 1 (Figura 14) y un ahorro de
tiempo en el examen aunque al romperse los
eritrocitos resulta difiacutecil la identificacioacuten de especie
Figura 14 Vista al microscopio de los eritrocitos26
26 Disponible en
httpdpdcdcgovdpdxhtmlFramesMRMalariaovalebody_malariadfovaringhtm
Malaria y Plasmodium
28
Es una prueba sencilla y poco costosa que muestra los casos positivos En
zonas de alta trasmisioacuten esta prueba no es determinante ya que la deteccioacuten de
paraacutesitos en sangre no significa que la posible fiebre que presente una persona
sea por malaria
Como se ha indicado antes es importante la determinacioacuten de la especie de
Plasmodium y se consigue tambieacuten de una manera sencilla con el Meacutetodo de
frotis donde la muestra se colecta de la misma forma que la gota gruesa pero en
este caso se recoge una gota de sangre en un portaobjetos y con otro se realiza
la extensioacuten en capa fina de la misma El inconveniente para realizar estas dos
teacutecnicas sencillas es que se necesita un laboratorio y personal cualificado no
disponible en muchas de las zonas endeacutemicas
Hay otras teacutecnicas de deteccioacuten maacutes desarrolladas como el sistema QBC
(Quantitative Buffy Coat test) que es un meacutetodo de screening para la deteccioacuten
raacutepida de paraacutesitos en sangre centrifugada en un microcapilar Es un meacutetodo
gravimeacutetrico que usa la fluorescencia para la determinacioacuten Aunque es un
meacutetodo raacutepido son necesarias infraestructuras y es difiacutecil distinguir la especie
Existen tambieacuten otros meacutetodos basados en teacutecnicas inmunocromatograacuteficas
en la deteccioacuten de antiacutegenos parasitarios La HRP-2 y la LDH son proteiacutenas
secretadas por el paraacutesito y por tanto indicadoras de su presencia Son pruebas
raacutepidas y no precisan microscopio Tambieacuten son faacuteciles de interpretar ya que
son test en tiras o tarjetas donde se pone una muestra de sangre y se revelan
Son usados como examen de autodiagnoacutestico y en lugares donde no hay
laboratorios como examen preliminar El problema es que dan falsos negativos
y no es un meacutetodo cuantitativo del grado de infeccioacuten
Por uacuteltimo las teacutecnicas de biologiacutea molecular usadas en casos de baja
parasitemia infecciones mixtas o mutaciones entre otras Aunque presentan
muchas ventajas son teacutecnicas laboriosas caras y poco accesibles ya que se
necesitan medios y personal muy cualificado
Es por tanto la combinacioacuten de los criterios explicados la forma maacutes
concluyente de diagnosticar que tipo de malaria estaacute afectando a un enfermo
IIIIII PPRREEVVEENNCCIIOacuteOacuteNN YY TTRRAATTAAMMIIEENNTTOO
Prevencioacuten y Tratamiento
31
III1 Medidas preventivas
La malaria es una enfermedad que puede prevenirse desde sus dos frentes
principales el vector mosquito y el hospedador humano Las medidas de
prevencioacuten se centran en objetivos distintos como evitar el desarrollo de la
enfermedad con proteccioacuten individual en aacutereas endeacutemicas erradicacioacuten del
mosquito prevencioacuten de la picadura o desarrollo de medicamentos
profilaacutecticos
En lo que a la lucha antivectorial se refiere el uso de mosquiteras en las
camas ha reducido mucho el caso de nuevos contagios de la enfermedad Es
una medida que a simple vista parece muy sencilla pero que en realidad no lo
es El problema estaacute en que en muchos de los paiacuteses endeacutemicos la pobreza es
elevada y por tanto el coste de las mosquiteras no es asumible por las personas
En otras ocasiones no es el coste de dichas mosquiteras lo que impide la
prevencioacuten sino que las redes son usadas con otros fines prioritarios como la
pesca En la actualidad la OMS recomienda el uso de insecticidas como
piretroides para impregnar las mosquiteras
Otra forma eficaz de reducir raacutepidamente la transmisioacuten del paludismo es la
fumigacioacuten de interiores con insecticidas de accioacuten residual Los mejores
resultados se consiguen cuando se fumiga al menos el 80 de las viviendas de
la zona en cuestioacuten La fumigacioacuten de interiores es eficaz de tres a seis meses
dependiendo del insecticida utilizado y del tipo de superficie sobre la que se
aplica En algunos casos el DDT puede ser eficaz de nueve a doce meses
Actualmente se estaacuten desarrollando insecticidas con accioacuten residual maacutes
prolongada para la fumigacioacuten de interiores Se ha comprobado la eficacia de
insecticidas como el DDT que aunque fue prohibido su uso por su alto grado de
toxicidad en plantas y su efecto acumulativo sigue siendo ampliamente
utilizado en la lucha contra la malaria Tambieacuten se cuenta con la ayuda de los
repelentes para la piel (DEET) o tiras insecticidas Finalmente no se deberiacutea
olvidar como arma vaacutelida y primaria para la lucha la educacioacuten en prevencioacuten
y gestioacuten del medio ambiente
En lo que al factor humano se refiere el uso de medicamentos especiacuteficos en
bajas dosis durante largo tiempo es la forma actual de profilaxis En esta liacutenea
se estaacuten desarrollando vacunas y tratamientos actualmente en el campo de la
genoacutemica
Prevencioacuten y Tratamiento
32
III2 Tratamiento
III21 Historia del tratamiento
La malaria es una de las enfermedades mejor estudiadas de la medicina
occidental hasta mediados del siglo XX a pesar de
que no se haya encontrado solucioacuten para su
erradicacioacuten A principios del siglo XVIII el
primer tratamiento conocido se basoacute en el uso de
la corteza de un aacuterbol originario de Sudameacuterica
la Cinchona (Figura 15) En 1820 se consiguioacute
aislar e identificar la quinina como compuesto
activo
Figura 15 Aacuterbol de la Cinchona pubescens
En 1891 el azul de metileno se usoacute para tratar a dos pacientes enfermos de
malaria Asiacute se convierte este compuesto en el primer ldquomedicamento sinteacuteticordquo
Actualmente se conoce que su mecanismo de accioacuten implica la inhibicioacuten de la
glutatioacuten reductasa y posteriormente la interrupcioacuten de la homeostasis redox
del paraacutesito
En 1925 se desarrolloacute la mepraquina para combatir estadios del P falciparum
en sangre Es un compuesto que pertenece al grupo de derivados de acridina
usados en el sudeste asiaacutetico durante la II Guerra Mundial Ya en 1934 se
sintetizoacute la cloroquina (CQ) aunque no es hasta el antildeo 1946 cuando comienza
su uso porque se consideraba demasiado toacutexica Con esta estructura comienza a
desarrollarse el grupo de las 4-aminoquinolinas Desde entonces ha sido el
antimalaacuterico maacutes utilizado En 1969 la guerra del Vietnam conlleva el uso de la
mefloquina y halofantrina que son aminoalcoholes derivados de la quinina
Sin embargo el antimalaacuterico maacutes antiguo puede ser la artemisina descubierta
en el antildeo 1596 a partir de un compuesto de origen natural de China La
Artemisina Annua es una planta originaria oriental que constaba ya siglos atraacutes
en los manuales de procedimientos para el tratamiento de fiebres Aunque no
fue hasta el antildeo 1972 cuando se consiguioacute aislar e identificar Este compuesto es
utilizado en la actualidad y resulta eficaz y poco toacutexico
Prevencioacuten y Tratamiento
33
III22 Clasificacioacuten de los compuestos antimalaacutericos
A lo largo de la historia se han usado diferentes tratamientos derivados del
desarrollo de nuevas estructuras y del mejor conocimiento de la enfermedad y
del paraacutesito
De este modo las estructuras pueden clasificarse por
Actividad antimalaacuterica
o Hombre
Estados pre-eritrociacuteticos profilaxis eventual pero poco praacutecticos
Hipnoticidas para P vivax y P ovale actuacutean a nivel hepaacutetico
Esquizonticidas en sangre para estados eritrociacuteticos asexuales
o Mosquito
Gametocidas destruccioacuten de las formas eritrociacuteticas de la fase
sexual del mosquito Prevencioacuten de la transmisioacuten
Esporonticidas previene el crecimiento de los oocitos en el
mosquito tambieacuten se usa para prevenir transmisioacuten
Mecanismo de accioacuten
o Accioacuten sobre la vacuola digestiva del Plasmodium accioacuten sobre la
degradacioacuten de la Hb detoxificacioacuten de la hematina (por ejemplo la
CQ)
o Enzimas involucradas en la siacutentesis y metabolismo de
macromoleacuteculas
o Accioacuten sobre procesos de membrana
o Siacutentesis de purinas y pirimidinas
o Glucoacutelisis y siacutentesis de ATP mitocondrial
Forman familias de compuestos con actividades diferentes en muacuteltiples aacutereas
y niveles
Metanolquinolinas y arilaminoalcoholes
La metanolquinolinas y arilaminoalcoholes forman una familia de
compuestos de gran importancia Este grupo engloba desde
estructuras con gran relevancia histoacuterica como la quinina hasta
compuestos como la lumefantrina que se usa en terapias combinadas
en la actualidad
Prevencioacuten y Tratamiento
34
Estas dos familias de compuestos estaacuten relacionadas entre siacute Como
primera correspondencia destacar su gran efectividad como
esquizonticidas sanguiacuteneos Intervienen en la digestioacuten de la Hb en
concreto en la detoxificacioacuten especiacutefica de la hemozoiacutena
Pertenecientes a la familia de metanolquinolinas son la quinina y
quinidina (que son isoacutemeros L y D) y mefloquina (Figura 16)
Figura 16 Estructura de metanolquinolinas
El problema de la quinina y la quinidina es sus efectos adversos sin
embargo siguen siendo ampliamente usados debido a su faacutecil acceso
La mefloquina es muy uacutetil en malarias resistentes pero tiene efectos
neurosiquiaacutetricos adversos
Los arilaminoalcoholes como halofantrina y lumefantrina (Figura
17) son estructuras de gran capacidad esquizonticida siendo el
mecanismo de accioacuten en la mayor parte de ellos la intervencioacuten en los
procesos de degradacioacuten de la Hb
Figura 17 Estructura de arilaminoalcoholes
Estas estructuras actuacutean en los paraacutesitos maacutes maduros pero no tienen
capacidad hipnoticida Se desarrollaron tras la aparicioacuten de
resistencias a la quinina y CQ
Prevencioacuten y Tratamiento
35
Aminoquinolinas
En este grupo se engloban compuestos como la familia de las 4-
aminoquinolinas y las 8-aminoquinolinas Las 4ndashaminoquinolinas
actuacutean en las fases endo-eritrociacuteticas del paraacutesito La gran ventaja de
esta familia es que los compuestos son faacuteciles de sintetizar
econoacutemicos y bien tolerados A este grupo pertenecen compuestos tan
relevantes como la cloroquina efectiva en profilaxis pero que en la
actualidad presenta problemas de resistencias o la amodiaquina que
es mejor que la CQ para eliminar parasitemias aunque es
hepatotoacutexica (Figura 18)
Figura 18 Estructura quiacutemica de la cloroquina y la amodiaquina
Al grupo de las 8-aminoquinolinas pertenecen la pamaquina la
primaquina y la tafenoquina (Figura 19) que son el uacutenico grupo de
gametocidas y tambieacuten son usadas como profilaxis El gran problema
de estos compuestos es su alta toxicidad
Figura 19 Estructuras de 8-aminoquinolinas
Prevencioacuten y Tratamiento
36
Derivados de acridina
Son compuestos de relevancia histoacuterica como la mepraquina
compuesto sucesor y de origen muy similar a la CQ que fue el primer
compuesto sinteacutetico usado cliacutenicamente como esquizonticida La
pironaridina que tambieacuten pertenece a esta familia (estructuralmente
relacionado con la amodiaquina) se usa en casos de malaria por P
falciparum resistente pero tiene baja biodisponibilidad oral y su precio
es elevado (Figura 18)
Figura 18 Estructura de derivados de acridina
Antifolatos e inhibidores de la siacutentesis de folatos
El aacutecido foacutelico obtenido mediante la dieta es convertido por el
paraacutesito en aacutecido tetrahidrofoacutelico necesario para su superviviencia
Los antifolatos inhiben el metabolismo del aacutecido foacutelico actuando como
coenzimas de la siacutentesis de ADN y pirimidinas Estos compuestos
actuacutean sobre los estados de crecimiento del paraacutesito en el hiacutegado y
detienen la reinfeccioacuten del mosquito
Pertenecen a esta familia sulfonamidas como sulfadoxina o sulfonas
como dapsona y compuestos como proguanil y pirimetamina (Figura
19)
Figura 19 Estructura de antifolatos
Prevencioacuten y Tratamiento
37
Antibioacuteticos
Son familias de compuestos que actuacutean a nivel celular y de
genoma Una de sus dianas es la inhibicioacuten de la siacutentesis de
proteiacutenas con funciones metaboacutelicas importantes para la
supervivencia del paraacutesito Este es el caso de la inhibicioacuten de la
funcioacuten del apicoplasto que interviene en la siacutentesis del grupo
hemo o liacutepidos Para ello estaacuten los antibioacuteticos del grupo de
tetraciclinas como la doxiciclina (Vibramycinreg) (Figura 20)
Figura 20 Estructura de la doxiciclina
Artemisinas y terapias combinadas de artemisinas (TCA)
Esta familia proviene del compuesto aislado del la planta Artemisia
Annua La artemisina (Figura 21) se obtiene solo por viacutea natural y el
resto de derivados son semisinteacuteticos El mecanismo de accioacuten es el
mismo que el de las 4-Aminoquinolinas solo que en esta ocasioacuten viacutea
radicales libres
Son compuestos muy activos en malaria y aunque sus tiempos de vida
son cortos ofrecen actividad aguda El punto negativo es que en su
tiempo de accioacuten no son capaces de eliminar toda la parasitemia y son
necesarias terapias combinadas con otros compuestos En la
actualidad se ha detectado la aparicioacuten de resistencias debido al uso
de monoterapias
Figura 21 Estructura de la artemisina
Prevencioacuten y Tratamiento
38
III23 Aparicioacuten de resistencias
La OMS ha definido resistencia como la capacidad de una cepa parasitaria de
sobrevivir yo multiplicarse a pesar de la administracioacuten y absorcioacuten de un
medicamento dada a dosis iguales o mayores que aquellas usualmente
recomendadas pero dentro de los liacutemites de tolerancia del sujeto La resistencia
a los antimalaacutericos es un serio problema desde hace antildeos En 1973 la CQ fue
reemplazada por la combinacioacuten de sulfadoxina + pirimetamina (Fansidarreg)
Pero en 1985 eacutesta tambieacuten se volvioacute inefectiva en algunas cepas de P falciparum
Estaacute demostrado que la resistencia a algunos antimalaacutericos se desarrolla cierto
tiempo despueacutes de la introduccioacuten de los mismos como tratamiento uacutenico
Seguacuten la OMS se describen tres grados de resistencia in vivo a las drogas
antimalaacutericas
- Grado I (bajo grado) recurrencia a los 7 y 28 diacuteas del tratamiento completo
siguiendo a una inicial solucioacuten de los siacutentomas y reduccioacuten de la
parasitemia
- Grado II (grado intermedio) reduccioacuten de la parasitemia asexuada en maacutes
de un 75 dentro de las 48 h del tratamiento pero con aumento a los siete
diacuteas
- Grado III (alto grado) el nivel de la parasitemia asexuada no cae en maacutes del
75 dentro de las 48 h despueacutes del tratamiento
En la actualidad uno de los compuestos maacutes utilizados es la quinina que a
pesar de los efectos adversos que tiene es uno de los compuestos maacutes accesibles
en los paiacuteses pobres lo que facilita su uso actual Tambieacuten la artemisina y sus
derivados son ampliamente utilizados ya que estudios recientes demuestran la
gran capacidad antiplasmoacutedica Pero en su contra estaacute la baja vida del
compuesto la parasitemia residual y la aparicioacuten de resistencias Ademaacutes de
estos puntos negativos se une el hecho de que la uacutenica viacutea de obtencioacuten de este
compuesto es por medio natural no es viable su obtencioacuten por siacutentesis quiacutemica
lo que conlleva encarecimiento del producto por su limitada accesibilidad
Estudios actuales han conseguido explicar el origen de alguna de estas
resistencias La CQ es un compuesto que accede a la vacuola digestiva del
paraacutesito para interferir en la detoxificacioacuten de la hemozoiacutena El pH de la
vacuola estaacute en torno a 5 lo que produce una protonacioacuten de la CQ hasta su
forma diproacutetica (CQH2+2) En esta forma protonada la QC queda atrapada
Prevencioacuten y Tratamiento
39
dentro de la vacuola porque no se puede difundir y es asiacute como produce su
accioacuten
El Plasmodium falciparum que ha desarrollado resistencia a la CQ se caracteriza
por la proteiacutena PfCRT (Plasmodium Falciparum Chloroquine Resistance
Transporter) modificada Esta proteiacutena adopta la funcioacuten de unirse a la CQ para
realizar su transporte fuera de la vacuola evitando asiacute la acumulacioacuten y la
realizacioacuten de la funcioacuten del faacutermaco Los primeros estudios realizados en este
tema (Fidock DA et alts 2000) mostraron los primeros datos sobre la relacioacuten
entre las mutaciones el pH de la vacuola digestiva y las concentraciones del
faacutermaco dentro de la vacuola digestiva En un principio se pensoacute que las
mutaciones en los genes del Plasmodium provocaban la acidificacioacuten del medio
interior de la vacuola digestiva alterando la concentracioacuten del faacutermaco o
reduciendo la fijacioacuten a la hematina
Estudios posteriores (Martin R et alts 2009) han llegado a concretar el
mecanismo por el cual se producen resistencias a la CQ La mutacioacuten que le
confiere resistencia a la CQ es el cambio de una lisina (K) por una treonina (T)
en la posicioacuten 76 de la serie de aminoaacutecidos Esta mutacioacuten K76T se da en la
regioacuten de la proteiacutena que se cree involucrada en la unioacuten con la moleacutecula Estaacute
siendo objeto de estudio la creacioacuten de nuevos derivados que favorezcan la
inversioacuten de las mutaciones asiacute como favorecer de nuevo la formacioacuten de la
conformacioacuten T76K Ocurre lo mismo con el intercambio de posicioacuten arginina-
serina (R163S confiere resistencia a la CQ y el cambio a S163R la vuelve
sensible) Este cambio confiere carga positiva al sitio de unioacuten e imposibilita por
repulsioacuten de cargas la unioacuten de la PfCRT con la CQ lo que confiere
sensibilidad a la cepa resistente
La aparicioacuten de resistencias a la artemisina queda registrada en el sudeste
asiaacutetico durante estos uacuteltimos antildeos Se han descrito evidencias cliacutenicas que
concluyen que existen en la actualidad casos de resistencias a la artemisina y a
los TCA promovida principalmente por el extendido uso de las monoterapias
de artemisina pero todaviacutea estaacute en estudio el mecanismo por el que se producen
estas resistencias (OMS Informe 2011) En la actualidad la posibilidad de
estudiar el genoma de los paraacutesitos y los mecanismos de accioacuten de los
diferentes tratamientos da como resultado el conocimiento de las resistencias y
la oportunidad de mejorar los tratamientos existentes
Prevencioacuten y Tratamiento
40
Dentro de las medidas de lucha contra la malaria estaacuten como se ha
comentado las referentes al control de vectores La uacutenica clase de insecticidas
empleados en las mosquiteras actualmente recomendadas incluidos los de
accioacuten prolongada actualmente recomendados son los piretroides En este
aacutembito tambieacuten se han desarrollado resistencias en la actualidad Se carece por
ahora de insecticidas alternativos que sean seguros y con una aceptable relacioacuten
costo-eficacia El desarrollo de nuevos insecticidas alternativos es una tarea de
alta prioridad pero tambieacuten larga y costosa Mientras la deteccioacuten de las
resistencias debe ser un componente esencial de todos los esfuerzos por
controlar el paludismo (OMS 2012)27
III24 Tratamientos actuales
Los regiacutemenes terapeacuteuticos en malaria son muy diversos ya que ademaacutes de
las caracteriacutesticas del paciente dependen del tipo de Plasmodium que infecta y la
zona donde se contrae la enfermedad
Cloroquina
Se usa a dosis maacutexima de 25 mgkg viacutea oral en P ovale y P malariae y cepas
sensibles de P vivax y P falciparum Actuacutea en la vacuola digestiva del
paraacutesito interfiriendo en la detoxificacioacuten de la hematina La alternativa
terapeacuteutica es gluconato de quinidina o quinina
Los efectos adversos que se producen son nauseas irritacioacuten con picor o
desoacuterdenes neuropsiquiaacutetricos La sobredosis se ha de tratar con diazepam
En caso de cepas P vivax resistentes se usa mefloquina halofantrina o
sulfato de quinina combinado con tetraciclinas o sulfonamidas Para tratar
recaiacutedas por hipnozoiacutetos se usa el fosfato de primaquina Para tratar
infeccioacuten por P falciparum resistente se usa sulfato de quinina 250 mgkg
combinado con pirimetamina-sulfadoxina o combiando con doxiclina Para
el tratamiento de nintildeos y embarazadas la quinina se combina con
clindamicina
Quinina
Es usada para el tratamiento de P falciparum resistente a la CQ Actuacutea como
esquizonticida sanguiacuteneo Como alternativa se usa el gluconato de
quinidina que es maacutes potente Las alternativas terapeacuteuticas son mefloquina
27 httpwwwwhointmalariadiagnosis_treatment
Prevencioacuten y Tratamiento
41
halofantrina atovaquona artemisinina y pirimetamina-sulfadoxina Para P
falciparum resistente se usa la artemisina IV combinada con tetraclicina o
mefloquina
Los efectos adversos son sabor metaacutelico tinnitus28 y peacuterdida de audicioacuten
reversible
Pirimetamina-sulfadoxina (Fansidarreg)
Es inhibidor de la siacutentesis de aacutecido foacutelico del ciclo vital del paraacutesito Se
utiliza en paiacuteses en desarrollo por su bajo coste sin embargo el incremento
de la resistencia a los antifolatos lo colocan como agente de segunda liacutenea
Mefloquina (Lariamreg)
Puede administrarse a dosis uacutenica de 25 mg baseKg y actuacutea como
esquizonticida sanguiacuteneo No debe administrarse en nintildeos con menos de 15
Kg de peso ni en pacientes que reciban quimioprofilaxis ni halofantrina
para evitar la resistencia cruzada Puede combinarse con doxiciclina
quinina y derivados de la artemisinina
Los efectos adversos son voacutemitos y toxicidad neuroloacutegica manifiestada en
forma de mareos delirio ataxia29 y convulsiones
Halofantrina
Se administra en dosis de 24 mgKg para intervenir en la degradacioacuten de la
Hb El faacutermaco tiene absorcioacuten oral variable y estaacute contraindicado en
enfermos con afecciones cardiacuteacas embarazadas y durante la lactancia Los
efectos adversos se han asociado con toxicidad cardiacuteaca y arritmias30
Atovaquona ndashproguanil (Malaronereg)
La dosis empleada es de 250 mg atovaquona100 mg proguanil Interviene
en la siacutentesis de aacutecido foacutelico del paraacutesito y en la cadena de transporte
electroacutenico mitocondrial (principal accioacuten de la atovaquona) El faacutermaco se
usa generalmente en profilaxis pero tambieacuten en el tratamiento de malaria
28 Patologia Otorrinolaringologa Estomatologa Percepcioacuten de golpeos o pitidos en el oiacutedo que no proceden de ninguna fuente [ claacutes tinnītus es tintineo] httpdicciomedeusales 29 Patologiacutea Neuroloacutegica Perdida de la capacidad de ejecutar movimientos de manera voluntaria ordenada y suavemente Puede afectar a tronco extremidades faringe laringe etc Se debe a la afectacioacuten de algunas estructuras del sistema nervioso [gr ataxiacuteā ἀταξία [a(n)- ἀ-ἀν- gr no + tag- τάξις gr orden formacioacuten + -siacuteā gr] httpdicciomedeusales 30 Patologiacutea cardiovascular Irregularidad y desigualdad en las contracciones del corazoacuten [gr arrythmiacuteā ἀρρυθμία [a(n)- ἀ-ἀν- gr no + rhythm(o)- ῥυθμός gr cadencia ritmo + -iacuteā gr cualidad] wwwdicciomedeusales
Prevencioacuten y Tratamiento
42
por P falciparum resistente a otros medicamentos No presenta efectos
adversos destacables
Derivados de la artemisina o TCA
La dosis de administracioacuten es de 12 mgKg pero es conveniente que se
combinen preferiblemente con mefloquina tetraciclina o clindamicina
Son el tratamiento de eleccioacuten para P falciparum resistente a quinina ya que
estos eliminan la parasitemia maacutes raacutepidamente que la quinina No se ha
descrito toxicidad severa en humanos aunque algunos estudios
demuestran neurotoxicidad en animales Auacuten no se ha determinado la
seguridad del uso de estos compuestos durante el embarazo
Artemeter-lumefantrina (Coartemreg y Riametreg)
Es una combinacioacuten fija de artemeter (20 mg) y lumefantrina (120 mg) con
accioacuten esquizonticida sanguiacutenea La combinacioacuten es eficaz contra las cepas
de P falciparum resistentes a otros tratamientos sin artemisina
Prevencioacuten y Tratamiento
43
III3 Estrategias mundiales en la lucha contra la malaria
En el antildeo 2008 se formoacute un grupo de estudio y control sobre la malaria
mundial integrado por la OMS Fondo de Naciones Unidas para la infancia
(UNICEF) el Programa de Naciones Unidas para el desarrollo (PNUD) el
Banco Mundial y la Asociacioacuten de la lucha contra el paludismo (FRP) Se crean
una serie de frentes de lucha para combatir y reducir la malaria mundial en un
plazo de 7 antildeos incluiacutedo en los Objetivos de Desarrollo del Milenio propuestos
por la ONU
La estrategia mundial tiene cuatro elementos baacutesicos
o Asegurar el diagnoacutestico precoz y el tratamiento inmediato
o Planificar y aplicar las medidas selectivas y sostenibles de prevencioacuten
incluiacuteda la lucha antivectorial
o Detectar a tiempo contener o prevenir las epidemias
o Reforzar la capacidad local en materia de investigacioacuten baacutesica y aplicada
a fin de permitir y promover la evaluacioacuten regular de la situacioacuten del
paludismo en el paiacutes en particular los factores ecoloacutegicos sociales y
econoacutemicos que influyen en la enfermedad
En el antildeo 2010 se realizoacute una revisioacuten del estado del plan y se propusieron
una serie de adaptaciones para mejorar los buenos resultados obtenidos
teniendo en cuenta la situacioacuten actual de aparicioacuten de resistencias
- Cobertura universal de los programas de prevencioacuten y tratamiento
- En prevencioacuten se proponen
mayores esfuerzos en proporcionar mosquiteras y principalmente un
haacutebito en su uso ya que se habiacutean obtenidos datos concluyentes que
relacionan directamente la disminucioacuten de muertes sobre todo
infantiles con el uso de mosquiteras
mantenimiento del rociado de exteriores con insecticidas de accioacuten
residual aprobadas por la OMS
administracioacuten de tratamiento preventivo intermitente a embarazadas
en zonas endeacutemicas
- En tratamientos se propone
priorizar las confirmaciones parasitoacutelogas de la enfermedad en
pacientes Es decir en la medida de lo posible no administrar
Prevencioacuten y Tratamiento
44
tratamientos sin confirmacioacuten de la enfermedad al microscopio o con
pruebas de diagnostico raacutepido
priorizar al uso de las TCA proponieacutendose la retirada de las
monoterapias orales de artemisina (OMS 2011)
III4 Liacuteneas de investigacioacuten actual
III41 Buacutesqueda de nuevas dianas
En la actualidad la aparicioacuten de resistencias por las mutaciones en el ADN del
paraacutesito obliga a un esfuerzo mayor por encontrar compuestos o asociaciones
de compuestos que sigan siendo efectivos contra el Plasmodium ademaacutes de a la
buacutesqueda de nuevos medicamentos Gracias a los avances de las ciencias
quiacutemicas y tecnologiacuteas actuales y el desarrollo de la Bioquiacutemica y la Genoacutemica
en la lucha contra la malaria posibilitan la determinacioacuten de nuevas dianas Ya
desde hace tiempo se conoce la viacutea de accioacuten de la detoxificacioacuten de la Hb pero
el continuo avance de la ciencia ha llevado al conocimiento del ADN y de las
macromoleacuteculas necesarias para la vida del paraacutesito conocimiento de las
mutaciones que llevan a las resistencias enzimas y otras moleacuteculas que
participan en el desarrollo del paraacutesito
Actualmente diferentes proyectos se encuentran en la fase de identificacioacuten de
cabezas de serie con actividad antimalaacuterica o en periodo de optimizacioacuten con el
fin de generar compuestos con propiedades terapeacuteuticas adecuadas como
inhibidores de proteasas de aacutecidos grasos inhibidores de la ruta de siacutentesis de
isoprenoides o del transporte y metabolismo de fosfoliacutepidos del metabolismo
mitocrondial o pirimidiacutenico
En lo que a inhibidores de proteasas se refiere las hemo-polimerasas como
cistein-proteasas (falcipainas) o aspartil-proteasas (plasmepsinas) son objetivos
primordiales de estudio Es el caso del conocimiento de las proteasas aspaacuterticas
del Plasmodium en los procesos de degradacioacuten de la hemoglobina de los
eritrocitos infectados Se ha determinado bioloacutegicamente que participan 4 tipos
de proteasas en concreto las plasmepsinas I II y IV y la histoaspaacutertica
(Ersmark K et alts 2006)
El mecanismo de accioacuten propuesto es la ruptura inicial de las cadenas α de la
Hb en el enlace peptiacutedico entre Phe-33 y Leu-34 Por meacutetodos computacionales
Prevencioacuten y Tratamiento
45
se genera la estructura tridimensional detallada de las enzimas y se estudia si
los compuestos pueden interaccionar inhibiendo su actividad
En relacioacuten con la siacutentesis de aacutecidos grasos hay que destacar las peculiares
caracteriacutesticas que reviste este proceso en bacterias y en cloroplastos Contienen
un sistema denominado tipo II (FASII) en el que cada reaccioacuten en el proceso de
biosiacutentesis estaacute catalizada por una proteiacutena independiente monofuncional al
contrario que en las ceacutelulas de mamiacutefero donde la siacutentesis estaacute mediada por una
proteiacutena multifuncional conocida como la aacutecido graso sintetasa de tipo I Los
inhibidores de enzimas de la ruta son el triclosan y la tiolactomicina un
metabolito secundario de hongos y estaacuten en desarrollo nuevos compuestos con
potencial terapeacuteutico
En faacutermacos dirigidos a la ruta de biosiacutentesis de isoprenoides vale la pena
destacar que el P falciparum depende de la viacutea 2C-metil-D-eritrol 4-fosfato
(MEP) para la siacutentesis de sus isoprenoides La fosmidomicina un antibioacutetico
natural producido por Streptomyces lavendulae ha demostrado ser un buen
tratamiento en el control de la malaria resistente porque inhibe de manera
especiacutefica la actividad de la enzima DOXP reductoisomerasa y porque controla
el segundo paso de la viacutea MEP
Otro proceso que tiene lugar durante las fases endo-eritrociacuteticas del paraacutesito
es la siacutentesis activa de estructuras de membrana Uno de los componentes
principales de las membranas del paraacutesito es el fosfoliacutepido fosfatidil-colina cuya
siacutentesis a su vez depende de la incorporacioacuten de colina exoacutegena a partir de la
sangre Distintos anaacutelogos de la colina exhiben una potente actividad
antimalaacuterica y se asume que inhiben el transporte de colina que tiene lugar a
traveacutes de un transportador especiacutefico localizado en la membrana del paraacutesito
(Vial HJ et alts 2004)
Existen un conjunto de compuestos que interfieren con la actividad
mitocondrial del paraacutesito Las fases endo-eritrociacuteticas tienen un metabolismo
mitocondrial activo estando presentes todas las enzimas implicadas en el ciclo
de los aacutecidos tricarboxiacutelicos y determinados componentes de la cadena de
transporte electroacutenico Asiacute la cadena respiratoria del paraacutesito constituye un
blanco de accioacuten para los faacutermacos Un ejemplo de desarrollo de faacutermacos por
esta viacutea es el Malaronereg donde la atovaquona se une al sitio de oxidacioacuten del
coenzima Q en el citocromo B del complejo III La accioacuten estaacute complementada
por la combinacioacuten con Proguanilo 45 (antifolato)
Prevencioacuten y Tratamiento
46
III42 Productos naturales
Los productos naturales han sido y son de gran intereacutes en el tratamiento de la
malaria La sociedad apuesta por lo natural y se plantean buacutesquedas de
compuestos activos en diferentes plantas de diferentes regiones africanas
(Magadula JJ y Erasto P 2009) o americanas (Mariath IR et alts 2009) ya
consideradas anteriormente como medicinales
La artemisina y sus derivados es el ejemplo a conseguir con estos
compuestos pero evitando en este caso el inconveniente de que solo puede
obtenerse por viacutea natural o semisinteacutetica
En esta liacutenea se siguen desarrollando derivados de artemisina y peroacutexidos que
tienen el mismo mecanismo de accioacuten que la artemisina viacutea radicales libres
(Muraleedharan KM and Mitchell A 2009) Uno de los muchos resultados de
esta variacioacuten de la estructura base son los compuestos hiacutebridos artemisinas-
quinolinas actualmente en desarrollo que dan lugar a los TCA recomendados
por la OMS Las benzo[c]fenantridinas son un grupo de compuestos
provenientes de extractos de plantas que pueden ser sintetizados y
modificados en un laboratorio (Rivaud M et alts 2012) Su mecanismo de
accioacuten estaacute todaviacutea por confirmar pero se cree que tienen actividad sobre la
inhibicioacuten de la ADN topoisomerasa que participa en la degradacioacuten de la Hb
Siguiendo con la liacutenea de productos naturales un objetivo que no se puede
pasar por alto son los compuestos marinos provenientes de esponjas algas
coraleshellip que contienen compuestos con estudiada actividad antimalaacuterica
(Gademann K y Kobyliska J 2009) Un ejemplo son las esponjas que
contienen diferentes familias de compuestos antimalaacutericos como las
pirroloquinolinas o las manzaminas A (Figura 23) de funcioacuten similar a la CQ y
mejor que la artemisina a igual dosis
Figura 23 Estructuras de compuestos naturales de origen marino
Prevencioacuten y Tratamiento
47
III43 Desarrollo de vacunas
Atendiendo a las observaciones sobre inmunidades que llegan a expresar las
personas que habitan zonas con altas tasas de malaria se van desarrollando las
vacunas Se ha comprobado que los esporozoiacutetos inactivos son muy eficaces
como inductores de la inmunidad en el ser humano Desafortunadamente no es
posible producir esporozoiacutetos inactivos en las enormes cantidades requeridas
para utilizarlos como meacutetodo viable de vacunacioacuten Por otro lado los avances
en materia de genoacutemica permiten identificar prometedoras moleacuteculas
inmunogeacutenicas con una rapidez mucho mayor y eso ampliacutea considerablemente
el nuacutemero de vacunas potenciales (Rojas Rivero L et alts 2005)
Las vacunas experimentales estaacuten basadas en diversos antiacutegenos derivados
de las diferentes formas que adopta el paraacutesito durante su ciclo de desarrollo
Los tipos de vacunas actualmente se clasifican en
Vacunas pre-eritrociacuteticas impiden que los esporozoiacutetos penetren o se
desarrollen en las ceacutelulas hepaacuteticas Estas vacunas prevendriacutean las
consecuencias graves y potencialmente mortales del paludismo en las
personas no inmunizadas Hasta la fecha se han ultimado unos 20 ensayos
cliacutenicos en el hombre con diversas proto-vacunas pre-eritrociacuteticas de
Plasmodium falciparum Una proto-vacuna muy prometedora es la RTS S
que promueve la activacioacuten del sistema inmunitario para que actuacutee contra
el P falciparum (Aponte JJ et alts 2007)
Vacunas contra las formas hemaacuteticas asexuadas son aquellas que impiden
que los merozoiacutetos penetren o se desarrollen en el interior de los hematiacutees
Se han desarrollado varios candidatos Sin embargo la mayoriacutea de esos
preparados se encuentra en estudios precliacutenicos y muy pocos han llegado a
estudios cliacutenicos de fase I debido en parte a la gran variabilidad que
manifiestan estas moleacuteculas en diferentes cepas
Vacunas bloqueadoras de la transmisioacuten son aquellas que estimulan la
produccioacuten de anticuerpos contra antiacutegenos de la fase sexuada del paraacutesito
que puedan impedir el desarrollo de esporozoiacutetos infecciosos en las
glaacutendulas salivales del mosquito Anopheles Teoacutericamente estas vacunas
podriacutean interrumpir el ciclo de transmisioacuten del paraacutesito al paso de este por
el vector y seriacutean de gran utilidad para reducir la diseminacioacuten de paraacutesitos
de cepas resistentes a otros tipos de vacunas El problema es que seriacutea
Prevencioacuten y Tratamiento
48
necesaria una vacunacioacuten masiva durante un largo periodo de tiempo
Actualmente hay algunas en estudios cliacutenicos de fase I
A pesar de todas las prometedoras vacunas que estaacuten en desarrollo
actualmente hay que tener en cuenta que los paraacutesitos desarrollan ingeniosos y
complejos mecanismos para soslayar la respuesta inmunitaria del hueacutesped Por
ejemplo son capaces de expresar diferentes antiacutegenos en cada una de las fases
de su ciclo de vida y a menudo modificar esos antiacutegenos cuando el hueacutesped
activa contra ellos su sistema inmunitario Ademaacutes se ha de vigilar la
complejidad inherente a la realizacioacuten de los propios ensayos cliacutenicos sobre el
terreno por cuanto no es faacutecil para los investigadores determinar la reduccioacuten
de la morbilidad y la mortalidad atribuible a la vacuna experimental
ANTECEDENTES
Antecedentes
51
La Unidad de I+D de Medicamentos de la Universidad de Navarra ha estado
trabajando durante varios antildeos en la siacutentesis de nuevos compuestos duales con
afinidad por los receptores 5-HT1A que fuesen a su vez inhibidores de la
recaptacioacuten de 5-HT para el tratamiento de la depresioacuten (Martinez- Esparza J
et alts 2001 Oruacutes L et alts 2002a Oruacutes L et alts 2002c Perez-Silanes S et
alts 2004)
Se llevaron a cabo estudios de modelizacioacuten molecular (Oruacutes L et alts
2002b) que definieron como farmacoacuteforo la estructura de la figura 24
Figura 24 Elementos farmacofoacutericos para la afinidad por los receptores 5-HT1 e inhibicioacuten del transportador de 5-HT
Los compuestos sintetizados podriacutean definirse como arilaminopropanoles
estructuralmente proacuteximos a las metanolquinolinas y arilaminoalcoholes
usados desde hace antildeos como antimalaacutericos Tal y como se como se ha tratado
en el apartado de introduccioacuten quinina y CQ (metanolquinolinas y
arilaminoalcoholes respectivamente) y halofantrina y lumefantina
(arilaminoalcoholes desarrollados tras la aparicioacuten de resistencias a las
anteriores) son compuestos de gran capacidad esquizonticida
Desde el punto de vista estructural la quinina y cloroquina pueden
considerarse farmacoacuteforos polivalentes ya que a partir de sus estructuras se han
desarrollado muchos de los compuestos que se usan como tratamiento de la
malaria en la actualidad La relacioacuten estructura-actividad de estos farmacoacuteforos
con base de quinolina se puede estudiar en la figura 25 (Konznetsov VV et
alts 2008)
Figura 25 Relacioacuten estructura actividad de la CQ
Antecedentes
52
Viendo la similitud estructural de los compuestos con estas estrucutras y los
aminoalcoholes utilizados en el tratamiento actual se decidioacute ensayar la posible
actividad antiplasmoacutedica de los mismos con buenos resultados en cepas
sensibles a la CQ (Perez-Silanes S et alts 2009)
Figura 26 Estructuras de los arilaminoalcoholes sintetizados como antidepresivos con mejor actividad antimalaacuterica Valores de CI50 en microM La CQ tiene un valor de 008 microM en cepas 3D7 sensibles a la CQ
Surgen asiacute las estructuras a desarrollar en este proyecto enfocado a la siacutentesis
de nuevos derivados de arilamino alcoholes para el tratamiento de la malaria
resistente a la CQ
OBJETIVOS Y
PLAN DE TRABAJO
IIVV OOBBJJEETTIIVVOOSS
Objetivos
57
El presente trabajo tiene como objetivo la buacutesqueda de nuevos derivados para
el tratamiento de la malaria resistente Teniendo en cuenta la estructura de los
aminoalcoholes derivados de la quinina y tomando como referencia la CQ se
propone la siacutentesis de nuevos derivados de arilaminoalcoholes con actividad
antimalaacuterica
El objetivo para llevar a cabo este proyecto estaacute basado en el trabajo detallado
a continuacioacuten
Revisioacuten bibliograacutefica de los faacutermacos con actividad antimalaacuterica
publicada hasta la fecha y planteamiento de un farmacoacuteforo
Disentildeo y siacutentesis de nuevos compuestos derivados de
arilaminoalcoholes con potencial actividad antimalaacuterica
Caracterizacioacuten estructural y evaluacioacuten bioloacutegica y computacional de
cada uno de los nuevos compuestos obtenidos
Estudio de la posible relacioacuten estructura-actividad de los compuestos
sintetizados que permita identificar liacutederes y una optimizacioacuten en el
disentildeo de nuevos derivados
Refinamiento estructural de nuevos compuestos con afinidad mejorada
por las dianas del plasmodio en base a los resultados obtenidos
VV PPLLAANN DDEE TTRRAABBAAJJOO
Plan de Trabajo
61
V1 Disentildeo de nuevos arilaminoalcoholes
Tal y como se ha comentado anteriormente se puede observar en la figura 27
que muchos de los compuestos antimalaacutericos de las diferentes subfamilias
tienen su base de desarrollo en la quinolina De ella surgen los dos compuestos
antimalaacutericos por excelencia
Figura 27 Esquema general del proceso de disentildeo de las moleacuteculas a desarrollar
Teniendo en cuenta todo esto se propone como estructura general de este
proyecto la mostrada en la figura 28
Figura 28 Esquema general de las nuevas estructuras
El proceso de disentildeo estructural de las nuevas moleacuteculas fue el siguiente
1 GRUPO AR1
En muchos de los compuestos antimalaricos mas relevantes como quinina o
cloroquina una constante en la estructura es la presencia del anillo de
quinolina aunque ya en los derivados de la familia de arilaminoalcoholes este
grupo es variable como en la halofantrina donde el grupo quinolina es
Plan de Trabajo
62
sustituido por el grupo fenantreno o el Benflumetol (lumefantrina) que cuenta
con un fluoreno sustituido
De este modo se plantea la posibilidad de la sustitucioacuten de la quinoleiacutena por el
benzo[b]tiofeno (basanda en estudios previos) el naftaleno (bioisoacutemero de la
quinoleiacutena) e incluso se plantea la simplificacioacuten a benceno (por motivos de
reduccioacuten estructurural) Se ha tenido en cuenta tambieacuten que en la familia de las
4-aminoquinolinas asociado a esa quinolina se presenta un grupo
electroatrayente (CF3) Asiacute se propone la introduccioacuten de un aacutetomo de fluacuteor
que es maacutes electronegativo y de menor tamantildeo
2 GRUPO Y
Si bien en la bibliografiacutea el grupo alcohol se considera esencial para la
actividad antimalaacuterica se quiso probar si en nuestros compuestos seguiacutea siendo
grupo esencial en la actividad Se estudioacute la actividad de los carbonilos
precursores de siacutentesis sustituyeacutendolos por un grupo oxima en posicioacuten 1 de la
cadena alifaacutetica en los nuevos derivados
3 CADENA ALIFAacuteTICA (CH2)n
En la familia de las aminoquinolinas y dentro del grupo de
arilaminoalcoholes se observa la presencia de una cadena alifaacutetica como puente
de unioacuten entre el grupo Ar1 y el resto de la moleacutecula De este modo los nuevos
derivados que desarrollar contaraacuten con una variacioacuten de uno a dos carbonos en
la cadena carbonada para determinar la longitud oacuteptima para la actividad
4 AMINA CENTRAL
El grupo amino es constante en todas las familias tomadas como referencia
Del mismo modo las aminoquinolinas tienen como similitud estructural entre
otras un grupo amino unido a la cadena alifaacutetica En este trabajo se plantea el
uso de piperazina homopiperazina (S)-aminopirrolidina aminopiperidina e
tetrahidropiridina para evaluar el efecto del cambio y determinar queacute tipo de
estructuras resulta maacutes conveniente
5 GRUPO AR2
En los compuestos tomados como referencia estructural de partida se observa
la presencia de las cadenas alifaacuteticas en el extremo amino Los nuevos
derivados combinan la amina ciacuteclica con un anillo aromaacutetico sustituido por
grupos electroatrayentes como CF3 (presentes en metanolquinolinas y
Plan de Trabajo
63
arilaminoalcoholes y de efecto positivo deducible para la actividad) el grupo
NO2 o el aacutetomo de F
Figura 29 Disentildeo de nuevas series de derivados de arilaminoalcoholes como nuevos agentes antimalaacutericos
V2 Siacutentesis de los compuestos disentildeados
Una vez disentildeados los compuestos y antes de empezar el trabajo de siacutentesis
se debe dejar claro cuaacutel va a ser el proceso elegido De forma general se puede
definir la siacutentesis de todos los derivados como siacutentesis lineal
La reaccioacuten de Mannnich que se usa para condensar metilcetonas con aminas
y las reacciones de condensacioacuten por sustitucioacuten nucleoacutefila alifaacutetica son
reacciones lineales La posterior reduccioacuten a hidroxilos u oximas se realiza en
un solo paso de reaccioacuten De esta forma nos aseguramos el menor nuacutemero de
pasos de reaccioacuten simplificacioacuten de la siacutentesis disminucioacuten del tiempo
invertido en el mismo y reduccioacuten del coste
V3 Caracterizacioacuten de los compuestos
Todas las reacciones seraacuten seguidas y controladas por cromatografiacutea en capa
fina Una vez obtenidos los compuestos se identificaraacuten por cromatografiacutea en
capa fina espectroscopia infrarroja resonancia magneacutetica nuclear de protoacuten
anaacutelisis elemental y punto de fusioacuten
Plan de Trabajo
64
V4 Evaluacioacuten bioloacutegica ldquoin vitrordquo
Los compuestos finales obtenidos seraacuten enviados a la Universidad de
Antioquiacutea (Medelliacuten Colombia) para la evaluacioacuten in vitro de su actividad
antimalaacuterica Los ensayos de toxicidad de los mismos se realizaraacuten en el
Laboratorio de Farmacologiacutea para el Desarrollo (IRD) de la Universidad Paul
Sabatier en Toulouse (Francia)
V5 Evaluacioacuten bioloacutegica ldquoin vivordquo
Aquellos compuestos que sean seleccionados por sus caracteriacutesticas de
estructura actividad in vitro y toxicidad seraacuten enviados a la Universidad Paul
Sabatier de Toulouse (Francia) para su evaluacioacuten in vivo
V6 Estudios computacionales
Todos los compuestos se someteraacuten a estudios computacionales sobre sus
propiedades fisicoquiacutemicas para obtener datos aproximados de su
comportamiento en solucioacuten (Log P) lipofilia o caraacutecter polar-apolar (presencia
de grupos polares y capacidad de formar enlaces donadores o aceptores) que
aporten datos teoacutericos sobre su absorcioacuten en el organismo A partir de los datos
conformacionales teoacutericos se plantea la unioacuten con una diana Los estudios
computacionales se realizaraacuten en la Unidad de I+D de Medicamentos de la
Universidad de Navarra
MATERIAL Y
MEacuteTODOS
VVII QQUUIacuteIacuteMMIICCAA TTEEOacuteOacuteRRIICCAA
VI1 Esquema general de siacutentesis
Figura 30 Reactivos y condiciones Viacutea 1 Carbonato potaacutesico en tetrahidrofurano a reflujo
Viacutea 2 Dioxolano con aacutecido clorhiacutedrico a reflujo 130-140ordmC
Quiacutemica Teoacuterica
70
VI2 Siacutentesis de precursores
VI21 Siacutentesis de (benzo[b]tiofen-3-il)-3-cloropropan-1-ona
Figura 31 Esquema general de siacutentesis de (benzo[b]tiofen-3-il)-3-cloropropan-1-ona
La siacutentesis de este derivado se lleva a cabo usando tricloruro de aluminio a
temperatura ambiente durante 48 horas (Peacuterez-Silanes S et alts 2001) En vez
de emplear cloroformo como disolvente tal y como describen los autores se
empleoacute diclorometano ya que es menos toacutexico y resulta igualmente efectivo
VI22 Siacutentesis de arilaminas
VI221 Siacutentesis de arilaminas protegidas
Los compuestos sintetizados se ajustan a la estructura general que se muestra
en la figura 32
Figura 32 Estructura general de las arilaminas intermedias sintetizadas
Las arilaminas sintetizadas tienen un extremo amino protegido con un grupo
tert-butiloxicarbonilo (BOC) voluminoso que evita que estas diaminas
reaccionen por ambos extremos con el fluoruro de arilo
Figura 33 Esquema general para la siacutentesis de arilaminas
Este tipo de reacciones raramente transcurren por un mecanismo de
sustitucioacuten nucleofiacutelica aromaacutetica (SNA) Normalmente la SNA dan bajos
rendimientos debido a que el enlace C (sp2)-X es maacutes corto y fuerte que el de un
carbono con hibridacioacuten sp3 La SN2 estaacute impedida por dificultades esteacutericas del
anillo para que se aproxime el nucleoacutefilo y la SN1 estaacute impedida por la
inestabilidad del catioacuten fenilo intermedio
Tras revisar la bibliografiacutea se propone que este tipo de SNA transcurren
seguacuten un mecanismo llamado Sustitucioacuten nucleofiacutelica aromaacutetica viacutea complejos
Quiacutemica teoacuterica
71
de meisenheimer (Figura 34) consistente en una adicioacuten-eliminacioacuten (Bruckner
et alts 2002)
En la primera fase la adicioacuten el nucleoacutefilo ataca al compuesto aromaacutetico en la
que es la etapa lenta de la reaccioacuten Se produce un carbanioacuten que es llamado
Complejo de Meisenheimer La carga negativa queda deslocalizada sobre los
cinco carbonos aromaacuteticos con hibridacioacuten sp2 del anillo pero no lo hace
uniformemente sino que se distribuye tal y como se indica en la figura 34
Figura 34 Primera Etapa Etapa lenta del mecanismo de reaccioacuten de sustitucioacuten nucleofiacutelica viacutea complejos de
Meisenheimer
El aacutetomo unido al nucleoacutefilo tiene hibridacioacuten sp3 ya que tambieacuten se
encuentra unido al sustituyente X que se elimina en una segunda etapa la fase
raacutepida de la reaccioacuten (Figura 35)
Figura 35 Segunda Etapa Etapa raacutepida del mecanismo de reaccioacuten de sustitucioacuten nucleofiacutelica viacutea complejos de
Meisenheimer
Independientemente del haloacutegeno X y del sustituyente R empleados en la
posicioacuten para respecto del aacutetomo de carbono al que ataca el nucleoacutefilo aparece
una carga parcial de -030 del mismo modo en las posiciones orto esta carga
parcial es de -025 y en la posiciones meta la carga es de -010 Como
consecuencia de esto uno de los requisitos maacutes importantes para que se de la
reaccioacuten es que alguacuten grupo electroatrayente estabilice el complejo La mayor
densidad de carga negativa se encuentra en para por lo que los grupos
electroatrayentes en esta posicioacuten estabilizan mucho el compuesto formado Por
esta razoacuten se han empleado grupos nitro o fluacuteor en dicha posicioacuten
El empleo de fluoruros de arilo para la formacioacuten de los intermedios de
aminas protegidas tambieacuten se explica por esta razoacuten El fluacuteor tiene un fuerte
efecto inductivo lo que estabiliza el complejo formado
Quiacutemica Teoacuterica
72
Tras una revisioacuten bibliograacutefica se observoacute que esta reaccioacuten esta favorecida
llevaacutendose a cabo en un medio de acetonitrilo (CH3CN) a reflujo en lugar del
dimetilsulfoacutexido (DMSO) anteriormente descrito usando carbonato potaacutesico
(K2CO3) (Blizzard et alts 2005) lo que facilita el trabajo por el bajo punto de
ebullicioacuten del medio y simplificando la extraccioacuten de los compuestos en este
medio
VI222 Desproteccioacuten de aminas
Las arilaminas sintetizadas tienen un extremo amino protegido con un grupo
BOC asiacute una vez formados los intermedios protegidos el paso siguiente para
continuar con la siacutentesis de los compuestos deseados consiste en eliminar este
grupo protector
Figura 36 Generacioacuten del carbocatioacuten t-butilo y del aacutecido carbaacutemico
La reaccioacuten de las aminas protegidas con aacutecidos acuosos como aacutecido
clorhiacutedrico y aacutecido aceacutetico (HCl y HAc) en condiciones de temperatura
ambiente rinde la consiguiente amina desprotegida en forma de hidrocloruro
Para esta reaccioacuten la amina protegida se disuelve en una disolucioacuten (11) de
HClHAc a temperatura ambiente generaacutendose un aacutecido carbaacutemico (Figura 36)
que es inestable y se descarboxila in situ (Figura 37) dando lugar a la amina
desprotegida en forma de hidrocloruro debido la presencia de HCl en el medio
Figura 37 Descarboxilacioacuten espontaacutenea del aacutecido carbaacutemico
Los hidrocloruros son compuestos poco solubles en muchos de los
disolventes orgaacutenicos y en ocasiones impiden los siguientes pasos de siacutentesis
Asiacute los intermedios se convierten a su forma de base libre por medio de su
disolucioacuten en agua y posterior adicioacuten de una disolucioacuten de hidroacutexido soacutedico
Quiacutemica teoacuterica
73
(NaOH) 2M de forma gradual hasta pH baacutesico para asegurar una completa
eliminacioacuten de HCl de la moleacutecula La disolucioacuten baacutesica se deja en agitacioacuten
durante dos horas aproximadamente Normalmente se observa como al antildeadir
la base se obtiene un precipitado debido a la insolubilidad de la amina en forma
de base libre en el medio acuoso mientras que en forma de hidrocloruro
resultaba soluble
Como uacuteltimo paso de reaccioacuten se procede a la extraccioacuten de la amina con un
disolvente orgaacutenico que suele ser diclorometano En general las aminas
precipitan faacutecilmente en hexano friacuteo como soacutelido Si fuese necesario purificar el
aceite impuro se realiza una cromatografiacutea en columna no flash con
diclorometano basificado con unas gotas de amoniacuteaco
VI3 Siacutentesis de derivados carboniacutelicos (Serie 0)
VI31 Condensacioacuten de 1-(benzo[b]tiofen-3-il)-3-cloropropan-1-ona y
de 2-bromo-2acute-acetonaftona con la amina (Viacutea 1)
En este caso los productos finales se obtienen a traveacutes de una reaccioacuten de
sustitucioacuten nucleofiacutelica alifaacutetica (Figura 38) a partir del 1-(benzo[b]tiofen-3-il)-3-
cloropropan-1-ona o del 2-bromo-2acute-acetonaftona y la correspondiente amina
Al tratarse de un cloruro de alquilo primario el mecanismo maacutes probable de
reaccioacuten es el de una sustitucioacuten nucleofiacutelica de segundo orden (SN2)
Figura 38 Esquema de siacutentesis de cetonas
La mayoriacutea de las veces los reactivos de partida no se llegan a consumir
completamente y se obtienen productos secundarios que no se eliminan con
facilidad Ha sido especialmente costosa la purificacioacuten de algunos compuestos
los que han requerido la purificacioacuten por medio dos columnas cromatograacuteficas
tradicionales consdecutivas columna tradicional seguida de una preparativa o
purificarlos dos veces consecutivas en el equipo de cromatografiacutea flash Todos
estos intentos de purificacioacuten ldquoparcialrdquo hacen disminuiacuter notablemente el
rendimiento de la reaccioacuten Otras veces los compuestos se precipitan como
hidrocloruro consiguiendo al mismo tiempo ser purificados
Quiacutemica Teoacuterica
74
VI32 Reaccioacuten de Mannich Condensacioacuten de metilcetonas con aminas
en medio aacutecido (Viacutea 2)
La reaccioacuten de Mannich consiste en la condensacioacuten de un compuesto que
posea aacutetomos de hidroacutegeno activos (sustrato) con formaldehiacutedo y una amina
para formar una moleacutecula conocida como ldquoBase de Mannichrdquo
En la mayor parte de las reacciones se usoacute el 13-dioxolano que es una amina
secundaria como compuesto generador de formaldehido El sustrato son
arilmetilcetonas donde el anillo aromaacutetico es fluorobenzo[b]tiofeno naftaleno
4-fluoronaftaleno o bencenos para-sustituidos El 13-dioxolano es ademaacutes el
disolvente y como catalizador el aacutecido clorhiacutedrico aporta al medio los protones
necesarios para la reaccioacuten
Las arilmetilcetonas utilizadas presentan hidroacutegenos aacutecidos en posiciones α
con respecto al grupo carboniacutelico (Figura 40) En medio aacutecido la acidez de estos
se debe a la estabilizacioacuten de la base conjugada (forma enoacutelica) por resonancia
La presencia del anillo en α con respecto al carbonilo provoca una situacioacuten de
deslocalizacioacuten electroacutenica π del sistema en su forma enoacutelica que se ve
favorecida por los sustituyentes electroatrayentes unidos al anillo La
reactividad aumenta debido a la retirada de carga del sistema π por estos
sustituyenes que acidifican asiacute los hidrogenos α
El mecanismo de reaccioacuten propuesto transcurre en dos etapas
En una primera etapa la amina reacciona con el formaldehiacutedo generando el
catioacuten iminio El 13 dioxolano es un acetal que en medio aacutecido genera
formaldehiacutedo ldquoin siturdquo para producirse entonces una adicioacuten nucleoacutefila de
la amina al carbonilo del compuesto no enolizable como es el recieacuten
generado formaldehiacutedo (Figura 39) (Tramontini et alts 1973)
Figura 39 Primera etapa del mecanismo de reaccioacuten propuesto para la formacioacuten de la base de Mannich
En la segunda etapa de reaccioacuten la metilcetona en medio aacutecido se protona
dando lugar a un equilibrio ceto-enoacutelico desplazado hacia la forma enoacutelica
(Figura 40)
Quiacutemica teoacuterica
75
Figura 40 Equilibrio ceto-enoacutelico en medio aacutecido
El ion iminio formado en la primera etapa es un buen electroacutefilo que
reacciona con la forma enolica nucleoacutefila obtenieacutendose como resultado la sal del
compuesto final (Figura 41) Asiacute el uacuteltimo paso de reaccioacuten es la basificacioacuten del
medio con una disolucioacuten acuosa de NaOH para la obtencioacuten de la sal
inorgaacutenica y compuesto orgaacutenico libre
Figura 41 Segunda etapa del mecanismo de reaccioacuten de Mannich
Se ha determinado experimentalmente que en la obtencioacuten de la base se
produce la misma reaccioacuten usando como generador de formaldehido el
paraformaldehido Para ella ha de usarse como medio de reaccioacuten un medio
proacutetico como el alcohol etiacutelico y HCl Despueacutes de varios experimentos y
optimizacioacuten de la temperatura necesaria para la reaccioacuten se comproboacute que la
viacutea oacuteptima por rapidez y rendimiento era la del 13 dioxolano
VI4 Siacutentesis de derivados hidroxiacutelicos (Series 1-7)
Los derivados hidroxiacutelicos se sintetizan a traveacutes de la reduccioacuten de las
correspondientes intermedios carboniacutelicos con borohidruro soacutedico (BH4Na) en
metanol a 0ordmC
Figura 42 Esquema general para la siacutentesis de alcoholes desde cetonas
En todas las reducciones que se han realizado se utiliza como agente
reductor el BH4Na que es probablemente el agente reductor maacutes usado en este
tipo de siacutentesis Se trata de un hidruro de reactividad media que presenta alta
quimioselectividad y un manejo sencillo en comparacioacuten con otros hidruros
El disolvente empleado es metanol con el que se logra una buena solubilidad
del BH4Na La temperatura de reaccioacuten se ha de mantener en torno a 0ordmC por
Quiacutemica Teoacuterica
76
tres motivos primero para evitar que la reaccioacuten se deacute demasiado raacutepida lo que
conlleva la aparicioacuten de productos secundarios en segundo lugar para evitar
que sea demasiado lenta lo que favorece la reaccioacuten secundaria entre el
borohidruro y el metanol El tercer motivo es impedir que tenga lugar la
reaccioacuten inversa a la reaccioacuten de Mannich
En general la reaccioacuten entre el BH4Na y el compuesto se da por completo
durante la primera hora de reaccioacuten antes de que tenga lugar la reaccioacuten
inversa de descomposicioacuten del compuesto cetoacutenico El mecanismo de reaccioacuten
no se ha descrito de forma totalmente definitiva aunque siacute que parece seguro el
hecho de que la estequiometriacutea de la reaccioacuten es de cuatro moleacuteculas de cetona
por una de BH4Na
La reaccioacuten transcurre siguiendo una transferencia secuencial de hidruros
desde la moleacutecula de BH4Na hasta cada una de las cuatro cetonas a traveacutes de
sendos ataques nucleofiacutelicos a los carbonos carboniacutelicos que tras estas
transferencias forman la sal soacutedica del tetraborato Este complejo sufre con
posterioridad una hidroacutelisis dando lugar finalmente a la formacioacuten del alcohol
(Figura 43)
Figura 43 Mecanismo de reaccioacuten propuesto para la siacutentesis de los alcoholes
Quiacutemica teoacuterica
77
El disolvente utilizado es el metanol que al ser un disolvente proacutetico cumple
la misioacuten de reducir la energiacutea de activacioacuten que es demasiado grande para que
la reaccioacuten se produzca de forma espontaacutenea a pesar de que el proceso neto es
exoteacutermico Esta cataacutelisis de la reaccioacuten se debe a la estabilizacioacuten que el
disolvente aporta al estado de transicioacuten ademaacutes de estabilizar el borano y el
anioacuten alcoacutexido cuando eacutestos no se hayan unido
Todos los derivados hidroxiacutelicos se han purificado por cromatografiacutea en capa
fina cromatografiacutea de columna cromatografiacutea preparativa o cromatografiacutea
flash Algunos se han precipitado en forma de hidrocloruro mediante la
adicioacuten de eacuteter saturado de aacutecido clorhiacutedrico
Estereoquiacutemica de la reaccioacuten
Las cetonas asimeacutetricas empleadas en estas reacciones son productos
proquirales por lo que dan lugar a las dos configuraciones posibles del
derivado hidroxiacutelico R y S La reaccioacuten rinde una mezcla raceacutemica ya que el
borohidruro soacutedico no es agente estereoselectivo y el grupo carbonilo es plano
con lo que el ion hidruro puede atacar por ambos lados del grupo con igual
probabilidad Ademaacutes estas moleacuteculas no poseen grupos voluminosos que
favorezcan la aparicioacuten de un mayor porcentaje de uno de los enantioacutemeros
Dado que es muy costoso el aislamiento de los isoacutemeros por separado se
replanteariacutea este trabajo en caso de encontrar una moleacutecula especialmente
activa
Reacciones secundarias
Una de las reacciones secundarias maacutes frecuentes es la rotura de la base de
Mannich formada a traveacutes de una desaminacioacuten o de una desaminometilacioacuten
que recibe el nombre de ldquoretro-Mannichrdquo (Tramontini y Angiolono 1990) La
reaccioacuten tiene como productos los reactivos de partida de la condensacioacuten
carboniacutelica
Todaviacutea no queda claro el porqueacute de estas reacciones pero podriacutea deberse a
un aumento de la temperatura del medio provocada por una adicioacuten
demasiado raacutepida de BH4Na o por una excesiva basificacioacuten del medio
ocasionada por un exceso del agente reductor
Quiacutemica Teoacuterica
78
VI5 Siacutentesis de oximas (Serie 8)
La siacutentesis de estos derivados se abordoacute a partir de los derivados carboniacutelicos
mediante una condensacioacuten de estos con hidroxilamina usando etanol (EtOH)
como disolvente (Figura 44)
Figura 44 Esquema general de reduccioacuten de carbonilo a oxima
El mecanismo de la reaccioacuten transcurre en dos etapas a traveacutes de un
intermedio cuya existencia ha sido verificada mediante el uso de teacutecnicas de
espectroscopia de IR (Martinez J 1999)
La primera etapa consiste en la formacioacuten del intermedio de reaccioacuten para lo
cual es necesaria la presencia de hidroxilamina en su forma libre (la forma
protonada no posee caraacutecter nucleofiacutelico) por lo que esta etapa de la reaccioacuten se
veraacute favorecida a pH baacutesico
Figura 45 Mecanismo de reaccioacuten propuesto para la formacioacuten del intermedio de reaccioacuten en la formacioacuten de oximas
La segunda etapa consiste en la deshidratacioacuten del intermedio que estaraacute
favorecida por un pH aacutecido La velocidad de la reaccioacuten dependeraacute del pH de la
misma y asiacute mientras que en un pH baacutesico la adicioacuten de hidroxilamina es un
proceso raacutepido y es la segunda etapa la que controla la velocidad de reaccioacuten lo
contrario ocurre a pH aacutecido siendo entonces la primera etapa la que controla la
velocidad de reaccioacuten
Figura 46 Mecanismo propuesto para la formacioacuten de la oxima por deshidratacioacuten del intermedio de reaccioacuten en media aacutecido
Quiacutemica teoacuterica
79
Estereoquiacutemica de la reaccioacuten
La formacioacuten de oximas puede producir dos isoacutemeros posibles el Z o cis y el
E o trans
Figura 47 Isomeriacutea cis-trans de los derivados oxima31
Se observoacute que seguacuten el derivado carboxiacutelico del que se partiacutea se obteniacutea
mayoritariamente un isoacutemero u otro pero aunque no se ha encontrado
explicacioacuten a esta selectividad
31 El estudio espectroscoacutepico de ambos isoacutemeros se encuentra desarrollado en la tesis del Dr J Martinez Esparza (1999)
VVIIII QQUUIacuteIacuteMMIICCAA EEXXPPEERRIIMMEENNTTAALL
Quiacutemica experimental
83
VII1 Instrumental y reactivos
Los reactivos quiacutemicos utilizados en siacutentesis fueron adquiridos en E Merck
(Darmstadt Alemania) Scharlau (FEROSA Barcelona Espantildea) Panreac
Quiacutemica SA (Montcada i Reixac Barcelona Espantildea) Sigma-Aldrich Quiacutemica
SA (Alcobendas Madrid) Acros Organics (Janssen Pharmaceuticalaan 3a
2440 Geel Beacutelgica) Maybridge (Cornwall Reino Unido) Lancaster (Bischheim-
Strasbourg Francia) y Prolabo (Leuven Belgica)
Las cromatografiacuteas de capa Fina se desarrollan sobre gel de siacutelice de 02 mm de
espesor (Alugram SIL GUV254 [ref 818133] Macherey-Nagel Alemania) Las
placas se desarrollan en diclorometanometanol en diferentes proporciones y
se revelan bajo una laacutempara ultravioleta a longitud de onda 254 y 365 nm
La cromatografiacutea en columna se desarrolla en columnas de vidrio
empaquetadas con siacutelica gel 60 (0040-0063 mm y 0063-0200 mm de tamantildeo
de partiacutecula Merck) con fases moacuteviles diclorometanometanol o
hexanoacetato en diferentes proporciones
La cromatografiacutea preparativa se desarrolla en placas de vidrio rectangulares
sobre las cuales se preparan laacuteminas de siacutelica gel (Siacutelica Gel 60 PF254
cromatografiacutea en capa fina (ref 1077472500) Merck KGaA Darmstadt
Alemania) de 1 mm de grosor La fase moacutevil utilizada en esta metodologiacutea es
diclorometanometanol 973
La cromatografiacutea flash se realiza en un equipo de cromatografiacutea Combiflashreg
Rf 200 (Teledyne Isco Lincoln USA) Se desarrolla en columnas flash de fase
normal de 12 gramos RediSepreg Rf Columns (Teledyne Isco USA) con un
gradiente binario hasta 991 diclorometanometanol (pureza de siacutentesis SDS-
Carlo Erba Reactifs Francia)
Formacioacuten de hidrocloruro algunos de los compuestos fueron purificados o
precipitados en forma de sales Para ellos se utilizoacute eacuteter saturado de HCl
preparado en el laboratorio
VII2 Meacutetodos de elucidacioacuten estructural
Todos los compuestos sintetizados han sido caracterizados quiacutemicamente por
cromatografiacutea en capa fina (CCF) punto de fusioacuten espectroscopia infrarroja
(IR) resonancia magneacutetica nuclear (RMN) anaacutelisis elemental de carbono
Ensayos Bioloacutegicos
84
hidroacutegeno y nitroacutegeno (CHN) y cromatografiacutea liacutequida de alta resolucioacuten
(HPLC)
Los puntos de fusioacuten han sido determinados en un equipo Mettler FP82 +
FP80 (Greifense Suiza) y no han sido corregidos La temperatura de fusioacuten se
muestra en grados centiacutegrados (0C)
Los espectros de IR han sido registrados en un equipo Thermo Nicolet FTIR
Nexus Euro (Madison USA) con el programa informaacutetico OMNIC 60
empleando pastillas de bromuro potaacutesico Las frecuencias se expresan en cm-1 y
las intensidades de sentildeal se representan como md (media deacutebil) d (deacutebil) m
(media) f (fuerte) y mf (muy fuerte)
Los espectros de RMN-1H han sido registrados en un equipo Brucker 400
UltrasieldTM (Brucker BioSpin GmbH Rheinstelten Alemania) utilizando como
referencia interna tetrametilsilano en una concentracioacuten aproximada de 01
gmL de TMS y dimetilsulfoacutexido-d6 (DMSO-d6) o cloroformo deuterado
(CDCl3) como disolventes La concentracioacuten de las muestras ha sido
aproximadamente 20 mgmL Para la deteccioacuten de los protones laacutebiles se
emplean unas gotas de agua deuterada Los desplazamientos quiacutemicos (δ) han
sido expresadas en ppm relativas a tetrametilsilano y las multiplicidades de
sentildeal se han representado como se indican en las siguientes abreviaturas sa
(sentildeal ancha) s (singlete) d (doblete) t (triplete) c (cuadruplete) m
(multiplete) dd (doble doblete) y ddd (doble doblete desdoblado) Las
constantes de acoplamiento J han sido expresadas en Hz Los experimentos
HMBC (espectros en 2D para determinar los acoplamientos de protones a larga
distancia) HMQC (espectros en 2D para observar los acoplamientos C-H en la
moleacutecula) DEPT-135 (espectros en 1D donde los CH y CH3 salen positivos y
los CH2 negativos) DEPT-90 (espectros en 1D donde solo aparecen los grupos
CH) RMN-13C y COSY (espectro 2D para determinar los acoplamientos de los
protones con los protones vecinos) se han registrado en el mismo equipo
empleado para la resonancia de protoacuten utilizando los mismos disolventes
deuterados
Los CHN han sido obtenidos en un microanalizador LECO CHN-900(Tres
cantos Espantildea) a partir de muestras previamente secadas con pentoacutexido de
foacutesforo durante 24-48 horas a vaciacuteo (3-4 mm Hg) y temperatura ambienteEl
intervalo de error admitido para cada producto es de plusmn04 para cada tipo de
aacutetomo determinado
Quiacutemica experimental
85
Los tiempos de retencioacuten y longitudes maacuteximas de absorcioacuten para la
determinacioacuten de pureza y caracterizacioacuten han sido obtenidos en un equipo de
HPLC Los experimentos fueron realizados en un cromatoacutegrafo Ultimate 3000
(DIONEX) controlado por el software Cromeleon versioacuten 68 Las medidas se
obtuvieron con una columna RP18 (LICHROSPHER 100 RP18 EC 5 microm
10x046 TEKNOKROMA) como fase estacionaria y un flujo de 1 mL minuto
con metanolagua (8020) como fase moacutevil Los tiempos de retencioacuten (tR) se
expresan en minutos y las longitudes de onda maacuteximas en nm
VII3 Denominaciones de compuestos
El criterio elegido para la asignacioacuten de las referencias ha sido el siguiente En
primer lugar se dividen los compuestos obtenidos en carbonilos hidroxilos y
oximas Los derivados carboniacutelicos son considerados como intermedios en la
reaccioacuten global asiacute que se les asigna el nombre de Serie 0 Los compuestos
hidroxiacutelicos son los que corresponden estructuralmente con los
arilaminoalcoholes antimalaacutericos objeto central de este trabajo que se divide en
subgrupos En el caso de las oximas se ha denominado al grupo de compuestos
como Serie 8
La primera divisioacuten se realiza seguacuten la naturaleza del Ar1 y de la longitud de la
cadena alifaacutetica
Figura 48 Estructura general de los derivados hidroxiacutelicos sintetizados
Serie 1 2 3 4 5 6 7
Ar1
n 2 2 2 1 2 2 2
Tabla 1 Distribucioacuten de compuestos en series por Ar1
Ademaacutes de la serie numeacuterica una letra diferenciaraacute cada compuesto seguacuten la
amina y los sustituyentes Ra y Rb del benceno de Ar2 que conforman cada
derivado De esta forma
Ensayos Bioloacutegicos
86
a b c d e f g
Amina
RaRb CF3N
O2 NO2CF3 HCF3 CF3NO2 CF3NO2 CF3NO2 HF
Tabla 2 Denominacioacuten de compuestos
Siguiendo este orden alfabeacutetico los derivados que forman la Serie 0 son
numerados seguacuten el mismo criterio
Ejemplo un compuesto hidroxiacutelico que presenta un aacutetomo de fluacuteor en Ar1
unido a un grupo naftaleno con una piperidina central y grupo fenil con Ra
trifluorometil y Rb nitro se denomina como compuesto 5f
Referencia Serie 5f
Ar1= FNFT
(CH2) n n=2
Amina= PIPR
Ar2 Ra=CF3 ndash Rb= NO2
VII4 Descripcioacuten general de meacutetodos de siacutentesis
VII41 Meacutetodo A procedimiento general para la obtencioacuten de las
arilaminas protegidas
En 30 mL de acetonitrilo (CH3CN) se disuelven 1 equivalente de la amina
comercial protegida y 12 equivalentes del halogenuro de arilo correspondiente
seguacuten la arilamina que se desee sintetizar en cada caso Se antildeaden tambieacuten 15
equivalentes de carbonato potaacutesico (K2CO3) para neutralizar el medio de
reaccioacuten Se hace reaccionar a reflujo un maacuteximo de 24 horas tras lo cual se
elimina el CH3CN en el rotavapor El residuo obtenido se disuelve en
diclorometano y se extrae tres veces con agua La fase orgaacutenica obtenida se seca
con sulfato soacutedico anhidro se filtra y se elimina el disolvente a sequedad en el
rotavapor obtenieacutendose la correspondiente BOC-arilamina
Quiacutemica experimental
87
VII42 Meacutetodo B procedimiento general para la desproteccioacuten de
aminas
Se disuelve la amina protegida en 40 mL de disolucioacuten HClAcH (11)
observaacutendose ligera efervescencia por el desprendimiento de H2 Se deja
agitando 2 horas a temperatura ambiente Transcurrido el tiempo se elimina el
disolvente en el rotavapor El clorhidrato obtenido se disuelve en agua y se
antildeade NaOH 2M hasta conseguir pH baacutesico Se agita 2 horas y la mezcla de
reaccioacuten se extrae con DCM La fase orgaacutenica se seca con sulfato soacutedico anhidro
se filtra y se elimina el disolvente a sequedad en el rotavapor obtenieacutendose la
correspondiente arilamina desprotegida
VII43 Meacutetodo C procedimiento general para condensacioacuten de aminas
(Viacutea 1)
Se disuelven en 40 mL de tetrahidrofurano (THF) las cantidades indicadas en
cada caso de 1-(benzo[b]tiofen-3-il)-3-cloropropan-1-ona o 2-bromo-2acute-
acetonaftona y la amina deseada en proporciones 11 Se antildeade la cantidad
equimolecular de carbonato potaacutesico Se deja agitando un maacuteximo de 24 horas a
temperatura ambiente y en el transcurso de ese tiempo se sigue el desarrollo de
la reaccioacuten por CCF Se elimina el THF en el rotavapor a presioacuten reducida y el
residuo obtenido se disuelve en diclorometano para lavarlo tres veces con agua
La fase orgaacutenica se seca con sulfato soacutedico se filtra y se elimina el disolvente en
el rotavapor El residuo obtenido se purifica por el meacutetodo descrito en cada
caso
Esta viacutea se siacutentesis se aplica a la obtencioacuten de los derivados de la Serie 0 1 2
3 14 y 15 que son los intermedios para la obtencioacuten las Series 1 y 4
VII44 Meacutetodo D procedimiento de condensacioacuten de aminas (Viacutea 2)
En un matraz se ponen las cantidades indicadas de 1-(5-fluorobenzo[b]tiofen-
3-il)etanona 2-acetonaftona 4-fluoro-1acute-acetonaftona 4-fluoroacetofenona o 4-
(trifluorometil)acetofenona y la amina deseada en proporciones
equimoleculares Se antildeade 13 dioxolano en una proporcioacuten 14 molar y se
antildeaden varias gotas HCl concentrado Se lleva a reflujo a una temperatura de
bantildeo de 130-140 ordmC siguiendo la reaccioacuten por CCF Finalizada la reaccioacuten se
enfriacutea a temperatura ambiente y se antildeade agua y NaOH 2M hasta pH baacutesico en
agitacioacuten El compuesto se extrae con diclorometano y se seca la fase orgaacutenica
con sulfato soacutedico anhidro Se filtra y elimina el disolvente en el rotavapor a
Ensayos Bioloacutegicos
88
sequedad El residuo obtenido puede precipitar puro o necesitar posterior
purificacioacuten por los meacutetodos descritos en cada caso
Esta viacutea de siacutentesis se aplica para la obtencioacuten de la mayor parte de los
compuestos de la Serie 0 intermedios para la obtencioacuten de las Series 2 35 6 7
y 8
VII45 Meacutetodo E procedimiento general para la reduccioacuten de cetonas
En un bantildeo de hielo a 0 ordmC se pone un matraz con 10 mL de metanol a
enfriar Una vez friacuteo se antildeade el compuesto carboniacutelico al matraz y se deja en
agitacioacuten Se le antildeade a la disolucioacuten enfriada aproximadamente 200 mg de
BH4Na observaacutendose efervescencia Se deja en agitacioacuten un maacuteximo de una
hora manteniendo la temperatura del bantildeo siguiendo la evolucioacuten por CCF
Transcurrido el tiempo se antildeaden 5 mL de agua que inactivan el BH4Na y se
elimina a vaciacuteo el disolvente Se extrae con DCM y la fase orgaacutenica se seca con
sulfato soacutedico anhidro Se filtra y se elimina el disolvente a vaciacuteo El residuo
puede precipitar puro o necesitar purificacioacuten por cromatografiacutea en columna
flash o mediante formacioacuten del correspondiente hidrocloruro
Se obtienen por este meacutetodo los compuestos de las Series 1 a 7
VII46 Meacutetodo F procedimiento general para siacutentesis de oximas desde
carbonilos
En un matraz se pone la cantidad de carbonilo obtenido deseada y se antildeade
el clorhidrato de hidroxilamina en proporcioacuten 1 55 molar respectivamente Por
uacuteltimo se antildeaden 15 mL de EtOH y se lleva a reflujo durante 90 minutos
Pasado el tiempo se retira el reflujo y se deja enfriar unos minutos A
continuacioacuten se antildeaden 30 mL de una disolucioacuten previamente preparada de
NaOH 2M en EtOH hasta que el pH es baacutesico y se lleva media hora maacutes a
reflujo Se deja enfriar la reaccioacuten se antildeade un poco de agua al matraz y se hace
una extraccioacuten acetato de etiloagua Se seca y se elimina el disolvente en el
rotavapor obteniendo un soacutelido impuro que se purifica solubilizando las
impurezas en diclorometano puesto que la oxima no es soluble en ese
disolvente El soacutelido que se obtiene se lava con eacuteter etiacutelico para su purificacioacuten
Se obtienen por este meacutetodo los compuestos de la Serie 8
Quiacutemica experimental
89
VII5 Purificacioacuten por cromatografiacutea flash
La cromatografiacutea manual en columna de vidrio tradicional ha sido uno de los
meacutetodos de purificacioacuten maacutes usados en quiacutemica orgaacutenica por ser un meacutetodo
praacutectico de bajo coste y controlado por el operario Por otro lado lleva asociado
algunos inconvenientes como la baja resolucioacuten y reproducibilidad teacutecnica
costosa en tiempo opciones de tipo de elucioacuten limitadas baja utilidad en
separacioacuten de muestras complejas y baja estandarizacioacuten del sistema por la falta
de automatizacioacuten La evolucioacuten para mejorar todos estos puntos deacutebiles pasa
por la automatizacioacuten del sistema que va desde la inyeccioacuten de la muestra hasta
la coleccioacuten automaacutetica que permite la realizacioacuten de otros trabajos durante la
separacioacuten de los compuestos Ademaacutes aumenta la reproducibilidad y la
productividad Seguacuten la muestra que purificar y sus caracteriacutesticas
fisicoquiacutemicas se ha de seleccionar las condiciones de trabajo del equipo de
cromatografiacutea flash
Fase estacionaria Existen disponibles comercialmente una gran variabilidad
de columnas con distintas fases estacionarias La maacutes usual que es tambieacuten la
empleada en este trabajo es la columna de siacutelica de fase normal Pero tambieacuten
se dispone de columnas C18 fase reversa columnas de aminas aluacutemina baacutesica
aluacutemina neutra ciano diol de intercambio anioacutenico y de intercambio catioacutenico
Las columnas de siacutelica de fase normal estaacuten formadas por un poliacutemero de oacutexido
de silicio entrecruzado tetraeacutedricamente En medio acuoso las valencias libres
de los aacutetomos de silicio adsorben grupos hidroxilos formando grupos silanol
polares en la superficie
Claacutesicamente para cada gramo de compuesto que va a ser purificado se pone
100 g de siacutelica gel (1 de carga) pero en el nuevo sistema las columnas estaacuten
preparadas para el 10 de carga En este trabajo se ha usado columnas de siacutelica
de 12 g de tamantildeo (tamantildeo de partiacutecula 35-70 microm y tamantildeo de poro 60 Aring con
una capacidad de muestra de 12 a 1200 mg con flujo oacuteptimo 25-40 mLmin y
volumen 168 mL
Fase moacutevil Al igual que la fase estacionaria la eleccioacuten de la fase moacutevil
depende de la muestra a purificar Existen diferentes gradientes de elucioacuten
siendo el gradiente binario el maacutes utilizado en la separacioacuten de compuestos
Controlando el gradiente se pueden obtener tiempos de elucioacuten menores
menor dependencia de los factores oacuteptimos de separacioacuten y mayor eficacia
repetitividad y pureza El gradiente elegido en este caso para la purificacioacuten de
compuestos es el isocraacutetico lineal donde se alternan periodos donde las
Ensayos Bioloacutegicos
90
proporciones de mezcla de solventes permanecen constantes en el tiempo con
otros periodos donde aumenta la proporcioacuten del solvente maacutes polar
Para la eleccioacuten del solvente adecuado se realiza un estudio previo del
desarrollo de los componentes en CCF ya que esto da una aproximacioacuten del
comportamiento de los componentes de la muestra en la columna durante la
purificacioacuten Se ha seleccionado la mezcla DCMmetanol en todos los casos de
purificacioacuten de compuestos por la buena separacioacuten de componentes que ha
mostrado No es posible la utilizacioacuten de metanol al 100 ya que se podriacutean
producir dantildeos en las columnas de fases estacionarias Ademaacutes la estabilidad
de las bombas tambieacuten podriacutea verse afectada por tanto ha de utilizarse como
fase moacutevil polar una mezcla DCMmetanol 8020
Longitud de onda de deteccioacuten La longitud de onda de deteccioacuten oacuteptima ha
de ser elegida seguacuten la estructura quiacutemica de la muestra En el caso de
arilaminoalcoholes se ha seleccionado como longitud de onda de deteccioacuten 254
nm que es la oacuteptima para aromaacuteticos En el caso de los derivados de las Series
3 4 y 5 (naftalenos) como el equipo ofrece la posibilidad de detectar dos
longitudes de onda se seleccionoacute la deteccioacuten a 365 nm como complementaria
Teacutecnicas de carga de muestra Las muestras son cargadas en el sistema en
estado soacutelido o en disolucioacuten dependiendo de la solubilidad que presenten a la
fase menos polar con la que se inicia la purificacioacuten En el caso de muestras
solubles al diclorometano se realiza una disolucioacuten con la miacutenima cantidad de
solvente posible y se inyectan en el equipo Si la muestra no es soluble al
diclorometano se realiza una disolucioacuten soacutelida en siacutelica gel 60 (0040-0063 nm
de tamantildeo de poro) Para ello se disuelve la muestra en un solvente adecuado y
se antildeade siacutelica Se elimina el disolvente a sequedad a vaciacuteo y se pone la muestra
en un cartucho vaciacuteo especial para este tipo de muestras desde donde el equipo
inyectaraacute automaacuteticamente la muestra
VVIIIIII EENNSSAAYYOOSS BBIIOOLLOacuteOacuteGGIICCOOSS
Ensayos bioloacutegicos
93
VIII1 Ensayos in vitro
Los compuestos descritos han sido ensayados por el Grupo Malaria de la
Universidad de Antioquiacutea en Medelliacuten (Colombia)
Los ensayos in vitro han sido realizaron en cepas sensibles a la CQ NF-54 y
Colombian FCR-3 de Plasmodium falciparum resistentes a la CQ Los cultivos se
desarrollaron a 37ordmC en una atmoacutesfera de CO2 al 5 y en un medio de glucosa
enriquecida RPMI 1640 con gentamicina a una concentracioacuten de 01 mgmL y
suero humano al 10 inactivado por calor como se describe en la bibliografiacutea
(Trager y Jensen 1976) Los compuestos se disuelven en dimetilsulfoacutexido
(DMSO) hasta completar un rango de concentraciones entre 200 y 01 microM La
concentracioacuten final de DMSO nunca es superior al 01
La actividad antimalaacuterica in vitro se mide utilizando el ensayo de
incorporacioacuten de hipoxantina tritiada (MP Biomedicals USA) seguacuten el meacutetodo
de Desjardins (Desjardins et alts 1979) El meacutetodo consiste en una medicioacuten
indirecta de la actividad metaboacutelica del paraacutesito por medio de la incorporacioacuten
de un precursor de aacutecidos nucleicos marcado radiactivamente El Plasmodium es
incapaz de sintetizar las purinas que necesita para su replicacioacuten obtenieacutendolas
de una fuente externa La utilizacioacuten del precursor de purinas marcadas
permitiraacute determinar la incorporacioacuten del material geneacutetico del paraacutesito y por
tanto se comportaraacute como marcador de la regeneracioacuten del mismo
Los ensayos se realizan por triplicado y los resultados se obtienen por
interpolacioacuten lineal (Huber y Koella 1993) Finalmente se expresan como CI50
(concentracioacuten que produce una inhibicioacuten del 50 del crecimiento plusmn la
desviacioacuten estaacutendar) siendo
Log (IC50) = log (X1) + (50-Y1)(Y2-Y1) [log (X2) ndash log (X1)]
Siendo X1 Concentracioacuten del compuesto que da un de inhibicioacuten de la
parasitemia Y1gt50 X2 Concentracioacuten de compuesto que da un de
inhibicioacuten de la parasitemia Y2lt50
El porcentaje de incorporacioacuten de hipoxantina unida al paraacutesito se calcula con la siguiente ecuacioacuten
hipoxantina incorporada = 100 ndash (PTx100)
Siendo P cuentas por minuto (cpm) para cada concentracioacuten T control
negativo (eritrocitos sin tratar)
Ensayos bioloacutegicos
94
VIII2 Ensayos toxicoloacutegicos
Los ensayos de citotoxicidad de los compuestos se realizaron en dos etapas
Inicialmente se llevaron a cabo en la Universidad Cayetano Heredia (UPCH) en
Lima Peruacute y posteriormente en la Universidad Paul Sabatier (Toulouse III) en
Toulouse Francia
La toxicidad de todos los compuestos se evaluaron en ceacutelulas epiteliales de
rintildeoacuten de mono African (Vero) Estas ceacutelulas fueron cultivadas con medio
DMEN F-12 (Cat Nordm BE12-719F) suplementado con 10 de suero fetal bovino
inactivado por calor NEAA piruvato de Na y mantenidas en una incubadora a
37 ordmC con una atmoacutesfera de 5 de CO2 La evaluacioacuten toxicoloacutegica se realiza en
placas de 96 pocillos de fondo plano adicionando 100 microL de cultivo de ceacutelulas
Vero a cada pocillo a una concentracioacuten de 10x105 ceacutelulaspocillo Los
compuestos se antildeadieron a diferentes concentraciones 100 microgmL 10 microgmL 1
microgmL y 01 microgmL y el efecto se evaluacutea 48 horas despueacutes de haber adicionado
el compuesto
El efecto se determinoacute usando el ensayo de viabilidad celular del MTT que
consiste en adicionar 10 microL de MTT a una concentracioacuten de 10 microgmL en las
placas que son colocadas nuevamente en la incubadora cubiertas con papel
aluminio durante el periodo de incubacioacuten Cuatro horas despueacutes de finalizado
el periodo de incubacioacuten se antildeade 100 microL de una solucioacuten de lisis que contiene
50 de isopropanol 10 de SDS y se deja reposar las placas a temperatura
ambiente en un orbital a 150 rpm durante 30 minutos
Finalmente se lee la densidad oacuteptica con un escaacutener de 96 pocillos a 590 nm
en un equipo Bio-Rad Todos los experimentos se realizan por triplicado
El dato de inhibicioacuten de crecimiento GI50 se determina por anaacutelisis de
regresioacuten linear definido como la concentracioacuten de compuesto que produce el
50 de reduccioacuten de absorbancia comparaacutendola con los controles
VIII3 Ensayos in vivo
Los procedimientos se desarrollaron siguiendo el manual de Teacutecnicas de
laboratorio para la seleccioacuten de sustancias antimalaacutericas (Deharo et alts 2000)
en el Laboratorio de Farmacologiacutea para el Desarrollo perteneciente al Instituto
para el Desarrollo (IRD) de la Universidad Paul Sabatier (Toulouse III) de
Toulouse (Francia)
Ensayos bioloacutegicos
95
VIII31 Instrumental y reactivos
Los estudios in vivo se llevaron a cabo seguacuten la legislacioacuten francesa sobre
cuidado y uso de animales de laboratorio vigente (Ndeg 008430) Se utilizaron
ratones macho IOPF Swiss de 4-6 semanas de vida con un peso de 20 2 g con
certificado negativo para Encephalitozoom cuniculi (Janvier Saint Berthevin
Francia) El animalario-bioterio de la Facultad de Farmacia de la Universidad
Paul Sabatier se encargoacute del cuidado de animales mantenimiento condiciones
ambientales de las instalaciones y eliminacioacuten del material bioloacutegico
Las cepas usadas tanto para los ensayos de virulencia como para los estudios
provienen de la reserva de material bioloacutegico del IRD De ahiacute se descongelaron
una cepa Plasmodium berghei NK65 y otra Plasmodium petteri que se encontraban
bien identificadas dentro de tanques de nitroacutegeno liacutequido en caacutemaras
refrigeradas del IRD
Los materiales empleados en el manejo animal fueron agujas Neolus de 05
mm y jeringas de 1 mL U100 Insulin de Tarumo Europe NV (Beacutelgica) Ademaacutes
se usoacute heparina Sigma H6263 (Alemania) suero fisioloacutegico esteacuteril Baxter
(Francia) y viales de plaacutestico con tapoacuten no esteacuteriles Para los frotis se usaron
laacuteminas portaobjetos de vidrio (Tarumo Europe NV Belgica) y metanol de
calidad HPLC Fisher Chemicals (Leicestershine Reino Unido) Para la
coloracioacuten se usoacute el reactivo Giemsa en polvo con glicerol de Sigma Ultra
(Steinheim Alemania) disolucioacuten tampoacuten de fosfato soacutedico dibaacutesico
heptahidratado y fosfato potaacutesico monobaacutesico anhidro de Sigma Aldrich
(Steinheim Alemania) en agua miliQ
Para la lectura de los frotis y conteo de hematiacutees se ha usado un microscopio
Leica DME (USA)
VIII32 Metodologiacutea
VIII321 Preparacioacuten de disolucioacuten Giemsa
La Giemsa es un colorante neutro compuesto de un colorante aacutecido (azul de
eosinato) y otro baacutesico (azul de metileno) que precipita con agua Lo que se
obtiene es un colorante neutro que no es soluble al agua pero si al alcohol
metiacutelico De forma inversa no es activo en solucioacuten metiacutelica pero siacute en
disolucioacuten acuosa Las ceacutelulas protozoarias disocian el colorante neutro el ADN
se tintildee de rojo y el citoplasma de azul Por las caracteriacutesticas comentadas ha de
Ensayos bioloacutegicos
96
ser utilizado con un tampoacuten para evitar que el pH de los medios de trabajo lo
precipite o inactive y con agua destilada calidad miliQ
Se pesan 076 g de polvo de Giemsa en un erlenmeyer y se pone suavemente
en agitacioacuten con 50 mL de glicerina y se deja hasta completa disolucioacuten a 60 ordmC
Una vez disuelto se deja enfriar y se le antildeaden 50 mL de metanol dejando la
disolucioacuten en agitacioacuten 12 horas Transcurrido el tiempo se deja reposar
protegido de la luz 7 diacuteas para finalizar con una filtracioacuten eliminando asiacute los
restos no disueltos Mientras se prepara una disolucioacuten tampoacuten fosfato con 02 g
de fosfato potaacutesico monobaacutesico anhidro y 05 g de fosfato soacutedico dibaacutesico
heptahidratado en un litro de agua MiliQ ajustaacutendose el pH a 74
Estas dos disoluciones no se mezclaraacuten hasta el momento de ser utilizadas
manteniendo la de Giemsa protegida de la luz Para su utilizacioacuten en un tubo
coacutenico de 50 mL se colocan 45 mL de la disolucioacuten tampoacuten de tampoacuten fosfato
y 5 mL de Giemsa y se homogenizan cuidadosamente dos veces por inversioacuten
Se cubre la muestra con el preparado y lo sobrante se desecha
Las disoluciones preparadas de Giemsa tienen un tiempo de vida corto ya
que con el paso del tiempo van precipitando y formaacutendose cristales que dantildean
la tincioacuten Debido a esto se recomienda preparar perioacutedicamente un nuevo
stock de colorante y nunca mezclar dos tipos diferentes puesto que cada
preparado tiene caracteriacutesticas propias que afectan el resultado en la coloracioacuten
VIII322 Tincioacuten con Panoacuteptico Raacutepido
Esta es una teacutecnica de tincioacuten por inmersioacuten a diferencia de la tincioacuten por
Giemsa que es por cobertura La ventaja es que es maacutes raacutepida y faacutecil de trabajar
cuando no se cuenta con un gran nuacutemero de laacuteminas para colorear El meacutetodo
consiste en la inmersioacuten sucesiva de la laacutemina que tentildeir en tres colorantes
consecutivamente En una primera cubeta Wertheim se pone una solucioacuten
alcohoacutelica de triarilmetano en la segunda cubeta se pone una solucioacuten
tamponada de xanteno y en la tercera una tamponada de tiazina
Las laacuteminas con las muestras fijadas se sumergen verticalmente y en el mismo
sentido que se ha extendido la muestra en la primera cubeta realizando
movimientos regulares verticales durante unos segundos Se sacan de la cubeta
y se espera que escurran el colorante sobrante Este procedimiento se repite en
las tres cubetas teniendo especial cuidado en la uacuteltima donde se debe asegurar
la homogeneidad de la tincioacuten sin exceso de coloracioacuten Finalmente se lava con
agua se dejan secar al aire para ser analizadas al microscopio
Ensayos bioloacutegicos
97
VIII323 Realizacioacuten de un frotis
Se denomina frotis a la extensioacuten de una muestra o cultivo que se realiza
sobre un portaobjetos con objeto de separar lo maacutes posible los microorganismos
o componentes sanguiacuteneos y para obtener de ellos una imagen clara y niacutetida al
microscopio
La muestra ha de ser fijada al vidrio del portaobjetos sin que la muestra sea
arrastrada en los lavados para poder aplicar despueacutes sobre eacutel meacutetodos de
tincioacuten que permiten la observacioacuten al microscopio de las ceacutelulas En la
actualidad los portaobjetos utilizados se comercializan limpios y esterilizados
para su uso inmediato
En primer lugar se toma un portaobjetos nuevo y se rotula adecuadamente
Con unas tijeras esterilizadas se hace un pequentildeo corte en la punta de la cola
del ratoacuten y se presiona para conseguir una gota de sangre que es recogida en el
centro de un extremo del portaobjetos Raacutepidamente con el filo de otro
portaobjetos se extiende la gota arrastraacutendola suavemente por la superficie del
primer portaobjetos para conseguir una peliacutecula lo maacutes homogeacutenea posible
tratando de cubrir toda la superficie de la laacutemina Posteriormente se pone el
portaobjetos horizontal y se cubre con metanol se deja secar con cuidado al aire
y se guarda la muestra hasta la tincioacuten el tiempo que sea necesario
Asiacute tentildeida la muestra se puede proceder a su lectura para calcular el
porcentaje de parasitemia ( parasitemia paraacutemetro que indica el nivel de
infeccioacuten de la sangre de un ratoacuten) mediante el conteo manual de los hematiacutees
sanos y los parasitados Se hace un conteo de veinte campos elegidos de forma
que los hematiacutees no se solapen y aproximadamente contengan la misma
cantidad de unidades El tanto por ciento de parasitemia se calcula aplicando la
siguiente foacutermula
Siendo H infectados hematiacutees infectados H sanos hematiacutees sanos
Ensayos bioloacutegicos
98
iquestQueacute se puede ver en un frotis al microscopio
En un frotis de ratoacuten sano se pueden ver
Trozos de cristales de colorante si el vidrio no ha sido lavado lo
suficiente
Hematiacutees o gloacutebulos rojos o eritrocitos
Leucocitos o gloacutebulos blancos Estos se colorean con la tincioacuten
porque tiene carga geneacutetica y los hematiacutees no En ocasiones puede
confundirse un hematiacutee joven y un leucocito porque los hematiacutees
joacutevenes conservan restos de nuacutecleo pero se diferencian en nuacutemero
y tamantildeo Los leucocitos son menos numerosos y de mayor
tamantildeo ademaacutes en la tincioacuten quedan anteriormente tentildeidos de
morado con una aureola azul
En un ratoacuten infectado se puede observar
Hematiacutees sanos
Hematiacutee joven
Esquizonte joven que puede confundirse con un hematiacutee joven
Esquizonte desarrollado
Esquizonte agotado Es el momento previo a la ruptura del
espacio y la liberacioacuten de trofozoiacutetos libres que continuaran con la
infeccioacuten
Trofozoiacutetos libres que pueden confundirse con plaquetas
Hematiacutees en invasioacuten
Figura 49 Vista al microscopio de un frotis de sangre infectada por Plasmodium32
32 Disponible en httpwwwelrincondelamedicinainternacom2011_05_16_archivehtml
Ensayos bioloacutegicos
99
VIII324 Preparacioacuten y lectura en la caacutemara Malassez
La caacutemara se usa para hacer el conteo de hematiacutees totales Se cubre la
cuadriacutecula de la caacutemara con la muestra de sangre heparinizada con la ayuda de
una micropipeta y por capilaridad se llena la cuadriacutecula de conteo Como la
disolucioacuten tiene caraacutecter tridimensional y en el microscopio las lecturas son
bidimensionales se pone la ceacutelula en una caacutemara huacutemeda durante diez minutos
para que la muestra sedimente y no se deshidrate durante el proceso Pasado el
tiempo se pone la caacutemara de Malassez al microscopio y con cuarenta aumentos
y se hace el recuento manual de hematiacutees por mm3 de sangre Con el valor
promedio y teniendo en cuenta la dilucioacuten y el volumen de la caacutemara es posible
calcular la densidad de gloacutebulos rojos (GR) en la sangre de un ratoacuten sano
mediante la siguiente ecuacioacuten
GRmm3= GR promedio x dilucioacuten muestra x volumen celda
Siendo GR promedio promedio de hematiacutees dilucioacuten muestra valor fijo de
200 (10 microL en 2 mL) volumen volumen de la celda valor fijo 100 mm3
EL valor medio de hematiacutees de un ratoacuten sano es 5 millones de hematiacutees por
mm3
Una caracteriacutestica de la enfermedad es la anemia asiacute un ratoacuten infectado que
ha desarrollado la enfermedad presenta una disminucioacuten aproximada de un 75
en el nuacutemero de hematiacutees con respecto al ratoacuten sano por conteo en caacutemara
Malassez
VIII325 Ensayos de virulencia
Para este estudio es necesario tener al paraacutesito y al hueacutesped En este caso se
utilizaraacuten dos especies diferentes de paraacutesito que producen la enfermedad de la
malaria como son Plasmodium berghei NK65 y Plasmodium vinckei petteri
provenientes de la reserva del IRD Estas dos especies son capaces de infectar
roedores por lo que el hueacutesped seraacute un grupo de veinte ratones machos IOPF
Swiss
Descongelacioacuten de cepas y activacioacuten de paraacutesitos
Cuando se descongela una cepa no tiene mucha capacidad de infeccioacuten
(virulencia) sino que esta va en aumento con el paso de los diacuteas Por otro lado
es probable que los ratones inoculados no lleguen a desarrollar la enfermedad
porque la muestra haya sido mal conservada o se haya degradado demasiado
Ensayos bioloacutegicos
100
en el friacuteo que es lo que ocurrioacute experimentalmente con la cepa de P vinckei
petteri En este caso se esperan 10 diacuteas despueacutes de la inoculacioacuten y se
monitoriza al ratoacuten para observar si hay progresioacuten de la infeccioacuten de no ser
asiacute debe realizarse una revisioacuten de los tanques de almacenamiento para
descartar las muestras anteriores a la fecha de congelacioacuten de la muestras que
presentaron problemas ya que pueden estar en igual o en peores condiciones
El estudio comienza con la descongelacioacuten de una cepa de Plasmodium berghei
NK65 a temperatura ambiente mientras se extraen 10-20 microL (45 gotas) de sangre
de cola de ratoacuten sano Este volumen se mezcla inmediatamente con una gota de
heparina con el fin de evitar la coagulacioacuten de la sangre extraiacuteda La sangre
heparinizada se diluye 1200 en un vial esteacuteril con tapoacuten con 4 mL de suero
fisioloacutegico para devolver las ceacutelulas sanguiacuteneas a un medio parecido al normal
y que no se produzcan procesos de oacutesmosis que destruyan la muestra Cerrar el
vial y guardar la muestra
Cuando este descongelado el vial con la cepa se toma con una jeringa el
volumen contenido en el vial y se divide en dos para ser inyectado viacutea
intraperitoneal en dos ratones separados previamente del grupo Estos ratones
se separan del grupo en una celda identificada con la fecha de infeccioacuten la cepa
y la especie que contiene para observar la progresioacuten de la infeccioacuten La sangre
heparinizada se usa para un primer conteo del nuacutemero de hematiacutees en
ejemplares sanos cuyo recuento se realiza con cuadriacutecula doble en la ceacutelula o
caacutemara de Malassez A los tres diacuteas de la inoculacioacuten se hace un control del
estado de los dos ratones infectados tanto visual como sanguiacuteneo Los siacutentomas
externos de la enfermedad son peacuterdida de coloracioacuten en los ojos y orejas pelo
erizado ademaacutes de peacuterdida de peso y aglomeracioacuten entre ellos por causa de la
fiebre Tambieacuten se realiza un frotis para calcular la parasitemia
Cuando los ratones infectados desarrollen la enfermedad se infecta con su
sangre a otros dos ratones sanos de forma que ademaacutes de conocer coacutemo se
desarrolla el paraacutesito se garantice que tendraacuten la fuerza suficiente para
comenzar los ensayos de actividad De esta forma no es necesario conocer la
parasitemia basta con saber que la cepa estaacute viva Asiacute se realiza un frotis
control positivo con sangre de la cola del ratoacuten y del mismo sitio se obtendraacuten
20 microL de sangre que se hepariniza y disuelve en 1 mL de suero Se puede
conocer el buen estado de esta disolucioacuten visualmente si se observa un color
rojo muy claro ya que indica que no se ha producido hemoacutelisis Este nuevo
grupo de ratones infectados son los ratones fuente
Ensayos bioloacutegicos
101
El volumen de la disolucioacuten anterior se pone en una jeringa para ser
inyectado en dos ratones sanos que tambieacuten se aiacuteslan para controlar coacutemo
evoluciona la infeccioacuten
Diariamente se realiza un frotis control a los diferentes grupos de ratones
infectados para registrar la evolucioacuten de la parasitemia ya que algunos
evolucionaraacuten muy raacutepido y moriraacuten mientras que otros no mostraraacuten la
enfermedad
Ensayos de virulencia
El quinto diacutea desde la inoculacioacuten del paraacutesito vivo en los ratones fuente se
procede a calcular la parasitemia En este momento se infecta a un nuevo grupo
de 5 ratones En esta ocasioacuten la infeccioacuten seraacute controlada y se procederaacute a una
infeccioacuten con un nuacutemero de paraacutesitos determinado Para estos ensayos
normalmente se inoculan 107 paraacutesitos por ratoacuten por tal motivo es necesario
conocer previamente el nuacutemero de paraacutesitos en la sangre del ratoacuten fuente
sabiendo esto se puede calcular la cantidad de paraacutesitos necesarios para
inocular a todos los grupos de ratones experimentales seguacuten la siguiente
ecuacioacuten
Para preparar las cantidades necesarias de sangre infectada heparina y suero
fisioloacutegico necesarias para desarrollar el ensayo de virulencia se deben tener en
cuenta los cinco ratones disponibles a los que se antildeade un sexto ratoacuten hipoteacutetico
con el que se tienen en cuenta las peacuterdidas de disoluciones durante los
procedimientos experimentales Seraacuten necesarios 10 microL de sangre del ratoacuten
fuente para inyectar a cada ratoacuten del ensayo El procedimiento de extraccioacuten de
sangre e infeccioacuten del grupo es el mismo
Durante todo este proceso es preciso llevar un seguimiento diario de la
parasitemia para observar el grado de virulencia del paraacutesito Los resultados
del comportamiento del paraacutesito son aproximados debido al aumento de la
parasitemia en los sucesivos ensayos
Por queacute un seguimiento previo del desarrollo de la infeccioacuten
El desarrollo de los paraacutesitos en individuos infectados no se produce siempre
de igual forma por lo que si se parte de cepas congeladas es necesaria una
primera activacioacuten del paraacutesito (primera infeccioacuten) y una posterior reactivacioacuten
del paraacutesito (infecciones sucesivas) a partir de la primera infeccioacuten
Ensayos bioloacutegicos
102
Las diferencias de desarrollo se deben a tres factores principalmente
1- Viacutea intraperitoneal Es una viacutea menos precisa que la viacutea intravenosa
porque no hay una localizacioacuten exacta de la inyeccioacuten de la sangre
infectada Todos los ratones tienen la misma capacidad de respuesta pero
no se puede controlar la respuesta del ratoacuten por esta viacutea de inoculacioacuten
Por viacutea intravenosa se asegurariacutea su introduccioacuten en el hiacutegado pero por
las por las caracteriacutesticas aproximativas de los ensayos y queda
descartada
2- Raza Swiss Este tipo de ratoacuten no es monoclonal por tanto todos los
individuos son diferentes entre siacute De ahiacute se deduce que la respuesta seraacute
distinta en cada uno de ellos El objetivo de los ensayos realizados es
encontrar un nuevo compuesto que revierta cualquier tipo de
parasitemia como hace la CQ de manera que la variabilidad del sistema
no sea influyente
3- Enzephalitozoom Cuniculli Es un paraacutesito de roedor que puede interferir
cruzadamente con el Plasmodium lo que hace que los ensayos no sean
fiables En la actualidad este factor no se tiene en cuenta ya que todos los
lotes de ratones adquiridos traen consigo el certificado de anaacutelisis de la
empresa que los suministra
Una vez conocido coacutemo se desarrolla el paraacutesito de la cepa elegida se
comienza con la infeccioacuten de otro grupo de ratones Esta infeccioacuten se realiza con
el objetivo de tener ratones fuente disponibles el diacutea que se ha de comenzar el
ensayo Del mismo modo la sangre de los ratones infectados es usada para la
congelacioacuten de nuevas cepas
VIII326 Ensayos de actividad Test de Peters
El test claacutesico de supresioacuten de 4 diacuteas (Peters y Robinson 1999) da comienzo
una vez que se conoce coacutemo se va a desarrollar previsiblemente la cepa elegida
En este ensayo dicha cepa es Plasmodium berghei NK65 inoculada en 100 ratones
macho tipo Swiss con un peso de 20 2 g Se distribuyen en 10 grupos de 10
individuos identificados de la siguiente manera
-Grupo Negativo 10 ratones que seraacuten tratados con el medio de dilucioacuten de
los compuestos que ensayar En esta ocasioacuten el medio de dilucioacuten es DMSO
utilizado a una dosis maacutexima de 100 microL por ratoacuten y diacutea
Ensayos bioloacutegicos
103
-Grupo Positivo 10 ratones que seraacuten tratados con 40 microg de CQ en 100 microL
DMSO (2 mg por kg)
-Grupos de A1 al A4 Cuatro grupos de 10 ratones que seraacuten tratados con uno
de los compuestos que ensayar a dosis de 40 20 10 y 5 mgkg respectivamente
-Grupos del B1 al B4 Cuatro grupos de 10 ratones que seraacuten tratados con el
otro compuesto que ensayar a dosis 40 20 10 y 5 mgkg respectivamente
El ensayo parte de la determinacioacuten de la parasitemia y de un conteo de
hematiacutees por ceacutelula Malassez de ratones fuente para conocer queacute cantidad de
sangre se necesita para realizar una infeccioacuten controlada y simultaacutenea de los
cien ratones con ceacutelulas parasitadas con 107 ceacutelulas parasitadasratoacuten en una
solucioacuten salina al 09 por viacutea intraperitoneal
La extraccioacuten se realiza por puncioacuten seno retro-orbital ya que el volumen de
sangre que se necesita es superior al que se puede obtener por puncioacuten de la
vena de la cola La muestra se trata de la misma forma que lo explicado
anteriormente y se procede a la infeccioacuten de la totalidad de los individuos
Trascurridas dos horas se comienza con la administracioacuten del tratamiento
especiacutefico de cada grupo en lo que se denomina Diacutea 0 En dicho momento se
realiza la administracioacuten del tratamiento todos los diacuteas siguientes a la misma
hora y con el mismo procedimiento El tratamiento se aplica viacutea subcutaacutenea en
la parte interna de las patas traseras Con esto evitamos que se produzca
toxicidad o necropsia de alguacuten oacutergano del peritoneo Tambieacuten se alterna la pata
donde se inyecta el tratamiento para asegurarse de que no se produzca una
necrosis por toxicidad debida a la acumulacioacuten del producto por una mala
difusioacuten Si un producto no es toacutexico podriacutea acumularse pero no necrosar y
esto tambieacuten podriacutea observarse como un bulto debajo de la piel
Durante el transcurso del test se ha de llevar a cabo un seguimiento visual de
la posible respuesta externa de los ratones a la administracioacuten de los
compuestos anotando cambios en el comportamiento de los ratones
irritaciones deacutermicas en diferentes zonas prestando especial atencioacuten a la zona
donde se produce la inyeccioacuten del tratamiento falta de movilidad y cambios
morfoloacutegicos como disminucioacuten de la temperatura peacuterdida de peso o pelo
cambios en la pigmentacioacuten de la piel
Pasados cinco diacuteas o Diacutea 4 se realiza un frotis a todos los ratones
supervivientes para calcular la parasitemia en sangre perifeacuterica Se comprueba
la inhibicioacuten de la parasitemia para calcular la dosis letal (DL50) determinada
Ensayos bioloacutegicos
104
por anaacutelisis de regresioacuten lineal de miacutenimos cuadrados Una vez pasado el
tiempo del Test de Peters los ratones supervivientes seguiraacuten siendo
observados en los siguientes diacuteas lo que se denomina Test Rane Esto sirve para
la determinacioacuten de la actividad esquizonticida en vivo comparando de la
mortalidad de los ratones del grupo negativo con el resto de grupos
Durante la realizacioacuten de los ensayos los ratones que mueren son desechados
seguacuten los protocolos normalizados del animalario (bioterio) en el que se
realizan todos los procedimientos experimentales
IIXX EESSTTUUDDIIOOSS CCOOMMPPUUTTAACCIIOONNAALLEESS
Estudios Computacionales
107
IX1 Propiedades fisicoquiacutemicas de los compuestos
Para los caacutelculos de las propiedades fisicoquiacutemicas de los compuestos se
utilizoacute el Laboratorio de Quiacutemica Computacional Virtual33 (Tetko et alts 2005)
y la herramienta de caacutelculo de propiedades online Molinspiration34 (Ertl et alts
2000)
Los datos obtenidos fueron utilizados para establecer una aproximacioacuten
teoacuterica del comportamiento de los compuestos en tratamientos orales Los
estudios se centraron en la obtencioacuten de las caracteriacutesticas de absorcioacuten de cada
compuesto que depende de otros factores como liposolubilidad fuerzas polares
moleculares y caracteriacutesticas propias de la estructura molecular
El coeficiente de particioacuten octanolagua estaacute asociado a la solubilidad y se
calculoacute desde MLog P miLogP AlogP KOWLogP y ABlogP Las
caracteriacutesticas estructurales de la moleacutecula como tamantildeo y posibilidad de giro
de enlaces tambieacuten influyen en la absorcioacuten Las caracteriacutesticas polares son
importantes para la absorcioacuten porque intervienen en la lipofilia de los
compuestos asiacute se desprende del estudio de los enlaces aceptores y receptores
de enlaces polares y del TPSA Se puede obtener asiacute una aproximacioacuten al
porcentaje de absorcioacuten (Zhao et alts 2002) de los compuestos en la membranas
celulares
Los compuestos que a su vez cumplen las Reglas de Lipinski (Lipinski et alts
1997) son buenos candidatos para ofrecer buenas cualidades en la
administracioacuten oral
IX2 Optimizacioacuten geomeacutetrica
Los estudios computacionales de Modelizacioacuten y Docking35 se llevaron a
cabo para compuestos liacutederes en los Laboratorios de Investigacioacuten y Desarrollo
de la Facultad de Ciencias y Filosofiacutea de la Universidad Peruana Cayetano
Heredia (UPCH) Lima (Peruacute)
33 httpwwwvcclaborg 34 httpwwwmolinspirationcomservicespropertieshtml 35 Docking (del ingleacutes anclarse) En el campo del Modelado molecular este es un meacutetodo que predice la conformacioacuten preferida de un moleacutecula al estar unida a otra con el fin de formar un complejo estable1 El conocimiento de la orientacioacuten preferida a su vez puede ser usada para predecir la fuerza de la asociacioacuten o la afinidad de enlace entre dos moleacuteculas usando por ejemplo las funciones de puntuacioacuten (o funciones de scoring)
Estudios Computacionales
108
El compuesto maacutes activo se sometioacute a estudios de modelizacioacuten para
optimizar la geometriacutea y determinar los potenciales electrostaacuteticos de la
moleacutecula Para esto se usoacute el caacutelculo mecaacutenico Quantum en concreto el
programa Gaussian36 de quiacutemica cuaacutentica y el set baacutesico HF3-21G El Potencial
molecular electrostaacutetico (MEP) fue computerizado por la densidad electroacutenica
y fue calculado a partir de datos del software Molekel37 (Fluumlckigel et alts 2008)
IX3 Estudios de Acoplamiento Molecular (Docking)
El programa ICM38 de modelizacioacuten se usoacute para determinar el potencial
modo de unioacuten entre los compuestos maacutes activos y la enzima diana
previamente estudiada en estudios anteriores la plasmepsina II del Plasmodium
Ensayos anteriores mostraban la cristalizacioacuten de la enzima plasmepsina II con
un compuesto denominado EH58 (N-(3-[(2-benzo[13]dioxol-5-yl-ethyl)[3-(1-
methyl-3-oxo-13-dihydro-isoindol-2-yl)-propionyl]-amino]-1-benzyl-2-
(hydroxypropyl)-4-benzyloxy-35-dimethoxy-benzamide Figura 50) (Asojo et
alts 2003)
Figura 50 Imagen de la interaccioacuten del compuesto EH-58 y la plasmepsina II39
Seguacuten datos publicados posteriormente se demostroacute que la enzima presenta
un hueco activo donde pueden introducirse diferentes moleacuteculas y establecer
interacciones que inhiben su actividad En el caso de los derivados estudiados
se planteoacute la posible unioacuten de estos al resto polar del aminoaacutecido aspartato
(ASP) de las posiciones 214 y 34 de sitio activo de la enzima (Bjelic et alts
36 Gaussian Inc Pittsburg PA 2003 37 httpwwwcscschmolekel 38 versioacuten3 4-8 La Jolla CA Molsoft LLC 2006 39 Disponible en Asojo et alts 2003
Estudios Computacionales
109
2007) En primer lugar para validar la metodologiacutea y comprobar la capacidad
del programa ICM para estudiar los modos de enlace de los inhibidores en el
sitio de unioacuten de la enzima el complejo EH50-plasmepsina II40 fue reacoplado
mediante caacutelculos computacionales De acuerdo con la bibliografiacutea (Cunico et
alts 2009a b y Mendoza et alts 2011) en los estudios de acoplamiento se
considera como vaacutelidos los valores de desviacioacuten de la media cuadraacutetica
(RMSD) entre 30 a 40 Aring
Las estructuras se prepararon siguiendo la metodologiacutea ICM (Abagyan et
alts 1994) y se dibujaron con el editor molecular del software41 Asiacute las
estructuras de los compuestos y la proteiacutena fueron convertidas a objetos ICM
Durante este proceso de conversioacuten de la proteiacutena se antildeadieron hidroacutegenos
para proceder despueacutes con una optimizacioacuten geomeacutetrica Ademaacutes las
representaciones en dos dimensiones fueron convertidas a tres dimensiones
asignando cargas parciales y asignando enlaces rotatorios
De acuerdo con estudios previos (Mendoza et al 2011 y Cunico et al 2009b)
los aminoaacutecidos que conforman el sitio activo son la ASP 34 y la ASP 214
El programa buscador de cavidades del sistema ICM42 se usoacute para identificar
el sitio activo con un valor de tolerancia de 46 Aring La posicioacuten y orientacioacuten
inicial del ligando y el tamantildeo y posicioacuten del hueco fueron escogidos de
acuerdo con los valores sugeridos por el sistema
Los modos de unioacuten calculados con al menos un enlace por puentes de
hidroacutegeno con alguno de los aspartatos que conforman el sitio cataliacutetico se
consideraron como los maacutes representativos y tomados en cuenta para su
anaacutelisis (Kasam et alts 2007 y Aringqvist et alts 1994) El acoplamiento planteado
para cada ligando fue analizado estudiaacutendose su energiacutea total relativa La
conformacioacuten maacutes favorable energeacuteticamente se seleccionoacute como mejor
posicioacuten espacial
40 Protein Data Bank PDB code 1LF3 wwwrcsborg 41 Molecular Editor versioacuten 25 La jolla CA Molsoft LLC 2006 42 ICM Pocket Finder An et alts 2005
RESULTADOS Y
DISCUSIOacuteN
XX DDEESSCCRRIIPPCCIIOacuteOacuteNN DDEE CCOOMMPPUUEESSTTOOSS
Descripcioacuten de Compuestos
115
X1 Siacutentesis de precursores
(Benzo[b]tiofen-3-il)-3-cloropropan-1-ona
Procedimiento experimental
Sobre 205 g de AlCl3 (015 mmol) disueltos en 150 mL de diclorometano seco y
en atmoacutesfera de N2 se antildeade gota a gota una disolucioacuten de 1878 g de
benzo[b]tiofeno (140 mmol) y 159 mL de cloruro de 3-cloropropionilo (140
mmol) disueltos en 50 mL de diclorometano seco A continuacioacuten se antildeaden
tambieacuten gota a gota 95 mL de aacutecido sulfuacuterico en 150 mL de agua Se realiza
extracciones con diclorometano La fase orgaacutenica se seca con trazas de sulfato
soacutedico anhidro y se elimina el disolvente a presioacuten reducida Se obtiene un
aceite que se purifica por cromatografiacutea en columna empleando una mezcla de
hexanoacetato de etilo como fase moacutevil en gradiente hasta (955) El producto
se precipita con hexano friacuteo
Punto de fusioacuten 55-57ordmC
IR (cm-1) 1655 (mf CO)
RMN-1H (CDCl3 400 MHz) δ (ppm) 343 (m 2H CH2-CO) 386 (c 2H CH2-
Cl) 732-748 (m 2H H5 + H6) 780 (d 1H H4 J45= 76 Hz) 824 (s 1H H2 ) 847
(d 1H H7 J76= 73 Hz)
Anaacutelisis elemental (CHN)
Calculado Hallado
C 5879 5845
H 400 396
N 000 000
FM C11H9 ClOS PM 2245 APARIENCIA Soacutelido blanco RENDIMIENTO 86
Descripcioacuten de Compuestos
116
Tert-butil 4-(4-nitro-2-trifluorometilfenil)piperazin-1-carboxilato
Procedimiento experimental
Seguacuten el meacutetodo A a partir de 2 g de 2-fluacuteor-5-nitro-1-(trifluorometil)benceno
(956 mmol) y 25 g de tert-butil piperacin-1-carboxilato (1342 mmol) se obtiene
un residuo que se lava con hexano y se usa en la reaccioacuten siguiente sin maacutes
purificaciones
Punto de fusioacuten 136ndash138 ordmC
IR (cm-1) 2982-2751 (m C-H alifaacuteticos) 1685 (mf CO) 1530 y 1350 (m NO2)
1280 y 1155 (mf CF3)
RMN-1H (CDCl3 400 MHz) δ (ppm) 150 (s 9H C(CH3)3) 308 (dd 4H H3+H5
PIPZ) 362 (dd 4H H2+H6 PIPZ) 732 (d 1H H6 FENIL J65= 90 Hz) 837 (dd
1H H5 FENIL J56= 90 Hz J53= 28 Hz) 855 (d 1H H3 FENIL J35= 27 Hz)
(4-nitro-2-trifluorometilfenil)piperazina
Procedimiento experimental
Seguacuten el meacutetodo B usando amina protegida se obtiene un aceite que precipita
con hexano en friacuteo obtenieacutendose un polvo amarillo intenso
Punto de fusioacuten 97-99ordmC
IR (cm-1) 3380 (f NH) 2982-2751 (m C-H alifaacuteticos) 1685 (mf CO) 1530 y 1350
(m NO2) 1280 y 1155 (mf CF3)
RMN-1H (CDCl3 400 MHz) δ (ppm) 212 (s 1H NH) 306-308 (m 4H H2+H6
PIPZ) 313-315 (m 4H H3+H5 PIPZ) 730 (d 1H H6 FENIL J65= 90 Hz) 835
(dd 1H H5 FENIL J56= 90 Hz J53= 26 Hz) 853 (d 1H H3 FENIL J35= 26 Hz)
FM C16H20N3F3O4
PM 3751 Apariencia Soacutelido amarillo Rendimiento 75
FM C11H12N3F3O2
PM 2751 Apariencia Soacutelido amarillo Rendimiento 75
Descripcioacuten de Compuestos
117
Tert-butil 4-(4-nitro-2-trifluorometilfenil)-14-diazepan-1-carboxilato
Procedimiento experimental
Seguacuten el meacutetodo A a partir de 2 g de tert-butil 14-diazepan-1-carboxilato (999
mmol) y 108 g de 1-fluacuteor-2-nitro-4-(trifluorometil)benceno (516 mmol) se
obtiene un residuo que se lava con eacuteter etiacutelico y se usa en la reaccioacuten siguiente
sin maacutes purificacioacuten
Punto de fusioacuten 197ndash198 ordmC
IR (cm-1) 2982-2751 (m C-H alifaacuteticos) 1694 (mf CO) 1524 y 1346 (m NO2)
1283 y 1154 (mf CF3)
RMN-1H (DMSO-d6 400 MHz) δ (ppm) 208-211 (q 2H H6 DZP) 324 (sa
2H H2 DZP) 330 (sa 2H H7 DZP) 344 (t 2H H5 DZP) 363 (t 2H H3 DZP)
756 (d 1H H6 FENIL J65= 99Hz) 839-845 (m 2H H3+H5 FENIL)
(4-nitro-2-trifluorometil)fenil)-14-diazepan
Procedimiento experimental
Seguacuten el meacutetodo B usando amina protegida se obtiene un aceite que precipita
con eacuteter etiacutelico en friacuteo
Punto de fusioacuten 121ndash123 ordmC
IR (cm-1) 3352 (m NH) 2938-2850 (m C-H alifaacuteticos) 1581 y 1331 (mf CF3)
RMN-1H (CDCl3 400 MHz) δ (ppm) 174 (sa 1H NH) 192-197 (m 2H H6
DZP) 303-309 (m 4H H3+H5 DZP) 350-357 (m 4H H2+H7 DZP) 721 (d 1H
H6 FENIL J65= 93 Hz) 825 (dd 1H H5 FENIL J56= 92 Hz J53= 28 Hz) 853
(d 1H H3 FENIL J35= 28 Hz)
FM C17H22N3F3O4
PM 3893 Apariencia Soacutelido amarillo Rendimiento 77
FM C12H14N3F3O2
PM 2893 Apariencia Soacutelido amarillo Rendimiento 75
Descripcioacuten de Compuestos
118
Tert-butil 1-(4-nitro-2-trifluorometilfenil)-(S)-pirrolodin-3-ilcarbamato
Procedimiento experimental
Seguacuten el meacutetodo A a partir de 127 g (686 mmol) de tert-butil-(S)-pirrolidin-3-ilcarbamato y
072 g (343 mmol) de 2-fluor-5-nitro-1-(trifluorometil) benceno El residuo obtenido se precipita
y se lava con hexano
Punto de fusioacuten 115 ndash 117 ordmC
IR (cm-1) 3349 (f NH) 2981-2880 (d C-H alifaacuteticos) 1680 (mf CO) 1507 y 1326 (m NO2) 1273 y
1120 (f CF3)
RMN-1H (CDCl3 400 MHz) δ (ppm) 148 (s 9H C(CH3)3) 199-207 (m 1H H4ec PIRR) 226-
235 (m 1H H4ax PIRR) 342(c 1H H2ec PIRR) 359-365 (m 1H H5ax PIRR) 368-374 (m 1H
H5ec PIRR) 384 (c 1H H2ax PIRR) 438 (sa 1H NH) 470 (sa 2H H3 PIRR) 683 (d 1H H6
FENIL J65 = 95 Hz) 820 (dd 1H H5 FENIL J56 = 94 Hz J53 = 27Hz) 856 (d 1H H3 FENIL
J35= 27 Hz)
1-(4-nitro-2-trifluorometilfenil)-(S)-pirrolidin-3-il amina
Procedimiento experimental
Seguacuten el meacutetodo B usando la amina protegida se obtiene un aceite que precipita
con hexano en friacuteo Se identifica y se usa sin maacutes purificaciones en la siguiente
reaccioacuten
Punto de fusioacuten 64ndash66 ordmC
IR (cm-1) 3359 (d NH) 2943-2851 (d C-H alifaacuteticos) 1505 y 1317 (mf NO2) 1105 (mf CF3)
RMN-1H (CDCl3 400 MHz) δ (ppm) 149 (sa 2H NH2) 183-191 (m 1H H4ec
PIRR) 219-226 (m 1H H4ax PIRR) 327-330 (m 1H H2ec PIRR) 358-363 (m
1H H5ax PIRR) 375-381 (m 4H H2ax+H3+H5ec PIRR) 683 (d 1H H6 FENIL
J65= 95 Hz) 819 (dd 1H H5 FENIL J56= 95 Hz J53= 27 Hz) 856 (d 1H H3
FENIL J35= 27 Hz)
FM C16H20N3F3O4
PM 37521 Apariencia Soacutelido amarillo Rendimiento 71
FM C11H12N3F3O2
PM 2751 Apariencia Soacutelido marroacuten claro Rendimiento 83
Descripcioacuten de Compuestos
119
Tert-butil 1-(4-nitro-2-trifluorometilfenil)piperidin-4-ilcarbamato
Procedimiento experimental
Seguacuten el meacutetodo A a partir de 241 g de tert-butil piperidin-4-ilcarbamato (1203 mmol) y 214 g
de 1-fluacuteor-4-nitro-2-(trifluorometil)benceno (1023 mmol) El residuo obtenido se lava con
hexano
Punto de fusioacuten 120ndash122 ordmC
IR (cm-1) 3431 (m NH) 2979-2798 (m C-H alifaacuteticos) 1707 (mf CO) 1500 y 1341 (mf NO2)
1118 (f CF3)
RMN-1H (CDCl3 400 MHz) δ (ppm) 147 (s 9H C(CH3)3) 162 (dd 2H H3ax+H5ax PIPR J3ax3ec
= J5ax5ec = 113 Hz J3ax2ax = J5ax6ax = 35 Hz) 209 (d 2H H3ec+H5ec PIPR J3ec3ax = J5aec5ax = 121 Hz)
296 (td 2H H2ax+H6ax PIPR J2ax2ec = J6ax6ec = J2ax3ax = J6ax5ax = 125 Hz J2ax3ec = J6ax5ec = 19 Hz) 335
(d 2H H2ec+H6ec PIPR J2ec2ax = J6ex6ac =125 Hz) 366 (sa 1H H4 PIPR) 456 (sa 1H HN) 728 (d
1H H6 PIPR J65= 90 Hz) 832 (dd 1H H5 FENIL J56= 90 Hz J53 = 27 Hz) 851 (d 1H H3
FENIL J35 = 27 Hz)
1-(4-nitro-2-trifluorometilfenil)piperidin-4-il amina
Procedimiento experimental
Seguacuten el meacutetodo B usando la amina protegida se obtiene un aceite que precipita con
hexano en friacuteo Se identifica y se usa sin maacutes purificaciones en la siguiente reaccioacuten
Punto de fusioacuten 24-25 ordmC
IR (cm-1) 2938-2847 (m C-H alifaacuteticos) 1499 y 1334 (mf NO2) 1119 (mf CF3)
RMN-1H (CDCl3 400 MHz) δ (ppm) 152 (sa 1H NH2) 151-162 (m 2H H3ax+H5ax
PIPR) 195 (d 2H H3ec+H5ec PIPR J3ax3ec = J5ax5ec = 126 Hz) 287-296 (m 3H
H2ax+H6ax+H4 PIPR) 339 (d 2H H2ec+H6ec PIPR J2ec2ax = J6ec6ax = 127 Hz) 725 (d 1H
H6 FENIL J65= 91 Hz) 830 (dd 2H H5 FENIL J56= 90 Hz J53= 25 Hz) 851 (d 1H H3
FENIL J35= 26 Hz)
FM C17H22N3F3O4
PM 3892 Apariencia Soacutelido amarillo Rendimiento 93
FM C12H14N3O2F3
PM 2891 Apariencia Soacutelido amarillo Rendimiento 88
Descripcioacuten de Compuestos
120
X2 Siacutentesis de derivados carboniacutelicos (Serie 0)
1-(benzo[b]tiofen-3-il)-3-[4-(4-nitro-2-trifluorometilfenil)piperazin-1-
il]propan-1-ona
Procedimiento experimental
Seguacuten el meacutetodo general C a partir de 104 g (378 mmol) de (4-nitro-2-
trifluorometilfenil)piperazina y 085 g (370 mmol) de 1-(benzo[b]tiofen-3-il)-3-
cloropropan-1-ona Se elimina el disolvente a presioacuten reducida y se precipita el
soacutelido con hexanoeacuteter en friacuteo El soacutelido obtenido se purifica en columna
cromatograacutefica usando como fase moacutevil diclorometanometanol (991) Se
elimina el disolvente de las fracciones adecuadas a presioacuten reducida
obtenieacutendose el compuesto de forma soacutelida
Punto de fusioacuten 153-154ordmC
IR (cm-1) 2952-2815 (m C-H alifaacuteticos) 1673 (mf CO) 1457 y 1332 (mf NO2)
1281 y 1131 (m CF3)
RMN-1H (CDCl3 400 MHz) δ (ppm) 276-277 (m 4H H3+H5 PIPZ) 298-312
(m 2H CO-CH2-CH2) 319-321 (t 4H H2+H6 PIPZ) 327-330 (m 2H CO-CH2-
CH2) 729 (dd 1H H5rsquo FENIL J5acute6acute= 94 Hz J5acute3acute= 25 Hz) 746 (t 1H H6 BZT
J65= 80 Hz) 752 (t 1H H5 BZT J56= J54= 81 Hz) 790 (d 1H H4 BZT J45= 80
Hz) 833-836 (m 2H H6rsquo FENIL+ H7 BZT) 853 (s 1H H2 BZT) 878 (d 1H H3rsquo
FENIL J3acute5acute= 26 Hz)
Anaacutelisis elemental (CHN)
HPLC (RP-18 1 mLmin metanol-agua (8020)) tr 713 min ʎmax 2196 nm
Calculado Hallado
C 5720 5677
H 432 457
N 916 908
FM C22H20N3F3O3S PM 4635 Apariencia Soacutelido amarillo
Rendimiento 13
01
Descripcioacuten de Compuestos
121
Hidrocloruro de 1-(benzo[b]tiofen-3-il)-3-[4-(2-nitro-4-
trifluorometilfenil)piperazin-1-il]propan-1-ona
Procedimiento experimental
Seguacuten el meacutetodo general C a partir de 147 g (534 mmol) de 4-(2-nitro-4-
trifluorometilfenil) piperazina comercial y 104 g (445 mmol) de 1-
(benzo[b]tiofen-3-il)-3-cloropropan-1-ona Se elimina el disolvente a presioacuten
reducida y precipita con hexano El soacutelido obtenido no es del todo puro por lo
que se purifica por columna cromatograacutefica usando como fase moacutevil
diclorometanometanol (991) Se elimina el disolvente de las fracciones
adecuadas a presioacuten reducida obteniendo un aceite claro que se precipita como
hidrocloruro
Punto de fusioacuten 207-209 ordmC
IR (cm-1) 2970-2930 (d C-H alifaacuteticos) 1657 (mf CO) 1447 y 1332 (mf NO2)
1253 y 1120 (m CF3)
RMN-1H (DMSO 400 MHz) δ (ppm) 326 (d 2H CO-CH2-CH2 JCHCH= 98
Hz) 351 (d 2H H3ax + H5ax PIPZ Jaxec= 128 Hz) 355 (d 4H
H3ec+H5ec+H2ax+H6ax PIPZ Jaxec= 129 Hz) 367 (d 2H H2ec+H6ec PIPZ Jecec=
122 Hz) 377 (t 2H CO-CH2 JCHCH= 100 Hz) 749 (ddd 1H H5 BZT J54= 84
Hz J56= 68 Hz) 754 (ddd 1H H6 BZT J67= 82 Hz J65= 70 Hz) 758 (d 1H
H6rsquo FENIL J6acute5acute= 88 Hz) 797 (dd 1H H5rsquo FENIL J5acute6acute= 89 Hz J5acute3acute= 21 Hz)
812 (d 1H H4 BZT J45= 79 Hz) 830 (sa 1H H3rsquo FENIL) 862 (d 1H H7 BZT
J76= 78 Hz) 909 (sa 1H H2 BTZ) 1145 (sa 1H HCl)
Anaacutelisis elemental (CHN)
HPLC (RP-18 1 mLmin metanol-agua (8020)) tr 523 min ʎmax 2181 nm
Calculado Hallado
C 5285 5301
H 400 416
N 841 831
FMC22H20N3F3O3SHCl PM 4999 Apariencia Soacutelido beige Rendimiento 60
02
Descripcioacuten de Compuestos
122
1-(benzo[b]tiofen-3-il)-3-[4-(4-fluorofenil)-36-dihidropiridin-
1(2H)-il]propan-1-ona
Procedimiento experimental
Seguacuten el meacutetodo general C a partir de 1 g (567 mmol) de 4-(4-fluorofenil)-
1236-tetrahidropiridina y 12 g (534 mmol) de 1-(benzo[b]tiofen-3-il)-3-
cloropropan-1-ona Se elimina el disolvente a presioacuten reducida y se precipita el
soacutelido con eacuteter El soacutelido obtenido se purifica por cromatografiacutea flash usando
como fase moacutevil diclorometanometanol (991) Se elimina el disolvente de las
fracciones adecuadas a presioacuten reducida obtenieacutendose el compuesto de forma
soacutelida
Punto de fusioacuten 79-80 ordmC
IR (cm-1) 2780-2775 (d C-H alifaacuteticos) 1664 (mf CO)
RMN-1H (CDCl3 400 MHz) δ (ppm) 261 (sa 2H H6 PIRD) 285 (t 2H H2
PIRD J2ec3ec= J2ax3ax= 57 Hz) 306 (t 2H CO-CH2-CH2 JCHCH= 74 Hz) 330 (sa
2H H5 PIRD) 335 (t 2H CO-CH2 JCHCH= 73 Hz) 603 (t 1H H3 PIRD J56ec=
J56ax= 40 Hz) 702 (dd 2H H3rsquo+ H5rsquo FENIL J3acute2acute= J5acute6acute= 87 Hz) 736 (dd 2H
H2rsquo+ H6rsquo FENIL J3acute2acute= J6acute5acute= 86 Hz) 745 (t 1H H6 BZT J65= J67= 76 Hz) 752 (t
1H H5 BZT J56= J54= 77 Hz) 790 (d 1H H4 BZT J45 = 73 Hz) 839 (s H2 BZT)
879 (d 1H H7 BZT J76= 75 Hz)
Anaacutelisis elemental (CHN)
HPLC (RP-18 1 mLmin metanol-agua (8020)) tr 561 min ʎmax 2196 nm
Calculado Hallado
C 7232 7214
H 548 549
N 383 369
FM C22H20NFOS PM 3655 Apariencia Soacutelido amarillo Rendimiento 15
03
Descripcioacuten de Compuestos
123
1-(5-fluorobenzo[b]tiofen-3-il)-3[4-(4-nitro-2-
(trifluorometilfenil)piperazin-1-il]propan-1-ona
Procedimiento experimental
Seguacuten el meacutetodo general D a partir de 048 g (174 mmol) de 4-(4-nitro-2-
trifluorometilfenil) piperazina y 035 g (179 mmol) de 1-(5-fluorobenzo[b]tiofen-
3-il) etanona se elimina el disolvente a presioacuten reducida y se precipita el soacutelido
con hexanoeacuteter en friacuteo
IR (cm-1) 2976-2832 (d C-H alifaacuteticos) 1671 (mf CO) 1330 (f NO2) 1281 y 1127
(m CF3)
RMN-1H (CDCl3 400 MHz) δ (ppm) 296 (sa 4H H3+H5 PIPZ) 320 (sa 2H
CO-CH2-CH2) 331 (sa 4H H2+H6 PIPZ) 346 (sa 2H CO-CH2) 723 (dt 1H
H6 FBZT J65= J67= 86 Hz J64= 25 Hz) 739 (d 1H H6acute FENIL J6acute5acute= 88 Hz)
783 (dd 1H H7 FBZT J76= 88 Hz J75= 48 Hz) 837 (dd 1H H5acute FENIL J5acute6acute=
89 Hz J5acute3acute= 26 Hz) 848 (dd 1H H4 FBZT J4F= 104 Hz J46= 25 Hz) 853 (s
1H H2 FBZT) 854 (d 1H H3rsquo FENIL)
Anaacutelisis elemental (CHN)
HPLC (RP-18 1 mLmin metanol-agua (8020)) tr 703 min ʎmax 2159 nm
Calculado Hallado
C 5101 5055
H 387 390
N 811 786
FM C22H19N3F4O3S PM 4815 Apariencia Soacutelido amarillo Rendimiento 35
04
Descripcioacuten de Compuestos
124
1-(5-fluorobenzo[b]tiofen-3-il)-3-[4-(2-nitro-4-
(trifluorometilfenil)piperazin-1-il]propan-1-ona
Procedimiento experimental
Seguacuten el meacutetodo general D a partir de 058 g (209 mmol) de 4-(2-nitro-4-
trifluorometilfenil) piperazina y 043 g (222 mmol) de 1-(5-fluorobenzo[b]tiofen-
3-il) etanona Se elimina el disolvente a presioacuten reducida y el residuo se
precipita con eacuteter en friacuteo
RMN-1H (CDCl3 400 MHz) δ (ppm) 280 (sa 4H H3+H5 PIPZ) 303 (t 2H
CO-CH2-CH2 JCHCH= JCHCH= 74 Hz) 323 (sa 4H H2+H6 PIPZ) 328 (t 2H
CO-CH2 JCHCH= JCHCH = 73 Hz) 719 (d 1H H6rsquo FENIL J6acute5acute= 84 Hz) 722-725
(m 1H H6 FBZT) 769 (dd 1H H5acute FENIL J5acute6acute= 87 Hz J5acute3acute= 20 Hz) 782 (dd
1H H7 FBZT J76= 89 Hz J7F= 49 Hz) 843 (s 1H H2 FBZT) 808 (d 1HH3acute
FENIL J3acute5acute= 16 Hz) 850 (dd 1H H4 FBZT J4F= 104 Hz J46= 26 Hz)
Anaacutelisis elemental (CHN)
HPLC (RP-18 1 mLmin metanol-agua (8020)) tr 542 min ʎmax 2196 nm
Calculado Hallado
C 5101 5102
H 386 384
N 811 798
FM C22H19N3F4O3S PM 4815 Apariencia Soacutelido naranja Rendimiento 51
05
Descripcioacuten de Compuestos
125
1-(5-fluorobenzo[b]tiofen-3-il)-3-[4-(4-(trifluorometilfenil)
piperazin-1-il]propan-1-ona
Procedimiento experimental
Seguacuten el meacutetodo general D a partir de 036 g (130 mmol) de 4-(4-
trifluorometilfenil) piperazina y 033 g (170 mmol) de 1-(5-fluorobenzo[b]tiofen-
3-il)etanona Se elimina el disolvente a presioacuten reducida y se precipita el soacutelido
con hexanoeacuteter El soacutelido obtenido no es del todo puro por lo que se purifica
por cromatografiacutea flash usando como fase moacutevil diclorometanometanol (991)
Se elimina el disolvente de las fracciones adecuadas a presioacuten reducida
obtenieacutendose un aceite claro
Debido al bajo rendimiento de la reaccioacuten el aceite puro obtenido se identifica
por CCF y se usa en su totalidad para la siacutentesis del derivado hidroxiacutelico 2c
FM C22H20N2F4OS PM 4815 Apariencia Aceite incoloro Rendimiento 15
06
Descripcioacuten de Compuestos
126
Hidrocloruro de 1-(5-fluorobenzo[b]tiofen-3-il)-3-[4-(4-nitro-2-
(trifluorometilfenil)-14-diazepan-1-il]propan-1-ona
Procedimiento experimental
Seguacuten el meacutetodo general D a partir de 051 g (177 mmol) de 4-(2-nitro-4-
trifluorometilfenil) piperazina comercial y 035 g (179 mmol) de 1-(5-
fluorobenzo[b]tiofen-3-il)etanona se elimina el disolvente a presioacuten reducida y
se precipita con hexanoeacuteter etiacutelico
IR (cm-1) 2938 (d C-H alifaacuteticos) 1663 (m CO) 1449 y 1332 (mf NO2) 1281 y
1120 (m CF3)
RMN-1H (DMSO-d6 400 MHz) δ (ppm) 290-297 (m 6H H3+H5+H6 DZP)
310 (t 2H CO-CH2-CH2 JCHCH= 69 Hz) 322 (t 2H CO-CH2 JCHCH= 71 Hz)
353 (d 2H H7 DZP J76= 78 Hz) 356 (d 2H H2 DZP J23= 81 Hz) 712 (d 1H
H6acute FENIL J6acute5acute= 90 Hz) 722 (dd 1H H6 FBZT J67= 83 Hz J64= 23 Hz) 781
(dd 1H H5acute FENIL J5acute6acute= 93 Hz J5acute3acute= 28 Hz ) 820 (d 1H H7rsquo FBZT J76= 80
Hz) 841 (sa 1H H2 FBZT) 848 (d 1H H3acute FENIL J3acute5acute= 26 Hz) 850 (d 1H H4
FBTF J4F= 102 Hz)
Anaacutelisis elemental (CHN)
HPLC (RP-18 1 mLmin metanol-agua (8020)) tr 239 min ʎmax 2235 nm
Calculado Hallado
C 519lt3 5094
H 414 413
N 790 760
FM C23H21N3F4O3SHCl PM 5320 Apariencia Soacutelido amarillo
Rendimiento 80
07
Descripcioacuten de Compuestos
127
1-(5-fluorobenzo[b]tiofen-3-il)-3-[1-(4-nitro-2-
(trifluorometilfenil)piperidin-4-ilamino]propan-1-ona
Procedimiento experimental
Seguacuten el meacutetodo general D a partir de 030 g (155 mmol) de 1-(4-nitro-2-
trifluorometilfenil) piperidin-4-il amina y 033 g (172 mmol) de 1-(5-
fluorobenzo[b]tiofen-3-il) etanona se elimina el disolvente a presioacuten reducida y
se purifica el aceite impuro por cromatografiacutea flash usando como fase moacutevil
diclorometanometanol (991) Se elimina el disolvente de las fracciones
adecuadas a presioacuten reducida obtenieacutendose un aceite claro aacutembar intenso
Debido al bajo rendimiento de la reaccioacuten el intermedio obtenido se identifica
por CCF y se usa en su totalidad para la siacutentesis del derivado hidroxiacutelico 2f
FM C23H21N3F4O3S PM 4955 Apariencia Aceite aacutembar Rendimiento 20
08
Descripcioacuten de Compuestos
128
Hidrocloruro de 1-(2-naftil)-3-[4-(4-nitro-2-trifluorometilfenil)
piperazin-1-il] propan-1-ona
Procedimiento experimental
Seguacuten el meacutetodo general D partiendo de 031 g (181 mmol) de 2-acetonaftona
comercial y 050 g (181 mmol) de 4-(4-nitro-2-trifluorometilfenil) piperazina
Despueacutes de la extraccioacuten y eliminacioacuten a presioacuten reducida del disolvente se
obtiene un aceite impuro El compuesto se purifica y precipita con eacuteter saturado
de clorhiacutedrico para la obtencioacuten del hidrocloruro
Punto de fusioacuten 181-183ordmC
IR (cm-1) 2922-2844 (d C-H alifaacuteticos) 1680 (mf CO) 1521 y 1347 (mf NO2)
1279 y 1151 (m CF3)
RMN-1H (DMSO-d6 400 MHz) δ (ppm) 321 (d 2H H3ax+H5ax PIPZ) 327 (d
2H H3ec+H5ec PIPZ) 364 (sa 2H H2ax+H6ax PIPZ) 367 (sa 2H H2ec+H6ec PIPZ)
390 (t 2H CO-CH2-CH2 JCH-CH= 118 Hz) 403 (t 2H CO-CH2 JCH-CH= 64 Hz)
765-759 (m 3H H6+H7 NFT+H6acute FENIL) 792 (d 1H H4 NFT J43= 79 Hz)
795 (d 1H H5 NFT J56= 87 Hz) 804 (d 1H H8 NFT J87= 83 Hz) 806 (d 1H
H3 NFT J34= 79 Hz) 846 (dd 1H H5acute FENIL J5acute6acute= 88 Hz J5acute3acute= 25 Hz) 858
(d 1H H3acute FENIL J3acute5acute= 25 Hz) 862 (sa 1H H1 NFT)
Anaacutelisis elemental (CHN)
HPLC (RP-18 1 mLmin metanol-agua (8020)) tr 252 min ʎmax 2134 nm
Calculado Hallado
C 5434 5410
H 434 455
N 790 765
FM C24H22N3F3O3HCl PM 4940 Apariencia Soacutelido beige Rendimiento 17
09
Descripcioacuten de Compuestos
129
Hidrocloruro de 1-(2-naftil)-3-[4-(2-nitro-4-
trifluorometilfenil)piperazin-1-il]propan-1-ona
Procedimiento experimental
Seguacuten el meacutetodo general D partiendo de 062 g (363 mmol) de 2-acetonaftona
comercial y 100 g (363 mmol) de 4-(2-nitro-4-trifluorometilfenil) piperazina
Despueacutes de extraer y eliminar a presioacuten reducida el disolvente se obtiene un
aceite impuro El compuesto se purifica y precipita con eacuteter saturado de
clorhiacutedrico para la obtencioacuten del hidrocloruro
Punto de fusioacuten 152ndash153 ordmC
IR (cm-1) 2953-2838 (md C-H alifaacuteticos) 1672 (mf CO) 1535 y 1329 (mf NO2)
1278 y 1169 (m CF3)
RMN-1H (DMSO-d6 400 MHz) δ (ppm) 324ndash331 (m 2H CO-CH2-CH2)
345ndash361(m 6H H3+H5+H2ax+H2ax PIPZ) 371 (d 2H H2ec+H6ec PIPZ Jec-ax=
1148 Hz) 387 (t 2H CO-CH2 JCH-CH= 111 Hz) 756 (d 1H H6acute FENIL J6acute5acute=
87 Hz) 767 (ddd 1H H6 NFT J65= 82 Hz J67= 68 Hz J68= 13 Hz) 771 (ddd
1H H7 NFT J78= 83 Hz J76= 71 Hz J75= 13 Hz) 797 (dd 1H H5acute FENIL J5acute6acute=
89 Hz) 803 (d 1H H4 NFT J43= 84 Hz) 804 (d 1H H5 NFT J56= 85 Hz) 808
(d 1H H8 NFT J87= 85 Hz) 815 (d 1H H3 NFT J34= 80 Hz) 828 (d 1H H3acute
FENIL J3acute5acute= 13 Hz) 877 (sa 1H H1 NFT) 1135 (sa 1H HCl)
Anaacutelisis elemental (CHN)
HPLC (RP-18 1 mLmin metanol-agua (8020)) tr 528 min ʎmax 2475 nm
Calculado Hallado
C 5836 5842
H 466 471
N 850 843
FM C24H22N3F3O3HCl PM 4940 Apariencia Soacutelido amarillo Rendimiento 41
010
Descripcioacuten de Compuestos
130
Hidrocloruro de 1-(2-naftil)-3-[1-(4-nitro-2-
trifluorometilfenil)pirrolidin-3-ilamino]propan-1-ona
Procedimiento experimental
Seguacuten el meacutetodo general D partiendo de 067 g (394 mmol) de 2-acetonaftona y
095 g de 1-(4-nitro-2-(trifluorometilfenil)-(S)-pirrolidin-3-amina Despueacutes de
extraer con acetato de etilo y eliminar a presioacuten reducida el disolvente se
obtiene un soacutelido fino que se lava con eacuteter
Punto de fusioacuten 170-171ordmC
IR (cm-1) 2942-2716 (m C-H alifaacuteticos) 1681 (m CO) 1504 y 1324 (mf NO2)
1285 y 1121 (m CF3)
RMN-1H (DMSO-d6 400 MHz) δ (ppm) 238 (dd 1H H4ec PIRR) 245 (dd 1H
H4ax PIRR) 342 (d 2H CO-CH2-CH2) 364 (dd 1H H2ec PIRR) 375 (t 2H CO-
CH2) 381- 386 (m 2H H5ec+ H2ax PIRR) 394 (dd 1H H5ax PIRR) 408 (s 1H
H3 PIRR) 712 (d 1H H6acute FENIL J6acute5acute= 96 Hz) 765 (dd 1H H6 NFT J67= 78
Hz J65= 68 Hz) 769 (dd 1H H7 NFT J78= 83 Hz J76= 78 Hz) 800 (d 1H H4
NFT J43= 65 Hz) 802 (d 1H H3 NFT J34= 65 Hz) 806 (d 1H H5acute FENIL
J5acute6acute= 86 Hz) 816 (d 1H H5 NFT J56= 68 Hz) 825 (d 1H H8 NFT J87= 84
Hz) 839 (sa 1H H3acute FENIL) 869 (sa 1H H1 NFT) 980 (sa 2H NH+ HCl)
Anaacutelisis elemental (CHN)
HPLC (RP-18 1 mLmin metanol-agua (8020)) 25 min ʎmax= 2141 nm
Calculado Hallado
C 5836 5794
H 466 475
N 851 837
FM C24H22N3F3O3HCl PM 4935 Apariencia Soacutelido anaranjado
Rendimiento 38
011
Descripcioacuten de Compuestos
131
3-[4-(4-fluorofenil)-36-dihidropiridin-1(2H)-il]-1-(naftalen-2-
il)propan-1-ona
Procedimiento experimental
Seguacuten el meacutetodo general D a partir de 082 g (463 mmol) de 4-(4-fluorofenil)-
1236-tetrahidropiridina y 070 g (411 mmol) de 2-acetonaftona Se elimina el
disolvente a presioacuten reducida y se precipita el soacutelido con eacuteter El soacutelido
obtenido se purifica por cromatografiacutea flash usando como fase moacutevil
diclorometanometanol (991) Se elimina el disolvente de las fracciones
adecuadas a presioacuten reducida obtenieacutendose un soacutelido
Punto de fusioacuten 172ndash175 ordmC
IR (cm-1) 2780-2775 (d C-H alifaacuteticos) 1677 (f CO) 1510 (f C=C)
RMN-1H (CDCl3 400 MHz) δ (ppm) 161 (sa 2H H6 PIRD) 214 (sa 2H H2
PIRD) 272 (sa 2H CO-CH2-CH2) 292-299 (m 2H H5 PIRD) 345 (d 2H CO-
CH2) 602 (sa 1H H3 PIRD) 705 (t 2H H3rsquo+ H5rsquo FENIL J3acute2acute= J5acute6acute= 86 Hz)
735 (d 1H H6acute FENIL J6acute5acute= 86 Hz) 739 (sa 1H H2acute FENIL) 748-751 (m 3H
H5+H6+H7 NFT) 784-786 (m 3H H3+H4+H8 NFT) 791 (s 1H H1 NFT)
Anaacutelisis elemental (CHN)
HPLC (RP-18 1 mLmin metanol-agua (8020)) tr 557 min ʎmax 2455 nm
Calculado Hallado
C 7182 7125
H 581 573
N 354 350
FM C24H22NFO PM 3595 Apariencia Soacutelido beige Rendimiento 24
012
Descripcioacuten de Compuestos
132
3-[4-(4-fluorofenil)-36-dihidropiridin-1(2H)-il]-1-(4-
trifluorometilfenil)propan-1-ona
Procedimiento experimental
Seguacuten el meacutetodo general D a partir de 054 g (293 mmol) de 4-(4-fluorofenil)-
1236-tetrahidropiridina y 052 g (276 mmol) de 1-(4-trifluorometilfenil)
etanona se elimina el disolvente a presioacuten reducida y el aceite se purifica por
cromatografiacutea flash usando como fase moacutevil diclorometanometanol (991) Se
elimina el disolvente de las fracciones adecuadas a presioacuten reducida obteniendo
el compuesto puro
RMN-1H (DMSO-d6 400 MHz) δ (ppm) 284 (sa 2H H6 PIRD) 355 (t 2H H2
PIRD) 382 (t 4H CO-CH2 +CO-CH2-CH2) 406 (sa 2H H5 PIRD) 621 (sa 1H
H3 PIRD) 723 (t 2H H2+ H6 TFBZN J23= J65= 88 Hz) 756 (dd 2H H3acute+ H5acute
FENIL J3acute2acute= J5acute6acute= 87 Hz J3acute5acute= J5acute3acute= 54 Hz) 797 (d 2H H2acute+ H6acute FENIL J2acute3acute=
J6acute5acute= 83 Hz) 823 (d 2H H3+H5 TFBZN J32= J56= 86 Hz)
FM C21H19NF4O
PM 3774 Apariencia Aceite beige Rendimiento 13
013
Descripcioacuten de Compuestos
133
1-(2-naftil)-2-[4-(4-nitro-2-trifluorometilfenil)piperazin-1-il]etan-1-
ona
Procedimiento experimental
Seguacuten el meacutetodo general C a partir de 070 g (254 mmol) de 4-(4-nitro-2-
trifluorometilfenil) piperazina y 053 g (211 mmol) de 2-bromo-2acute-acetonaftona
Se elimina el disolvente a presioacuten reducida obteniendo un aceite que se purifica
por columna cromatograacutefica usando como fase moacutevil diclorometanometanol
(973) Se elimina el disolvente de las fracciones adecuadas a presioacuten reducida
obteniendo compuesto puro en forma soacutelida
Punto de fusioacuten 167-168ordmC
IR (cm-1) 2925-2873 (d C-H alifaacuteticos) 1669 (mf CO) 1499 y 1334 (mf NO2)
1281 y 1124 (m CF3)
RMN-1H (DMSO-d6 400 MHz) δ (ppm) 309 (sa 4H H2+H6 PIPZ) 336 (sa
4H H3+H5 PIPZ) 428 (sa 2H COCH2) 739 (d 1H H6acute FENIL J6acute5acute= 88 Hz)
760-765 (m 1H H6 NFT) 766-771 (m 1H H7 NFT) 792 (d 1H H3 NFT J34=
81 Hz) 794 (d 1H H5acute FENIL J5acute6acute= 89 Hz) 800 (d 1H H4 NFT J43= 81 Hz)
805 (dd 1H H5 NFT J56= 85 Hz J57= 12 Hz) 837 (dd 1H H8 NFT J87= 90
Hz J86= 19 Hz) 856 (sa 2H H2 NFT+ H3acute FENIL)
Anaacutelisis elemental (CHN)
HPLC (RP-18 1 mLmin metanol-agua (8020)) tr 69 min ʎmax 2477 nm
Calculado Hallado
C 6225 602
H 451 421
N 948 925
FM C23H20N3F3O3 PM 4434 Apariencia Soacutelido beige Rendimiento 13
014
Descripcioacuten de Compuestos
134
1-(2-naftil)-2-[4-(2-nitro-4-trifluorometilfenil)piperazin-1-il]etan-1-
ona
Procedimiento experimental
Seguacuten el meacutetodo general C a partir de 135 g (481 mmol) de 4-(2-nitro-4-
trifluorometilfenil) piperazina y 104 g (417 mmol) de 2-bromo-2acute-acetonaftona
Se elimina el disolvente a presioacuten reducida obteniendo un aceite que se
precipita con una mezcla de hexanoeacuteter etiacutelico en frio
Punto de Fusioacuten 105-106ordmC
IR (cm-1) 2943-2854 (d alifaacuteticos) 1686 (f CO) 1532 y 1329 (m NO2) 1295 y
1118 (m CF3)
RMN-1H (CDCl3 400 MHz) δ (ppm) 290 (t 4H H3+H5 PIPZ) 331 (t 4H
H2+H6 PIPZ) 410 (sa 2H CO-CH2) 721 (d 1H H6acute FENIL J6acute5acute= 86 Hz) 760
(dd 1H H7 NFT J78= 85 Hz J75= 84 Hz) 764 (dd 1H H4 NFT J43= 81 Hz
J45= 14 Hz) 769 (ddd 1H H6 NFT J65= 95 Hz J67= 84 Hz J68= 16 Hz) 791
(d 1H H5 NFT J56= 95 Hz) 794 (d 1H H8 NFT J87= 84 Hz) 800 (d 1H H3
NFT J34= 81 Hz) 806 (dd 1H H5acute FENIL J5acute6acute= 86 Hz J5acute3acute= 16 Hz) 809 (d
1H H3acute FENIL J3acute5acute= 16 Hz) 856 (sa 1H H1 NFT)
Anaacutelisis elemental (CHN)
Calculado Hallado
C 6230 6173
H 451 481
N 948 933
FM C23H20N3F3O3 PM 44340 Apariencia Soacutelido naranja Rendimiento 60
015
Descripcioacuten de Compuestos
135
1-(4-fluoronaftil)-3-[4-(4-nitro-2-trifluorometilfenil)piperazin-1-
il]propan-1-ona
Procedimiento experimental
Seguacuten el meacutetodo general D a partir de 063 g (229 mmol) de 4-(4-nitro-2-
trifluorometilfenil) piperazina y 056 g (299 mmol) de 4acute-fluoro-1acute-acetonaftona
comercial se elimina el disolvente a presioacuten reducida obteniendo un aceite que
se purifica por cromatografiacutea flash usando como fase moacutevil
diclorometanometanol (955) Se elimina el disolvente de las fracciones
adecuadas a presioacuten reducida obtenieacutendose el compuesto en forma de aceite
que se usa en su totalidad despueacutes de su identificacioacuten por CCF para la siacutentesis
del derivado hidroxiacutelico 5a
FM C24H21N3F4O3 PM 4754 Apariencia Aceite amarillo Rendimiento 53
016
Descripcioacuten de Compuestos
136
1-(4-fluoronaftil)-3-[4-(2-nitro-4-trifluorometilfenil) piperazin-1-il]
propan-1-ona
Procedimiento experimental
Seguacuten el meacutetodo general D partiendo de 144 g (523 mmol) de 4-(2-nitro-4-
trifluorometilfenil) piperazina y 098 g (522 mmol) de 4acute-fluoro-1acute-acetonaftona
comercial Despueacutes de extraer y eliminar a presioacuten reducida el disolvente se
obtiene un aceite que al antildeadir hexano friacuteo precipita el compuesto puro como
soacutelido fino
Punto de fusioacuten 106ndash107 ordmC
IR (cm-1) 2924-2854 (f C-H alifaacuteticos) 1675 (mf CO) 1531 y 1326 (m NO2)
1278 y 1123 (m CF3)
RMN-1H (DMSO 400 MHz) δ (ppm) 270 (sa 4H H3+H5 PIPZ) 304 (sa 2H
CO-CH2-CH2) 319 (sa 4H H2+H6 PIPZ) 335 (sa 2H CO-CH2) 717 (d 1H H6acute
FENIL J6acute5acute= 88 Hz) 720 (dd 1H H7 FNFT J78= 90 Hz J76= 80 Hz) 763 (ddd
1H H6 FNFT) 768 (dd 1H H5acute FENIL J5acute6acute= 88 Hz J5acute3acute= 16 Hz) 769 (dd 1H
H5 FNFT J56= 73 Hz J5F= 27 Hz) 794 (dd 1H H3 FNFT J32= 79 Hz J3F= 54
Hz) 807 (d 1H H3acute FENIL J3acute5acute= 15 Hz) 819 (d 1H H2 FNFT J23= 79 Hz)
873 (d 1H H8 FNFT J87= 90 Hz)
Anaacutelisis elemental (CHN)
HPLC (RP-18 1 mLmin metanol-agua (8020)) 243 min ʎmax= 2200 nm
Calculado Hallado
C 6063 6100
H 442 459
N 884 867
FM C24H21N3F4O3 PM 4754 Apariencia Soacutelido anaranjado Rendimiento 73
017
Descripcioacuten de Compuestos
137
1-(4-fluoronaft-1-il)-3-[4-(4-trifluorometilfenil)piperazin-1-
il]propan-1-ona
Procedimiento experimental
Seguacuten el meacutetodo general D a partir de 037 g (187 mmol) de 4-(4-
trifluorometilfenil) piperazina y 032 g (169 mmol) de 4acute-fluoro-1acute-acetonaftona
se elimina el disolvente a presioacuten reducida y precipita un soacutelido impuro con
hexanoeacuteter Se purifica por cromatografiacutea flash usando como fase moacutevil
diclorometanometanol (991) y se elimina el disolvente de las fracciones
adecuadas a presioacuten reducida obtenieacutendose el compuesto en forma de aceite
que despueacutes de su identificacioacuten por CCF se usa en su totalidad para la siacutentesis
del derivado hidroxiacutelico 5c
FM C24H22N2F4O PM 4305 Apariencia Aceite beige Rendimiento 23
018
Descripcioacuten de Compuestos
138
1-(4-fluoronaft-1-il)-3-[1-(4-nitro-2-trifluorometilfenil)piperidin-4-
ilamino]propan-1-ona
Procedimiento experimental
Seguacuten el meacutetodo general D a partir de 085 g (293 mmol) de 1-(4-nitro-2-
trifluorometilfenil)piperidin-4-il amina y 100 g (531 mmol) de 4acute-fluoro-1acute-
acetonaftona Se elimina el disolvente a presioacuten reducida y se purifica el aceite
impuro por cromatografiacutea flash usando como fase moacutevil
diclorometanometanol (991) Se elimina el disolvente de las fracciones
adecuadas a presioacuten reducida obtenieacutendose un soacutelido amarillo
IR (cm-1) 2950-2732 (d C-H alifaacuteticos) 1673 (mf CO) 1508 y 1334 (m NO2)
1284 y 1119 (m CF3)
RMN-1H (DMSO 400 MHz) δ (ppm) 180 (d 2H H3ax+ H5ax PIPR J3ax5ax=
J5ax3ax= 116 Hz) 224 (d 2H H3ec+H5ec PIPR J3ec5ec= J5ec3ec= 116 Hz) 300 (t 2H
CO-CH2-CH2 JCHCH= 118 Hz) 336-343 (m 5H H2+H4+H6 PIPR) 366 (t 2H
CO-CH2 JCHCH= 62 Hz) 753 (ddd 1H H3 FNFT J3F= 106 Hz J32= 85 Hz J35=
157 Hz) 760 (d 1H H6acute FENIL J6acute5acute= 89 Hz) 774 (ddd 1H H6 FNFT J65= 79
Hz J67= 69 Hz J68= 12 Hz) 779 (ddd 1H H7 FNFT J78= 85 Hz J76= 70 Hz
J75= 14 Hz) 818 (d 1H H2 FNFT J23= 81 Hz) 826 (dd 1H H5 FNFT J56= 74
Hz J5F= 56 Hz J57= 14 Hz) 840 (d 1H H3acute FENIL J3acute5acute= 24 Hz ) 844 (dd 1H
H5acute FENIL J5acute6acute= 87 Hz J5acute3acute= 26 Hz) 880 (d 1H H8 FNFT J87= 83 Hz)
FM C25H23N3F4O3 PM 4895 Apariencia Soacutelido amarillo Rendimiento 52
019
Descripcioacuten de Compuestos
139
1-(4-fluoronaft-1-il)-3-[4-(4-fluorofenil)-36-dihidropiridin-1(2H)-
il]propan-1-ona
Procedimiento experimental
Seguacuten el meacutetodo general D a partir de 143 g (669 mmol) de 4-(4-fluorofenil)-
1236-tetrahidropiridina y 097 g (518 mmol) de 4acute-fluoro-1acute-acetonaftona Se
elimina el disolvente a presioacuten reducida y el aceite se purifica por cromatografiacutea
flash usando como fase moacutevil diclorometanometanol (955) Se elimina el
disolvente de las fracciones adecuadas a presioacuten reducida obteniendo un soacutelido
puro
Punto de fusioacuten 127-128ordmC
IR (cm-1) 2536 (d C-H alifaacuteticos) 1672 (f CO)
RMN-1H (DMSO-d6 400 MHz) δ (ppm) 263 (s 2H H5 PIRD) 314-335 (m
6H H2+ H6 PIRD+ CO-CH2-CH2) 361 (s 2H CO-CH2) 616 (s 1H H3 PIRD)
719 (t 2H H3acute+ H5acute FENIL J3acute2acute= J6acute5acute= 89 Hz) 749 (d 1H H3 FNFT J32= 80
Hz) 751 (d 2H H2acute+H6acute FENIL J2acute3acute= J6acute5acute= 87 Hz) 773 (t 2H H6+H7 FNFT
J67= J76= 71 Hz) 815 (d 1H H5 FNFT J56= 75 Hz) 828 (dd 1H H2 FNFT J23=
78 Hz J2F= 43 Hz) 868 (d 1H H8 FNFT J87= 81 Hz)
FM C24H21NF2O
PM 3775 Apariencia Soacutelido blanco Rendimiento 44
020
Descripcioacuten de Compuestos
140
1-(4-fluorofenil)-3-[4-(4-nitro-2-trifluorometilfenil) piperazin-1-il]
propan-1-ona
Procedimiento experimental
Seguacuten el meacutetodo general D a partir de 026 g (093 mmol) de 4-(4-nitro-2-
trifluorometilfenil) piperazina y 025 g (180 mmol) de 1-(4-fluorofenil) etanona
se elimina el disolvente a presioacuten reducida obtenieacutendose un aceite que se
purifica por cromatografiacutea flash usando como fase moacutevil
diclorometanometanol (991) Se elimina el disolvente de las fracciones
adecuadas a presioacuten reducida obteniendo el compuesto en forma de aceite que
se usa en su totalidad despueacutes de su identificacioacuten por CCF para la siacutentesis del
derivado hidroxiacutelico 6a
FM C20H19N3F4O3 PM 4254 Apariencia Aceite amarillo Rendimiento 63
021
Descripcioacuten de Compuestos
141
1-(4-fluorofenil)-3-[1-(4-nitro-2-trifluorometilfenil)piperidin-4-il-
amino]propan-1-ona
Procedimiento experimental
Seguacuten el meacutetodo general D a partir de 025 g (853 mmol) de 1-(4-nitro-2-
trifluorometilfenil) piperidin-4-il amina y 022 g (160 mmol) de 1-(4-
fluorofenil)etanona Se elimina el disolvente a presioacuten reducida y se purifica el
aceite impuro por cromatografiacutea flash usando como fase moacutevil
diclorometanometanol (991) Se elimina el disolvente de las fracciones
adecuadas a presioacuten reducida obtenieacutendose un aceite
RMN-1H (DMSO-d6 400 MHz) δ (ppm) 250 (sa 1H H4 PIPR) 263-256 (m
4H H3+ H5 PIPR) 275 (t 2H CO-CH2-CH2) 314-309 (m 4H H2 +H6 PIPR)
324 (t 2H CO-CH2) 736 (t 2H H2 +H6 FBZN J23= J65=80 Hz) 754 (d 1H H6acute
FENIL J6acute5acute= 79 Hz) 808 (d 1H H5 FBZN J56= 79 Hz) 810 (d 1H H3 FBZN
J32= 76 Hz) 838 (s 1H H3acute FENIL) 839 (sa 1H H5acute FENIL)
FM C21H21N3F4O3 PM 4394 Apariencia Aceite amarillo Rendimiento 12
022
Descripcioacuten de Compuestos
142
1-(4-fluorofenil)-3-[4-(4-fluorofenil)-36-dihidropiridin-1(2H)-il]
propan-1-ona
Procedimiento experimental
Seguacuten el meacutetodo general D a partir de 050 g (288 mmol) de 4-(4-fluorofenil)-
1236-tetrahidropiridina y 034 g (245 mmol) de 1-(4-fluorofenil)etanona Se
elimina el disolvente a presioacuten reducida y el aceite se purifica por cromatografiacutea
flash usando como fase moacutevil diclorometanometanol (991) Se elimina el
disolvente de las fracciones adecuadas a presioacuten reducida obteniendo un aceite
amarillo
Despueacutes de identificar el compuesto por CCF debido al bajo rendimiento se usa
todo el aceite obtenido para la siacutentesis del derivado hidroxiacutelico 6g
FM C20H19NF2O
PM 32740 Apariencia Aceite amarillo Rendimiento 10
023
Descripcioacuten de Compuestos
143
X3 Siacutentesis de derivados hidroxiacutelicos
1-(benzo[b]tiofen-3-il)-3-[4-(4-nitro-2-
trifluorometilfenil)piperazin-1-il] propan-1-ol
Procedimiento experimental
Seguacuten el meacutetodo general E partiendo de 050 g (107 mmol) de 1-
(benzo[b]tiofen-3-il)-3-[4-(4-nitro-2-trifluorometilfenil)piperazin-1-il]propan-1-
ona se obtiene tras la eliminacioacuten del disolvente un soacutelido que se purifica por
columna cromatograacutefica de fase moacutevil diclorometanometanol (991) y se
obtiene el compuesto puro
Punto de fusioacuten 157ndash158 ordmC
IR (cm-1) 3365 (m OH) 2998-2830 (m C-H alifaacuteticos) 1524 y 1349 (mf NO2)
1282 y 1128 (f CF3)
RMN-1H (CDCl3 400 MHz) δ (ppm) 214-216 (m 2H CHOH-CH2) 277-287
(m 6H CHOH-CH2-CH2+H3+H5 PIPZ) 320-329 (m 4H H2 +H6 PIPZ) 538
(dd 1H CHOH) 733-742 (m 3H H6rsquo FENIL +H6+H5 BZT) 745 (s 1H H2
BZT) 782 (d 1H H4 BZT J45 = 84 Hz) 788 (d 1H H7 BZT J76= 80 Hz) 837
(dd 1H H5rsquo FENIL J5rsquo6rsquo = 92 Hz J5rsquo3rsquo = 28 Hz) 855 (d 1H H3rsquo FENIL)
Anaacutelisis elemental (CHN)
HPLC (RP-18 1 mLmin metanol-agua (8020)) 54 min ʎmax= 2281 nm
Calculado Hallado
C 5677 5701
H 473 485
N 903 853
FM C22H22N3F3O3S PM 4655 Apariencia Soacutelido amarillo Rendimiento 13
1a
Descripcioacuten de Compuestos
144
Hidrocloruro de 1-(benzo[b]tiofen-3-il)-3-[4-(2-nitro-4-
trifluorometilfenil)piperazin-1-il]propan-1-ol
Procedimiento experimental
Seguacuten el meacutetodo general E se parte de 041 g (082 mmol) de 1-(benzo[b]tiofen-
3-il)-3-[4-(2-nitro-4-trifluorometilfenil)piperazin-1-il]propan-1-ona Tras la
eliminacioacuten del disolvente se obtiene un aceite impuro que se purifica por
cromatografiacutea flash con diclorometanometanol (991) El aceite puro precipita
con eacuteter clorhiacutedrico como hidrocloruro
Punto de fusioacuten 176-178ordmC
IR (cm-1) 3185 (d OH) 2924-2851 (f C-H alifaacuteticos) 1509 y 1346 (mf NO2) 1279
y 1119 (f CF3)
RMN-1H (DMSO-d6 400 MHz) δ (ppm) 223ndash232 (m 2H CHOH-CH2) 317
(sa 2H CHOH-CH2-CH2) 335 (sa 2H H3ax+H5ax PIPZ) 349 (sa 4H
H2ax+H6ax+ H3ec+H5ec PIPZ) 359 (d 2H H2ec+H6ec PIPZ) 501 (m 1H CH-OH)
743ndash736 (m 2H H5+H6 BZT) 754 (d 1H H6acute FENIL J6acute5acute = 80 Hz) 764 (sa
1H H2 BZT) 794 (dd 1H H5acute FENIL J5acute6acute = 81 Hz J5acute3acute = 16 Hz) 798-801 (m
2H H7+ H4 BZT) 825 (sa 1H H3acute FENIL) 1111 (sa 1H HCl)
Anaacutelisis elemental (CHN)
HPLC (RP-18 1 mLmin metanol-agua (8020)) 433 min ʎmax= 2290 nm
Calculado Hallado
C 5264 5253
H 439 428
N 838 826
FM C22H22N3F3O3SHCl PM 502 Apariencia Soacutelido camel Rendimiento 16
1b
Descripcioacuten de Compuestos
145
Hidrocloruro de 1-(benzo[b]tiofen-3-il)-3-[4-(4-fluorofenil)-36-
dihidropiridin-1(2H)-il)propan-1-ol
Procedimiento experimental
Seguacuten el meacutetodo general E partiendo de 015 g (041 mmol) de 1-
(benzo[b]tiofen-3-il)-3-[4-(4-fluorofenil)-36-dihidropiridin-1(2H)-il] propan-1-
ona Despueacutes se elimina el disolvente y se obtiene un soacutelido impuro que se
purifica precipitando el hidrocloruro con eacuteter clorhiacutedrico
Punto fusioacuten 204-206ordmC
IR (cm-1) 3385 (d OH) 2924-2851 (f C-H alifaacuteticos)
RMN-1H (DMSO 400 MHz) δ (ppm) 229-30 (m 2H CHOH-CH2) 274- 281
(m 2H CHOH-CH2-CH2) 337-340 (m 2H H6 PIRD) 366-377 (m 3H
H2+H5ax PIRD) 40 (d 1H H5ec PIRD) 509 (sa 1H CHOH) 620 (s 1H H3
PIRD) 723 (d 2H H3rsquo+ H5rsquo FENIL J3acute2acute= J5acute6acute= 90 Hz) 738-74 (m 2H H2rsquo+ H6rsquo
FENIL) 750 (dd 2H H6+H5 BTF J65= J56= 80 Hz J54= J67= 71 Hz) 760 (s 1H
H2 BTF) 800 (dd 2H H4 +H7 BTF J45= J76= 70 Hz J6= J75= 18 Hz) 105 (sa
1H HCl)
Anaacutelisis elemental (CHN)
HPLC (RP-18 1 mLmin metanol-agua (8020)) tr 426 min ʎmax 2282 nm
Calculado Hallado
C 640 6389
H 551 575
N 339 325
FM C22H22NFOSHCl PM 4405 Apariencia Soacutelido blanco
Rendimiento 65
1g
Descripcioacuten de Compuestos
146
1-(5-fluorobenzo[b]tiofen-3-il)-3-[4-(4-nitro-2-
trifluorometilfenil)piperazin-1-il]propan-1-ol
Procedimiento experimental
Seguacuten el meacutetodo general E partiendo de 040 g (092 mmol) de 1-(5-
fluorobenzo[b]tiofen-3-il)-3-[4-(4-nitro-2-trifluorometilfenil)piperazin-1-
il]propan-1-ona Despueacutes de eliminar el disolvente se obtiene un soacutelido marroacuten
impuro que purificamos por cromatografiacutea flash en diclorometanometanol
(991)
Punto fusioacuten 140-142ordmC
IR (cm-1) 3426 (d OH) 2826 (d C-H alifaacuteticos) 1507 y 1329 (mf NO2) 1283 (mf
F-BZT)1240 y 1122 (f CF3)
RMN-1H (CDCl3 400 MHz) δ (ppm) 206-215 (m 2H CHOH-CH2) 274-283
(sa 3H H3ax+H5ax PIPZ+ CHOH-CH2-CH2) 292-386 (m 3H H3ec+H5ec PIPZ+
CHOH-CH2-CH2) 324 (t 4H H2+H6 PIPZ) 530 (dd 1H CHOH JCH-OH = 74
Hz JCH-CH = 39 Hz) 713 (dt 1H H6 FBZT J67 = 87 Hz J6F = 83 Hz J64 = 25
Hz) 735 (d 1H H6acute FENIL J6acute5acute= 90 Hz) 752 (dd 1H H4 FBZT J4F = 95 Hz J46
= 28 Hz) 751 (s 1H H2 FBZT) 780 (dd 1H H7 FBZT J76 = 88 Hz J7F = 49
Hz) 838 (dd 1H H5rsquo FENIL J5acute6acute = 89 Hz J5acute3acute = 27 Hz) 855 (d 1H H3rsquo FENIL
J3acute5acute = 27 Hz)
Anaacutelisis elemental (CHN)
HPLC (RP-18 1 mLmin metanol-agua (8020)) 554 min ʎmax= 2283 nm
Calculado Hallado
C 5446 5483
H 434 444
N 869 920
FM C22H21N3F4O3S PM 4835 Apariencia Soacutelido amarillo Rendimiento 21
2a
Descripcioacuten de Compuestos
147
Hidrocloruro de 1-(5-fluorobenzo[b]tiofen-3-il)-3-[4-(2-nitro-4-
trifluorometilfenil)piperazin-1-il]propan-1-ol
Procedimiento experimental
Seguacuten el meacutetodo general E partiendo de 031 g (086 mmol) de 1-(5-
fluorobenzo[b]tiofen-3-il)-3-[4-(2-nitro-4-trifluorometilfenil)piperazin-1-
il]propan-1-ona se obtiene tras la eliminacioacuten del disolvente un aceite impuro
que se purifica por cromatografiacutea flash con diclorometanometanol (991) El
aceite puro precipita como hidrocloruro con eacuteter clorhiacutedrico
Punto de fusioacuten 196-198ordmC
IR (cm-1) 3408 (d OH) 2968-2814 (d C-H alifaacuteticos) 1533 y 1329 (mf NO2)
1230 y 1112 (f CF3)
RMN-1H (DMSO-d6 400 MHz) δ (ppm) 206 (sa 2H CHOH-CH2) 292 (sa
4H H2+H6 PIPZ) 324 (sa 4H H3+H5 PIPZ) 37 (sa 2H CHOH-CH2-CH2) 50
(sa 1H CHOH) 726 (dt 1H H6 FBZT J6F = 91 Hz J67 = 88 Hz J64 = 22 Hz)
749 (d 1H H6acute FENIL J6acute5acute= 85 Hz) 772 (s 1H H2 FBZT) 777 (d 1H H4
FBZT J4F = 102 Hz) 790 (d 1H H5acute FENIL J5acute6acute = 84 Hz) 802 (dd 1H H7
FBZT J76 = 89 Hz J7F = 51 Hz ) 820 (s 1H H3acute FENIL)
Anaacutelisis elemental (CHN)
HPLC (RP-18 1 mLmin metanol-agua (8020)) 445 min ʎmax=2308 nm
Calculado Hallado
C 5081 5121
H 423 375
N 808 811
FM C22H21N3F4O3S HCl PM 5195 Apariencia Soacutelido amarillo Rendimiento 20
2b
Descripcioacuten de Compuestos
148
1-(5-fluorobenzo[b]tiofen-3-il)-3-[4-(4-
trifluorometilfenil)piperazin-1-il]propan-1-ol
Procedimiento experimental
Seguacuten el meacutetodo general E partiendo de 053 g de 1-(5-fluorobenzo[b]tiofen-3-
il)-3-[4-(4-trifluorometilfenil)piperazin-1-il]propan-1-ona se obtiene en la
eliminacioacuten del disolvente un aceite impuro que se purifica por cromatografiacutea
flash con diclorometanometanol (991)
Punto de fusioacuten 158-160ordmC
IR (cm-1) 2961-2831 (d C-H alifaacuteticos) 1248 y 1115 (f CF3)
RMN-1H (CDCl3 400 MHz) δ (ppm) 221 (sa 2H CHOH-CH2) 282 (sa 3H
H3ax+H5ax PIPZ +CHOH-CH2-CH2) 293-294 (m 3H H3ec+H5ec PIPZ + CHOH-
CH2-CH2) 345 (sa 4H H2+H6 PIPZ) 532 (dd 1H CHOH JCH-OH = 41 Hz JCH-
CH = 67 Hz) 696 (d 2H H6+H7 FBZT J67 = J76 = 84 Hz) 710-715 (m 1H H4
FBZT) 750-754 (m 4H H2acute+H3acute+H5acute+H6acute FENIL) 780 (sa 1H H2 FBZT)
Anaacutelisis elemental (CHN)
HPLC (RP-18 1 mLmin metanol-agua (8020)) tr 466 min ʎmax 2005 nm
Calculado Hallado
C 6027 5930
H 502 495
N 639 624
FM C22H22N2F4OS
PM 4385 Apariencia Soacutelido blanco Rendimiento 15
2c
Descripcioacuten de Compuestos
149
1-(5-fluorobenzo[b]tiofen-3-il)-3-[4-(4-nitro-2-trifluorometilfenil)-
14-diazepan-1-il]propan-1-ol
Procedimiento experimental
Seguacuten el meacutetodo general E partiendo de 039 g (080 mmol) de 1-(5-
fluorobenzo[b]tiofen-3-il)-3-[4-(4-nitro-2-trifluorometilfenil)-14-diazepan-1-
il]propan-1-ona se obtiene tras la eliminacioacuten del disolvente un aceite impuro
que se purifica por cromatografiacutea flash en diclorometanometanol (991)
Punto de fusioacuten 110-111ordmC
IR (cm-1) 3425 (m OH) 1500 y 1338 (mf NO2) 1280 (mf F-BZT)1257 y 1106 (f
CF3)
RMN-1H (CDCl3 400 MHz) δ (ppm) 208 (sa 4H CHOH-CH2+H6 DZP) 287-
293 (m 4H H2+H7 DZP) 298-299 (m 2H CHOH-CH2-CH2) 354 (sa 2H H5
DZP) 562 (sa 2H H3 DZP) 530 (t 1H CHOH JCH-OH = JCH-CH = 57 Hz) 712
(dd 1H H7 BZT J76= 88 Hz J7F= 24 Hz) 722 (d 1H H6acute FENIL J65acuteacute= 92 Hz)
750 (s 1H H2 FBZT) 751 (dd 1H H4 FBZT J4F= 98 Hz J46= 15 Hz) 780 (dd
1H H6 FBZT J67= 88 Hz J6F= 50 Hz) 828 (dd 1H H5acute FENIL J5acute6acute= 92 Hz
J5acute3acute= 27 Hz) 854 (s 1H H3acute FENIL)
Anaacutelisis elemental (CHN)
HPLC (RP-18 1 mLmin metanol-agua (8020)) 557 min ʎmax= 2308 nm
Calculado Hallado
C 5548 5515
H 462 464
N 844 826
FM C23H23N3O3F4S PM 4975 Apariencia Soacutelido amarillo Rendimiento 25
2d
Descripcioacuten de Compuestos
150
1-(5-fluorobenzo[b]tiofen-3-il)-3-[1-(4-nitro-2-
trifluorometilfenil)piperidin-4-il]amino propan-1-ol
Procedimiento experimental
Seguacuten el meacutetodo general E partiendo de 017 g (034 mmol) de 1-(5-
fluorobenzo[b]tiofen-3-il)-3-[1-(4-nitro-2-trifluorometilfenil)piperidin-4-
il]aminopropan-1-ona se obtiene tras la eliminacioacuten del disolvente un aceite
impuro que se purifica por cromatografiacutea flash en diclorometanometanol
(991)
Punto de fusioacuten 140-142ordmC
IR (cm-1) 3425 (m OH) 1498 y 1334 (mf NO2) 1283 (mf F-BTF)1283 y 1106 (f
CF3)
RMN-1H (CDCl3 400 MHz) δ (ppm) 156-171 (m 2H H3ax+H5ax PIPR) 195-
197 (m 2H CHOH-CH2) 211 (sa 2H H3ec+H5ec PIPR) 275 (sa 1H H4 PIPR)
295 (t 2H H2ax+H6ax PIPR J2ax2ec= J6ax6ec= 97 Hz) 313 (sa 2H CHOH-CH2-
CH2) 342 (d 2H H2ec+H6ec PIPR J2ec2ax= J6ec6ax= 90 Hz) 530 (d 1H CHOH JCH-
OH = 77 Hz) 712 (t 1H H6 FBZT J6F = J67 = 77 Hz) 729 (d 1H H6acute FENIL J6acute5acute=
86 Hz) 750 (dd 1H H4 FBZT J4F = 85 Hz J46 = 49 Hz) 752 (s 1H H2 FBZT)
779 (dd 1H H7 FBZT J76 = 82 Hz J7F = 31 Hz) 833 (dd 1H H5rsquo FENIL J5acute6acute =
85 Hz J5acute3acute = 18 Hz) 853 (sa 1H H3rsquo FENIL)
Anaacutelisis elemental (CHN)
HPLC (RP-18 1 mLmin metanol-agua (8020)) 443 min ʎmax= 2299 nm
Calculado Hallado
C 5548 5555
H 481 462
N 826 844
FM C23H23N3O3F4S PM 49751 Apariencia Soacutelido amarillo Rendimiento 37
2f
Descripcioacuten de Compuestos
151
Hidrocloruro de 1-(2-naftil)-3-[4-(4-nitro-2-
trifluorometilfenil)piperazin-1-il]propan-1-ol
Procedimiento experimental
Seguacuten el meacutetodo general E partiendo de 033 g (066 mmol) de 1-(2-naftil)-3-[4-
(4-nitro-2-trifluorometilfenil)piperazin-1-il]propan-1-ona tras la eliminacioacuten del
disolvente se obtiene un aceite que precipita en forma de hidrocloruro con eacuteter
saturado de HCl
Punto de fusioacuten 183-185ordmC
IR (cm-1) 3185 (d OH) 2924-2851 (f C-H alifaacuteticos) 1509 y 1346 (mf NO2) 1279
y 1119 (f CF3)
RMN-1H (DMSO-d6 400 MHz) δ (ppm) 214 (sa 2H CHOH-CH2) 317 (sa
2H CHOH-CH2-CH2) 329-335 (m 6H H3ax+ H5ax+ H2+H6 PIPZ) 360 (sa 2H
H3ec+ H5ec PIPZ) 483-485 (m 1H CHOH) 749-752 (m 3H H6rsquo FENIL + H6+H7
NFT) 764 (d 1H H3 NFT J34 = 91 Hz) 786 (sa 1H H1 NFT) 788-792 (m 3H
H4+H5+H8 NFT ) 841 (d 1H H3acute FENIL J3acute5acute = 21 Hz) 846 (dd 1H H5rsquo FENIL
J5rsquo6rsquo = 92 Hz J5rsquo3rsquo = 19 Hz)
Anaacutelisis elemental (CHN)
HPLC (RP-18 1 mLmin metanol-agua (8020)) 762 min ʎmax= 2236 nm
Calculado Hallado
C 5812 5770
H 484 520
N 847 801
FM C24H24N3F3O3HCl PM 5325 Apariencia Soacutelido amarillo Rendimiento 50
3a
Descripcioacuten de Compuestos
152
Hidrocloruro de 1-(2-naftil)-3-[4-(2-nitro-4-trifluorometilfenil)
piperazin-1-il] propan-1-ol
Procedimiento experimental
Seguacuten el meacutetodo general E partiendo de 036 g (083 mmol) de 1-(2-naftil)-3-[4-
(2-nitro-4-trifluorometilfenil)piperazin-1-il]propan-1-ona tras la eliminacioacuten del
disolvente se obtiene un aceite que precipita en forma de hidrocloruro con eacuteter
saturado de HCl
Punto de fusioacuten 165ndash166 ordmC
IR (cm-1) 3250 (m OH) 2927-2873 (d C-H alifaacuteticos) 1534 y 1327 (mf NO2)
1280 y 1123 (f CF3)
RMN-1H (DMSO-d6 400 MHz) δ (ppm) 219-222 (m 2H CHOH-CH2) 316
(sa 4H H3+H5 PIPZ) 348 (sa 4H H2+H6 PIPZ) 358 (d 2H CHOH-CH2-CH2)
484-487 (m 1H CHOH) 574 (sa 1H OH) 747-752 (m 2H H6acuteFENIL+H3
NFT) 754 (sa 1H H7 NFT) 756 (sa 1H H6 NFT) 788-795 (m 5H
H1+H4+H5+H8 NFT+H5acute FENIL) 825 (sa 1H H3acute FENIL) 1110 (sa 1H HCl)
Anaacutelisis elemental (CHN)
HPLC (RP-18 1 mLmin metanol-agua (8020)) 457 min ʎmax= 2220 nm
Calculado Hallado
C 5663 5682
H 469 458
N 821 813
FM C24H24N3F3O3HCl PM 4960 Apariencia Soacutelido camel Rendimiento 63
3b
Descripcioacuten de Compuestos
153
Hidrocloruro de 1-(2-naftil)-3-[3-(4-nitro-2-trifluorometilfenil)-
pirrolidin-3-ilamino]propan-1-ol
Procedimiento experimental
Seguacuten el meacutetodo general E partiendo de 025 g (0546 mmol) de 1-(2-naftil)-3-[3-
(4-nitro-2-trifluorometilfenil)pirrolidin-3-ilamino]propan-1-ona tras la
eliminacioacuten del disolvente se obtiene un aceite que se precipita en forma de
hidrocloruro con eacuteter saturado de HCl
Punto de fusioacuten 180-182ordmC
IR (cm-1) 3422 (m OH) 2951-2793 (d C-H alifaacuteticos) 1580 y 1327 (mf NO2)
1286 y 1122 (f CF3)
RMN-1H (DMSO-d6 400 MHz) δ (ppm) 207-214 (m 2H CHOH-CH2) 229-
231 (m 1H H4ax PIRR) 236-241 (m 1H H4ec PIRR) 311 (sa 2H CHOH-CH2-
CH2) 357-364 (m 1H H2ax PIRR) 375-379 (m 2H H5ax+ H2ec PIRR) 385-389
(m 1H H5ec PIRR) 397 (sa 1H H3 PIRR) 590 (sa 1H CHOH) 576 (s 1H
OH) 710 (d 1H H6rsquo FENIL J6rsquo5rsquo = 87 Hz) 747-755 (m 3H H3 + H6+ H7 NFT)
786 (sa 1H H1 NFT) 790-792 (m 3H H4+ H5+ H8 NFT) 824-890 (d 1H H5rsquo
FENIL J5rsquo6rsquo = 89 Hz) 840 (sa 1H H3rsquo FENIL) 949 (sa 1H NH)
Anaacutelisis elemental (CHN)
HPLC (RP-18 1 mLmin metanol-agua (8020)) 115 min ʎmax= 2238 nm
Calculado Hallado
C 5631 5650
H 492 523
N 821 821
FM C24H24N3F3O3HCl PM 4961 Apariencia Soacutelido anaranjado
Rendimiento 38
3e
Descripcioacuten de Compuestos
154
3-[4-(4-fluorofenil)-36-dihidropiridin-1(2H)-il]-1-(naftalen-2-
il)propan-1-ol
Procedimiento experimental
Seguir el meacutetodo general E partiendo de 030 g (084 mmol) de 3-[4-(4-
fluorofenil)-36-dihidropiridin-1(2H)-il)]-1-(naftalen-2-il)propan-1-ona se
obtiene tras la eliminacioacuten del disolvente un aceite impuro que puede
purificarse por cromatografiacutea flash en diclorometano-metanol (991)
Punto de fusioacuten 127-129ordmC
IR (cm-1) 3510 (d OH) 2833 (m C-H alifaacuteticos)
RMN-1H (CDCl3 400 MHz) δ (ppm) 199-212 (m 2H CHOH-CH2) 264 (s
2H H6 PIRD) 272-296 (m 4H H2+H5 PIRD) 331 (d 2H CHOH-CH2-CH2 JCH-
CH= 167 Hz) 517 (sa 1H CH-OH) 602 (s 1H H3 PIRD) 704 (t 2H H3acute+ H5acute
FENIL J3acute2acute= J5acute6acute= 87 Hz) 737 (dd 2H H2acute+ H6acute FENIL J2acute3acute= J6acute5acute= 87 Hz
J2acuteF= J6acuteF= 54 Hz) 745-750 (m 2H H6 + H7 NFT) 751 (dd 1H H8 NFT J87= 74
Hz J86=16 Hz) 785 (d 2H H3+ H4 NFT J34acute= J43acute=83 Hz) 787 (dd 1H H5
NFT J56= 78 Hz J57=23 Hz) 791 (s 1H H1 NFT)
Anaacutelisis elemental (CHN)
HPLC (RP-18 1 mLmin metanol-agua (8020)) tr 468 min ʎmax 2196 nm
Calculado Hallado
C 7783 7787
H 662 682
N 378 330
FM C24H24NFO PM 3615 Apariencia Soacutelido blanco Rendimiento 23
3g
Descripcioacuten de Compuestos
155
1-(2-naftil)-2-[4-(2-nitro-4-trifluorometilfenil)piperazin-1-il]etan-1-
ol
Procedimiento experimental
Seguacuten el meacutetodo general E partiendo de 038 g (086 mmol) de 1-(2-naftil)-2-[4-
(2-nitro-4-trifluorometilfenil)piperazin-1-il]propan-1-ona se obtiene tras la
eliminacioacuten del disolvente un aceite impuro que se puede purificar
precipitando el compuesto con hexano
Punto de fusioacuten 134ndash135 ordmC
IR (cm-1) 3408 (d OH) 2968-2814 (d C-H alifaacuteticos) 1533 y 1329 (mf NO2)
1230 y 1112 (f CF3)
RMN-1H (DMSO-d6 400 MHz) δ (ppm) 275-281 (m 4H H3+H5 PIPZ) 303
(sa 2H CHOH-CH2) 326-331 (m 2H H2+H6 PIPZ) 504 (dd 1H CHOH) 721
(d 1H H6acute FENIL J6acute5acute = 87 Hz) 749-752 (m 3H H3+H6+H7 NFT) 771 (dd
1H H5acute FENIL J5acute6acute = 87 Hz J5acute3acute = 19 Hz) 786 (sa 1H H1 NFT) 787 (dd 1H
H8 NFT J87 = 79 Hz J86 = 15 Hz) 788 (d 1H H4 NFT J43 = 55 Hz) 790 (sa
1H H5 NFT) 811 (d 1H H3acute FENIL J3acute5acute = 19 Hz)
Anaacutelisis elemental (CHN)
HPLC (RP-18 1 mLmin metanol-agua (8020)) 566 min ʎmax= 2228 nm
Calculado Hallado
C 6202 6226
H 494 512
N 944 914
FM C23H22N3F3O3 PM 4454 Apariencia Soacutelido amarillo Rendimiento 78
4b
Descripcioacuten de Compuestos
156
1-(4-fluoronaftil)-3-[4-(4-nitro-2-trifluorometilfenil)piperazin-1-
il]propan-1-ol
Procedimiento experimental
Seguacuten el meacutetodo general E partiendo de 053 g (107 mmol) de 1-(4-
fluoronaftil)-3-[4-(4-nitro-2-trifluorometilfenil)piperazin-1-il]propan-1-ona se
obtiene tras la eliminacioacuten del disolvente un aceite impuro que se purifica por
cromatografiacutea flash usando como fase moacutevil diclorometanometanol (991)
Punto de fusioacuten 183-184ordmC
IR (cm-1) 3447 (d OH) 2931-2836 (d C-H alifaacuteticos) 1513 y 1338 (f NO2) 1283
y 1119 (f CF3)
RMN-1H (CDCl3 400 MHz) δ (ppm) 206-214 (m 2H CHOH-CH2) 274-280
(m 3H H5 PIPZ+ CHOH-CH2-CH2) 288-294 (m 3H H3 PIPZ+ CHOH-CH2-
CH2) 327 (t 4H H2+H6 PIPZ J23= J65= 467 Hz) 571 (dd 1H CHOH JCH-CH =
81 Hz JCH-CH = 27 Hz) 718 (dd 1H H3 FNFT J3F = 102 Hz J32= 80 Hz) 735
(d 1H H6acute FENIL J6acute5acute = 89 Hz) 767-771 (m 2H H6+H7 FNFT) 769 (dd 1H
H2 FNFT J23 = 79 Hz J2F= 56 Hz) 804 (d 1H H8 FNFT J87 = 80 Hz) 817 (dd
1H H5 FNFT J56 = 76 Hz J5F = 21 Hz) 838 (dd 1H H5acute FENIL J5acute6acute = 89 Hz
J5acute3acute = 27 Hz) 855 (d 1H H3acute FENIL J3acute5acute = 27 Hz)
Anaacutelisis elemental (CHN)
HPLC (RP-18 1 mLmin metanol-agua (8020)) 703 min ʎmax= 2217 nm
Calculado Hallado
C 6038 6015
H 482 486
N 880 878
FM C24H23N3F4O3 PM 4775 Apariencia Cristales amarillos Rendimiento 51
5a
Descripcioacuten de Compuestos
157
1-(4-fluoronaftil)-3-[4-(2-nitro-4-trifluorometilfenil)piperazin-1-
il]propan-1-ol
Procedimiento experimental
Seguacuten el meacutetodo general E partiendo de 049 g (102 mmol) de 1-(4-
fluoronaftil)-3-[4-(2-nitro-4-trifluorometilfenil)piperazin-1-il]propan-1-ona se
obtiene tras la eliminacioacuten del disolvente un aceite impuro que se purifica al
lavarlo con hexano
Punto de fusioacuten 147ndash148 ordmC
IR (cm-1) 3430 (m OH) 2957-2835 (d C-H alifaacuteticos) 1533 y 1330 (mf NO2)
1278 y 1125 (f CF3)
RMN-1H (DMSO-d6 400 MHz) δ (ppm) 208-218 (m 2H CHOH-CH2) 283
(sa 3H H5 PIPZ+ CHOH-CH2-CH2) 295 (sa 3H H3 PIPZ+ CHOH-CH2-CH2)
332 (sa 4H H2+H6 PIPZ) 571 (dd 1H CHOH) 718 (dd 1H H3 FNFT J3F =
102 Hz J32 = 81 Hz) 723 (d 1H H6acute FENIL J6acute5acute = 87 Hz) 754-762 (m 2H
H6+H7 FNFT) 768 (dd 1H H2 FNFT J23 = 80 Hz J2F = 56 Hz) 774 (dd 1H
H5acute FENIL J5acute6acute = 87 Hz J5acute3acute = 19 Hz) 805 (dd 1H H5 FNFT J56 = 82 Hz J5F =
17 Hz) 811 (d 1H H3acute FENIL J3acute5acute = 19 Hz) 817 (dd 1H H8 FNFT J87 = 86
Hz J86 = 29 Hz)
Anaacutelisis elemental (CHN)
HPLC (RP-18 1 mLmin metanol-agua (8020)) 556 min ʎmax= 2222 nm
Calculado Hallado
C 6038 6012
H 482 505
N 881 862
FM C24H23N3F4O3 PM 4775 Apariencia Soacutelido amarillo Rendimiento 90
5b
Descripcioacuten de Compuestos
158
Hidrocloruro de 1-(4-fluoronaft-1-il)-3-[4-(4-trifluorometilfenil)
piperidin-1-il] propan-1-ol
Procedimiento experimental
Seguacuten el meacutetodo general E partiendo de 010 g de 1-(4-fluoronaftalen-1-il)-3-[1-
(4-trifluorometilfenilpiperidin-4-il)amino]propan-1-ona se obtiene tras la
eliminacioacuten del disolvente un aceite impuro que se purifica por cromatografiacutea
flash en diclorometanometanol (991) y se precipita como hidrocloruro con
eacuteter saturado de HCl
Punto de fusioacuten 174-175ordmC
IR (cm-1) 3436 (m OH) 2983 (d C-H alifaacuteticos) 2396 (d HCl) 1333 (f N-C)
1118 (mf CF3)
RMN-1H (DMSO-d6 400 MHz) δ (ppm) 221 (d 2H CHOH-CH2) 320-360
(m 6H CHOH-CH2-CH2+ H3+H5 PIPZ) 355 (sa 2H H2ax+H6ax PIPZ) 397 (sa
2H H2ec+H6ec PIPZ) 541 (d 1H CH-OH JCH-CH=75 Hz) 590 (sa 1H OH) 713
(d 2H H6acute+H2acute FENIL J6acute5acute= J2acute3acuteacute= 81 Hz) 736 (dd 1H H3 FNFT J32= 82 Hz
J3F= 97 Hz) 756 (d 2H H6+H7 FNFT J67= J76acute= 84 Hz) 767 (sa 3H H2
FNFT+H3acute+H5acute FENIL) 810 (d 1H H5 FNFT J56 = 66 Hz) 829 (d 1H H8
FNFT J87= 88 Hz) 1112 (sa 1H HCl)
Anaacutelisis elemental (CHN)
HPLC (RP-18 1 mLmin metanol-agua (8020)) 850 min ʎmax= 2266 nm
Calculado Hallado
C 6147 6135
H 539 482
N 598 596
FM C24H24N2F4OHCl PM 4690 Apariencia Soacutelido blanco Rendimiento 45
5c
Descripcioacuten de Compuestos
159
1-(4-fluoronaft-1-il)-3-[1-(4-nitro-2-trifluorometilfenilpiperidin-4-
il)amino]propan-1-ol
Procedimiento experimental
Seguacuten el meacutetodo general E partiendo de 04106 g (084 mmol) de 1-(4-
fluoronaft-1-il)-3-[1-(4-nitro-2-trifluorometilfenilpiperidin-4-il)amino] propan-1-
ona se obtiene tras la eliminacioacuten del disolvente un aceite impuro que se
purifica por cromatografiacutea flash en diclorometanometanol (991)
Punto de fusioacuten 93-95ordmC
IR (cm-1) 3352 (m OH) 1524 y 1318 (mf NO2) 1280 y 1171 (f CF3)
RMN-1H (CDCl3 400 MHz) δ (ppm) 168-183 (m 2H H3ax+ H5ax PIPR) 186-
201 (m 2H CHOH-CH2) 215-223 (m 2H H3ec+H5ec PIPR) 212 (d 1H CH-
OH JCH-CH= 127 Hz) 275-284 (m 1H H4 PIPR) 298 (t 2H H2ax+ H6ax PIPR
J2ax2ec = J6ax6ec = 115 Hz) 300-303 (m 1H CHOH-CH2-CH2) 308-315 (m 1H
CHOH-CH2-CH2) 342 (d 2H H2ec+H6ec PIPR) 571 (dd 1H CHOH JCHCH =
82 Hz JCH-CH2 = 23 Hz) 717 (dd 1H H3 FNFT J3F = 102 Hz J32 = 81 Hz)
727-730 (m 1H H6acute FENIL) 753-761 (m 2H H6+H7 FNFT) 767-772 (m 1H
H2 FNFT) 804 (d 1H H8 FNFT J87 = 78 Hz) 816 (dd 1H H5 FNFT J56 =72 Hz
J5F = 33 Hz ) 833 (dd 1H H5acute FENIL J5acute6acute = 90 Hz J5acute3acute = 27 Hz ) 853 (d 1H
H3acute FENIL J3acute5acute = 27 Hz)
Anaacutelisis elemental (CHN)
HPLC (RP-18 1 mLmin metanol-agua (8020)) tr 464 min ʎmax 2230 nm
Calculado Hallado
C 6111 6077
H 543 543
N 855 830
FM C25H25N3O3F4 PM 4910 Apariencia Soacutelido amarillo Rendimiento 90
5f
Descripcioacuten de Compuestos
160
1-(4-fluoronaftalen-1-il)-3-[4-(4-fluorofenil)-36-dihidropiridin-
1(2H)-il]propan-1-ol
Procedimiento experimental
Seguacuten el meacutetodo general E partiendo de 043 g (114 mmol) de 1-(4-
fluoronaftalen-1-il)-3-[4-(4-fluorofenil)-36-dihidropiridin-1(2H)-il]propan-1-
ona se obtiene tras la eliminacioacuten del disolvente un soacutelido blanco que precipita
con hexanoeacuteter
Punto de fusioacuten 162-163ordmC
IR (cm-1) 2828 (d C-H alifaacuteticos) 1509 (f F-BZN) 1227 (mf F-NFT)
RMN-1H (DMSO-d6 400 MHz) δ (ppm) 214-220 (m 2H CHOH-CH2) 273
(sa 2H H6 PIRD) 284-312 (m 4H CHOH-CH2-CH2+H5 PIRD) 341 (d 1H
H2ax PIRD J2ax 2ec=164 Hz) 347 (d 1H H2ec PIRD J2ec2ax=161 Hz) 574 (sa 1H
CHOH) 600-605 (m 1H H3 PIRD) 700-708 (m 2H H2acute+H6acute FENIL) 718 (dd
1H H3 FNFT J3F= 102 Hz J32 = 81 Hz) 735-740 (m 2H H6+H7 FNFT) 754-
761 (m 2H H5acute+H3acute FENIL) 770 (dd 1H H2 FNFT J23= 80 Hz J2F = 56 Hz)
807 (d 1H H5 FNFT J56 = 82 Hz) 82 (dd 1H H8 FNFT J87= 70 Hz J86 = 25
Hz)
Anaacutelisis elemental (CHN)
Calculado Hallado
C 7595 7525
H 606 645
N 369 350
FM C24H23NF2O PM 3792 Apariencia Soacutelido blanco Rendimiento 82
5g
Descripcioacuten de Compuestos
161
Hidrocloruro de 1-(4-fluorofenil)-3-[4-(4-nitro-2-
trifluorometilfenilpiperazin-1-il]propan-1-ol
Procedimiento experimental
Seguacuten el meacutetodo general E partiendo de 036 g (107 mmol) de 1-(4-fluorofenil)-
3-[4-(4-nitro-2-trifluorometilfenil)piperazin-1-il]propan-1-ona se obtiene tras la
eliminacioacuten del disolvente un aceite impuro que se precipita con hexanoeacuteter
El soacutelido que se obtiene se lava con eacuteter saturado de HCl
Punto de fusioacuten 163-165ordmC
IR (cm-1) 3348 (m OH) 2928-2848 (d C-H alifaacuteticos) 1519 y 1352 (f NO2) 1284
y 1120 (f CF3)
RMN-1H (DMSO-d6 400 MHz) δ (ppm) 209 (sa 2H CHOH-CH2) 315-320
(m 4H H3+H5 PIPZ) 335-344 (m 4H H2+H6 PIPZ) 360 (sa 2H CHOH-CH2-
CH2) 469 (s 1H CHOH) 565 (s 1H OH) 718 (t 2H H3+H5 FBZN J32 = J56=
81 Hz) 742 (dd 2H H2+H6 FBZN J23 = J65= 80 Hz J2Facute= J6F= 66 Hz) 764 (d
1H H6acute FENIL J6acute5acute = 90 Hz) 842 (s 1H H3acute FENIL) 847 (d 1H H5acute FENIL
J5acute6acute = 88 Hz) 1120 (sa 1H HCl)
Anaacutelisis elemental (CHN)
HPLC (RP-18 1 mLmin metanol-agua (8020)) tr 206 min ʎmax 2011 nm
Calculado Hallado
C 4984 4950
H 477 476
N 872 863
FM C20H21N3F4O3HCl PM 4659 Apariencia Soacutelido amarillo Rendimiento 20
6a
Descripcioacuten de Compuestos
162
Hidrocloruro de 1-(4-fluorofenil)-3-[1-(4-nitro-2-
trifluorometilfenil)piperidin-4-il)amino]propan-1-ol
Procedimiento experimental
Seguacuten el meacutetodo general E partiendo de 010 g (021 mmol) de 1-(4-fluorofenil)-
3-[1-(4-nitro-2-trifluorometilfenilpiperidin-4-il)amino]propan-1-ona se obtiene
en la eliminacioacuten del disolvente un aceite impuro que se purifica como
hidrocloruro lavando con eacuteter saturado de HCl
Punto de fusioacuten 185-187ordmC
IR (cm-1) 3425 1498 y 1334 (mf NO2) 1283 (mf F BZN)1283 y 1106 (f CF3)
RMN-1H (DMSO-d6 400 MHz) δ (ppm) 138 (sa 2H H3ax+ H5ax PIPR) 170
(sa 2H H3ec+H5ec PIPD) 190 (d 2H CHOH-CH2 JCH-CH= 110 Hz) 258 (sa 1H
H4 PIPR) 263-264 (m 2H H2ax+ H6ax PIPR) 295 (t 2H H2ec+H6ec PIPR J2ec2ax =
J6ec6ax = 121 Hz) 320-330 (m 2H CHOH-CH2-CH2) 469 (t 1H CHOH JCHOH-
CHCH = 90 Hz) 713 (t 2H H3+H5 FBZN J32 = J56= 81 Hz) 736 (sa 2H H2+H6
FBZN) 750 (d 1H H6acute FENIL J6acute5acute = 80 Hz) 837 (sa 2H H3acute+H5acute FENIL)
Anaacutelisis elemental (CHN)
HPLC (RP-18 1 mLmin metanol-agua (8020)) tr 1977 min ʎmax 2011 nm
Calculado Hallado
C 5251 5213
H 503 491
N 880 849
FM C21H23N3F4O3HCl PM 4799 Apariencia Soacutelido amarillo Rendimiento 11
6f
Descripcioacuten de Compuestos
163
1-(4-fluorofenil)-3-[4-(4-fluorofenil)-36-dihidropiridin-1(2H)-
il]propan-1-ol
Procedimiento experimental
Seguir el meacutetodo general E partiendo de 090 g (027 mmol) de 1-(4-fluorofenil)-
3-(4-(4-fluorofenil)-56-dihidropiridin-1(2H)-il)propan-1-ona y se obtiene tras la
eliminacioacuten del disolvente un aceite impuro que se purifica por cromatografiacutea
flash en diclorometanometanol (991) El soacutelido obtenido se recristaliza de
hexano para su total purificacioacuten
Punto de fusioacuten 199-201ordmC
RMN-1H (DMSO-d6 400 MHz) δ (ppm) 176-180 (m 2H CHOH-CH2) 245
(sa 4H CHOH-CH2-CH2+H5 PIRD) 257-262 (m 2H H6 PIRD) 306 (sa 2H
H2 PIRD) 466 (t 1H CHOH JCH-OH=63 Hz) 549 (sa 1H OH) 612 (sa 1H H3
PIRD) 714 (dd 4H H3acute+H5acute FENIL+ H3+H5 FBZN J3acuteF= J5acuteF= J3F= J5F = 126 Hz
J3acute2acute= J5acute6acute= J32= J56 = 80 Hz) 737 (dd 2H H2+H6 FBZN J23= J65= 79 Hz J2F=
J6F= 60 Hz) 746 (dd 2H H2acute+H6acute FENIL J2acute3acute= J6acute5acute= 77 Hz J2acuteF= J6acuteF= 55 Hz)
Anaacutelisis elemental (CHN)
Calculado Hallado
C 7242 7196
H 634 633
N 422 403
FM C20H21NF2O PM 3314 Apariencia Soacutelido blanco Rendimiento 2
6g
Descripcioacuten de Compuestos
164
3-[4-(4-fluorofenil)-36-dihidropiridin-1(2H)-il]-1-(4-
trifluorometilfenil)propan-1-ol
Procedimiento experimental
Seguacuten el meacutetodo general E partiendo de 013 g (034 mmol) de 1-(4-
fluoronaftalen-1-il)-3-[1-(4-nitro-2-trifluorometilfenilpiperidin-4-
il)amino]propan-1-ona se obtiene tras la eliminacioacuten del disolvente se obtiene
un soacutelido blanco que se lava con hexano eacuteter y se recristaliza de hexano
Punto de fusioacuten 116-117ordmC
IR (cm-1) 2912- 2761 (C-H alifaacuteticos) 1511 (f F) 1328 y 1127 (f CF3)
RMN-1H (DMSO-d6 400 MHz) δ (ppm) 181 (dd 2H CHOH-CH2 JCH-CH=
137 Hz JCH-CHOH= 73 HZ) 245-250 (m 4H CHOH-CH2-CH2+H5 PIRD) 262 (t
2H H6 PIRD JCH-CH= JCH-CH=55 Hz) 308 (s 2H H2 PIRD) 475-480 (m 1H
CHOH) 570 (sa 1H OH) 612 (s 1H H3 PIRD) 715 (t 2H H5acute+H3acute FENIL
J5acuteF=J3acuteF= 88 Hz J5acute6acute= J3acute2acute =88 Hz) 747 (dd 2H H6acute+H2acute FENIL J6acute5acute=J2acute3acute= 84
Hz J6acuteF= J2acuteF =56 Hz) 757 (d 2H H2+H6 TFBZN J23acute=J65= 79 Hz) 768 (d 2H
H3+H5 TFBZN J32acute=J56= 81 Hz)
Anaacutelisis elemental (CHN)
HPLC (RP-18 1 mLmin metanol-agua (8020)) tr 1027 min ʎmax 2418 nm
Calculado Hallado
C 6649 6601
H 554 567
N 370 381
FM C21H21NF4O
PM 379 Apariencia Agujas blancas Rendimiento 40
7g
Descripcioacuten de Compuestos
165
X4 Siacutentesis de Oximas (Serie 8)
1-(naftalen-2-il)-3-[4-(2-nitro-4-trifluorometilfenil)piperazin-1-
il]propan-1-oxima
Procedimiento experimental
Seguacuten el meacutetodo general F partiendo de 023 g (050 mmol) de 1-(2-naftil)-3-[4-
(2-nitro-4-trifluorometilfenil)piperazin-1-il]propan-1-ona se obtiene tras la
eliminacioacuten del disolvente un aceite impuro que se purifica por columna
cromatograacutefica con diclorometanometanol (973)
Punto de fusioacuten 185-187 ordmC
IR (cm-1) 1560 y 1328 (mf NO2) 1283 y 1120 (f CF3)
RMN-1H (DMSO-d6 400 MHz) δ (ppm) 254-264 (m 6H CNOH-CH2-
CH2+H3+H5 PIPZ) 303-309 (m 2H CNOH-CH2) 311-317 (m 4H H2+H6
PIPZ) 743 (d 1H H6acuteFENIL J6acute5acute= 88 Hz) 751-756 (m 2H H6+H7 NFT) 784
(dd 1H H5acute FENIL J5acute6acuteacute= 88 Hz J5acute3acuteacute= 17 Hz) 788-793 (m 3H H4+H5+H8
NFT) 798-802 (m 1H H3 NFT) 814 (sa 2H H1 NFT+H3acute FENIL) 1140 (sa
1H OH)
Anaacutelisis elemental (CHN)
HPLC (RP-18 1 mLmin metanol-agua (8020)) tr 464 min ʎmax 2391 nm
Calculado Hallado
C 6102 6114
H 487 521
N 1186 1163
FM C24H23N4F3O3 PM 4720 Apariencia Soacutelido camel Rendimiento 54
81
Descripcioacuten de Compuestos
166
1-(2-naftil)-3-[3-(4-nitro-2-trifluorometilfenil)pirrolidin-3-
ilamino]propan-1-oxima
Procedimiento experimental
Seguir el meacutetodo general F partiendo de 0350 g (0769 mmol) de 1-(2-naftil)-3-
[3-(4-nitro-2-trifluorometilfenil)pirrolidin-3-ilamino]propan-1-ona se obtiene
tras la eliminacioacuten del disolvente un soacutelido anaranjado que se lava con
diclorometano y eacuteter etiacutelico obtenieacutendose el compuesto puro
Punto de fusioacuten 129 - 130ordfC
IR (cm-1) 3441 (d OH) 2951-2834 (d C-H alifaacuteticos) 1503 y 1323 (mf NO2)
1285 y 1112 (f CF3)
RMN-1H (DMSO-d6 400 MHz) δ (ppm) 178-185 (m 1H H4ax PIRR) 202-209
(m 1H H4ec PIRR) 221 (sa 1H -NH-) 270-282 (m 2H CNOH-CH2-CH2) 300
(t 2H CNOH-CH2) 325 (dd 1H H3 PIRR) 343-351 (m 2H H2ax+ H2ec PIRR)
358-361 (m 2H H5 PIRR) 697 (d 1H H6acute FENIL J6acute5acute = 96 Hz) 751 (d 1H
H5 NFT J56 = 61 Hz) 752 (d 1H H8 NFT J87 = 61 Hz) 786 (sa 2H H3+H4
NFT) 788-794 (m 2H H6+H7 NFT) 813 (sa 1H H1 NFT) 815 (dd 1H H5acute
FENIL J5acute6acute = 94 Hz J5acute3acute = 27 Hz) 835 (d 1H H3acute FENIL J3acute5acute = 27 Hz)
Anaacutelisis elemental (CHN)
HPLC (RP-18 1 mLmin metanol-agua (8020)) 365 min ʎmax= 2360 nm
Calculado Hallado
C 5987 5954
H 502 474
N 1164 1157
FM C24H23N4O3F3 PM 472 Apariencia Soacutelido amarillo Rendimiento 45
82
Descripcioacuten de Compuestos
167
X5 Purificacioacuten de compuestos por cromatografiacutea flash
La cromatografiacutea flash ha sido utilizada como meacutetodo de purificacioacuten de
muchos de los compuestos de este trabajo Las condiciones elegidas para la
purificacioacuten han sido
- Fase Estacionaria Columnas de Siacutelica gel Rf RediSepreg de tamantildeo de
partiacutecula entre 35 y 70 micras y tamantildeo de poro 60 Aring
- Fase Moacutevil Diclorometanometanol de flujo isocraacutetico linear (Figuras 51 y
52) con un volumen de equilibrado de 20 mL
- Longitud de onda de deteccioacuten 254 nm en todas las muestras y 365 nm en
los compuestos que contienen el grupo naftaleno
- Tipo de muestra Liacutequidas cuando no
son muy complejas y soacutelidas cuando se
trata de purificacioacuten de mezclas
complejas e hidrocloruros
Figura 51 Informe graacutefico de la purificacioacuten compuesto 023
Figura 52 Informe graacutefico de la purificacioacuten compuesto 5f
De los 47 compuestos sintetizados 23 han sido purificados mediante
cromatografiacutea flash Este meacutetodo ha supuesto una mejora y simplificacioacuten del
proceso de siacutentesis asiacute como un ahorro de costes por la reduccioacuten de tiempos
solventes y residuos La purificacioacuten del resto ha sido realizada por
precipitacioacuten como hidrocloruros lavado del compuesto con hexanoeacuteter o
recristalizacioacuten con hexano
Tabla 3
Condiciones de trabajo empleadas en la figuras 51 y 52
Tiempo (min)
Metanol (B)
Teacutecnica de flujo
Compuesto 023
10 00 Isocraacutetico
1 25 Linear
15 25 Isocratico
1 5 Linear
30 5 isocraacutetico
Compuesto 5f
5 0 Isocraacutetico
1 25 Linear
15 25 Isocratico
1 5 Linear
30 5 isocraacutetico
Descripcioacuten de Compuestos
168
X6 Elucidacioacuten estructural de compuestos por RMN
Todos los compuestos sintetizados han sido identificados a traveacutes de teacutecnicas
de CCF IR y RMN-1H Los compuestos finales han sido caracterizados ademaacutes
mediante anaacutelisis elemental de CHN De este modo se ha podido determinar
inequiacutevocamente las estructuras orgaacutenicas de las moleacuteculas obtenidas y formar
un ldquoficha de identidadrdquo de cada compuesto
X61 Elucidacioacuten estructural para los derivados de piperazina
En el caso de que las teacutecnicas anteriores fueran insuficientes para la
caracterizacioacuten exacta de la moleacutecula se han empleado teacutecnicas
complementarias de RMN como RMN-13C 2D 1H-1H COSY y 2D HMQC Este
ha sido el caso del compuesto 5a (figura 53)
Figura 53 Estructura molecular del compuesto 5a ejemplo escogido para un anaacutelisis maacutes exhaustivo mediante experimentos de RMN
La espectroscopia de RMN revela el nuacutemero de hidroacutegenos o carbonos de la
moleacutecula y su posible posicioacuten A traveacutes de los distintos experimentos esta
teacutecnica permite identificar y asignar los distintos protones y carbonos presentes
en la moleacutecula mediante el anaacutelisis de los desplazamientos y multiplicidades
que muestra cada uno de ellos
Figura 54 RMN-1H del compuesto 5a
Descripcioacuten de Compuestos
169
Zona alifaacutetica
En la zona de hidroacutegenos alifaacuteticos se observan cuatro sentildeales
Figura 55 Regioacuten alifaacutetica de la RMN-1H
Los hidroacutegenos alifaacuteticos aparecen a desplazamientos bajos porque estaacuten
muy apantallados
El C1 es un carbono terciario y por tanto tiene un hidroacutegeno muy
desapantallado por el efecto del grupo OH dando una sentildeal a altos ppm como
queda sentildealada en naranja en la figura 55 Esta asignacioacuten facilita el poder
asociar los picos sentildealados en morado (Figura 55) con el metileno vecino C2 ya
que aparece a bajos ppm debido a su aumentado caraacutecter alifaacutetico El multiplete
obtenido integrado por dos hidroacutegenos aparece a 210 ppm Mediante el
espectro COSY (Figura 56) se puede comprobar siguiendo el trazado naranja
coacutemo siendo la sentildeal de CHOH la de 571 ppm se acopla con ella uacutenicamente la
de su vecino CHOH-CH2
Los hidroacutegenos pertenecientes al ciclo de piperazina se diferencian entre siacute por
el desplazamiento de las sentildeales seguacuten esteacuten maacutes o menos cercanos al grupo
fenilo Asiacute los protones H3p y H5p son los que aparecen a menores ppm A 277
ppm y a 291 ppm aparecen dos multipletes (sentildealados con azul en la figura 55)
que integran a tres hidroacutegenos cada uno lo cual resulta extrantildeo ya que en la
moleacutecula no hay ninguacuten CH3 Esto se debe a la diastereotopiacutea del carbono
hidroxiacutelico que hace que los 4 hidroacutegenos salgan divididos en dos sentildeales que
integran a dos hidroacutegenos cada una y a ambas se les suma uno de los
hidroacutegenos del C3 alifaacutetico Esto hace que aparezcan dos sentildeales que integran a
tres hidroacutegenos correspondientes a 2H3p 2H5p y los dos hidroacutegenos alifaacuteticos
Descripcioacuten de Compuestos
170
de C3 Si se siguen ahora las
liacuteneas moradas de la figura
55 se corrobora la
informacioacuten de que los
protones del C3 salen unidos
a las sentildeales de los protones
de H3 y H5 porque hay un
acoplamiento entre el C2 y
esas sentildeales
Figura 56 Espectro COSY Acoplamientos entre metilenos
Por uacuteltimo a 327 ppm se encuentra la sentildeal marcada con verde (figura 55)
correspondiente a 2H2 y 2H6 que integra por cuatro hidroacutegenos y aparece como
triplete debido a los acoplamientos con 2H3 y 2H5
Zona aromaacutetica
En esta moleacutecula se encuentran 9 hidroacutegenos aromaacuteticos no equivalentes lo
que dificulta la asignacioacuten de las sentildeales Como en el apartado anterior se
recurriraacute para estudiar los acoplamientos protoacuten-protoacuten y protoacuten-carbono a la
resonancia magneacutetica nuclear en dos dimensiones con el fin de asignar
inequiacutevocamente cada sentildeal
Figura 57 Resonancia magneacutetica nuclear de protoacuten de la zona aromaacutetica de la moleacutecula 5a
La dificultad de la asignacioacuten en esta moleacutecula se ve aumentada por la
presencia de un aacutetomo de fluacuteor en la parte del naftaleno En el espectro de
Descripcioacuten de Compuestos
171
RMN-1H el aacutetomo de fluacuteor no produce sentildeal pero siacute acoplamientos con los
hidroacutegenos vecinos obtenieacutendose constantes de acoplamiento (J) bastantes altas
y sentildeales desdobladas no esperadas en protones de su entorno
En la figura 57 lo primero que se observa son los altos desplazamientos de los
hidroacutegenos aromaacuteticos debido al menor apantallamiento de estos por su
naturaleza aromaacutetica
Teoacutericamente el espectro deberiacutea tener un singlete claro perteneciente a H3acute
pero no se encuentra ninguno en la figura 57 Asiacute que se puede pensar en un
desdoblamiento de la sentildeal por acoplamiento deacutebil a larga distancia con el H5acute
lo que mostrariacutea un doblete con acoplamiento muy bajo
En el espectro se encuentran tres dobletes sencillos Con las constantes de
acoplamiento a 850 ppm se ve este doblete que integra por uno y que tiene
una J = 27 Hz El otro doblete se encuentra a 804 ppm con una J = 80 Hz y el
maacutes bajo estaacute en 735 ppm con una J = 89 Hz Por el razonamiento inicial la
sentildeal a 850 ppm es la que deberiacutea asociarse con un acoplamiento a larga
distancia y por tanto con H3acute Esta informacioacuten puede ser contrastada con el
COSY
En el espectro bidimensional COSY se ha marcado en rojo el uacutenico
acoplamiento de H3acute que solo
pueda asociarse con la sentildeal
de H5acute Por tanto el doble
doblete a 838 ppm sentildealado
en la figura 56 de azul se
corresponde con H5acute
(informacioacuten verificada por
su constante de acoplamiento
menor J = 27Hz igual a la de
H3acute)
Figura 58 Espectro COSY de la zona aromaacutetica de la moleacutecula
Si ahora se sigue la liacutenea azul de la figura 58 donde se sentildealan los
acoplamientos de H5acute se puede ver un acoplamiento mayor con su uacutenico
hidroacutegeno vecino H6acute Asiacute tambieacuten queda asignada la sentildeal de este uacuteltimo que
se puede comprobar por comparacioacuten de las constantes de acoplamiento
(J5acute6acute=89 Hz y J6acute5acute=90 Hz)
Descripcioacuten de Compuestos
172
Para asignar los hidroacutegenos del naftaleno se debe tener en cuenta la presencia
del aacutetomo de fluacuteor De esta forma para los hidroacutegenos H2 H3 y H5 se puede
establecer teoacutericamente
que no se veraacuten como
dobletes sino dobles
dobletes en el espectro
de protoacuten En el COSY
(Figura 58) para una
primera aproximacioacuten
se seleccionan los tres
dobles dobletes de
protoacuten que solo tengan
un acoplamiento
Figura 59 Espectro COSY Zona aromaacutetica de la moleacutecula
Seguacuten la posicioacuten de H2 y H3 con por efecto del fluacuteor de la moleacutecula ademaacutes de
ser dobles dobletes el espectro COSY (Figura 58) debe mostrar dos sentildeales que
se acoplan entre ellas Por lo que se deduce que estos protones seraacuten los
sentildealados en azul y morado (figura 57) Si se recurre ahora a los valores de
acoplamiento se justifica la asignacioacuten ya que la sentildeal morada a 770 ppm
tiene una J = 79 Hz que se corresponde con la J = 81 Hz de la sentildeal azul a 720
ppm Ademaacutes estas sentildeales por la proximidad del fluacuteor tienen un segundo
valor de acoplamiento que en el caso de H3 seraacute muy alto y en H2 menor De
este modo se concluye que la sentildeal a 770 ppm corresponde a H2 y la sentildeal a
720 ppm a H3
La continuacioacuten de la asignacioacuten se centra en H6 y H7 Estos dos protones
teoacutericamente produciraacuten sentildeales como miacutenimo con multiplicidad de triplete ya
que son los uacutenicos que presentan tres protones diferentes en su entorno Como
no hay ninguacuten triplete en el espectro podemos pensar que sus sentildeales pudieran
aparecer juntas en el multiplete que se observa sentildealado en verde en la figura
57 a 750 ppm
Por otro lado queda por asociar las sentildeales a 817 ppm y a 804 ppm (Figura
57) correspondientes a un doble doblete y un doblete respectivamente Los
protones que quedan por asignar son H5 y H8 Se podriacutea pensar que H8 seriacutea un
doblete y H5 un doble doblete por efecto del fluacuteor como el caso de H2 Si se
estudian las J se verifica esta informacioacuten ya que la sentildeal a 817 ppm tiene una
constante de acoplamiento de 21 Hz muy pequentildea para pertenecer a un
Descripcioacuten de Compuestos
173
acoplamiento protoacutenndashprotoacuten aromaacutetico Por tanto se asigna a un acoplamiento a
larga distancia del H5 con
el fluacuteor sustituido en
posicioacuten 4 del NFT
Recurriendo al espectro
COSY (Figura 60) se
puede visualizar y
verificar estas cuatro
asignaciones ya que en
caso de ser correctas
deben acoplarse las
sentildeales doblete con el
uacutenico multiplete
Figura 60 Espectro COSY para la asignacioacuten de los H del naftaleno
Identificados todos los hidroacutegenos de la moleacutecula si se recurre ahora al
espectro HMQC (Figura 61) se pueden asignar directamente los carbonos no
cuaternarios presentes en la estructura esto se debe a que este experimento
bidimensional muestra el acoplamiento entre cada carbono y los protones
directamente unidos al mismo
Lo anterior se realiza siguiendo las liacuteneas de unioacuten entre el eje horizontal
espectro de RMN- 1H y el vertical que es el espectro de RMN-13C
Figura 61 Espectro HMQC Acoplamientos protoacuten-carbono
Descripcioacuten de Compuestos
174
Las asignaciones quedan de la siguiente forma
Zona aromaacutetica
C2
FNFT
C3
FNFT
C5
FNFT
C6
FNFT
C7
FNFT
C8
FNFT
C3
FENIL
C5
FENIL
C6
FENIL
RMN-
13C
(ppm)
12320 10912 12840 12725 12611 12311 12180 12491 12332
RMN-
1H
(ppm)
770 720 817 750 750 804 805 838 735
Zona alifaacutetica
C1
alifaacutetico
C2
alifaacutetico
C3
alifaacutetico C2 PIPZ C3 PIPZ C5 PIPZ C6 PIPZ
RMN-13C
(ppm) 7232 3295 5743 5350 5310 5310 5350
RMN-1H
(ppm) 571 210
Ha 290
Hb 278 291 327 327 270
De esta forma queda correctamente determinada la estructura de la moleacutecula
Con el anaacutelisis elemental (CHN) en uacuteltimo lugar se verifica el compuesto y se
determina la pureza del mismo
Descripcioacuten de Compuestos
175
X62 Elucidacioacuten estructural para los derivados de piperidina
El compuesto que se ha tomado como referencia en este caso es el 5f Se trata
de un derivado de FNFT que tiene como amina central una amino piperidina
En la figura 62 se muestra la estructura plana de la moleacutecula con los carbonos
alifaacuteticos diferenciados
Figura 62 Estructura del compuesto 5f con los diferentes carbonos alifaacuteticos coloreados
El espectro de protoacuten del compuesto se muestra en la figura 62
Figura 63 Resonancia de protoacuten del compuesto 5f
Por pertenencia al mismo grupo estructural el derivado 5f y el 5a tienen en
comuacuten los grupos aromaacuteticos de la estructura en consecuencia la zona
aromaacutetica de la moleacutecula ya ha quedado elucidada en el apartado anterior En
este apartado los estudios se centran en la descripcioacuten y asignacioacuten de sentildeales
de la regioacuten alifaacutetica que corresponden a la aminopiperidina En la figura 64 se
han destacado en distintos colores las diferentes sentildeales correspondientes a los
carbonos alifaacuteticos de la moleacutecula 5f
Descripcioacuten de Compuestos
176
Figura 64 Ampliacioacuten zona alifaacutetica de la resonancia de protoacuten del compuesto 5f
Para comenzar con la explicacioacuten de la asignacioacuten se revisa en primer lugar el
espectro DEPT-135 (Figura 65) de resonancia de la zona alifaacutetica donde quedan
diferenciados los carbonos terciarios que dan lugar a sentildeales positivas de los
secundarios que dan lugar a sentildeales negativas
Figura 65 DEPT 135 de la regioacuten aromaacutetica del compuesto 5f Coloreados los carbonos terciarios
En el espectro quedan sentildealados los carbonos terciarios que corresponden al
C1 y a C4p Los
desplazamientos se
mantienen en el espectro de
RMN-13C simple por lo que
en el espectro de HMQC se
puede obtener a queacute
hidroacutegenos van asociadas
las sentildeales de esos carbonos
(Figura 66)
Figura 66 HMQC alifaacutetica asignacioacuten de los carbonos terciarios
Descripcioacuten de Compuestos
177
Al trazar las liacuteneas de unioacuten se observa que la sentildeal de carbono a mayores ppm
corresponde con la de un H que integra a uno y que corresponde a la sentildeal que
aparece a mayores ppm Los H de C1 estaacuten muy desapantallados por el efecto
del OH asiacute la sentildeal a 571 ppm del espectro de protoacuten (Figura 64) corresponde al
CHOH De esta forma la otra sentildeal del C terciario corresponde con el H4 asiacute
trazando una liacutenea amarilla en el HMQC se puede asignar con seguridad la
sentildeal de ese H
Seguacuten el DEPT-135 (Figura 65) en torno a 30 ppm se pueden ver dos singletes
muy proacuteximos que corresponden a dos C secundarios y en torno a 50 ppm
aparece un singlete que integra dos sentildeales Seguacuten la estructura del compuesto
hay cuatro carbonos equivalentes dos a dos los CH2 y CH2 de la piperidina
que aparecen como singletes muy proacuteximos
Los carbonos C2p y C6p (H2+H6) aparecen a desplazamientos mayores como
C4p En el espectro de carbono el desplazamiento a 5230 ppm cumple estas
especificaciones y por tanto puede ser asignado a los CH2 En el HMQC
(Figura 67) al trazar una liacutenea verde desde RMN-13C al RMN-1H para unir las
sentildeales de acoplamiento C-H se comprueba que hay dos acoplamientos de
protoacuten con el mismo carbono Esta situacioacuten se produce porque los hidroacutegenos
de los metilenos no son equivalentes ya que espacialmente se disponen en
planos axiales y ecuatoriales seguacuten se representa en la figura 67
Figura 67 HMQC del compuesto 5f asignacioacuten H piperidina
Descripcioacuten de Compuestos
178
En la disposicioacuten espacial de miacutenima energiacutea en el vaciacuteo (Figura 68) los
hidroacutegenos de los carbonos de piperazina se disponen en diferentes planos Los
H axiales se encuentran
perpendiculares al plano del ciclo de
amina y los H ecuatoriales se
disponen en el mismo plano lo que
produce cambios en el entorno
quiacutemico que quedan reflejados en el
espectro de protoacuten (Figura 64)
Figura 68 Imagen 3D del compuesto 5f obtenida con Chemdraw 3D
La disposicioacuten adoptada hace que los H axiales esteacuten maacutes cerca entre siacute y se
produzcan acoplamientos fuertes con los H axiales vecinos y deacutebiles con los H
ecuatoriales del carbono al que pertenecen En el caso de los H ecuatoriales los
acoplamientos que se generan son deacutebiles con el H en axial del carbono propio
y en ocasiones acoplan muy deacutebilmente con los H ecuatoriales de carbonos
vecinos ya que se encuentran maacutes alejados Por esto en el espectro de esta
moleacutecula no se obtiene una uacutenica sentildeal que integra por cuatro hidroacutegenos sino
que se obtienen dos sentildeales que integran a dos H y que tienen distintas
multiplicidades
En el espectro de protoacuten en HMQC (Figura 67) siguiendo la liacutenea verde que
muestra el acoplamiento de C2p y C6p con los H se ven dos sentildeales a 342 ppm
y 291 ppm La sentildeal a 342 ppm es un doblete ancho con una J =121Hz que
seguacuten lo explicado corresponde a los CH2 (H2+H6) ecuatoriales El H2ec (y por
analogiacutea H6ec) se acopla solo con H2ax la amplitud de la sentildeal podriacutea explicarse
por el acoplamiento deacutebil con H3ec La sentildeal a 291 ppm es un triplete que se
asocia a H2 Y H6 axial ya que H2ax de acoplamientos fuertes con H3ax y H2ec
Las sentildeales de carbonos en 3274 ppm y 3303 ppm corresponden a los CH2 (H3
y H5) Por el razonamiento seguido para los metilenos 2 y 6 las sentildeales a 210
ppm y 160 ppm en el espectro de protoacuten corresponden a los H ecuatoriales y
axiales respectivamente
Los carbonos de la cadena alifaacutetica quedan asignados tambieacuten en base a los
desplazamientos del RMN-13C El C2 estaacute maacutes apantallado por el caraacutecter
alifaacutetico del entorno por lo que de las dos sentildeales que quedan por asignar la
que se obtiene a 3676 ppm corresponde al CHOH-CH2
Descripcioacuten de Compuestos
179
En el espectro HMQC (Figura 69) se obtiene para esta sentildeal CHOH-CH2
varios acoplamientos
correspondientes a
diferentes sentildeales
muacuteltiples a 200 ppm
y 212 ppm en el
espectro de protoacuten
Esto se debe tambieacuten
a la disposicioacuten
espacial de ambos H
como ocurre en el
caso de los H de la
amina
Figura 69 HMQC Asignacioacuten de los carbonos del puente de metilenos
Las sentildeales que quedan sin asignar pertenecen a C3 (sentildealado en rosa en la
figura CH2) a 4575 ppm que seguacuten el HMQC corresponde a los dos protones
que dan sentildeales como multipletes a 310 ppm y 300 ppm
La asignacioacuten de las sentildeales queda de la siguiente manera
Zona aromaacutetica
C2
FNFT
C3
FNFT
C5
FNFT
C6
FNFT
C7
FNFT
C8
FNFT
C3
FENIL
C5
FENIL
C6
FENIL
RMN-13C
(ppm) 12320 10912 12840 12725 12611 12311 12180 12491 12332
RMN-1H
(ppm) 770 720 817 750 750 804 805 838 735
Zona alifaacutetica
C1
alifaacutetico
C2
alifaacutetico
C3
alifaacutetico C2 PIPR C3 PIPR
C4
PIPR C5 PIPR C6 PIPR
RMN-13C
(ppm) 7259 3676 4575 5230 3303 5456 3274 5230
RMN-1H
(ppm) 571
Ha 212
Hb 200
Ha 319
Hb 300
Ha 342
Hb 298
Ha 210
Hb 160 280
Ha 210
Hb 160
Ha 342
Hb 298
De esta forma queda correctamente identificada la estructura del compuesto
5f
Descripcioacuten de Compuestos
180
X63 Elucidacioacuten estructural para los derivados de tetrahidropiridina
En este apartado se describen los compuestos 6g y 7g derivados de benceno
que tienen como amina central una tetrahidropiridina y como resto Ar2 un
benceno para-fluacuteor-sustituido En estos derivados la diferencia estructural que
cabe destacar estaacute en el resto Ar1 donde el 6g presenta un p-fluorobenceno
sustituido y el 7g un p-trifluorometileno (Figura 70)
Figura 70 Estructuras del compuesto 7g y 6g
Para la determinacioacuten estructural de estos compuestos se toma como punto
de partida la RMN-1H asignando las posibles sentildeales con sus correspondientes
protones El espectro de protoacuten de los compuestos se muestra en la figura 71
pudieacutendose comprobar su similitud
Figura 71 Espectro de RMN 1H del compuesto 6g y 7g respectivamente
Descripcioacuten de Compuestos
181
Zona Alifaacutetica
La regioacuten alifaacutetica de estas dos moleacuteculas son ideacutenticas por tanto las sentildeales
estaacuten a desplazamientos similares Estas moleacuteculas cuentan con cinco metilenos
de caraacutecter alifaacutetico y dos carbonos terciarios de los cuales C1 y C3p estaacuten muy
desapantallados por efecto tanto del OH
como por la pertenencia a una insaturacioacuten
como es el doble enlace de la
tetrahidropiridina Por las descripciones de
las zonas alifaacuteticas anteriores se puede
aproximar que el H perteneciente al C1
tendraacute un desplazamiento en torno a 500
ppm En la figura 72 queda sentildealada en
amarillo esta sentildeal a 470 ppm la otra sentildeal
de H sentildealada en naranja a un
desplazamiento 61 ppm corresponde al
protoacuten H3 de la tetrahidropiridina
Figura 72 Ampliacioacuten de RMN- 1H
La sentildeal pequentildea y ancha de entre ambas
sentildeales desaparece con agua deuterada por lo
que se identifica con el protoacuten del OH
El resto de sentildeales corresponden a la
tetrahidropiridina y el puente alifaacutetico En la
figura 73 se muestra ampliada la zona alifaacutetica
del espectro El estudio del espectro COSY
(Figura 74) ayudaraacute en la asignacioacuten de las
sentildeales
Figura 73 Ampliacioacuten RMN- 1H zona alifaacutetica
Habiendo asociado las sentildeales de C1 y C3p seguacuten los acoplamientos
mostrados se puede asignar las sentildeales de los carbonos contiguos con los que se
acopla De esta manera en la figura 74 puede observarse seguacuten los
acoplamientos cuaacuteles son los H contiguos al grupo hidroxilo que son los
pertenecientes a C2
Descripcioacuten de Compuestos
182
Figura 74 Asignacioacuten de las sentildeales de la cadena alifaacutetica
Se asigna la sentildeal que se observa a
180 ppm a C2 (CH2) puesto que es de
los dos el de mayor caraacutecter alifaacutetico
Integrado en el multiplete de 250 ppm
queda la sentildeal del otro CH2
correspondiente a C3 Si se traslada
esta asignacioacuten al HMQC (Figura 75) se
pueden asignar por las sentildeales a queacute C
pertenecen
Figura 75 Espectro HMQC- 1H-13C alifaacuteticos
Tomando como referencia el CH
de C3p (Figura 76) seguacuten los
acoplamientos mostrados en el
espectro COSY se determina
claramente cuaacutel es la sentildeal del CH2
de C2p
Figura 76 Ampliacioacuten zona alifaacutetica del espectro COSY
Si se continuacutea analizando los acoplamientos desde la sentildeal de H2 sentildealados
en morado se corresponde con el multiplete de 260 ppm de la RMN de protoacuten
Descripcioacuten de Compuestos
183
Como se ha explicado en el apartado anterior la posicioacuten espacial de la
moleacutecula genera acoplamientos deacutebiles de los H entre carbonos que no estaacuten
contiguos pero si espacialmente proacuteximos Por ello el multiplete genera
acoplamiento deacutebil con el hidroacutegeno del doble enlace y con los H2 y con una
tercera sentildeal que
pertenece a los H que
quedan por describir
Si se recurre al
espectro HMQC
(Figura 77) de esa
parte de la moleacutecula se
puede asignar las
sentildeales con seguridad
teniendo en cuenta los
desplazamientos
quiacutemicos de los
carbonos
Figura 77 Ampliacioacuten del espectro HMQC en la parte de la piridina
Habieacutendose asignado el H2 de C2p se puede ver el acoplamiento con el
carbono correspondiente Los dos carbonos que quedan por asignar
corresponden a las posiciones C5p y C6p El C5p teoacutericamente deberaacute aparecer a
desplazamientos menores pero la presencia del doble enlace hace que aparezca
a mayores desplazamientos Por tanto trazando las liacuteneas de unioacuten con la RMN
de protoacuten quedan justificadas todas las asignaciones realizadas al comienzo
sobre la resonancia de protoacuten
Zona aromaacutetica
Los protones aromaacuteticos de los compuestos 6g y 7g muestran diferentes
desplazamientos en la RMN- 1H (Figura 78)
Figura 78 Zona aromaacutetica de las RMN- 1H de los compuestos 6g y 7g respectivamente
Descripcioacuten de Compuestos
184
Sin embargo en una primera aproximacioacuten se puede comprobar que hay
sentildeales que se mantienen de una moleacutecula a otra La diferencia estructural entre
los dos compuestos estaacute en el sustituyente Ar1 donde se intercambian un fluacuteor y
un trifluorometil Por tanto las sentildeales que se conservan con desplazamientos a
710 ppm y 740 ppm pertenecen al benceno para sustituido de Ar2 (unido a la
amina) comuacuten en las dos estructuras Se recurre a los espectros bidimensionales
para la asignacioacuten de las sentildeales
En el espectro COSY del compuesto 7g (Figura 79) se puede determinar queacute
hidroacutegenos pertenecen a carbonos del mismo ciclo por sus acoplamientos
vecinales En la RMN- 1H del compuesto 7g a 710 ppm hay un triplete que
integra por dos hidroacutegenos Teoacutericamente la sentildeal obtenida deberiacutea ser un
doblete ya que los hidroacutegenos del los anillos solo se ven afectados por un
hidroacutegeno vecino La explicacioacuten de esta multiplicidad es la presencia del
aacutetomo de fluacuteor que no genera sentildeal pero si influencia en los hidroacutegenos vecinos
De esta forma se asigna esa sentildeal a 710 ppm a los hidroacutegenos 3acute y 5acute del anillo
de Ar2 Con el espectro COSY quedan descritos los correspondientes vecinos
H2acute y H6acute a 740 ppm
Figura 79 Espectro COSY del compuesto 6g
De esta manera queda claro que las otras dos sentildeales pertenecen a Ar1 Si se
recurre de nuevo a la RMN- 1H del compuesto 6g se puede observar una sentildeal
intensa que integra cuatro protones a 710 ppm Conociendo que dos
hidroacutegenos son H3acute y H5acute que pertenecen a Ar2 los otros dos seraacuten H3 y H5
pertenecientes al benceno unido al hidroxilo Ar1 que en este compuesto
tambieacuten tienen un aacutetomo de fluacuteor contiguo
Descripcioacuten de Compuestos
185
En el espectro COSY del compuesto 7g la sentildeal a 750 ppm se ha asignado a
H2acute y H6acute de Ar2 El compuesto 6g tiene los mismos protones H2acute y H6acute de Ar2 a
igual desplazamiento por lo que la sentildeal a 740 ppm perteneceraacute a los protones
H2 y H6 que faltaban por designar en el compuesto 6g Los uacutenicos protones que
no comparten 6g y 7g son H3 y H5 Por RMN- 1H del compuesto 6g se ha deduce
que estos hidroacutegenos dan una sentildeal a 71 ppm En el espectro del compuesto 7g
a 770 ppm hay una sentildeal que por lo explicado se asigna a estos hidroacutegenos
vecinos del grupo trifluorometil de Ar1
Las asignaciones son
Zona aromaacutetica
6g C2
FBZN
C3
FBZN
C5
FBZN
C6
FBZN
C2
FENIL
C3
FENIL
C5
FENIL
C6
FENIL
RMN-13C
(ppm) 12730 11580 11580 12730 12730 11580 11580 12730
RMN-1H
(ppm) 740 710 710 740 750 710 710 750
7g C2
TBZN
C3
TBZN
C5
TBZN
C6
TBZN
C2
FENIL
C3
FENIL
C5
FENIL
C6
FENIL
RMN-13C
(ppm) 12730 12570 12570 12730 12730 11580 11580 12730
RMN-1H
(ppm) 750 770 770 750 740 710 710 740
Zona alifaacutetica comuacuten
C1
alifaacutetico
C2
alifaacutetico
C3
alifaacutetico
C2
PIRD
C3
PIRD
C5
PIRD
C6
PIRD
RMN-13C
(ppm) 7149 3696 2836 5360 12280 5531 5074
RMN-1H
(ppm) 470 180 250 306 610 245 260
XXII EENNSSAAYYOOSS BBIIOOLLOacuteOacuteGGIICCOOSS
Ensayos Bioloacutegicos
189
XI1Ensayos de actividad antiplasmoacutedica in vitro
Se determinoacute como se describe en el apartado de material y meacutetodos la
actividad antimalaacuterica in vitro y la citotoxicidad de la mayor parte de los
compuestos obtenidos y los resultados se muestran en las siguiente tablas
(Tabla 4 5 y 6)
Compuesto Ar1 n Amina RaRb CI50
NF54 microM
CI50 FCR3 microM
DT50
Vero microM
IS VeroFCR3
1
2 PIPZ CF3NO2 1250 10310 3610 035
2 2 PIPZ NO2CF3 ND 090 490 544
9
2 PIPZ CF3NO2 830 4205 1890 045
11 2 PIRR CF3NO2 390 4605 7040 150
14
1 PIPZ CF3NO2 23260 19020 gt100 065
15 1 PIPZ NO2CF3 10320 18615 gt100 053
17
2 PIPZ NO2CF3 1700 7300 949 013
Referencia QC 004 013 gt50 gt350
Tabla 4 Tabla de resultados de actividad y citotoxicidad de los compuestos de la Serie 0 derivados carboniacutelicos CQ Cloroquina CI50 valores medios del ensayo realizado por triplicado expresados en microM de la inhibicioacuten del 50 del
crecimiento celular de cepas FCR-3 de Plasmodium falciparum DT50 concentracioacuten citotoacutexica media de los compuestos en ceacutelulas Vero IS Iacutendice de Selectividad de los compuestos obtenido del cociente de DT50 de ceacutelulas Vero y la CI50 en
cepas FCR3 ND No determinado
Ensayos Bioloacutegicos
190
Series Ar1 Comp n Amina RaRb CI50
NF54 microM
CI50
FCR3 microM
DT50 Vero microM
IS VeroFCR3
Serie 1
1a 2 PIPZ CF3NO2 230 400 2420 605
1b 2 PIPZ NO2CF3 420 645 gt100 gt100
1g 2 PIRD HF ND 1689 1790 106
Serie 2
2a 2 PIPZ CF3NO2 ND 130 gt200 gt100
2b 2 PIPZ NO2CF3 ND 223 gt150 8598
2c 2 PIPZ HCF3 ND 105 gt250 gt100
2d 2 DZP CF3NO2 ND 075 133 1770
2f 2 PIPR CF3NO2 ND 070 660 670
Serie 3
3b 2 PIPZ NO2CF3 1670 3615 gt100 380
3e 2 PIRR CF3NO2 610 1050 2970 190
3g 2 PIRD HF ND 1403 2460 175
Serie 4
4b 1 PIPZ NO2CF3 2170 10225 7460 070
Serie 5
5a 2 PIPZ CF3NO2 130 050 2090 4180
5b 2 PIPZ NO2CF3 170 490 7570 1540
5c 2 PIPZ HCF3 ND 093 gt200 gt100
5f 2 PIPR CF3NO2 ND 015 550 5500
5g 2 PIRD HF ND 040 3430 8590
Serie 6
6a 2 PIPZ CF3NO2 ND 036 8798 gt100
6f 2 PIPR CF3NO2 ND 048 3000 gt100
6g 2 PIRD HF ND 066 gt1000 gt1000
Serie 7
7g 2 PIRD HF ND 560 gt300 gt100
Referencia CQ 004 013 gt50 gt300
Tabla 5 Tabla de resultados de actividad y citotoxicidad de los compuestos hidroxiacutelicos CQ Cloroquina CI50 valores medios del ensayo realizado por triplicado expresados en microM de la inhibicioacuten del 50 del crecimiento celular de cepas FCR-3 de Plasmodium falciparum DT50 concentracioacuten citotoacutexica media de los compuestos en ceacutelulas Vero IS Iacutendice de
Selectividad de los compuestos obtenido del cociente de DT50 de ceacutelulas Vero y la CI50 en cepas FCR3 ND No determinado
Ensayos Bioloacutegicos
191
Serie 8
Ar1 Amina RaRb IC50
NF54 microM
IC50
FCR3 microM
DT50 Vero
microM
DT50 MCF7
microM
IS VeroFCR3
1
PIPZ NO2CF3 ND SA 150 471 ND
2 PIRR CF3NO2 214 465 101 ND 022
Referencia CQ 004 013 gt50 ND gt400
Tabla 6 Tabla de resultados de actividad y citotoxicidad de los compuestos de la Serie 8 derivados oxima CQ Cloroquina CI50 valores medios del ensayo realizado por triplicado expresados en microM de la inhibicioacuten del 50 del
crecimiento celular de cepas FCR-3 de Plasmodium falciparum DT50 concentracioacuten citotoacutexica media de los compuestos en ceacutelulas Vero IS Iacutendice de Selectividad de los compuestos obtenido del cociente de DT50 de ceacutelulas Vero y la CI50 en
cepas FCR3 ND No determinado SA sin actividad
XI2 Ensayos de actividad antiplasmoacutedica in vivo
Los ensayos in vivo comenzaron con los ensayos de virulencia para obtener
una aproximacioacuten del comportamiento de la cepa elegida Fueron desarrollados
como se muestra en la figura 80
Figura 80 Desarrollo del ensayo de virulencia previo al ensayo de actividad in vivo de los compuestos
En ratones parasitados al 50 hay 24x106 hematiacutees infectados por microL y son
necesarios 107 hematiacutees totales por ratoacuten Para el test de Peters se dispuso de
Ensayos Bioloacutegicos
192
100 ratones pero en los caacutelculos teniendo en cuenta las posibles peacuterdidas se
contoacute con 110 ratones en total Asiacute fueron necesarios 110x107 paraacutesitos para
comenzar la experimentacioacuten El volumen maacuteximo que inyectar es 100 microL de
solucioacuten lo que supone preparar 11 mL de solucioacuten de sangre parasitada al
comienzo del ensayo
Teniendo en cuenta estos tres datos fueron necesarios 458 microL de sangre
infectada al 50 en un volumen de 11 mL de suero fisioloacutegico Con la
inoculacioacuten de los ratones da comienzo el Test de Peters
Los resultados a lo largo del test se ofrecen en la Tabla 7
Test de Peters (respuesta visual externa) P Supervivencia
Grupo Diacutea 0 Diacutea 1 Diacutea 2 Diacutea 3 Diacutea 4 Diacutea 5 Diacutea 7 Diacutea 9 Diacutea 11 Diacutea 12
Control negativo - - + AC + AC + AC 23 910 35 13 11 1
Control positivo - - + AC + AC + AC 19 1010 68 44 44 2
Grupo 2a1 - - + AC + AC + AC 24 710 34 12 - -
Grupo 2a2 - - + AC + AC + AC 32 810 22 22 - -
Grupo 2a3 - - + AC + AC + AC 14 1010 66 55 13 1
Grupo 2a4 - - + AC + AC + AC 31 910 45 22 12 1
Grupo 5f1 - +AC +AC
ID
+AC
BMBO
+AC
BMBO 6 510 35 33 23 2
Grupo 5f2 - +AC + AC +AC
BMBO
+AC
BMBO 15 1010 67 45 23 -
Grupo 5f3 - +AC + AC + AC + AC 32 910 44 23 - -
Grupo 5f4 - +AC + AC + AC + AC 18 1010 67 44 - -
Tabla 7 Resultados de los ensayos in vivo para los compuestos 2a y 5f P porcentaje de parasitemia (-) sin respuesta visual externa (+) respuesta externa AC alteracioacuten momentaacutenea del comportamiento en el momento de la inyeccioacuten del tratamiento BM baja movilidad BO baja oxigenacioacuten principios de cianosis parasitemia medida al cuarto diacutea
Supervivencia expresada en ratones supervivientes con respecto al grupo el diacutea determinado
XI3 Discusioacuten de ensayos bioloacutegicos
Los resultados bioloacutegicos obtenidos ofrecen datos de estructura-actividad
suficientemente consistentes como para proseguir con un refinamiento
estructural de los compuestos El estudio del comportamiento de los
compuestos de las diferentes series en el ensayo de actividad antiplasmoacutedica in
vitro en la cepa FCR3 ha sido suficiente para comprobar que (Series 1-7) son
mucho maacutes activos en todos los casos los derivados hidroxiacutelicos (CHOH) que
un reducido nuacutemero de derivados carboniacutelicos (Serie 0) Por esto no fueron
ensayados el resto de compuestos de la Serie 0
Ensayos Bioloacutegicos
193
Los mismos resultados se obtuvieron para las dos oximas de la Serie 8 por lo
que se paroacute su siacutentesis Sin embargo esto no es extensible a los datos de
toxicidad que se ve influenciada por otros sustituyentes en la moleacutecula Por esto
se centraraacute el estudio en los resultados de las modificaciones estructurales de
los derivados hidroxiacutelicos pertenecientes a las Series 1 a 7
En referencia al sustituyente en la posicioacuten Ar1 comparando series como 1 vs
2 y 3 vs 5 se puede destacar que las series con un grupo fluacuteor en Ar1 aumentan
significativamente su actividad sin ser extensible este dato a la toxicidad (veacutease
compuestos 1a vs 2a 1b vs 2b 3b vs 5b y 3g vs 5g) La siguiente comparativa se
basa en la naturaleza de los anillos condensados (benzo[b]tiofeno y naftaleno)
respecto del benceno sustituido que forman el nuacutecleo del sustituyente Ar1 En
una primera aproximacioacuten se puede ver que la actividad desciende en orden
derivados de FNFTgtderivados de FBZNgtderivados de FBTF Comparando
ahora la actividad de los compuestos 1a vs 2a vs 3a vs 5a vs 6a puede verse que
el compuesto 5f (derivado de FNFT) tiene el mejor dato de CI50 pero el
compuesto 6a (derivado de FBZN) es el que mejor actividad in vitro ha
mostrado siendo soacutelo 3 veces menos activo que la CQ usada como referencia Si
se comparan los derivados de FBTF (Serie 2) y FNFT (Serie 5) en general los
compuestos de la Serie 5 son maacutes activos que sus homoacutelogos de la Serie 2
excepto en el caso de los compuestos 2b vs 5b
En cuanto a toxicidad aunque de forma menos marcada se observa un
aumento en los derivados de FNFT respecto de sus homoacutelogos de FBTF
Centrando el estudio en la variacioacuten de la longitud de la cadena alifaacutetica se
comparan los compuestos 3b y 4b La mayor parte de los compuestos
sintetizados contienen dos carbonos en la cadena alifaacutetica La disminucioacuten en
un aacutetomo de carbono en esta cadena (Compuestos de la Serie 0 14 y 015 y Serie
4) supone una peacuterdida muy considerable de la actividad de los compuestos
Este dato de menor actividad condujo a cerrar esta serie
La naturaleza de la amina central ademaacutes de influir claramente en la
actividad tiene gran influencia en la toxicidad in vitro de los derivados De
forma que se puede ver como la mayoriacutea de derivados de piperazina muestran
una toxicidad bastante baja en comparacioacuten con compuestos derivados de otras
aminas Por el contrario exceptuando el compuesto 6a estos derivados tienen
menor actividad que sus anaacutelogos con otras aminas como homopiperazinas
(compuestos 2a vs 2d) o piperidinas (compuestos 2a vs 2f o 5a vs 5f)
Ensayos Bioloacutegicos
194
Se puede plantear como hipoacutetesis que la presencia de un grupo NH libre en la
estructura aumenta considerablemente la toxicidad de los compuestos Este
caso se observa en los derivados de la Serie 2 y Serie 3 donde los compuestos
con piperazina no son toacutexicos pero al introducir una amina con un NH libre
aumenta su toxicidad a la vez que lo hace la actividad Esto no es de aplicacioacuten
en los anaacutelogos de la Serie 5 (ya que el compuesto 5a contiene el anillo de
piperazina y muestra toxicidad) por lo que se podriacutea deducir que el grupo FNFT
confiere por si mismo cierta toxicidad Con respecto a los derivados de
tetrahidropiridina no se tienen suficientes datos como para extraer conclusiones
claras en la relacioacuten estructura-actividad
Por uacuteltimo se estudia la variacioacuten de la actividad y citotoxicidad en relacioacuten a
los sustituyentes en Ar2 Si se comparan los compuestos a y b de las diferentes
series se deduce que es conveniente para la actividad que el grupo CF3 esteacute en
posicioacuten orto con respecto a la amina (compuestos ldquoardquo de las diferentes series)
Los compuestos con CF3 en para (compuestos ldquobrdquo) son menos activos pero
tambieacuten menos toacutexicos Los anaacutelogos que carecen de grupo NO2 (compuestos 2c
y 5c) aumentan la actividad y cabe destacar el descenso en la toxicidad por lo
que se deduce que el grupo NO2 confiere toxicidad no ligada a la actividad
como el caso de los grupos NH libres Los datos obtenidos permiten una
aproximacioacuten al comportamiento de los compuestos in vivo Para estos ensayos
de los compuestos disponibles se seleccionaron dos el 5f el maacutes activo
(proacuteximo al compuesto de referencia) y 2a el de mejor perfil de toxicidad
En la Tabla 4 se muestran los datos experimentales obtenidos durante la
realizacioacuten del Test de Peters El compuesto 5f disminuye en gran medida la
parasitemia a altas concentraciones pero por acumulacioacuten en el tratamiento
diario provoca diferentes muestras de toxicidad como mala oxigenacioacuten o
alteraciones de conducta de los ratones A concentraciones menores los
resultados desafortunadamente no son tan relevantes como cabiacutea esperar ni en
cuanto a parasitemias ni a supervivencia
El compuesto 2a si bien no muestra indicios de toxicidad no mejora los
resultados con respecto a la CQ en datos de parasitemia ni de supervivencia
XXIIII EENNSSAAYYOOSS CCOOMMPPUUTTAACCIIOONNAALLEESS
Ensayos Computacionales
197
XII1 Propiedades fisicoquiacutemicas de los compuestos
Todos los valores obtenidos en relacioacuten a las propiedades fisicoquiacutemicas de
los compuestos sintetizados se exponen en la tabla siguiente (Tabla 8)
ABS TPSA (Ǻ2)
n-ROTB
PM miLogP KOWLogP ALogPS
21 MLogP
n-OHNH n-ON aceptores
Lipinskis violations ID donadores
rule
gt500 lt5 lt5 lt5 lt415 lt5 lt10 le1
01 8506 6940 7 46350 503 486 480 414 0 6 1
02 8507 6937 7 gt500 503 486 476 414 0 6 1
03 10000 2031 5 36450 481 548 52 442 0 2 0
04 8507 6937 7 48151 419 506 476 424 0 6 0
05 8507 6937 7 48151 419 506 476 424 0 6 0
06 10000 2355 6 43651 431 525 502 451 0 3 0
07 8703 6368 7 49554 401 543 504 485 0 5 0
08 8203 7816 8 49554 448 576 463 445 1 6 0
09 8506 6940 7 4940 532 504 479 448 0 6 1
010 8507 6937 8 gt500 489 504 520 448 0 6 0
011 8202 7820 8 4940 533 525 435 448 1 6 1
012 10000 2031 5 35947 510 566 507 477 0 2 1
013 10000 2031 6 37741 481 544 461 487 0 2 0
014 8506 6940 6 44340 505 531 458 427 0 6 1
015 8506 6940 6 44340 505 531 461 427 0 6 1
016 8507 6937 7 47548 541 524 457 458 0 6 1
017 8506 6940 7 47540 541 524 458 458 0 6 1
018 10000 2355 6 43048 552 543 504 485 0 3 1
019 8203 7816 8 48951 463 594 461 478 1 6 0
020 10000 2031 5 37746 519 580 490 514 0 2 1
021 8507 6937 7 42542 430 407 372 390 0 6 0
022 8203 7816 8 43945 458 477 373 411 1 6 0
023 10000 2031 5 32740 408 468 422 411 0 2 0
81 7971 8489 7 47247 538 468 463 395 1 7 1
82 7668 9368 8 47247 469 458 463 395 1 6 0
CQ 9930 2820 8 31990 501 450 528 352 1 3 1
Tabla 8 Datos computacionales de las propiedades fisicoquiacutemicas de los derivados de la Serie 0 y Serie 8 ABS porcentaje de absorcioacuten calculado como 109 ndash (0345 x TPSA) siendo TPSA el Aacuterea Superficial Polar Topoloacutegica n-
ROTB es el nuacutemero de enlaces de giro permitido Log P es el coeficiente de particioacuten del compuesto en octanol-agua n-OHNH es nuacutemero de enlaces de hidrogeno donadores n-ON es el nuacutemero de enlaces de hidroacutegeno aceptores CQ
cloroquina
ID ABS TPSA (Ǻ2) n-ROTB PM miLogP KOWLogP ALogPS 21 MLogP n-OHNH n-ON
aceptores Lipinskis violations donadores
rule
gt500 lt5 lt5 lt5 lt415 lt5 lt10 le1
1a 8398 7253 7 46550 469 468 463 395 1 6 0
1b 8398 7253 7 gt500 469 458 463 395 1 6 0
1g 10000 2347 5 40399 447 530 461 423 1 2 0
2a 8398 7253 7 48349 407 488 499 432 1 6 0
2b 8398 7253 7 gt500 478 488 499 432 1 6 0
2c 9979 2670 6 43849 397 507 509 432 1 3 0
2d 8398 7253 7 49751 413 538 505 453 1 6 0
2f 8095 8132 8 49751 414 558 461 453 2 6 0
3b 8398 7253 7 49600 498 486 483 429 1 6 0
3e 8095 8132 8 49607 499 506 439 429 1 6 0
3g 10000 2347 5 36146 476 548 466 457 1 2 0
4b 8399 7250 6 44540 471 415 477 408 1 6 0
5a 8399 7250 7 47750 507 506 503 466 1 6 1
5b 8399 7250 7 47750 507 424 384 546 1 6 1
5c 9979 2670 6 46896 519 525 514 466 1 3 1
5f 8095 8132 8 49147 536 576 465 486 2 6 1
5g 10000 2347 5 37945 485 568 488 495 1 2 0
6a 8398 7253 7 46591 337 389 413 398 1 6 0
6f 8095 8132 8 47994 424 459 374 419 2 6 0
6g 10000 2347 5 329 39 374 450 395 425 1 2 0
7g 10000 2347 6 37974 447 526 469 468 1 2 0
CQ 9930 2820 8 31990 501 450 528 352 1 3 1
Tabla 9 Datos computacionales de las propiedades fisicoquiacutemicas de los derivados hidroxiacutelicos ABS porcentaje de absorcioacuten calculado como 109 ndash (0345 x TPSA) siendo TPSA el Aacuterea Superficial Polar Topoloacutegica n- ROTB es el nuacutemero de enlaces de giro permitido Log P es el coeficiente de particioacuten del compuesto en octanol-agua n-OHNH es nuacutemero de enlaces de hidrogeno donadores n-
ON es el nuacutemero de enlaces de hidroacutegeno aceptores CQ cloroquina
Ensayos Computacionales
199
XII2 Discusioacuten de propiedades fisicoquiacutemicas
Los estudios teoacutericos de los paraacutemetros fiacutesico-quiacutemicos muestran que los
compuestos cumplen las Reglas de Lipinski ya que tienen un peso molecular
menor de 500 Daltons los coeficientes de particioacuten octanolagua estaacuten dentro
de los liacutemites admitidos (entre -04 y 56) lejos de los cinco enlaces donadores
de hidroacutegeno (suma de los OH y NH) y de los 10 aceptores (suma de O y N)
Las caracteriacutesticas estructurales han de ser tenidas en cuenta para predecir la
solubilidad de los compuestos
El tamantildeo de las estructuras influye de manera directa en la absorcioacuten de un
compuesto puesto que los de bajo peso molecular difunden mejor pasivamente
Todos los compuestos de este trabajo presentan bajos pesos moleculares
La polaridad de las estructuras tambieacuten juega un papel importante en las
caracteriacutesticas farmacocineacuteticas Las moleacuteculas apolares difunden con mayor
facilidad que las polares ya que son maacutes lipoacutefilas Los coeficientes de reparto
octanolagua determinan esta caracteriacutestica de la moleacutecula teniendo en cuenta
el medio Es decir los compuestos con altos coeficientes de particioacuten son maacutes
hidroacutefobos y por tanto tendraacuten buena difusioacuten Los valores obtenidos para los
distintos compuestos en las diferentes aplicaciones utilizadas no muestran una
tendencia clara que permita distinguir entre estructuras Lo que siacute cabe destacar
es que todos cuentan con valores altos proacuteximos a 5 que les confiere buena
difusioacuten
Los aacutetomos que conforman las moleacuteculas estaacuten cargados y confieren
polaridad a la estructura Esta caracteriacutestica estaacute distribuida en el espacio de
diferente forma seguacuten los aacutetomos de O N y F que posea la moleacutecula dando
lugar al TPSA (suma de superficie de todos los aacutetomos polares) La bibliografiacutea
(Palm et alts 1997) demuestra que la liposolubilidad estaacute relacionada con los
valores de TPSA Los valores de TPSA entre 63 y 139 Aring2 predicen una buena
absorcioacuten de los compuestos La mayoriacutea de las estructuras del trabajo estaacuten
dentro de esos paraacutemetros incluso hay estructuras que como la CQ tienen
TPSA menores de 63 Aring2 que indican que el porcentaje de absorcioacuten de los
compuestos seraacute oacuteptimo
Todos los paraacutemetros fisicoquiacutemicos proponen unas buenas cualidades de
absorcioacuten de los compuestos de este trabajo
Ensayos computacionales
200
XII3 Estudios de Modelizacioacuten y Acoplamiento Molecular
Se realiza una primera aproximacioacuten para la validacioacuten de la diana propuesta
usando el programa Autodock donde se analizan los modos de unioacuten maacutes
representativos de las diez conformaciones calculadas del compuesto EH58 y del
5a con al menos un enlace de hidroacutegeno con uno de los aspartatos del sitio
cataliacutetico Las energiacuteas de unioacuten y los valores de RMSD de EH58 y las energiacuteas de
unioacuten del compuesto 5a para esas diez conformaciones se muestran en la
siguiente tabla
EH58 5a
Confa Energiacutea
b RMSD
c Energiacutea
b
1 -406 453 -616
2 -250 361 -607
3 -245 559 -585
4 -230 393 -584
5 -232 299 -570
6 -232 632 -556
7 -209 551 -556
8 -197 557 -545
9 -162 556 -525
10 -121 733 -478
Tabla 10 Datos de energiacutea de las distintas conformaciones de los compuestos EH58 y 5a a Mejores conformaciones obtenidas por docking ordenadas seguacuten la energiacutea b energiacutea de unioacuten en in Kcalmol calculadas con el programa
Autodock c Valores RMSD en Aring
Los resultados de los ensayos computacionales realizados al compuesto 5a
producen representaciones graacuteficas tridimensionales del MEP (Figura 81) de la
conformacioacuten de miacutenima energiacutea obtenida seguacuten los datos mostrados en la
anterior Tabla 10
En el MEP se observa una red de potencial electronegativo alrededor del fluacuteor
los grupos OH y los NO2 Asiacute se puede deducir que los compuestos maacutes activos
los derivados hidroxiacutelicos tendraacuten un potencial electronegativo y un modo de
accioacuten similar
Ensayos Computacionales
201
Figura 81 MEP de la mejor conformacioacuten del compuesto 5g
Los estudios de docking se orientaron a la unioacuten entre el compuesto liacuteder y la
plasmepsina II como se ha explicado anteriormente Se llegoacute a la conclusioacuten que
se forma un puente de hidroacutegeno con el sitio activo de la aspartato cataliacutetica de
la enzima (ASP 214 y ASP 34) Esta interaccioacuten se da sobre el uacutenico grupo
hidroxilo de la moleacutecula y el residuo ASP 214
Todo esto nos aporta representaciones graacuteficas como la obtenida para la mejor
conformacioacuten encontrada para el compuesto 5a dentro del sitio activo de la
plasmepsina II (figura 82)
Figura 82 Representacioacuten de la unioacuten del compuesto 5a y la Plasmepsina Sentildealado con raya discontinua amarilla la unioacuten del OH y la ASP 214 Tambieacuten se puede ver dibujadas en rama otras terminaciones de la enzima
En base al resultado obtenido en la primera aproximacioacuten con el programa
Autodock que valida como diana la plasmepsina se realiza una segunda
aproximacioacuten con el programa ICM que emplea menos tiempo para sus caacutelculos
una vez conocidos los paraacutemetros de buacutesqueda base
Ensayos computacionales
202
Para este segundo estudio se emplearon las estructuras de los derivados 5a 5c
5g 6a 6g y 6f Una de las hipoacutetesis base del estudio es que partiendo de que
habiacutea comprobado que el compuesto 5a encaja en el sitio activo los demaacutes
derivados deberaacuten encajar tambieacuten Esto se confirma en la figura 83 donde se
muestra como los diferentes derivados solapan estructuralmente en el hueco del
sitio activo de la moleacutecula
Figura 83 Imagen de la plasmepsina donde se muestra el solapamiento de las diferentes estructuras estudiadas
El programa ICM realizoacute caacutelculos para obtener las energiacuteas de las mejores
conformaciones de las moleacuteculas propuestas (Tabla 11)
Compuesto Energiacutea
(Kcalmol) Actividad
uM
5f -917627 015
5a -867278 05
6f -815261 048
6a -764088 036
5c -751448 093
6g -681119 066
Tabla 11 Energiacutea de las conformaciones oacuteptimas de los diferentes compuestos estudiados
Teniendo en cuenta los datos de energiacutea y las configuraciones espaciales maacutes
estables para el sitio de unioacuten de las moleacuteculas se obtuvo la representacioacuten de las
interacciones que realiza cada moleacutecula en el sitio activo de la enzima
plasmepsina (Figuras 84 a 89)
En la figura 84 se puede ver la representacioacuten de las interacciones del
compuesto 5a en el sitio activo En amarillo quedan sentildealadas las interacciones
hidrofoacutebicas (interacciones de Van der Waals) entre restos apolares de la
Ensayos Computacionales
203
moleacutecula y de los restos de la enzima
En verde se sentildeala el puente de
hidroacutegeno entre el grupo OH y la
ASP 214 En este compuesto el
programa plantea otra posible unioacuten
con el resto THR 217 En azul se
resalta la regioacuten ionizable la amina
Los restos libres que podriacutean
interaccionar con las moleacuteculas
propuestas se plantean en recuadros
alrededor de ella
Figura 84 Representacioacuten de las interacciones de 5a
En la figura 85 se puede estudiar la
variacioacuten en las interacciones con el
cambio de posicioacuten del grupo CF3 y la
desaparicioacuten del grupo NO2 del
compuesto 5c Ahora el programa
plantea la posibilidad de la interaccioacuten
del OH con ASP 34 ademaacutes de la
interaccioacuten con ASP 214
Figura 85 Representacioacuten de las interacciones de 5c
En la figura 86 se muestra el compuesto 5f y se aprecia el cambio los aacutengulos de
conformacioacuten de la estructura
cuando la amina PIPZ central se
cambia por PIPR Se observa como
se establecen muchas maacutes
interacciones apolares del grupo
FNFT y del CF3 en orto pero
disminuyen las del ciclo de la amina
con respecto a la piperazina
Ademaacutes se plantea una nueva unioacuten
por puente de hidroacutegeno entre el
NH libre y la ASP 34
Figura 86 Representacioacuten de las interacciones de 5f
Ensayos computacionales
204
En la figura 87 el compuesto 6f se
diferencia del anterior en que en lugar de
un FNFT se tiene un FBZN que plantea
una unioacuten con el resto TYR 192 Se ve a
simple vista la disminucioacuten en la cantidad
de interacciones apolares que hay en la
moleacutecula
Figura87 Representacioacuten de las interacciones de 6f
En la figura 88 se representa el
compuesto 6a Se puede ver como de
nuevo el anillo de PIPZ vuelve a dar
interacciones apolares y aporta
regiones ionizables aunque se pierde
el puente de hidroacutegeno con ASP 34
Figura 88 Representacioacuten de las interacciones de 6a
En esta uacuteltima figura 89 se
representa el compuesto 6g que se
diferencia del anterior en que la
amina central es la PIRD Este ciclo
posibilita una interaccioacuten con TYR 77
y VAL 78 La distribucioacuten de
interacciones apolares se asemeja a la
de la moleacutecula 5c ya que el
sustituyente tambieacuten de caraacutecter
electro-atrayente se encuentra en
posicioacuten para del anillo
Figura 89 Representacioacuten de las interacciones de 6g
En este estudio se incluyoacute una seacuteptima moleacutecula el derivado 4b Este
compuesto se diferencia del resto de los sintetizados en que su cadena alifaacutetica
cuenta con dos aacutetomos de carbono lo que significa que la separacioacuten entre el OH
y la amina es de un uacutenico carbono Los caacutelculos sobre energiacuteas y configuraciones
espaciales de maacutexima estabilidad para una correcta interaccioacuten con la diana
Ensayos Computacionales
205
propuesta mostraron que el compuesto 4b puede adoptar una conformacioacuten que
le permitiriacutea acceder al hueco activo de la plasmepsina pero no se produciriacutea la
interaccioacuten caracteriacutestica del grupo OH y la ASP 214
Estos datos ofrecen la posibilidad de un farmacoacuteforo que se muestra en la
figura 90
Figura 90 Farmacoacuteforo propuesto para los derivados de arilaminoalcoholes con actividad antimalaacuterica que tienen como diana propuesta la plasmepsina II
En la imagen del farmacoacuteforo quedan destacadas en amarillo las zonas
apolares que establecen interacciones hidrofoacutebicas con los aminoaacutecidos del sitio
activo de la plasmepsina y que se corresponden con la zona aromaacutetica Ar1 Las
flechas granate sentildealan las posibles interacciones que establece el aacutetomo de fluacuteor
Las flechas verdes sentildealan las interacciones polares entre los grupos polares y la
ASP 214 Asiacute de la zona azul correspondiente a las interacciones de la amina se
destaca una segunda interaccioacuten de los NH libres con la enzima en el resto ASP
34 El resto del ciclo de amina establece interacciones apolares
En la imagen la parte de Ar2 por su naturaleza aromaacutetica tambieacuten plantea
interacciones apolares con la enzima propuesta
Con los datos obtenidos y tomando como diana la enzima plasmepsina se puede
proponer un nuevo esquema para seguir con el refinamiento estructural
Ensayos computacionales
206
Figura 91 Estructura general planteada para el refinamiento estructural
Las nuevas estructuras deberaacuten contar con un grupo hidroxilo separado por un
espaciador alifaacutetico de una longitud miacutenima de dos carbonos con una amina A
ambos lados de la moleacutecula se dispondraacuten las zonas de interaccioacuten apolar
formadas por sistemas aromaacuteticos sencillos o conjugados sutituidos por grupos
de caraacutecter electroatrayente como haloacutegenos metoxi o trifluorometoxi
Ensayos Computacionales
207
XII4 Discusioacuten de resultados de modelizacioacuten
Los estudios computacionales proponen como diana de los compuestos
desarrollados en este trabajo la plasmepsina II Seguacuten los datos obtenidos para
las diferentes estructuras estudiadas se pueden establecer relaciones
estructura-actividad Estos resultados se ven confirmados por las distintas
interacciones de los compuestos en su conformacioacuten maacutes estable dentro de
hueco activo de la enzima
Al estudiar los resultados de las diferentes interacciones por zonas de las
moleacuteculas en las figuras 84 a 89 se podriacutea dar una explicacioacuten de la diferente
actividad mostrada por los compuestos ensayados
Queda evidenciado desde la primera aproximacioacuten computacional que el
puente de hidroacutegeno entre el grupo OH y la ASP 214 es el punto clave en la
validacioacuten de la plasmepsina II como diana de los compuestos Esta interaccioacuten
confirma que es requisito indispensable para la actividad de los derivados la
presencia de un grupo OH en la estructura
Los sistemas aromaacuteticos conjugados o anillo aromaacutetico que conforman Ar1
son sistemas completamente apolares que ejercen interacciones hidrofoacutebicas
con los restos apolares del bolsillo activo de la enzima como isoleucina (ILE)
fenilalanina (PHE) o leucina (LEU) Cuanto mayor es la nube de electrones π del
sistema Ar1 mayores son las interacciones con los sistemas π de los
aminoaacutecidos que explica porqueacute los derivados de la Serie 5 tienen maacutes
actividad que los de la Serie 6 Varias representaciones plantean una posible
unioacuten polar del aacutetomo de fluacuteor con tirosina (TYR) que aumentariacutea la interaccioacuten
global de la moleacutecula y aclara el porqueacute los derivados fluorados son maacutes afines
que los no fluorados
La longitud de la cadena alifaacutetica tambieacuten juega un papel importante en la
actividad de los derivados la disminucioacuten de tres aacutetomos de carbono a dos de
la cadena alifaacutetica ha supuesto una disminucioacuten draacutestica de la actividad (veacuteanse
los compuestos 3b y 4b) Los estudios realizados al compuesto 4b podriacutean
explicar esta disminucioacuten Los carbonos de la cadena alifaacutetica tienen capacidad
de rotar lo que confiere a la estructura mayor capacidad para adoptar
diferentes conformaciones que le permiten llegar a la disposicioacuten de miacutenima
energiacutea Los derivados ensayados con un carbono alifaacutetico menos seguacuten las
previsiones teoacutericas adoptan una conformacioacuten que les permite acceder al
Ensayos computacionales
208
hueco activo de la plasmepsina II pero no permite la unioacuten del grupo OH con
el resto ASP 214 que se predice como esencial para la actividad de los
compuestos presentados en este trabajo Se puede predecir que teoacutericamente la
plasmepsina II no es la diana adecuada para los derivados de la Serie 0 14 y 15
y 4b
La naturaleza de la amina central juega un papel muy importante en este tipo
de estudios Puede verse en las representaciones que seguacuten sea la amina
piperazina o amino-piperidina las interacciones con el entorno son muy
diferentes Centrando la atencioacuten en los derivados de PIPZ se observa que el
ciclo por completo da lugar a una regioacuten ionizable por el efecto del N y las
interacciones electrostaacuteticas del ciclo debidas al plegamiento espacial que
confiere estabilidad Si ahora se estudian las PIPR lo que se puede ver es que el
ciclo pierde interaccioacuten apolar con el medio ya que se plantea un nuevo puente
de hidroacutegeno del grupo NH libre con el resto ASP 34 Esta segunda unioacuten polar
hace que la moleacutecula adquiera menos energiacutea y maacutes estabilidad dentro del
hueco activo que justifica por queacute los derivados de amino-piperidina muestran
maacutes actividad (compuestos 2a y 2f 5a y 5f 6a y 6f)
Los grupos CF3 y NO2 presentes en Ar2 y OH seguacuten el mapa MEP de
potenciales electrostaacuteticos son restos que aportan polaridad a las moleacuteculas La
posibilidad de establecer nuevas interacciones polares maacutes fuertes con sitios del
hueco de la plasmepsina podriacutea explicar por queacute son maacutes activos los
compuestos con estos restos
Con los datos obtenidos en los estudios computacionales se puede proponer
un posible farmacoacuteforo para la plasmepsina II En la figura 89 se ve como las
interacciones maacutes importantes son las descritas teoacutericamente para los enlaces
polares del OH con la ASP214 NH libre con ASP 34 y la posible interaccioacuten del
aacutetomo de fluacuteor de Ar1 con otros restos como tirosina lo que justifica los datos de
actividad de los derivados El resto de interacciones con el sitio activo son
producidas por los restos apolares de la estructura lo que sugiere que es
necesaria la presencia de zonas aromaacuteticas terminales como son los NFT o BZN
en Ar1 y Ar2 Los datos disponibles no permiten establecer una hipoacutetesis sobre
la influencia del tamantildeo de las zonas aromaacuteticas ni de los sustituyentes
presentes en la zona aromaacutetica de Ar2
CONCLUSIONES
Conclusiones
211
El objetivo de este trabajo ha sido la obtencioacuten de nuevos arilaminoalcoholes
como agentes antimalaacutericos para el tratamiento de la malaria resistente al
tratamiento con cloroquina
En las paacuteginas de esta memoria se han presentado los antecedentes del tema
los objetivos fijados y el plan de trabajo para su desarrollo Se ha realizado la
parte experimental correspondiente y ha sido descrito el trabajo realizado en la
preparacioacuten de los compuestos asiacute como en los ensayos bioloacutegicos y
computacionales Finalmente se ha realizado la discusioacuten de los diferentes
resultados obtenidos para obtener unas conclusiones estructura actividad de los
compuestos que se presentan
Desde el punto de vista quiacutemico las aportaciones son las siguientes
1 Se ha sintetizado cuarenta y siete nuevos compuestos derivados de
arilaminas identificados mediante teacutecnicas claacutesicas de elucidacioacuten
estructural como cromatografiacutea de capa fina espectroscopia infrarroja
resonancia magneacutetica nuclear de protoacuten anaacutelisis elemental y punto de
fusioacuten
2 Se ha logrado optimizar rutas sinteacuteticas anteriormente utilizadas para
obtener derivados con mejores rendimientos En el caso de la siacutentesis de
aminas sustituidas se ha comprobado que una relacioacuten molar de amina
protegida-halogenuro de arilo 151 mejora considerablemente los tiempos
de reaccioacuten El uso de esta proporcioacuten de reactivos de partida favorece que
la reaccioacuten finalice en una hora En la obtencioacuten de los derivados
carboniacutelicos por siacutentesis de Mannich la reaccioacuten se optimiza cuando la
temperatura de reflujo se mantiene entre 130 y 140 ordmC De esta forma el
tiempo necesario para completar la reaccioacuten se reduce a un maacuteximo de tres
horas
3 La aplicacioacuten de la cromatografiacutea en columna flash para la purificacioacuten de
23 de los 47 compuestos ha supuesto un notable avance en la obtencioacuten de
los derivados Las condiciones de trabajo se han adaptado a las necesidades
de cada reaccioacuten reducieacutendose asiacute los tiempos globales de siacutentesis
aumentando los rendimientos y disminuyendo los costes
Desde el punto de vista bioloacutegico las aportaciones son las siguientes
1 Diez de los treinta compuestos evaluados in vitro frente a cepas de
Plasmodium falciparum FCR-3 cloroquino resistentes presentan un valor de
CI50 inferior a 1 microM Quince derivados muestran un nivel de citotoxicidad
en ceacutelulas VERO menor de 50 microM Estos resultados permiten confirmar que
la hipoacutetesis de trabajo planteada fue bien dirigida hacia los objetivos
establecidos
2 Los compuestos 2a y 5f fueron seleccionados para desarrollar ensayos in
vivo Los resultados obtenidos no superan los datos de parasitemia y
supervivencia obtenidos en el tratamiento con CQ
3 Los datos obtenidos en los estudios realizados a la totalidad de los
compuestos presentados en este trabajo indican buenas propiedades
fisicoquiacutemicas de solubilidad y distribucioacuten de cargas electrostaacuteticas Con
estos datos teoacutericos se predice un buen perfil de absorcioacuten en el caso de
tratamientos por viacutea oral
4 Los estudios computacionales proponen como diana de los compuestos
desarrollados en este trabajo la enzima Plasmepsina II que interviene en
los procesos de degradacioacuten de la Hb Quedando pendiente su validacioacuten
experimental
5 Siete de los veintiuacuten derivados hidroxiacutelicos que mostraron buenas
actividades in vitro fueron seleccionados para los estudios de acoplamiento
(docking) con la enzima diana plasmepsina II Se obtuvieron buenos
resultados de acoplamiento de los derivados seleccionados en el sitio activo
de la enzima debido a la unioacuten por puente de hidroacutegeno del grupo
hidroxilo con el resto ASP 214 reforzado por el resto de interacciones
electrostaacuteticas de las zonas apolares de la moleacutecula y restos apolares del
hueco activo de la plasmepsina II
De los resultados bioloacutegicos obtenidos se puede establecer la siguiente
relacioacuten estructura-actividad
1 El estudio de la actividad antimalaacuterica ha demostrado que es esencial la
presencia de un grupo hidroxilo en la estructura Queda demostrado que
los compuestos de las Series 1 a 7 muestran actividad significativa frente al
Plasmodium falciparum resistente a la CQ Los derivados cetona (Serie 0) y
oxima (Serie 8) carecen de intereacutes seguacuten los datos de actividad
Conclusiones
213
2 Entre los derivados hidroxiacutelicos los compuestos de las Series 2 5 y 6 son
los que muestran mejores actividades debido a la presencia de un aacutetomo de
fluacuteor en la posicioacuten 5 del benzo[b]tiofeno en la posicioacuten 4 del naftaleno y
para del benceno respectivamente A su vez son los derivados de las Series
5 y 6 (naftalenos y bencenos) los que han mostrado mejores potenciales
antimalaacuterico
3 La longitud miacutenima de la cadena alifaacutetica debe ser tres unidades que
permitan la libre rotacioacuten estructural Los estudios computacionales
plantean que la disminucioacuten de un aacutetomo de carbono de la cadena alifaacutetica
imposibilita la unioacuten esencial de la estructura a la diana propuesta
4 La amina central juega un papel importante en la actividad-toxicidad de las
estructuras Los resultados obtenidos apuntan a que las piperazinas y
tetrahidropiridinas (compuestos 5a 5b 5c 5g 6a y 6g) son las aminas maacutes
adecuadas para formar parte de los compuestos antimalaacutericos por su buena
relacioacuten toxicidad y actividad in vitro Las piperidinas han resultado maacutes
activas (5f y 6f) pero a su vez mas toacutexicas
5 Los sustituyentes o-trifluorometil y p-nitro benceno (compuestos 5a 5f 6a y
6f) confieren en general buena actividad a los derivados estudiados Los
derivados de aril-tetrahidropiridinas sustituidos con un fluacuteor en para
(compuestos 5g y 6g) tambieacuten demuestran buena actividad antimalaacuterica
Con los datos obtenidos del estudio de los derivados sintetizados se ha
establecido un farmacoacuteforo que permite continuar con el refinamiento
estructural de estos nuevos arilaminoalcoholes Queda abierta la viacutea a la
optimizacioacuten de las estructuras la profundizacioacuten en ensayos bioloacutegicos y en el
mecanismo de accioacuten propuesto para la validacioacuten de la diana plasmepsina II
Conclusions
215
CONCLUSIONS
The objective of this work was to obtain new arylamino alcohols as
antimalarial agents for treating chloroquine-resistant malaria
This thesis presents general background information the proposed objectives
and the plan established for developing the work The experimental part was
carried out and a description of the work involved in preparing the
compounds and in performing biological assays and computational analysis
has also been provided Finally this thesis includes a discussion of the all
results obtained and the structure-activity conclusions reached regarding the
compounds presented here
From a chemical standpoint the work carried out made the following
contributions
1 Forty-seven new arylamino-derived compounds (identified by classical
structural elucidation techniques such as thin layer chromatography
infrared spectroscopy proton nuclear magnetic resonance elemental
analysis and melting point) were synthesized
2 Previously used synthetic routes were optimized so as to obtain derivatives
with better yields In the case of the synthesis of substituted amines a molar
ratio of protected amine to aryl halide 151 improves the reaction times
considerably The use of this proportion of starting reagents helps the
reaction to finish in just one hour In obtaining the carbonyl derivatives by
Mannich reaction the reaction is optimized when the reflux temperature is
maintained between 130 and 140 ordmC Therefore time needed to complete the
reaction is reduced to a maximum of three hours
3 Applying flash column chromatography for the purification of 23 out of the
47 compounds has made a notable advance in obtaining the derivatives
The work conditions have been adapted to the specific needs of each
reaction thereby reducing the time needed for syntheses increasing the
yields and bringing down the costs involved
From a biological point of view contributions from this work included the
following
4 Ten out of the thirty compounds evaluated in vitro against chloroquine-
resistant Plasmodium falciparum strain FCR-3 presented an IC50 value less
Conclusions
216
than 1 microM Fifteen derivatives showed a toxicity level in VERO cells that is
less than 50 microM These results show that the established work hypothesis
was a good approach for attaining the proposed objectives
5 Compounds 2a and 5f were selected for developing in vivo assays The
results obtained do not improve the parasitemia and survival data obtained
in treatment with CQ
6 The data obtained from the assays that were performed on all the
compounds presented in this work indicate good physicocochemical
properties of solubility and good electrostatic charge distribution With this
theoretical data a good absorption profile is predicted in the case of orally
administered treatments
7 The computational studies propose the enzyme plasmepsin II as the target
of the compounds that were developed in this study this enzyme is
involved in the degradation processes of Hb although experimental
validation is still pending
8 Seven out of the twenty-one hydroxyl derivatives which showed good in
vitro activity were chosen for docking studies with the target enzyme
plasmepsin II Good docking results were obtained from the selected
derivatives in the active site of the enzyme due to the bonding of the
hydroxyl group with the ASP 214 by means of a hydrogen bridge
reinforced by the rest of the electrostatic interactions from the nonpolar
areas of the molecule and nonpolar rests from the active gap of plasmepsin
II
The following structure-activity relationship has been established from the
biological results that were obtained in the study
9 The antimalarial activity study has demonstrated that the presence of a
hydroxyl group is essential in the study It has been demonstrated that the
compounds from Series 1 to 7 show significant activity against CQ-resistant
Plasmodium falciparum Based on their activity data the ketone (Series 0)
and oxime (Series 8) derivatives are not of interest
10 From among the hydroxyl derivatives compounds from the Series 2 5 and
6 show the best activity due to the presence of a fluorine atom in position 5
of the benzo[b]thiophene in position 4 of the naphthalene and in para
position of the benzene respectively In addition derivatives from the
Conclusions
217
Series 5 and 6 (naphthalenes and benzenes) have shown better antimalarial
potential
11 The minimum length of the aliphatic chain should be three units that
permit free rotation The computational studies suggest that a decrease of
one carbon atom from the aliphatic chain impedes the essential linking of
the structure to the proposed target
12 The central amine plays an important roll in the toxicity-activity of the
structures The obtained results appear to indicate that the piperazines and
tetrahydropyridines (compounds 5a 5b 5c 5g 6a and 6g) are the most
adequate amines for forming part of the antimalarial compounds due to
their good activity-toxicity relationships in vitro The piperidines were more
active (5f and 6f) but they were also more toxic
13 In general the o-trifluoromethyl y p-nitro benzene substituents (compounds
5a 5f 6a and 6f) give good activity to the derivatives that were studied The
aryl-tetrahydropyridine derivatives that are substituted with fluorine in
para position (compounds 5g and 6g) also show good antimalarial activity
With the data obtained from the study carried out on the synthesized
derivatives a pharmacophore has been established which permits continuing
with the structural refinement of these new arylamino alcohols The road for
optimizing structures and advancing in biological testing and in the mechanism
of action proposed for validating the target plasmepsin II remains wide open
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10- Distribucioacuten de la malaria en Espantildea
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32- Imagen de frotis
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33- Laboratorio de quiacutemica virtual
httpwwwvcclaborglabalogpsstarthtml
34- Herramienta de caacutelculo de propiedades
httpwwwmolinspirationcomcgi-binproperties
35- Disponible en httpeswikipediaorgwikiDocking
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36- Sitio web del programa httpwwwgaussiancomindexhtm
37- Calculo de potenciales
httpmolekelcscschwikipmwikiphpMainDownloadBinary
38- Programa de ICM de modelizacioacuten httpwwwmolsoftcom
40- Sitio web del PDB httpwwwrcsborgpdbhomehomedo
41- Editor molecular httpwwwmolsoftcomicm_browser_prohtml
42- Buscador de cavidades ICM
httpwwwncbinlmnihgovpubmedterm=Pocketome20via20com
prehensive20identification20and20classification20of20ligand2
0binding20envelopes
ANEXOS
Este trabajo ha sido desarrollado en la Unidad de I+D de Medicamentos
del Centro de Investigacioacuten de Farmacobiologiacutea Aplicada (CIFA) de la
Universidad de Navarra perteneciente a uno de los proyectos de
investigacioacuten que dirigen el Dr Antonio Monge Vega y el Dr Ignacio
Aldana Moraza Doctores en Ciencias Quiacutemicas
El trabajo presentado en esta memoria ha sido realizado gracias a la
concesioacuten de la ldquoAyuda para la Formacioacuten de Tecnoacutelogosrdquo concedida por el
Gobierno de Navarra y la ldquoAyuda al Personal Investigador en Formacioacutenrdquo
concedida por la Asociacioacuten de Amigos de la Universidad de Navarra
A mis padres y mi hermana
A Javi y Julen
ldquoPuede que los ideales que albergamos
nuestros suentildeos maacutes anhelados y nuestras maacutes fervientes esperanzas
no lleguen a cumplirse mientras vivimos
Pero eso no importa
Saber que en tu diacutea cumpliste con tu deber y
estuviste a la altura de las expectativas de tus congeacuteneres
es por siacute misma una experiencia gratificante y un logro magniacuteficordquo
Nelson Mandela
Agradecimientos
La realizacioacuten de esta tesis doctoral no hubiese podido llevarse a cabo sin la ayuda y
el apoyo de las personas que han compartido conmigo estos uacuteltimos antildeos A todos
ellos que han hecho posible hoy la presentacioacuten de este trabajo deseo expresar mi maacutes
sincero agradecimiento
Mi agradecimiento especial al Dr Antonio Monge la persona de referencia durante
el desarrollo de todo este trabajo Por apostar por miacute y mi trabajo en momentos en que
todo pareciacutea que no llegariacutea a teacutermino Por ensentildearme que todo el trabajo merece la
pena que la contribucioacuten de todos es igual de vaacutelida que somos una familia Gracias
por su apoyo en los buenos y malos momentos personales
Mi gratitud a la Dra Silvia Peacuterez Silanes por estar siempre dispuesta a ayudarme en
todo lo que fuese necesario en todos los planos de la vida durante estos antildeos por su
gran implicacioacuten en este proyecto por transmitirme tesoacuten orden correccioacuten y sobre
todo optimismo durante todo este tiempo que he tenido el honor de trabajar a su lado
Gracias al Dr Ignacio Aldana la persona que me ofrecioacute la oportunidad de
introducirme en el mundo de la investigacioacuten por ayudarme y apoyarme en todo
momento y transmitirme que en investigacioacuten tambieacuten es importante la tranquilidad
I wish to express my gratitude to Dr Valerie Jullian for being such a splendid host
during my first few days in Toulouse and for considering my small contribution to his
magnificent work to be of importance
I would also like to thank Dr Michel Sauvain for introducing me into the world of in
vivo biological research He accepted the challenge of introducing a chemist into his
specialized area of experimentation with live rodents showing a great amount of
patience with me
I want to give a special thanks to Dr Eric Deharo who had faith in this work and
whose collaboration was immensely helpful He provided the necessary contacts of
other researchers outside the University of Navarras RampD department and
coordinated the project contributing to the success of this work
I would also like to give a special mention to Adriana Pabon from Colombia and to
German Gonzalez Giovanni Garavito and Miguel Quiliano from Peru for their active
participation in this project
A todos los compantildeeros de laboratorio con los que he trabajado estos antildeos
A mi familia por animarme a seguir siempre adelante al hacerme sentir en todo
momento que todo este trabajo es algo de gran importancia y valor humano
ABREVIATURAS
ABS Porcentaje de absorcioacuten
ADN Aacutecido desoxirribonucleico
AMREF African Medical and Reserch Foundation
ARN Aacutecido ribonucleico
ASP 214 Aspartato 214
ASP 34 Asptartato 34
ATP Adenosin trifosfato
BZN Benceno
BZT Benzotiofeno
CCF Cromatografiacutea en capa fina
CDCl3 Triclorometano deuterado
CI50 Concentracioacuten Inhibitoria al 50
COSY Correlated Espectroscopy H-H
CQ Cloroquina
CSP Proteina circumsporozito
DDT Dicloro-difenil-Tricloroetano
DEET NN-dimetil-meta-toluamida
DEPT 90 Distorsionless Enhancement by Polarization Transfer (CH)
DEPT-135 Distorsionless Enhancement by Polarization Transfer
DMEN F-12 Medio de cultivo con mezcla de nutrientes
DMSO Dimetilsulfoacutexido
DOXP Enzima 1-desoxi-D-xilulosa-5-fosfato
DT50 Dosis Toacutexica al 50
ECDC European Centre for Disease Prevention and Control
EMP-1 Proteiacutena de la membrana epitelial
FM Foacutermula Molecular
FAS II Siacutentesis de aacutecidos grasos II
FBZT Fluoro-benzotiofeno
FCR-3 Cepas Plasmodium Falciparum Cloroquino-resistente
FNFT Fluoro-naftaleno
FRP Asociacioacuten de la lucha contra el Paludismo
Hb Hemoglobina
HMBC Heteronuclear Multiple Bond Correlation
HMQC Heteronuclear Multiple Quantum Correlation
HPLC High Performance Liquid Chromatography
HRP-2 Proteiacutena Rica en Histidina
IC50 Concentracioacuten Inhibitoria del 50
IR Espectroscopia Infrarroja
IS Iacutendice de Selectividad
J Constante de Acoplamiento
K Lisina (coacutedigo de una letra)
LDH Lactato Deshidrogenasa
MSP-1 Proteiacutena de superficie del merozoiacuteto
MTT Bromuro de 3-(45- dimetiltiazol-2-ilo)-25-difeniltetrazol
NaOH Hidroacutexido de sodio
NEAA Nonessential amino-acids
NFT Naftalenos
OMS Organizacioacuten Mundial de la Salud (en ingleacutes WHO)
PM Peso Molecular
PENUD Programa de Naciones Unidas para el Desarrollo
PfCRT Proteiacutena Transportadora del Plasmodium falciparum causante
de la resistencia a la Cloroquina
PIPR Piperidina
PIPZ Piperazina
PIRD Tertrahidropiridina
PIRR Pirrolidina
R Arginina (coacutedigo de una letra)
RMN Resonancia Magneacutetica Nuclear
RMSD (Root-mean-square derivation) Desviacioacuten de la media
cuadraacutetica
S Serina (coacutedigo de una letra)
S163R Mutacioacuten arginina-serina en posicioacuten 163 que invierte la
resistencia a la Cloroquina
T Treonina (simplificacioacuten para codificacioacuten en aminoaacutecidos)
TCA Terapias Combinadas de Artemisina
THR Treonina
TNFα Factor de Necrosis tumoral
TPSA Aacuterea superficial Topoloacutegica
TYR Tirosina
UNICEF Fondo de Naciones Unidas para la Infancia
Iacutendice
INTRODUCCIOacuteN 1
I MALARIA 3
I1 Definicioacuten 5
I2 Historia de la enfermedad 5
I3 Epidemiologiacutea 7
I31 Situacioacuten global de la enfermedad 7
I32 Factores epidemioloacutegicos 11
I33 Tipologiacutea de aacutereas endeacutemicas 11
I34 Zonas endeacutemicas e inmunidad 12
II MALARIA Y PLASMODIUM 13
II1 El Plasmodium 15
II11 Caracteriacutesticas morfoloacutegicas 15
II12 Mecanismo de movilidad 16
II13 Mecanismo de invasioacuten celular 16
II14 Metabolismo para el crecimiento 17
II2 Ciclo de la malaria 18
II21 Ciclo de vida del paraacutesito 18
II22 Desarrollo de los esquizontes 20
II3 Especies de Plasmodium 22
II4 Sintomatologiacutea 25
II5 Deteccioacuten y diagnoacutestico 26
III PREVENCIOacuteN Y TRATAMIENTO 29
III1 Medidas preventivas 31
III2 Tratamiento 32
III21 Historia del tratamiento 32
III22 Clasificacioacuten de los compuestos antimalaacutericos 33
III23 Aparicioacuten de resistencias 38
III24 Tratamientos actuales 40
III3 Estrategias mundiales en la lucha contra la malaria 43
III4 Liacuteneas de investigacioacuten actual 44
III41 Buacutesqueda de nuevas dianas 44
III42 Productos naturales 46
III43 Desarrollo de vacunas 47
ANTECEDENTES 49
OBJETIVOS Y PLAN DE TRABAJO 53
IV OBJETIVOS 55
V PLAN DE TRABAJO 59
V1 Disentildeo de nuevos arilaminoalcoholes 61
V2 Siacutentesis de los compuestos disentildeados 63
V3 Caracterizacioacuten de los compuestos 63
Iacutendice
V4 Evaluacioacuten bioloacutegica ldquoin vitrordquo 64
V5 Evaluacioacuten bioloacutegica ldquoin vivordquo 64
V6 Estudios computacionales 64
MATERIAL Y MEacuteTODOS 65
VI QUIacuteMICA TEOacuteRICA 67
VI1 Esquema general de siacutentesis 69
VI2 Siacutentesis de precursores 70
VI21 Siacutentesis de (benzo[b]tiofen-3-il)-3-cloropropan-1-ona 70
VI22 Siacutentesis de arilaminas 70
VI3 Siacutentesis de derivados carboniacutelicos (Serie 0) 73
VI31 Condensacioacuten de 1-(benzo[b]tiofen-3-il)-3-cloropropan-1-ona y de 2-bromo-2acute-acetonaftona
con la amina (Viacutea 1) 73
VI32 Reaccioacuten de Mannich Condensacioacuten de metilcetonas con aminas en medio aacutecido (Viacutea 2) 74
VI4 Siacutentesis de derivados hidroxiacutelicos (Series 1-7) 75
VI5 Siacutentesis de oximas (Serie 8) 78
VII QUIacuteMICA EXPERIMENTAL 81
VII1 Instrumental y reactivos 83
VII2 Meacutetodos de elucidacioacuten estructural 83
VII3 Denominaciones de compuestos 85
VII4 Descripcioacuten general de meacutetodos de siacutentesis 86
VII41 Meacutetodo A procedimiento general para la obtencioacuten de las arilaminas protegidas 86
VII42 Meacutetodo B procedimiento general para la desproteccioacuten de aminas 87
VII43 Meacutetodo C procedimiento general para condensacioacuten de aminas (Viacutea 1) 87
VII44 Meacutetodo D procedimiento de condensacioacuten de aminas (Viacutea 2) 87
VII45 Meacutetodo E procedimiento general para la reduccioacuten de cetonas 88
VII46 Meacutetodo F procedimiento general para siacutentesis de oximas desde carbonilos 88
VII5 Purificacioacuten por cromatografiacutea flash 89
VIII ENSAYOS BIOLOacuteGICOS 91
VIII1 Ensayos in vitro 93
VIII2 Ensayos toxicoloacutegicos 94
VIII3 Ensayos in vivo 94
VIII31 Instrumental y reactivos 95
VIII32 Metodologiacutea 95
IX ESTUDIOS COMPUTACIONALES 105
IX1 Propiedades fisicoquiacutemicas de los compuestos 107
IX2 Optimizacioacuten geomeacutetrica 107
IX3 Estudios de Acoplamiento Molecular (Docking) 108
RESULTADOS Y DISCUSIOacuteN 111
X DESCRIPCIOacuteN DE COMPUESTOS 113
Iacutendice
X1 Siacutentesis de precursores 115
X2 Siacutentesis de derivados carboniacutelicos (Serie 0) 120
X3 Siacutentesis de derivados hidroxiacutelicos 143
X4 Siacutentesis de Oximas (Serie 8) 165
X5 Purificacioacuten de compuestos por cromatografiacutea flash 167
X6 Elucidacioacuten estructural de compuestos por RMN 168
X61 Elucidacioacuten estructural para los derivados de piperazina 168
X62 Elucidacioacuten estructural para los derivados de piperidina 175
X63 Elucidacioacuten estructural para los derivados de tetrahidropiridina 180
XI ENSAYOS BIOLOacuteGICOS 187
XI1 Ensayos de actividad antiplasmoacutedica in vitro 189
XI2 Ensayos de actividad antiplasmoacutedica in vivo 191
XI3 Discusioacuten de ensayos bioloacutegicos 192
XII ENSAYOS COMPUTACIONALES 195
XII1 Propiedades fisicoquiacutemicas de los compuestos 197
XII2 Discusioacuten de propiedades fisicoquiacutemicas 199
XII3 Estudios de Modelizacioacuten y Acoplamiento Molecular 200
XII4 Discusioacuten de resultados de modelizacioacuten 207
CONCLUSIONES 209
BIBLIOGRAFIacuteA 219
ANEXOS 231
INTRODUCCIOacuteN
II MMAALLAARRIIAA
Malaria
5
I1 Definicioacuten
La malaria fiebre paluacutedica o tambieacuten llamada paludismo es una enfermedad
infecciosa causada por el paraacutesito protozoario del filo Apicomplexa clase
Aconoidasida orden Haemosporididae de la familia Plasmodiidae del geacutenero
Plasmodium1 y es transmitido por la hembra del mosquito del geacutenero Anopheles
La malaria es una de las enfermedades tropicales maacutes importante del mundo
que provoca la muerte de miles personas Estaacute estrechamente ligada a la
pobreza y a la evolucioacuten y el desarrollo del hombre
Los mayores problemas en la lucha contra la enfermedad ademaacutes de la crisis
actual que reduce los fondos destinados a los paiacuteses en viacuteas de desarrollo (que
son los maacutes afectados) son la constante aparicioacuten de resistencias por el uso de
monoterapias en tratamientos y debido a los insecticidas utilizados
I2 Historia de la enfermedad
La historia de la malaria es tan antigua como la historia de la civilizacioacuten ya
que se tiene constancia de la presencia de la enfermedad en manuscritos
originarios de China la India o el Antiguo Egipto
Teniendo en cuenta esto se puede entender de donde proviene el nombre de
la enfermedad La palabra malaria proviene de las palabras ldquomal ndashairerdquo que
fueron empleadas en Italia para describir las fiebres intermitentes asociadas a la
exposicioacuten al ambiente de las marismas o cieacutenagas El otro nombre por el que
nos referimos a la enfermedad proviene del latiacuten ldquopalusrdquo que significa pantano
cieacutenaga de ahiacute la denominacioacuten de fiebres paluacutedicas o paludismo
Aunque su nombre tiene su origen en Europa se cree que los paraacutesitos se
desarrollaron en el oeste y centro oeste de Aacutefrica y en el sudeste asiaacutetico Es
importante tener en cuenta su estrecha relacioacuten con la historia natural Ha sido
la evolucioacuten del hombre la que ha expandido la enfermedad de ahiacute que hay
que ser muy conscientes de que durante la historia de la humanidad ha habido
picos de enfermedad ocasionados por la accioacuten del hombre y su desarrollo No
es de extrantildear dicha variacioacuten en la incidencia cuando en China hace maacutes de
5000 antildeos que se conoce la enfermedad2 y los textos egipcios dejan constancia
1httpwwwncbinlmnihgovTaxonomy 2 httpwwwmalariasitecommalariahistory_literaturehtm
Malaria
6
de ella desde hace ya 4000 antildeos Se puede saber por textos antiguos que la
enfermedad se extiendioacute por el mar Mediterraacuteneo hace 2000 antildeos y que al Norte
de Europa llegoacute hace aproximadamente 1000 antildeos Podemos darnos cuenta de
que la malaria ha avanzado unida a la historia del hombre si se tiene en cuenta
que cada vez es mayor la intercomunicacioacuten de sociedades alejadas
geograacuteficamente las continuas guerras e invasiones las rutas comerciales el
comercio de esclavos la profundizacioacuten y especializacioacuten de cultivos propensos
a la criacutea del paraacutesito como arrozales (humedales) el desarrollo de los medios de
transporte que permiten viajar a grandes distancias el aumento y la lejaniacutea de
las migraciones la democratizacioacuten de las vacaciones el comercio-intercambio
de grandes cantidades de alimentos el cada vez mayor trasiego de animales
vivos
Alrededor de 400 aC en la antigua Roma Hipoacutecrates fue el primero en
describir las manifestaciones tiacutepicas de la malaria que la diferenciaba de otras
enfermedades estudioacute la eacutepoca del antildeo donde aumentaba la enfermedad y el
lugar de vida de los enfermos Con ello establecioacute una relacioacuten enfermedad-
agua estancada que dio lugar a los primeros programas de drenaje de agua en
Roma y a la primera intervencioacuten contra la malaria
La escuela hipocraacutetica sosteniacutea que la enfermedad era el resultado de un
desequilibrio en el cuerpo de los cuatro humores unos fluidos que en las
personas sanas se encontraban naturalmente en una proporcioacuten semejante
Cuando los cuatro humores (sangre bilis negra bilis amarilla y flema) se
desequilibraban (laquodyscrasiaraquo mala mezcla) el individuo enfermaba y
permaneciacutea enfermo hasta que se recuperaba el equilibrio La terapia
hipocraacutetica se concentraba en restaurar este equilibrio El tratamiento maacutes
administrado era la purga de la sangre
No seriacutea hasta el antildeo 100 dC cuando se pensoacute que la enfermedad se
transmitiacutea por inhalacioacuten de vapores de la enfermedad el ldquomal airardquo italiano
No era tan errado el diagnoacutestico ya que por el aire vuelan los responsables de
transmitir los paraacutesitos que ocasionan la enfermedad Del otro sinoacutenimo de
malaria se deriva una confusioacuten semejante que llega tambieacuten indirectamente
del aire el paludismo rdquopalusrdquo en latiacuten designa a los pantanos que se creiacutean
responsables de la dolencia pero en realidad era donde proliferaban los
mosquitos Habraacute que esperar hasta 1898 en que se demostroacute que la malaria era
Malaria
7
transmitida por estos cuando ya se relacionaba la enfermedad con larvas del
moquito y microorganismos involucrados en la infeccioacuten
El nacimiento y desarrollo de la microbiologiacutea supuso un salto importante en
el conocimiento de las ciencias y como no podiacutea ser menos impulsoacute el
conocimiento de la enfermedad Asiacute en el antildeo 1880 el cirujano franceacutes Charles
Louis Alphonse Laveran (disciacutepulo de Pasteur) observoacute en Argelia los paraacutesitos
dentro de los gloacutebulos rojos de personas infectadas Planteoacute entonces que la
enfermedad era causada por protozoos siendo esta la primera vez que se
asociaba un protozoo con una enfermedad humana Posteriormente sus
estudios sobre protozoos le reportaron el Nobel de Medicina en 1907 aunque
fueron los cientiacuteficos italianos Ettore Marchiafava y Angelo Celli los que
bautizaron a estos protozoos con el nombre de ldquoPlasmodiumrdquo Carlos Finlay
meacutedico cubano sugirioacute por sus conocimientos sobre la fiebre amarilla que la
malaria podiacutea ser transmitida tambieacuten por mosquitos Hipoacutetesis confirmada en
el antildeo 1898 por Sir Ronald Ross en la India por lo que le fue concedido el
premio Nobel de medicina en 1902 Desde ese momento los estudios
protozoarios fueron avanzando y al poco tiempo en el antildeo 1899 Grassi
Bignami y Basianelli descubrieron el ciclo completo de la enfermedad el ciclo
celular protozoario y su transmisioacuten3
Desde entonces hasta la actualidad se han desarrollado diferentes
conocimientos y modos de prevencioacuten y tratamiento Un caso muy interesante
y uacutetil de estos avances fue el hecho de que los trabajos realizados por Finlay y
Ross sirvieron para crear las primeras guiacuteas de salud muy uacutetiles en eventos tan
importantes para el mundo como la construccioacuten del Canal de Panamaacute
I3 Epidemiologiacutea
I31 Situacioacuten global de la enfermedad
Seguacuten el informe de 2011 de la OMS4 sobre malaria son 106 paiacuteses los que
incluyen esta enfermedad como endeacutemica Se estima en 216 millones los casos
registrados a nivel mundial de los que se han producido 266 mil muertes Los
esfuerzos en la lucha contra la enfermedad de los diferentes organismos
3 httpwwwmedicinamcom 4httpwwwwhointmalariaes
Malaria
8
internacionales han dado como resultado un descenso de un 25 de las tasas de
mortalidad por malaria en la uacuteltima deacutecada5
Figura 1 Distribucioacuten mundial de la malaria paiacuteses libres endeacutemicos y en tratamiento6
En la figura 1 se observa coacutemo la malaria es una enfermedad asociada a la
pobreza y a los climas tropicales El 81 de los casos detectados provienen de
Aacutefrica subsahariana aunque a nivel mundial el 86 de las viacutectimas de la
malaria son nintildeos menores de cinco antildeos
De los 3300 millones de personas en riesgo de contraer la malaria 2100
millones se encuentran en situacioacuten de alto riego de los que el 47 pertenecen
al continente africano y el 37 al asiaacutetico De los 1200 millones restantes que
estaacuten en bajo riesgo de contraer malaria el 94 no son africanos En Aacutefrica
seguacuten los datos del informe de la Fundacioacuten para la investigacioacuten y la medicina
africana (AMREF) de 20117 se concentra la mayor poblacioacuten en riesgo donde el
apoyo externo es mayor y donde por el contrario se invierte el menor gasto
puacuteblico El 90 de los casos de malaria los produce el plasmodio maacutes agresivo
el P falciparum Seguacuten la OMS muchos paiacuteses de la regioacuten africana han
registrado desde el antildeo 2000 hasta 2010 un descenso mayor del 50 de casos
confirmados ingresos y muertes Esto se debe a los cada vez maacutes eficaces
sistemas de vigilancia Del 25 de la disminucioacuten mundial de las muertes
causadas por la malaria un 33 corresponde a Aacutefrica8 En el continente
americano la malaria se centra en la zona amazoacutenica y de Centroameacuterica En
5 Centro de prensa de la OMS (dic 2011) 6 Disponible en httpwwwwhointmalariaworld_malaria_report_2009 7httpwwwamrefesuploadsdocumento 8 Diez datos sobre el paludismo (OMS abril 2012)
Malaria
9
estas zonas se dan menos casos de malaria que en la regioacuten africana pero la
inversioacuten del gasto puacuteblico para erradicarla es mucho mayor La mayoriacutea de los
casos son producidos por el P vivax aunque tambieacuten se dan casos de P
falciparum Del 25 de la disminucioacuten mundial el 55 corresponde a este
continente
En Asia la situacioacuten es maacutes complicada de definir porque depende mucho de
la zona geograacutefica En la zona del sudeste asiaacutetico la situacioacuten es maacutes grave
maacutes parecida a Aacutefrica donde predominan los casos de P falciparum En el resto
de Asia predomina sin embargo el P vivax como en centro y Sudameacuterica En
Oceaniacutea la situacioacuten es muy parecida a la zona de Asia donde la malaria no es
tan grave La disminucioacuten de las muertes supone un 42 de la disminucioacuten de
mortalidad por malaria en este continente
El continente europeo se consideraba libre de malaria desde hace unos antildeos
pero en la actualidad se han registrado nuevos datos El 80 de los casos de la
Europa Occidental se registran en Francia Inglaterra Italia y Alemania Son
zonas donde la malaria se produce de forma ocasional estacional o por razones
de migraciones humanas (ECDC 20119) La zona de Oriente medio concentran
el mayor nuacutemero de casos ocasionados por P vivax La tasa de mortalidad por
malaria en Europa ha disminuido hasta el 1 de los casos
I311 La malaria en Espantildea
La lucha antipaluacutedica fue la primera intervencioacuten sanitaria espantildeola que se
basoacute en criterios epidemioloacutegicos es decir se planificoacute en base a datos de
prevalencia de la enfermedad En 1920 se realizoacute una organizacioacuten de Lucha
Antiplasmoacutedica que consiguioacute con la creacioacuten de dispensarios antipaluacutedicos el
estudio del vector con la participacioacuten y asesoramiento de entomoacutelogos
especialistas en saneamiento ambiental dieron como resultado en los antildeos 30
una disminucioacuten de los datos endeacutemicos en Espantildea En la guerra civil espantildeola
por el debilitamiento socioeconoacutemico y las circunstancias propias de una guerra
se produjo un recrudecimiento de la malaria
9 ECDC European Centre for Disease Prevention and Control Centro de la Unioacuten Europea creado en 2005 para el control de las enfermedades infecciosas con sede en Suecia
Malaria
10
Figura 2 Distribucioacuten de la malaria en Espantildea en el antildeo 193310
En el antildeo 1943 ante la evidente gravedad sanitaria del paiacutes se produce una
reactivacioacuten del Dispensario y un uso masivo de insecticidas A esto se le suma
la firma del convenio con la OMS para potenciar la erradicacioacuten de la malaria
en Espantildea
En 1943 se da por finalizada la campantildea entrando en fase de mantenimiento
que da paso en 1964 a la declaracioacuten de paiacutes libre de malaria por la OMS
siempre teniendo en cuenta que se han de mantener los sistemas de vigilancia
de la enfermedad
En 1961 se registra el uacuteltimo caso de malaria autoacutectona en Espantildea aunque desde
la declaracioacuten de zona libre se han descrito por parte de la Red nacional de
vigilancia epidemioloacutegica varios casos de malaria En el antildeo 2001 se registraron
466 casos diagnosticados en Espantildea asociados a inmigrantes y turistas ademaacutes
se debe tener en cuenta la posibilidad de producirse casos por transfusiones
sanguiacuteneas trasiego de jeringuillas de pacientes drogadictos o malaria de
aeropuerto (Bueno Mari R y Jimenez Peydro R 2008)
El uacuteltimo caso de malaria en Espantildea se diagnosticoacute en una mujer en Aragoacuten en
2009 Por esto se incrementaron las alertas pero no han quedado registrados
maacutes casos (Santa Olalla et alts 201011)
10 Disponible en httpscieloisciiiesscielophppid=s1135-57272008000500003ampscript=sci_arttext 11 httpwwweurosurveillanceorgViewArticleASPxArticleId=19684
Malaria
11
I32 Factores epidemioloacutegicos
La epidemiologiacutea de esta enfermedad depende principalmente de dos
factores
- Primarios
o Hueacutesped o fuente de infeccioacuten hombre portador
o Vector hembras de ciertas especies de mosquito Anopheles
o Susceptibilidad humana este es el factor maacutes variable ya que
depende de factores de inmunidad natural o adquirida factores
geneacuteticos edad (los nintildeos estaacuten maacutes expuestos) migraciones
ocupacioacuten y caracteriacutesticas socioeconoacutemicas
- Secundarios son los que ayudan a la transmisioacuten de la enfermedad como
los factores geograacuteficos (altura sobre el nivel del mar) o climatoloacutegicos
(temperatura humedad atmosfeacuterica o lluvias)
I33 Tipologiacutea de aacutereas endeacutemicas
Seguacuten la proporcioacuten de poblacioacuten que se encuentre afectada las aacutereas donde
la enfermedad estaacute considerada como endeacutemica se dividen en cuatro12
- Aacutereas hipo-endeacutemicas son aquellas donde la malaria afecta a menos del
10 de la poblacioacuten
- Aacutereas meso-endeacutemicas aquellas donde la poblacioacuten afectada estaacute entre el
11 y el 50
- Aacutereas hiper-endeacutemicas son las aacutereas donde el porcentaje de poblacioacuten
afectada estaacute entre el 51 y el 75
- Aacutereas holo-endeacutemicas aquellas donde maacutes del 75 de la poblacioacuten es
portadora de la enfermedad Estas aacutereas estaacuten asociadas a malaria latente
Las hiper y holo-endeacutemicas se caracterizan por alta mortalidad infantil y
juvenil pero los adultos suelen ser asintomaacuteticos por la inmunidad especiacutefica
que generan algunos humanos al sufrir maacutes de una picadura por mosquito
infectado al diacutea
12httpwwwmonografiascomtrabajos77paludismo-enfermedad-tercer-mundopaludismo-enfermedad-tercer-mundo2shtml
Malaria
12
I34 Zonas endeacutemicas e inmunidad
El ciclo de vida del paraacutesito es complejo e involucra distintos medios lo que
demuestra su capacidad para entrar y salir de diferentes ceacutelulas tanto del
hueacutesped como del vector Para ello el paraacutesito debe cambiar su forma la
constitucioacuten y el modo de presentacioacuten de sus proteiacutenas y receptores asiacute se
pone de manifiesto que su respuesta inmune a los tratamientos es muy
compleja A su vez la respuesta inmune del hueacutesped debe generar respuestas
especiacuteficas para las diferentes formas del paraacutesito lo que se denomina
Inmunidad adaptada
Los tipos de inmunidad consideradas para la enfermedad son tres
- Natural ciertos grupos de poblacioacuten poseen alguacuten grado de resistencia
conferida por factores geneacuteticos como la deficiencia de la G6PDH que
confiere resistencia al paraacutesito o la mutacioacuten Hemoglobina E (Hb E la
mutacioacuten del gen que codifica la cadena β-globina que compone la Hb
tambieacuten conocido como talasemia) Hb S (anemia drepanociacutetica) o Hb
fetal
- Adquirida con este tipo de infeccioacuten se produce premunicioacuten13 Se da en
personas de exposicioacuten prolongada como los habitantes de zonas holo-
endeacutemicas El problema estaacute en que la inmunidad adquirida es una
inmunidad parcial y relativa y no garantiza la inmunidad esterilizante
Es una inmunidad especiacutefica a un lugar determinado que en muchos
casos se pierde tras el cambio de haacutebitat a zonas donde la malaria no es
endeacutemica Esto conlleva que el individuo sea vulnerable si vuelve
posteriormente a zonas endeacutemicas
- Pasiva es la que suele relacionarse con el embarazo La conferida por la
madre al feto en muchos lugares donde la enfermedad es endeacutemica
13 (Edm Sergent L Parrot y A Donatien 1924) (Del latiacuten prae antes y munire fortificar) Sinoacutenimo inmunidad de infeccioacuten o de sobreinfeccioacuten (R Debreacute y Bonnet 1927) inmunidad no esterilizante inmunidad relativa (Pasteur 1881 Plehn 1901 von Wasielewski 1901-1908) inmunidad parcial (J Bordet 1920) inmunidad- tolerancia premunidad (Ch Nicolle) laquoEstado de resistencia a toda sobreinfeccioacuten de un organismo ya infectado La premunicioacuten que es simultaacutenea a la infeccioacuten y cesa con ella es conferida por diversas enfermedades infecciosas croacutenicas (paludismo piroplasmosis tuberculosis siacutefilis brucelosis etc) Se opone a la inmunidad verdadera que caracteriza la resistencia del organismo curado a toda reinfeccioacuten es generalmente durable y consecutiva a ciertas infecciones agudas (sarampioacuten escarlatina viruela carbunco fiebre tifoidea etc)raquo (Edm Sergent)
IIII MMAALLAARRIIAA YY PPLLAASSMMOODDIIUUMM
Malaria y Plasmodium
15
II1 El Plasmodium
El Plasmodium es un protozoo eucariota unicelular esporozoario que se
caracteriza por un estilo de vida intracelular obligado con orgaacutenulos
especializados en las diferentes funciones vitales La proliferacioacuten se produce
por invasioacuten celular crecimiento y divisioacuten celular hasta que las reacuteplicas
destruyen la ceacutelula hueacutesped Ademaacutes es el miembro maacutes importante de los
Apicomplexa grupo de clasificacioacuten al que pertenecen tambieacuten otros paraacutesitos
como el toxoplasma o el criptosporium De las 175 especies de Plasmodium son 4
especies las que pueden infectar a humanos P vivax P ovale P falciparum y P
malariae Las tres primeras son las que afectan en mayor grado al hombre
siendo el P falciparum el maacutes violento y resistente Existe una quinta P
knowlesi que afecta maacutes a los grandes simios pero desde hace pocos antildeos se ha
registrado alguacuten caso de infeccioacuten humana por este tipo de paraacutesitos (Figtree et
alts 2010)
El paludismo es causado por paraacutesitos del geacutenero Plasmodium que se
transmiten al ser humano por la picadura de mosquitos infectados de las 20
especies del geacutenero Anopheles los llamados vectores del paludismo que pican
sobre todo entre el anochecer y el amanecer en zonas con climas tropicales
II11 Caracteriacutesticas morfoloacutegicas
El Plasmodium es un protozoo con orgaacutenulos especializados suspendidos en el
citoplasma que se encargan de sus diferentes necesidades como movimiento
invasioacuten celular penetracioacuten de membranas celulares expulsioacuten enzimas
eliminacioacuten de metabolitos o nutricioacuten por fagocitosis
Los trofozoiacutetos son las formas vegetativas moacuteviles que constan de membrana
citoplasma y nuacutecleo La membrana limita el contorno celular protege y permite
el intercambio de sustancias Aquiacute se produce el metabolismo de fosfoliacutepidos y
el mecanismo de transporte de protones y sodio El citoplasma es un sistema
coloidal que representa el cuerpo donde se desarrollan funciones como siacutentesis
de folatos y glicoacutelisis ademaacutes de biosiacutentesis de nucleoacutetidos necesarios para la
reproduccioacuten El nuacutecleo eucarionte contiene el ARN y ADN del paraacutesito
Malaria y Plasmodium
16
II12 Mecanismo de movilidad
Una de las principales caracteriacutesticas del paraacutesito es que no tiene sistema de
locomocioacuten (cilios ni flagelos) su movilidad se produce por deslizamiento Se
ha estudiado (Casanova Morales 2010) que la membrana del paraacutesito tiene dos
dimensiones citoesqueleto y submembrana El movimiento se produce gracias
al citoesqueleto en concreto al sistema actina-miosina que actuacutea como motor
molecular La miosina se transporta a lo largo de los filamentos de la actina con
la energiacutea obtenida de la hidroacutelisis de ATP e interacciona con las adhesinas
transmembrana de la superficie de la ceacutelula hueacutesped Por medio de una
trayectoria helicoidal generada con estas interacciones se produce el
desplazamiento
II13 Mecanismo de invasioacuten celular
Uno de los organelos funcionales maacutes caracteriacutesticos es el orgaacutenulo o
complejo apical que se localiza en un extremo del paraacutesito y estaacute involucrado en
la interaccioacuten hueacutesped paraacutesito durante la invasioacuten celular Su funcioacuten se
relaciona con la adherencia y perforacioacuten de membrana eritrociacutetica ya que
excreta una sustancia que facilita la penetracioacuten celular imprescindible para la
supervivencia del paraacutesito Este orgaacutenulo estaacute presente en las formas
esporozoiacuteto merozoiacuteto y ookinete
La invasioacuten de un eritrocito induce un proceso controlado y transitorio de
rotura de la membrana y reorganizacioacuten de la ceacutelula Es un proceso complicado
(Gratzer y Dluzewski 1993) que conlleva un contacto inicial reorientacioacuten y
deformacioacuten del eritrocito unioacuten de formacioacuten y entrada del paraacutesito Las
interacciones con el eritrocito se piensa que son al azar y que son interacciones
reversibles entre proteiacutenas de superficie del paraacutesito y del gloacutebulo rojo
Son muchas las proteiacutenas implicadas en estos procesos como la proteiacutena de
superficie del merozoiacuteto 1 (MSP-1) que participa directamente en el paso de
invasioacuten y es una de las dianas terapeacuteuticas planteadas actualmente Otra
proteiacutena diana es la proteiacutena circumsporozoiacuteto (CSP) que estaacute implicada en los
procesos de reorientacioacuten del complejo apical En la invasioacuten se producen
cambios en la composicioacuten lipiacutedica de la membrana El paraacutesito una vez
realizada la invasioacuten exporta proteiacutenas como la proteiacutena de membrana epitelial
(EMP) a la membrana eritrociacutetrica que evita que se produzca la depuracioacuten de
los eritrocitos infectados en el bazo Durante la invasioacuten de la membrana
Malaria y Plasmodium
17
diferentes orgaacutenulos del paraacutesito van introducieacutendose en el eritrocito y
producen la unioacuten con la ceacutelula hueacutesped
II14 Metabolismo para el crecimiento
La caracteriacutestica principal del paraacutesito es la dependencia total del hueacutesped
para la supervivencia Como consecuencia de la invasioacuten aumenta la tasa
metaboacutelica de los eritrocitos infectados con cambios en la permeabilidad de
membrana que permiten por fagocitosis el ingreso de solutos necesarios para el
desarrollo del Plasmodium Este cambio de permeabilidad da preferencia al paso
de aniones y solutos como monosacaacuteridos aminoaacutecidos nucleoacutesidos lactato
acido pantoteacutenico y amonio cuaternario La composicioacuten ioacutenica del paraacutesito
depende del proceso de transporte a traveacutes de tres membranas la membrana
plasmaacutetica del eritrocito la vacuola digestiva y la membrana digestiva del
paraacutesito
Las alteraciones proteicas de la membrana intervienen en el transporte de
nutrientes y productos de desecho ademaacutes de evitar la accioacuten del sistema
inmune del hueacutesped Mediante endocitosis el Plasmodium retiene porciones del
citoplasma del eritrocito dentro de vesiacuteculas que se fusionan con la vacuola
digestiva El paraacutesito tiene mitocondria pero carece de ciclo de aacutecido ciacutetrico
funcional por lo que se piensa que es totalmente dependiente de la glucoacutelisis
para su abastecimiento energeacutetico (Dario Mendez 2010) Durante el periodo de
maduracioacuten del paraacutesito se produce un aumento en el uso de glucosa y la
produccioacuten de aacutecido laacutectico en la ceacutelula hueacutesped en detrimento de la capacidad
de la ceacutelula de sintetizar macromoleacuteculas Para su crecimiento y replicacioacuten en
el eritrocito requiere purinas y pirimidinas Las purinas provenientes del
eritrocito son recicladas por el propio paraacutesito para su uso En cambio las
pirimidinas han de ser sintetizadas a partir de sustancias como carbonatos o
adenosiacuten trifosfato (ATP) y mediante la accioacuten de enzimas como dihidrofolato
reductasa o dihidrooroato dihidrogenasa (DHOD) que se convierten asiacute en
dianas terapeacuteuticas La atovaquona es un ejemplo de inhibidor de la DHOD
En la vacuola digestiva del paraacutesito se producen enzimas digestivas y
residuos que se eliminan a traveacutes de la membrana celular Dentro de los
gloacutebulos rojos los paraacutesitos se alimentan de la Hb En primer lugar se produce
la endocitosis de la moleacutecula hasta la vacuola digestiva donde las
endopeptidasas cisteiacutenicas y aspaacuterticas continuacutean con la degradacioacuten de la Hb
Malaria y Plasmodium
18
hasta pequentildeos aminoaacutecidos que el paraacutesito requiere para sus muacuteltiples
funciones de desarrollo En la ruptura celular se produce la liberacioacuten de los
residuos generados durante los diferentes procesos del metabolismo de
nutrientes Algunos siacutentomas de la enfermedad se ocasionan por esta liberacioacuten
En todos estos procesos de cambio de permeabilidad celular necesarios para
la supervivencia del paraacutesito el pH juega un papel fundamental El Plasmodium
desarrolla diferentes sistemas de control y autorregulacioacuten que estaacuten siendo
estudiados y propuestos como diana terapeacuteutica (Loacutepez y Segura 2008)
II2 Ciclo de la malaria
II21 Ciclo de vida del paraacutesito
Para referirnos al ciclo de la enfermedad hablaremos en todo momento del
ciclo de vida del paraacutesito (Figura 5) El Plasmodium falciparum es un organismo
eucariota que cuenta con 14 cromosomas y es transmitido como hemos
comentado al comienzo por los mosquitos Anopheles hembra Pero no son los
mosquitos los que tienen el paraacutesito inicialmente ya que en la picadura a un ser
humano infectado adquieren los paraacutesitos presentes en las sangre (en forma de
gametocitos) dando comienzo la fase Esporogoacutenica (fase sexual) del ciclo de
vida del paraacutesito en el mosquito
En esta sangre infectada hay microgametocitos (macho) y macrogametocitos
(hembra) Los gametocitos macho fertilizan a los hembra formando un cigoto
que recibe el nombre de ookinete el cual penetra en la pared celular de los
mosquitos para desarrollarse hasta formar un oocito Los oocitos desarrollados
se almacenan en sus glaacutendulas salivares Es ahiacute donde estaacuten listos para infectar
a otro humano con su picadura liberando esporozoiacutetos a traveacutes de la saliva
Esta fase esporogoacutenica se da a gran velocidad y se completa en dos semanas si
las condiciones son las idoacuteneas Queda claro de esta forma que el mosquito es el
vector que transporta la enfermedad y los humanos son los hueacutespedes
En este punto la enfermedad se desarrolla en el hombre por medio de dos
viacuteas Exo-eritrociacutetica (hepaacutetica) y Endo-eritrociacutetica La viacutea exo-eritrociacutetica es la
fase del ciclo de vida del paraacutesito que comienza en el momento que el mosquito
infectado pica a un humano y transfiere en la saliva ademaacutes de los esporozoiacutetos
del paraacutesito otros compuestos anti hemostaacuteticos y vasodilatadores al torrente
sanguiacuteneo humano
Malaria y Plasmodium
19
Los esporozoiacutetos son formas alargadas que miden
11 microm de ancho por 1 microm de largo con extremidades
afiladas (Figura 3) Se mueven por deslizamiento y
poseen una gruesa membrana cuya extremidad
anterior se transforma en una caacutepsula apical provista
de anillos polares y de un conoide que favorece la
penetracioacuten celular
Figura 3 Imagen de un esporozoiacuteto14
En treinta minutos los esporozoiacutetos llegan al hiacutegado humano e infectan los
hepatocitos Asiacute durante un periodo de 6 a 15 diacuteas se van a multiplicar
asexualmente (en este periodo de latencia de la enfermedad se llaman
hipnozoiacutetos) Estos daraacuten lugar a miles de merozoiacutetos que rompen las ceacutelulas
hepaacuteticas e para invadir el torrente sanguiacuteneo
En la viacutea endo-eritrociacutetrica los merozoiacutetos del torrente sanguiacuteneo invaden
los eritrocitos (gloacutebulos rojos o hematiacutees) para convertirse en trofozoiacutetos
(formas paraeritrociacuteticas Figura 4) Esta forma madura
y se multiplica asexualmente para formar los
esquizontes Estos a su vez se rompen liberando de
nuevo merozoiacutetos (en su forma endo-eritrociacutetica) que
repetiraacuten el ciclo de los hematiacutees Es la formacioacuten de
los esquizontes la que causaraacute la aparicioacuten de los
siacutentomas cliacutenicos A la vez que esto ocurre unos pocos
merozoiacutetos sufren gametocitogeacutenesis dando lugar a los
gametocitos que infectaraacuten nuevos mosquitos
Figura 4 Imagen de trofozoiacutetos15
En el caso de Plasmodium vivax y ovale se producen hipnozoiacutetos en la fase exo-
eritrociacutetica que permanecen en estado latente y durante un periodo de hasta
tres antildeos sin manifestarse siacutentomas En liacuteneas generales la duracioacuten del ciclo
eritrociacutetico del P ovale es de 50 horas el de P malarie de 72 horas y el de P vivax
y falciparum de 48 horas
14 Disponible en wwwfabaorg 15 Disponible en wwwdfarmaciacom
Malaria y Plasmodium
20
Figura 5 Ciclo de vida completo del plasmodio El mosquito Anopheles infectado en su picadura transmite los
esporocitos del parasito Plasmodio Esporocitos infectan ceacutelulas hepaacuteticas que maduran hasta esquizontes y
que liberaran despueacutes merozoitos Fase exo-eritrociacutetica y fase endo-eritrociacutetica Los merozoitos infectan los
hematiacutees Los trofozoiacutetos maduros daraacuten esquizontes que se rompen para dar maacutes merozoitos Algunos
merozoitos pasan a ser nuevos gametocitos Los gametocitos sexuados son ingeridos por el mosquito La Fase
esporogoacutenica Microgametos y macrogametos forman cigotos que evolucionan hasta ookinete Estos a su vez se
desarrollan hasta Los oocitos se rompen dando esporocitos que se almacenan en las glaacutendulas salivares del mosquito
esperando a ser inoculadas a otro humano 16
II22 Desarrollo de los esquizontes
Los merozoiacutetos provenientes de las ceacutelulas hepaacuteticas viajan al torrente
sanguiacuteneo para infectar a los eritrocitos que contienen la Hb En concreto es la
degradacioacuten de la Hb el factor fundamental para el desarrollo de los
esquizontes ya que este proceso conlleva la obtencioacuten de ldquonutrientesrdquo como
aminoaacutecidos esenciales para el desarrollo de las nuevas formas del paraacutesito En
el citoplasma de los eritrocitos se encuentra la Hb que es ingerida por
endocitosis al citostoma del paraacutesito y comprimida en vesiacuteculas transportadoras
que la conducen hasta las vacuolas digestivas del merozoiacuteto (Figura 6)
16 Citado de wwwdpdcdcgovdpdxHTMLMalariahtm
Malaria y Plasmodium
21
Figura 6 Transporte de membrana de la Hb a la vacuola del merozoiacuteto
Una vez dentro de la vacuola comienza su digestioacuten o degradacioacuten en un
proceso en el que intervienen varias proteasas y peptidasas que generan
diferentes subproductos Del conocimiento de estas enzimas surgen las
muacuteltiples dianas terapeacuteuticas para combatir este proceso y por tanto la
enfermedad ya que el proceso es clave para la supervivencia del paraacutesito Una
vez que la moleacutecula de Hb es introducida en la vacuola digestiva se produce la
ruptura de la estructura (Figura 7) en porcioacuten proteica la globina y en el
producto de degradacioacuten el grupo hemo La globina a su vez se degrada por
medio de peptidasas especiacuteficas (cisteiacutenas y aspartatos) que generan peacuteptidos
maacutes pequentildeos que seraacuten transportados en forma de aminoaacutecidos (los α-Aa) al
citoplasma del paraacutesito (citosol del merozoiacuteto)
Figura 7 Proceso de digestioacuten de la Hb en la vacuola digestiva del paraacutesito
Otro producto de dicha reaccioacuten de degradacioacuten es el grupo hemo libre que
se oxida hasta formar hematina (Figura 8) compuesto muy toacutexico debido a que
puede generar especies reactivas de oxiacutegeno como peroacutexido de hidroacutegeno
(H2O2) radicales superoacutexido y radicales hidroxilo Estos radicales son
mediadores directos de ciertos procesos bioquiacutemicos que ocasionan la ruptura
Malaria y Plasmodium
22
celular y en uacuteltima instancia la muerte del paraacutesito De este modo la siguiente
reaccioacuten es el proceso de detoxificacioacuten de dicho compuesto Esta reaccioacuten
consiste en una biomineralizacioacuten o biocristalizacioacuten donde la hematina
cristaliza como diacutemero cristalino llamado β-hematina (la unioacuten por puentes de
hidroacutegeno de los cristales recibe el nombre de hemozoiacutena) que no es toacutexica para
el paraacutesito
Figura 8 Compuestos obtenidos en la degradacioacuten de la Hb
Para el final del estado trofozoiacutetico del ciclo han sido consumidas muchas
unidades de Hb
II3 Especies de Plasmodium
Son muchas las variables de las que depende el desarrollo de la enfermedad
comenzando por la especie de paraacutesito que infecta
Plasmodium vivax esta especie estaacute presente en casi todas las zonas donde el
paludismo es endeacutemico y su aacuterea de distribucioacuten se extiende
principalmente en Ameacuterica Central y la India La duracioacuten de su ciclo exo-
eritrociacutetico variacutea seguacuten la cepa desde 20 diacuteas a 9 meses Los paraacutesitos
pueden permanecer en el hiacutegado en estado latente maacutes de 2 antildeos y ser
responsable de recaiacuteda La parasitemia raramente excede de 2 paraacutesitos en
100 gloacutebulos rojos y el proceso de formacioacuten de esquizontes dura 48 horas
P vivax parasita sobre todo los hematiacutees joacutevenes (reticulocitos) el hematiacutee
parasitado es maacutes grande que los hematiacutees normales y contiene numerosos
graacutenulos de Schuumlffner que resultan de la degradacioacuten de la Hb y le dan un
aspecto punteado Las formas endo-eritrociacuteticas son grandes (llegan a
ocupar hasta 23 partes del eritrocito) y estaacuten provistas de movimientos
ameboides vivaces (de ahiacute el nombre vivax) los esquizontes presentan
Malaria y Plasmodium
23
hasta 16 merozoiacutetos los gametocitos son redondos frecuentemente
exceacutentricos y con pigmento abundante
Figura 9 Formas endo-eritrociacuteticas del P vivax17
Plasmodium ovale es muy proacuteximo a P vivax con el cual fue confundido por
mucho tiempo Su incubacioacuten variacutea de 15 diacuteas a varios meses P ovale
parasita los hematiacutees joacutevenes el
hematiacutee parasitado es de talla grande
ovalado (es el porqueacute del nombre
ovale) sus bordes estaacuten recortados y
contiene tempranamente numerosos
graacutenulos de Schuumlffner El poli-
parasitismo es posible Los trofozoiacutetos
son ovalados los esquizontes son
irregulares y tienen de 8 hasta 16
merozoiacutetos
Figura 10 Formas endo-eritrociacuteticas del P ovale
Plasmodium malariae es menos frecuente que P vivax o P falciparum y se
encuentra principalmente en zonas como Aacutefrica subsahariana o sudeste
asiaacutetico Su incubacioacuten dura alrededor de 3 a 4 semanas Puede permanecer
en estado latente hasta 20 antildeos El ciclo de maduracioacuten eritrociacutetica dura 72
horas Parasita los hematiacutees viejos (1 a 2) los que son de tamantildeo normal o
retractado y monocromaacutetico Morfoloacutegicamente P malariae estaacute
caracterizado por la disposicioacuten en banda cuadrilaacutetera o ecuatorial de los
17 Imaacutegenes extraiacuteda de wwwgefor4tcom
Malaria y Plasmodium
24
trofozoiacutetos con esquizontes que presentan 8 merozoiacutetos y con gametocitos
semejantes a los de P vivax pero maacutes pequentildeos
Figura 11 Formas endo-eritrociacuteticas del P malariae
Plasmodium falciparum es la especie maacutes temible y mortal Se encuentra en
las regiones tropicales y subtropicales de Aacutefrica en Nueva Guinea y Haitiacute
El desarrollo de su ciclo en el mosquito necesita una temperatura superior a
los 18 degC a esto se debe su ausencia en las montantildeas tropicales y en las
regiones templadas Su ciclo exo-eritrociacutetico es el periodo maacutes corto dura
solamente de 7 a 15 diacuteas de promedio La longevidad del paraacutesito no pasa
habitualmente de 2 meses aunque puede llegar a un antildeo P falciparum
parasita todos los hematiacutees por esto maacutes del 10 de los gloacutebulos rojos
pueden ser parasitados En el frotis de sangre se observa la presencia
uniforme de trofozoiacutetos anulares (los esquizontes se encuentran en
capilares profundos y presentan hasta 16 merozoiacutetos) el poliparasitismo de
un gloacutebulo rojo es frecuente Los gametocitos tienen la forma de banana o
pequentildea hoz (del latino falx falcis) a esto se debe el nombre de esta especie
Figura 12 Formas endo-eritrociacuteticas del P falciparum
Malaria y Plasmodium
25
II4 Sintomatologiacutea
La infeccioacuten por malaria se puede confundir faacutecilmente con un catarro o gripe
comuacuten ya que como se describe en apartados anteriores es el desarrollo de los
esquizontes y la posterior ruptura de los hematiacutees (Figura 13) para seguir
infectando hematiacutees sanos lo que causa la aparicioacuten de sintomatologiacutea cliacutenica
Aunque en la liberacioacuten de nuevos merozoiacutetos tambieacuten se produce la liberacioacuten
de otras sustancias que producen la
sintomatologiacutea caracteriacutestica como los dolores
musculares dolor de cabeza naacuteuseas y voacutemitos
fiebres sudoraciones secuenciales y escalofriacuteos
La sintomatologiacutea observada en la infeccioacuten por
Plasmodium variacutea seguacuten el tipo de malaria que
desarrolla el enfermo
Figura 13 Ruptura de los Eritrocitos infectados18
En Malaria no complicada los siacutentomas caracteriacutesticos son acceso malaacuterico
anemia19 esplenomegalia20 (por la funcioacuten de limpieza de la sangre de
geacutermenes e impurezas por fagocitosis y la produccioacuten de linfocitos la funcioacuten
inmune produce este marcador interno de la infeccioacuten) y en ocasiones
ictericia21 Los picos de fiebre se correlacionan con altos niveles seacutericos de TNF-
α por la liberacioacuten de proteiacutenas del paraacutesito en la ruptura de los eritrocitos que
crea la anemia Ademaacutes de esto se asocia una creacioacuten de anticuerpos contra los
hematiacutees diseritropoyesis22 y secuestro espleacutenico23
18 Imagen extraida de wwwimmuninforu 19 Patologiacutea general Empobrecimiento de la sangre por disminucioacuten de su cantidad total o cantidad de hemoglobina [a(n)- ἀ-ἀν- gr no + -haimiacuteā -αιμία gr sangre] httpDicciomedeusales 20 Patolgiacutea general Aumento de volumen o hipertrofia del bazo[ splēn(o)- σπλή-ν-νός gr bazo + -megalia μεγαλ-ία gr cient tamantildeo excesivo] httpDicciomedeusales 21 Patologiacutea digestiva y hepatoloacutegica Enfermedad producida por acumulacioacuten de pigmentos biliares en la sangre cuya sentildeal exterior maacutes visibles es la amarillez de la piel y las conjuntivas [ikter(o)- ἴκτερος gr ictericia (amarillo) + -ik-os-ik-ē gr + -ia(m) lat cualidad] httpDicciomedeusales 22 (Del griego an- privacioacuten y haima sangre) Sinoacutenimo OLIGOHEMIA ESPANEMIA Empobrecimiento de la sangre caracterizado por la disminucioacuten de uno de varios o de todos sus elementos (anemia total anemias parciales) Esta palabra se aplica generalmente cuando se emplea sin epiacuteteto a una anemia parcial caracterizada por la disminucioacuten del nuacutemero de gloacutebulos rojos o maacutes exactamente por la disminucioacuten de la cantidad de hemoglobina contenida en la unidad de volumen de sangre no estando aumentado el volumen plasmaacutetico (Jean Bernard) Se emplea tambieacuten para designar el estado del organismo privado de sangre y desde este punto de vista la anemia puede ser general o local Se dice que la anemia es hemotiacutesica cuando obedece a la destruccioacuten exagerada de los hematiacutees y mielotiacutesica cuando resulta de la detencioacuten de su formacioacuten por insuficiencia del tejido mieloide (Pappenheim) wwwportalesmedicoscom
Malaria y Plasmodium
26
En Malaria croacutenica se produce esplenomegalia y hepatomegalia24 asiacute como
accesos febriles irregulares y de baja intensidad La piel se torna amarillo-
terrosa se producen palpitaciones somnolencia y fatiga Una caracteriacutestica muy
comuacuten es la baja parasitemia que presentan los pacientes
En el embarazo la malaria produce alta mortalidad materna por anemia
partos prematuros por insuficiencia cardiacuteaca palpitaciones mareos y disnea25
Esto repercute en el bebeacute de forma que producen muertes neonatales y dantildeos
cerebrales
La Malaria severa es producida por Plasmodium falciparum que ocasiona
disfuncioacuten de oacuterganos vitales altas parasitemias imposibilidad de tratamiento
por viacutea oral y hemoacutelisis intravascular
Los casos maacutes graves son los de Malaria cerebral Los nintildeos son el grupo maacutes
susceptible de contraer este tipo de malaria Los hematiacutees infectados se tornan
maacutes adhesivos y se pegan a las paredes de los vasos capilares entre otros a los
del cerebro Se produce anemia grave fallos renales y pulmonares agudos
convulsiones trastornos de movilidad y neuroloacutegicos El paciente entra en
coma pudiendo fallecer en 24 horas Si se logra un retorno del coma los dantildeos
cerebrales residuales son permanentes
II5 Deteccioacuten y diagnoacutestico
Es relativamente sencillo diagnosticar malaria pero lo realmente complicado
y uacutetil es el diagnostico concreto del tipo de malaria Ejemplo de ello es que una
caracteriacutestica de la infeccioacuten por P falciparum es la alta parasitemia donde
hasta 3 trofozoiacutetos se encuentran invadiendo un eritrocito o la aparicioacuten de
gametocitos con forma alargada que no se da en otros tipos de plasmodio
El diagnoacutestico de la malaria se realiza basaacutendose en una serie de criterios
cliacutenicos epidemioloacutegicos y de laboratorio que con una adecuada anamnesis y
examen fiacutesico pueden orientar con alto grado de certeza sobre el tipo de malaria
23 Un gran nuacutemero de ceacutelulas falciformes quedan atrapadas en el bazo y producen su agrandamiento repentino Los siacutentomas pueden incluir debilidad repentina palidez en los labios respiracioacuten raacutepida sed extrema dolor abdominal (del estoacutemago) o en el costado izquierdo del cuerpo y palpitaciones raacutepidas wwwcdcgov 24 Patologiacutea digestiva y hepatoloacutegica Aumento de volumen o hipertrofia del hiacutegado [hēpat(o)- ἧπα-ρ-τος
gr hiacutegado + -megalia μεγαλ-ία gr cient tamantildeo excesivo] httpDicciomedeusales 25 Patologiacutea neumoloacutegica dificultad para respirar [dys- δυσ- gr dificultad + -pnoi(a) -πνοια gr respiracioacuten] httpDicciomedeusales
Malaria y Plasmodium
27
contraiacuteda Las pruebas maacutes concluyentes son la visualizacioacuten del paraacutesito o
deteccioacuten de antiacutegenos en pruebas raacutepidas
Criterios cliacutenicos Se tendraacuten en cuenta tanto episodios malaacutericos anteriores
del paciente como fiebres actuales o recientes (en menos de un mes) escalofriacuteos
intensos sudoracioacuten profusa naacuteuseas y voacutemitos mialgias siacutentomas
gastrointestinales anemia o esplenomegalia
Criterios epidemioloacutegicos El estudio de antecedentes aporta mucha
informacioacuten para el diagnoacutestico Antecedentes como los de exposicioacuten en los
uacuteltimos quince diacuteas en aacutereas de transmisioacuten activas antecedentes hospitalarios
transfusioacuten sanguiacutenea de medicacioacuten antimalaacuterica o relacioacuten con personas que
hayan sufrido malaria
Criterios de laboratorio La forma maacutes sencilla de detectar la enfermedad
incluyendo casos donde todaviacutea estaacute en estado latente es el Meacutetodo de la Gota
gruesa La toma de muestra se realiza mediante la puncioacuten con una lanceta
esteacuteril normalmente en la yema del dedo Se recogen 3 oacute 4 gotas sobre un
portaobjetos y con la esquina de otro se unen en movimientos raacutepidos
extendieacutendose hasta formar una capa gruesa y uniforme Se usa para la
determinacioacuten de la parasitemia y tiene una sensibilidad del 80 y 100 de
especificidad
Se mide mediante la ecuacioacuten
(Nordm paraacutesitos x 8000) Parasitemia (paraacutesitosμL) =
200 eritrocitos (hematiacutees)
La gota gruesa permite analizar una mayor cantidad
de sangre facilitando la deteccioacuten de parasitemias
bajas menores del 1 (Figura 14) y un ahorro de
tiempo en el examen aunque al romperse los
eritrocitos resulta difiacutecil la identificacioacuten de especie
Figura 14 Vista al microscopio de los eritrocitos26
26 Disponible en
httpdpdcdcgovdpdxhtmlFramesMRMalariaovalebody_malariadfovaringhtm
Malaria y Plasmodium
28
Es una prueba sencilla y poco costosa que muestra los casos positivos En
zonas de alta trasmisioacuten esta prueba no es determinante ya que la deteccioacuten de
paraacutesitos en sangre no significa que la posible fiebre que presente una persona
sea por malaria
Como se ha indicado antes es importante la determinacioacuten de la especie de
Plasmodium y se consigue tambieacuten de una manera sencilla con el Meacutetodo de
frotis donde la muestra se colecta de la misma forma que la gota gruesa pero en
este caso se recoge una gota de sangre en un portaobjetos y con otro se realiza
la extensioacuten en capa fina de la misma El inconveniente para realizar estas dos
teacutecnicas sencillas es que se necesita un laboratorio y personal cualificado no
disponible en muchas de las zonas endeacutemicas
Hay otras teacutecnicas de deteccioacuten maacutes desarrolladas como el sistema QBC
(Quantitative Buffy Coat test) que es un meacutetodo de screening para la deteccioacuten
raacutepida de paraacutesitos en sangre centrifugada en un microcapilar Es un meacutetodo
gravimeacutetrico que usa la fluorescencia para la determinacioacuten Aunque es un
meacutetodo raacutepido son necesarias infraestructuras y es difiacutecil distinguir la especie
Existen tambieacuten otros meacutetodos basados en teacutecnicas inmunocromatograacuteficas
en la deteccioacuten de antiacutegenos parasitarios La HRP-2 y la LDH son proteiacutenas
secretadas por el paraacutesito y por tanto indicadoras de su presencia Son pruebas
raacutepidas y no precisan microscopio Tambieacuten son faacuteciles de interpretar ya que
son test en tiras o tarjetas donde se pone una muestra de sangre y se revelan
Son usados como examen de autodiagnoacutestico y en lugares donde no hay
laboratorios como examen preliminar El problema es que dan falsos negativos
y no es un meacutetodo cuantitativo del grado de infeccioacuten
Por uacuteltimo las teacutecnicas de biologiacutea molecular usadas en casos de baja
parasitemia infecciones mixtas o mutaciones entre otras Aunque presentan
muchas ventajas son teacutecnicas laboriosas caras y poco accesibles ya que se
necesitan medios y personal muy cualificado
Es por tanto la combinacioacuten de los criterios explicados la forma maacutes
concluyente de diagnosticar que tipo de malaria estaacute afectando a un enfermo
IIIIII PPRREEVVEENNCCIIOacuteOacuteNN YY TTRRAATTAAMMIIEENNTTOO
Prevencioacuten y Tratamiento
31
III1 Medidas preventivas
La malaria es una enfermedad que puede prevenirse desde sus dos frentes
principales el vector mosquito y el hospedador humano Las medidas de
prevencioacuten se centran en objetivos distintos como evitar el desarrollo de la
enfermedad con proteccioacuten individual en aacutereas endeacutemicas erradicacioacuten del
mosquito prevencioacuten de la picadura o desarrollo de medicamentos
profilaacutecticos
En lo que a la lucha antivectorial se refiere el uso de mosquiteras en las
camas ha reducido mucho el caso de nuevos contagios de la enfermedad Es
una medida que a simple vista parece muy sencilla pero que en realidad no lo
es El problema estaacute en que en muchos de los paiacuteses endeacutemicos la pobreza es
elevada y por tanto el coste de las mosquiteras no es asumible por las personas
En otras ocasiones no es el coste de dichas mosquiteras lo que impide la
prevencioacuten sino que las redes son usadas con otros fines prioritarios como la
pesca En la actualidad la OMS recomienda el uso de insecticidas como
piretroides para impregnar las mosquiteras
Otra forma eficaz de reducir raacutepidamente la transmisioacuten del paludismo es la
fumigacioacuten de interiores con insecticidas de accioacuten residual Los mejores
resultados se consiguen cuando se fumiga al menos el 80 de las viviendas de
la zona en cuestioacuten La fumigacioacuten de interiores es eficaz de tres a seis meses
dependiendo del insecticida utilizado y del tipo de superficie sobre la que se
aplica En algunos casos el DDT puede ser eficaz de nueve a doce meses
Actualmente se estaacuten desarrollando insecticidas con accioacuten residual maacutes
prolongada para la fumigacioacuten de interiores Se ha comprobado la eficacia de
insecticidas como el DDT que aunque fue prohibido su uso por su alto grado de
toxicidad en plantas y su efecto acumulativo sigue siendo ampliamente
utilizado en la lucha contra la malaria Tambieacuten se cuenta con la ayuda de los
repelentes para la piel (DEET) o tiras insecticidas Finalmente no se deberiacutea
olvidar como arma vaacutelida y primaria para la lucha la educacioacuten en prevencioacuten
y gestioacuten del medio ambiente
En lo que al factor humano se refiere el uso de medicamentos especiacuteficos en
bajas dosis durante largo tiempo es la forma actual de profilaxis En esta liacutenea
se estaacuten desarrollando vacunas y tratamientos actualmente en el campo de la
genoacutemica
Prevencioacuten y Tratamiento
32
III2 Tratamiento
III21 Historia del tratamiento
La malaria es una de las enfermedades mejor estudiadas de la medicina
occidental hasta mediados del siglo XX a pesar de
que no se haya encontrado solucioacuten para su
erradicacioacuten A principios del siglo XVIII el
primer tratamiento conocido se basoacute en el uso de
la corteza de un aacuterbol originario de Sudameacuterica
la Cinchona (Figura 15) En 1820 se consiguioacute
aislar e identificar la quinina como compuesto
activo
Figura 15 Aacuterbol de la Cinchona pubescens
En 1891 el azul de metileno se usoacute para tratar a dos pacientes enfermos de
malaria Asiacute se convierte este compuesto en el primer ldquomedicamento sinteacuteticordquo
Actualmente se conoce que su mecanismo de accioacuten implica la inhibicioacuten de la
glutatioacuten reductasa y posteriormente la interrupcioacuten de la homeostasis redox
del paraacutesito
En 1925 se desarrolloacute la mepraquina para combatir estadios del P falciparum
en sangre Es un compuesto que pertenece al grupo de derivados de acridina
usados en el sudeste asiaacutetico durante la II Guerra Mundial Ya en 1934 se
sintetizoacute la cloroquina (CQ) aunque no es hasta el antildeo 1946 cuando comienza
su uso porque se consideraba demasiado toacutexica Con esta estructura comienza a
desarrollarse el grupo de las 4-aminoquinolinas Desde entonces ha sido el
antimalaacuterico maacutes utilizado En 1969 la guerra del Vietnam conlleva el uso de la
mefloquina y halofantrina que son aminoalcoholes derivados de la quinina
Sin embargo el antimalaacuterico maacutes antiguo puede ser la artemisina descubierta
en el antildeo 1596 a partir de un compuesto de origen natural de China La
Artemisina Annua es una planta originaria oriental que constaba ya siglos atraacutes
en los manuales de procedimientos para el tratamiento de fiebres Aunque no
fue hasta el antildeo 1972 cuando se consiguioacute aislar e identificar Este compuesto es
utilizado en la actualidad y resulta eficaz y poco toacutexico
Prevencioacuten y Tratamiento
33
III22 Clasificacioacuten de los compuestos antimalaacutericos
A lo largo de la historia se han usado diferentes tratamientos derivados del
desarrollo de nuevas estructuras y del mejor conocimiento de la enfermedad y
del paraacutesito
De este modo las estructuras pueden clasificarse por
Actividad antimalaacuterica
o Hombre
Estados pre-eritrociacuteticos profilaxis eventual pero poco praacutecticos
Hipnoticidas para P vivax y P ovale actuacutean a nivel hepaacutetico
Esquizonticidas en sangre para estados eritrociacuteticos asexuales
o Mosquito
Gametocidas destruccioacuten de las formas eritrociacuteticas de la fase
sexual del mosquito Prevencioacuten de la transmisioacuten
Esporonticidas previene el crecimiento de los oocitos en el
mosquito tambieacuten se usa para prevenir transmisioacuten
Mecanismo de accioacuten
o Accioacuten sobre la vacuola digestiva del Plasmodium accioacuten sobre la
degradacioacuten de la Hb detoxificacioacuten de la hematina (por ejemplo la
CQ)
o Enzimas involucradas en la siacutentesis y metabolismo de
macromoleacuteculas
o Accioacuten sobre procesos de membrana
o Siacutentesis de purinas y pirimidinas
o Glucoacutelisis y siacutentesis de ATP mitocondrial
Forman familias de compuestos con actividades diferentes en muacuteltiples aacutereas
y niveles
Metanolquinolinas y arilaminoalcoholes
La metanolquinolinas y arilaminoalcoholes forman una familia de
compuestos de gran importancia Este grupo engloba desde
estructuras con gran relevancia histoacuterica como la quinina hasta
compuestos como la lumefantrina que se usa en terapias combinadas
en la actualidad
Prevencioacuten y Tratamiento
34
Estas dos familias de compuestos estaacuten relacionadas entre siacute Como
primera correspondencia destacar su gran efectividad como
esquizonticidas sanguiacuteneos Intervienen en la digestioacuten de la Hb en
concreto en la detoxificacioacuten especiacutefica de la hemozoiacutena
Pertenecientes a la familia de metanolquinolinas son la quinina y
quinidina (que son isoacutemeros L y D) y mefloquina (Figura 16)
Figura 16 Estructura de metanolquinolinas
El problema de la quinina y la quinidina es sus efectos adversos sin
embargo siguen siendo ampliamente usados debido a su faacutecil acceso
La mefloquina es muy uacutetil en malarias resistentes pero tiene efectos
neurosiquiaacutetricos adversos
Los arilaminoalcoholes como halofantrina y lumefantrina (Figura
17) son estructuras de gran capacidad esquizonticida siendo el
mecanismo de accioacuten en la mayor parte de ellos la intervencioacuten en los
procesos de degradacioacuten de la Hb
Figura 17 Estructura de arilaminoalcoholes
Estas estructuras actuacutean en los paraacutesitos maacutes maduros pero no tienen
capacidad hipnoticida Se desarrollaron tras la aparicioacuten de
resistencias a la quinina y CQ
Prevencioacuten y Tratamiento
35
Aminoquinolinas
En este grupo se engloban compuestos como la familia de las 4-
aminoquinolinas y las 8-aminoquinolinas Las 4ndashaminoquinolinas
actuacutean en las fases endo-eritrociacuteticas del paraacutesito La gran ventaja de
esta familia es que los compuestos son faacuteciles de sintetizar
econoacutemicos y bien tolerados A este grupo pertenecen compuestos tan
relevantes como la cloroquina efectiva en profilaxis pero que en la
actualidad presenta problemas de resistencias o la amodiaquina que
es mejor que la CQ para eliminar parasitemias aunque es
hepatotoacutexica (Figura 18)
Figura 18 Estructura quiacutemica de la cloroquina y la amodiaquina
Al grupo de las 8-aminoquinolinas pertenecen la pamaquina la
primaquina y la tafenoquina (Figura 19) que son el uacutenico grupo de
gametocidas y tambieacuten son usadas como profilaxis El gran problema
de estos compuestos es su alta toxicidad
Figura 19 Estructuras de 8-aminoquinolinas
Prevencioacuten y Tratamiento
36
Derivados de acridina
Son compuestos de relevancia histoacuterica como la mepraquina
compuesto sucesor y de origen muy similar a la CQ que fue el primer
compuesto sinteacutetico usado cliacutenicamente como esquizonticida La
pironaridina que tambieacuten pertenece a esta familia (estructuralmente
relacionado con la amodiaquina) se usa en casos de malaria por P
falciparum resistente pero tiene baja biodisponibilidad oral y su precio
es elevado (Figura 18)
Figura 18 Estructura de derivados de acridina
Antifolatos e inhibidores de la siacutentesis de folatos
El aacutecido foacutelico obtenido mediante la dieta es convertido por el
paraacutesito en aacutecido tetrahidrofoacutelico necesario para su superviviencia
Los antifolatos inhiben el metabolismo del aacutecido foacutelico actuando como
coenzimas de la siacutentesis de ADN y pirimidinas Estos compuestos
actuacutean sobre los estados de crecimiento del paraacutesito en el hiacutegado y
detienen la reinfeccioacuten del mosquito
Pertenecen a esta familia sulfonamidas como sulfadoxina o sulfonas
como dapsona y compuestos como proguanil y pirimetamina (Figura
19)
Figura 19 Estructura de antifolatos
Prevencioacuten y Tratamiento
37
Antibioacuteticos
Son familias de compuestos que actuacutean a nivel celular y de
genoma Una de sus dianas es la inhibicioacuten de la siacutentesis de
proteiacutenas con funciones metaboacutelicas importantes para la
supervivencia del paraacutesito Este es el caso de la inhibicioacuten de la
funcioacuten del apicoplasto que interviene en la siacutentesis del grupo
hemo o liacutepidos Para ello estaacuten los antibioacuteticos del grupo de
tetraciclinas como la doxiciclina (Vibramycinreg) (Figura 20)
Figura 20 Estructura de la doxiciclina
Artemisinas y terapias combinadas de artemisinas (TCA)
Esta familia proviene del compuesto aislado del la planta Artemisia
Annua La artemisina (Figura 21) se obtiene solo por viacutea natural y el
resto de derivados son semisinteacuteticos El mecanismo de accioacuten es el
mismo que el de las 4-Aminoquinolinas solo que en esta ocasioacuten viacutea
radicales libres
Son compuestos muy activos en malaria y aunque sus tiempos de vida
son cortos ofrecen actividad aguda El punto negativo es que en su
tiempo de accioacuten no son capaces de eliminar toda la parasitemia y son
necesarias terapias combinadas con otros compuestos En la
actualidad se ha detectado la aparicioacuten de resistencias debido al uso
de monoterapias
Figura 21 Estructura de la artemisina
Prevencioacuten y Tratamiento
38
III23 Aparicioacuten de resistencias
La OMS ha definido resistencia como la capacidad de una cepa parasitaria de
sobrevivir yo multiplicarse a pesar de la administracioacuten y absorcioacuten de un
medicamento dada a dosis iguales o mayores que aquellas usualmente
recomendadas pero dentro de los liacutemites de tolerancia del sujeto La resistencia
a los antimalaacutericos es un serio problema desde hace antildeos En 1973 la CQ fue
reemplazada por la combinacioacuten de sulfadoxina + pirimetamina (Fansidarreg)
Pero en 1985 eacutesta tambieacuten se volvioacute inefectiva en algunas cepas de P falciparum
Estaacute demostrado que la resistencia a algunos antimalaacutericos se desarrolla cierto
tiempo despueacutes de la introduccioacuten de los mismos como tratamiento uacutenico
Seguacuten la OMS se describen tres grados de resistencia in vivo a las drogas
antimalaacutericas
- Grado I (bajo grado) recurrencia a los 7 y 28 diacuteas del tratamiento completo
siguiendo a una inicial solucioacuten de los siacutentomas y reduccioacuten de la
parasitemia
- Grado II (grado intermedio) reduccioacuten de la parasitemia asexuada en maacutes
de un 75 dentro de las 48 h del tratamiento pero con aumento a los siete
diacuteas
- Grado III (alto grado) el nivel de la parasitemia asexuada no cae en maacutes del
75 dentro de las 48 h despueacutes del tratamiento
En la actualidad uno de los compuestos maacutes utilizados es la quinina que a
pesar de los efectos adversos que tiene es uno de los compuestos maacutes accesibles
en los paiacuteses pobres lo que facilita su uso actual Tambieacuten la artemisina y sus
derivados son ampliamente utilizados ya que estudios recientes demuestran la
gran capacidad antiplasmoacutedica Pero en su contra estaacute la baja vida del
compuesto la parasitemia residual y la aparicioacuten de resistencias Ademaacutes de
estos puntos negativos se une el hecho de que la uacutenica viacutea de obtencioacuten de este
compuesto es por medio natural no es viable su obtencioacuten por siacutentesis quiacutemica
lo que conlleva encarecimiento del producto por su limitada accesibilidad
Estudios actuales han conseguido explicar el origen de alguna de estas
resistencias La CQ es un compuesto que accede a la vacuola digestiva del
paraacutesito para interferir en la detoxificacioacuten de la hemozoiacutena El pH de la
vacuola estaacute en torno a 5 lo que produce una protonacioacuten de la CQ hasta su
forma diproacutetica (CQH2+2) En esta forma protonada la QC queda atrapada
Prevencioacuten y Tratamiento
39
dentro de la vacuola porque no se puede difundir y es asiacute como produce su
accioacuten
El Plasmodium falciparum que ha desarrollado resistencia a la CQ se caracteriza
por la proteiacutena PfCRT (Plasmodium Falciparum Chloroquine Resistance
Transporter) modificada Esta proteiacutena adopta la funcioacuten de unirse a la CQ para
realizar su transporte fuera de la vacuola evitando asiacute la acumulacioacuten y la
realizacioacuten de la funcioacuten del faacutermaco Los primeros estudios realizados en este
tema (Fidock DA et alts 2000) mostraron los primeros datos sobre la relacioacuten
entre las mutaciones el pH de la vacuola digestiva y las concentraciones del
faacutermaco dentro de la vacuola digestiva En un principio se pensoacute que las
mutaciones en los genes del Plasmodium provocaban la acidificacioacuten del medio
interior de la vacuola digestiva alterando la concentracioacuten del faacutermaco o
reduciendo la fijacioacuten a la hematina
Estudios posteriores (Martin R et alts 2009) han llegado a concretar el
mecanismo por el cual se producen resistencias a la CQ La mutacioacuten que le
confiere resistencia a la CQ es el cambio de una lisina (K) por una treonina (T)
en la posicioacuten 76 de la serie de aminoaacutecidos Esta mutacioacuten K76T se da en la
regioacuten de la proteiacutena que se cree involucrada en la unioacuten con la moleacutecula Estaacute
siendo objeto de estudio la creacioacuten de nuevos derivados que favorezcan la
inversioacuten de las mutaciones asiacute como favorecer de nuevo la formacioacuten de la
conformacioacuten T76K Ocurre lo mismo con el intercambio de posicioacuten arginina-
serina (R163S confiere resistencia a la CQ y el cambio a S163R la vuelve
sensible) Este cambio confiere carga positiva al sitio de unioacuten e imposibilita por
repulsioacuten de cargas la unioacuten de la PfCRT con la CQ lo que confiere
sensibilidad a la cepa resistente
La aparicioacuten de resistencias a la artemisina queda registrada en el sudeste
asiaacutetico durante estos uacuteltimos antildeos Se han descrito evidencias cliacutenicas que
concluyen que existen en la actualidad casos de resistencias a la artemisina y a
los TCA promovida principalmente por el extendido uso de las monoterapias
de artemisina pero todaviacutea estaacute en estudio el mecanismo por el que se producen
estas resistencias (OMS Informe 2011) En la actualidad la posibilidad de
estudiar el genoma de los paraacutesitos y los mecanismos de accioacuten de los
diferentes tratamientos da como resultado el conocimiento de las resistencias y
la oportunidad de mejorar los tratamientos existentes
Prevencioacuten y Tratamiento
40
Dentro de las medidas de lucha contra la malaria estaacuten como se ha
comentado las referentes al control de vectores La uacutenica clase de insecticidas
empleados en las mosquiteras actualmente recomendadas incluidos los de
accioacuten prolongada actualmente recomendados son los piretroides En este
aacutembito tambieacuten se han desarrollado resistencias en la actualidad Se carece por
ahora de insecticidas alternativos que sean seguros y con una aceptable relacioacuten
costo-eficacia El desarrollo de nuevos insecticidas alternativos es una tarea de
alta prioridad pero tambieacuten larga y costosa Mientras la deteccioacuten de las
resistencias debe ser un componente esencial de todos los esfuerzos por
controlar el paludismo (OMS 2012)27
III24 Tratamientos actuales
Los regiacutemenes terapeacuteuticos en malaria son muy diversos ya que ademaacutes de
las caracteriacutesticas del paciente dependen del tipo de Plasmodium que infecta y la
zona donde se contrae la enfermedad
Cloroquina
Se usa a dosis maacutexima de 25 mgkg viacutea oral en P ovale y P malariae y cepas
sensibles de P vivax y P falciparum Actuacutea en la vacuola digestiva del
paraacutesito interfiriendo en la detoxificacioacuten de la hematina La alternativa
terapeacuteutica es gluconato de quinidina o quinina
Los efectos adversos que se producen son nauseas irritacioacuten con picor o
desoacuterdenes neuropsiquiaacutetricos La sobredosis se ha de tratar con diazepam
En caso de cepas P vivax resistentes se usa mefloquina halofantrina o
sulfato de quinina combinado con tetraciclinas o sulfonamidas Para tratar
recaiacutedas por hipnozoiacutetos se usa el fosfato de primaquina Para tratar
infeccioacuten por P falciparum resistente se usa sulfato de quinina 250 mgkg
combinado con pirimetamina-sulfadoxina o combiando con doxiclina Para
el tratamiento de nintildeos y embarazadas la quinina se combina con
clindamicina
Quinina
Es usada para el tratamiento de P falciparum resistente a la CQ Actuacutea como
esquizonticida sanguiacuteneo Como alternativa se usa el gluconato de
quinidina que es maacutes potente Las alternativas terapeacuteuticas son mefloquina
27 httpwwwwhointmalariadiagnosis_treatment
Prevencioacuten y Tratamiento
41
halofantrina atovaquona artemisinina y pirimetamina-sulfadoxina Para P
falciparum resistente se usa la artemisina IV combinada con tetraclicina o
mefloquina
Los efectos adversos son sabor metaacutelico tinnitus28 y peacuterdida de audicioacuten
reversible
Pirimetamina-sulfadoxina (Fansidarreg)
Es inhibidor de la siacutentesis de aacutecido foacutelico del ciclo vital del paraacutesito Se
utiliza en paiacuteses en desarrollo por su bajo coste sin embargo el incremento
de la resistencia a los antifolatos lo colocan como agente de segunda liacutenea
Mefloquina (Lariamreg)
Puede administrarse a dosis uacutenica de 25 mg baseKg y actuacutea como
esquizonticida sanguiacuteneo No debe administrarse en nintildeos con menos de 15
Kg de peso ni en pacientes que reciban quimioprofilaxis ni halofantrina
para evitar la resistencia cruzada Puede combinarse con doxiciclina
quinina y derivados de la artemisinina
Los efectos adversos son voacutemitos y toxicidad neuroloacutegica manifiestada en
forma de mareos delirio ataxia29 y convulsiones
Halofantrina
Se administra en dosis de 24 mgKg para intervenir en la degradacioacuten de la
Hb El faacutermaco tiene absorcioacuten oral variable y estaacute contraindicado en
enfermos con afecciones cardiacuteacas embarazadas y durante la lactancia Los
efectos adversos se han asociado con toxicidad cardiacuteaca y arritmias30
Atovaquona ndashproguanil (Malaronereg)
La dosis empleada es de 250 mg atovaquona100 mg proguanil Interviene
en la siacutentesis de aacutecido foacutelico del paraacutesito y en la cadena de transporte
electroacutenico mitocondrial (principal accioacuten de la atovaquona) El faacutermaco se
usa generalmente en profilaxis pero tambieacuten en el tratamiento de malaria
28 Patologia Otorrinolaringologa Estomatologa Percepcioacuten de golpeos o pitidos en el oiacutedo que no proceden de ninguna fuente [ claacutes tinnītus es tintineo] httpdicciomedeusales 29 Patologiacutea Neuroloacutegica Perdida de la capacidad de ejecutar movimientos de manera voluntaria ordenada y suavemente Puede afectar a tronco extremidades faringe laringe etc Se debe a la afectacioacuten de algunas estructuras del sistema nervioso [gr ataxiacuteā ἀταξία [a(n)- ἀ-ἀν- gr no + tag- τάξις gr orden formacioacuten + -siacuteā gr] httpdicciomedeusales 30 Patologiacutea cardiovascular Irregularidad y desigualdad en las contracciones del corazoacuten [gr arrythmiacuteā ἀρρυθμία [a(n)- ἀ-ἀν- gr no + rhythm(o)- ῥυθμός gr cadencia ritmo + -iacuteā gr cualidad] wwwdicciomedeusales
Prevencioacuten y Tratamiento
42
por P falciparum resistente a otros medicamentos No presenta efectos
adversos destacables
Derivados de la artemisina o TCA
La dosis de administracioacuten es de 12 mgKg pero es conveniente que se
combinen preferiblemente con mefloquina tetraciclina o clindamicina
Son el tratamiento de eleccioacuten para P falciparum resistente a quinina ya que
estos eliminan la parasitemia maacutes raacutepidamente que la quinina No se ha
descrito toxicidad severa en humanos aunque algunos estudios
demuestran neurotoxicidad en animales Auacuten no se ha determinado la
seguridad del uso de estos compuestos durante el embarazo
Artemeter-lumefantrina (Coartemreg y Riametreg)
Es una combinacioacuten fija de artemeter (20 mg) y lumefantrina (120 mg) con
accioacuten esquizonticida sanguiacutenea La combinacioacuten es eficaz contra las cepas
de P falciparum resistentes a otros tratamientos sin artemisina
Prevencioacuten y Tratamiento
43
III3 Estrategias mundiales en la lucha contra la malaria
En el antildeo 2008 se formoacute un grupo de estudio y control sobre la malaria
mundial integrado por la OMS Fondo de Naciones Unidas para la infancia
(UNICEF) el Programa de Naciones Unidas para el desarrollo (PNUD) el
Banco Mundial y la Asociacioacuten de la lucha contra el paludismo (FRP) Se crean
una serie de frentes de lucha para combatir y reducir la malaria mundial en un
plazo de 7 antildeos incluiacutedo en los Objetivos de Desarrollo del Milenio propuestos
por la ONU
La estrategia mundial tiene cuatro elementos baacutesicos
o Asegurar el diagnoacutestico precoz y el tratamiento inmediato
o Planificar y aplicar las medidas selectivas y sostenibles de prevencioacuten
incluiacuteda la lucha antivectorial
o Detectar a tiempo contener o prevenir las epidemias
o Reforzar la capacidad local en materia de investigacioacuten baacutesica y aplicada
a fin de permitir y promover la evaluacioacuten regular de la situacioacuten del
paludismo en el paiacutes en particular los factores ecoloacutegicos sociales y
econoacutemicos que influyen en la enfermedad
En el antildeo 2010 se realizoacute una revisioacuten del estado del plan y se propusieron
una serie de adaptaciones para mejorar los buenos resultados obtenidos
teniendo en cuenta la situacioacuten actual de aparicioacuten de resistencias
- Cobertura universal de los programas de prevencioacuten y tratamiento
- En prevencioacuten se proponen
mayores esfuerzos en proporcionar mosquiteras y principalmente un
haacutebito en su uso ya que se habiacutean obtenidos datos concluyentes que
relacionan directamente la disminucioacuten de muertes sobre todo
infantiles con el uso de mosquiteras
mantenimiento del rociado de exteriores con insecticidas de accioacuten
residual aprobadas por la OMS
administracioacuten de tratamiento preventivo intermitente a embarazadas
en zonas endeacutemicas
- En tratamientos se propone
priorizar las confirmaciones parasitoacutelogas de la enfermedad en
pacientes Es decir en la medida de lo posible no administrar
Prevencioacuten y Tratamiento
44
tratamientos sin confirmacioacuten de la enfermedad al microscopio o con
pruebas de diagnostico raacutepido
priorizar al uso de las TCA proponieacutendose la retirada de las
monoterapias orales de artemisina (OMS 2011)
III4 Liacuteneas de investigacioacuten actual
III41 Buacutesqueda de nuevas dianas
En la actualidad la aparicioacuten de resistencias por las mutaciones en el ADN del
paraacutesito obliga a un esfuerzo mayor por encontrar compuestos o asociaciones
de compuestos que sigan siendo efectivos contra el Plasmodium ademaacutes de a la
buacutesqueda de nuevos medicamentos Gracias a los avances de las ciencias
quiacutemicas y tecnologiacuteas actuales y el desarrollo de la Bioquiacutemica y la Genoacutemica
en la lucha contra la malaria posibilitan la determinacioacuten de nuevas dianas Ya
desde hace tiempo se conoce la viacutea de accioacuten de la detoxificacioacuten de la Hb pero
el continuo avance de la ciencia ha llevado al conocimiento del ADN y de las
macromoleacuteculas necesarias para la vida del paraacutesito conocimiento de las
mutaciones que llevan a las resistencias enzimas y otras moleacuteculas que
participan en el desarrollo del paraacutesito
Actualmente diferentes proyectos se encuentran en la fase de identificacioacuten de
cabezas de serie con actividad antimalaacuterica o en periodo de optimizacioacuten con el
fin de generar compuestos con propiedades terapeacuteuticas adecuadas como
inhibidores de proteasas de aacutecidos grasos inhibidores de la ruta de siacutentesis de
isoprenoides o del transporte y metabolismo de fosfoliacutepidos del metabolismo
mitocrondial o pirimidiacutenico
En lo que a inhibidores de proteasas se refiere las hemo-polimerasas como
cistein-proteasas (falcipainas) o aspartil-proteasas (plasmepsinas) son objetivos
primordiales de estudio Es el caso del conocimiento de las proteasas aspaacuterticas
del Plasmodium en los procesos de degradacioacuten de la hemoglobina de los
eritrocitos infectados Se ha determinado bioloacutegicamente que participan 4 tipos
de proteasas en concreto las plasmepsinas I II y IV y la histoaspaacutertica
(Ersmark K et alts 2006)
El mecanismo de accioacuten propuesto es la ruptura inicial de las cadenas α de la
Hb en el enlace peptiacutedico entre Phe-33 y Leu-34 Por meacutetodos computacionales
Prevencioacuten y Tratamiento
45
se genera la estructura tridimensional detallada de las enzimas y se estudia si
los compuestos pueden interaccionar inhibiendo su actividad
En relacioacuten con la siacutentesis de aacutecidos grasos hay que destacar las peculiares
caracteriacutesticas que reviste este proceso en bacterias y en cloroplastos Contienen
un sistema denominado tipo II (FASII) en el que cada reaccioacuten en el proceso de
biosiacutentesis estaacute catalizada por una proteiacutena independiente monofuncional al
contrario que en las ceacutelulas de mamiacutefero donde la siacutentesis estaacute mediada por una
proteiacutena multifuncional conocida como la aacutecido graso sintetasa de tipo I Los
inhibidores de enzimas de la ruta son el triclosan y la tiolactomicina un
metabolito secundario de hongos y estaacuten en desarrollo nuevos compuestos con
potencial terapeacuteutico
En faacutermacos dirigidos a la ruta de biosiacutentesis de isoprenoides vale la pena
destacar que el P falciparum depende de la viacutea 2C-metil-D-eritrol 4-fosfato
(MEP) para la siacutentesis de sus isoprenoides La fosmidomicina un antibioacutetico
natural producido por Streptomyces lavendulae ha demostrado ser un buen
tratamiento en el control de la malaria resistente porque inhibe de manera
especiacutefica la actividad de la enzima DOXP reductoisomerasa y porque controla
el segundo paso de la viacutea MEP
Otro proceso que tiene lugar durante las fases endo-eritrociacuteticas del paraacutesito
es la siacutentesis activa de estructuras de membrana Uno de los componentes
principales de las membranas del paraacutesito es el fosfoliacutepido fosfatidil-colina cuya
siacutentesis a su vez depende de la incorporacioacuten de colina exoacutegena a partir de la
sangre Distintos anaacutelogos de la colina exhiben una potente actividad
antimalaacuterica y se asume que inhiben el transporte de colina que tiene lugar a
traveacutes de un transportador especiacutefico localizado en la membrana del paraacutesito
(Vial HJ et alts 2004)
Existen un conjunto de compuestos que interfieren con la actividad
mitocondrial del paraacutesito Las fases endo-eritrociacuteticas tienen un metabolismo
mitocondrial activo estando presentes todas las enzimas implicadas en el ciclo
de los aacutecidos tricarboxiacutelicos y determinados componentes de la cadena de
transporte electroacutenico Asiacute la cadena respiratoria del paraacutesito constituye un
blanco de accioacuten para los faacutermacos Un ejemplo de desarrollo de faacutermacos por
esta viacutea es el Malaronereg donde la atovaquona se une al sitio de oxidacioacuten del
coenzima Q en el citocromo B del complejo III La accioacuten estaacute complementada
por la combinacioacuten con Proguanilo 45 (antifolato)
Prevencioacuten y Tratamiento
46
III42 Productos naturales
Los productos naturales han sido y son de gran intereacutes en el tratamiento de la
malaria La sociedad apuesta por lo natural y se plantean buacutesquedas de
compuestos activos en diferentes plantas de diferentes regiones africanas
(Magadula JJ y Erasto P 2009) o americanas (Mariath IR et alts 2009) ya
consideradas anteriormente como medicinales
La artemisina y sus derivados es el ejemplo a conseguir con estos
compuestos pero evitando en este caso el inconveniente de que solo puede
obtenerse por viacutea natural o semisinteacutetica
En esta liacutenea se siguen desarrollando derivados de artemisina y peroacutexidos que
tienen el mismo mecanismo de accioacuten que la artemisina viacutea radicales libres
(Muraleedharan KM and Mitchell A 2009) Uno de los muchos resultados de
esta variacioacuten de la estructura base son los compuestos hiacutebridos artemisinas-
quinolinas actualmente en desarrollo que dan lugar a los TCA recomendados
por la OMS Las benzo[c]fenantridinas son un grupo de compuestos
provenientes de extractos de plantas que pueden ser sintetizados y
modificados en un laboratorio (Rivaud M et alts 2012) Su mecanismo de
accioacuten estaacute todaviacutea por confirmar pero se cree que tienen actividad sobre la
inhibicioacuten de la ADN topoisomerasa que participa en la degradacioacuten de la Hb
Siguiendo con la liacutenea de productos naturales un objetivo que no se puede
pasar por alto son los compuestos marinos provenientes de esponjas algas
coraleshellip que contienen compuestos con estudiada actividad antimalaacuterica
(Gademann K y Kobyliska J 2009) Un ejemplo son las esponjas que
contienen diferentes familias de compuestos antimalaacutericos como las
pirroloquinolinas o las manzaminas A (Figura 23) de funcioacuten similar a la CQ y
mejor que la artemisina a igual dosis
Figura 23 Estructuras de compuestos naturales de origen marino
Prevencioacuten y Tratamiento
47
III43 Desarrollo de vacunas
Atendiendo a las observaciones sobre inmunidades que llegan a expresar las
personas que habitan zonas con altas tasas de malaria se van desarrollando las
vacunas Se ha comprobado que los esporozoiacutetos inactivos son muy eficaces
como inductores de la inmunidad en el ser humano Desafortunadamente no es
posible producir esporozoiacutetos inactivos en las enormes cantidades requeridas
para utilizarlos como meacutetodo viable de vacunacioacuten Por otro lado los avances
en materia de genoacutemica permiten identificar prometedoras moleacuteculas
inmunogeacutenicas con una rapidez mucho mayor y eso ampliacutea considerablemente
el nuacutemero de vacunas potenciales (Rojas Rivero L et alts 2005)
Las vacunas experimentales estaacuten basadas en diversos antiacutegenos derivados
de las diferentes formas que adopta el paraacutesito durante su ciclo de desarrollo
Los tipos de vacunas actualmente se clasifican en
Vacunas pre-eritrociacuteticas impiden que los esporozoiacutetos penetren o se
desarrollen en las ceacutelulas hepaacuteticas Estas vacunas prevendriacutean las
consecuencias graves y potencialmente mortales del paludismo en las
personas no inmunizadas Hasta la fecha se han ultimado unos 20 ensayos
cliacutenicos en el hombre con diversas proto-vacunas pre-eritrociacuteticas de
Plasmodium falciparum Una proto-vacuna muy prometedora es la RTS S
que promueve la activacioacuten del sistema inmunitario para que actuacutee contra
el P falciparum (Aponte JJ et alts 2007)
Vacunas contra las formas hemaacuteticas asexuadas son aquellas que impiden
que los merozoiacutetos penetren o se desarrollen en el interior de los hematiacutees
Se han desarrollado varios candidatos Sin embargo la mayoriacutea de esos
preparados se encuentra en estudios precliacutenicos y muy pocos han llegado a
estudios cliacutenicos de fase I debido en parte a la gran variabilidad que
manifiestan estas moleacuteculas en diferentes cepas
Vacunas bloqueadoras de la transmisioacuten son aquellas que estimulan la
produccioacuten de anticuerpos contra antiacutegenos de la fase sexuada del paraacutesito
que puedan impedir el desarrollo de esporozoiacutetos infecciosos en las
glaacutendulas salivales del mosquito Anopheles Teoacutericamente estas vacunas
podriacutean interrumpir el ciclo de transmisioacuten del paraacutesito al paso de este por
el vector y seriacutean de gran utilidad para reducir la diseminacioacuten de paraacutesitos
de cepas resistentes a otros tipos de vacunas El problema es que seriacutea
Prevencioacuten y Tratamiento
48
necesaria una vacunacioacuten masiva durante un largo periodo de tiempo
Actualmente hay algunas en estudios cliacutenicos de fase I
A pesar de todas las prometedoras vacunas que estaacuten en desarrollo
actualmente hay que tener en cuenta que los paraacutesitos desarrollan ingeniosos y
complejos mecanismos para soslayar la respuesta inmunitaria del hueacutesped Por
ejemplo son capaces de expresar diferentes antiacutegenos en cada una de las fases
de su ciclo de vida y a menudo modificar esos antiacutegenos cuando el hueacutesped
activa contra ellos su sistema inmunitario Ademaacutes se ha de vigilar la
complejidad inherente a la realizacioacuten de los propios ensayos cliacutenicos sobre el
terreno por cuanto no es faacutecil para los investigadores determinar la reduccioacuten
de la morbilidad y la mortalidad atribuible a la vacuna experimental
ANTECEDENTES
Antecedentes
51
La Unidad de I+D de Medicamentos de la Universidad de Navarra ha estado
trabajando durante varios antildeos en la siacutentesis de nuevos compuestos duales con
afinidad por los receptores 5-HT1A que fuesen a su vez inhibidores de la
recaptacioacuten de 5-HT para el tratamiento de la depresioacuten (Martinez- Esparza J
et alts 2001 Oruacutes L et alts 2002a Oruacutes L et alts 2002c Perez-Silanes S et
alts 2004)
Se llevaron a cabo estudios de modelizacioacuten molecular (Oruacutes L et alts
2002b) que definieron como farmacoacuteforo la estructura de la figura 24
Figura 24 Elementos farmacofoacutericos para la afinidad por los receptores 5-HT1 e inhibicioacuten del transportador de 5-HT
Los compuestos sintetizados podriacutean definirse como arilaminopropanoles
estructuralmente proacuteximos a las metanolquinolinas y arilaminoalcoholes
usados desde hace antildeos como antimalaacutericos Tal y como se como se ha tratado
en el apartado de introduccioacuten quinina y CQ (metanolquinolinas y
arilaminoalcoholes respectivamente) y halofantrina y lumefantina
(arilaminoalcoholes desarrollados tras la aparicioacuten de resistencias a las
anteriores) son compuestos de gran capacidad esquizonticida
Desde el punto de vista estructural la quinina y cloroquina pueden
considerarse farmacoacuteforos polivalentes ya que a partir de sus estructuras se han
desarrollado muchos de los compuestos que se usan como tratamiento de la
malaria en la actualidad La relacioacuten estructura-actividad de estos farmacoacuteforos
con base de quinolina se puede estudiar en la figura 25 (Konznetsov VV et
alts 2008)
Figura 25 Relacioacuten estructura actividad de la CQ
Antecedentes
52
Viendo la similitud estructural de los compuestos con estas estrucutras y los
aminoalcoholes utilizados en el tratamiento actual se decidioacute ensayar la posible
actividad antiplasmoacutedica de los mismos con buenos resultados en cepas
sensibles a la CQ (Perez-Silanes S et alts 2009)
Figura 26 Estructuras de los arilaminoalcoholes sintetizados como antidepresivos con mejor actividad antimalaacuterica Valores de CI50 en microM La CQ tiene un valor de 008 microM en cepas 3D7 sensibles a la CQ
Surgen asiacute las estructuras a desarrollar en este proyecto enfocado a la siacutentesis
de nuevos derivados de arilamino alcoholes para el tratamiento de la malaria
resistente a la CQ
OBJETIVOS Y
PLAN DE TRABAJO
IIVV OOBBJJEETTIIVVOOSS
Objetivos
57
El presente trabajo tiene como objetivo la buacutesqueda de nuevos derivados para
el tratamiento de la malaria resistente Teniendo en cuenta la estructura de los
aminoalcoholes derivados de la quinina y tomando como referencia la CQ se
propone la siacutentesis de nuevos derivados de arilaminoalcoholes con actividad
antimalaacuterica
El objetivo para llevar a cabo este proyecto estaacute basado en el trabajo detallado
a continuacioacuten
Revisioacuten bibliograacutefica de los faacutermacos con actividad antimalaacuterica
publicada hasta la fecha y planteamiento de un farmacoacuteforo
Disentildeo y siacutentesis de nuevos compuestos derivados de
arilaminoalcoholes con potencial actividad antimalaacuterica
Caracterizacioacuten estructural y evaluacioacuten bioloacutegica y computacional de
cada uno de los nuevos compuestos obtenidos
Estudio de la posible relacioacuten estructura-actividad de los compuestos
sintetizados que permita identificar liacutederes y una optimizacioacuten en el
disentildeo de nuevos derivados
Refinamiento estructural de nuevos compuestos con afinidad mejorada
por las dianas del plasmodio en base a los resultados obtenidos
VV PPLLAANN DDEE TTRRAABBAAJJOO
Plan de Trabajo
61
V1 Disentildeo de nuevos arilaminoalcoholes
Tal y como se ha comentado anteriormente se puede observar en la figura 27
que muchos de los compuestos antimalaacutericos de las diferentes subfamilias
tienen su base de desarrollo en la quinolina De ella surgen los dos compuestos
antimalaacutericos por excelencia
Figura 27 Esquema general del proceso de disentildeo de las moleacuteculas a desarrollar
Teniendo en cuenta todo esto se propone como estructura general de este
proyecto la mostrada en la figura 28
Figura 28 Esquema general de las nuevas estructuras
El proceso de disentildeo estructural de las nuevas moleacuteculas fue el siguiente
1 GRUPO AR1
En muchos de los compuestos antimalaricos mas relevantes como quinina o
cloroquina una constante en la estructura es la presencia del anillo de
quinolina aunque ya en los derivados de la familia de arilaminoalcoholes este
grupo es variable como en la halofantrina donde el grupo quinolina es
Plan de Trabajo
62
sustituido por el grupo fenantreno o el Benflumetol (lumefantrina) que cuenta
con un fluoreno sustituido
De este modo se plantea la posibilidad de la sustitucioacuten de la quinoleiacutena por el
benzo[b]tiofeno (basanda en estudios previos) el naftaleno (bioisoacutemero de la
quinoleiacutena) e incluso se plantea la simplificacioacuten a benceno (por motivos de
reduccioacuten estructurural) Se ha tenido en cuenta tambieacuten que en la familia de las
4-aminoquinolinas asociado a esa quinolina se presenta un grupo
electroatrayente (CF3) Asiacute se propone la introduccioacuten de un aacutetomo de fluacuteor
que es maacutes electronegativo y de menor tamantildeo
2 GRUPO Y
Si bien en la bibliografiacutea el grupo alcohol se considera esencial para la
actividad antimalaacuterica se quiso probar si en nuestros compuestos seguiacutea siendo
grupo esencial en la actividad Se estudioacute la actividad de los carbonilos
precursores de siacutentesis sustituyeacutendolos por un grupo oxima en posicioacuten 1 de la
cadena alifaacutetica en los nuevos derivados
3 CADENA ALIFAacuteTICA (CH2)n
En la familia de las aminoquinolinas y dentro del grupo de
arilaminoalcoholes se observa la presencia de una cadena alifaacutetica como puente
de unioacuten entre el grupo Ar1 y el resto de la moleacutecula De este modo los nuevos
derivados que desarrollar contaraacuten con una variacioacuten de uno a dos carbonos en
la cadena carbonada para determinar la longitud oacuteptima para la actividad
4 AMINA CENTRAL
El grupo amino es constante en todas las familias tomadas como referencia
Del mismo modo las aminoquinolinas tienen como similitud estructural entre
otras un grupo amino unido a la cadena alifaacutetica En este trabajo se plantea el
uso de piperazina homopiperazina (S)-aminopirrolidina aminopiperidina e
tetrahidropiridina para evaluar el efecto del cambio y determinar queacute tipo de
estructuras resulta maacutes conveniente
5 GRUPO AR2
En los compuestos tomados como referencia estructural de partida se observa
la presencia de las cadenas alifaacuteticas en el extremo amino Los nuevos
derivados combinan la amina ciacuteclica con un anillo aromaacutetico sustituido por
grupos electroatrayentes como CF3 (presentes en metanolquinolinas y
Plan de Trabajo
63
arilaminoalcoholes y de efecto positivo deducible para la actividad) el grupo
NO2 o el aacutetomo de F
Figura 29 Disentildeo de nuevas series de derivados de arilaminoalcoholes como nuevos agentes antimalaacutericos
V2 Siacutentesis de los compuestos disentildeados
Una vez disentildeados los compuestos y antes de empezar el trabajo de siacutentesis
se debe dejar claro cuaacutel va a ser el proceso elegido De forma general se puede
definir la siacutentesis de todos los derivados como siacutentesis lineal
La reaccioacuten de Mannnich que se usa para condensar metilcetonas con aminas
y las reacciones de condensacioacuten por sustitucioacuten nucleoacutefila alifaacutetica son
reacciones lineales La posterior reduccioacuten a hidroxilos u oximas se realiza en
un solo paso de reaccioacuten De esta forma nos aseguramos el menor nuacutemero de
pasos de reaccioacuten simplificacioacuten de la siacutentesis disminucioacuten del tiempo
invertido en el mismo y reduccioacuten del coste
V3 Caracterizacioacuten de los compuestos
Todas las reacciones seraacuten seguidas y controladas por cromatografiacutea en capa
fina Una vez obtenidos los compuestos se identificaraacuten por cromatografiacutea en
capa fina espectroscopia infrarroja resonancia magneacutetica nuclear de protoacuten
anaacutelisis elemental y punto de fusioacuten
Plan de Trabajo
64
V4 Evaluacioacuten bioloacutegica ldquoin vitrordquo
Los compuestos finales obtenidos seraacuten enviados a la Universidad de
Antioquiacutea (Medelliacuten Colombia) para la evaluacioacuten in vitro de su actividad
antimalaacuterica Los ensayos de toxicidad de los mismos se realizaraacuten en el
Laboratorio de Farmacologiacutea para el Desarrollo (IRD) de la Universidad Paul
Sabatier en Toulouse (Francia)
V5 Evaluacioacuten bioloacutegica ldquoin vivordquo
Aquellos compuestos que sean seleccionados por sus caracteriacutesticas de
estructura actividad in vitro y toxicidad seraacuten enviados a la Universidad Paul
Sabatier de Toulouse (Francia) para su evaluacioacuten in vivo
V6 Estudios computacionales
Todos los compuestos se someteraacuten a estudios computacionales sobre sus
propiedades fisicoquiacutemicas para obtener datos aproximados de su
comportamiento en solucioacuten (Log P) lipofilia o caraacutecter polar-apolar (presencia
de grupos polares y capacidad de formar enlaces donadores o aceptores) que
aporten datos teoacutericos sobre su absorcioacuten en el organismo A partir de los datos
conformacionales teoacutericos se plantea la unioacuten con una diana Los estudios
computacionales se realizaraacuten en la Unidad de I+D de Medicamentos de la
Universidad de Navarra
MATERIAL Y
MEacuteTODOS
VVII QQUUIacuteIacuteMMIICCAA TTEEOacuteOacuteRRIICCAA
VI1 Esquema general de siacutentesis
Figura 30 Reactivos y condiciones Viacutea 1 Carbonato potaacutesico en tetrahidrofurano a reflujo
Viacutea 2 Dioxolano con aacutecido clorhiacutedrico a reflujo 130-140ordmC
Quiacutemica Teoacuterica
70
VI2 Siacutentesis de precursores
VI21 Siacutentesis de (benzo[b]tiofen-3-il)-3-cloropropan-1-ona
Figura 31 Esquema general de siacutentesis de (benzo[b]tiofen-3-il)-3-cloropropan-1-ona
La siacutentesis de este derivado se lleva a cabo usando tricloruro de aluminio a
temperatura ambiente durante 48 horas (Peacuterez-Silanes S et alts 2001) En vez
de emplear cloroformo como disolvente tal y como describen los autores se
empleoacute diclorometano ya que es menos toacutexico y resulta igualmente efectivo
VI22 Siacutentesis de arilaminas
VI221 Siacutentesis de arilaminas protegidas
Los compuestos sintetizados se ajustan a la estructura general que se muestra
en la figura 32
Figura 32 Estructura general de las arilaminas intermedias sintetizadas
Las arilaminas sintetizadas tienen un extremo amino protegido con un grupo
tert-butiloxicarbonilo (BOC) voluminoso que evita que estas diaminas
reaccionen por ambos extremos con el fluoruro de arilo
Figura 33 Esquema general para la siacutentesis de arilaminas
Este tipo de reacciones raramente transcurren por un mecanismo de
sustitucioacuten nucleofiacutelica aromaacutetica (SNA) Normalmente la SNA dan bajos
rendimientos debido a que el enlace C (sp2)-X es maacutes corto y fuerte que el de un
carbono con hibridacioacuten sp3 La SN2 estaacute impedida por dificultades esteacutericas del
anillo para que se aproxime el nucleoacutefilo y la SN1 estaacute impedida por la
inestabilidad del catioacuten fenilo intermedio
Tras revisar la bibliografiacutea se propone que este tipo de SNA transcurren
seguacuten un mecanismo llamado Sustitucioacuten nucleofiacutelica aromaacutetica viacutea complejos
Quiacutemica teoacuterica
71
de meisenheimer (Figura 34) consistente en una adicioacuten-eliminacioacuten (Bruckner
et alts 2002)
En la primera fase la adicioacuten el nucleoacutefilo ataca al compuesto aromaacutetico en la
que es la etapa lenta de la reaccioacuten Se produce un carbanioacuten que es llamado
Complejo de Meisenheimer La carga negativa queda deslocalizada sobre los
cinco carbonos aromaacuteticos con hibridacioacuten sp2 del anillo pero no lo hace
uniformemente sino que se distribuye tal y como se indica en la figura 34
Figura 34 Primera Etapa Etapa lenta del mecanismo de reaccioacuten de sustitucioacuten nucleofiacutelica viacutea complejos de
Meisenheimer
El aacutetomo unido al nucleoacutefilo tiene hibridacioacuten sp3 ya que tambieacuten se
encuentra unido al sustituyente X que se elimina en una segunda etapa la fase
raacutepida de la reaccioacuten (Figura 35)
Figura 35 Segunda Etapa Etapa raacutepida del mecanismo de reaccioacuten de sustitucioacuten nucleofiacutelica viacutea complejos de
Meisenheimer
Independientemente del haloacutegeno X y del sustituyente R empleados en la
posicioacuten para respecto del aacutetomo de carbono al que ataca el nucleoacutefilo aparece
una carga parcial de -030 del mismo modo en las posiciones orto esta carga
parcial es de -025 y en la posiciones meta la carga es de -010 Como
consecuencia de esto uno de los requisitos maacutes importantes para que se de la
reaccioacuten es que alguacuten grupo electroatrayente estabilice el complejo La mayor
densidad de carga negativa se encuentra en para por lo que los grupos
electroatrayentes en esta posicioacuten estabilizan mucho el compuesto formado Por
esta razoacuten se han empleado grupos nitro o fluacuteor en dicha posicioacuten
El empleo de fluoruros de arilo para la formacioacuten de los intermedios de
aminas protegidas tambieacuten se explica por esta razoacuten El fluacuteor tiene un fuerte
efecto inductivo lo que estabiliza el complejo formado
Quiacutemica Teoacuterica
72
Tras una revisioacuten bibliograacutefica se observoacute que esta reaccioacuten esta favorecida
llevaacutendose a cabo en un medio de acetonitrilo (CH3CN) a reflujo en lugar del
dimetilsulfoacutexido (DMSO) anteriormente descrito usando carbonato potaacutesico
(K2CO3) (Blizzard et alts 2005) lo que facilita el trabajo por el bajo punto de
ebullicioacuten del medio y simplificando la extraccioacuten de los compuestos en este
medio
VI222 Desproteccioacuten de aminas
Las arilaminas sintetizadas tienen un extremo amino protegido con un grupo
BOC asiacute una vez formados los intermedios protegidos el paso siguiente para
continuar con la siacutentesis de los compuestos deseados consiste en eliminar este
grupo protector
Figura 36 Generacioacuten del carbocatioacuten t-butilo y del aacutecido carbaacutemico
La reaccioacuten de las aminas protegidas con aacutecidos acuosos como aacutecido
clorhiacutedrico y aacutecido aceacutetico (HCl y HAc) en condiciones de temperatura
ambiente rinde la consiguiente amina desprotegida en forma de hidrocloruro
Para esta reaccioacuten la amina protegida se disuelve en una disolucioacuten (11) de
HClHAc a temperatura ambiente generaacutendose un aacutecido carbaacutemico (Figura 36)
que es inestable y se descarboxila in situ (Figura 37) dando lugar a la amina
desprotegida en forma de hidrocloruro debido la presencia de HCl en el medio
Figura 37 Descarboxilacioacuten espontaacutenea del aacutecido carbaacutemico
Los hidrocloruros son compuestos poco solubles en muchos de los
disolventes orgaacutenicos y en ocasiones impiden los siguientes pasos de siacutentesis
Asiacute los intermedios se convierten a su forma de base libre por medio de su
disolucioacuten en agua y posterior adicioacuten de una disolucioacuten de hidroacutexido soacutedico
Quiacutemica teoacuterica
73
(NaOH) 2M de forma gradual hasta pH baacutesico para asegurar una completa
eliminacioacuten de HCl de la moleacutecula La disolucioacuten baacutesica se deja en agitacioacuten
durante dos horas aproximadamente Normalmente se observa como al antildeadir
la base se obtiene un precipitado debido a la insolubilidad de la amina en forma
de base libre en el medio acuoso mientras que en forma de hidrocloruro
resultaba soluble
Como uacuteltimo paso de reaccioacuten se procede a la extraccioacuten de la amina con un
disolvente orgaacutenico que suele ser diclorometano En general las aminas
precipitan faacutecilmente en hexano friacuteo como soacutelido Si fuese necesario purificar el
aceite impuro se realiza una cromatografiacutea en columna no flash con
diclorometano basificado con unas gotas de amoniacuteaco
VI3 Siacutentesis de derivados carboniacutelicos (Serie 0)
VI31 Condensacioacuten de 1-(benzo[b]tiofen-3-il)-3-cloropropan-1-ona y
de 2-bromo-2acute-acetonaftona con la amina (Viacutea 1)
En este caso los productos finales se obtienen a traveacutes de una reaccioacuten de
sustitucioacuten nucleofiacutelica alifaacutetica (Figura 38) a partir del 1-(benzo[b]tiofen-3-il)-3-
cloropropan-1-ona o del 2-bromo-2acute-acetonaftona y la correspondiente amina
Al tratarse de un cloruro de alquilo primario el mecanismo maacutes probable de
reaccioacuten es el de una sustitucioacuten nucleofiacutelica de segundo orden (SN2)
Figura 38 Esquema de siacutentesis de cetonas
La mayoriacutea de las veces los reactivos de partida no se llegan a consumir
completamente y se obtienen productos secundarios que no se eliminan con
facilidad Ha sido especialmente costosa la purificacioacuten de algunos compuestos
los que han requerido la purificacioacuten por medio dos columnas cromatograacuteficas
tradicionales consdecutivas columna tradicional seguida de una preparativa o
purificarlos dos veces consecutivas en el equipo de cromatografiacutea flash Todos
estos intentos de purificacioacuten ldquoparcialrdquo hacen disminuiacuter notablemente el
rendimiento de la reaccioacuten Otras veces los compuestos se precipitan como
hidrocloruro consiguiendo al mismo tiempo ser purificados
Quiacutemica Teoacuterica
74
VI32 Reaccioacuten de Mannich Condensacioacuten de metilcetonas con aminas
en medio aacutecido (Viacutea 2)
La reaccioacuten de Mannich consiste en la condensacioacuten de un compuesto que
posea aacutetomos de hidroacutegeno activos (sustrato) con formaldehiacutedo y una amina
para formar una moleacutecula conocida como ldquoBase de Mannichrdquo
En la mayor parte de las reacciones se usoacute el 13-dioxolano que es una amina
secundaria como compuesto generador de formaldehido El sustrato son
arilmetilcetonas donde el anillo aromaacutetico es fluorobenzo[b]tiofeno naftaleno
4-fluoronaftaleno o bencenos para-sustituidos El 13-dioxolano es ademaacutes el
disolvente y como catalizador el aacutecido clorhiacutedrico aporta al medio los protones
necesarios para la reaccioacuten
Las arilmetilcetonas utilizadas presentan hidroacutegenos aacutecidos en posiciones α
con respecto al grupo carboniacutelico (Figura 40) En medio aacutecido la acidez de estos
se debe a la estabilizacioacuten de la base conjugada (forma enoacutelica) por resonancia
La presencia del anillo en α con respecto al carbonilo provoca una situacioacuten de
deslocalizacioacuten electroacutenica π del sistema en su forma enoacutelica que se ve
favorecida por los sustituyentes electroatrayentes unidos al anillo La
reactividad aumenta debido a la retirada de carga del sistema π por estos
sustituyenes que acidifican asiacute los hidrogenos α
El mecanismo de reaccioacuten propuesto transcurre en dos etapas
En una primera etapa la amina reacciona con el formaldehiacutedo generando el
catioacuten iminio El 13 dioxolano es un acetal que en medio aacutecido genera
formaldehiacutedo ldquoin siturdquo para producirse entonces una adicioacuten nucleoacutefila de
la amina al carbonilo del compuesto no enolizable como es el recieacuten
generado formaldehiacutedo (Figura 39) (Tramontini et alts 1973)
Figura 39 Primera etapa del mecanismo de reaccioacuten propuesto para la formacioacuten de la base de Mannich
En la segunda etapa de reaccioacuten la metilcetona en medio aacutecido se protona
dando lugar a un equilibrio ceto-enoacutelico desplazado hacia la forma enoacutelica
(Figura 40)
Quiacutemica teoacuterica
75
Figura 40 Equilibrio ceto-enoacutelico en medio aacutecido
El ion iminio formado en la primera etapa es un buen electroacutefilo que
reacciona con la forma enolica nucleoacutefila obtenieacutendose como resultado la sal del
compuesto final (Figura 41) Asiacute el uacuteltimo paso de reaccioacuten es la basificacioacuten del
medio con una disolucioacuten acuosa de NaOH para la obtencioacuten de la sal
inorgaacutenica y compuesto orgaacutenico libre
Figura 41 Segunda etapa del mecanismo de reaccioacuten de Mannich
Se ha determinado experimentalmente que en la obtencioacuten de la base se
produce la misma reaccioacuten usando como generador de formaldehido el
paraformaldehido Para ella ha de usarse como medio de reaccioacuten un medio
proacutetico como el alcohol etiacutelico y HCl Despueacutes de varios experimentos y
optimizacioacuten de la temperatura necesaria para la reaccioacuten se comproboacute que la
viacutea oacuteptima por rapidez y rendimiento era la del 13 dioxolano
VI4 Siacutentesis de derivados hidroxiacutelicos (Series 1-7)
Los derivados hidroxiacutelicos se sintetizan a traveacutes de la reduccioacuten de las
correspondientes intermedios carboniacutelicos con borohidruro soacutedico (BH4Na) en
metanol a 0ordmC
Figura 42 Esquema general para la siacutentesis de alcoholes desde cetonas
En todas las reducciones que se han realizado se utiliza como agente
reductor el BH4Na que es probablemente el agente reductor maacutes usado en este
tipo de siacutentesis Se trata de un hidruro de reactividad media que presenta alta
quimioselectividad y un manejo sencillo en comparacioacuten con otros hidruros
El disolvente empleado es metanol con el que se logra una buena solubilidad
del BH4Na La temperatura de reaccioacuten se ha de mantener en torno a 0ordmC por
Quiacutemica Teoacuterica
76
tres motivos primero para evitar que la reaccioacuten se deacute demasiado raacutepida lo que
conlleva la aparicioacuten de productos secundarios en segundo lugar para evitar
que sea demasiado lenta lo que favorece la reaccioacuten secundaria entre el
borohidruro y el metanol El tercer motivo es impedir que tenga lugar la
reaccioacuten inversa a la reaccioacuten de Mannich
En general la reaccioacuten entre el BH4Na y el compuesto se da por completo
durante la primera hora de reaccioacuten antes de que tenga lugar la reaccioacuten
inversa de descomposicioacuten del compuesto cetoacutenico El mecanismo de reaccioacuten
no se ha descrito de forma totalmente definitiva aunque siacute que parece seguro el
hecho de que la estequiometriacutea de la reaccioacuten es de cuatro moleacuteculas de cetona
por una de BH4Na
La reaccioacuten transcurre siguiendo una transferencia secuencial de hidruros
desde la moleacutecula de BH4Na hasta cada una de las cuatro cetonas a traveacutes de
sendos ataques nucleofiacutelicos a los carbonos carboniacutelicos que tras estas
transferencias forman la sal soacutedica del tetraborato Este complejo sufre con
posterioridad una hidroacutelisis dando lugar finalmente a la formacioacuten del alcohol
(Figura 43)
Figura 43 Mecanismo de reaccioacuten propuesto para la siacutentesis de los alcoholes
Quiacutemica teoacuterica
77
El disolvente utilizado es el metanol que al ser un disolvente proacutetico cumple
la misioacuten de reducir la energiacutea de activacioacuten que es demasiado grande para que
la reaccioacuten se produzca de forma espontaacutenea a pesar de que el proceso neto es
exoteacutermico Esta cataacutelisis de la reaccioacuten se debe a la estabilizacioacuten que el
disolvente aporta al estado de transicioacuten ademaacutes de estabilizar el borano y el
anioacuten alcoacutexido cuando eacutestos no se hayan unido
Todos los derivados hidroxiacutelicos se han purificado por cromatografiacutea en capa
fina cromatografiacutea de columna cromatografiacutea preparativa o cromatografiacutea
flash Algunos se han precipitado en forma de hidrocloruro mediante la
adicioacuten de eacuteter saturado de aacutecido clorhiacutedrico
Estereoquiacutemica de la reaccioacuten
Las cetonas asimeacutetricas empleadas en estas reacciones son productos
proquirales por lo que dan lugar a las dos configuraciones posibles del
derivado hidroxiacutelico R y S La reaccioacuten rinde una mezcla raceacutemica ya que el
borohidruro soacutedico no es agente estereoselectivo y el grupo carbonilo es plano
con lo que el ion hidruro puede atacar por ambos lados del grupo con igual
probabilidad Ademaacutes estas moleacuteculas no poseen grupos voluminosos que
favorezcan la aparicioacuten de un mayor porcentaje de uno de los enantioacutemeros
Dado que es muy costoso el aislamiento de los isoacutemeros por separado se
replanteariacutea este trabajo en caso de encontrar una moleacutecula especialmente
activa
Reacciones secundarias
Una de las reacciones secundarias maacutes frecuentes es la rotura de la base de
Mannich formada a traveacutes de una desaminacioacuten o de una desaminometilacioacuten
que recibe el nombre de ldquoretro-Mannichrdquo (Tramontini y Angiolono 1990) La
reaccioacuten tiene como productos los reactivos de partida de la condensacioacuten
carboniacutelica
Todaviacutea no queda claro el porqueacute de estas reacciones pero podriacutea deberse a
un aumento de la temperatura del medio provocada por una adicioacuten
demasiado raacutepida de BH4Na o por una excesiva basificacioacuten del medio
ocasionada por un exceso del agente reductor
Quiacutemica Teoacuterica
78
VI5 Siacutentesis de oximas (Serie 8)
La siacutentesis de estos derivados se abordoacute a partir de los derivados carboniacutelicos
mediante una condensacioacuten de estos con hidroxilamina usando etanol (EtOH)
como disolvente (Figura 44)
Figura 44 Esquema general de reduccioacuten de carbonilo a oxima
El mecanismo de la reaccioacuten transcurre en dos etapas a traveacutes de un
intermedio cuya existencia ha sido verificada mediante el uso de teacutecnicas de
espectroscopia de IR (Martinez J 1999)
La primera etapa consiste en la formacioacuten del intermedio de reaccioacuten para lo
cual es necesaria la presencia de hidroxilamina en su forma libre (la forma
protonada no posee caraacutecter nucleofiacutelico) por lo que esta etapa de la reaccioacuten se
veraacute favorecida a pH baacutesico
Figura 45 Mecanismo de reaccioacuten propuesto para la formacioacuten del intermedio de reaccioacuten en la formacioacuten de oximas
La segunda etapa consiste en la deshidratacioacuten del intermedio que estaraacute
favorecida por un pH aacutecido La velocidad de la reaccioacuten dependeraacute del pH de la
misma y asiacute mientras que en un pH baacutesico la adicioacuten de hidroxilamina es un
proceso raacutepido y es la segunda etapa la que controla la velocidad de reaccioacuten lo
contrario ocurre a pH aacutecido siendo entonces la primera etapa la que controla la
velocidad de reaccioacuten
Figura 46 Mecanismo propuesto para la formacioacuten de la oxima por deshidratacioacuten del intermedio de reaccioacuten en media aacutecido
Quiacutemica teoacuterica
79
Estereoquiacutemica de la reaccioacuten
La formacioacuten de oximas puede producir dos isoacutemeros posibles el Z o cis y el
E o trans
Figura 47 Isomeriacutea cis-trans de los derivados oxima31
Se observoacute que seguacuten el derivado carboxiacutelico del que se partiacutea se obteniacutea
mayoritariamente un isoacutemero u otro pero aunque no se ha encontrado
explicacioacuten a esta selectividad
31 El estudio espectroscoacutepico de ambos isoacutemeros se encuentra desarrollado en la tesis del Dr J Martinez Esparza (1999)
VVIIII QQUUIacuteIacuteMMIICCAA EEXXPPEERRIIMMEENNTTAALL
Quiacutemica experimental
83
VII1 Instrumental y reactivos
Los reactivos quiacutemicos utilizados en siacutentesis fueron adquiridos en E Merck
(Darmstadt Alemania) Scharlau (FEROSA Barcelona Espantildea) Panreac
Quiacutemica SA (Montcada i Reixac Barcelona Espantildea) Sigma-Aldrich Quiacutemica
SA (Alcobendas Madrid) Acros Organics (Janssen Pharmaceuticalaan 3a
2440 Geel Beacutelgica) Maybridge (Cornwall Reino Unido) Lancaster (Bischheim-
Strasbourg Francia) y Prolabo (Leuven Belgica)
Las cromatografiacuteas de capa Fina se desarrollan sobre gel de siacutelice de 02 mm de
espesor (Alugram SIL GUV254 [ref 818133] Macherey-Nagel Alemania) Las
placas se desarrollan en diclorometanometanol en diferentes proporciones y
se revelan bajo una laacutempara ultravioleta a longitud de onda 254 y 365 nm
La cromatografiacutea en columna se desarrolla en columnas de vidrio
empaquetadas con siacutelica gel 60 (0040-0063 mm y 0063-0200 mm de tamantildeo
de partiacutecula Merck) con fases moacuteviles diclorometanometanol o
hexanoacetato en diferentes proporciones
La cromatografiacutea preparativa se desarrolla en placas de vidrio rectangulares
sobre las cuales se preparan laacuteminas de siacutelica gel (Siacutelica Gel 60 PF254
cromatografiacutea en capa fina (ref 1077472500) Merck KGaA Darmstadt
Alemania) de 1 mm de grosor La fase moacutevil utilizada en esta metodologiacutea es
diclorometanometanol 973
La cromatografiacutea flash se realiza en un equipo de cromatografiacutea Combiflashreg
Rf 200 (Teledyne Isco Lincoln USA) Se desarrolla en columnas flash de fase
normal de 12 gramos RediSepreg Rf Columns (Teledyne Isco USA) con un
gradiente binario hasta 991 diclorometanometanol (pureza de siacutentesis SDS-
Carlo Erba Reactifs Francia)
Formacioacuten de hidrocloruro algunos de los compuestos fueron purificados o
precipitados en forma de sales Para ellos se utilizoacute eacuteter saturado de HCl
preparado en el laboratorio
VII2 Meacutetodos de elucidacioacuten estructural
Todos los compuestos sintetizados han sido caracterizados quiacutemicamente por
cromatografiacutea en capa fina (CCF) punto de fusioacuten espectroscopia infrarroja
(IR) resonancia magneacutetica nuclear (RMN) anaacutelisis elemental de carbono
Ensayos Bioloacutegicos
84
hidroacutegeno y nitroacutegeno (CHN) y cromatografiacutea liacutequida de alta resolucioacuten
(HPLC)
Los puntos de fusioacuten han sido determinados en un equipo Mettler FP82 +
FP80 (Greifense Suiza) y no han sido corregidos La temperatura de fusioacuten se
muestra en grados centiacutegrados (0C)
Los espectros de IR han sido registrados en un equipo Thermo Nicolet FTIR
Nexus Euro (Madison USA) con el programa informaacutetico OMNIC 60
empleando pastillas de bromuro potaacutesico Las frecuencias se expresan en cm-1 y
las intensidades de sentildeal se representan como md (media deacutebil) d (deacutebil) m
(media) f (fuerte) y mf (muy fuerte)
Los espectros de RMN-1H han sido registrados en un equipo Brucker 400
UltrasieldTM (Brucker BioSpin GmbH Rheinstelten Alemania) utilizando como
referencia interna tetrametilsilano en una concentracioacuten aproximada de 01
gmL de TMS y dimetilsulfoacutexido-d6 (DMSO-d6) o cloroformo deuterado
(CDCl3) como disolventes La concentracioacuten de las muestras ha sido
aproximadamente 20 mgmL Para la deteccioacuten de los protones laacutebiles se
emplean unas gotas de agua deuterada Los desplazamientos quiacutemicos (δ) han
sido expresadas en ppm relativas a tetrametilsilano y las multiplicidades de
sentildeal se han representado como se indican en las siguientes abreviaturas sa
(sentildeal ancha) s (singlete) d (doblete) t (triplete) c (cuadruplete) m
(multiplete) dd (doble doblete) y ddd (doble doblete desdoblado) Las
constantes de acoplamiento J han sido expresadas en Hz Los experimentos
HMBC (espectros en 2D para determinar los acoplamientos de protones a larga
distancia) HMQC (espectros en 2D para observar los acoplamientos C-H en la
moleacutecula) DEPT-135 (espectros en 1D donde los CH y CH3 salen positivos y
los CH2 negativos) DEPT-90 (espectros en 1D donde solo aparecen los grupos
CH) RMN-13C y COSY (espectro 2D para determinar los acoplamientos de los
protones con los protones vecinos) se han registrado en el mismo equipo
empleado para la resonancia de protoacuten utilizando los mismos disolventes
deuterados
Los CHN han sido obtenidos en un microanalizador LECO CHN-900(Tres
cantos Espantildea) a partir de muestras previamente secadas con pentoacutexido de
foacutesforo durante 24-48 horas a vaciacuteo (3-4 mm Hg) y temperatura ambienteEl
intervalo de error admitido para cada producto es de plusmn04 para cada tipo de
aacutetomo determinado
Quiacutemica experimental
85
Los tiempos de retencioacuten y longitudes maacuteximas de absorcioacuten para la
determinacioacuten de pureza y caracterizacioacuten han sido obtenidos en un equipo de
HPLC Los experimentos fueron realizados en un cromatoacutegrafo Ultimate 3000
(DIONEX) controlado por el software Cromeleon versioacuten 68 Las medidas se
obtuvieron con una columna RP18 (LICHROSPHER 100 RP18 EC 5 microm
10x046 TEKNOKROMA) como fase estacionaria y un flujo de 1 mL minuto
con metanolagua (8020) como fase moacutevil Los tiempos de retencioacuten (tR) se
expresan en minutos y las longitudes de onda maacuteximas en nm
VII3 Denominaciones de compuestos
El criterio elegido para la asignacioacuten de las referencias ha sido el siguiente En
primer lugar se dividen los compuestos obtenidos en carbonilos hidroxilos y
oximas Los derivados carboniacutelicos son considerados como intermedios en la
reaccioacuten global asiacute que se les asigna el nombre de Serie 0 Los compuestos
hidroxiacutelicos son los que corresponden estructuralmente con los
arilaminoalcoholes antimalaacutericos objeto central de este trabajo que se divide en
subgrupos En el caso de las oximas se ha denominado al grupo de compuestos
como Serie 8
La primera divisioacuten se realiza seguacuten la naturaleza del Ar1 y de la longitud de la
cadena alifaacutetica
Figura 48 Estructura general de los derivados hidroxiacutelicos sintetizados
Serie 1 2 3 4 5 6 7
Ar1
n 2 2 2 1 2 2 2
Tabla 1 Distribucioacuten de compuestos en series por Ar1
Ademaacutes de la serie numeacuterica una letra diferenciaraacute cada compuesto seguacuten la
amina y los sustituyentes Ra y Rb del benceno de Ar2 que conforman cada
derivado De esta forma
Ensayos Bioloacutegicos
86
a b c d e f g
Amina
RaRb CF3N
O2 NO2CF3 HCF3 CF3NO2 CF3NO2 CF3NO2 HF
Tabla 2 Denominacioacuten de compuestos
Siguiendo este orden alfabeacutetico los derivados que forman la Serie 0 son
numerados seguacuten el mismo criterio
Ejemplo un compuesto hidroxiacutelico que presenta un aacutetomo de fluacuteor en Ar1
unido a un grupo naftaleno con una piperidina central y grupo fenil con Ra
trifluorometil y Rb nitro se denomina como compuesto 5f
Referencia Serie 5f
Ar1= FNFT
(CH2) n n=2
Amina= PIPR
Ar2 Ra=CF3 ndash Rb= NO2
VII4 Descripcioacuten general de meacutetodos de siacutentesis
VII41 Meacutetodo A procedimiento general para la obtencioacuten de las
arilaminas protegidas
En 30 mL de acetonitrilo (CH3CN) se disuelven 1 equivalente de la amina
comercial protegida y 12 equivalentes del halogenuro de arilo correspondiente
seguacuten la arilamina que se desee sintetizar en cada caso Se antildeaden tambieacuten 15
equivalentes de carbonato potaacutesico (K2CO3) para neutralizar el medio de
reaccioacuten Se hace reaccionar a reflujo un maacuteximo de 24 horas tras lo cual se
elimina el CH3CN en el rotavapor El residuo obtenido se disuelve en
diclorometano y se extrae tres veces con agua La fase orgaacutenica obtenida se seca
con sulfato soacutedico anhidro se filtra y se elimina el disolvente a sequedad en el
rotavapor obtenieacutendose la correspondiente BOC-arilamina
Quiacutemica experimental
87
VII42 Meacutetodo B procedimiento general para la desproteccioacuten de
aminas
Se disuelve la amina protegida en 40 mL de disolucioacuten HClAcH (11)
observaacutendose ligera efervescencia por el desprendimiento de H2 Se deja
agitando 2 horas a temperatura ambiente Transcurrido el tiempo se elimina el
disolvente en el rotavapor El clorhidrato obtenido se disuelve en agua y se
antildeade NaOH 2M hasta conseguir pH baacutesico Se agita 2 horas y la mezcla de
reaccioacuten se extrae con DCM La fase orgaacutenica se seca con sulfato soacutedico anhidro
se filtra y se elimina el disolvente a sequedad en el rotavapor obtenieacutendose la
correspondiente arilamina desprotegida
VII43 Meacutetodo C procedimiento general para condensacioacuten de aminas
(Viacutea 1)
Se disuelven en 40 mL de tetrahidrofurano (THF) las cantidades indicadas en
cada caso de 1-(benzo[b]tiofen-3-il)-3-cloropropan-1-ona o 2-bromo-2acute-
acetonaftona y la amina deseada en proporciones 11 Se antildeade la cantidad
equimolecular de carbonato potaacutesico Se deja agitando un maacuteximo de 24 horas a
temperatura ambiente y en el transcurso de ese tiempo se sigue el desarrollo de
la reaccioacuten por CCF Se elimina el THF en el rotavapor a presioacuten reducida y el
residuo obtenido se disuelve en diclorometano para lavarlo tres veces con agua
La fase orgaacutenica se seca con sulfato soacutedico se filtra y se elimina el disolvente en
el rotavapor El residuo obtenido se purifica por el meacutetodo descrito en cada
caso
Esta viacutea se siacutentesis se aplica a la obtencioacuten de los derivados de la Serie 0 1 2
3 14 y 15 que son los intermedios para la obtencioacuten las Series 1 y 4
VII44 Meacutetodo D procedimiento de condensacioacuten de aminas (Viacutea 2)
En un matraz se ponen las cantidades indicadas de 1-(5-fluorobenzo[b]tiofen-
3-il)etanona 2-acetonaftona 4-fluoro-1acute-acetonaftona 4-fluoroacetofenona o 4-
(trifluorometil)acetofenona y la amina deseada en proporciones
equimoleculares Se antildeade 13 dioxolano en una proporcioacuten 14 molar y se
antildeaden varias gotas HCl concentrado Se lleva a reflujo a una temperatura de
bantildeo de 130-140 ordmC siguiendo la reaccioacuten por CCF Finalizada la reaccioacuten se
enfriacutea a temperatura ambiente y se antildeade agua y NaOH 2M hasta pH baacutesico en
agitacioacuten El compuesto se extrae con diclorometano y se seca la fase orgaacutenica
con sulfato soacutedico anhidro Se filtra y elimina el disolvente en el rotavapor a
Ensayos Bioloacutegicos
88
sequedad El residuo obtenido puede precipitar puro o necesitar posterior
purificacioacuten por los meacutetodos descritos en cada caso
Esta viacutea de siacutentesis se aplica para la obtencioacuten de la mayor parte de los
compuestos de la Serie 0 intermedios para la obtencioacuten de las Series 2 35 6 7
y 8
VII45 Meacutetodo E procedimiento general para la reduccioacuten de cetonas
En un bantildeo de hielo a 0 ordmC se pone un matraz con 10 mL de metanol a
enfriar Una vez friacuteo se antildeade el compuesto carboniacutelico al matraz y se deja en
agitacioacuten Se le antildeade a la disolucioacuten enfriada aproximadamente 200 mg de
BH4Na observaacutendose efervescencia Se deja en agitacioacuten un maacuteximo de una
hora manteniendo la temperatura del bantildeo siguiendo la evolucioacuten por CCF
Transcurrido el tiempo se antildeaden 5 mL de agua que inactivan el BH4Na y se
elimina a vaciacuteo el disolvente Se extrae con DCM y la fase orgaacutenica se seca con
sulfato soacutedico anhidro Se filtra y se elimina el disolvente a vaciacuteo El residuo
puede precipitar puro o necesitar purificacioacuten por cromatografiacutea en columna
flash o mediante formacioacuten del correspondiente hidrocloruro
Se obtienen por este meacutetodo los compuestos de las Series 1 a 7
VII46 Meacutetodo F procedimiento general para siacutentesis de oximas desde
carbonilos
En un matraz se pone la cantidad de carbonilo obtenido deseada y se antildeade
el clorhidrato de hidroxilamina en proporcioacuten 1 55 molar respectivamente Por
uacuteltimo se antildeaden 15 mL de EtOH y se lleva a reflujo durante 90 minutos
Pasado el tiempo se retira el reflujo y se deja enfriar unos minutos A
continuacioacuten se antildeaden 30 mL de una disolucioacuten previamente preparada de
NaOH 2M en EtOH hasta que el pH es baacutesico y se lleva media hora maacutes a
reflujo Se deja enfriar la reaccioacuten se antildeade un poco de agua al matraz y se hace
una extraccioacuten acetato de etiloagua Se seca y se elimina el disolvente en el
rotavapor obteniendo un soacutelido impuro que se purifica solubilizando las
impurezas en diclorometano puesto que la oxima no es soluble en ese
disolvente El soacutelido que se obtiene se lava con eacuteter etiacutelico para su purificacioacuten
Se obtienen por este meacutetodo los compuestos de la Serie 8
Quiacutemica experimental
89
VII5 Purificacioacuten por cromatografiacutea flash
La cromatografiacutea manual en columna de vidrio tradicional ha sido uno de los
meacutetodos de purificacioacuten maacutes usados en quiacutemica orgaacutenica por ser un meacutetodo
praacutectico de bajo coste y controlado por el operario Por otro lado lleva asociado
algunos inconvenientes como la baja resolucioacuten y reproducibilidad teacutecnica
costosa en tiempo opciones de tipo de elucioacuten limitadas baja utilidad en
separacioacuten de muestras complejas y baja estandarizacioacuten del sistema por la falta
de automatizacioacuten La evolucioacuten para mejorar todos estos puntos deacutebiles pasa
por la automatizacioacuten del sistema que va desde la inyeccioacuten de la muestra hasta
la coleccioacuten automaacutetica que permite la realizacioacuten de otros trabajos durante la
separacioacuten de los compuestos Ademaacutes aumenta la reproducibilidad y la
productividad Seguacuten la muestra que purificar y sus caracteriacutesticas
fisicoquiacutemicas se ha de seleccionar las condiciones de trabajo del equipo de
cromatografiacutea flash
Fase estacionaria Existen disponibles comercialmente una gran variabilidad
de columnas con distintas fases estacionarias La maacutes usual que es tambieacuten la
empleada en este trabajo es la columna de siacutelica de fase normal Pero tambieacuten
se dispone de columnas C18 fase reversa columnas de aminas aluacutemina baacutesica
aluacutemina neutra ciano diol de intercambio anioacutenico y de intercambio catioacutenico
Las columnas de siacutelica de fase normal estaacuten formadas por un poliacutemero de oacutexido
de silicio entrecruzado tetraeacutedricamente En medio acuoso las valencias libres
de los aacutetomos de silicio adsorben grupos hidroxilos formando grupos silanol
polares en la superficie
Claacutesicamente para cada gramo de compuesto que va a ser purificado se pone
100 g de siacutelica gel (1 de carga) pero en el nuevo sistema las columnas estaacuten
preparadas para el 10 de carga En este trabajo se ha usado columnas de siacutelica
de 12 g de tamantildeo (tamantildeo de partiacutecula 35-70 microm y tamantildeo de poro 60 Aring con
una capacidad de muestra de 12 a 1200 mg con flujo oacuteptimo 25-40 mLmin y
volumen 168 mL
Fase moacutevil Al igual que la fase estacionaria la eleccioacuten de la fase moacutevil
depende de la muestra a purificar Existen diferentes gradientes de elucioacuten
siendo el gradiente binario el maacutes utilizado en la separacioacuten de compuestos
Controlando el gradiente se pueden obtener tiempos de elucioacuten menores
menor dependencia de los factores oacuteptimos de separacioacuten y mayor eficacia
repetitividad y pureza El gradiente elegido en este caso para la purificacioacuten de
compuestos es el isocraacutetico lineal donde se alternan periodos donde las
Ensayos Bioloacutegicos
90
proporciones de mezcla de solventes permanecen constantes en el tiempo con
otros periodos donde aumenta la proporcioacuten del solvente maacutes polar
Para la eleccioacuten del solvente adecuado se realiza un estudio previo del
desarrollo de los componentes en CCF ya que esto da una aproximacioacuten del
comportamiento de los componentes de la muestra en la columna durante la
purificacioacuten Se ha seleccionado la mezcla DCMmetanol en todos los casos de
purificacioacuten de compuestos por la buena separacioacuten de componentes que ha
mostrado No es posible la utilizacioacuten de metanol al 100 ya que se podriacutean
producir dantildeos en las columnas de fases estacionarias Ademaacutes la estabilidad
de las bombas tambieacuten podriacutea verse afectada por tanto ha de utilizarse como
fase moacutevil polar una mezcla DCMmetanol 8020
Longitud de onda de deteccioacuten La longitud de onda de deteccioacuten oacuteptima ha
de ser elegida seguacuten la estructura quiacutemica de la muestra En el caso de
arilaminoalcoholes se ha seleccionado como longitud de onda de deteccioacuten 254
nm que es la oacuteptima para aromaacuteticos En el caso de los derivados de las Series
3 4 y 5 (naftalenos) como el equipo ofrece la posibilidad de detectar dos
longitudes de onda se seleccionoacute la deteccioacuten a 365 nm como complementaria
Teacutecnicas de carga de muestra Las muestras son cargadas en el sistema en
estado soacutelido o en disolucioacuten dependiendo de la solubilidad que presenten a la
fase menos polar con la que se inicia la purificacioacuten En el caso de muestras
solubles al diclorometano se realiza una disolucioacuten con la miacutenima cantidad de
solvente posible y se inyectan en el equipo Si la muestra no es soluble al
diclorometano se realiza una disolucioacuten soacutelida en siacutelica gel 60 (0040-0063 nm
de tamantildeo de poro) Para ello se disuelve la muestra en un solvente adecuado y
se antildeade siacutelica Se elimina el disolvente a sequedad a vaciacuteo y se pone la muestra
en un cartucho vaciacuteo especial para este tipo de muestras desde donde el equipo
inyectaraacute automaacuteticamente la muestra
VVIIIIII EENNSSAAYYOOSS BBIIOOLLOacuteOacuteGGIICCOOSS
Ensayos bioloacutegicos
93
VIII1 Ensayos in vitro
Los compuestos descritos han sido ensayados por el Grupo Malaria de la
Universidad de Antioquiacutea en Medelliacuten (Colombia)
Los ensayos in vitro han sido realizaron en cepas sensibles a la CQ NF-54 y
Colombian FCR-3 de Plasmodium falciparum resistentes a la CQ Los cultivos se
desarrollaron a 37ordmC en una atmoacutesfera de CO2 al 5 y en un medio de glucosa
enriquecida RPMI 1640 con gentamicina a una concentracioacuten de 01 mgmL y
suero humano al 10 inactivado por calor como se describe en la bibliografiacutea
(Trager y Jensen 1976) Los compuestos se disuelven en dimetilsulfoacutexido
(DMSO) hasta completar un rango de concentraciones entre 200 y 01 microM La
concentracioacuten final de DMSO nunca es superior al 01
La actividad antimalaacuterica in vitro se mide utilizando el ensayo de
incorporacioacuten de hipoxantina tritiada (MP Biomedicals USA) seguacuten el meacutetodo
de Desjardins (Desjardins et alts 1979) El meacutetodo consiste en una medicioacuten
indirecta de la actividad metaboacutelica del paraacutesito por medio de la incorporacioacuten
de un precursor de aacutecidos nucleicos marcado radiactivamente El Plasmodium es
incapaz de sintetizar las purinas que necesita para su replicacioacuten obtenieacutendolas
de una fuente externa La utilizacioacuten del precursor de purinas marcadas
permitiraacute determinar la incorporacioacuten del material geneacutetico del paraacutesito y por
tanto se comportaraacute como marcador de la regeneracioacuten del mismo
Los ensayos se realizan por triplicado y los resultados se obtienen por
interpolacioacuten lineal (Huber y Koella 1993) Finalmente se expresan como CI50
(concentracioacuten que produce una inhibicioacuten del 50 del crecimiento plusmn la
desviacioacuten estaacutendar) siendo
Log (IC50) = log (X1) + (50-Y1)(Y2-Y1) [log (X2) ndash log (X1)]
Siendo X1 Concentracioacuten del compuesto que da un de inhibicioacuten de la
parasitemia Y1gt50 X2 Concentracioacuten de compuesto que da un de
inhibicioacuten de la parasitemia Y2lt50
El porcentaje de incorporacioacuten de hipoxantina unida al paraacutesito se calcula con la siguiente ecuacioacuten
hipoxantina incorporada = 100 ndash (PTx100)
Siendo P cuentas por minuto (cpm) para cada concentracioacuten T control
negativo (eritrocitos sin tratar)
Ensayos bioloacutegicos
94
VIII2 Ensayos toxicoloacutegicos
Los ensayos de citotoxicidad de los compuestos se realizaron en dos etapas
Inicialmente se llevaron a cabo en la Universidad Cayetano Heredia (UPCH) en
Lima Peruacute y posteriormente en la Universidad Paul Sabatier (Toulouse III) en
Toulouse Francia
La toxicidad de todos los compuestos se evaluaron en ceacutelulas epiteliales de
rintildeoacuten de mono African (Vero) Estas ceacutelulas fueron cultivadas con medio
DMEN F-12 (Cat Nordm BE12-719F) suplementado con 10 de suero fetal bovino
inactivado por calor NEAA piruvato de Na y mantenidas en una incubadora a
37 ordmC con una atmoacutesfera de 5 de CO2 La evaluacioacuten toxicoloacutegica se realiza en
placas de 96 pocillos de fondo plano adicionando 100 microL de cultivo de ceacutelulas
Vero a cada pocillo a una concentracioacuten de 10x105 ceacutelulaspocillo Los
compuestos se antildeadieron a diferentes concentraciones 100 microgmL 10 microgmL 1
microgmL y 01 microgmL y el efecto se evaluacutea 48 horas despueacutes de haber adicionado
el compuesto
El efecto se determinoacute usando el ensayo de viabilidad celular del MTT que
consiste en adicionar 10 microL de MTT a una concentracioacuten de 10 microgmL en las
placas que son colocadas nuevamente en la incubadora cubiertas con papel
aluminio durante el periodo de incubacioacuten Cuatro horas despueacutes de finalizado
el periodo de incubacioacuten se antildeade 100 microL de una solucioacuten de lisis que contiene
50 de isopropanol 10 de SDS y se deja reposar las placas a temperatura
ambiente en un orbital a 150 rpm durante 30 minutos
Finalmente se lee la densidad oacuteptica con un escaacutener de 96 pocillos a 590 nm
en un equipo Bio-Rad Todos los experimentos se realizan por triplicado
El dato de inhibicioacuten de crecimiento GI50 se determina por anaacutelisis de
regresioacuten linear definido como la concentracioacuten de compuesto que produce el
50 de reduccioacuten de absorbancia comparaacutendola con los controles
VIII3 Ensayos in vivo
Los procedimientos se desarrollaron siguiendo el manual de Teacutecnicas de
laboratorio para la seleccioacuten de sustancias antimalaacutericas (Deharo et alts 2000)
en el Laboratorio de Farmacologiacutea para el Desarrollo perteneciente al Instituto
para el Desarrollo (IRD) de la Universidad Paul Sabatier (Toulouse III) de
Toulouse (Francia)
Ensayos bioloacutegicos
95
VIII31 Instrumental y reactivos
Los estudios in vivo se llevaron a cabo seguacuten la legislacioacuten francesa sobre
cuidado y uso de animales de laboratorio vigente (Ndeg 008430) Se utilizaron
ratones macho IOPF Swiss de 4-6 semanas de vida con un peso de 20 2 g con
certificado negativo para Encephalitozoom cuniculi (Janvier Saint Berthevin
Francia) El animalario-bioterio de la Facultad de Farmacia de la Universidad
Paul Sabatier se encargoacute del cuidado de animales mantenimiento condiciones
ambientales de las instalaciones y eliminacioacuten del material bioloacutegico
Las cepas usadas tanto para los ensayos de virulencia como para los estudios
provienen de la reserva de material bioloacutegico del IRD De ahiacute se descongelaron
una cepa Plasmodium berghei NK65 y otra Plasmodium petteri que se encontraban
bien identificadas dentro de tanques de nitroacutegeno liacutequido en caacutemaras
refrigeradas del IRD
Los materiales empleados en el manejo animal fueron agujas Neolus de 05
mm y jeringas de 1 mL U100 Insulin de Tarumo Europe NV (Beacutelgica) Ademaacutes
se usoacute heparina Sigma H6263 (Alemania) suero fisioloacutegico esteacuteril Baxter
(Francia) y viales de plaacutestico con tapoacuten no esteacuteriles Para los frotis se usaron
laacuteminas portaobjetos de vidrio (Tarumo Europe NV Belgica) y metanol de
calidad HPLC Fisher Chemicals (Leicestershine Reino Unido) Para la
coloracioacuten se usoacute el reactivo Giemsa en polvo con glicerol de Sigma Ultra
(Steinheim Alemania) disolucioacuten tampoacuten de fosfato soacutedico dibaacutesico
heptahidratado y fosfato potaacutesico monobaacutesico anhidro de Sigma Aldrich
(Steinheim Alemania) en agua miliQ
Para la lectura de los frotis y conteo de hematiacutees se ha usado un microscopio
Leica DME (USA)
VIII32 Metodologiacutea
VIII321 Preparacioacuten de disolucioacuten Giemsa
La Giemsa es un colorante neutro compuesto de un colorante aacutecido (azul de
eosinato) y otro baacutesico (azul de metileno) que precipita con agua Lo que se
obtiene es un colorante neutro que no es soluble al agua pero si al alcohol
metiacutelico De forma inversa no es activo en solucioacuten metiacutelica pero siacute en
disolucioacuten acuosa Las ceacutelulas protozoarias disocian el colorante neutro el ADN
se tintildee de rojo y el citoplasma de azul Por las caracteriacutesticas comentadas ha de
Ensayos bioloacutegicos
96
ser utilizado con un tampoacuten para evitar que el pH de los medios de trabajo lo
precipite o inactive y con agua destilada calidad miliQ
Se pesan 076 g de polvo de Giemsa en un erlenmeyer y se pone suavemente
en agitacioacuten con 50 mL de glicerina y se deja hasta completa disolucioacuten a 60 ordmC
Una vez disuelto se deja enfriar y se le antildeaden 50 mL de metanol dejando la
disolucioacuten en agitacioacuten 12 horas Transcurrido el tiempo se deja reposar
protegido de la luz 7 diacuteas para finalizar con una filtracioacuten eliminando asiacute los
restos no disueltos Mientras se prepara una disolucioacuten tampoacuten fosfato con 02 g
de fosfato potaacutesico monobaacutesico anhidro y 05 g de fosfato soacutedico dibaacutesico
heptahidratado en un litro de agua MiliQ ajustaacutendose el pH a 74
Estas dos disoluciones no se mezclaraacuten hasta el momento de ser utilizadas
manteniendo la de Giemsa protegida de la luz Para su utilizacioacuten en un tubo
coacutenico de 50 mL se colocan 45 mL de la disolucioacuten tampoacuten de tampoacuten fosfato
y 5 mL de Giemsa y se homogenizan cuidadosamente dos veces por inversioacuten
Se cubre la muestra con el preparado y lo sobrante se desecha
Las disoluciones preparadas de Giemsa tienen un tiempo de vida corto ya
que con el paso del tiempo van precipitando y formaacutendose cristales que dantildean
la tincioacuten Debido a esto se recomienda preparar perioacutedicamente un nuevo
stock de colorante y nunca mezclar dos tipos diferentes puesto que cada
preparado tiene caracteriacutesticas propias que afectan el resultado en la coloracioacuten
VIII322 Tincioacuten con Panoacuteptico Raacutepido
Esta es una teacutecnica de tincioacuten por inmersioacuten a diferencia de la tincioacuten por
Giemsa que es por cobertura La ventaja es que es maacutes raacutepida y faacutecil de trabajar
cuando no se cuenta con un gran nuacutemero de laacuteminas para colorear El meacutetodo
consiste en la inmersioacuten sucesiva de la laacutemina que tentildeir en tres colorantes
consecutivamente En una primera cubeta Wertheim se pone una solucioacuten
alcohoacutelica de triarilmetano en la segunda cubeta se pone una solucioacuten
tamponada de xanteno y en la tercera una tamponada de tiazina
Las laacuteminas con las muestras fijadas se sumergen verticalmente y en el mismo
sentido que se ha extendido la muestra en la primera cubeta realizando
movimientos regulares verticales durante unos segundos Se sacan de la cubeta
y se espera que escurran el colorante sobrante Este procedimiento se repite en
las tres cubetas teniendo especial cuidado en la uacuteltima donde se debe asegurar
la homogeneidad de la tincioacuten sin exceso de coloracioacuten Finalmente se lava con
agua se dejan secar al aire para ser analizadas al microscopio
Ensayos bioloacutegicos
97
VIII323 Realizacioacuten de un frotis
Se denomina frotis a la extensioacuten de una muestra o cultivo que se realiza
sobre un portaobjetos con objeto de separar lo maacutes posible los microorganismos
o componentes sanguiacuteneos y para obtener de ellos una imagen clara y niacutetida al
microscopio
La muestra ha de ser fijada al vidrio del portaobjetos sin que la muestra sea
arrastrada en los lavados para poder aplicar despueacutes sobre eacutel meacutetodos de
tincioacuten que permiten la observacioacuten al microscopio de las ceacutelulas En la
actualidad los portaobjetos utilizados se comercializan limpios y esterilizados
para su uso inmediato
En primer lugar se toma un portaobjetos nuevo y se rotula adecuadamente
Con unas tijeras esterilizadas se hace un pequentildeo corte en la punta de la cola
del ratoacuten y se presiona para conseguir una gota de sangre que es recogida en el
centro de un extremo del portaobjetos Raacutepidamente con el filo de otro
portaobjetos se extiende la gota arrastraacutendola suavemente por la superficie del
primer portaobjetos para conseguir una peliacutecula lo maacutes homogeacutenea posible
tratando de cubrir toda la superficie de la laacutemina Posteriormente se pone el
portaobjetos horizontal y se cubre con metanol se deja secar con cuidado al aire
y se guarda la muestra hasta la tincioacuten el tiempo que sea necesario
Asiacute tentildeida la muestra se puede proceder a su lectura para calcular el
porcentaje de parasitemia ( parasitemia paraacutemetro que indica el nivel de
infeccioacuten de la sangre de un ratoacuten) mediante el conteo manual de los hematiacutees
sanos y los parasitados Se hace un conteo de veinte campos elegidos de forma
que los hematiacutees no se solapen y aproximadamente contengan la misma
cantidad de unidades El tanto por ciento de parasitemia se calcula aplicando la
siguiente foacutermula
Siendo H infectados hematiacutees infectados H sanos hematiacutees sanos
Ensayos bioloacutegicos
98
iquestQueacute se puede ver en un frotis al microscopio
En un frotis de ratoacuten sano se pueden ver
Trozos de cristales de colorante si el vidrio no ha sido lavado lo
suficiente
Hematiacutees o gloacutebulos rojos o eritrocitos
Leucocitos o gloacutebulos blancos Estos se colorean con la tincioacuten
porque tiene carga geneacutetica y los hematiacutees no En ocasiones puede
confundirse un hematiacutee joven y un leucocito porque los hematiacutees
joacutevenes conservan restos de nuacutecleo pero se diferencian en nuacutemero
y tamantildeo Los leucocitos son menos numerosos y de mayor
tamantildeo ademaacutes en la tincioacuten quedan anteriormente tentildeidos de
morado con una aureola azul
En un ratoacuten infectado se puede observar
Hematiacutees sanos
Hematiacutee joven
Esquizonte joven que puede confundirse con un hematiacutee joven
Esquizonte desarrollado
Esquizonte agotado Es el momento previo a la ruptura del
espacio y la liberacioacuten de trofozoiacutetos libres que continuaran con la
infeccioacuten
Trofozoiacutetos libres que pueden confundirse con plaquetas
Hematiacutees en invasioacuten
Figura 49 Vista al microscopio de un frotis de sangre infectada por Plasmodium32
32 Disponible en httpwwwelrincondelamedicinainternacom2011_05_16_archivehtml
Ensayos bioloacutegicos
99
VIII324 Preparacioacuten y lectura en la caacutemara Malassez
La caacutemara se usa para hacer el conteo de hematiacutees totales Se cubre la
cuadriacutecula de la caacutemara con la muestra de sangre heparinizada con la ayuda de
una micropipeta y por capilaridad se llena la cuadriacutecula de conteo Como la
disolucioacuten tiene caraacutecter tridimensional y en el microscopio las lecturas son
bidimensionales se pone la ceacutelula en una caacutemara huacutemeda durante diez minutos
para que la muestra sedimente y no se deshidrate durante el proceso Pasado el
tiempo se pone la caacutemara de Malassez al microscopio y con cuarenta aumentos
y se hace el recuento manual de hematiacutees por mm3 de sangre Con el valor
promedio y teniendo en cuenta la dilucioacuten y el volumen de la caacutemara es posible
calcular la densidad de gloacutebulos rojos (GR) en la sangre de un ratoacuten sano
mediante la siguiente ecuacioacuten
GRmm3= GR promedio x dilucioacuten muestra x volumen celda
Siendo GR promedio promedio de hematiacutees dilucioacuten muestra valor fijo de
200 (10 microL en 2 mL) volumen volumen de la celda valor fijo 100 mm3
EL valor medio de hematiacutees de un ratoacuten sano es 5 millones de hematiacutees por
mm3
Una caracteriacutestica de la enfermedad es la anemia asiacute un ratoacuten infectado que
ha desarrollado la enfermedad presenta una disminucioacuten aproximada de un 75
en el nuacutemero de hematiacutees con respecto al ratoacuten sano por conteo en caacutemara
Malassez
VIII325 Ensayos de virulencia
Para este estudio es necesario tener al paraacutesito y al hueacutesped En este caso se
utilizaraacuten dos especies diferentes de paraacutesito que producen la enfermedad de la
malaria como son Plasmodium berghei NK65 y Plasmodium vinckei petteri
provenientes de la reserva del IRD Estas dos especies son capaces de infectar
roedores por lo que el hueacutesped seraacute un grupo de veinte ratones machos IOPF
Swiss
Descongelacioacuten de cepas y activacioacuten de paraacutesitos
Cuando se descongela una cepa no tiene mucha capacidad de infeccioacuten
(virulencia) sino que esta va en aumento con el paso de los diacuteas Por otro lado
es probable que los ratones inoculados no lleguen a desarrollar la enfermedad
porque la muestra haya sido mal conservada o se haya degradado demasiado
Ensayos bioloacutegicos
100
en el friacuteo que es lo que ocurrioacute experimentalmente con la cepa de P vinckei
petteri En este caso se esperan 10 diacuteas despueacutes de la inoculacioacuten y se
monitoriza al ratoacuten para observar si hay progresioacuten de la infeccioacuten de no ser
asiacute debe realizarse una revisioacuten de los tanques de almacenamiento para
descartar las muestras anteriores a la fecha de congelacioacuten de la muestras que
presentaron problemas ya que pueden estar en igual o en peores condiciones
El estudio comienza con la descongelacioacuten de una cepa de Plasmodium berghei
NK65 a temperatura ambiente mientras se extraen 10-20 microL (45 gotas) de sangre
de cola de ratoacuten sano Este volumen se mezcla inmediatamente con una gota de
heparina con el fin de evitar la coagulacioacuten de la sangre extraiacuteda La sangre
heparinizada se diluye 1200 en un vial esteacuteril con tapoacuten con 4 mL de suero
fisioloacutegico para devolver las ceacutelulas sanguiacuteneas a un medio parecido al normal
y que no se produzcan procesos de oacutesmosis que destruyan la muestra Cerrar el
vial y guardar la muestra
Cuando este descongelado el vial con la cepa se toma con una jeringa el
volumen contenido en el vial y se divide en dos para ser inyectado viacutea
intraperitoneal en dos ratones separados previamente del grupo Estos ratones
se separan del grupo en una celda identificada con la fecha de infeccioacuten la cepa
y la especie que contiene para observar la progresioacuten de la infeccioacuten La sangre
heparinizada se usa para un primer conteo del nuacutemero de hematiacutees en
ejemplares sanos cuyo recuento se realiza con cuadriacutecula doble en la ceacutelula o
caacutemara de Malassez A los tres diacuteas de la inoculacioacuten se hace un control del
estado de los dos ratones infectados tanto visual como sanguiacuteneo Los siacutentomas
externos de la enfermedad son peacuterdida de coloracioacuten en los ojos y orejas pelo
erizado ademaacutes de peacuterdida de peso y aglomeracioacuten entre ellos por causa de la
fiebre Tambieacuten se realiza un frotis para calcular la parasitemia
Cuando los ratones infectados desarrollen la enfermedad se infecta con su
sangre a otros dos ratones sanos de forma que ademaacutes de conocer coacutemo se
desarrolla el paraacutesito se garantice que tendraacuten la fuerza suficiente para
comenzar los ensayos de actividad De esta forma no es necesario conocer la
parasitemia basta con saber que la cepa estaacute viva Asiacute se realiza un frotis
control positivo con sangre de la cola del ratoacuten y del mismo sitio se obtendraacuten
20 microL de sangre que se hepariniza y disuelve en 1 mL de suero Se puede
conocer el buen estado de esta disolucioacuten visualmente si se observa un color
rojo muy claro ya que indica que no se ha producido hemoacutelisis Este nuevo
grupo de ratones infectados son los ratones fuente
Ensayos bioloacutegicos
101
El volumen de la disolucioacuten anterior se pone en una jeringa para ser
inyectado en dos ratones sanos que tambieacuten se aiacuteslan para controlar coacutemo
evoluciona la infeccioacuten
Diariamente se realiza un frotis control a los diferentes grupos de ratones
infectados para registrar la evolucioacuten de la parasitemia ya que algunos
evolucionaraacuten muy raacutepido y moriraacuten mientras que otros no mostraraacuten la
enfermedad
Ensayos de virulencia
El quinto diacutea desde la inoculacioacuten del paraacutesito vivo en los ratones fuente se
procede a calcular la parasitemia En este momento se infecta a un nuevo grupo
de 5 ratones En esta ocasioacuten la infeccioacuten seraacute controlada y se procederaacute a una
infeccioacuten con un nuacutemero de paraacutesitos determinado Para estos ensayos
normalmente se inoculan 107 paraacutesitos por ratoacuten por tal motivo es necesario
conocer previamente el nuacutemero de paraacutesitos en la sangre del ratoacuten fuente
sabiendo esto se puede calcular la cantidad de paraacutesitos necesarios para
inocular a todos los grupos de ratones experimentales seguacuten la siguiente
ecuacioacuten
Para preparar las cantidades necesarias de sangre infectada heparina y suero
fisioloacutegico necesarias para desarrollar el ensayo de virulencia se deben tener en
cuenta los cinco ratones disponibles a los que se antildeade un sexto ratoacuten hipoteacutetico
con el que se tienen en cuenta las peacuterdidas de disoluciones durante los
procedimientos experimentales Seraacuten necesarios 10 microL de sangre del ratoacuten
fuente para inyectar a cada ratoacuten del ensayo El procedimiento de extraccioacuten de
sangre e infeccioacuten del grupo es el mismo
Durante todo este proceso es preciso llevar un seguimiento diario de la
parasitemia para observar el grado de virulencia del paraacutesito Los resultados
del comportamiento del paraacutesito son aproximados debido al aumento de la
parasitemia en los sucesivos ensayos
Por queacute un seguimiento previo del desarrollo de la infeccioacuten
El desarrollo de los paraacutesitos en individuos infectados no se produce siempre
de igual forma por lo que si se parte de cepas congeladas es necesaria una
primera activacioacuten del paraacutesito (primera infeccioacuten) y una posterior reactivacioacuten
del paraacutesito (infecciones sucesivas) a partir de la primera infeccioacuten
Ensayos bioloacutegicos
102
Las diferencias de desarrollo se deben a tres factores principalmente
1- Viacutea intraperitoneal Es una viacutea menos precisa que la viacutea intravenosa
porque no hay una localizacioacuten exacta de la inyeccioacuten de la sangre
infectada Todos los ratones tienen la misma capacidad de respuesta pero
no se puede controlar la respuesta del ratoacuten por esta viacutea de inoculacioacuten
Por viacutea intravenosa se asegurariacutea su introduccioacuten en el hiacutegado pero por
las por las caracteriacutesticas aproximativas de los ensayos y queda
descartada
2- Raza Swiss Este tipo de ratoacuten no es monoclonal por tanto todos los
individuos son diferentes entre siacute De ahiacute se deduce que la respuesta seraacute
distinta en cada uno de ellos El objetivo de los ensayos realizados es
encontrar un nuevo compuesto que revierta cualquier tipo de
parasitemia como hace la CQ de manera que la variabilidad del sistema
no sea influyente
3- Enzephalitozoom Cuniculli Es un paraacutesito de roedor que puede interferir
cruzadamente con el Plasmodium lo que hace que los ensayos no sean
fiables En la actualidad este factor no se tiene en cuenta ya que todos los
lotes de ratones adquiridos traen consigo el certificado de anaacutelisis de la
empresa que los suministra
Una vez conocido coacutemo se desarrolla el paraacutesito de la cepa elegida se
comienza con la infeccioacuten de otro grupo de ratones Esta infeccioacuten se realiza con
el objetivo de tener ratones fuente disponibles el diacutea que se ha de comenzar el
ensayo Del mismo modo la sangre de los ratones infectados es usada para la
congelacioacuten de nuevas cepas
VIII326 Ensayos de actividad Test de Peters
El test claacutesico de supresioacuten de 4 diacuteas (Peters y Robinson 1999) da comienzo
una vez que se conoce coacutemo se va a desarrollar previsiblemente la cepa elegida
En este ensayo dicha cepa es Plasmodium berghei NK65 inoculada en 100 ratones
macho tipo Swiss con un peso de 20 2 g Se distribuyen en 10 grupos de 10
individuos identificados de la siguiente manera
-Grupo Negativo 10 ratones que seraacuten tratados con el medio de dilucioacuten de
los compuestos que ensayar En esta ocasioacuten el medio de dilucioacuten es DMSO
utilizado a una dosis maacutexima de 100 microL por ratoacuten y diacutea
Ensayos bioloacutegicos
103
-Grupo Positivo 10 ratones que seraacuten tratados con 40 microg de CQ en 100 microL
DMSO (2 mg por kg)
-Grupos de A1 al A4 Cuatro grupos de 10 ratones que seraacuten tratados con uno
de los compuestos que ensayar a dosis de 40 20 10 y 5 mgkg respectivamente
-Grupos del B1 al B4 Cuatro grupos de 10 ratones que seraacuten tratados con el
otro compuesto que ensayar a dosis 40 20 10 y 5 mgkg respectivamente
El ensayo parte de la determinacioacuten de la parasitemia y de un conteo de
hematiacutees por ceacutelula Malassez de ratones fuente para conocer queacute cantidad de
sangre se necesita para realizar una infeccioacuten controlada y simultaacutenea de los
cien ratones con ceacutelulas parasitadas con 107 ceacutelulas parasitadasratoacuten en una
solucioacuten salina al 09 por viacutea intraperitoneal
La extraccioacuten se realiza por puncioacuten seno retro-orbital ya que el volumen de
sangre que se necesita es superior al que se puede obtener por puncioacuten de la
vena de la cola La muestra se trata de la misma forma que lo explicado
anteriormente y se procede a la infeccioacuten de la totalidad de los individuos
Trascurridas dos horas se comienza con la administracioacuten del tratamiento
especiacutefico de cada grupo en lo que se denomina Diacutea 0 En dicho momento se
realiza la administracioacuten del tratamiento todos los diacuteas siguientes a la misma
hora y con el mismo procedimiento El tratamiento se aplica viacutea subcutaacutenea en
la parte interna de las patas traseras Con esto evitamos que se produzca
toxicidad o necropsia de alguacuten oacutergano del peritoneo Tambieacuten se alterna la pata
donde se inyecta el tratamiento para asegurarse de que no se produzca una
necrosis por toxicidad debida a la acumulacioacuten del producto por una mala
difusioacuten Si un producto no es toacutexico podriacutea acumularse pero no necrosar y
esto tambieacuten podriacutea observarse como un bulto debajo de la piel
Durante el transcurso del test se ha de llevar a cabo un seguimiento visual de
la posible respuesta externa de los ratones a la administracioacuten de los
compuestos anotando cambios en el comportamiento de los ratones
irritaciones deacutermicas en diferentes zonas prestando especial atencioacuten a la zona
donde se produce la inyeccioacuten del tratamiento falta de movilidad y cambios
morfoloacutegicos como disminucioacuten de la temperatura peacuterdida de peso o pelo
cambios en la pigmentacioacuten de la piel
Pasados cinco diacuteas o Diacutea 4 se realiza un frotis a todos los ratones
supervivientes para calcular la parasitemia en sangre perifeacuterica Se comprueba
la inhibicioacuten de la parasitemia para calcular la dosis letal (DL50) determinada
Ensayos bioloacutegicos
104
por anaacutelisis de regresioacuten lineal de miacutenimos cuadrados Una vez pasado el
tiempo del Test de Peters los ratones supervivientes seguiraacuten siendo
observados en los siguientes diacuteas lo que se denomina Test Rane Esto sirve para
la determinacioacuten de la actividad esquizonticida en vivo comparando de la
mortalidad de los ratones del grupo negativo con el resto de grupos
Durante la realizacioacuten de los ensayos los ratones que mueren son desechados
seguacuten los protocolos normalizados del animalario (bioterio) en el que se
realizan todos los procedimientos experimentales
IIXX EESSTTUUDDIIOOSS CCOOMMPPUUTTAACCIIOONNAALLEESS
Estudios Computacionales
107
IX1 Propiedades fisicoquiacutemicas de los compuestos
Para los caacutelculos de las propiedades fisicoquiacutemicas de los compuestos se
utilizoacute el Laboratorio de Quiacutemica Computacional Virtual33 (Tetko et alts 2005)
y la herramienta de caacutelculo de propiedades online Molinspiration34 (Ertl et alts
2000)
Los datos obtenidos fueron utilizados para establecer una aproximacioacuten
teoacuterica del comportamiento de los compuestos en tratamientos orales Los
estudios se centraron en la obtencioacuten de las caracteriacutesticas de absorcioacuten de cada
compuesto que depende de otros factores como liposolubilidad fuerzas polares
moleculares y caracteriacutesticas propias de la estructura molecular
El coeficiente de particioacuten octanolagua estaacute asociado a la solubilidad y se
calculoacute desde MLog P miLogP AlogP KOWLogP y ABlogP Las
caracteriacutesticas estructurales de la moleacutecula como tamantildeo y posibilidad de giro
de enlaces tambieacuten influyen en la absorcioacuten Las caracteriacutesticas polares son
importantes para la absorcioacuten porque intervienen en la lipofilia de los
compuestos asiacute se desprende del estudio de los enlaces aceptores y receptores
de enlaces polares y del TPSA Se puede obtener asiacute una aproximacioacuten al
porcentaje de absorcioacuten (Zhao et alts 2002) de los compuestos en la membranas
celulares
Los compuestos que a su vez cumplen las Reglas de Lipinski (Lipinski et alts
1997) son buenos candidatos para ofrecer buenas cualidades en la
administracioacuten oral
IX2 Optimizacioacuten geomeacutetrica
Los estudios computacionales de Modelizacioacuten y Docking35 se llevaron a
cabo para compuestos liacutederes en los Laboratorios de Investigacioacuten y Desarrollo
de la Facultad de Ciencias y Filosofiacutea de la Universidad Peruana Cayetano
Heredia (UPCH) Lima (Peruacute)
33 httpwwwvcclaborg 34 httpwwwmolinspirationcomservicespropertieshtml 35 Docking (del ingleacutes anclarse) En el campo del Modelado molecular este es un meacutetodo que predice la conformacioacuten preferida de un moleacutecula al estar unida a otra con el fin de formar un complejo estable1 El conocimiento de la orientacioacuten preferida a su vez puede ser usada para predecir la fuerza de la asociacioacuten o la afinidad de enlace entre dos moleacuteculas usando por ejemplo las funciones de puntuacioacuten (o funciones de scoring)
Estudios Computacionales
108
El compuesto maacutes activo se sometioacute a estudios de modelizacioacuten para
optimizar la geometriacutea y determinar los potenciales electrostaacuteticos de la
moleacutecula Para esto se usoacute el caacutelculo mecaacutenico Quantum en concreto el
programa Gaussian36 de quiacutemica cuaacutentica y el set baacutesico HF3-21G El Potencial
molecular electrostaacutetico (MEP) fue computerizado por la densidad electroacutenica
y fue calculado a partir de datos del software Molekel37 (Fluumlckigel et alts 2008)
IX3 Estudios de Acoplamiento Molecular (Docking)
El programa ICM38 de modelizacioacuten se usoacute para determinar el potencial
modo de unioacuten entre los compuestos maacutes activos y la enzima diana
previamente estudiada en estudios anteriores la plasmepsina II del Plasmodium
Ensayos anteriores mostraban la cristalizacioacuten de la enzima plasmepsina II con
un compuesto denominado EH58 (N-(3-[(2-benzo[13]dioxol-5-yl-ethyl)[3-(1-
methyl-3-oxo-13-dihydro-isoindol-2-yl)-propionyl]-amino]-1-benzyl-2-
(hydroxypropyl)-4-benzyloxy-35-dimethoxy-benzamide Figura 50) (Asojo et
alts 2003)
Figura 50 Imagen de la interaccioacuten del compuesto EH-58 y la plasmepsina II39
Seguacuten datos publicados posteriormente se demostroacute que la enzima presenta
un hueco activo donde pueden introducirse diferentes moleacuteculas y establecer
interacciones que inhiben su actividad En el caso de los derivados estudiados
se planteoacute la posible unioacuten de estos al resto polar del aminoaacutecido aspartato
(ASP) de las posiciones 214 y 34 de sitio activo de la enzima (Bjelic et alts
36 Gaussian Inc Pittsburg PA 2003 37 httpwwwcscschmolekel 38 versioacuten3 4-8 La Jolla CA Molsoft LLC 2006 39 Disponible en Asojo et alts 2003
Estudios Computacionales
109
2007) En primer lugar para validar la metodologiacutea y comprobar la capacidad
del programa ICM para estudiar los modos de enlace de los inhibidores en el
sitio de unioacuten de la enzima el complejo EH50-plasmepsina II40 fue reacoplado
mediante caacutelculos computacionales De acuerdo con la bibliografiacutea (Cunico et
alts 2009a b y Mendoza et alts 2011) en los estudios de acoplamiento se
considera como vaacutelidos los valores de desviacioacuten de la media cuadraacutetica
(RMSD) entre 30 a 40 Aring
Las estructuras se prepararon siguiendo la metodologiacutea ICM (Abagyan et
alts 1994) y se dibujaron con el editor molecular del software41 Asiacute las
estructuras de los compuestos y la proteiacutena fueron convertidas a objetos ICM
Durante este proceso de conversioacuten de la proteiacutena se antildeadieron hidroacutegenos
para proceder despueacutes con una optimizacioacuten geomeacutetrica Ademaacutes las
representaciones en dos dimensiones fueron convertidas a tres dimensiones
asignando cargas parciales y asignando enlaces rotatorios
De acuerdo con estudios previos (Mendoza et al 2011 y Cunico et al 2009b)
los aminoaacutecidos que conforman el sitio activo son la ASP 34 y la ASP 214
El programa buscador de cavidades del sistema ICM42 se usoacute para identificar
el sitio activo con un valor de tolerancia de 46 Aring La posicioacuten y orientacioacuten
inicial del ligando y el tamantildeo y posicioacuten del hueco fueron escogidos de
acuerdo con los valores sugeridos por el sistema
Los modos de unioacuten calculados con al menos un enlace por puentes de
hidroacutegeno con alguno de los aspartatos que conforman el sitio cataliacutetico se
consideraron como los maacutes representativos y tomados en cuenta para su
anaacutelisis (Kasam et alts 2007 y Aringqvist et alts 1994) El acoplamiento planteado
para cada ligando fue analizado estudiaacutendose su energiacutea total relativa La
conformacioacuten maacutes favorable energeacuteticamente se seleccionoacute como mejor
posicioacuten espacial
40 Protein Data Bank PDB code 1LF3 wwwrcsborg 41 Molecular Editor versioacuten 25 La jolla CA Molsoft LLC 2006 42 ICM Pocket Finder An et alts 2005
RESULTADOS Y
DISCUSIOacuteN
XX DDEESSCCRRIIPPCCIIOacuteOacuteNN DDEE CCOOMMPPUUEESSTTOOSS
Descripcioacuten de Compuestos
115
X1 Siacutentesis de precursores
(Benzo[b]tiofen-3-il)-3-cloropropan-1-ona
Procedimiento experimental
Sobre 205 g de AlCl3 (015 mmol) disueltos en 150 mL de diclorometano seco y
en atmoacutesfera de N2 se antildeade gota a gota una disolucioacuten de 1878 g de
benzo[b]tiofeno (140 mmol) y 159 mL de cloruro de 3-cloropropionilo (140
mmol) disueltos en 50 mL de diclorometano seco A continuacioacuten se antildeaden
tambieacuten gota a gota 95 mL de aacutecido sulfuacuterico en 150 mL de agua Se realiza
extracciones con diclorometano La fase orgaacutenica se seca con trazas de sulfato
soacutedico anhidro y se elimina el disolvente a presioacuten reducida Se obtiene un
aceite que se purifica por cromatografiacutea en columna empleando una mezcla de
hexanoacetato de etilo como fase moacutevil en gradiente hasta (955) El producto
se precipita con hexano friacuteo
Punto de fusioacuten 55-57ordmC
IR (cm-1) 1655 (mf CO)
RMN-1H (CDCl3 400 MHz) δ (ppm) 343 (m 2H CH2-CO) 386 (c 2H CH2-
Cl) 732-748 (m 2H H5 + H6) 780 (d 1H H4 J45= 76 Hz) 824 (s 1H H2 ) 847
(d 1H H7 J76= 73 Hz)
Anaacutelisis elemental (CHN)
Calculado Hallado
C 5879 5845
H 400 396
N 000 000
FM C11H9 ClOS PM 2245 APARIENCIA Soacutelido blanco RENDIMIENTO 86
Descripcioacuten de Compuestos
116
Tert-butil 4-(4-nitro-2-trifluorometilfenil)piperazin-1-carboxilato
Procedimiento experimental
Seguacuten el meacutetodo A a partir de 2 g de 2-fluacuteor-5-nitro-1-(trifluorometil)benceno
(956 mmol) y 25 g de tert-butil piperacin-1-carboxilato (1342 mmol) se obtiene
un residuo que se lava con hexano y se usa en la reaccioacuten siguiente sin maacutes
purificaciones
Punto de fusioacuten 136ndash138 ordmC
IR (cm-1) 2982-2751 (m C-H alifaacuteticos) 1685 (mf CO) 1530 y 1350 (m NO2)
1280 y 1155 (mf CF3)
RMN-1H (CDCl3 400 MHz) δ (ppm) 150 (s 9H C(CH3)3) 308 (dd 4H H3+H5
PIPZ) 362 (dd 4H H2+H6 PIPZ) 732 (d 1H H6 FENIL J65= 90 Hz) 837 (dd
1H H5 FENIL J56= 90 Hz J53= 28 Hz) 855 (d 1H H3 FENIL J35= 27 Hz)
(4-nitro-2-trifluorometilfenil)piperazina
Procedimiento experimental
Seguacuten el meacutetodo B usando amina protegida se obtiene un aceite que precipita
con hexano en friacuteo obtenieacutendose un polvo amarillo intenso
Punto de fusioacuten 97-99ordmC
IR (cm-1) 3380 (f NH) 2982-2751 (m C-H alifaacuteticos) 1685 (mf CO) 1530 y 1350
(m NO2) 1280 y 1155 (mf CF3)
RMN-1H (CDCl3 400 MHz) δ (ppm) 212 (s 1H NH) 306-308 (m 4H H2+H6
PIPZ) 313-315 (m 4H H3+H5 PIPZ) 730 (d 1H H6 FENIL J65= 90 Hz) 835
(dd 1H H5 FENIL J56= 90 Hz J53= 26 Hz) 853 (d 1H H3 FENIL J35= 26 Hz)
FM C16H20N3F3O4
PM 3751 Apariencia Soacutelido amarillo Rendimiento 75
FM C11H12N3F3O2
PM 2751 Apariencia Soacutelido amarillo Rendimiento 75
Descripcioacuten de Compuestos
117
Tert-butil 4-(4-nitro-2-trifluorometilfenil)-14-diazepan-1-carboxilato
Procedimiento experimental
Seguacuten el meacutetodo A a partir de 2 g de tert-butil 14-diazepan-1-carboxilato (999
mmol) y 108 g de 1-fluacuteor-2-nitro-4-(trifluorometil)benceno (516 mmol) se
obtiene un residuo que se lava con eacuteter etiacutelico y se usa en la reaccioacuten siguiente
sin maacutes purificacioacuten
Punto de fusioacuten 197ndash198 ordmC
IR (cm-1) 2982-2751 (m C-H alifaacuteticos) 1694 (mf CO) 1524 y 1346 (m NO2)
1283 y 1154 (mf CF3)
RMN-1H (DMSO-d6 400 MHz) δ (ppm) 208-211 (q 2H H6 DZP) 324 (sa
2H H2 DZP) 330 (sa 2H H7 DZP) 344 (t 2H H5 DZP) 363 (t 2H H3 DZP)
756 (d 1H H6 FENIL J65= 99Hz) 839-845 (m 2H H3+H5 FENIL)
(4-nitro-2-trifluorometil)fenil)-14-diazepan
Procedimiento experimental
Seguacuten el meacutetodo B usando amina protegida se obtiene un aceite que precipita
con eacuteter etiacutelico en friacuteo
Punto de fusioacuten 121ndash123 ordmC
IR (cm-1) 3352 (m NH) 2938-2850 (m C-H alifaacuteticos) 1581 y 1331 (mf CF3)
RMN-1H (CDCl3 400 MHz) δ (ppm) 174 (sa 1H NH) 192-197 (m 2H H6
DZP) 303-309 (m 4H H3+H5 DZP) 350-357 (m 4H H2+H7 DZP) 721 (d 1H
H6 FENIL J65= 93 Hz) 825 (dd 1H H5 FENIL J56= 92 Hz J53= 28 Hz) 853
(d 1H H3 FENIL J35= 28 Hz)
FM C17H22N3F3O4
PM 3893 Apariencia Soacutelido amarillo Rendimiento 77
FM C12H14N3F3O2
PM 2893 Apariencia Soacutelido amarillo Rendimiento 75
Descripcioacuten de Compuestos
118
Tert-butil 1-(4-nitro-2-trifluorometilfenil)-(S)-pirrolodin-3-ilcarbamato
Procedimiento experimental
Seguacuten el meacutetodo A a partir de 127 g (686 mmol) de tert-butil-(S)-pirrolidin-3-ilcarbamato y
072 g (343 mmol) de 2-fluor-5-nitro-1-(trifluorometil) benceno El residuo obtenido se precipita
y se lava con hexano
Punto de fusioacuten 115 ndash 117 ordmC
IR (cm-1) 3349 (f NH) 2981-2880 (d C-H alifaacuteticos) 1680 (mf CO) 1507 y 1326 (m NO2) 1273 y
1120 (f CF3)
RMN-1H (CDCl3 400 MHz) δ (ppm) 148 (s 9H C(CH3)3) 199-207 (m 1H H4ec PIRR) 226-
235 (m 1H H4ax PIRR) 342(c 1H H2ec PIRR) 359-365 (m 1H H5ax PIRR) 368-374 (m 1H
H5ec PIRR) 384 (c 1H H2ax PIRR) 438 (sa 1H NH) 470 (sa 2H H3 PIRR) 683 (d 1H H6
FENIL J65 = 95 Hz) 820 (dd 1H H5 FENIL J56 = 94 Hz J53 = 27Hz) 856 (d 1H H3 FENIL
J35= 27 Hz)
1-(4-nitro-2-trifluorometilfenil)-(S)-pirrolidin-3-il amina
Procedimiento experimental
Seguacuten el meacutetodo B usando la amina protegida se obtiene un aceite que precipita
con hexano en friacuteo Se identifica y se usa sin maacutes purificaciones en la siguiente
reaccioacuten
Punto de fusioacuten 64ndash66 ordmC
IR (cm-1) 3359 (d NH) 2943-2851 (d C-H alifaacuteticos) 1505 y 1317 (mf NO2) 1105 (mf CF3)
RMN-1H (CDCl3 400 MHz) δ (ppm) 149 (sa 2H NH2) 183-191 (m 1H H4ec
PIRR) 219-226 (m 1H H4ax PIRR) 327-330 (m 1H H2ec PIRR) 358-363 (m
1H H5ax PIRR) 375-381 (m 4H H2ax+H3+H5ec PIRR) 683 (d 1H H6 FENIL
J65= 95 Hz) 819 (dd 1H H5 FENIL J56= 95 Hz J53= 27 Hz) 856 (d 1H H3
FENIL J35= 27 Hz)
FM C16H20N3F3O4
PM 37521 Apariencia Soacutelido amarillo Rendimiento 71
FM C11H12N3F3O2
PM 2751 Apariencia Soacutelido marroacuten claro Rendimiento 83
Descripcioacuten de Compuestos
119
Tert-butil 1-(4-nitro-2-trifluorometilfenil)piperidin-4-ilcarbamato
Procedimiento experimental
Seguacuten el meacutetodo A a partir de 241 g de tert-butil piperidin-4-ilcarbamato (1203 mmol) y 214 g
de 1-fluacuteor-4-nitro-2-(trifluorometil)benceno (1023 mmol) El residuo obtenido se lava con
hexano
Punto de fusioacuten 120ndash122 ordmC
IR (cm-1) 3431 (m NH) 2979-2798 (m C-H alifaacuteticos) 1707 (mf CO) 1500 y 1341 (mf NO2)
1118 (f CF3)
RMN-1H (CDCl3 400 MHz) δ (ppm) 147 (s 9H C(CH3)3) 162 (dd 2H H3ax+H5ax PIPR J3ax3ec
= J5ax5ec = 113 Hz J3ax2ax = J5ax6ax = 35 Hz) 209 (d 2H H3ec+H5ec PIPR J3ec3ax = J5aec5ax = 121 Hz)
296 (td 2H H2ax+H6ax PIPR J2ax2ec = J6ax6ec = J2ax3ax = J6ax5ax = 125 Hz J2ax3ec = J6ax5ec = 19 Hz) 335
(d 2H H2ec+H6ec PIPR J2ec2ax = J6ex6ac =125 Hz) 366 (sa 1H H4 PIPR) 456 (sa 1H HN) 728 (d
1H H6 PIPR J65= 90 Hz) 832 (dd 1H H5 FENIL J56= 90 Hz J53 = 27 Hz) 851 (d 1H H3
FENIL J35 = 27 Hz)
1-(4-nitro-2-trifluorometilfenil)piperidin-4-il amina
Procedimiento experimental
Seguacuten el meacutetodo B usando la amina protegida se obtiene un aceite que precipita con
hexano en friacuteo Se identifica y se usa sin maacutes purificaciones en la siguiente reaccioacuten
Punto de fusioacuten 24-25 ordmC
IR (cm-1) 2938-2847 (m C-H alifaacuteticos) 1499 y 1334 (mf NO2) 1119 (mf CF3)
RMN-1H (CDCl3 400 MHz) δ (ppm) 152 (sa 1H NH2) 151-162 (m 2H H3ax+H5ax
PIPR) 195 (d 2H H3ec+H5ec PIPR J3ax3ec = J5ax5ec = 126 Hz) 287-296 (m 3H
H2ax+H6ax+H4 PIPR) 339 (d 2H H2ec+H6ec PIPR J2ec2ax = J6ec6ax = 127 Hz) 725 (d 1H
H6 FENIL J65= 91 Hz) 830 (dd 2H H5 FENIL J56= 90 Hz J53= 25 Hz) 851 (d 1H H3
FENIL J35= 26 Hz)
FM C17H22N3F3O4
PM 3892 Apariencia Soacutelido amarillo Rendimiento 93
FM C12H14N3O2F3
PM 2891 Apariencia Soacutelido amarillo Rendimiento 88
Descripcioacuten de Compuestos
120
X2 Siacutentesis de derivados carboniacutelicos (Serie 0)
1-(benzo[b]tiofen-3-il)-3-[4-(4-nitro-2-trifluorometilfenil)piperazin-1-
il]propan-1-ona
Procedimiento experimental
Seguacuten el meacutetodo general C a partir de 104 g (378 mmol) de (4-nitro-2-
trifluorometilfenil)piperazina y 085 g (370 mmol) de 1-(benzo[b]tiofen-3-il)-3-
cloropropan-1-ona Se elimina el disolvente a presioacuten reducida y se precipita el
soacutelido con hexanoeacuteter en friacuteo El soacutelido obtenido se purifica en columna
cromatograacutefica usando como fase moacutevil diclorometanometanol (991) Se
elimina el disolvente de las fracciones adecuadas a presioacuten reducida
obtenieacutendose el compuesto de forma soacutelida
Punto de fusioacuten 153-154ordmC
IR (cm-1) 2952-2815 (m C-H alifaacuteticos) 1673 (mf CO) 1457 y 1332 (mf NO2)
1281 y 1131 (m CF3)
RMN-1H (CDCl3 400 MHz) δ (ppm) 276-277 (m 4H H3+H5 PIPZ) 298-312
(m 2H CO-CH2-CH2) 319-321 (t 4H H2+H6 PIPZ) 327-330 (m 2H CO-CH2-
CH2) 729 (dd 1H H5rsquo FENIL J5acute6acute= 94 Hz J5acute3acute= 25 Hz) 746 (t 1H H6 BZT
J65= 80 Hz) 752 (t 1H H5 BZT J56= J54= 81 Hz) 790 (d 1H H4 BZT J45= 80
Hz) 833-836 (m 2H H6rsquo FENIL+ H7 BZT) 853 (s 1H H2 BZT) 878 (d 1H H3rsquo
FENIL J3acute5acute= 26 Hz)
Anaacutelisis elemental (CHN)
HPLC (RP-18 1 mLmin metanol-agua (8020)) tr 713 min ʎmax 2196 nm
Calculado Hallado
C 5720 5677
H 432 457
N 916 908
FM C22H20N3F3O3S PM 4635 Apariencia Soacutelido amarillo
Rendimiento 13
01
Descripcioacuten de Compuestos
121
Hidrocloruro de 1-(benzo[b]tiofen-3-il)-3-[4-(2-nitro-4-
trifluorometilfenil)piperazin-1-il]propan-1-ona
Procedimiento experimental
Seguacuten el meacutetodo general C a partir de 147 g (534 mmol) de 4-(2-nitro-4-
trifluorometilfenil) piperazina comercial y 104 g (445 mmol) de 1-
(benzo[b]tiofen-3-il)-3-cloropropan-1-ona Se elimina el disolvente a presioacuten
reducida y precipita con hexano El soacutelido obtenido no es del todo puro por lo
que se purifica por columna cromatograacutefica usando como fase moacutevil
diclorometanometanol (991) Se elimina el disolvente de las fracciones
adecuadas a presioacuten reducida obteniendo un aceite claro que se precipita como
hidrocloruro
Punto de fusioacuten 207-209 ordmC
IR (cm-1) 2970-2930 (d C-H alifaacuteticos) 1657 (mf CO) 1447 y 1332 (mf NO2)
1253 y 1120 (m CF3)
RMN-1H (DMSO 400 MHz) δ (ppm) 326 (d 2H CO-CH2-CH2 JCHCH= 98
Hz) 351 (d 2H H3ax + H5ax PIPZ Jaxec= 128 Hz) 355 (d 4H
H3ec+H5ec+H2ax+H6ax PIPZ Jaxec= 129 Hz) 367 (d 2H H2ec+H6ec PIPZ Jecec=
122 Hz) 377 (t 2H CO-CH2 JCHCH= 100 Hz) 749 (ddd 1H H5 BZT J54= 84
Hz J56= 68 Hz) 754 (ddd 1H H6 BZT J67= 82 Hz J65= 70 Hz) 758 (d 1H
H6rsquo FENIL J6acute5acute= 88 Hz) 797 (dd 1H H5rsquo FENIL J5acute6acute= 89 Hz J5acute3acute= 21 Hz)
812 (d 1H H4 BZT J45= 79 Hz) 830 (sa 1H H3rsquo FENIL) 862 (d 1H H7 BZT
J76= 78 Hz) 909 (sa 1H H2 BTZ) 1145 (sa 1H HCl)
Anaacutelisis elemental (CHN)
HPLC (RP-18 1 mLmin metanol-agua (8020)) tr 523 min ʎmax 2181 nm
Calculado Hallado
C 5285 5301
H 400 416
N 841 831
FMC22H20N3F3O3SHCl PM 4999 Apariencia Soacutelido beige Rendimiento 60
02
Descripcioacuten de Compuestos
122
1-(benzo[b]tiofen-3-il)-3-[4-(4-fluorofenil)-36-dihidropiridin-
1(2H)-il]propan-1-ona
Procedimiento experimental
Seguacuten el meacutetodo general C a partir de 1 g (567 mmol) de 4-(4-fluorofenil)-
1236-tetrahidropiridina y 12 g (534 mmol) de 1-(benzo[b]tiofen-3-il)-3-
cloropropan-1-ona Se elimina el disolvente a presioacuten reducida y se precipita el
soacutelido con eacuteter El soacutelido obtenido se purifica por cromatografiacutea flash usando
como fase moacutevil diclorometanometanol (991) Se elimina el disolvente de las
fracciones adecuadas a presioacuten reducida obtenieacutendose el compuesto de forma
soacutelida
Punto de fusioacuten 79-80 ordmC
IR (cm-1) 2780-2775 (d C-H alifaacuteticos) 1664 (mf CO)
RMN-1H (CDCl3 400 MHz) δ (ppm) 261 (sa 2H H6 PIRD) 285 (t 2H H2
PIRD J2ec3ec= J2ax3ax= 57 Hz) 306 (t 2H CO-CH2-CH2 JCHCH= 74 Hz) 330 (sa
2H H5 PIRD) 335 (t 2H CO-CH2 JCHCH= 73 Hz) 603 (t 1H H3 PIRD J56ec=
J56ax= 40 Hz) 702 (dd 2H H3rsquo+ H5rsquo FENIL J3acute2acute= J5acute6acute= 87 Hz) 736 (dd 2H
H2rsquo+ H6rsquo FENIL J3acute2acute= J6acute5acute= 86 Hz) 745 (t 1H H6 BZT J65= J67= 76 Hz) 752 (t
1H H5 BZT J56= J54= 77 Hz) 790 (d 1H H4 BZT J45 = 73 Hz) 839 (s H2 BZT)
879 (d 1H H7 BZT J76= 75 Hz)
Anaacutelisis elemental (CHN)
HPLC (RP-18 1 mLmin metanol-agua (8020)) tr 561 min ʎmax 2196 nm
Calculado Hallado
C 7232 7214
H 548 549
N 383 369
FM C22H20NFOS PM 3655 Apariencia Soacutelido amarillo Rendimiento 15
03
Descripcioacuten de Compuestos
123
1-(5-fluorobenzo[b]tiofen-3-il)-3[4-(4-nitro-2-
(trifluorometilfenil)piperazin-1-il]propan-1-ona
Procedimiento experimental
Seguacuten el meacutetodo general D a partir de 048 g (174 mmol) de 4-(4-nitro-2-
trifluorometilfenil) piperazina y 035 g (179 mmol) de 1-(5-fluorobenzo[b]tiofen-
3-il) etanona se elimina el disolvente a presioacuten reducida y se precipita el soacutelido
con hexanoeacuteter en friacuteo
IR (cm-1) 2976-2832 (d C-H alifaacuteticos) 1671 (mf CO) 1330 (f NO2) 1281 y 1127
(m CF3)
RMN-1H (CDCl3 400 MHz) δ (ppm) 296 (sa 4H H3+H5 PIPZ) 320 (sa 2H
CO-CH2-CH2) 331 (sa 4H H2+H6 PIPZ) 346 (sa 2H CO-CH2) 723 (dt 1H
H6 FBZT J65= J67= 86 Hz J64= 25 Hz) 739 (d 1H H6acute FENIL J6acute5acute= 88 Hz)
783 (dd 1H H7 FBZT J76= 88 Hz J75= 48 Hz) 837 (dd 1H H5acute FENIL J5acute6acute=
89 Hz J5acute3acute= 26 Hz) 848 (dd 1H H4 FBZT J4F= 104 Hz J46= 25 Hz) 853 (s
1H H2 FBZT) 854 (d 1H H3rsquo FENIL)
Anaacutelisis elemental (CHN)
HPLC (RP-18 1 mLmin metanol-agua (8020)) tr 703 min ʎmax 2159 nm
Calculado Hallado
C 5101 5055
H 387 390
N 811 786
FM C22H19N3F4O3S PM 4815 Apariencia Soacutelido amarillo Rendimiento 35
04
Descripcioacuten de Compuestos
124
1-(5-fluorobenzo[b]tiofen-3-il)-3-[4-(2-nitro-4-
(trifluorometilfenil)piperazin-1-il]propan-1-ona
Procedimiento experimental
Seguacuten el meacutetodo general D a partir de 058 g (209 mmol) de 4-(2-nitro-4-
trifluorometilfenil) piperazina y 043 g (222 mmol) de 1-(5-fluorobenzo[b]tiofen-
3-il) etanona Se elimina el disolvente a presioacuten reducida y el residuo se
precipita con eacuteter en friacuteo
RMN-1H (CDCl3 400 MHz) δ (ppm) 280 (sa 4H H3+H5 PIPZ) 303 (t 2H
CO-CH2-CH2 JCHCH= JCHCH= 74 Hz) 323 (sa 4H H2+H6 PIPZ) 328 (t 2H
CO-CH2 JCHCH= JCHCH = 73 Hz) 719 (d 1H H6rsquo FENIL J6acute5acute= 84 Hz) 722-725
(m 1H H6 FBZT) 769 (dd 1H H5acute FENIL J5acute6acute= 87 Hz J5acute3acute= 20 Hz) 782 (dd
1H H7 FBZT J76= 89 Hz J7F= 49 Hz) 843 (s 1H H2 FBZT) 808 (d 1HH3acute
FENIL J3acute5acute= 16 Hz) 850 (dd 1H H4 FBZT J4F= 104 Hz J46= 26 Hz)
Anaacutelisis elemental (CHN)
HPLC (RP-18 1 mLmin metanol-agua (8020)) tr 542 min ʎmax 2196 nm
Calculado Hallado
C 5101 5102
H 386 384
N 811 798
FM C22H19N3F4O3S PM 4815 Apariencia Soacutelido naranja Rendimiento 51
05
Descripcioacuten de Compuestos
125
1-(5-fluorobenzo[b]tiofen-3-il)-3-[4-(4-(trifluorometilfenil)
piperazin-1-il]propan-1-ona
Procedimiento experimental
Seguacuten el meacutetodo general D a partir de 036 g (130 mmol) de 4-(4-
trifluorometilfenil) piperazina y 033 g (170 mmol) de 1-(5-fluorobenzo[b]tiofen-
3-il)etanona Se elimina el disolvente a presioacuten reducida y se precipita el soacutelido
con hexanoeacuteter El soacutelido obtenido no es del todo puro por lo que se purifica
por cromatografiacutea flash usando como fase moacutevil diclorometanometanol (991)
Se elimina el disolvente de las fracciones adecuadas a presioacuten reducida
obtenieacutendose un aceite claro
Debido al bajo rendimiento de la reaccioacuten el aceite puro obtenido se identifica
por CCF y se usa en su totalidad para la siacutentesis del derivado hidroxiacutelico 2c
FM C22H20N2F4OS PM 4815 Apariencia Aceite incoloro Rendimiento 15
06
Descripcioacuten de Compuestos
126
Hidrocloruro de 1-(5-fluorobenzo[b]tiofen-3-il)-3-[4-(4-nitro-2-
(trifluorometilfenil)-14-diazepan-1-il]propan-1-ona
Procedimiento experimental
Seguacuten el meacutetodo general D a partir de 051 g (177 mmol) de 4-(2-nitro-4-
trifluorometilfenil) piperazina comercial y 035 g (179 mmol) de 1-(5-
fluorobenzo[b]tiofen-3-il)etanona se elimina el disolvente a presioacuten reducida y
se precipita con hexanoeacuteter etiacutelico
IR (cm-1) 2938 (d C-H alifaacuteticos) 1663 (m CO) 1449 y 1332 (mf NO2) 1281 y
1120 (m CF3)
RMN-1H (DMSO-d6 400 MHz) δ (ppm) 290-297 (m 6H H3+H5+H6 DZP)
310 (t 2H CO-CH2-CH2 JCHCH= 69 Hz) 322 (t 2H CO-CH2 JCHCH= 71 Hz)
353 (d 2H H7 DZP J76= 78 Hz) 356 (d 2H H2 DZP J23= 81 Hz) 712 (d 1H
H6acute FENIL J6acute5acute= 90 Hz) 722 (dd 1H H6 FBZT J67= 83 Hz J64= 23 Hz) 781
(dd 1H H5acute FENIL J5acute6acute= 93 Hz J5acute3acute= 28 Hz ) 820 (d 1H H7rsquo FBZT J76= 80
Hz) 841 (sa 1H H2 FBZT) 848 (d 1H H3acute FENIL J3acute5acute= 26 Hz) 850 (d 1H H4
FBTF J4F= 102 Hz)
Anaacutelisis elemental (CHN)
HPLC (RP-18 1 mLmin metanol-agua (8020)) tr 239 min ʎmax 2235 nm
Calculado Hallado
C 519lt3 5094
H 414 413
N 790 760
FM C23H21N3F4O3SHCl PM 5320 Apariencia Soacutelido amarillo
Rendimiento 80
07
Descripcioacuten de Compuestos
127
1-(5-fluorobenzo[b]tiofen-3-il)-3-[1-(4-nitro-2-
(trifluorometilfenil)piperidin-4-ilamino]propan-1-ona
Procedimiento experimental
Seguacuten el meacutetodo general D a partir de 030 g (155 mmol) de 1-(4-nitro-2-
trifluorometilfenil) piperidin-4-il amina y 033 g (172 mmol) de 1-(5-
fluorobenzo[b]tiofen-3-il) etanona se elimina el disolvente a presioacuten reducida y
se purifica el aceite impuro por cromatografiacutea flash usando como fase moacutevil
diclorometanometanol (991) Se elimina el disolvente de las fracciones
adecuadas a presioacuten reducida obtenieacutendose un aceite claro aacutembar intenso
Debido al bajo rendimiento de la reaccioacuten el intermedio obtenido se identifica
por CCF y se usa en su totalidad para la siacutentesis del derivado hidroxiacutelico 2f
FM C23H21N3F4O3S PM 4955 Apariencia Aceite aacutembar Rendimiento 20
08
Descripcioacuten de Compuestos
128
Hidrocloruro de 1-(2-naftil)-3-[4-(4-nitro-2-trifluorometilfenil)
piperazin-1-il] propan-1-ona
Procedimiento experimental
Seguacuten el meacutetodo general D partiendo de 031 g (181 mmol) de 2-acetonaftona
comercial y 050 g (181 mmol) de 4-(4-nitro-2-trifluorometilfenil) piperazina
Despueacutes de la extraccioacuten y eliminacioacuten a presioacuten reducida del disolvente se
obtiene un aceite impuro El compuesto se purifica y precipita con eacuteter saturado
de clorhiacutedrico para la obtencioacuten del hidrocloruro
Punto de fusioacuten 181-183ordmC
IR (cm-1) 2922-2844 (d C-H alifaacuteticos) 1680 (mf CO) 1521 y 1347 (mf NO2)
1279 y 1151 (m CF3)
RMN-1H (DMSO-d6 400 MHz) δ (ppm) 321 (d 2H H3ax+H5ax PIPZ) 327 (d
2H H3ec+H5ec PIPZ) 364 (sa 2H H2ax+H6ax PIPZ) 367 (sa 2H H2ec+H6ec PIPZ)
390 (t 2H CO-CH2-CH2 JCH-CH= 118 Hz) 403 (t 2H CO-CH2 JCH-CH= 64 Hz)
765-759 (m 3H H6+H7 NFT+H6acute FENIL) 792 (d 1H H4 NFT J43= 79 Hz)
795 (d 1H H5 NFT J56= 87 Hz) 804 (d 1H H8 NFT J87= 83 Hz) 806 (d 1H
H3 NFT J34= 79 Hz) 846 (dd 1H H5acute FENIL J5acute6acute= 88 Hz J5acute3acute= 25 Hz) 858
(d 1H H3acute FENIL J3acute5acute= 25 Hz) 862 (sa 1H H1 NFT)
Anaacutelisis elemental (CHN)
HPLC (RP-18 1 mLmin metanol-agua (8020)) tr 252 min ʎmax 2134 nm
Calculado Hallado
C 5434 5410
H 434 455
N 790 765
FM C24H22N3F3O3HCl PM 4940 Apariencia Soacutelido beige Rendimiento 17
09
Descripcioacuten de Compuestos
129
Hidrocloruro de 1-(2-naftil)-3-[4-(2-nitro-4-
trifluorometilfenil)piperazin-1-il]propan-1-ona
Procedimiento experimental
Seguacuten el meacutetodo general D partiendo de 062 g (363 mmol) de 2-acetonaftona
comercial y 100 g (363 mmol) de 4-(2-nitro-4-trifluorometilfenil) piperazina
Despueacutes de extraer y eliminar a presioacuten reducida el disolvente se obtiene un
aceite impuro El compuesto se purifica y precipita con eacuteter saturado de
clorhiacutedrico para la obtencioacuten del hidrocloruro
Punto de fusioacuten 152ndash153 ordmC
IR (cm-1) 2953-2838 (md C-H alifaacuteticos) 1672 (mf CO) 1535 y 1329 (mf NO2)
1278 y 1169 (m CF3)
RMN-1H (DMSO-d6 400 MHz) δ (ppm) 324ndash331 (m 2H CO-CH2-CH2)
345ndash361(m 6H H3+H5+H2ax+H2ax PIPZ) 371 (d 2H H2ec+H6ec PIPZ Jec-ax=
1148 Hz) 387 (t 2H CO-CH2 JCH-CH= 111 Hz) 756 (d 1H H6acute FENIL J6acute5acute=
87 Hz) 767 (ddd 1H H6 NFT J65= 82 Hz J67= 68 Hz J68= 13 Hz) 771 (ddd
1H H7 NFT J78= 83 Hz J76= 71 Hz J75= 13 Hz) 797 (dd 1H H5acute FENIL J5acute6acute=
89 Hz) 803 (d 1H H4 NFT J43= 84 Hz) 804 (d 1H H5 NFT J56= 85 Hz) 808
(d 1H H8 NFT J87= 85 Hz) 815 (d 1H H3 NFT J34= 80 Hz) 828 (d 1H H3acute
FENIL J3acute5acute= 13 Hz) 877 (sa 1H H1 NFT) 1135 (sa 1H HCl)
Anaacutelisis elemental (CHN)
HPLC (RP-18 1 mLmin metanol-agua (8020)) tr 528 min ʎmax 2475 nm
Calculado Hallado
C 5836 5842
H 466 471
N 850 843
FM C24H22N3F3O3HCl PM 4940 Apariencia Soacutelido amarillo Rendimiento 41
010
Descripcioacuten de Compuestos
130
Hidrocloruro de 1-(2-naftil)-3-[1-(4-nitro-2-
trifluorometilfenil)pirrolidin-3-ilamino]propan-1-ona
Procedimiento experimental
Seguacuten el meacutetodo general D partiendo de 067 g (394 mmol) de 2-acetonaftona y
095 g de 1-(4-nitro-2-(trifluorometilfenil)-(S)-pirrolidin-3-amina Despueacutes de
extraer con acetato de etilo y eliminar a presioacuten reducida el disolvente se
obtiene un soacutelido fino que se lava con eacuteter
Punto de fusioacuten 170-171ordmC
IR (cm-1) 2942-2716 (m C-H alifaacuteticos) 1681 (m CO) 1504 y 1324 (mf NO2)
1285 y 1121 (m CF3)
RMN-1H (DMSO-d6 400 MHz) δ (ppm) 238 (dd 1H H4ec PIRR) 245 (dd 1H
H4ax PIRR) 342 (d 2H CO-CH2-CH2) 364 (dd 1H H2ec PIRR) 375 (t 2H CO-
CH2) 381- 386 (m 2H H5ec+ H2ax PIRR) 394 (dd 1H H5ax PIRR) 408 (s 1H
H3 PIRR) 712 (d 1H H6acute FENIL J6acute5acute= 96 Hz) 765 (dd 1H H6 NFT J67= 78
Hz J65= 68 Hz) 769 (dd 1H H7 NFT J78= 83 Hz J76= 78 Hz) 800 (d 1H H4
NFT J43= 65 Hz) 802 (d 1H H3 NFT J34= 65 Hz) 806 (d 1H H5acute FENIL
J5acute6acute= 86 Hz) 816 (d 1H H5 NFT J56= 68 Hz) 825 (d 1H H8 NFT J87= 84
Hz) 839 (sa 1H H3acute FENIL) 869 (sa 1H H1 NFT) 980 (sa 2H NH+ HCl)
Anaacutelisis elemental (CHN)
HPLC (RP-18 1 mLmin metanol-agua (8020)) 25 min ʎmax= 2141 nm
Calculado Hallado
C 5836 5794
H 466 475
N 851 837
FM C24H22N3F3O3HCl PM 4935 Apariencia Soacutelido anaranjado
Rendimiento 38
011
Descripcioacuten de Compuestos
131
3-[4-(4-fluorofenil)-36-dihidropiridin-1(2H)-il]-1-(naftalen-2-
il)propan-1-ona
Procedimiento experimental
Seguacuten el meacutetodo general D a partir de 082 g (463 mmol) de 4-(4-fluorofenil)-
1236-tetrahidropiridina y 070 g (411 mmol) de 2-acetonaftona Se elimina el
disolvente a presioacuten reducida y se precipita el soacutelido con eacuteter El soacutelido
obtenido se purifica por cromatografiacutea flash usando como fase moacutevil
diclorometanometanol (991) Se elimina el disolvente de las fracciones
adecuadas a presioacuten reducida obtenieacutendose un soacutelido
Punto de fusioacuten 172ndash175 ordmC
IR (cm-1) 2780-2775 (d C-H alifaacuteticos) 1677 (f CO) 1510 (f C=C)
RMN-1H (CDCl3 400 MHz) δ (ppm) 161 (sa 2H H6 PIRD) 214 (sa 2H H2
PIRD) 272 (sa 2H CO-CH2-CH2) 292-299 (m 2H H5 PIRD) 345 (d 2H CO-
CH2) 602 (sa 1H H3 PIRD) 705 (t 2H H3rsquo+ H5rsquo FENIL J3acute2acute= J5acute6acute= 86 Hz)
735 (d 1H H6acute FENIL J6acute5acute= 86 Hz) 739 (sa 1H H2acute FENIL) 748-751 (m 3H
H5+H6+H7 NFT) 784-786 (m 3H H3+H4+H8 NFT) 791 (s 1H H1 NFT)
Anaacutelisis elemental (CHN)
HPLC (RP-18 1 mLmin metanol-agua (8020)) tr 557 min ʎmax 2455 nm
Calculado Hallado
C 7182 7125
H 581 573
N 354 350
FM C24H22NFO PM 3595 Apariencia Soacutelido beige Rendimiento 24
012
Descripcioacuten de Compuestos
132
3-[4-(4-fluorofenil)-36-dihidropiridin-1(2H)-il]-1-(4-
trifluorometilfenil)propan-1-ona
Procedimiento experimental
Seguacuten el meacutetodo general D a partir de 054 g (293 mmol) de 4-(4-fluorofenil)-
1236-tetrahidropiridina y 052 g (276 mmol) de 1-(4-trifluorometilfenil)
etanona se elimina el disolvente a presioacuten reducida y el aceite se purifica por
cromatografiacutea flash usando como fase moacutevil diclorometanometanol (991) Se
elimina el disolvente de las fracciones adecuadas a presioacuten reducida obteniendo
el compuesto puro
RMN-1H (DMSO-d6 400 MHz) δ (ppm) 284 (sa 2H H6 PIRD) 355 (t 2H H2
PIRD) 382 (t 4H CO-CH2 +CO-CH2-CH2) 406 (sa 2H H5 PIRD) 621 (sa 1H
H3 PIRD) 723 (t 2H H2+ H6 TFBZN J23= J65= 88 Hz) 756 (dd 2H H3acute+ H5acute
FENIL J3acute2acute= J5acute6acute= 87 Hz J3acute5acute= J5acute3acute= 54 Hz) 797 (d 2H H2acute+ H6acute FENIL J2acute3acute=
J6acute5acute= 83 Hz) 823 (d 2H H3+H5 TFBZN J32= J56= 86 Hz)
FM C21H19NF4O
PM 3774 Apariencia Aceite beige Rendimiento 13
013
Descripcioacuten de Compuestos
133
1-(2-naftil)-2-[4-(4-nitro-2-trifluorometilfenil)piperazin-1-il]etan-1-
ona
Procedimiento experimental
Seguacuten el meacutetodo general C a partir de 070 g (254 mmol) de 4-(4-nitro-2-
trifluorometilfenil) piperazina y 053 g (211 mmol) de 2-bromo-2acute-acetonaftona
Se elimina el disolvente a presioacuten reducida obteniendo un aceite que se purifica
por columna cromatograacutefica usando como fase moacutevil diclorometanometanol
(973) Se elimina el disolvente de las fracciones adecuadas a presioacuten reducida
obteniendo compuesto puro en forma soacutelida
Punto de fusioacuten 167-168ordmC
IR (cm-1) 2925-2873 (d C-H alifaacuteticos) 1669 (mf CO) 1499 y 1334 (mf NO2)
1281 y 1124 (m CF3)
RMN-1H (DMSO-d6 400 MHz) δ (ppm) 309 (sa 4H H2+H6 PIPZ) 336 (sa
4H H3+H5 PIPZ) 428 (sa 2H COCH2) 739 (d 1H H6acute FENIL J6acute5acute= 88 Hz)
760-765 (m 1H H6 NFT) 766-771 (m 1H H7 NFT) 792 (d 1H H3 NFT J34=
81 Hz) 794 (d 1H H5acute FENIL J5acute6acute= 89 Hz) 800 (d 1H H4 NFT J43= 81 Hz)
805 (dd 1H H5 NFT J56= 85 Hz J57= 12 Hz) 837 (dd 1H H8 NFT J87= 90
Hz J86= 19 Hz) 856 (sa 2H H2 NFT+ H3acute FENIL)
Anaacutelisis elemental (CHN)
HPLC (RP-18 1 mLmin metanol-agua (8020)) tr 69 min ʎmax 2477 nm
Calculado Hallado
C 6225 602
H 451 421
N 948 925
FM C23H20N3F3O3 PM 4434 Apariencia Soacutelido beige Rendimiento 13
014
Descripcioacuten de Compuestos
134
1-(2-naftil)-2-[4-(2-nitro-4-trifluorometilfenil)piperazin-1-il]etan-1-
ona
Procedimiento experimental
Seguacuten el meacutetodo general C a partir de 135 g (481 mmol) de 4-(2-nitro-4-
trifluorometilfenil) piperazina y 104 g (417 mmol) de 2-bromo-2acute-acetonaftona
Se elimina el disolvente a presioacuten reducida obteniendo un aceite que se
precipita con una mezcla de hexanoeacuteter etiacutelico en frio
Punto de Fusioacuten 105-106ordmC
IR (cm-1) 2943-2854 (d alifaacuteticos) 1686 (f CO) 1532 y 1329 (m NO2) 1295 y
1118 (m CF3)
RMN-1H (CDCl3 400 MHz) δ (ppm) 290 (t 4H H3+H5 PIPZ) 331 (t 4H
H2+H6 PIPZ) 410 (sa 2H CO-CH2) 721 (d 1H H6acute FENIL J6acute5acute= 86 Hz) 760
(dd 1H H7 NFT J78= 85 Hz J75= 84 Hz) 764 (dd 1H H4 NFT J43= 81 Hz
J45= 14 Hz) 769 (ddd 1H H6 NFT J65= 95 Hz J67= 84 Hz J68= 16 Hz) 791
(d 1H H5 NFT J56= 95 Hz) 794 (d 1H H8 NFT J87= 84 Hz) 800 (d 1H H3
NFT J34= 81 Hz) 806 (dd 1H H5acute FENIL J5acute6acute= 86 Hz J5acute3acute= 16 Hz) 809 (d
1H H3acute FENIL J3acute5acute= 16 Hz) 856 (sa 1H H1 NFT)
Anaacutelisis elemental (CHN)
Calculado Hallado
C 6230 6173
H 451 481
N 948 933
FM C23H20N3F3O3 PM 44340 Apariencia Soacutelido naranja Rendimiento 60
015
Descripcioacuten de Compuestos
135
1-(4-fluoronaftil)-3-[4-(4-nitro-2-trifluorometilfenil)piperazin-1-
il]propan-1-ona
Procedimiento experimental
Seguacuten el meacutetodo general D a partir de 063 g (229 mmol) de 4-(4-nitro-2-
trifluorometilfenil) piperazina y 056 g (299 mmol) de 4acute-fluoro-1acute-acetonaftona
comercial se elimina el disolvente a presioacuten reducida obteniendo un aceite que
se purifica por cromatografiacutea flash usando como fase moacutevil
diclorometanometanol (955) Se elimina el disolvente de las fracciones
adecuadas a presioacuten reducida obtenieacutendose el compuesto en forma de aceite
que se usa en su totalidad despueacutes de su identificacioacuten por CCF para la siacutentesis
del derivado hidroxiacutelico 5a
FM C24H21N3F4O3 PM 4754 Apariencia Aceite amarillo Rendimiento 53
016
Descripcioacuten de Compuestos
136
1-(4-fluoronaftil)-3-[4-(2-nitro-4-trifluorometilfenil) piperazin-1-il]
propan-1-ona
Procedimiento experimental
Seguacuten el meacutetodo general D partiendo de 144 g (523 mmol) de 4-(2-nitro-4-
trifluorometilfenil) piperazina y 098 g (522 mmol) de 4acute-fluoro-1acute-acetonaftona
comercial Despueacutes de extraer y eliminar a presioacuten reducida el disolvente se
obtiene un aceite que al antildeadir hexano friacuteo precipita el compuesto puro como
soacutelido fino
Punto de fusioacuten 106ndash107 ordmC
IR (cm-1) 2924-2854 (f C-H alifaacuteticos) 1675 (mf CO) 1531 y 1326 (m NO2)
1278 y 1123 (m CF3)
RMN-1H (DMSO 400 MHz) δ (ppm) 270 (sa 4H H3+H5 PIPZ) 304 (sa 2H
CO-CH2-CH2) 319 (sa 4H H2+H6 PIPZ) 335 (sa 2H CO-CH2) 717 (d 1H H6acute
FENIL J6acute5acute= 88 Hz) 720 (dd 1H H7 FNFT J78= 90 Hz J76= 80 Hz) 763 (ddd
1H H6 FNFT) 768 (dd 1H H5acute FENIL J5acute6acute= 88 Hz J5acute3acute= 16 Hz) 769 (dd 1H
H5 FNFT J56= 73 Hz J5F= 27 Hz) 794 (dd 1H H3 FNFT J32= 79 Hz J3F= 54
Hz) 807 (d 1H H3acute FENIL J3acute5acute= 15 Hz) 819 (d 1H H2 FNFT J23= 79 Hz)
873 (d 1H H8 FNFT J87= 90 Hz)
Anaacutelisis elemental (CHN)
HPLC (RP-18 1 mLmin metanol-agua (8020)) 243 min ʎmax= 2200 nm
Calculado Hallado
C 6063 6100
H 442 459
N 884 867
FM C24H21N3F4O3 PM 4754 Apariencia Soacutelido anaranjado Rendimiento 73
017
Descripcioacuten de Compuestos
137
1-(4-fluoronaft-1-il)-3-[4-(4-trifluorometilfenil)piperazin-1-
il]propan-1-ona
Procedimiento experimental
Seguacuten el meacutetodo general D a partir de 037 g (187 mmol) de 4-(4-
trifluorometilfenil) piperazina y 032 g (169 mmol) de 4acute-fluoro-1acute-acetonaftona
se elimina el disolvente a presioacuten reducida y precipita un soacutelido impuro con
hexanoeacuteter Se purifica por cromatografiacutea flash usando como fase moacutevil
diclorometanometanol (991) y se elimina el disolvente de las fracciones
adecuadas a presioacuten reducida obtenieacutendose el compuesto en forma de aceite
que despueacutes de su identificacioacuten por CCF se usa en su totalidad para la siacutentesis
del derivado hidroxiacutelico 5c
FM C24H22N2F4O PM 4305 Apariencia Aceite beige Rendimiento 23
018
Descripcioacuten de Compuestos
138
1-(4-fluoronaft-1-il)-3-[1-(4-nitro-2-trifluorometilfenil)piperidin-4-
ilamino]propan-1-ona
Procedimiento experimental
Seguacuten el meacutetodo general D a partir de 085 g (293 mmol) de 1-(4-nitro-2-
trifluorometilfenil)piperidin-4-il amina y 100 g (531 mmol) de 4acute-fluoro-1acute-
acetonaftona Se elimina el disolvente a presioacuten reducida y se purifica el aceite
impuro por cromatografiacutea flash usando como fase moacutevil
diclorometanometanol (991) Se elimina el disolvente de las fracciones
adecuadas a presioacuten reducida obtenieacutendose un soacutelido amarillo
IR (cm-1) 2950-2732 (d C-H alifaacuteticos) 1673 (mf CO) 1508 y 1334 (m NO2)
1284 y 1119 (m CF3)
RMN-1H (DMSO 400 MHz) δ (ppm) 180 (d 2H H3ax+ H5ax PIPR J3ax5ax=
J5ax3ax= 116 Hz) 224 (d 2H H3ec+H5ec PIPR J3ec5ec= J5ec3ec= 116 Hz) 300 (t 2H
CO-CH2-CH2 JCHCH= 118 Hz) 336-343 (m 5H H2+H4+H6 PIPR) 366 (t 2H
CO-CH2 JCHCH= 62 Hz) 753 (ddd 1H H3 FNFT J3F= 106 Hz J32= 85 Hz J35=
157 Hz) 760 (d 1H H6acute FENIL J6acute5acute= 89 Hz) 774 (ddd 1H H6 FNFT J65= 79
Hz J67= 69 Hz J68= 12 Hz) 779 (ddd 1H H7 FNFT J78= 85 Hz J76= 70 Hz
J75= 14 Hz) 818 (d 1H H2 FNFT J23= 81 Hz) 826 (dd 1H H5 FNFT J56= 74
Hz J5F= 56 Hz J57= 14 Hz) 840 (d 1H H3acute FENIL J3acute5acute= 24 Hz ) 844 (dd 1H
H5acute FENIL J5acute6acute= 87 Hz J5acute3acute= 26 Hz) 880 (d 1H H8 FNFT J87= 83 Hz)
FM C25H23N3F4O3 PM 4895 Apariencia Soacutelido amarillo Rendimiento 52
019
Descripcioacuten de Compuestos
139
1-(4-fluoronaft-1-il)-3-[4-(4-fluorofenil)-36-dihidropiridin-1(2H)-
il]propan-1-ona
Procedimiento experimental
Seguacuten el meacutetodo general D a partir de 143 g (669 mmol) de 4-(4-fluorofenil)-
1236-tetrahidropiridina y 097 g (518 mmol) de 4acute-fluoro-1acute-acetonaftona Se
elimina el disolvente a presioacuten reducida y el aceite se purifica por cromatografiacutea
flash usando como fase moacutevil diclorometanometanol (955) Se elimina el
disolvente de las fracciones adecuadas a presioacuten reducida obteniendo un soacutelido
puro
Punto de fusioacuten 127-128ordmC
IR (cm-1) 2536 (d C-H alifaacuteticos) 1672 (f CO)
RMN-1H (DMSO-d6 400 MHz) δ (ppm) 263 (s 2H H5 PIRD) 314-335 (m
6H H2+ H6 PIRD+ CO-CH2-CH2) 361 (s 2H CO-CH2) 616 (s 1H H3 PIRD)
719 (t 2H H3acute+ H5acute FENIL J3acute2acute= J6acute5acute= 89 Hz) 749 (d 1H H3 FNFT J32= 80
Hz) 751 (d 2H H2acute+H6acute FENIL J2acute3acute= J6acute5acute= 87 Hz) 773 (t 2H H6+H7 FNFT
J67= J76= 71 Hz) 815 (d 1H H5 FNFT J56= 75 Hz) 828 (dd 1H H2 FNFT J23=
78 Hz J2F= 43 Hz) 868 (d 1H H8 FNFT J87= 81 Hz)
FM C24H21NF2O
PM 3775 Apariencia Soacutelido blanco Rendimiento 44
020
Descripcioacuten de Compuestos
140
1-(4-fluorofenil)-3-[4-(4-nitro-2-trifluorometilfenil) piperazin-1-il]
propan-1-ona
Procedimiento experimental
Seguacuten el meacutetodo general D a partir de 026 g (093 mmol) de 4-(4-nitro-2-
trifluorometilfenil) piperazina y 025 g (180 mmol) de 1-(4-fluorofenil) etanona
se elimina el disolvente a presioacuten reducida obtenieacutendose un aceite que se
purifica por cromatografiacutea flash usando como fase moacutevil
diclorometanometanol (991) Se elimina el disolvente de las fracciones
adecuadas a presioacuten reducida obteniendo el compuesto en forma de aceite que
se usa en su totalidad despueacutes de su identificacioacuten por CCF para la siacutentesis del
derivado hidroxiacutelico 6a
FM C20H19N3F4O3 PM 4254 Apariencia Aceite amarillo Rendimiento 63
021
Descripcioacuten de Compuestos
141
1-(4-fluorofenil)-3-[1-(4-nitro-2-trifluorometilfenil)piperidin-4-il-
amino]propan-1-ona
Procedimiento experimental
Seguacuten el meacutetodo general D a partir de 025 g (853 mmol) de 1-(4-nitro-2-
trifluorometilfenil) piperidin-4-il amina y 022 g (160 mmol) de 1-(4-
fluorofenil)etanona Se elimina el disolvente a presioacuten reducida y se purifica el
aceite impuro por cromatografiacutea flash usando como fase moacutevil
diclorometanometanol (991) Se elimina el disolvente de las fracciones
adecuadas a presioacuten reducida obtenieacutendose un aceite
RMN-1H (DMSO-d6 400 MHz) δ (ppm) 250 (sa 1H H4 PIPR) 263-256 (m
4H H3+ H5 PIPR) 275 (t 2H CO-CH2-CH2) 314-309 (m 4H H2 +H6 PIPR)
324 (t 2H CO-CH2) 736 (t 2H H2 +H6 FBZN J23= J65=80 Hz) 754 (d 1H H6acute
FENIL J6acute5acute= 79 Hz) 808 (d 1H H5 FBZN J56= 79 Hz) 810 (d 1H H3 FBZN
J32= 76 Hz) 838 (s 1H H3acute FENIL) 839 (sa 1H H5acute FENIL)
FM C21H21N3F4O3 PM 4394 Apariencia Aceite amarillo Rendimiento 12
022
Descripcioacuten de Compuestos
142
1-(4-fluorofenil)-3-[4-(4-fluorofenil)-36-dihidropiridin-1(2H)-il]
propan-1-ona
Procedimiento experimental
Seguacuten el meacutetodo general D a partir de 050 g (288 mmol) de 4-(4-fluorofenil)-
1236-tetrahidropiridina y 034 g (245 mmol) de 1-(4-fluorofenil)etanona Se
elimina el disolvente a presioacuten reducida y el aceite se purifica por cromatografiacutea
flash usando como fase moacutevil diclorometanometanol (991) Se elimina el
disolvente de las fracciones adecuadas a presioacuten reducida obteniendo un aceite
amarillo
Despueacutes de identificar el compuesto por CCF debido al bajo rendimiento se usa
todo el aceite obtenido para la siacutentesis del derivado hidroxiacutelico 6g
FM C20H19NF2O
PM 32740 Apariencia Aceite amarillo Rendimiento 10
023
Descripcioacuten de Compuestos
143
X3 Siacutentesis de derivados hidroxiacutelicos
1-(benzo[b]tiofen-3-il)-3-[4-(4-nitro-2-
trifluorometilfenil)piperazin-1-il] propan-1-ol
Procedimiento experimental
Seguacuten el meacutetodo general E partiendo de 050 g (107 mmol) de 1-
(benzo[b]tiofen-3-il)-3-[4-(4-nitro-2-trifluorometilfenil)piperazin-1-il]propan-1-
ona se obtiene tras la eliminacioacuten del disolvente un soacutelido que se purifica por
columna cromatograacutefica de fase moacutevil diclorometanometanol (991) y se
obtiene el compuesto puro
Punto de fusioacuten 157ndash158 ordmC
IR (cm-1) 3365 (m OH) 2998-2830 (m C-H alifaacuteticos) 1524 y 1349 (mf NO2)
1282 y 1128 (f CF3)
RMN-1H (CDCl3 400 MHz) δ (ppm) 214-216 (m 2H CHOH-CH2) 277-287
(m 6H CHOH-CH2-CH2+H3+H5 PIPZ) 320-329 (m 4H H2 +H6 PIPZ) 538
(dd 1H CHOH) 733-742 (m 3H H6rsquo FENIL +H6+H5 BZT) 745 (s 1H H2
BZT) 782 (d 1H H4 BZT J45 = 84 Hz) 788 (d 1H H7 BZT J76= 80 Hz) 837
(dd 1H H5rsquo FENIL J5rsquo6rsquo = 92 Hz J5rsquo3rsquo = 28 Hz) 855 (d 1H H3rsquo FENIL)
Anaacutelisis elemental (CHN)
HPLC (RP-18 1 mLmin metanol-agua (8020)) 54 min ʎmax= 2281 nm
Calculado Hallado
C 5677 5701
H 473 485
N 903 853
FM C22H22N3F3O3S PM 4655 Apariencia Soacutelido amarillo Rendimiento 13
1a
Descripcioacuten de Compuestos
144
Hidrocloruro de 1-(benzo[b]tiofen-3-il)-3-[4-(2-nitro-4-
trifluorometilfenil)piperazin-1-il]propan-1-ol
Procedimiento experimental
Seguacuten el meacutetodo general E se parte de 041 g (082 mmol) de 1-(benzo[b]tiofen-
3-il)-3-[4-(2-nitro-4-trifluorometilfenil)piperazin-1-il]propan-1-ona Tras la
eliminacioacuten del disolvente se obtiene un aceite impuro que se purifica por
cromatografiacutea flash con diclorometanometanol (991) El aceite puro precipita
con eacuteter clorhiacutedrico como hidrocloruro
Punto de fusioacuten 176-178ordmC
IR (cm-1) 3185 (d OH) 2924-2851 (f C-H alifaacuteticos) 1509 y 1346 (mf NO2) 1279
y 1119 (f CF3)
RMN-1H (DMSO-d6 400 MHz) δ (ppm) 223ndash232 (m 2H CHOH-CH2) 317
(sa 2H CHOH-CH2-CH2) 335 (sa 2H H3ax+H5ax PIPZ) 349 (sa 4H
H2ax+H6ax+ H3ec+H5ec PIPZ) 359 (d 2H H2ec+H6ec PIPZ) 501 (m 1H CH-OH)
743ndash736 (m 2H H5+H6 BZT) 754 (d 1H H6acute FENIL J6acute5acute = 80 Hz) 764 (sa
1H H2 BZT) 794 (dd 1H H5acute FENIL J5acute6acute = 81 Hz J5acute3acute = 16 Hz) 798-801 (m
2H H7+ H4 BZT) 825 (sa 1H H3acute FENIL) 1111 (sa 1H HCl)
Anaacutelisis elemental (CHN)
HPLC (RP-18 1 mLmin metanol-agua (8020)) 433 min ʎmax= 2290 nm
Calculado Hallado
C 5264 5253
H 439 428
N 838 826
FM C22H22N3F3O3SHCl PM 502 Apariencia Soacutelido camel Rendimiento 16
1b
Descripcioacuten de Compuestos
145
Hidrocloruro de 1-(benzo[b]tiofen-3-il)-3-[4-(4-fluorofenil)-36-
dihidropiridin-1(2H)-il)propan-1-ol
Procedimiento experimental
Seguacuten el meacutetodo general E partiendo de 015 g (041 mmol) de 1-
(benzo[b]tiofen-3-il)-3-[4-(4-fluorofenil)-36-dihidropiridin-1(2H)-il] propan-1-
ona Despueacutes se elimina el disolvente y se obtiene un soacutelido impuro que se
purifica precipitando el hidrocloruro con eacuteter clorhiacutedrico
Punto fusioacuten 204-206ordmC
IR (cm-1) 3385 (d OH) 2924-2851 (f C-H alifaacuteticos)
RMN-1H (DMSO 400 MHz) δ (ppm) 229-30 (m 2H CHOH-CH2) 274- 281
(m 2H CHOH-CH2-CH2) 337-340 (m 2H H6 PIRD) 366-377 (m 3H
H2+H5ax PIRD) 40 (d 1H H5ec PIRD) 509 (sa 1H CHOH) 620 (s 1H H3
PIRD) 723 (d 2H H3rsquo+ H5rsquo FENIL J3acute2acute= J5acute6acute= 90 Hz) 738-74 (m 2H H2rsquo+ H6rsquo
FENIL) 750 (dd 2H H6+H5 BTF J65= J56= 80 Hz J54= J67= 71 Hz) 760 (s 1H
H2 BTF) 800 (dd 2H H4 +H7 BTF J45= J76= 70 Hz J6= J75= 18 Hz) 105 (sa
1H HCl)
Anaacutelisis elemental (CHN)
HPLC (RP-18 1 mLmin metanol-agua (8020)) tr 426 min ʎmax 2282 nm
Calculado Hallado
C 640 6389
H 551 575
N 339 325
FM C22H22NFOSHCl PM 4405 Apariencia Soacutelido blanco
Rendimiento 65
1g
Descripcioacuten de Compuestos
146
1-(5-fluorobenzo[b]tiofen-3-il)-3-[4-(4-nitro-2-
trifluorometilfenil)piperazin-1-il]propan-1-ol
Procedimiento experimental
Seguacuten el meacutetodo general E partiendo de 040 g (092 mmol) de 1-(5-
fluorobenzo[b]tiofen-3-il)-3-[4-(4-nitro-2-trifluorometilfenil)piperazin-1-
il]propan-1-ona Despueacutes de eliminar el disolvente se obtiene un soacutelido marroacuten
impuro que purificamos por cromatografiacutea flash en diclorometanometanol
(991)
Punto fusioacuten 140-142ordmC
IR (cm-1) 3426 (d OH) 2826 (d C-H alifaacuteticos) 1507 y 1329 (mf NO2) 1283 (mf
F-BZT)1240 y 1122 (f CF3)
RMN-1H (CDCl3 400 MHz) δ (ppm) 206-215 (m 2H CHOH-CH2) 274-283
(sa 3H H3ax+H5ax PIPZ+ CHOH-CH2-CH2) 292-386 (m 3H H3ec+H5ec PIPZ+
CHOH-CH2-CH2) 324 (t 4H H2+H6 PIPZ) 530 (dd 1H CHOH JCH-OH = 74
Hz JCH-CH = 39 Hz) 713 (dt 1H H6 FBZT J67 = 87 Hz J6F = 83 Hz J64 = 25
Hz) 735 (d 1H H6acute FENIL J6acute5acute= 90 Hz) 752 (dd 1H H4 FBZT J4F = 95 Hz J46
= 28 Hz) 751 (s 1H H2 FBZT) 780 (dd 1H H7 FBZT J76 = 88 Hz J7F = 49
Hz) 838 (dd 1H H5rsquo FENIL J5acute6acute = 89 Hz J5acute3acute = 27 Hz) 855 (d 1H H3rsquo FENIL
J3acute5acute = 27 Hz)
Anaacutelisis elemental (CHN)
HPLC (RP-18 1 mLmin metanol-agua (8020)) 554 min ʎmax= 2283 nm
Calculado Hallado
C 5446 5483
H 434 444
N 869 920
FM C22H21N3F4O3S PM 4835 Apariencia Soacutelido amarillo Rendimiento 21
2a
Descripcioacuten de Compuestos
147
Hidrocloruro de 1-(5-fluorobenzo[b]tiofen-3-il)-3-[4-(2-nitro-4-
trifluorometilfenil)piperazin-1-il]propan-1-ol
Procedimiento experimental
Seguacuten el meacutetodo general E partiendo de 031 g (086 mmol) de 1-(5-
fluorobenzo[b]tiofen-3-il)-3-[4-(2-nitro-4-trifluorometilfenil)piperazin-1-
il]propan-1-ona se obtiene tras la eliminacioacuten del disolvente un aceite impuro
que se purifica por cromatografiacutea flash con diclorometanometanol (991) El
aceite puro precipita como hidrocloruro con eacuteter clorhiacutedrico
Punto de fusioacuten 196-198ordmC
IR (cm-1) 3408 (d OH) 2968-2814 (d C-H alifaacuteticos) 1533 y 1329 (mf NO2)
1230 y 1112 (f CF3)
RMN-1H (DMSO-d6 400 MHz) δ (ppm) 206 (sa 2H CHOH-CH2) 292 (sa
4H H2+H6 PIPZ) 324 (sa 4H H3+H5 PIPZ) 37 (sa 2H CHOH-CH2-CH2) 50
(sa 1H CHOH) 726 (dt 1H H6 FBZT J6F = 91 Hz J67 = 88 Hz J64 = 22 Hz)
749 (d 1H H6acute FENIL J6acute5acute= 85 Hz) 772 (s 1H H2 FBZT) 777 (d 1H H4
FBZT J4F = 102 Hz) 790 (d 1H H5acute FENIL J5acute6acute = 84 Hz) 802 (dd 1H H7
FBZT J76 = 89 Hz J7F = 51 Hz ) 820 (s 1H H3acute FENIL)
Anaacutelisis elemental (CHN)
HPLC (RP-18 1 mLmin metanol-agua (8020)) 445 min ʎmax=2308 nm
Calculado Hallado
C 5081 5121
H 423 375
N 808 811
FM C22H21N3F4O3S HCl PM 5195 Apariencia Soacutelido amarillo Rendimiento 20
2b
Descripcioacuten de Compuestos
148
1-(5-fluorobenzo[b]tiofen-3-il)-3-[4-(4-
trifluorometilfenil)piperazin-1-il]propan-1-ol
Procedimiento experimental
Seguacuten el meacutetodo general E partiendo de 053 g de 1-(5-fluorobenzo[b]tiofen-3-
il)-3-[4-(4-trifluorometilfenil)piperazin-1-il]propan-1-ona se obtiene en la
eliminacioacuten del disolvente un aceite impuro que se purifica por cromatografiacutea
flash con diclorometanometanol (991)
Punto de fusioacuten 158-160ordmC
IR (cm-1) 2961-2831 (d C-H alifaacuteticos) 1248 y 1115 (f CF3)
RMN-1H (CDCl3 400 MHz) δ (ppm) 221 (sa 2H CHOH-CH2) 282 (sa 3H
H3ax+H5ax PIPZ +CHOH-CH2-CH2) 293-294 (m 3H H3ec+H5ec PIPZ + CHOH-
CH2-CH2) 345 (sa 4H H2+H6 PIPZ) 532 (dd 1H CHOH JCH-OH = 41 Hz JCH-
CH = 67 Hz) 696 (d 2H H6+H7 FBZT J67 = J76 = 84 Hz) 710-715 (m 1H H4
FBZT) 750-754 (m 4H H2acute+H3acute+H5acute+H6acute FENIL) 780 (sa 1H H2 FBZT)
Anaacutelisis elemental (CHN)
HPLC (RP-18 1 mLmin metanol-agua (8020)) tr 466 min ʎmax 2005 nm
Calculado Hallado
C 6027 5930
H 502 495
N 639 624
FM C22H22N2F4OS
PM 4385 Apariencia Soacutelido blanco Rendimiento 15
2c
Descripcioacuten de Compuestos
149
1-(5-fluorobenzo[b]tiofen-3-il)-3-[4-(4-nitro-2-trifluorometilfenil)-
14-diazepan-1-il]propan-1-ol
Procedimiento experimental
Seguacuten el meacutetodo general E partiendo de 039 g (080 mmol) de 1-(5-
fluorobenzo[b]tiofen-3-il)-3-[4-(4-nitro-2-trifluorometilfenil)-14-diazepan-1-
il]propan-1-ona se obtiene tras la eliminacioacuten del disolvente un aceite impuro
que se purifica por cromatografiacutea flash en diclorometanometanol (991)
Punto de fusioacuten 110-111ordmC
IR (cm-1) 3425 (m OH) 1500 y 1338 (mf NO2) 1280 (mf F-BZT)1257 y 1106 (f
CF3)
RMN-1H (CDCl3 400 MHz) δ (ppm) 208 (sa 4H CHOH-CH2+H6 DZP) 287-
293 (m 4H H2+H7 DZP) 298-299 (m 2H CHOH-CH2-CH2) 354 (sa 2H H5
DZP) 562 (sa 2H H3 DZP) 530 (t 1H CHOH JCH-OH = JCH-CH = 57 Hz) 712
(dd 1H H7 BZT J76= 88 Hz J7F= 24 Hz) 722 (d 1H H6acute FENIL J65acuteacute= 92 Hz)
750 (s 1H H2 FBZT) 751 (dd 1H H4 FBZT J4F= 98 Hz J46= 15 Hz) 780 (dd
1H H6 FBZT J67= 88 Hz J6F= 50 Hz) 828 (dd 1H H5acute FENIL J5acute6acute= 92 Hz
J5acute3acute= 27 Hz) 854 (s 1H H3acute FENIL)
Anaacutelisis elemental (CHN)
HPLC (RP-18 1 mLmin metanol-agua (8020)) 557 min ʎmax= 2308 nm
Calculado Hallado
C 5548 5515
H 462 464
N 844 826
FM C23H23N3O3F4S PM 4975 Apariencia Soacutelido amarillo Rendimiento 25
2d
Descripcioacuten de Compuestos
150
1-(5-fluorobenzo[b]tiofen-3-il)-3-[1-(4-nitro-2-
trifluorometilfenil)piperidin-4-il]amino propan-1-ol
Procedimiento experimental
Seguacuten el meacutetodo general E partiendo de 017 g (034 mmol) de 1-(5-
fluorobenzo[b]tiofen-3-il)-3-[1-(4-nitro-2-trifluorometilfenil)piperidin-4-
il]aminopropan-1-ona se obtiene tras la eliminacioacuten del disolvente un aceite
impuro que se purifica por cromatografiacutea flash en diclorometanometanol
(991)
Punto de fusioacuten 140-142ordmC
IR (cm-1) 3425 (m OH) 1498 y 1334 (mf NO2) 1283 (mf F-BTF)1283 y 1106 (f
CF3)
RMN-1H (CDCl3 400 MHz) δ (ppm) 156-171 (m 2H H3ax+H5ax PIPR) 195-
197 (m 2H CHOH-CH2) 211 (sa 2H H3ec+H5ec PIPR) 275 (sa 1H H4 PIPR)
295 (t 2H H2ax+H6ax PIPR J2ax2ec= J6ax6ec= 97 Hz) 313 (sa 2H CHOH-CH2-
CH2) 342 (d 2H H2ec+H6ec PIPR J2ec2ax= J6ec6ax= 90 Hz) 530 (d 1H CHOH JCH-
OH = 77 Hz) 712 (t 1H H6 FBZT J6F = J67 = 77 Hz) 729 (d 1H H6acute FENIL J6acute5acute=
86 Hz) 750 (dd 1H H4 FBZT J4F = 85 Hz J46 = 49 Hz) 752 (s 1H H2 FBZT)
779 (dd 1H H7 FBZT J76 = 82 Hz J7F = 31 Hz) 833 (dd 1H H5rsquo FENIL J5acute6acute =
85 Hz J5acute3acute = 18 Hz) 853 (sa 1H H3rsquo FENIL)
Anaacutelisis elemental (CHN)
HPLC (RP-18 1 mLmin metanol-agua (8020)) 443 min ʎmax= 2299 nm
Calculado Hallado
C 5548 5555
H 481 462
N 826 844
FM C23H23N3O3F4S PM 49751 Apariencia Soacutelido amarillo Rendimiento 37
2f
Descripcioacuten de Compuestos
151
Hidrocloruro de 1-(2-naftil)-3-[4-(4-nitro-2-
trifluorometilfenil)piperazin-1-il]propan-1-ol
Procedimiento experimental
Seguacuten el meacutetodo general E partiendo de 033 g (066 mmol) de 1-(2-naftil)-3-[4-
(4-nitro-2-trifluorometilfenil)piperazin-1-il]propan-1-ona tras la eliminacioacuten del
disolvente se obtiene un aceite que precipita en forma de hidrocloruro con eacuteter
saturado de HCl
Punto de fusioacuten 183-185ordmC
IR (cm-1) 3185 (d OH) 2924-2851 (f C-H alifaacuteticos) 1509 y 1346 (mf NO2) 1279
y 1119 (f CF3)
RMN-1H (DMSO-d6 400 MHz) δ (ppm) 214 (sa 2H CHOH-CH2) 317 (sa
2H CHOH-CH2-CH2) 329-335 (m 6H H3ax+ H5ax+ H2+H6 PIPZ) 360 (sa 2H
H3ec+ H5ec PIPZ) 483-485 (m 1H CHOH) 749-752 (m 3H H6rsquo FENIL + H6+H7
NFT) 764 (d 1H H3 NFT J34 = 91 Hz) 786 (sa 1H H1 NFT) 788-792 (m 3H
H4+H5+H8 NFT ) 841 (d 1H H3acute FENIL J3acute5acute = 21 Hz) 846 (dd 1H H5rsquo FENIL
J5rsquo6rsquo = 92 Hz J5rsquo3rsquo = 19 Hz)
Anaacutelisis elemental (CHN)
HPLC (RP-18 1 mLmin metanol-agua (8020)) 762 min ʎmax= 2236 nm
Calculado Hallado
C 5812 5770
H 484 520
N 847 801
FM C24H24N3F3O3HCl PM 5325 Apariencia Soacutelido amarillo Rendimiento 50
3a
Descripcioacuten de Compuestos
152
Hidrocloruro de 1-(2-naftil)-3-[4-(2-nitro-4-trifluorometilfenil)
piperazin-1-il] propan-1-ol
Procedimiento experimental
Seguacuten el meacutetodo general E partiendo de 036 g (083 mmol) de 1-(2-naftil)-3-[4-
(2-nitro-4-trifluorometilfenil)piperazin-1-il]propan-1-ona tras la eliminacioacuten del
disolvente se obtiene un aceite que precipita en forma de hidrocloruro con eacuteter
saturado de HCl
Punto de fusioacuten 165ndash166 ordmC
IR (cm-1) 3250 (m OH) 2927-2873 (d C-H alifaacuteticos) 1534 y 1327 (mf NO2)
1280 y 1123 (f CF3)
RMN-1H (DMSO-d6 400 MHz) δ (ppm) 219-222 (m 2H CHOH-CH2) 316
(sa 4H H3+H5 PIPZ) 348 (sa 4H H2+H6 PIPZ) 358 (d 2H CHOH-CH2-CH2)
484-487 (m 1H CHOH) 574 (sa 1H OH) 747-752 (m 2H H6acuteFENIL+H3
NFT) 754 (sa 1H H7 NFT) 756 (sa 1H H6 NFT) 788-795 (m 5H
H1+H4+H5+H8 NFT+H5acute FENIL) 825 (sa 1H H3acute FENIL) 1110 (sa 1H HCl)
Anaacutelisis elemental (CHN)
HPLC (RP-18 1 mLmin metanol-agua (8020)) 457 min ʎmax= 2220 nm
Calculado Hallado
C 5663 5682
H 469 458
N 821 813
FM C24H24N3F3O3HCl PM 4960 Apariencia Soacutelido camel Rendimiento 63
3b
Descripcioacuten de Compuestos
153
Hidrocloruro de 1-(2-naftil)-3-[3-(4-nitro-2-trifluorometilfenil)-
pirrolidin-3-ilamino]propan-1-ol
Procedimiento experimental
Seguacuten el meacutetodo general E partiendo de 025 g (0546 mmol) de 1-(2-naftil)-3-[3-
(4-nitro-2-trifluorometilfenil)pirrolidin-3-ilamino]propan-1-ona tras la
eliminacioacuten del disolvente se obtiene un aceite que se precipita en forma de
hidrocloruro con eacuteter saturado de HCl
Punto de fusioacuten 180-182ordmC
IR (cm-1) 3422 (m OH) 2951-2793 (d C-H alifaacuteticos) 1580 y 1327 (mf NO2)
1286 y 1122 (f CF3)
RMN-1H (DMSO-d6 400 MHz) δ (ppm) 207-214 (m 2H CHOH-CH2) 229-
231 (m 1H H4ax PIRR) 236-241 (m 1H H4ec PIRR) 311 (sa 2H CHOH-CH2-
CH2) 357-364 (m 1H H2ax PIRR) 375-379 (m 2H H5ax+ H2ec PIRR) 385-389
(m 1H H5ec PIRR) 397 (sa 1H H3 PIRR) 590 (sa 1H CHOH) 576 (s 1H
OH) 710 (d 1H H6rsquo FENIL J6rsquo5rsquo = 87 Hz) 747-755 (m 3H H3 + H6+ H7 NFT)
786 (sa 1H H1 NFT) 790-792 (m 3H H4+ H5+ H8 NFT) 824-890 (d 1H H5rsquo
FENIL J5rsquo6rsquo = 89 Hz) 840 (sa 1H H3rsquo FENIL) 949 (sa 1H NH)
Anaacutelisis elemental (CHN)
HPLC (RP-18 1 mLmin metanol-agua (8020)) 115 min ʎmax= 2238 nm
Calculado Hallado
C 5631 5650
H 492 523
N 821 821
FM C24H24N3F3O3HCl PM 4961 Apariencia Soacutelido anaranjado
Rendimiento 38
3e
Descripcioacuten de Compuestos
154
3-[4-(4-fluorofenil)-36-dihidropiridin-1(2H)-il]-1-(naftalen-2-
il)propan-1-ol
Procedimiento experimental
Seguir el meacutetodo general E partiendo de 030 g (084 mmol) de 3-[4-(4-
fluorofenil)-36-dihidropiridin-1(2H)-il)]-1-(naftalen-2-il)propan-1-ona se
obtiene tras la eliminacioacuten del disolvente un aceite impuro que puede
purificarse por cromatografiacutea flash en diclorometano-metanol (991)
Punto de fusioacuten 127-129ordmC
IR (cm-1) 3510 (d OH) 2833 (m C-H alifaacuteticos)
RMN-1H (CDCl3 400 MHz) δ (ppm) 199-212 (m 2H CHOH-CH2) 264 (s
2H H6 PIRD) 272-296 (m 4H H2+H5 PIRD) 331 (d 2H CHOH-CH2-CH2 JCH-
CH= 167 Hz) 517 (sa 1H CH-OH) 602 (s 1H H3 PIRD) 704 (t 2H H3acute+ H5acute
FENIL J3acute2acute= J5acute6acute= 87 Hz) 737 (dd 2H H2acute+ H6acute FENIL J2acute3acute= J6acute5acute= 87 Hz
J2acuteF= J6acuteF= 54 Hz) 745-750 (m 2H H6 + H7 NFT) 751 (dd 1H H8 NFT J87= 74
Hz J86=16 Hz) 785 (d 2H H3+ H4 NFT J34acute= J43acute=83 Hz) 787 (dd 1H H5
NFT J56= 78 Hz J57=23 Hz) 791 (s 1H H1 NFT)
Anaacutelisis elemental (CHN)
HPLC (RP-18 1 mLmin metanol-agua (8020)) tr 468 min ʎmax 2196 nm
Calculado Hallado
C 7783 7787
H 662 682
N 378 330
FM C24H24NFO PM 3615 Apariencia Soacutelido blanco Rendimiento 23
3g
Descripcioacuten de Compuestos
155
1-(2-naftil)-2-[4-(2-nitro-4-trifluorometilfenil)piperazin-1-il]etan-1-
ol
Procedimiento experimental
Seguacuten el meacutetodo general E partiendo de 038 g (086 mmol) de 1-(2-naftil)-2-[4-
(2-nitro-4-trifluorometilfenil)piperazin-1-il]propan-1-ona se obtiene tras la
eliminacioacuten del disolvente un aceite impuro que se puede purificar
precipitando el compuesto con hexano
Punto de fusioacuten 134ndash135 ordmC
IR (cm-1) 3408 (d OH) 2968-2814 (d C-H alifaacuteticos) 1533 y 1329 (mf NO2)
1230 y 1112 (f CF3)
RMN-1H (DMSO-d6 400 MHz) δ (ppm) 275-281 (m 4H H3+H5 PIPZ) 303
(sa 2H CHOH-CH2) 326-331 (m 2H H2+H6 PIPZ) 504 (dd 1H CHOH) 721
(d 1H H6acute FENIL J6acute5acute = 87 Hz) 749-752 (m 3H H3+H6+H7 NFT) 771 (dd
1H H5acute FENIL J5acute6acute = 87 Hz J5acute3acute = 19 Hz) 786 (sa 1H H1 NFT) 787 (dd 1H
H8 NFT J87 = 79 Hz J86 = 15 Hz) 788 (d 1H H4 NFT J43 = 55 Hz) 790 (sa
1H H5 NFT) 811 (d 1H H3acute FENIL J3acute5acute = 19 Hz)
Anaacutelisis elemental (CHN)
HPLC (RP-18 1 mLmin metanol-agua (8020)) 566 min ʎmax= 2228 nm
Calculado Hallado
C 6202 6226
H 494 512
N 944 914
FM C23H22N3F3O3 PM 4454 Apariencia Soacutelido amarillo Rendimiento 78
4b
Descripcioacuten de Compuestos
156
1-(4-fluoronaftil)-3-[4-(4-nitro-2-trifluorometilfenil)piperazin-1-
il]propan-1-ol
Procedimiento experimental
Seguacuten el meacutetodo general E partiendo de 053 g (107 mmol) de 1-(4-
fluoronaftil)-3-[4-(4-nitro-2-trifluorometilfenil)piperazin-1-il]propan-1-ona se
obtiene tras la eliminacioacuten del disolvente un aceite impuro que se purifica por
cromatografiacutea flash usando como fase moacutevil diclorometanometanol (991)
Punto de fusioacuten 183-184ordmC
IR (cm-1) 3447 (d OH) 2931-2836 (d C-H alifaacuteticos) 1513 y 1338 (f NO2) 1283
y 1119 (f CF3)
RMN-1H (CDCl3 400 MHz) δ (ppm) 206-214 (m 2H CHOH-CH2) 274-280
(m 3H H5 PIPZ+ CHOH-CH2-CH2) 288-294 (m 3H H3 PIPZ+ CHOH-CH2-
CH2) 327 (t 4H H2+H6 PIPZ J23= J65= 467 Hz) 571 (dd 1H CHOH JCH-CH =
81 Hz JCH-CH = 27 Hz) 718 (dd 1H H3 FNFT J3F = 102 Hz J32= 80 Hz) 735
(d 1H H6acute FENIL J6acute5acute = 89 Hz) 767-771 (m 2H H6+H7 FNFT) 769 (dd 1H
H2 FNFT J23 = 79 Hz J2F= 56 Hz) 804 (d 1H H8 FNFT J87 = 80 Hz) 817 (dd
1H H5 FNFT J56 = 76 Hz J5F = 21 Hz) 838 (dd 1H H5acute FENIL J5acute6acute = 89 Hz
J5acute3acute = 27 Hz) 855 (d 1H H3acute FENIL J3acute5acute = 27 Hz)
Anaacutelisis elemental (CHN)
HPLC (RP-18 1 mLmin metanol-agua (8020)) 703 min ʎmax= 2217 nm
Calculado Hallado
C 6038 6015
H 482 486
N 880 878
FM C24H23N3F4O3 PM 4775 Apariencia Cristales amarillos Rendimiento 51
5a
Descripcioacuten de Compuestos
157
1-(4-fluoronaftil)-3-[4-(2-nitro-4-trifluorometilfenil)piperazin-1-
il]propan-1-ol
Procedimiento experimental
Seguacuten el meacutetodo general E partiendo de 049 g (102 mmol) de 1-(4-
fluoronaftil)-3-[4-(2-nitro-4-trifluorometilfenil)piperazin-1-il]propan-1-ona se
obtiene tras la eliminacioacuten del disolvente un aceite impuro que se purifica al
lavarlo con hexano
Punto de fusioacuten 147ndash148 ordmC
IR (cm-1) 3430 (m OH) 2957-2835 (d C-H alifaacuteticos) 1533 y 1330 (mf NO2)
1278 y 1125 (f CF3)
RMN-1H (DMSO-d6 400 MHz) δ (ppm) 208-218 (m 2H CHOH-CH2) 283
(sa 3H H5 PIPZ+ CHOH-CH2-CH2) 295 (sa 3H H3 PIPZ+ CHOH-CH2-CH2)
332 (sa 4H H2+H6 PIPZ) 571 (dd 1H CHOH) 718 (dd 1H H3 FNFT J3F =
102 Hz J32 = 81 Hz) 723 (d 1H H6acute FENIL J6acute5acute = 87 Hz) 754-762 (m 2H
H6+H7 FNFT) 768 (dd 1H H2 FNFT J23 = 80 Hz J2F = 56 Hz) 774 (dd 1H
H5acute FENIL J5acute6acute = 87 Hz J5acute3acute = 19 Hz) 805 (dd 1H H5 FNFT J56 = 82 Hz J5F =
17 Hz) 811 (d 1H H3acute FENIL J3acute5acute = 19 Hz) 817 (dd 1H H8 FNFT J87 = 86
Hz J86 = 29 Hz)
Anaacutelisis elemental (CHN)
HPLC (RP-18 1 mLmin metanol-agua (8020)) 556 min ʎmax= 2222 nm
Calculado Hallado
C 6038 6012
H 482 505
N 881 862
FM C24H23N3F4O3 PM 4775 Apariencia Soacutelido amarillo Rendimiento 90
5b
Descripcioacuten de Compuestos
158
Hidrocloruro de 1-(4-fluoronaft-1-il)-3-[4-(4-trifluorometilfenil)
piperidin-1-il] propan-1-ol
Procedimiento experimental
Seguacuten el meacutetodo general E partiendo de 010 g de 1-(4-fluoronaftalen-1-il)-3-[1-
(4-trifluorometilfenilpiperidin-4-il)amino]propan-1-ona se obtiene tras la
eliminacioacuten del disolvente un aceite impuro que se purifica por cromatografiacutea
flash en diclorometanometanol (991) y se precipita como hidrocloruro con
eacuteter saturado de HCl
Punto de fusioacuten 174-175ordmC
IR (cm-1) 3436 (m OH) 2983 (d C-H alifaacuteticos) 2396 (d HCl) 1333 (f N-C)
1118 (mf CF3)
RMN-1H (DMSO-d6 400 MHz) δ (ppm) 221 (d 2H CHOH-CH2) 320-360
(m 6H CHOH-CH2-CH2+ H3+H5 PIPZ) 355 (sa 2H H2ax+H6ax PIPZ) 397 (sa
2H H2ec+H6ec PIPZ) 541 (d 1H CH-OH JCH-CH=75 Hz) 590 (sa 1H OH) 713
(d 2H H6acute+H2acute FENIL J6acute5acute= J2acute3acuteacute= 81 Hz) 736 (dd 1H H3 FNFT J32= 82 Hz
J3F= 97 Hz) 756 (d 2H H6+H7 FNFT J67= J76acute= 84 Hz) 767 (sa 3H H2
FNFT+H3acute+H5acute FENIL) 810 (d 1H H5 FNFT J56 = 66 Hz) 829 (d 1H H8
FNFT J87= 88 Hz) 1112 (sa 1H HCl)
Anaacutelisis elemental (CHN)
HPLC (RP-18 1 mLmin metanol-agua (8020)) 850 min ʎmax= 2266 nm
Calculado Hallado
C 6147 6135
H 539 482
N 598 596
FM C24H24N2F4OHCl PM 4690 Apariencia Soacutelido blanco Rendimiento 45
5c
Descripcioacuten de Compuestos
159
1-(4-fluoronaft-1-il)-3-[1-(4-nitro-2-trifluorometilfenilpiperidin-4-
il)amino]propan-1-ol
Procedimiento experimental
Seguacuten el meacutetodo general E partiendo de 04106 g (084 mmol) de 1-(4-
fluoronaft-1-il)-3-[1-(4-nitro-2-trifluorometilfenilpiperidin-4-il)amino] propan-1-
ona se obtiene tras la eliminacioacuten del disolvente un aceite impuro que se
purifica por cromatografiacutea flash en diclorometanometanol (991)
Punto de fusioacuten 93-95ordmC
IR (cm-1) 3352 (m OH) 1524 y 1318 (mf NO2) 1280 y 1171 (f CF3)
RMN-1H (CDCl3 400 MHz) δ (ppm) 168-183 (m 2H H3ax+ H5ax PIPR) 186-
201 (m 2H CHOH-CH2) 215-223 (m 2H H3ec+H5ec PIPR) 212 (d 1H CH-
OH JCH-CH= 127 Hz) 275-284 (m 1H H4 PIPR) 298 (t 2H H2ax+ H6ax PIPR
J2ax2ec = J6ax6ec = 115 Hz) 300-303 (m 1H CHOH-CH2-CH2) 308-315 (m 1H
CHOH-CH2-CH2) 342 (d 2H H2ec+H6ec PIPR) 571 (dd 1H CHOH JCHCH =
82 Hz JCH-CH2 = 23 Hz) 717 (dd 1H H3 FNFT J3F = 102 Hz J32 = 81 Hz)
727-730 (m 1H H6acute FENIL) 753-761 (m 2H H6+H7 FNFT) 767-772 (m 1H
H2 FNFT) 804 (d 1H H8 FNFT J87 = 78 Hz) 816 (dd 1H H5 FNFT J56 =72 Hz
J5F = 33 Hz ) 833 (dd 1H H5acute FENIL J5acute6acute = 90 Hz J5acute3acute = 27 Hz ) 853 (d 1H
H3acute FENIL J3acute5acute = 27 Hz)
Anaacutelisis elemental (CHN)
HPLC (RP-18 1 mLmin metanol-agua (8020)) tr 464 min ʎmax 2230 nm
Calculado Hallado
C 6111 6077
H 543 543
N 855 830
FM C25H25N3O3F4 PM 4910 Apariencia Soacutelido amarillo Rendimiento 90
5f
Descripcioacuten de Compuestos
160
1-(4-fluoronaftalen-1-il)-3-[4-(4-fluorofenil)-36-dihidropiridin-
1(2H)-il]propan-1-ol
Procedimiento experimental
Seguacuten el meacutetodo general E partiendo de 043 g (114 mmol) de 1-(4-
fluoronaftalen-1-il)-3-[4-(4-fluorofenil)-36-dihidropiridin-1(2H)-il]propan-1-
ona se obtiene tras la eliminacioacuten del disolvente un soacutelido blanco que precipita
con hexanoeacuteter
Punto de fusioacuten 162-163ordmC
IR (cm-1) 2828 (d C-H alifaacuteticos) 1509 (f F-BZN) 1227 (mf F-NFT)
RMN-1H (DMSO-d6 400 MHz) δ (ppm) 214-220 (m 2H CHOH-CH2) 273
(sa 2H H6 PIRD) 284-312 (m 4H CHOH-CH2-CH2+H5 PIRD) 341 (d 1H
H2ax PIRD J2ax 2ec=164 Hz) 347 (d 1H H2ec PIRD J2ec2ax=161 Hz) 574 (sa 1H
CHOH) 600-605 (m 1H H3 PIRD) 700-708 (m 2H H2acute+H6acute FENIL) 718 (dd
1H H3 FNFT J3F= 102 Hz J32 = 81 Hz) 735-740 (m 2H H6+H7 FNFT) 754-
761 (m 2H H5acute+H3acute FENIL) 770 (dd 1H H2 FNFT J23= 80 Hz J2F = 56 Hz)
807 (d 1H H5 FNFT J56 = 82 Hz) 82 (dd 1H H8 FNFT J87= 70 Hz J86 = 25
Hz)
Anaacutelisis elemental (CHN)
Calculado Hallado
C 7595 7525
H 606 645
N 369 350
FM C24H23NF2O PM 3792 Apariencia Soacutelido blanco Rendimiento 82
5g
Descripcioacuten de Compuestos
161
Hidrocloruro de 1-(4-fluorofenil)-3-[4-(4-nitro-2-
trifluorometilfenilpiperazin-1-il]propan-1-ol
Procedimiento experimental
Seguacuten el meacutetodo general E partiendo de 036 g (107 mmol) de 1-(4-fluorofenil)-
3-[4-(4-nitro-2-trifluorometilfenil)piperazin-1-il]propan-1-ona se obtiene tras la
eliminacioacuten del disolvente un aceite impuro que se precipita con hexanoeacuteter
El soacutelido que se obtiene se lava con eacuteter saturado de HCl
Punto de fusioacuten 163-165ordmC
IR (cm-1) 3348 (m OH) 2928-2848 (d C-H alifaacuteticos) 1519 y 1352 (f NO2) 1284
y 1120 (f CF3)
RMN-1H (DMSO-d6 400 MHz) δ (ppm) 209 (sa 2H CHOH-CH2) 315-320
(m 4H H3+H5 PIPZ) 335-344 (m 4H H2+H6 PIPZ) 360 (sa 2H CHOH-CH2-
CH2) 469 (s 1H CHOH) 565 (s 1H OH) 718 (t 2H H3+H5 FBZN J32 = J56=
81 Hz) 742 (dd 2H H2+H6 FBZN J23 = J65= 80 Hz J2Facute= J6F= 66 Hz) 764 (d
1H H6acute FENIL J6acute5acute = 90 Hz) 842 (s 1H H3acute FENIL) 847 (d 1H H5acute FENIL
J5acute6acute = 88 Hz) 1120 (sa 1H HCl)
Anaacutelisis elemental (CHN)
HPLC (RP-18 1 mLmin metanol-agua (8020)) tr 206 min ʎmax 2011 nm
Calculado Hallado
C 4984 4950
H 477 476
N 872 863
FM C20H21N3F4O3HCl PM 4659 Apariencia Soacutelido amarillo Rendimiento 20
6a
Descripcioacuten de Compuestos
162
Hidrocloruro de 1-(4-fluorofenil)-3-[1-(4-nitro-2-
trifluorometilfenil)piperidin-4-il)amino]propan-1-ol
Procedimiento experimental
Seguacuten el meacutetodo general E partiendo de 010 g (021 mmol) de 1-(4-fluorofenil)-
3-[1-(4-nitro-2-trifluorometilfenilpiperidin-4-il)amino]propan-1-ona se obtiene
en la eliminacioacuten del disolvente un aceite impuro que se purifica como
hidrocloruro lavando con eacuteter saturado de HCl
Punto de fusioacuten 185-187ordmC
IR (cm-1) 3425 1498 y 1334 (mf NO2) 1283 (mf F BZN)1283 y 1106 (f CF3)
RMN-1H (DMSO-d6 400 MHz) δ (ppm) 138 (sa 2H H3ax+ H5ax PIPR) 170
(sa 2H H3ec+H5ec PIPD) 190 (d 2H CHOH-CH2 JCH-CH= 110 Hz) 258 (sa 1H
H4 PIPR) 263-264 (m 2H H2ax+ H6ax PIPR) 295 (t 2H H2ec+H6ec PIPR J2ec2ax =
J6ec6ax = 121 Hz) 320-330 (m 2H CHOH-CH2-CH2) 469 (t 1H CHOH JCHOH-
CHCH = 90 Hz) 713 (t 2H H3+H5 FBZN J32 = J56= 81 Hz) 736 (sa 2H H2+H6
FBZN) 750 (d 1H H6acute FENIL J6acute5acute = 80 Hz) 837 (sa 2H H3acute+H5acute FENIL)
Anaacutelisis elemental (CHN)
HPLC (RP-18 1 mLmin metanol-agua (8020)) tr 1977 min ʎmax 2011 nm
Calculado Hallado
C 5251 5213
H 503 491
N 880 849
FM C21H23N3F4O3HCl PM 4799 Apariencia Soacutelido amarillo Rendimiento 11
6f
Descripcioacuten de Compuestos
163
1-(4-fluorofenil)-3-[4-(4-fluorofenil)-36-dihidropiridin-1(2H)-
il]propan-1-ol
Procedimiento experimental
Seguir el meacutetodo general E partiendo de 090 g (027 mmol) de 1-(4-fluorofenil)-
3-(4-(4-fluorofenil)-56-dihidropiridin-1(2H)-il)propan-1-ona y se obtiene tras la
eliminacioacuten del disolvente un aceite impuro que se purifica por cromatografiacutea
flash en diclorometanometanol (991) El soacutelido obtenido se recristaliza de
hexano para su total purificacioacuten
Punto de fusioacuten 199-201ordmC
RMN-1H (DMSO-d6 400 MHz) δ (ppm) 176-180 (m 2H CHOH-CH2) 245
(sa 4H CHOH-CH2-CH2+H5 PIRD) 257-262 (m 2H H6 PIRD) 306 (sa 2H
H2 PIRD) 466 (t 1H CHOH JCH-OH=63 Hz) 549 (sa 1H OH) 612 (sa 1H H3
PIRD) 714 (dd 4H H3acute+H5acute FENIL+ H3+H5 FBZN J3acuteF= J5acuteF= J3F= J5F = 126 Hz
J3acute2acute= J5acute6acute= J32= J56 = 80 Hz) 737 (dd 2H H2+H6 FBZN J23= J65= 79 Hz J2F=
J6F= 60 Hz) 746 (dd 2H H2acute+H6acute FENIL J2acute3acute= J6acute5acute= 77 Hz J2acuteF= J6acuteF= 55 Hz)
Anaacutelisis elemental (CHN)
Calculado Hallado
C 7242 7196
H 634 633
N 422 403
FM C20H21NF2O PM 3314 Apariencia Soacutelido blanco Rendimiento 2
6g
Descripcioacuten de Compuestos
164
3-[4-(4-fluorofenil)-36-dihidropiridin-1(2H)-il]-1-(4-
trifluorometilfenil)propan-1-ol
Procedimiento experimental
Seguacuten el meacutetodo general E partiendo de 013 g (034 mmol) de 1-(4-
fluoronaftalen-1-il)-3-[1-(4-nitro-2-trifluorometilfenilpiperidin-4-
il)amino]propan-1-ona se obtiene tras la eliminacioacuten del disolvente se obtiene
un soacutelido blanco que se lava con hexano eacuteter y se recristaliza de hexano
Punto de fusioacuten 116-117ordmC
IR (cm-1) 2912- 2761 (C-H alifaacuteticos) 1511 (f F) 1328 y 1127 (f CF3)
RMN-1H (DMSO-d6 400 MHz) δ (ppm) 181 (dd 2H CHOH-CH2 JCH-CH=
137 Hz JCH-CHOH= 73 HZ) 245-250 (m 4H CHOH-CH2-CH2+H5 PIRD) 262 (t
2H H6 PIRD JCH-CH= JCH-CH=55 Hz) 308 (s 2H H2 PIRD) 475-480 (m 1H
CHOH) 570 (sa 1H OH) 612 (s 1H H3 PIRD) 715 (t 2H H5acute+H3acute FENIL
J5acuteF=J3acuteF= 88 Hz J5acute6acute= J3acute2acute =88 Hz) 747 (dd 2H H6acute+H2acute FENIL J6acute5acute=J2acute3acute= 84
Hz J6acuteF= J2acuteF =56 Hz) 757 (d 2H H2+H6 TFBZN J23acute=J65= 79 Hz) 768 (d 2H
H3+H5 TFBZN J32acute=J56= 81 Hz)
Anaacutelisis elemental (CHN)
HPLC (RP-18 1 mLmin metanol-agua (8020)) tr 1027 min ʎmax 2418 nm
Calculado Hallado
C 6649 6601
H 554 567
N 370 381
FM C21H21NF4O
PM 379 Apariencia Agujas blancas Rendimiento 40
7g
Descripcioacuten de Compuestos
165
X4 Siacutentesis de Oximas (Serie 8)
1-(naftalen-2-il)-3-[4-(2-nitro-4-trifluorometilfenil)piperazin-1-
il]propan-1-oxima
Procedimiento experimental
Seguacuten el meacutetodo general F partiendo de 023 g (050 mmol) de 1-(2-naftil)-3-[4-
(2-nitro-4-trifluorometilfenil)piperazin-1-il]propan-1-ona se obtiene tras la
eliminacioacuten del disolvente un aceite impuro que se purifica por columna
cromatograacutefica con diclorometanometanol (973)
Punto de fusioacuten 185-187 ordmC
IR (cm-1) 1560 y 1328 (mf NO2) 1283 y 1120 (f CF3)
RMN-1H (DMSO-d6 400 MHz) δ (ppm) 254-264 (m 6H CNOH-CH2-
CH2+H3+H5 PIPZ) 303-309 (m 2H CNOH-CH2) 311-317 (m 4H H2+H6
PIPZ) 743 (d 1H H6acuteFENIL J6acute5acute= 88 Hz) 751-756 (m 2H H6+H7 NFT) 784
(dd 1H H5acute FENIL J5acute6acuteacute= 88 Hz J5acute3acuteacute= 17 Hz) 788-793 (m 3H H4+H5+H8
NFT) 798-802 (m 1H H3 NFT) 814 (sa 2H H1 NFT+H3acute FENIL) 1140 (sa
1H OH)
Anaacutelisis elemental (CHN)
HPLC (RP-18 1 mLmin metanol-agua (8020)) tr 464 min ʎmax 2391 nm
Calculado Hallado
C 6102 6114
H 487 521
N 1186 1163
FM C24H23N4F3O3 PM 4720 Apariencia Soacutelido camel Rendimiento 54
81
Descripcioacuten de Compuestos
166
1-(2-naftil)-3-[3-(4-nitro-2-trifluorometilfenil)pirrolidin-3-
ilamino]propan-1-oxima
Procedimiento experimental
Seguir el meacutetodo general F partiendo de 0350 g (0769 mmol) de 1-(2-naftil)-3-
[3-(4-nitro-2-trifluorometilfenil)pirrolidin-3-ilamino]propan-1-ona se obtiene
tras la eliminacioacuten del disolvente un soacutelido anaranjado que se lava con
diclorometano y eacuteter etiacutelico obtenieacutendose el compuesto puro
Punto de fusioacuten 129 - 130ordfC
IR (cm-1) 3441 (d OH) 2951-2834 (d C-H alifaacuteticos) 1503 y 1323 (mf NO2)
1285 y 1112 (f CF3)
RMN-1H (DMSO-d6 400 MHz) δ (ppm) 178-185 (m 1H H4ax PIRR) 202-209
(m 1H H4ec PIRR) 221 (sa 1H -NH-) 270-282 (m 2H CNOH-CH2-CH2) 300
(t 2H CNOH-CH2) 325 (dd 1H H3 PIRR) 343-351 (m 2H H2ax+ H2ec PIRR)
358-361 (m 2H H5 PIRR) 697 (d 1H H6acute FENIL J6acute5acute = 96 Hz) 751 (d 1H
H5 NFT J56 = 61 Hz) 752 (d 1H H8 NFT J87 = 61 Hz) 786 (sa 2H H3+H4
NFT) 788-794 (m 2H H6+H7 NFT) 813 (sa 1H H1 NFT) 815 (dd 1H H5acute
FENIL J5acute6acute = 94 Hz J5acute3acute = 27 Hz) 835 (d 1H H3acute FENIL J3acute5acute = 27 Hz)
Anaacutelisis elemental (CHN)
HPLC (RP-18 1 mLmin metanol-agua (8020)) 365 min ʎmax= 2360 nm
Calculado Hallado
C 5987 5954
H 502 474
N 1164 1157
FM C24H23N4O3F3 PM 472 Apariencia Soacutelido amarillo Rendimiento 45
82
Descripcioacuten de Compuestos
167
X5 Purificacioacuten de compuestos por cromatografiacutea flash
La cromatografiacutea flash ha sido utilizada como meacutetodo de purificacioacuten de
muchos de los compuestos de este trabajo Las condiciones elegidas para la
purificacioacuten han sido
- Fase Estacionaria Columnas de Siacutelica gel Rf RediSepreg de tamantildeo de
partiacutecula entre 35 y 70 micras y tamantildeo de poro 60 Aring
- Fase Moacutevil Diclorometanometanol de flujo isocraacutetico linear (Figuras 51 y
52) con un volumen de equilibrado de 20 mL
- Longitud de onda de deteccioacuten 254 nm en todas las muestras y 365 nm en
los compuestos que contienen el grupo naftaleno
- Tipo de muestra Liacutequidas cuando no
son muy complejas y soacutelidas cuando se
trata de purificacioacuten de mezclas
complejas e hidrocloruros
Figura 51 Informe graacutefico de la purificacioacuten compuesto 023
Figura 52 Informe graacutefico de la purificacioacuten compuesto 5f
De los 47 compuestos sintetizados 23 han sido purificados mediante
cromatografiacutea flash Este meacutetodo ha supuesto una mejora y simplificacioacuten del
proceso de siacutentesis asiacute como un ahorro de costes por la reduccioacuten de tiempos
solventes y residuos La purificacioacuten del resto ha sido realizada por
precipitacioacuten como hidrocloruros lavado del compuesto con hexanoeacuteter o
recristalizacioacuten con hexano
Tabla 3
Condiciones de trabajo empleadas en la figuras 51 y 52
Tiempo (min)
Metanol (B)
Teacutecnica de flujo
Compuesto 023
10 00 Isocraacutetico
1 25 Linear
15 25 Isocratico
1 5 Linear
30 5 isocraacutetico
Compuesto 5f
5 0 Isocraacutetico
1 25 Linear
15 25 Isocratico
1 5 Linear
30 5 isocraacutetico
Descripcioacuten de Compuestos
168
X6 Elucidacioacuten estructural de compuestos por RMN
Todos los compuestos sintetizados han sido identificados a traveacutes de teacutecnicas
de CCF IR y RMN-1H Los compuestos finales han sido caracterizados ademaacutes
mediante anaacutelisis elemental de CHN De este modo se ha podido determinar
inequiacutevocamente las estructuras orgaacutenicas de las moleacuteculas obtenidas y formar
un ldquoficha de identidadrdquo de cada compuesto
X61 Elucidacioacuten estructural para los derivados de piperazina
En el caso de que las teacutecnicas anteriores fueran insuficientes para la
caracterizacioacuten exacta de la moleacutecula se han empleado teacutecnicas
complementarias de RMN como RMN-13C 2D 1H-1H COSY y 2D HMQC Este
ha sido el caso del compuesto 5a (figura 53)
Figura 53 Estructura molecular del compuesto 5a ejemplo escogido para un anaacutelisis maacutes exhaustivo mediante experimentos de RMN
La espectroscopia de RMN revela el nuacutemero de hidroacutegenos o carbonos de la
moleacutecula y su posible posicioacuten A traveacutes de los distintos experimentos esta
teacutecnica permite identificar y asignar los distintos protones y carbonos presentes
en la moleacutecula mediante el anaacutelisis de los desplazamientos y multiplicidades
que muestra cada uno de ellos
Figura 54 RMN-1H del compuesto 5a
Descripcioacuten de Compuestos
169
Zona alifaacutetica
En la zona de hidroacutegenos alifaacuteticos se observan cuatro sentildeales
Figura 55 Regioacuten alifaacutetica de la RMN-1H
Los hidroacutegenos alifaacuteticos aparecen a desplazamientos bajos porque estaacuten
muy apantallados
El C1 es un carbono terciario y por tanto tiene un hidroacutegeno muy
desapantallado por el efecto del grupo OH dando una sentildeal a altos ppm como
queda sentildealada en naranja en la figura 55 Esta asignacioacuten facilita el poder
asociar los picos sentildealados en morado (Figura 55) con el metileno vecino C2 ya
que aparece a bajos ppm debido a su aumentado caraacutecter alifaacutetico El multiplete
obtenido integrado por dos hidroacutegenos aparece a 210 ppm Mediante el
espectro COSY (Figura 56) se puede comprobar siguiendo el trazado naranja
coacutemo siendo la sentildeal de CHOH la de 571 ppm se acopla con ella uacutenicamente la
de su vecino CHOH-CH2
Los hidroacutegenos pertenecientes al ciclo de piperazina se diferencian entre siacute por
el desplazamiento de las sentildeales seguacuten esteacuten maacutes o menos cercanos al grupo
fenilo Asiacute los protones H3p y H5p son los que aparecen a menores ppm A 277
ppm y a 291 ppm aparecen dos multipletes (sentildealados con azul en la figura 55)
que integran a tres hidroacutegenos cada uno lo cual resulta extrantildeo ya que en la
moleacutecula no hay ninguacuten CH3 Esto se debe a la diastereotopiacutea del carbono
hidroxiacutelico que hace que los 4 hidroacutegenos salgan divididos en dos sentildeales que
integran a dos hidroacutegenos cada una y a ambas se les suma uno de los
hidroacutegenos del C3 alifaacutetico Esto hace que aparezcan dos sentildeales que integran a
tres hidroacutegenos correspondientes a 2H3p 2H5p y los dos hidroacutegenos alifaacuteticos
Descripcioacuten de Compuestos
170
de C3 Si se siguen ahora las
liacuteneas moradas de la figura
55 se corrobora la
informacioacuten de que los
protones del C3 salen unidos
a las sentildeales de los protones
de H3 y H5 porque hay un
acoplamiento entre el C2 y
esas sentildeales
Figura 56 Espectro COSY Acoplamientos entre metilenos
Por uacuteltimo a 327 ppm se encuentra la sentildeal marcada con verde (figura 55)
correspondiente a 2H2 y 2H6 que integra por cuatro hidroacutegenos y aparece como
triplete debido a los acoplamientos con 2H3 y 2H5
Zona aromaacutetica
En esta moleacutecula se encuentran 9 hidroacutegenos aromaacuteticos no equivalentes lo
que dificulta la asignacioacuten de las sentildeales Como en el apartado anterior se
recurriraacute para estudiar los acoplamientos protoacuten-protoacuten y protoacuten-carbono a la
resonancia magneacutetica nuclear en dos dimensiones con el fin de asignar
inequiacutevocamente cada sentildeal
Figura 57 Resonancia magneacutetica nuclear de protoacuten de la zona aromaacutetica de la moleacutecula 5a
La dificultad de la asignacioacuten en esta moleacutecula se ve aumentada por la
presencia de un aacutetomo de fluacuteor en la parte del naftaleno En el espectro de
Descripcioacuten de Compuestos
171
RMN-1H el aacutetomo de fluacuteor no produce sentildeal pero siacute acoplamientos con los
hidroacutegenos vecinos obtenieacutendose constantes de acoplamiento (J) bastantes altas
y sentildeales desdobladas no esperadas en protones de su entorno
En la figura 57 lo primero que se observa son los altos desplazamientos de los
hidroacutegenos aromaacuteticos debido al menor apantallamiento de estos por su
naturaleza aromaacutetica
Teoacutericamente el espectro deberiacutea tener un singlete claro perteneciente a H3acute
pero no se encuentra ninguno en la figura 57 Asiacute que se puede pensar en un
desdoblamiento de la sentildeal por acoplamiento deacutebil a larga distancia con el H5acute
lo que mostrariacutea un doblete con acoplamiento muy bajo
En el espectro se encuentran tres dobletes sencillos Con las constantes de
acoplamiento a 850 ppm se ve este doblete que integra por uno y que tiene
una J = 27 Hz El otro doblete se encuentra a 804 ppm con una J = 80 Hz y el
maacutes bajo estaacute en 735 ppm con una J = 89 Hz Por el razonamiento inicial la
sentildeal a 850 ppm es la que deberiacutea asociarse con un acoplamiento a larga
distancia y por tanto con H3acute Esta informacioacuten puede ser contrastada con el
COSY
En el espectro bidimensional COSY se ha marcado en rojo el uacutenico
acoplamiento de H3acute que solo
pueda asociarse con la sentildeal
de H5acute Por tanto el doble
doblete a 838 ppm sentildealado
en la figura 56 de azul se
corresponde con H5acute
(informacioacuten verificada por
su constante de acoplamiento
menor J = 27Hz igual a la de
H3acute)
Figura 58 Espectro COSY de la zona aromaacutetica de la moleacutecula
Si ahora se sigue la liacutenea azul de la figura 58 donde se sentildealan los
acoplamientos de H5acute se puede ver un acoplamiento mayor con su uacutenico
hidroacutegeno vecino H6acute Asiacute tambieacuten queda asignada la sentildeal de este uacuteltimo que
se puede comprobar por comparacioacuten de las constantes de acoplamiento
(J5acute6acute=89 Hz y J6acute5acute=90 Hz)
Descripcioacuten de Compuestos
172
Para asignar los hidroacutegenos del naftaleno se debe tener en cuenta la presencia
del aacutetomo de fluacuteor De esta forma para los hidroacutegenos H2 H3 y H5 se puede
establecer teoacutericamente
que no se veraacuten como
dobletes sino dobles
dobletes en el espectro
de protoacuten En el COSY
(Figura 58) para una
primera aproximacioacuten
se seleccionan los tres
dobles dobletes de
protoacuten que solo tengan
un acoplamiento
Figura 59 Espectro COSY Zona aromaacutetica de la moleacutecula
Seguacuten la posicioacuten de H2 y H3 con por efecto del fluacuteor de la moleacutecula ademaacutes de
ser dobles dobletes el espectro COSY (Figura 58) debe mostrar dos sentildeales que
se acoplan entre ellas Por lo que se deduce que estos protones seraacuten los
sentildealados en azul y morado (figura 57) Si se recurre ahora a los valores de
acoplamiento se justifica la asignacioacuten ya que la sentildeal morada a 770 ppm
tiene una J = 79 Hz que se corresponde con la J = 81 Hz de la sentildeal azul a 720
ppm Ademaacutes estas sentildeales por la proximidad del fluacuteor tienen un segundo
valor de acoplamiento que en el caso de H3 seraacute muy alto y en H2 menor De
este modo se concluye que la sentildeal a 770 ppm corresponde a H2 y la sentildeal a
720 ppm a H3
La continuacioacuten de la asignacioacuten se centra en H6 y H7 Estos dos protones
teoacutericamente produciraacuten sentildeales como miacutenimo con multiplicidad de triplete ya
que son los uacutenicos que presentan tres protones diferentes en su entorno Como
no hay ninguacuten triplete en el espectro podemos pensar que sus sentildeales pudieran
aparecer juntas en el multiplete que se observa sentildealado en verde en la figura
57 a 750 ppm
Por otro lado queda por asociar las sentildeales a 817 ppm y a 804 ppm (Figura
57) correspondientes a un doble doblete y un doblete respectivamente Los
protones que quedan por asignar son H5 y H8 Se podriacutea pensar que H8 seriacutea un
doblete y H5 un doble doblete por efecto del fluacuteor como el caso de H2 Si se
estudian las J se verifica esta informacioacuten ya que la sentildeal a 817 ppm tiene una
constante de acoplamiento de 21 Hz muy pequentildea para pertenecer a un
Descripcioacuten de Compuestos
173
acoplamiento protoacutenndashprotoacuten aromaacutetico Por tanto se asigna a un acoplamiento a
larga distancia del H5 con
el fluacuteor sustituido en
posicioacuten 4 del NFT
Recurriendo al espectro
COSY (Figura 60) se
puede visualizar y
verificar estas cuatro
asignaciones ya que en
caso de ser correctas
deben acoplarse las
sentildeales doblete con el
uacutenico multiplete
Figura 60 Espectro COSY para la asignacioacuten de los H del naftaleno
Identificados todos los hidroacutegenos de la moleacutecula si se recurre ahora al
espectro HMQC (Figura 61) se pueden asignar directamente los carbonos no
cuaternarios presentes en la estructura esto se debe a que este experimento
bidimensional muestra el acoplamiento entre cada carbono y los protones
directamente unidos al mismo
Lo anterior se realiza siguiendo las liacuteneas de unioacuten entre el eje horizontal
espectro de RMN- 1H y el vertical que es el espectro de RMN-13C
Figura 61 Espectro HMQC Acoplamientos protoacuten-carbono
Descripcioacuten de Compuestos
174
Las asignaciones quedan de la siguiente forma
Zona aromaacutetica
C2
FNFT
C3
FNFT
C5
FNFT
C6
FNFT
C7
FNFT
C8
FNFT
C3
FENIL
C5
FENIL
C6
FENIL
RMN-
13C
(ppm)
12320 10912 12840 12725 12611 12311 12180 12491 12332
RMN-
1H
(ppm)
770 720 817 750 750 804 805 838 735
Zona alifaacutetica
C1
alifaacutetico
C2
alifaacutetico
C3
alifaacutetico C2 PIPZ C3 PIPZ C5 PIPZ C6 PIPZ
RMN-13C
(ppm) 7232 3295 5743 5350 5310 5310 5350
RMN-1H
(ppm) 571 210
Ha 290
Hb 278 291 327 327 270
De esta forma queda correctamente determinada la estructura de la moleacutecula
Con el anaacutelisis elemental (CHN) en uacuteltimo lugar se verifica el compuesto y se
determina la pureza del mismo
Descripcioacuten de Compuestos
175
X62 Elucidacioacuten estructural para los derivados de piperidina
El compuesto que se ha tomado como referencia en este caso es el 5f Se trata
de un derivado de FNFT que tiene como amina central una amino piperidina
En la figura 62 se muestra la estructura plana de la moleacutecula con los carbonos
alifaacuteticos diferenciados
Figura 62 Estructura del compuesto 5f con los diferentes carbonos alifaacuteticos coloreados
El espectro de protoacuten del compuesto se muestra en la figura 62
Figura 63 Resonancia de protoacuten del compuesto 5f
Por pertenencia al mismo grupo estructural el derivado 5f y el 5a tienen en
comuacuten los grupos aromaacuteticos de la estructura en consecuencia la zona
aromaacutetica de la moleacutecula ya ha quedado elucidada en el apartado anterior En
este apartado los estudios se centran en la descripcioacuten y asignacioacuten de sentildeales
de la regioacuten alifaacutetica que corresponden a la aminopiperidina En la figura 64 se
han destacado en distintos colores las diferentes sentildeales correspondientes a los
carbonos alifaacuteticos de la moleacutecula 5f
Descripcioacuten de Compuestos
176
Figura 64 Ampliacioacuten zona alifaacutetica de la resonancia de protoacuten del compuesto 5f
Para comenzar con la explicacioacuten de la asignacioacuten se revisa en primer lugar el
espectro DEPT-135 (Figura 65) de resonancia de la zona alifaacutetica donde quedan
diferenciados los carbonos terciarios que dan lugar a sentildeales positivas de los
secundarios que dan lugar a sentildeales negativas
Figura 65 DEPT 135 de la regioacuten aromaacutetica del compuesto 5f Coloreados los carbonos terciarios
En el espectro quedan sentildealados los carbonos terciarios que corresponden al
C1 y a C4p Los
desplazamientos se
mantienen en el espectro de
RMN-13C simple por lo que
en el espectro de HMQC se
puede obtener a queacute
hidroacutegenos van asociadas
las sentildeales de esos carbonos
(Figura 66)
Figura 66 HMQC alifaacutetica asignacioacuten de los carbonos terciarios
Descripcioacuten de Compuestos
177
Al trazar las liacuteneas de unioacuten se observa que la sentildeal de carbono a mayores ppm
corresponde con la de un H que integra a uno y que corresponde a la sentildeal que
aparece a mayores ppm Los H de C1 estaacuten muy desapantallados por el efecto
del OH asiacute la sentildeal a 571 ppm del espectro de protoacuten (Figura 64) corresponde al
CHOH De esta forma la otra sentildeal del C terciario corresponde con el H4 asiacute
trazando una liacutenea amarilla en el HMQC se puede asignar con seguridad la
sentildeal de ese H
Seguacuten el DEPT-135 (Figura 65) en torno a 30 ppm se pueden ver dos singletes
muy proacuteximos que corresponden a dos C secundarios y en torno a 50 ppm
aparece un singlete que integra dos sentildeales Seguacuten la estructura del compuesto
hay cuatro carbonos equivalentes dos a dos los CH2 y CH2 de la piperidina
que aparecen como singletes muy proacuteximos
Los carbonos C2p y C6p (H2+H6) aparecen a desplazamientos mayores como
C4p En el espectro de carbono el desplazamiento a 5230 ppm cumple estas
especificaciones y por tanto puede ser asignado a los CH2 En el HMQC
(Figura 67) al trazar una liacutenea verde desde RMN-13C al RMN-1H para unir las
sentildeales de acoplamiento C-H se comprueba que hay dos acoplamientos de
protoacuten con el mismo carbono Esta situacioacuten se produce porque los hidroacutegenos
de los metilenos no son equivalentes ya que espacialmente se disponen en
planos axiales y ecuatoriales seguacuten se representa en la figura 67
Figura 67 HMQC del compuesto 5f asignacioacuten H piperidina
Descripcioacuten de Compuestos
178
En la disposicioacuten espacial de miacutenima energiacutea en el vaciacuteo (Figura 68) los
hidroacutegenos de los carbonos de piperazina se disponen en diferentes planos Los
H axiales se encuentran
perpendiculares al plano del ciclo de
amina y los H ecuatoriales se
disponen en el mismo plano lo que
produce cambios en el entorno
quiacutemico que quedan reflejados en el
espectro de protoacuten (Figura 64)
Figura 68 Imagen 3D del compuesto 5f obtenida con Chemdraw 3D
La disposicioacuten adoptada hace que los H axiales esteacuten maacutes cerca entre siacute y se
produzcan acoplamientos fuertes con los H axiales vecinos y deacutebiles con los H
ecuatoriales del carbono al que pertenecen En el caso de los H ecuatoriales los
acoplamientos que se generan son deacutebiles con el H en axial del carbono propio
y en ocasiones acoplan muy deacutebilmente con los H ecuatoriales de carbonos
vecinos ya que se encuentran maacutes alejados Por esto en el espectro de esta
moleacutecula no se obtiene una uacutenica sentildeal que integra por cuatro hidroacutegenos sino
que se obtienen dos sentildeales que integran a dos H y que tienen distintas
multiplicidades
En el espectro de protoacuten en HMQC (Figura 67) siguiendo la liacutenea verde que
muestra el acoplamiento de C2p y C6p con los H se ven dos sentildeales a 342 ppm
y 291 ppm La sentildeal a 342 ppm es un doblete ancho con una J =121Hz que
seguacuten lo explicado corresponde a los CH2 (H2+H6) ecuatoriales El H2ec (y por
analogiacutea H6ec) se acopla solo con H2ax la amplitud de la sentildeal podriacutea explicarse
por el acoplamiento deacutebil con H3ec La sentildeal a 291 ppm es un triplete que se
asocia a H2 Y H6 axial ya que H2ax de acoplamientos fuertes con H3ax y H2ec
Las sentildeales de carbonos en 3274 ppm y 3303 ppm corresponden a los CH2 (H3
y H5) Por el razonamiento seguido para los metilenos 2 y 6 las sentildeales a 210
ppm y 160 ppm en el espectro de protoacuten corresponden a los H ecuatoriales y
axiales respectivamente
Los carbonos de la cadena alifaacutetica quedan asignados tambieacuten en base a los
desplazamientos del RMN-13C El C2 estaacute maacutes apantallado por el caraacutecter
alifaacutetico del entorno por lo que de las dos sentildeales que quedan por asignar la
que se obtiene a 3676 ppm corresponde al CHOH-CH2
Descripcioacuten de Compuestos
179
En el espectro HMQC (Figura 69) se obtiene para esta sentildeal CHOH-CH2
varios acoplamientos
correspondientes a
diferentes sentildeales
muacuteltiples a 200 ppm
y 212 ppm en el
espectro de protoacuten
Esto se debe tambieacuten
a la disposicioacuten
espacial de ambos H
como ocurre en el
caso de los H de la
amina
Figura 69 HMQC Asignacioacuten de los carbonos del puente de metilenos
Las sentildeales que quedan sin asignar pertenecen a C3 (sentildealado en rosa en la
figura CH2) a 4575 ppm que seguacuten el HMQC corresponde a los dos protones
que dan sentildeales como multipletes a 310 ppm y 300 ppm
La asignacioacuten de las sentildeales queda de la siguiente manera
Zona aromaacutetica
C2
FNFT
C3
FNFT
C5
FNFT
C6
FNFT
C7
FNFT
C8
FNFT
C3
FENIL
C5
FENIL
C6
FENIL
RMN-13C
(ppm) 12320 10912 12840 12725 12611 12311 12180 12491 12332
RMN-1H
(ppm) 770 720 817 750 750 804 805 838 735
Zona alifaacutetica
C1
alifaacutetico
C2
alifaacutetico
C3
alifaacutetico C2 PIPR C3 PIPR
C4
PIPR C5 PIPR C6 PIPR
RMN-13C
(ppm) 7259 3676 4575 5230 3303 5456 3274 5230
RMN-1H
(ppm) 571
Ha 212
Hb 200
Ha 319
Hb 300
Ha 342
Hb 298
Ha 210
Hb 160 280
Ha 210
Hb 160
Ha 342
Hb 298
De esta forma queda correctamente identificada la estructura del compuesto
5f
Descripcioacuten de Compuestos
180
X63 Elucidacioacuten estructural para los derivados de tetrahidropiridina
En este apartado se describen los compuestos 6g y 7g derivados de benceno
que tienen como amina central una tetrahidropiridina y como resto Ar2 un
benceno para-fluacuteor-sustituido En estos derivados la diferencia estructural que
cabe destacar estaacute en el resto Ar1 donde el 6g presenta un p-fluorobenceno
sustituido y el 7g un p-trifluorometileno (Figura 70)
Figura 70 Estructuras del compuesto 7g y 6g
Para la determinacioacuten estructural de estos compuestos se toma como punto
de partida la RMN-1H asignando las posibles sentildeales con sus correspondientes
protones El espectro de protoacuten de los compuestos se muestra en la figura 71
pudieacutendose comprobar su similitud
Figura 71 Espectro de RMN 1H del compuesto 6g y 7g respectivamente
Descripcioacuten de Compuestos
181
Zona Alifaacutetica
La regioacuten alifaacutetica de estas dos moleacuteculas son ideacutenticas por tanto las sentildeales
estaacuten a desplazamientos similares Estas moleacuteculas cuentan con cinco metilenos
de caraacutecter alifaacutetico y dos carbonos terciarios de los cuales C1 y C3p estaacuten muy
desapantallados por efecto tanto del OH
como por la pertenencia a una insaturacioacuten
como es el doble enlace de la
tetrahidropiridina Por las descripciones de
las zonas alifaacuteticas anteriores se puede
aproximar que el H perteneciente al C1
tendraacute un desplazamiento en torno a 500
ppm En la figura 72 queda sentildealada en
amarillo esta sentildeal a 470 ppm la otra sentildeal
de H sentildealada en naranja a un
desplazamiento 61 ppm corresponde al
protoacuten H3 de la tetrahidropiridina
Figura 72 Ampliacioacuten de RMN- 1H
La sentildeal pequentildea y ancha de entre ambas
sentildeales desaparece con agua deuterada por lo
que se identifica con el protoacuten del OH
El resto de sentildeales corresponden a la
tetrahidropiridina y el puente alifaacutetico En la
figura 73 se muestra ampliada la zona alifaacutetica
del espectro El estudio del espectro COSY
(Figura 74) ayudaraacute en la asignacioacuten de las
sentildeales
Figura 73 Ampliacioacuten RMN- 1H zona alifaacutetica
Habiendo asociado las sentildeales de C1 y C3p seguacuten los acoplamientos
mostrados se puede asignar las sentildeales de los carbonos contiguos con los que se
acopla De esta manera en la figura 74 puede observarse seguacuten los
acoplamientos cuaacuteles son los H contiguos al grupo hidroxilo que son los
pertenecientes a C2
Descripcioacuten de Compuestos
182
Figura 74 Asignacioacuten de las sentildeales de la cadena alifaacutetica
Se asigna la sentildeal que se observa a
180 ppm a C2 (CH2) puesto que es de
los dos el de mayor caraacutecter alifaacutetico
Integrado en el multiplete de 250 ppm
queda la sentildeal del otro CH2
correspondiente a C3 Si se traslada
esta asignacioacuten al HMQC (Figura 75) se
pueden asignar por las sentildeales a queacute C
pertenecen
Figura 75 Espectro HMQC- 1H-13C alifaacuteticos
Tomando como referencia el CH
de C3p (Figura 76) seguacuten los
acoplamientos mostrados en el
espectro COSY se determina
claramente cuaacutel es la sentildeal del CH2
de C2p
Figura 76 Ampliacioacuten zona alifaacutetica del espectro COSY
Si se continuacutea analizando los acoplamientos desde la sentildeal de H2 sentildealados
en morado se corresponde con el multiplete de 260 ppm de la RMN de protoacuten
Descripcioacuten de Compuestos
183
Como se ha explicado en el apartado anterior la posicioacuten espacial de la
moleacutecula genera acoplamientos deacutebiles de los H entre carbonos que no estaacuten
contiguos pero si espacialmente proacuteximos Por ello el multiplete genera
acoplamiento deacutebil con el hidroacutegeno del doble enlace y con los H2 y con una
tercera sentildeal que
pertenece a los H que
quedan por describir
Si se recurre al
espectro HMQC
(Figura 77) de esa
parte de la moleacutecula se
puede asignar las
sentildeales con seguridad
teniendo en cuenta los
desplazamientos
quiacutemicos de los
carbonos
Figura 77 Ampliacioacuten del espectro HMQC en la parte de la piridina
Habieacutendose asignado el H2 de C2p se puede ver el acoplamiento con el
carbono correspondiente Los dos carbonos que quedan por asignar
corresponden a las posiciones C5p y C6p El C5p teoacutericamente deberaacute aparecer a
desplazamientos menores pero la presencia del doble enlace hace que aparezca
a mayores desplazamientos Por tanto trazando las liacuteneas de unioacuten con la RMN
de protoacuten quedan justificadas todas las asignaciones realizadas al comienzo
sobre la resonancia de protoacuten
Zona aromaacutetica
Los protones aromaacuteticos de los compuestos 6g y 7g muestran diferentes
desplazamientos en la RMN- 1H (Figura 78)
Figura 78 Zona aromaacutetica de las RMN- 1H de los compuestos 6g y 7g respectivamente
Descripcioacuten de Compuestos
184
Sin embargo en una primera aproximacioacuten se puede comprobar que hay
sentildeales que se mantienen de una moleacutecula a otra La diferencia estructural entre
los dos compuestos estaacute en el sustituyente Ar1 donde se intercambian un fluacuteor y
un trifluorometil Por tanto las sentildeales que se conservan con desplazamientos a
710 ppm y 740 ppm pertenecen al benceno para sustituido de Ar2 (unido a la
amina) comuacuten en las dos estructuras Se recurre a los espectros bidimensionales
para la asignacioacuten de las sentildeales
En el espectro COSY del compuesto 7g (Figura 79) se puede determinar queacute
hidroacutegenos pertenecen a carbonos del mismo ciclo por sus acoplamientos
vecinales En la RMN- 1H del compuesto 7g a 710 ppm hay un triplete que
integra por dos hidroacutegenos Teoacutericamente la sentildeal obtenida deberiacutea ser un
doblete ya que los hidroacutegenos del los anillos solo se ven afectados por un
hidroacutegeno vecino La explicacioacuten de esta multiplicidad es la presencia del
aacutetomo de fluacuteor que no genera sentildeal pero si influencia en los hidroacutegenos vecinos
De esta forma se asigna esa sentildeal a 710 ppm a los hidroacutegenos 3acute y 5acute del anillo
de Ar2 Con el espectro COSY quedan descritos los correspondientes vecinos
H2acute y H6acute a 740 ppm
Figura 79 Espectro COSY del compuesto 6g
De esta manera queda claro que las otras dos sentildeales pertenecen a Ar1 Si se
recurre de nuevo a la RMN- 1H del compuesto 6g se puede observar una sentildeal
intensa que integra cuatro protones a 710 ppm Conociendo que dos
hidroacutegenos son H3acute y H5acute que pertenecen a Ar2 los otros dos seraacuten H3 y H5
pertenecientes al benceno unido al hidroxilo Ar1 que en este compuesto
tambieacuten tienen un aacutetomo de fluacuteor contiguo
Descripcioacuten de Compuestos
185
En el espectro COSY del compuesto 7g la sentildeal a 750 ppm se ha asignado a
H2acute y H6acute de Ar2 El compuesto 6g tiene los mismos protones H2acute y H6acute de Ar2 a
igual desplazamiento por lo que la sentildeal a 740 ppm perteneceraacute a los protones
H2 y H6 que faltaban por designar en el compuesto 6g Los uacutenicos protones que
no comparten 6g y 7g son H3 y H5 Por RMN- 1H del compuesto 6g se ha deduce
que estos hidroacutegenos dan una sentildeal a 71 ppm En el espectro del compuesto 7g
a 770 ppm hay una sentildeal que por lo explicado se asigna a estos hidroacutegenos
vecinos del grupo trifluorometil de Ar1
Las asignaciones son
Zona aromaacutetica
6g C2
FBZN
C3
FBZN
C5
FBZN
C6
FBZN
C2
FENIL
C3
FENIL
C5
FENIL
C6
FENIL
RMN-13C
(ppm) 12730 11580 11580 12730 12730 11580 11580 12730
RMN-1H
(ppm) 740 710 710 740 750 710 710 750
7g C2
TBZN
C3
TBZN
C5
TBZN
C6
TBZN
C2
FENIL
C3
FENIL
C5
FENIL
C6
FENIL
RMN-13C
(ppm) 12730 12570 12570 12730 12730 11580 11580 12730
RMN-1H
(ppm) 750 770 770 750 740 710 710 740
Zona alifaacutetica comuacuten
C1
alifaacutetico
C2
alifaacutetico
C3
alifaacutetico
C2
PIRD
C3
PIRD
C5
PIRD
C6
PIRD
RMN-13C
(ppm) 7149 3696 2836 5360 12280 5531 5074
RMN-1H
(ppm) 470 180 250 306 610 245 260
XXII EENNSSAAYYOOSS BBIIOOLLOacuteOacuteGGIICCOOSS
Ensayos Bioloacutegicos
189
XI1Ensayos de actividad antiplasmoacutedica in vitro
Se determinoacute como se describe en el apartado de material y meacutetodos la
actividad antimalaacuterica in vitro y la citotoxicidad de la mayor parte de los
compuestos obtenidos y los resultados se muestran en las siguiente tablas
(Tabla 4 5 y 6)
Compuesto Ar1 n Amina RaRb CI50
NF54 microM
CI50 FCR3 microM
DT50
Vero microM
IS VeroFCR3
1
2 PIPZ CF3NO2 1250 10310 3610 035
2 2 PIPZ NO2CF3 ND 090 490 544
9
2 PIPZ CF3NO2 830 4205 1890 045
11 2 PIRR CF3NO2 390 4605 7040 150
14
1 PIPZ CF3NO2 23260 19020 gt100 065
15 1 PIPZ NO2CF3 10320 18615 gt100 053
17
2 PIPZ NO2CF3 1700 7300 949 013
Referencia QC 004 013 gt50 gt350
Tabla 4 Tabla de resultados de actividad y citotoxicidad de los compuestos de la Serie 0 derivados carboniacutelicos CQ Cloroquina CI50 valores medios del ensayo realizado por triplicado expresados en microM de la inhibicioacuten del 50 del
crecimiento celular de cepas FCR-3 de Plasmodium falciparum DT50 concentracioacuten citotoacutexica media de los compuestos en ceacutelulas Vero IS Iacutendice de Selectividad de los compuestos obtenido del cociente de DT50 de ceacutelulas Vero y la CI50 en
cepas FCR3 ND No determinado
Ensayos Bioloacutegicos
190
Series Ar1 Comp n Amina RaRb CI50
NF54 microM
CI50
FCR3 microM
DT50 Vero microM
IS VeroFCR3
Serie 1
1a 2 PIPZ CF3NO2 230 400 2420 605
1b 2 PIPZ NO2CF3 420 645 gt100 gt100
1g 2 PIRD HF ND 1689 1790 106
Serie 2
2a 2 PIPZ CF3NO2 ND 130 gt200 gt100
2b 2 PIPZ NO2CF3 ND 223 gt150 8598
2c 2 PIPZ HCF3 ND 105 gt250 gt100
2d 2 DZP CF3NO2 ND 075 133 1770
2f 2 PIPR CF3NO2 ND 070 660 670
Serie 3
3b 2 PIPZ NO2CF3 1670 3615 gt100 380
3e 2 PIRR CF3NO2 610 1050 2970 190
3g 2 PIRD HF ND 1403 2460 175
Serie 4
4b 1 PIPZ NO2CF3 2170 10225 7460 070
Serie 5
5a 2 PIPZ CF3NO2 130 050 2090 4180
5b 2 PIPZ NO2CF3 170 490 7570 1540
5c 2 PIPZ HCF3 ND 093 gt200 gt100
5f 2 PIPR CF3NO2 ND 015 550 5500
5g 2 PIRD HF ND 040 3430 8590
Serie 6
6a 2 PIPZ CF3NO2 ND 036 8798 gt100
6f 2 PIPR CF3NO2 ND 048 3000 gt100
6g 2 PIRD HF ND 066 gt1000 gt1000
Serie 7
7g 2 PIRD HF ND 560 gt300 gt100
Referencia CQ 004 013 gt50 gt300
Tabla 5 Tabla de resultados de actividad y citotoxicidad de los compuestos hidroxiacutelicos CQ Cloroquina CI50 valores medios del ensayo realizado por triplicado expresados en microM de la inhibicioacuten del 50 del crecimiento celular de cepas FCR-3 de Plasmodium falciparum DT50 concentracioacuten citotoacutexica media de los compuestos en ceacutelulas Vero IS Iacutendice de
Selectividad de los compuestos obtenido del cociente de DT50 de ceacutelulas Vero y la CI50 en cepas FCR3 ND No determinado
Ensayos Bioloacutegicos
191
Serie 8
Ar1 Amina RaRb IC50
NF54 microM
IC50
FCR3 microM
DT50 Vero
microM
DT50 MCF7
microM
IS VeroFCR3
1
PIPZ NO2CF3 ND SA 150 471 ND
2 PIRR CF3NO2 214 465 101 ND 022
Referencia CQ 004 013 gt50 ND gt400
Tabla 6 Tabla de resultados de actividad y citotoxicidad de los compuestos de la Serie 8 derivados oxima CQ Cloroquina CI50 valores medios del ensayo realizado por triplicado expresados en microM de la inhibicioacuten del 50 del
crecimiento celular de cepas FCR-3 de Plasmodium falciparum DT50 concentracioacuten citotoacutexica media de los compuestos en ceacutelulas Vero IS Iacutendice de Selectividad de los compuestos obtenido del cociente de DT50 de ceacutelulas Vero y la CI50 en
cepas FCR3 ND No determinado SA sin actividad
XI2 Ensayos de actividad antiplasmoacutedica in vivo
Los ensayos in vivo comenzaron con los ensayos de virulencia para obtener
una aproximacioacuten del comportamiento de la cepa elegida Fueron desarrollados
como se muestra en la figura 80
Figura 80 Desarrollo del ensayo de virulencia previo al ensayo de actividad in vivo de los compuestos
En ratones parasitados al 50 hay 24x106 hematiacutees infectados por microL y son
necesarios 107 hematiacutees totales por ratoacuten Para el test de Peters se dispuso de
Ensayos Bioloacutegicos
192
100 ratones pero en los caacutelculos teniendo en cuenta las posibles peacuterdidas se
contoacute con 110 ratones en total Asiacute fueron necesarios 110x107 paraacutesitos para
comenzar la experimentacioacuten El volumen maacuteximo que inyectar es 100 microL de
solucioacuten lo que supone preparar 11 mL de solucioacuten de sangre parasitada al
comienzo del ensayo
Teniendo en cuenta estos tres datos fueron necesarios 458 microL de sangre
infectada al 50 en un volumen de 11 mL de suero fisioloacutegico Con la
inoculacioacuten de los ratones da comienzo el Test de Peters
Los resultados a lo largo del test se ofrecen en la Tabla 7
Test de Peters (respuesta visual externa) P Supervivencia
Grupo Diacutea 0 Diacutea 1 Diacutea 2 Diacutea 3 Diacutea 4 Diacutea 5 Diacutea 7 Diacutea 9 Diacutea 11 Diacutea 12
Control negativo - - + AC + AC + AC 23 910 35 13 11 1
Control positivo - - + AC + AC + AC 19 1010 68 44 44 2
Grupo 2a1 - - + AC + AC + AC 24 710 34 12 - -
Grupo 2a2 - - + AC + AC + AC 32 810 22 22 - -
Grupo 2a3 - - + AC + AC + AC 14 1010 66 55 13 1
Grupo 2a4 - - + AC + AC + AC 31 910 45 22 12 1
Grupo 5f1 - +AC +AC
ID
+AC
BMBO
+AC
BMBO 6 510 35 33 23 2
Grupo 5f2 - +AC + AC +AC
BMBO
+AC
BMBO 15 1010 67 45 23 -
Grupo 5f3 - +AC + AC + AC + AC 32 910 44 23 - -
Grupo 5f4 - +AC + AC + AC + AC 18 1010 67 44 - -
Tabla 7 Resultados de los ensayos in vivo para los compuestos 2a y 5f P porcentaje de parasitemia (-) sin respuesta visual externa (+) respuesta externa AC alteracioacuten momentaacutenea del comportamiento en el momento de la inyeccioacuten del tratamiento BM baja movilidad BO baja oxigenacioacuten principios de cianosis parasitemia medida al cuarto diacutea
Supervivencia expresada en ratones supervivientes con respecto al grupo el diacutea determinado
XI3 Discusioacuten de ensayos bioloacutegicos
Los resultados bioloacutegicos obtenidos ofrecen datos de estructura-actividad
suficientemente consistentes como para proseguir con un refinamiento
estructural de los compuestos El estudio del comportamiento de los
compuestos de las diferentes series en el ensayo de actividad antiplasmoacutedica in
vitro en la cepa FCR3 ha sido suficiente para comprobar que (Series 1-7) son
mucho maacutes activos en todos los casos los derivados hidroxiacutelicos (CHOH) que
un reducido nuacutemero de derivados carboniacutelicos (Serie 0) Por esto no fueron
ensayados el resto de compuestos de la Serie 0
Ensayos Bioloacutegicos
193
Los mismos resultados se obtuvieron para las dos oximas de la Serie 8 por lo
que se paroacute su siacutentesis Sin embargo esto no es extensible a los datos de
toxicidad que se ve influenciada por otros sustituyentes en la moleacutecula Por esto
se centraraacute el estudio en los resultados de las modificaciones estructurales de
los derivados hidroxiacutelicos pertenecientes a las Series 1 a 7
En referencia al sustituyente en la posicioacuten Ar1 comparando series como 1 vs
2 y 3 vs 5 se puede destacar que las series con un grupo fluacuteor en Ar1 aumentan
significativamente su actividad sin ser extensible este dato a la toxicidad (veacutease
compuestos 1a vs 2a 1b vs 2b 3b vs 5b y 3g vs 5g) La siguiente comparativa se
basa en la naturaleza de los anillos condensados (benzo[b]tiofeno y naftaleno)
respecto del benceno sustituido que forman el nuacutecleo del sustituyente Ar1 En
una primera aproximacioacuten se puede ver que la actividad desciende en orden
derivados de FNFTgtderivados de FBZNgtderivados de FBTF Comparando
ahora la actividad de los compuestos 1a vs 2a vs 3a vs 5a vs 6a puede verse que
el compuesto 5f (derivado de FNFT) tiene el mejor dato de CI50 pero el
compuesto 6a (derivado de FBZN) es el que mejor actividad in vitro ha
mostrado siendo soacutelo 3 veces menos activo que la CQ usada como referencia Si
se comparan los derivados de FBTF (Serie 2) y FNFT (Serie 5) en general los
compuestos de la Serie 5 son maacutes activos que sus homoacutelogos de la Serie 2
excepto en el caso de los compuestos 2b vs 5b
En cuanto a toxicidad aunque de forma menos marcada se observa un
aumento en los derivados de FNFT respecto de sus homoacutelogos de FBTF
Centrando el estudio en la variacioacuten de la longitud de la cadena alifaacutetica se
comparan los compuestos 3b y 4b La mayor parte de los compuestos
sintetizados contienen dos carbonos en la cadena alifaacutetica La disminucioacuten en
un aacutetomo de carbono en esta cadena (Compuestos de la Serie 0 14 y 015 y Serie
4) supone una peacuterdida muy considerable de la actividad de los compuestos
Este dato de menor actividad condujo a cerrar esta serie
La naturaleza de la amina central ademaacutes de influir claramente en la
actividad tiene gran influencia en la toxicidad in vitro de los derivados De
forma que se puede ver como la mayoriacutea de derivados de piperazina muestran
una toxicidad bastante baja en comparacioacuten con compuestos derivados de otras
aminas Por el contrario exceptuando el compuesto 6a estos derivados tienen
menor actividad que sus anaacutelogos con otras aminas como homopiperazinas
(compuestos 2a vs 2d) o piperidinas (compuestos 2a vs 2f o 5a vs 5f)
Ensayos Bioloacutegicos
194
Se puede plantear como hipoacutetesis que la presencia de un grupo NH libre en la
estructura aumenta considerablemente la toxicidad de los compuestos Este
caso se observa en los derivados de la Serie 2 y Serie 3 donde los compuestos
con piperazina no son toacutexicos pero al introducir una amina con un NH libre
aumenta su toxicidad a la vez que lo hace la actividad Esto no es de aplicacioacuten
en los anaacutelogos de la Serie 5 (ya que el compuesto 5a contiene el anillo de
piperazina y muestra toxicidad) por lo que se podriacutea deducir que el grupo FNFT
confiere por si mismo cierta toxicidad Con respecto a los derivados de
tetrahidropiridina no se tienen suficientes datos como para extraer conclusiones
claras en la relacioacuten estructura-actividad
Por uacuteltimo se estudia la variacioacuten de la actividad y citotoxicidad en relacioacuten a
los sustituyentes en Ar2 Si se comparan los compuestos a y b de las diferentes
series se deduce que es conveniente para la actividad que el grupo CF3 esteacute en
posicioacuten orto con respecto a la amina (compuestos ldquoardquo de las diferentes series)
Los compuestos con CF3 en para (compuestos ldquobrdquo) son menos activos pero
tambieacuten menos toacutexicos Los anaacutelogos que carecen de grupo NO2 (compuestos 2c
y 5c) aumentan la actividad y cabe destacar el descenso en la toxicidad por lo
que se deduce que el grupo NO2 confiere toxicidad no ligada a la actividad
como el caso de los grupos NH libres Los datos obtenidos permiten una
aproximacioacuten al comportamiento de los compuestos in vivo Para estos ensayos
de los compuestos disponibles se seleccionaron dos el 5f el maacutes activo
(proacuteximo al compuesto de referencia) y 2a el de mejor perfil de toxicidad
En la Tabla 4 se muestran los datos experimentales obtenidos durante la
realizacioacuten del Test de Peters El compuesto 5f disminuye en gran medida la
parasitemia a altas concentraciones pero por acumulacioacuten en el tratamiento
diario provoca diferentes muestras de toxicidad como mala oxigenacioacuten o
alteraciones de conducta de los ratones A concentraciones menores los
resultados desafortunadamente no son tan relevantes como cabiacutea esperar ni en
cuanto a parasitemias ni a supervivencia
El compuesto 2a si bien no muestra indicios de toxicidad no mejora los
resultados con respecto a la CQ en datos de parasitemia ni de supervivencia
XXIIII EENNSSAAYYOOSS CCOOMMPPUUTTAACCIIOONNAALLEESS
Ensayos Computacionales
197
XII1 Propiedades fisicoquiacutemicas de los compuestos
Todos los valores obtenidos en relacioacuten a las propiedades fisicoquiacutemicas de
los compuestos sintetizados se exponen en la tabla siguiente (Tabla 8)
ABS TPSA (Ǻ2)
n-ROTB
PM miLogP KOWLogP ALogPS
21 MLogP
n-OHNH n-ON aceptores
Lipinskis violations ID donadores
rule
gt500 lt5 lt5 lt5 lt415 lt5 lt10 le1
01 8506 6940 7 46350 503 486 480 414 0 6 1
02 8507 6937 7 gt500 503 486 476 414 0 6 1
03 10000 2031 5 36450 481 548 52 442 0 2 0
04 8507 6937 7 48151 419 506 476 424 0 6 0
05 8507 6937 7 48151 419 506 476 424 0 6 0
06 10000 2355 6 43651 431 525 502 451 0 3 0
07 8703 6368 7 49554 401 543 504 485 0 5 0
08 8203 7816 8 49554 448 576 463 445 1 6 0
09 8506 6940 7 4940 532 504 479 448 0 6 1
010 8507 6937 8 gt500 489 504 520 448 0 6 0
011 8202 7820 8 4940 533 525 435 448 1 6 1
012 10000 2031 5 35947 510 566 507 477 0 2 1
013 10000 2031 6 37741 481 544 461 487 0 2 0
014 8506 6940 6 44340 505 531 458 427 0 6 1
015 8506 6940 6 44340 505 531 461 427 0 6 1
016 8507 6937 7 47548 541 524 457 458 0 6 1
017 8506 6940 7 47540 541 524 458 458 0 6 1
018 10000 2355 6 43048 552 543 504 485 0 3 1
019 8203 7816 8 48951 463 594 461 478 1 6 0
020 10000 2031 5 37746 519 580 490 514 0 2 1
021 8507 6937 7 42542 430 407 372 390 0 6 0
022 8203 7816 8 43945 458 477 373 411 1 6 0
023 10000 2031 5 32740 408 468 422 411 0 2 0
81 7971 8489 7 47247 538 468 463 395 1 7 1
82 7668 9368 8 47247 469 458 463 395 1 6 0
CQ 9930 2820 8 31990 501 450 528 352 1 3 1
Tabla 8 Datos computacionales de las propiedades fisicoquiacutemicas de los derivados de la Serie 0 y Serie 8 ABS porcentaje de absorcioacuten calculado como 109 ndash (0345 x TPSA) siendo TPSA el Aacuterea Superficial Polar Topoloacutegica n-
ROTB es el nuacutemero de enlaces de giro permitido Log P es el coeficiente de particioacuten del compuesto en octanol-agua n-OHNH es nuacutemero de enlaces de hidrogeno donadores n-ON es el nuacutemero de enlaces de hidroacutegeno aceptores CQ
cloroquina
ID ABS TPSA (Ǻ2) n-ROTB PM miLogP KOWLogP ALogPS 21 MLogP n-OHNH n-ON
aceptores Lipinskis violations donadores
rule
gt500 lt5 lt5 lt5 lt415 lt5 lt10 le1
1a 8398 7253 7 46550 469 468 463 395 1 6 0
1b 8398 7253 7 gt500 469 458 463 395 1 6 0
1g 10000 2347 5 40399 447 530 461 423 1 2 0
2a 8398 7253 7 48349 407 488 499 432 1 6 0
2b 8398 7253 7 gt500 478 488 499 432 1 6 0
2c 9979 2670 6 43849 397 507 509 432 1 3 0
2d 8398 7253 7 49751 413 538 505 453 1 6 0
2f 8095 8132 8 49751 414 558 461 453 2 6 0
3b 8398 7253 7 49600 498 486 483 429 1 6 0
3e 8095 8132 8 49607 499 506 439 429 1 6 0
3g 10000 2347 5 36146 476 548 466 457 1 2 0
4b 8399 7250 6 44540 471 415 477 408 1 6 0
5a 8399 7250 7 47750 507 506 503 466 1 6 1
5b 8399 7250 7 47750 507 424 384 546 1 6 1
5c 9979 2670 6 46896 519 525 514 466 1 3 1
5f 8095 8132 8 49147 536 576 465 486 2 6 1
5g 10000 2347 5 37945 485 568 488 495 1 2 0
6a 8398 7253 7 46591 337 389 413 398 1 6 0
6f 8095 8132 8 47994 424 459 374 419 2 6 0
6g 10000 2347 5 329 39 374 450 395 425 1 2 0
7g 10000 2347 6 37974 447 526 469 468 1 2 0
CQ 9930 2820 8 31990 501 450 528 352 1 3 1
Tabla 9 Datos computacionales de las propiedades fisicoquiacutemicas de los derivados hidroxiacutelicos ABS porcentaje de absorcioacuten calculado como 109 ndash (0345 x TPSA) siendo TPSA el Aacuterea Superficial Polar Topoloacutegica n- ROTB es el nuacutemero de enlaces de giro permitido Log P es el coeficiente de particioacuten del compuesto en octanol-agua n-OHNH es nuacutemero de enlaces de hidrogeno donadores n-
ON es el nuacutemero de enlaces de hidroacutegeno aceptores CQ cloroquina
Ensayos Computacionales
199
XII2 Discusioacuten de propiedades fisicoquiacutemicas
Los estudios teoacutericos de los paraacutemetros fiacutesico-quiacutemicos muestran que los
compuestos cumplen las Reglas de Lipinski ya que tienen un peso molecular
menor de 500 Daltons los coeficientes de particioacuten octanolagua estaacuten dentro
de los liacutemites admitidos (entre -04 y 56) lejos de los cinco enlaces donadores
de hidroacutegeno (suma de los OH y NH) y de los 10 aceptores (suma de O y N)
Las caracteriacutesticas estructurales han de ser tenidas en cuenta para predecir la
solubilidad de los compuestos
El tamantildeo de las estructuras influye de manera directa en la absorcioacuten de un
compuesto puesto que los de bajo peso molecular difunden mejor pasivamente
Todos los compuestos de este trabajo presentan bajos pesos moleculares
La polaridad de las estructuras tambieacuten juega un papel importante en las
caracteriacutesticas farmacocineacuteticas Las moleacuteculas apolares difunden con mayor
facilidad que las polares ya que son maacutes lipoacutefilas Los coeficientes de reparto
octanolagua determinan esta caracteriacutestica de la moleacutecula teniendo en cuenta
el medio Es decir los compuestos con altos coeficientes de particioacuten son maacutes
hidroacutefobos y por tanto tendraacuten buena difusioacuten Los valores obtenidos para los
distintos compuestos en las diferentes aplicaciones utilizadas no muestran una
tendencia clara que permita distinguir entre estructuras Lo que siacute cabe destacar
es que todos cuentan con valores altos proacuteximos a 5 que les confiere buena
difusioacuten
Los aacutetomos que conforman las moleacuteculas estaacuten cargados y confieren
polaridad a la estructura Esta caracteriacutestica estaacute distribuida en el espacio de
diferente forma seguacuten los aacutetomos de O N y F que posea la moleacutecula dando
lugar al TPSA (suma de superficie de todos los aacutetomos polares) La bibliografiacutea
(Palm et alts 1997) demuestra que la liposolubilidad estaacute relacionada con los
valores de TPSA Los valores de TPSA entre 63 y 139 Aring2 predicen una buena
absorcioacuten de los compuestos La mayoriacutea de las estructuras del trabajo estaacuten
dentro de esos paraacutemetros incluso hay estructuras que como la CQ tienen
TPSA menores de 63 Aring2 que indican que el porcentaje de absorcioacuten de los
compuestos seraacute oacuteptimo
Todos los paraacutemetros fisicoquiacutemicos proponen unas buenas cualidades de
absorcioacuten de los compuestos de este trabajo
Ensayos computacionales
200
XII3 Estudios de Modelizacioacuten y Acoplamiento Molecular
Se realiza una primera aproximacioacuten para la validacioacuten de la diana propuesta
usando el programa Autodock donde se analizan los modos de unioacuten maacutes
representativos de las diez conformaciones calculadas del compuesto EH58 y del
5a con al menos un enlace de hidroacutegeno con uno de los aspartatos del sitio
cataliacutetico Las energiacuteas de unioacuten y los valores de RMSD de EH58 y las energiacuteas de
unioacuten del compuesto 5a para esas diez conformaciones se muestran en la
siguiente tabla
EH58 5a
Confa Energiacutea
b RMSD
c Energiacutea
b
1 -406 453 -616
2 -250 361 -607
3 -245 559 -585
4 -230 393 -584
5 -232 299 -570
6 -232 632 -556
7 -209 551 -556
8 -197 557 -545
9 -162 556 -525
10 -121 733 -478
Tabla 10 Datos de energiacutea de las distintas conformaciones de los compuestos EH58 y 5a a Mejores conformaciones obtenidas por docking ordenadas seguacuten la energiacutea b energiacutea de unioacuten en in Kcalmol calculadas con el programa
Autodock c Valores RMSD en Aring
Los resultados de los ensayos computacionales realizados al compuesto 5a
producen representaciones graacuteficas tridimensionales del MEP (Figura 81) de la
conformacioacuten de miacutenima energiacutea obtenida seguacuten los datos mostrados en la
anterior Tabla 10
En el MEP se observa una red de potencial electronegativo alrededor del fluacuteor
los grupos OH y los NO2 Asiacute se puede deducir que los compuestos maacutes activos
los derivados hidroxiacutelicos tendraacuten un potencial electronegativo y un modo de
accioacuten similar
Ensayos Computacionales
201
Figura 81 MEP de la mejor conformacioacuten del compuesto 5g
Los estudios de docking se orientaron a la unioacuten entre el compuesto liacuteder y la
plasmepsina II como se ha explicado anteriormente Se llegoacute a la conclusioacuten que
se forma un puente de hidroacutegeno con el sitio activo de la aspartato cataliacutetica de
la enzima (ASP 214 y ASP 34) Esta interaccioacuten se da sobre el uacutenico grupo
hidroxilo de la moleacutecula y el residuo ASP 214
Todo esto nos aporta representaciones graacuteficas como la obtenida para la mejor
conformacioacuten encontrada para el compuesto 5a dentro del sitio activo de la
plasmepsina II (figura 82)
Figura 82 Representacioacuten de la unioacuten del compuesto 5a y la Plasmepsina Sentildealado con raya discontinua amarilla la unioacuten del OH y la ASP 214 Tambieacuten se puede ver dibujadas en rama otras terminaciones de la enzima
En base al resultado obtenido en la primera aproximacioacuten con el programa
Autodock que valida como diana la plasmepsina se realiza una segunda
aproximacioacuten con el programa ICM que emplea menos tiempo para sus caacutelculos
una vez conocidos los paraacutemetros de buacutesqueda base
Ensayos computacionales
202
Para este segundo estudio se emplearon las estructuras de los derivados 5a 5c
5g 6a 6g y 6f Una de las hipoacutetesis base del estudio es que partiendo de que
habiacutea comprobado que el compuesto 5a encaja en el sitio activo los demaacutes
derivados deberaacuten encajar tambieacuten Esto se confirma en la figura 83 donde se
muestra como los diferentes derivados solapan estructuralmente en el hueco del
sitio activo de la moleacutecula
Figura 83 Imagen de la plasmepsina donde se muestra el solapamiento de las diferentes estructuras estudiadas
El programa ICM realizoacute caacutelculos para obtener las energiacuteas de las mejores
conformaciones de las moleacuteculas propuestas (Tabla 11)
Compuesto Energiacutea
(Kcalmol) Actividad
uM
5f -917627 015
5a -867278 05
6f -815261 048
6a -764088 036
5c -751448 093
6g -681119 066
Tabla 11 Energiacutea de las conformaciones oacuteptimas de los diferentes compuestos estudiados
Teniendo en cuenta los datos de energiacutea y las configuraciones espaciales maacutes
estables para el sitio de unioacuten de las moleacuteculas se obtuvo la representacioacuten de las
interacciones que realiza cada moleacutecula en el sitio activo de la enzima
plasmepsina (Figuras 84 a 89)
En la figura 84 se puede ver la representacioacuten de las interacciones del
compuesto 5a en el sitio activo En amarillo quedan sentildealadas las interacciones
hidrofoacutebicas (interacciones de Van der Waals) entre restos apolares de la
Ensayos Computacionales
203
moleacutecula y de los restos de la enzima
En verde se sentildeala el puente de
hidroacutegeno entre el grupo OH y la
ASP 214 En este compuesto el
programa plantea otra posible unioacuten
con el resto THR 217 En azul se
resalta la regioacuten ionizable la amina
Los restos libres que podriacutean
interaccionar con las moleacuteculas
propuestas se plantean en recuadros
alrededor de ella
Figura 84 Representacioacuten de las interacciones de 5a
En la figura 85 se puede estudiar la
variacioacuten en las interacciones con el
cambio de posicioacuten del grupo CF3 y la
desaparicioacuten del grupo NO2 del
compuesto 5c Ahora el programa
plantea la posibilidad de la interaccioacuten
del OH con ASP 34 ademaacutes de la
interaccioacuten con ASP 214
Figura 85 Representacioacuten de las interacciones de 5c
En la figura 86 se muestra el compuesto 5f y se aprecia el cambio los aacutengulos de
conformacioacuten de la estructura
cuando la amina PIPZ central se
cambia por PIPR Se observa como
se establecen muchas maacutes
interacciones apolares del grupo
FNFT y del CF3 en orto pero
disminuyen las del ciclo de la amina
con respecto a la piperazina
Ademaacutes se plantea una nueva unioacuten
por puente de hidroacutegeno entre el
NH libre y la ASP 34
Figura 86 Representacioacuten de las interacciones de 5f
Ensayos computacionales
204
En la figura 87 el compuesto 6f se
diferencia del anterior en que en lugar de
un FNFT se tiene un FBZN que plantea
una unioacuten con el resto TYR 192 Se ve a
simple vista la disminucioacuten en la cantidad
de interacciones apolares que hay en la
moleacutecula
Figura87 Representacioacuten de las interacciones de 6f
En la figura 88 se representa el
compuesto 6a Se puede ver como de
nuevo el anillo de PIPZ vuelve a dar
interacciones apolares y aporta
regiones ionizables aunque se pierde
el puente de hidroacutegeno con ASP 34
Figura 88 Representacioacuten de las interacciones de 6a
En esta uacuteltima figura 89 se
representa el compuesto 6g que se
diferencia del anterior en que la
amina central es la PIRD Este ciclo
posibilita una interaccioacuten con TYR 77
y VAL 78 La distribucioacuten de
interacciones apolares se asemeja a la
de la moleacutecula 5c ya que el
sustituyente tambieacuten de caraacutecter
electro-atrayente se encuentra en
posicioacuten para del anillo
Figura 89 Representacioacuten de las interacciones de 6g
En este estudio se incluyoacute una seacuteptima moleacutecula el derivado 4b Este
compuesto se diferencia del resto de los sintetizados en que su cadena alifaacutetica
cuenta con dos aacutetomos de carbono lo que significa que la separacioacuten entre el OH
y la amina es de un uacutenico carbono Los caacutelculos sobre energiacuteas y configuraciones
espaciales de maacutexima estabilidad para una correcta interaccioacuten con la diana
Ensayos Computacionales
205
propuesta mostraron que el compuesto 4b puede adoptar una conformacioacuten que
le permitiriacutea acceder al hueco activo de la plasmepsina pero no se produciriacutea la
interaccioacuten caracteriacutestica del grupo OH y la ASP 214
Estos datos ofrecen la posibilidad de un farmacoacuteforo que se muestra en la
figura 90
Figura 90 Farmacoacuteforo propuesto para los derivados de arilaminoalcoholes con actividad antimalaacuterica que tienen como diana propuesta la plasmepsina II
En la imagen del farmacoacuteforo quedan destacadas en amarillo las zonas
apolares que establecen interacciones hidrofoacutebicas con los aminoaacutecidos del sitio
activo de la plasmepsina y que se corresponden con la zona aromaacutetica Ar1 Las
flechas granate sentildealan las posibles interacciones que establece el aacutetomo de fluacuteor
Las flechas verdes sentildealan las interacciones polares entre los grupos polares y la
ASP 214 Asiacute de la zona azul correspondiente a las interacciones de la amina se
destaca una segunda interaccioacuten de los NH libres con la enzima en el resto ASP
34 El resto del ciclo de amina establece interacciones apolares
En la imagen la parte de Ar2 por su naturaleza aromaacutetica tambieacuten plantea
interacciones apolares con la enzima propuesta
Con los datos obtenidos y tomando como diana la enzima plasmepsina se puede
proponer un nuevo esquema para seguir con el refinamiento estructural
Ensayos computacionales
206
Figura 91 Estructura general planteada para el refinamiento estructural
Las nuevas estructuras deberaacuten contar con un grupo hidroxilo separado por un
espaciador alifaacutetico de una longitud miacutenima de dos carbonos con una amina A
ambos lados de la moleacutecula se dispondraacuten las zonas de interaccioacuten apolar
formadas por sistemas aromaacuteticos sencillos o conjugados sutituidos por grupos
de caraacutecter electroatrayente como haloacutegenos metoxi o trifluorometoxi
Ensayos Computacionales
207
XII4 Discusioacuten de resultados de modelizacioacuten
Los estudios computacionales proponen como diana de los compuestos
desarrollados en este trabajo la plasmepsina II Seguacuten los datos obtenidos para
las diferentes estructuras estudiadas se pueden establecer relaciones
estructura-actividad Estos resultados se ven confirmados por las distintas
interacciones de los compuestos en su conformacioacuten maacutes estable dentro de
hueco activo de la enzima
Al estudiar los resultados de las diferentes interacciones por zonas de las
moleacuteculas en las figuras 84 a 89 se podriacutea dar una explicacioacuten de la diferente
actividad mostrada por los compuestos ensayados
Queda evidenciado desde la primera aproximacioacuten computacional que el
puente de hidroacutegeno entre el grupo OH y la ASP 214 es el punto clave en la
validacioacuten de la plasmepsina II como diana de los compuestos Esta interaccioacuten
confirma que es requisito indispensable para la actividad de los derivados la
presencia de un grupo OH en la estructura
Los sistemas aromaacuteticos conjugados o anillo aromaacutetico que conforman Ar1
son sistemas completamente apolares que ejercen interacciones hidrofoacutebicas
con los restos apolares del bolsillo activo de la enzima como isoleucina (ILE)
fenilalanina (PHE) o leucina (LEU) Cuanto mayor es la nube de electrones π del
sistema Ar1 mayores son las interacciones con los sistemas π de los
aminoaacutecidos que explica porqueacute los derivados de la Serie 5 tienen maacutes
actividad que los de la Serie 6 Varias representaciones plantean una posible
unioacuten polar del aacutetomo de fluacuteor con tirosina (TYR) que aumentariacutea la interaccioacuten
global de la moleacutecula y aclara el porqueacute los derivados fluorados son maacutes afines
que los no fluorados
La longitud de la cadena alifaacutetica tambieacuten juega un papel importante en la
actividad de los derivados la disminucioacuten de tres aacutetomos de carbono a dos de
la cadena alifaacutetica ha supuesto una disminucioacuten draacutestica de la actividad (veacuteanse
los compuestos 3b y 4b) Los estudios realizados al compuesto 4b podriacutean
explicar esta disminucioacuten Los carbonos de la cadena alifaacutetica tienen capacidad
de rotar lo que confiere a la estructura mayor capacidad para adoptar
diferentes conformaciones que le permiten llegar a la disposicioacuten de miacutenima
energiacutea Los derivados ensayados con un carbono alifaacutetico menos seguacuten las
previsiones teoacutericas adoptan una conformacioacuten que les permite acceder al
Ensayos computacionales
208
hueco activo de la plasmepsina II pero no permite la unioacuten del grupo OH con
el resto ASP 214 que se predice como esencial para la actividad de los
compuestos presentados en este trabajo Se puede predecir que teoacutericamente la
plasmepsina II no es la diana adecuada para los derivados de la Serie 0 14 y 15
y 4b
La naturaleza de la amina central juega un papel muy importante en este tipo
de estudios Puede verse en las representaciones que seguacuten sea la amina
piperazina o amino-piperidina las interacciones con el entorno son muy
diferentes Centrando la atencioacuten en los derivados de PIPZ se observa que el
ciclo por completo da lugar a una regioacuten ionizable por el efecto del N y las
interacciones electrostaacuteticas del ciclo debidas al plegamiento espacial que
confiere estabilidad Si ahora se estudian las PIPR lo que se puede ver es que el
ciclo pierde interaccioacuten apolar con el medio ya que se plantea un nuevo puente
de hidroacutegeno del grupo NH libre con el resto ASP 34 Esta segunda unioacuten polar
hace que la moleacutecula adquiera menos energiacutea y maacutes estabilidad dentro del
hueco activo que justifica por queacute los derivados de amino-piperidina muestran
maacutes actividad (compuestos 2a y 2f 5a y 5f 6a y 6f)
Los grupos CF3 y NO2 presentes en Ar2 y OH seguacuten el mapa MEP de
potenciales electrostaacuteticos son restos que aportan polaridad a las moleacuteculas La
posibilidad de establecer nuevas interacciones polares maacutes fuertes con sitios del
hueco de la plasmepsina podriacutea explicar por queacute son maacutes activos los
compuestos con estos restos
Con los datos obtenidos en los estudios computacionales se puede proponer
un posible farmacoacuteforo para la plasmepsina II En la figura 89 se ve como las
interacciones maacutes importantes son las descritas teoacutericamente para los enlaces
polares del OH con la ASP214 NH libre con ASP 34 y la posible interaccioacuten del
aacutetomo de fluacuteor de Ar1 con otros restos como tirosina lo que justifica los datos de
actividad de los derivados El resto de interacciones con el sitio activo son
producidas por los restos apolares de la estructura lo que sugiere que es
necesaria la presencia de zonas aromaacuteticas terminales como son los NFT o BZN
en Ar1 y Ar2 Los datos disponibles no permiten establecer una hipoacutetesis sobre
la influencia del tamantildeo de las zonas aromaacuteticas ni de los sustituyentes
presentes en la zona aromaacutetica de Ar2
CONCLUSIONES
Conclusiones
211
El objetivo de este trabajo ha sido la obtencioacuten de nuevos arilaminoalcoholes
como agentes antimalaacutericos para el tratamiento de la malaria resistente al
tratamiento con cloroquina
En las paacuteginas de esta memoria se han presentado los antecedentes del tema
los objetivos fijados y el plan de trabajo para su desarrollo Se ha realizado la
parte experimental correspondiente y ha sido descrito el trabajo realizado en la
preparacioacuten de los compuestos asiacute como en los ensayos bioloacutegicos y
computacionales Finalmente se ha realizado la discusioacuten de los diferentes
resultados obtenidos para obtener unas conclusiones estructura actividad de los
compuestos que se presentan
Desde el punto de vista quiacutemico las aportaciones son las siguientes
1 Se ha sintetizado cuarenta y siete nuevos compuestos derivados de
arilaminas identificados mediante teacutecnicas claacutesicas de elucidacioacuten
estructural como cromatografiacutea de capa fina espectroscopia infrarroja
resonancia magneacutetica nuclear de protoacuten anaacutelisis elemental y punto de
fusioacuten
2 Se ha logrado optimizar rutas sinteacuteticas anteriormente utilizadas para
obtener derivados con mejores rendimientos En el caso de la siacutentesis de
aminas sustituidas se ha comprobado que una relacioacuten molar de amina
protegida-halogenuro de arilo 151 mejora considerablemente los tiempos
de reaccioacuten El uso de esta proporcioacuten de reactivos de partida favorece que
la reaccioacuten finalice en una hora En la obtencioacuten de los derivados
carboniacutelicos por siacutentesis de Mannich la reaccioacuten se optimiza cuando la
temperatura de reflujo se mantiene entre 130 y 140 ordmC De esta forma el
tiempo necesario para completar la reaccioacuten se reduce a un maacuteximo de tres
horas
3 La aplicacioacuten de la cromatografiacutea en columna flash para la purificacioacuten de
23 de los 47 compuestos ha supuesto un notable avance en la obtencioacuten de
los derivados Las condiciones de trabajo se han adaptado a las necesidades
de cada reaccioacuten reducieacutendose asiacute los tiempos globales de siacutentesis
aumentando los rendimientos y disminuyendo los costes
Desde el punto de vista bioloacutegico las aportaciones son las siguientes
1 Diez de los treinta compuestos evaluados in vitro frente a cepas de
Plasmodium falciparum FCR-3 cloroquino resistentes presentan un valor de
CI50 inferior a 1 microM Quince derivados muestran un nivel de citotoxicidad
en ceacutelulas VERO menor de 50 microM Estos resultados permiten confirmar que
la hipoacutetesis de trabajo planteada fue bien dirigida hacia los objetivos
establecidos
2 Los compuestos 2a y 5f fueron seleccionados para desarrollar ensayos in
vivo Los resultados obtenidos no superan los datos de parasitemia y
supervivencia obtenidos en el tratamiento con CQ
3 Los datos obtenidos en los estudios realizados a la totalidad de los
compuestos presentados en este trabajo indican buenas propiedades
fisicoquiacutemicas de solubilidad y distribucioacuten de cargas electrostaacuteticas Con
estos datos teoacutericos se predice un buen perfil de absorcioacuten en el caso de
tratamientos por viacutea oral
4 Los estudios computacionales proponen como diana de los compuestos
desarrollados en este trabajo la enzima Plasmepsina II que interviene en
los procesos de degradacioacuten de la Hb Quedando pendiente su validacioacuten
experimental
5 Siete de los veintiuacuten derivados hidroxiacutelicos que mostraron buenas
actividades in vitro fueron seleccionados para los estudios de acoplamiento
(docking) con la enzima diana plasmepsina II Se obtuvieron buenos
resultados de acoplamiento de los derivados seleccionados en el sitio activo
de la enzima debido a la unioacuten por puente de hidroacutegeno del grupo
hidroxilo con el resto ASP 214 reforzado por el resto de interacciones
electrostaacuteticas de las zonas apolares de la moleacutecula y restos apolares del
hueco activo de la plasmepsina II
De los resultados bioloacutegicos obtenidos se puede establecer la siguiente
relacioacuten estructura-actividad
1 El estudio de la actividad antimalaacuterica ha demostrado que es esencial la
presencia de un grupo hidroxilo en la estructura Queda demostrado que
los compuestos de las Series 1 a 7 muestran actividad significativa frente al
Plasmodium falciparum resistente a la CQ Los derivados cetona (Serie 0) y
oxima (Serie 8) carecen de intereacutes seguacuten los datos de actividad
Conclusiones
213
2 Entre los derivados hidroxiacutelicos los compuestos de las Series 2 5 y 6 son
los que muestran mejores actividades debido a la presencia de un aacutetomo de
fluacuteor en la posicioacuten 5 del benzo[b]tiofeno en la posicioacuten 4 del naftaleno y
para del benceno respectivamente A su vez son los derivados de las Series
5 y 6 (naftalenos y bencenos) los que han mostrado mejores potenciales
antimalaacuterico
3 La longitud miacutenima de la cadena alifaacutetica debe ser tres unidades que
permitan la libre rotacioacuten estructural Los estudios computacionales
plantean que la disminucioacuten de un aacutetomo de carbono de la cadena alifaacutetica
imposibilita la unioacuten esencial de la estructura a la diana propuesta
4 La amina central juega un papel importante en la actividad-toxicidad de las
estructuras Los resultados obtenidos apuntan a que las piperazinas y
tetrahidropiridinas (compuestos 5a 5b 5c 5g 6a y 6g) son las aminas maacutes
adecuadas para formar parte de los compuestos antimalaacutericos por su buena
relacioacuten toxicidad y actividad in vitro Las piperidinas han resultado maacutes
activas (5f y 6f) pero a su vez mas toacutexicas
5 Los sustituyentes o-trifluorometil y p-nitro benceno (compuestos 5a 5f 6a y
6f) confieren en general buena actividad a los derivados estudiados Los
derivados de aril-tetrahidropiridinas sustituidos con un fluacuteor en para
(compuestos 5g y 6g) tambieacuten demuestran buena actividad antimalaacuterica
Con los datos obtenidos del estudio de los derivados sintetizados se ha
establecido un farmacoacuteforo que permite continuar con el refinamiento
estructural de estos nuevos arilaminoalcoholes Queda abierta la viacutea a la
optimizacioacuten de las estructuras la profundizacioacuten en ensayos bioloacutegicos y en el
mecanismo de accioacuten propuesto para la validacioacuten de la diana plasmepsina II
Conclusions
215
CONCLUSIONS
The objective of this work was to obtain new arylamino alcohols as
antimalarial agents for treating chloroquine-resistant malaria
This thesis presents general background information the proposed objectives
and the plan established for developing the work The experimental part was
carried out and a description of the work involved in preparing the
compounds and in performing biological assays and computational analysis
has also been provided Finally this thesis includes a discussion of the all
results obtained and the structure-activity conclusions reached regarding the
compounds presented here
From a chemical standpoint the work carried out made the following
contributions
1 Forty-seven new arylamino-derived compounds (identified by classical
structural elucidation techniques such as thin layer chromatography
infrared spectroscopy proton nuclear magnetic resonance elemental
analysis and melting point) were synthesized
2 Previously used synthetic routes were optimized so as to obtain derivatives
with better yields In the case of the synthesis of substituted amines a molar
ratio of protected amine to aryl halide 151 improves the reaction times
considerably The use of this proportion of starting reagents helps the
reaction to finish in just one hour In obtaining the carbonyl derivatives by
Mannich reaction the reaction is optimized when the reflux temperature is
maintained between 130 and 140 ordmC Therefore time needed to complete the
reaction is reduced to a maximum of three hours
3 Applying flash column chromatography for the purification of 23 out of the
47 compounds has made a notable advance in obtaining the derivatives
The work conditions have been adapted to the specific needs of each
reaction thereby reducing the time needed for syntheses increasing the
yields and bringing down the costs involved
From a biological point of view contributions from this work included the
following
4 Ten out of the thirty compounds evaluated in vitro against chloroquine-
resistant Plasmodium falciparum strain FCR-3 presented an IC50 value less
Conclusions
216
than 1 microM Fifteen derivatives showed a toxicity level in VERO cells that is
less than 50 microM These results show that the established work hypothesis
was a good approach for attaining the proposed objectives
5 Compounds 2a and 5f were selected for developing in vivo assays The
results obtained do not improve the parasitemia and survival data obtained
in treatment with CQ
6 The data obtained from the assays that were performed on all the
compounds presented in this work indicate good physicocochemical
properties of solubility and good electrostatic charge distribution With this
theoretical data a good absorption profile is predicted in the case of orally
administered treatments
7 The computational studies propose the enzyme plasmepsin II as the target
of the compounds that were developed in this study this enzyme is
involved in the degradation processes of Hb although experimental
validation is still pending
8 Seven out of the twenty-one hydroxyl derivatives which showed good in
vitro activity were chosen for docking studies with the target enzyme
plasmepsin II Good docking results were obtained from the selected
derivatives in the active site of the enzyme due to the bonding of the
hydroxyl group with the ASP 214 by means of a hydrogen bridge
reinforced by the rest of the electrostatic interactions from the nonpolar
areas of the molecule and nonpolar rests from the active gap of plasmepsin
II
The following structure-activity relationship has been established from the
biological results that were obtained in the study
9 The antimalarial activity study has demonstrated that the presence of a
hydroxyl group is essential in the study It has been demonstrated that the
compounds from Series 1 to 7 show significant activity against CQ-resistant
Plasmodium falciparum Based on their activity data the ketone (Series 0)
and oxime (Series 8) derivatives are not of interest
10 From among the hydroxyl derivatives compounds from the Series 2 5 and
6 show the best activity due to the presence of a fluorine atom in position 5
of the benzo[b]thiophene in position 4 of the naphthalene and in para
position of the benzene respectively In addition derivatives from the
Conclusions
217
Series 5 and 6 (naphthalenes and benzenes) have shown better antimalarial
potential
11 The minimum length of the aliphatic chain should be three units that
permit free rotation The computational studies suggest that a decrease of
one carbon atom from the aliphatic chain impedes the essential linking of
the structure to the proposed target
12 The central amine plays an important roll in the toxicity-activity of the
structures The obtained results appear to indicate that the piperazines and
tetrahydropyridines (compounds 5a 5b 5c 5g 6a and 6g) are the most
adequate amines for forming part of the antimalarial compounds due to
their good activity-toxicity relationships in vitro The piperidines were more
active (5f and 6f) but they were also more toxic
13 In general the o-trifluoromethyl y p-nitro benzene substituents (compounds
5a 5f 6a and 6f) give good activity to the derivatives that were studied The
aryl-tetrahydropyridine derivatives that are substituted with fluorine in
para position (compounds 5g and 6g) also show good antimalarial activity
With the data obtained from the study carried out on the synthesized
derivatives a pharmacophore has been established which permits continuing
with the structural refinement of these new arylamino alcohols The road for
optimizing structures and advancing in biological testing and in the mechanism
of action proposed for validating the target plasmepsin II remains wide open
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ANEXOS
El trabajo presentado en esta memoria ha sido realizado gracias a la
concesioacuten de la ldquoAyuda para la Formacioacuten de Tecnoacutelogosrdquo concedida por el
Gobierno de Navarra y la ldquoAyuda al Personal Investigador en Formacioacutenrdquo
concedida por la Asociacioacuten de Amigos de la Universidad de Navarra
A mis padres y mi hermana
A Javi y Julen
ldquoPuede que los ideales que albergamos
nuestros suentildeos maacutes anhelados y nuestras maacutes fervientes esperanzas
no lleguen a cumplirse mientras vivimos
Pero eso no importa
Saber que en tu diacutea cumpliste con tu deber y
estuviste a la altura de las expectativas de tus congeacuteneres
es por siacute misma una experiencia gratificante y un logro magniacuteficordquo
Nelson Mandela
Agradecimientos
La realizacioacuten de esta tesis doctoral no hubiese podido llevarse a cabo sin la ayuda y
el apoyo de las personas que han compartido conmigo estos uacuteltimos antildeos A todos
ellos que han hecho posible hoy la presentacioacuten de este trabajo deseo expresar mi maacutes
sincero agradecimiento
Mi agradecimiento especial al Dr Antonio Monge la persona de referencia durante
el desarrollo de todo este trabajo Por apostar por miacute y mi trabajo en momentos en que
todo pareciacutea que no llegariacutea a teacutermino Por ensentildearme que todo el trabajo merece la
pena que la contribucioacuten de todos es igual de vaacutelida que somos una familia Gracias
por su apoyo en los buenos y malos momentos personales
Mi gratitud a la Dra Silvia Peacuterez Silanes por estar siempre dispuesta a ayudarme en
todo lo que fuese necesario en todos los planos de la vida durante estos antildeos por su
gran implicacioacuten en este proyecto por transmitirme tesoacuten orden correccioacuten y sobre
todo optimismo durante todo este tiempo que he tenido el honor de trabajar a su lado
Gracias al Dr Ignacio Aldana la persona que me ofrecioacute la oportunidad de
introducirme en el mundo de la investigacioacuten por ayudarme y apoyarme en todo
momento y transmitirme que en investigacioacuten tambieacuten es importante la tranquilidad
I wish to express my gratitude to Dr Valerie Jullian for being such a splendid host
during my first few days in Toulouse and for considering my small contribution to his
magnificent work to be of importance
I would also like to thank Dr Michel Sauvain for introducing me into the world of in
vivo biological research He accepted the challenge of introducing a chemist into his
specialized area of experimentation with live rodents showing a great amount of
patience with me
I want to give a special thanks to Dr Eric Deharo who had faith in this work and
whose collaboration was immensely helpful He provided the necessary contacts of
other researchers outside the University of Navarras RampD department and
coordinated the project contributing to the success of this work
I would also like to give a special mention to Adriana Pabon from Colombia and to
German Gonzalez Giovanni Garavito and Miguel Quiliano from Peru for their active
participation in this project
A todos los compantildeeros de laboratorio con los que he trabajado estos antildeos
A mi familia por animarme a seguir siempre adelante al hacerme sentir en todo
momento que todo este trabajo es algo de gran importancia y valor humano
ABREVIATURAS
ABS Porcentaje de absorcioacuten
ADN Aacutecido desoxirribonucleico
AMREF African Medical and Reserch Foundation
ARN Aacutecido ribonucleico
ASP 214 Aspartato 214
ASP 34 Asptartato 34
ATP Adenosin trifosfato
BZN Benceno
BZT Benzotiofeno
CCF Cromatografiacutea en capa fina
CDCl3 Triclorometano deuterado
CI50 Concentracioacuten Inhibitoria al 50
COSY Correlated Espectroscopy H-H
CQ Cloroquina
CSP Proteina circumsporozito
DDT Dicloro-difenil-Tricloroetano
DEET NN-dimetil-meta-toluamida
DEPT 90 Distorsionless Enhancement by Polarization Transfer (CH)
DEPT-135 Distorsionless Enhancement by Polarization Transfer
DMEN F-12 Medio de cultivo con mezcla de nutrientes
DMSO Dimetilsulfoacutexido
DOXP Enzima 1-desoxi-D-xilulosa-5-fosfato
DT50 Dosis Toacutexica al 50
ECDC European Centre for Disease Prevention and Control
EMP-1 Proteiacutena de la membrana epitelial
FM Foacutermula Molecular
FAS II Siacutentesis de aacutecidos grasos II
FBZT Fluoro-benzotiofeno
FCR-3 Cepas Plasmodium Falciparum Cloroquino-resistente
FNFT Fluoro-naftaleno
FRP Asociacioacuten de la lucha contra el Paludismo
Hb Hemoglobina
HMBC Heteronuclear Multiple Bond Correlation
HMQC Heteronuclear Multiple Quantum Correlation
HPLC High Performance Liquid Chromatography
HRP-2 Proteiacutena Rica en Histidina
IC50 Concentracioacuten Inhibitoria del 50
IR Espectroscopia Infrarroja
IS Iacutendice de Selectividad
J Constante de Acoplamiento
K Lisina (coacutedigo de una letra)
LDH Lactato Deshidrogenasa
MSP-1 Proteiacutena de superficie del merozoiacuteto
MTT Bromuro de 3-(45- dimetiltiazol-2-ilo)-25-difeniltetrazol
NaOH Hidroacutexido de sodio
NEAA Nonessential amino-acids
NFT Naftalenos
OMS Organizacioacuten Mundial de la Salud (en ingleacutes WHO)
PM Peso Molecular
PENUD Programa de Naciones Unidas para el Desarrollo
PfCRT Proteiacutena Transportadora del Plasmodium falciparum causante
de la resistencia a la Cloroquina
PIPR Piperidina
PIPZ Piperazina
PIRD Tertrahidropiridina
PIRR Pirrolidina
R Arginina (coacutedigo de una letra)
RMN Resonancia Magneacutetica Nuclear
RMSD (Root-mean-square derivation) Desviacioacuten de la media
cuadraacutetica
S Serina (coacutedigo de una letra)
S163R Mutacioacuten arginina-serina en posicioacuten 163 que invierte la
resistencia a la Cloroquina
T Treonina (simplificacioacuten para codificacioacuten en aminoaacutecidos)
TCA Terapias Combinadas de Artemisina
THR Treonina
TNFα Factor de Necrosis tumoral
TPSA Aacuterea superficial Topoloacutegica
TYR Tirosina
UNICEF Fondo de Naciones Unidas para la Infancia
Iacutendice
INTRODUCCIOacuteN 1
I MALARIA 3
I1 Definicioacuten 5
I2 Historia de la enfermedad 5
I3 Epidemiologiacutea 7
I31 Situacioacuten global de la enfermedad 7
I32 Factores epidemioloacutegicos 11
I33 Tipologiacutea de aacutereas endeacutemicas 11
I34 Zonas endeacutemicas e inmunidad 12
II MALARIA Y PLASMODIUM 13
II1 El Plasmodium 15
II11 Caracteriacutesticas morfoloacutegicas 15
II12 Mecanismo de movilidad 16
II13 Mecanismo de invasioacuten celular 16
II14 Metabolismo para el crecimiento 17
II2 Ciclo de la malaria 18
II21 Ciclo de vida del paraacutesito 18
II22 Desarrollo de los esquizontes 20
II3 Especies de Plasmodium 22
II4 Sintomatologiacutea 25
II5 Deteccioacuten y diagnoacutestico 26
III PREVENCIOacuteN Y TRATAMIENTO 29
III1 Medidas preventivas 31
III2 Tratamiento 32
III21 Historia del tratamiento 32
III22 Clasificacioacuten de los compuestos antimalaacutericos 33
III23 Aparicioacuten de resistencias 38
III24 Tratamientos actuales 40
III3 Estrategias mundiales en la lucha contra la malaria 43
III4 Liacuteneas de investigacioacuten actual 44
III41 Buacutesqueda de nuevas dianas 44
III42 Productos naturales 46
III43 Desarrollo de vacunas 47
ANTECEDENTES 49
OBJETIVOS Y PLAN DE TRABAJO 53
IV OBJETIVOS 55
V PLAN DE TRABAJO 59
V1 Disentildeo de nuevos arilaminoalcoholes 61
V2 Siacutentesis de los compuestos disentildeados 63
V3 Caracterizacioacuten de los compuestos 63
Iacutendice
V4 Evaluacioacuten bioloacutegica ldquoin vitrordquo 64
V5 Evaluacioacuten bioloacutegica ldquoin vivordquo 64
V6 Estudios computacionales 64
MATERIAL Y MEacuteTODOS 65
VI QUIacuteMICA TEOacuteRICA 67
VI1 Esquema general de siacutentesis 69
VI2 Siacutentesis de precursores 70
VI21 Siacutentesis de (benzo[b]tiofen-3-il)-3-cloropropan-1-ona 70
VI22 Siacutentesis de arilaminas 70
VI3 Siacutentesis de derivados carboniacutelicos (Serie 0) 73
VI31 Condensacioacuten de 1-(benzo[b]tiofen-3-il)-3-cloropropan-1-ona y de 2-bromo-2acute-acetonaftona
con la amina (Viacutea 1) 73
VI32 Reaccioacuten de Mannich Condensacioacuten de metilcetonas con aminas en medio aacutecido (Viacutea 2) 74
VI4 Siacutentesis de derivados hidroxiacutelicos (Series 1-7) 75
VI5 Siacutentesis de oximas (Serie 8) 78
VII QUIacuteMICA EXPERIMENTAL 81
VII1 Instrumental y reactivos 83
VII2 Meacutetodos de elucidacioacuten estructural 83
VII3 Denominaciones de compuestos 85
VII4 Descripcioacuten general de meacutetodos de siacutentesis 86
VII41 Meacutetodo A procedimiento general para la obtencioacuten de las arilaminas protegidas 86
VII42 Meacutetodo B procedimiento general para la desproteccioacuten de aminas 87
VII43 Meacutetodo C procedimiento general para condensacioacuten de aminas (Viacutea 1) 87
VII44 Meacutetodo D procedimiento de condensacioacuten de aminas (Viacutea 2) 87
VII45 Meacutetodo E procedimiento general para la reduccioacuten de cetonas 88
VII46 Meacutetodo F procedimiento general para siacutentesis de oximas desde carbonilos 88
VII5 Purificacioacuten por cromatografiacutea flash 89
VIII ENSAYOS BIOLOacuteGICOS 91
VIII1 Ensayos in vitro 93
VIII2 Ensayos toxicoloacutegicos 94
VIII3 Ensayos in vivo 94
VIII31 Instrumental y reactivos 95
VIII32 Metodologiacutea 95
IX ESTUDIOS COMPUTACIONALES 105
IX1 Propiedades fisicoquiacutemicas de los compuestos 107
IX2 Optimizacioacuten geomeacutetrica 107
IX3 Estudios de Acoplamiento Molecular (Docking) 108
RESULTADOS Y DISCUSIOacuteN 111
X DESCRIPCIOacuteN DE COMPUESTOS 113
Iacutendice
X1 Siacutentesis de precursores 115
X2 Siacutentesis de derivados carboniacutelicos (Serie 0) 120
X3 Siacutentesis de derivados hidroxiacutelicos 143
X4 Siacutentesis de Oximas (Serie 8) 165
X5 Purificacioacuten de compuestos por cromatografiacutea flash 167
X6 Elucidacioacuten estructural de compuestos por RMN 168
X61 Elucidacioacuten estructural para los derivados de piperazina 168
X62 Elucidacioacuten estructural para los derivados de piperidina 175
X63 Elucidacioacuten estructural para los derivados de tetrahidropiridina 180
XI ENSAYOS BIOLOacuteGICOS 187
XI1 Ensayos de actividad antiplasmoacutedica in vitro 189
XI2 Ensayos de actividad antiplasmoacutedica in vivo 191
XI3 Discusioacuten de ensayos bioloacutegicos 192
XII ENSAYOS COMPUTACIONALES 195
XII1 Propiedades fisicoquiacutemicas de los compuestos 197
XII2 Discusioacuten de propiedades fisicoquiacutemicas 199
XII3 Estudios de Modelizacioacuten y Acoplamiento Molecular 200
XII4 Discusioacuten de resultados de modelizacioacuten 207
CONCLUSIONES 209
BIBLIOGRAFIacuteA 219
ANEXOS 231
INTRODUCCIOacuteN
II MMAALLAARRIIAA
Malaria
5
I1 Definicioacuten
La malaria fiebre paluacutedica o tambieacuten llamada paludismo es una enfermedad
infecciosa causada por el paraacutesito protozoario del filo Apicomplexa clase
Aconoidasida orden Haemosporididae de la familia Plasmodiidae del geacutenero
Plasmodium1 y es transmitido por la hembra del mosquito del geacutenero Anopheles
La malaria es una de las enfermedades tropicales maacutes importante del mundo
que provoca la muerte de miles personas Estaacute estrechamente ligada a la
pobreza y a la evolucioacuten y el desarrollo del hombre
Los mayores problemas en la lucha contra la enfermedad ademaacutes de la crisis
actual que reduce los fondos destinados a los paiacuteses en viacuteas de desarrollo (que
son los maacutes afectados) son la constante aparicioacuten de resistencias por el uso de
monoterapias en tratamientos y debido a los insecticidas utilizados
I2 Historia de la enfermedad
La historia de la malaria es tan antigua como la historia de la civilizacioacuten ya
que se tiene constancia de la presencia de la enfermedad en manuscritos
originarios de China la India o el Antiguo Egipto
Teniendo en cuenta esto se puede entender de donde proviene el nombre de
la enfermedad La palabra malaria proviene de las palabras ldquomal ndashairerdquo que
fueron empleadas en Italia para describir las fiebres intermitentes asociadas a la
exposicioacuten al ambiente de las marismas o cieacutenagas El otro nombre por el que
nos referimos a la enfermedad proviene del latiacuten ldquopalusrdquo que significa pantano
cieacutenaga de ahiacute la denominacioacuten de fiebres paluacutedicas o paludismo
Aunque su nombre tiene su origen en Europa se cree que los paraacutesitos se
desarrollaron en el oeste y centro oeste de Aacutefrica y en el sudeste asiaacutetico Es
importante tener en cuenta su estrecha relacioacuten con la historia natural Ha sido
la evolucioacuten del hombre la que ha expandido la enfermedad de ahiacute que hay
que ser muy conscientes de que durante la historia de la humanidad ha habido
picos de enfermedad ocasionados por la accioacuten del hombre y su desarrollo No
es de extrantildear dicha variacioacuten en la incidencia cuando en China hace maacutes de
5000 antildeos que se conoce la enfermedad2 y los textos egipcios dejan constancia
1httpwwwncbinlmnihgovTaxonomy 2 httpwwwmalariasitecommalariahistory_literaturehtm
Malaria
6
de ella desde hace ya 4000 antildeos Se puede saber por textos antiguos que la
enfermedad se extiendioacute por el mar Mediterraacuteneo hace 2000 antildeos y que al Norte
de Europa llegoacute hace aproximadamente 1000 antildeos Podemos darnos cuenta de
que la malaria ha avanzado unida a la historia del hombre si se tiene en cuenta
que cada vez es mayor la intercomunicacioacuten de sociedades alejadas
geograacuteficamente las continuas guerras e invasiones las rutas comerciales el
comercio de esclavos la profundizacioacuten y especializacioacuten de cultivos propensos
a la criacutea del paraacutesito como arrozales (humedales) el desarrollo de los medios de
transporte que permiten viajar a grandes distancias el aumento y la lejaniacutea de
las migraciones la democratizacioacuten de las vacaciones el comercio-intercambio
de grandes cantidades de alimentos el cada vez mayor trasiego de animales
vivos
Alrededor de 400 aC en la antigua Roma Hipoacutecrates fue el primero en
describir las manifestaciones tiacutepicas de la malaria que la diferenciaba de otras
enfermedades estudioacute la eacutepoca del antildeo donde aumentaba la enfermedad y el
lugar de vida de los enfermos Con ello establecioacute una relacioacuten enfermedad-
agua estancada que dio lugar a los primeros programas de drenaje de agua en
Roma y a la primera intervencioacuten contra la malaria
La escuela hipocraacutetica sosteniacutea que la enfermedad era el resultado de un
desequilibrio en el cuerpo de los cuatro humores unos fluidos que en las
personas sanas se encontraban naturalmente en una proporcioacuten semejante
Cuando los cuatro humores (sangre bilis negra bilis amarilla y flema) se
desequilibraban (laquodyscrasiaraquo mala mezcla) el individuo enfermaba y
permaneciacutea enfermo hasta que se recuperaba el equilibrio La terapia
hipocraacutetica se concentraba en restaurar este equilibrio El tratamiento maacutes
administrado era la purga de la sangre
No seriacutea hasta el antildeo 100 dC cuando se pensoacute que la enfermedad se
transmitiacutea por inhalacioacuten de vapores de la enfermedad el ldquomal airardquo italiano
No era tan errado el diagnoacutestico ya que por el aire vuelan los responsables de
transmitir los paraacutesitos que ocasionan la enfermedad Del otro sinoacutenimo de
malaria se deriva una confusioacuten semejante que llega tambieacuten indirectamente
del aire el paludismo rdquopalusrdquo en latiacuten designa a los pantanos que se creiacutean
responsables de la dolencia pero en realidad era donde proliferaban los
mosquitos Habraacute que esperar hasta 1898 en que se demostroacute que la malaria era
Malaria
7
transmitida por estos cuando ya se relacionaba la enfermedad con larvas del
moquito y microorganismos involucrados en la infeccioacuten
El nacimiento y desarrollo de la microbiologiacutea supuso un salto importante en
el conocimiento de las ciencias y como no podiacutea ser menos impulsoacute el
conocimiento de la enfermedad Asiacute en el antildeo 1880 el cirujano franceacutes Charles
Louis Alphonse Laveran (disciacutepulo de Pasteur) observoacute en Argelia los paraacutesitos
dentro de los gloacutebulos rojos de personas infectadas Planteoacute entonces que la
enfermedad era causada por protozoos siendo esta la primera vez que se
asociaba un protozoo con una enfermedad humana Posteriormente sus
estudios sobre protozoos le reportaron el Nobel de Medicina en 1907 aunque
fueron los cientiacuteficos italianos Ettore Marchiafava y Angelo Celli los que
bautizaron a estos protozoos con el nombre de ldquoPlasmodiumrdquo Carlos Finlay
meacutedico cubano sugirioacute por sus conocimientos sobre la fiebre amarilla que la
malaria podiacutea ser transmitida tambieacuten por mosquitos Hipoacutetesis confirmada en
el antildeo 1898 por Sir Ronald Ross en la India por lo que le fue concedido el
premio Nobel de medicina en 1902 Desde ese momento los estudios
protozoarios fueron avanzando y al poco tiempo en el antildeo 1899 Grassi
Bignami y Basianelli descubrieron el ciclo completo de la enfermedad el ciclo
celular protozoario y su transmisioacuten3
Desde entonces hasta la actualidad se han desarrollado diferentes
conocimientos y modos de prevencioacuten y tratamiento Un caso muy interesante
y uacutetil de estos avances fue el hecho de que los trabajos realizados por Finlay y
Ross sirvieron para crear las primeras guiacuteas de salud muy uacutetiles en eventos tan
importantes para el mundo como la construccioacuten del Canal de Panamaacute
I3 Epidemiologiacutea
I31 Situacioacuten global de la enfermedad
Seguacuten el informe de 2011 de la OMS4 sobre malaria son 106 paiacuteses los que
incluyen esta enfermedad como endeacutemica Se estima en 216 millones los casos
registrados a nivel mundial de los que se han producido 266 mil muertes Los
esfuerzos en la lucha contra la enfermedad de los diferentes organismos
3 httpwwwmedicinamcom 4httpwwwwhointmalariaes
Malaria
8
internacionales han dado como resultado un descenso de un 25 de las tasas de
mortalidad por malaria en la uacuteltima deacutecada5
Figura 1 Distribucioacuten mundial de la malaria paiacuteses libres endeacutemicos y en tratamiento6
En la figura 1 se observa coacutemo la malaria es una enfermedad asociada a la
pobreza y a los climas tropicales El 81 de los casos detectados provienen de
Aacutefrica subsahariana aunque a nivel mundial el 86 de las viacutectimas de la
malaria son nintildeos menores de cinco antildeos
De los 3300 millones de personas en riesgo de contraer la malaria 2100
millones se encuentran en situacioacuten de alto riego de los que el 47 pertenecen
al continente africano y el 37 al asiaacutetico De los 1200 millones restantes que
estaacuten en bajo riesgo de contraer malaria el 94 no son africanos En Aacutefrica
seguacuten los datos del informe de la Fundacioacuten para la investigacioacuten y la medicina
africana (AMREF) de 20117 se concentra la mayor poblacioacuten en riesgo donde el
apoyo externo es mayor y donde por el contrario se invierte el menor gasto
puacuteblico El 90 de los casos de malaria los produce el plasmodio maacutes agresivo
el P falciparum Seguacuten la OMS muchos paiacuteses de la regioacuten africana han
registrado desde el antildeo 2000 hasta 2010 un descenso mayor del 50 de casos
confirmados ingresos y muertes Esto se debe a los cada vez maacutes eficaces
sistemas de vigilancia Del 25 de la disminucioacuten mundial de las muertes
causadas por la malaria un 33 corresponde a Aacutefrica8 En el continente
americano la malaria se centra en la zona amazoacutenica y de Centroameacuterica En
5 Centro de prensa de la OMS (dic 2011) 6 Disponible en httpwwwwhointmalariaworld_malaria_report_2009 7httpwwwamrefesuploadsdocumento 8 Diez datos sobre el paludismo (OMS abril 2012)
Malaria
9
estas zonas se dan menos casos de malaria que en la regioacuten africana pero la
inversioacuten del gasto puacuteblico para erradicarla es mucho mayor La mayoriacutea de los
casos son producidos por el P vivax aunque tambieacuten se dan casos de P
falciparum Del 25 de la disminucioacuten mundial el 55 corresponde a este
continente
En Asia la situacioacuten es maacutes complicada de definir porque depende mucho de
la zona geograacutefica En la zona del sudeste asiaacutetico la situacioacuten es maacutes grave
maacutes parecida a Aacutefrica donde predominan los casos de P falciparum En el resto
de Asia predomina sin embargo el P vivax como en centro y Sudameacuterica En
Oceaniacutea la situacioacuten es muy parecida a la zona de Asia donde la malaria no es
tan grave La disminucioacuten de las muertes supone un 42 de la disminucioacuten de
mortalidad por malaria en este continente
El continente europeo se consideraba libre de malaria desde hace unos antildeos
pero en la actualidad se han registrado nuevos datos El 80 de los casos de la
Europa Occidental se registran en Francia Inglaterra Italia y Alemania Son
zonas donde la malaria se produce de forma ocasional estacional o por razones
de migraciones humanas (ECDC 20119) La zona de Oriente medio concentran
el mayor nuacutemero de casos ocasionados por P vivax La tasa de mortalidad por
malaria en Europa ha disminuido hasta el 1 de los casos
I311 La malaria en Espantildea
La lucha antipaluacutedica fue la primera intervencioacuten sanitaria espantildeola que se
basoacute en criterios epidemioloacutegicos es decir se planificoacute en base a datos de
prevalencia de la enfermedad En 1920 se realizoacute una organizacioacuten de Lucha
Antiplasmoacutedica que consiguioacute con la creacioacuten de dispensarios antipaluacutedicos el
estudio del vector con la participacioacuten y asesoramiento de entomoacutelogos
especialistas en saneamiento ambiental dieron como resultado en los antildeos 30
una disminucioacuten de los datos endeacutemicos en Espantildea En la guerra civil espantildeola
por el debilitamiento socioeconoacutemico y las circunstancias propias de una guerra
se produjo un recrudecimiento de la malaria
9 ECDC European Centre for Disease Prevention and Control Centro de la Unioacuten Europea creado en 2005 para el control de las enfermedades infecciosas con sede en Suecia
Malaria
10
Figura 2 Distribucioacuten de la malaria en Espantildea en el antildeo 193310
En el antildeo 1943 ante la evidente gravedad sanitaria del paiacutes se produce una
reactivacioacuten del Dispensario y un uso masivo de insecticidas A esto se le suma
la firma del convenio con la OMS para potenciar la erradicacioacuten de la malaria
en Espantildea
En 1943 se da por finalizada la campantildea entrando en fase de mantenimiento
que da paso en 1964 a la declaracioacuten de paiacutes libre de malaria por la OMS
siempre teniendo en cuenta que se han de mantener los sistemas de vigilancia
de la enfermedad
En 1961 se registra el uacuteltimo caso de malaria autoacutectona en Espantildea aunque desde
la declaracioacuten de zona libre se han descrito por parte de la Red nacional de
vigilancia epidemioloacutegica varios casos de malaria En el antildeo 2001 se registraron
466 casos diagnosticados en Espantildea asociados a inmigrantes y turistas ademaacutes
se debe tener en cuenta la posibilidad de producirse casos por transfusiones
sanguiacuteneas trasiego de jeringuillas de pacientes drogadictos o malaria de
aeropuerto (Bueno Mari R y Jimenez Peydro R 2008)
El uacuteltimo caso de malaria en Espantildea se diagnosticoacute en una mujer en Aragoacuten en
2009 Por esto se incrementaron las alertas pero no han quedado registrados
maacutes casos (Santa Olalla et alts 201011)
10 Disponible en httpscieloisciiiesscielophppid=s1135-57272008000500003ampscript=sci_arttext 11 httpwwweurosurveillanceorgViewArticleASPxArticleId=19684
Malaria
11
I32 Factores epidemioloacutegicos
La epidemiologiacutea de esta enfermedad depende principalmente de dos
factores
- Primarios
o Hueacutesped o fuente de infeccioacuten hombre portador
o Vector hembras de ciertas especies de mosquito Anopheles
o Susceptibilidad humana este es el factor maacutes variable ya que
depende de factores de inmunidad natural o adquirida factores
geneacuteticos edad (los nintildeos estaacuten maacutes expuestos) migraciones
ocupacioacuten y caracteriacutesticas socioeconoacutemicas
- Secundarios son los que ayudan a la transmisioacuten de la enfermedad como
los factores geograacuteficos (altura sobre el nivel del mar) o climatoloacutegicos
(temperatura humedad atmosfeacuterica o lluvias)
I33 Tipologiacutea de aacutereas endeacutemicas
Seguacuten la proporcioacuten de poblacioacuten que se encuentre afectada las aacutereas donde
la enfermedad estaacute considerada como endeacutemica se dividen en cuatro12
- Aacutereas hipo-endeacutemicas son aquellas donde la malaria afecta a menos del
10 de la poblacioacuten
- Aacutereas meso-endeacutemicas aquellas donde la poblacioacuten afectada estaacute entre el
11 y el 50
- Aacutereas hiper-endeacutemicas son las aacutereas donde el porcentaje de poblacioacuten
afectada estaacute entre el 51 y el 75
- Aacutereas holo-endeacutemicas aquellas donde maacutes del 75 de la poblacioacuten es
portadora de la enfermedad Estas aacutereas estaacuten asociadas a malaria latente
Las hiper y holo-endeacutemicas se caracterizan por alta mortalidad infantil y
juvenil pero los adultos suelen ser asintomaacuteticos por la inmunidad especiacutefica
que generan algunos humanos al sufrir maacutes de una picadura por mosquito
infectado al diacutea
12httpwwwmonografiascomtrabajos77paludismo-enfermedad-tercer-mundopaludismo-enfermedad-tercer-mundo2shtml
Malaria
12
I34 Zonas endeacutemicas e inmunidad
El ciclo de vida del paraacutesito es complejo e involucra distintos medios lo que
demuestra su capacidad para entrar y salir de diferentes ceacutelulas tanto del
hueacutesped como del vector Para ello el paraacutesito debe cambiar su forma la
constitucioacuten y el modo de presentacioacuten de sus proteiacutenas y receptores asiacute se
pone de manifiesto que su respuesta inmune a los tratamientos es muy
compleja A su vez la respuesta inmune del hueacutesped debe generar respuestas
especiacuteficas para las diferentes formas del paraacutesito lo que se denomina
Inmunidad adaptada
Los tipos de inmunidad consideradas para la enfermedad son tres
- Natural ciertos grupos de poblacioacuten poseen alguacuten grado de resistencia
conferida por factores geneacuteticos como la deficiencia de la G6PDH que
confiere resistencia al paraacutesito o la mutacioacuten Hemoglobina E (Hb E la
mutacioacuten del gen que codifica la cadena β-globina que compone la Hb
tambieacuten conocido como talasemia) Hb S (anemia drepanociacutetica) o Hb
fetal
- Adquirida con este tipo de infeccioacuten se produce premunicioacuten13 Se da en
personas de exposicioacuten prolongada como los habitantes de zonas holo-
endeacutemicas El problema estaacute en que la inmunidad adquirida es una
inmunidad parcial y relativa y no garantiza la inmunidad esterilizante
Es una inmunidad especiacutefica a un lugar determinado que en muchos
casos se pierde tras el cambio de haacutebitat a zonas donde la malaria no es
endeacutemica Esto conlleva que el individuo sea vulnerable si vuelve
posteriormente a zonas endeacutemicas
- Pasiva es la que suele relacionarse con el embarazo La conferida por la
madre al feto en muchos lugares donde la enfermedad es endeacutemica
13 (Edm Sergent L Parrot y A Donatien 1924) (Del latiacuten prae antes y munire fortificar) Sinoacutenimo inmunidad de infeccioacuten o de sobreinfeccioacuten (R Debreacute y Bonnet 1927) inmunidad no esterilizante inmunidad relativa (Pasteur 1881 Plehn 1901 von Wasielewski 1901-1908) inmunidad parcial (J Bordet 1920) inmunidad- tolerancia premunidad (Ch Nicolle) laquoEstado de resistencia a toda sobreinfeccioacuten de un organismo ya infectado La premunicioacuten que es simultaacutenea a la infeccioacuten y cesa con ella es conferida por diversas enfermedades infecciosas croacutenicas (paludismo piroplasmosis tuberculosis siacutefilis brucelosis etc) Se opone a la inmunidad verdadera que caracteriza la resistencia del organismo curado a toda reinfeccioacuten es generalmente durable y consecutiva a ciertas infecciones agudas (sarampioacuten escarlatina viruela carbunco fiebre tifoidea etc)raquo (Edm Sergent)
IIII MMAALLAARRIIAA YY PPLLAASSMMOODDIIUUMM
Malaria y Plasmodium
15
II1 El Plasmodium
El Plasmodium es un protozoo eucariota unicelular esporozoario que se
caracteriza por un estilo de vida intracelular obligado con orgaacutenulos
especializados en las diferentes funciones vitales La proliferacioacuten se produce
por invasioacuten celular crecimiento y divisioacuten celular hasta que las reacuteplicas
destruyen la ceacutelula hueacutesped Ademaacutes es el miembro maacutes importante de los
Apicomplexa grupo de clasificacioacuten al que pertenecen tambieacuten otros paraacutesitos
como el toxoplasma o el criptosporium De las 175 especies de Plasmodium son 4
especies las que pueden infectar a humanos P vivax P ovale P falciparum y P
malariae Las tres primeras son las que afectan en mayor grado al hombre
siendo el P falciparum el maacutes violento y resistente Existe una quinta P
knowlesi que afecta maacutes a los grandes simios pero desde hace pocos antildeos se ha
registrado alguacuten caso de infeccioacuten humana por este tipo de paraacutesitos (Figtree et
alts 2010)
El paludismo es causado por paraacutesitos del geacutenero Plasmodium que se
transmiten al ser humano por la picadura de mosquitos infectados de las 20
especies del geacutenero Anopheles los llamados vectores del paludismo que pican
sobre todo entre el anochecer y el amanecer en zonas con climas tropicales
II11 Caracteriacutesticas morfoloacutegicas
El Plasmodium es un protozoo con orgaacutenulos especializados suspendidos en el
citoplasma que se encargan de sus diferentes necesidades como movimiento
invasioacuten celular penetracioacuten de membranas celulares expulsioacuten enzimas
eliminacioacuten de metabolitos o nutricioacuten por fagocitosis
Los trofozoiacutetos son las formas vegetativas moacuteviles que constan de membrana
citoplasma y nuacutecleo La membrana limita el contorno celular protege y permite
el intercambio de sustancias Aquiacute se produce el metabolismo de fosfoliacutepidos y
el mecanismo de transporte de protones y sodio El citoplasma es un sistema
coloidal que representa el cuerpo donde se desarrollan funciones como siacutentesis
de folatos y glicoacutelisis ademaacutes de biosiacutentesis de nucleoacutetidos necesarios para la
reproduccioacuten El nuacutecleo eucarionte contiene el ARN y ADN del paraacutesito
Malaria y Plasmodium
16
II12 Mecanismo de movilidad
Una de las principales caracteriacutesticas del paraacutesito es que no tiene sistema de
locomocioacuten (cilios ni flagelos) su movilidad se produce por deslizamiento Se
ha estudiado (Casanova Morales 2010) que la membrana del paraacutesito tiene dos
dimensiones citoesqueleto y submembrana El movimiento se produce gracias
al citoesqueleto en concreto al sistema actina-miosina que actuacutea como motor
molecular La miosina se transporta a lo largo de los filamentos de la actina con
la energiacutea obtenida de la hidroacutelisis de ATP e interacciona con las adhesinas
transmembrana de la superficie de la ceacutelula hueacutesped Por medio de una
trayectoria helicoidal generada con estas interacciones se produce el
desplazamiento
II13 Mecanismo de invasioacuten celular
Uno de los organelos funcionales maacutes caracteriacutesticos es el orgaacutenulo o
complejo apical que se localiza en un extremo del paraacutesito y estaacute involucrado en
la interaccioacuten hueacutesped paraacutesito durante la invasioacuten celular Su funcioacuten se
relaciona con la adherencia y perforacioacuten de membrana eritrociacutetica ya que
excreta una sustancia que facilita la penetracioacuten celular imprescindible para la
supervivencia del paraacutesito Este orgaacutenulo estaacute presente en las formas
esporozoiacuteto merozoiacuteto y ookinete
La invasioacuten de un eritrocito induce un proceso controlado y transitorio de
rotura de la membrana y reorganizacioacuten de la ceacutelula Es un proceso complicado
(Gratzer y Dluzewski 1993) que conlleva un contacto inicial reorientacioacuten y
deformacioacuten del eritrocito unioacuten de formacioacuten y entrada del paraacutesito Las
interacciones con el eritrocito se piensa que son al azar y que son interacciones
reversibles entre proteiacutenas de superficie del paraacutesito y del gloacutebulo rojo
Son muchas las proteiacutenas implicadas en estos procesos como la proteiacutena de
superficie del merozoiacuteto 1 (MSP-1) que participa directamente en el paso de
invasioacuten y es una de las dianas terapeacuteuticas planteadas actualmente Otra
proteiacutena diana es la proteiacutena circumsporozoiacuteto (CSP) que estaacute implicada en los
procesos de reorientacioacuten del complejo apical En la invasioacuten se producen
cambios en la composicioacuten lipiacutedica de la membrana El paraacutesito una vez
realizada la invasioacuten exporta proteiacutenas como la proteiacutena de membrana epitelial
(EMP) a la membrana eritrociacutetrica que evita que se produzca la depuracioacuten de
los eritrocitos infectados en el bazo Durante la invasioacuten de la membrana
Malaria y Plasmodium
17
diferentes orgaacutenulos del paraacutesito van introducieacutendose en el eritrocito y
producen la unioacuten con la ceacutelula hueacutesped
II14 Metabolismo para el crecimiento
La caracteriacutestica principal del paraacutesito es la dependencia total del hueacutesped
para la supervivencia Como consecuencia de la invasioacuten aumenta la tasa
metaboacutelica de los eritrocitos infectados con cambios en la permeabilidad de
membrana que permiten por fagocitosis el ingreso de solutos necesarios para el
desarrollo del Plasmodium Este cambio de permeabilidad da preferencia al paso
de aniones y solutos como monosacaacuteridos aminoaacutecidos nucleoacutesidos lactato
acido pantoteacutenico y amonio cuaternario La composicioacuten ioacutenica del paraacutesito
depende del proceso de transporte a traveacutes de tres membranas la membrana
plasmaacutetica del eritrocito la vacuola digestiva y la membrana digestiva del
paraacutesito
Las alteraciones proteicas de la membrana intervienen en el transporte de
nutrientes y productos de desecho ademaacutes de evitar la accioacuten del sistema
inmune del hueacutesped Mediante endocitosis el Plasmodium retiene porciones del
citoplasma del eritrocito dentro de vesiacuteculas que se fusionan con la vacuola
digestiva El paraacutesito tiene mitocondria pero carece de ciclo de aacutecido ciacutetrico
funcional por lo que se piensa que es totalmente dependiente de la glucoacutelisis
para su abastecimiento energeacutetico (Dario Mendez 2010) Durante el periodo de
maduracioacuten del paraacutesito se produce un aumento en el uso de glucosa y la
produccioacuten de aacutecido laacutectico en la ceacutelula hueacutesped en detrimento de la capacidad
de la ceacutelula de sintetizar macromoleacuteculas Para su crecimiento y replicacioacuten en
el eritrocito requiere purinas y pirimidinas Las purinas provenientes del
eritrocito son recicladas por el propio paraacutesito para su uso En cambio las
pirimidinas han de ser sintetizadas a partir de sustancias como carbonatos o
adenosiacuten trifosfato (ATP) y mediante la accioacuten de enzimas como dihidrofolato
reductasa o dihidrooroato dihidrogenasa (DHOD) que se convierten asiacute en
dianas terapeacuteuticas La atovaquona es un ejemplo de inhibidor de la DHOD
En la vacuola digestiva del paraacutesito se producen enzimas digestivas y
residuos que se eliminan a traveacutes de la membrana celular Dentro de los
gloacutebulos rojos los paraacutesitos se alimentan de la Hb En primer lugar se produce
la endocitosis de la moleacutecula hasta la vacuola digestiva donde las
endopeptidasas cisteiacutenicas y aspaacuterticas continuacutean con la degradacioacuten de la Hb
Malaria y Plasmodium
18
hasta pequentildeos aminoaacutecidos que el paraacutesito requiere para sus muacuteltiples
funciones de desarrollo En la ruptura celular se produce la liberacioacuten de los
residuos generados durante los diferentes procesos del metabolismo de
nutrientes Algunos siacutentomas de la enfermedad se ocasionan por esta liberacioacuten
En todos estos procesos de cambio de permeabilidad celular necesarios para
la supervivencia del paraacutesito el pH juega un papel fundamental El Plasmodium
desarrolla diferentes sistemas de control y autorregulacioacuten que estaacuten siendo
estudiados y propuestos como diana terapeacuteutica (Loacutepez y Segura 2008)
II2 Ciclo de la malaria
II21 Ciclo de vida del paraacutesito
Para referirnos al ciclo de la enfermedad hablaremos en todo momento del
ciclo de vida del paraacutesito (Figura 5) El Plasmodium falciparum es un organismo
eucariota que cuenta con 14 cromosomas y es transmitido como hemos
comentado al comienzo por los mosquitos Anopheles hembra Pero no son los
mosquitos los que tienen el paraacutesito inicialmente ya que en la picadura a un ser
humano infectado adquieren los paraacutesitos presentes en las sangre (en forma de
gametocitos) dando comienzo la fase Esporogoacutenica (fase sexual) del ciclo de
vida del paraacutesito en el mosquito
En esta sangre infectada hay microgametocitos (macho) y macrogametocitos
(hembra) Los gametocitos macho fertilizan a los hembra formando un cigoto
que recibe el nombre de ookinete el cual penetra en la pared celular de los
mosquitos para desarrollarse hasta formar un oocito Los oocitos desarrollados
se almacenan en sus glaacutendulas salivares Es ahiacute donde estaacuten listos para infectar
a otro humano con su picadura liberando esporozoiacutetos a traveacutes de la saliva
Esta fase esporogoacutenica se da a gran velocidad y se completa en dos semanas si
las condiciones son las idoacuteneas Queda claro de esta forma que el mosquito es el
vector que transporta la enfermedad y los humanos son los hueacutespedes
En este punto la enfermedad se desarrolla en el hombre por medio de dos
viacuteas Exo-eritrociacutetica (hepaacutetica) y Endo-eritrociacutetica La viacutea exo-eritrociacutetica es la
fase del ciclo de vida del paraacutesito que comienza en el momento que el mosquito
infectado pica a un humano y transfiere en la saliva ademaacutes de los esporozoiacutetos
del paraacutesito otros compuestos anti hemostaacuteticos y vasodilatadores al torrente
sanguiacuteneo humano
Malaria y Plasmodium
19
Los esporozoiacutetos son formas alargadas que miden
11 microm de ancho por 1 microm de largo con extremidades
afiladas (Figura 3) Se mueven por deslizamiento y
poseen una gruesa membrana cuya extremidad
anterior se transforma en una caacutepsula apical provista
de anillos polares y de un conoide que favorece la
penetracioacuten celular
Figura 3 Imagen de un esporozoiacuteto14
En treinta minutos los esporozoiacutetos llegan al hiacutegado humano e infectan los
hepatocitos Asiacute durante un periodo de 6 a 15 diacuteas se van a multiplicar
asexualmente (en este periodo de latencia de la enfermedad se llaman
hipnozoiacutetos) Estos daraacuten lugar a miles de merozoiacutetos que rompen las ceacutelulas
hepaacuteticas e para invadir el torrente sanguiacuteneo
En la viacutea endo-eritrociacutetrica los merozoiacutetos del torrente sanguiacuteneo invaden
los eritrocitos (gloacutebulos rojos o hematiacutees) para convertirse en trofozoiacutetos
(formas paraeritrociacuteticas Figura 4) Esta forma madura
y se multiplica asexualmente para formar los
esquizontes Estos a su vez se rompen liberando de
nuevo merozoiacutetos (en su forma endo-eritrociacutetica) que
repetiraacuten el ciclo de los hematiacutees Es la formacioacuten de
los esquizontes la que causaraacute la aparicioacuten de los
siacutentomas cliacutenicos A la vez que esto ocurre unos pocos
merozoiacutetos sufren gametocitogeacutenesis dando lugar a los
gametocitos que infectaraacuten nuevos mosquitos
Figura 4 Imagen de trofozoiacutetos15
En el caso de Plasmodium vivax y ovale se producen hipnozoiacutetos en la fase exo-
eritrociacutetica que permanecen en estado latente y durante un periodo de hasta
tres antildeos sin manifestarse siacutentomas En liacuteneas generales la duracioacuten del ciclo
eritrociacutetico del P ovale es de 50 horas el de P malarie de 72 horas y el de P vivax
y falciparum de 48 horas
14 Disponible en wwwfabaorg 15 Disponible en wwwdfarmaciacom
Malaria y Plasmodium
20
Figura 5 Ciclo de vida completo del plasmodio El mosquito Anopheles infectado en su picadura transmite los
esporocitos del parasito Plasmodio Esporocitos infectan ceacutelulas hepaacuteticas que maduran hasta esquizontes y
que liberaran despueacutes merozoitos Fase exo-eritrociacutetica y fase endo-eritrociacutetica Los merozoitos infectan los
hematiacutees Los trofozoiacutetos maduros daraacuten esquizontes que se rompen para dar maacutes merozoitos Algunos
merozoitos pasan a ser nuevos gametocitos Los gametocitos sexuados son ingeridos por el mosquito La Fase
esporogoacutenica Microgametos y macrogametos forman cigotos que evolucionan hasta ookinete Estos a su vez se
desarrollan hasta Los oocitos se rompen dando esporocitos que se almacenan en las glaacutendulas salivares del mosquito
esperando a ser inoculadas a otro humano 16
II22 Desarrollo de los esquizontes
Los merozoiacutetos provenientes de las ceacutelulas hepaacuteticas viajan al torrente
sanguiacuteneo para infectar a los eritrocitos que contienen la Hb En concreto es la
degradacioacuten de la Hb el factor fundamental para el desarrollo de los
esquizontes ya que este proceso conlleva la obtencioacuten de ldquonutrientesrdquo como
aminoaacutecidos esenciales para el desarrollo de las nuevas formas del paraacutesito En
el citoplasma de los eritrocitos se encuentra la Hb que es ingerida por
endocitosis al citostoma del paraacutesito y comprimida en vesiacuteculas transportadoras
que la conducen hasta las vacuolas digestivas del merozoiacuteto (Figura 6)
16 Citado de wwwdpdcdcgovdpdxHTMLMalariahtm
Malaria y Plasmodium
21
Figura 6 Transporte de membrana de la Hb a la vacuola del merozoiacuteto
Una vez dentro de la vacuola comienza su digestioacuten o degradacioacuten en un
proceso en el que intervienen varias proteasas y peptidasas que generan
diferentes subproductos Del conocimiento de estas enzimas surgen las
muacuteltiples dianas terapeacuteuticas para combatir este proceso y por tanto la
enfermedad ya que el proceso es clave para la supervivencia del paraacutesito Una
vez que la moleacutecula de Hb es introducida en la vacuola digestiva se produce la
ruptura de la estructura (Figura 7) en porcioacuten proteica la globina y en el
producto de degradacioacuten el grupo hemo La globina a su vez se degrada por
medio de peptidasas especiacuteficas (cisteiacutenas y aspartatos) que generan peacuteptidos
maacutes pequentildeos que seraacuten transportados en forma de aminoaacutecidos (los α-Aa) al
citoplasma del paraacutesito (citosol del merozoiacuteto)
Figura 7 Proceso de digestioacuten de la Hb en la vacuola digestiva del paraacutesito
Otro producto de dicha reaccioacuten de degradacioacuten es el grupo hemo libre que
se oxida hasta formar hematina (Figura 8) compuesto muy toacutexico debido a que
puede generar especies reactivas de oxiacutegeno como peroacutexido de hidroacutegeno
(H2O2) radicales superoacutexido y radicales hidroxilo Estos radicales son
mediadores directos de ciertos procesos bioquiacutemicos que ocasionan la ruptura
Malaria y Plasmodium
22
celular y en uacuteltima instancia la muerte del paraacutesito De este modo la siguiente
reaccioacuten es el proceso de detoxificacioacuten de dicho compuesto Esta reaccioacuten
consiste en una biomineralizacioacuten o biocristalizacioacuten donde la hematina
cristaliza como diacutemero cristalino llamado β-hematina (la unioacuten por puentes de
hidroacutegeno de los cristales recibe el nombre de hemozoiacutena) que no es toacutexica para
el paraacutesito
Figura 8 Compuestos obtenidos en la degradacioacuten de la Hb
Para el final del estado trofozoiacutetico del ciclo han sido consumidas muchas
unidades de Hb
II3 Especies de Plasmodium
Son muchas las variables de las que depende el desarrollo de la enfermedad
comenzando por la especie de paraacutesito que infecta
Plasmodium vivax esta especie estaacute presente en casi todas las zonas donde el
paludismo es endeacutemico y su aacuterea de distribucioacuten se extiende
principalmente en Ameacuterica Central y la India La duracioacuten de su ciclo exo-
eritrociacutetico variacutea seguacuten la cepa desde 20 diacuteas a 9 meses Los paraacutesitos
pueden permanecer en el hiacutegado en estado latente maacutes de 2 antildeos y ser
responsable de recaiacuteda La parasitemia raramente excede de 2 paraacutesitos en
100 gloacutebulos rojos y el proceso de formacioacuten de esquizontes dura 48 horas
P vivax parasita sobre todo los hematiacutees joacutevenes (reticulocitos) el hematiacutee
parasitado es maacutes grande que los hematiacutees normales y contiene numerosos
graacutenulos de Schuumlffner que resultan de la degradacioacuten de la Hb y le dan un
aspecto punteado Las formas endo-eritrociacuteticas son grandes (llegan a
ocupar hasta 23 partes del eritrocito) y estaacuten provistas de movimientos
ameboides vivaces (de ahiacute el nombre vivax) los esquizontes presentan
Malaria y Plasmodium
23
hasta 16 merozoiacutetos los gametocitos son redondos frecuentemente
exceacutentricos y con pigmento abundante
Figura 9 Formas endo-eritrociacuteticas del P vivax17
Plasmodium ovale es muy proacuteximo a P vivax con el cual fue confundido por
mucho tiempo Su incubacioacuten variacutea de 15 diacuteas a varios meses P ovale
parasita los hematiacutees joacutevenes el
hematiacutee parasitado es de talla grande
ovalado (es el porqueacute del nombre
ovale) sus bordes estaacuten recortados y
contiene tempranamente numerosos
graacutenulos de Schuumlffner El poli-
parasitismo es posible Los trofozoiacutetos
son ovalados los esquizontes son
irregulares y tienen de 8 hasta 16
merozoiacutetos
Figura 10 Formas endo-eritrociacuteticas del P ovale
Plasmodium malariae es menos frecuente que P vivax o P falciparum y se
encuentra principalmente en zonas como Aacutefrica subsahariana o sudeste
asiaacutetico Su incubacioacuten dura alrededor de 3 a 4 semanas Puede permanecer
en estado latente hasta 20 antildeos El ciclo de maduracioacuten eritrociacutetica dura 72
horas Parasita los hematiacutees viejos (1 a 2) los que son de tamantildeo normal o
retractado y monocromaacutetico Morfoloacutegicamente P malariae estaacute
caracterizado por la disposicioacuten en banda cuadrilaacutetera o ecuatorial de los
17 Imaacutegenes extraiacuteda de wwwgefor4tcom
Malaria y Plasmodium
24
trofozoiacutetos con esquizontes que presentan 8 merozoiacutetos y con gametocitos
semejantes a los de P vivax pero maacutes pequentildeos
Figura 11 Formas endo-eritrociacuteticas del P malariae
Plasmodium falciparum es la especie maacutes temible y mortal Se encuentra en
las regiones tropicales y subtropicales de Aacutefrica en Nueva Guinea y Haitiacute
El desarrollo de su ciclo en el mosquito necesita una temperatura superior a
los 18 degC a esto se debe su ausencia en las montantildeas tropicales y en las
regiones templadas Su ciclo exo-eritrociacutetico es el periodo maacutes corto dura
solamente de 7 a 15 diacuteas de promedio La longevidad del paraacutesito no pasa
habitualmente de 2 meses aunque puede llegar a un antildeo P falciparum
parasita todos los hematiacutees por esto maacutes del 10 de los gloacutebulos rojos
pueden ser parasitados En el frotis de sangre se observa la presencia
uniforme de trofozoiacutetos anulares (los esquizontes se encuentran en
capilares profundos y presentan hasta 16 merozoiacutetos) el poliparasitismo de
un gloacutebulo rojo es frecuente Los gametocitos tienen la forma de banana o
pequentildea hoz (del latino falx falcis) a esto se debe el nombre de esta especie
Figura 12 Formas endo-eritrociacuteticas del P falciparum
Malaria y Plasmodium
25
II4 Sintomatologiacutea
La infeccioacuten por malaria se puede confundir faacutecilmente con un catarro o gripe
comuacuten ya que como se describe en apartados anteriores es el desarrollo de los
esquizontes y la posterior ruptura de los hematiacutees (Figura 13) para seguir
infectando hematiacutees sanos lo que causa la aparicioacuten de sintomatologiacutea cliacutenica
Aunque en la liberacioacuten de nuevos merozoiacutetos tambieacuten se produce la liberacioacuten
de otras sustancias que producen la
sintomatologiacutea caracteriacutestica como los dolores
musculares dolor de cabeza naacuteuseas y voacutemitos
fiebres sudoraciones secuenciales y escalofriacuteos
La sintomatologiacutea observada en la infeccioacuten por
Plasmodium variacutea seguacuten el tipo de malaria que
desarrolla el enfermo
Figura 13 Ruptura de los Eritrocitos infectados18
En Malaria no complicada los siacutentomas caracteriacutesticos son acceso malaacuterico
anemia19 esplenomegalia20 (por la funcioacuten de limpieza de la sangre de
geacutermenes e impurezas por fagocitosis y la produccioacuten de linfocitos la funcioacuten
inmune produce este marcador interno de la infeccioacuten) y en ocasiones
ictericia21 Los picos de fiebre se correlacionan con altos niveles seacutericos de TNF-
α por la liberacioacuten de proteiacutenas del paraacutesito en la ruptura de los eritrocitos que
crea la anemia Ademaacutes de esto se asocia una creacioacuten de anticuerpos contra los
hematiacutees diseritropoyesis22 y secuestro espleacutenico23
18 Imagen extraida de wwwimmuninforu 19 Patologiacutea general Empobrecimiento de la sangre por disminucioacuten de su cantidad total o cantidad de hemoglobina [a(n)- ἀ-ἀν- gr no + -haimiacuteā -αιμία gr sangre] httpDicciomedeusales 20 Patolgiacutea general Aumento de volumen o hipertrofia del bazo[ splēn(o)- σπλή-ν-νός gr bazo + -megalia μεγαλ-ία gr cient tamantildeo excesivo] httpDicciomedeusales 21 Patologiacutea digestiva y hepatoloacutegica Enfermedad producida por acumulacioacuten de pigmentos biliares en la sangre cuya sentildeal exterior maacutes visibles es la amarillez de la piel y las conjuntivas [ikter(o)- ἴκτερος gr ictericia (amarillo) + -ik-os-ik-ē gr + -ia(m) lat cualidad] httpDicciomedeusales 22 (Del griego an- privacioacuten y haima sangre) Sinoacutenimo OLIGOHEMIA ESPANEMIA Empobrecimiento de la sangre caracterizado por la disminucioacuten de uno de varios o de todos sus elementos (anemia total anemias parciales) Esta palabra se aplica generalmente cuando se emplea sin epiacuteteto a una anemia parcial caracterizada por la disminucioacuten del nuacutemero de gloacutebulos rojos o maacutes exactamente por la disminucioacuten de la cantidad de hemoglobina contenida en la unidad de volumen de sangre no estando aumentado el volumen plasmaacutetico (Jean Bernard) Se emplea tambieacuten para designar el estado del organismo privado de sangre y desde este punto de vista la anemia puede ser general o local Se dice que la anemia es hemotiacutesica cuando obedece a la destruccioacuten exagerada de los hematiacutees y mielotiacutesica cuando resulta de la detencioacuten de su formacioacuten por insuficiencia del tejido mieloide (Pappenheim) wwwportalesmedicoscom
Malaria y Plasmodium
26
En Malaria croacutenica se produce esplenomegalia y hepatomegalia24 asiacute como
accesos febriles irregulares y de baja intensidad La piel se torna amarillo-
terrosa se producen palpitaciones somnolencia y fatiga Una caracteriacutestica muy
comuacuten es la baja parasitemia que presentan los pacientes
En el embarazo la malaria produce alta mortalidad materna por anemia
partos prematuros por insuficiencia cardiacuteaca palpitaciones mareos y disnea25
Esto repercute en el bebeacute de forma que producen muertes neonatales y dantildeos
cerebrales
La Malaria severa es producida por Plasmodium falciparum que ocasiona
disfuncioacuten de oacuterganos vitales altas parasitemias imposibilidad de tratamiento
por viacutea oral y hemoacutelisis intravascular
Los casos maacutes graves son los de Malaria cerebral Los nintildeos son el grupo maacutes
susceptible de contraer este tipo de malaria Los hematiacutees infectados se tornan
maacutes adhesivos y se pegan a las paredes de los vasos capilares entre otros a los
del cerebro Se produce anemia grave fallos renales y pulmonares agudos
convulsiones trastornos de movilidad y neuroloacutegicos El paciente entra en
coma pudiendo fallecer en 24 horas Si se logra un retorno del coma los dantildeos
cerebrales residuales son permanentes
II5 Deteccioacuten y diagnoacutestico
Es relativamente sencillo diagnosticar malaria pero lo realmente complicado
y uacutetil es el diagnostico concreto del tipo de malaria Ejemplo de ello es que una
caracteriacutestica de la infeccioacuten por P falciparum es la alta parasitemia donde
hasta 3 trofozoiacutetos se encuentran invadiendo un eritrocito o la aparicioacuten de
gametocitos con forma alargada que no se da en otros tipos de plasmodio
El diagnoacutestico de la malaria se realiza basaacutendose en una serie de criterios
cliacutenicos epidemioloacutegicos y de laboratorio que con una adecuada anamnesis y
examen fiacutesico pueden orientar con alto grado de certeza sobre el tipo de malaria
23 Un gran nuacutemero de ceacutelulas falciformes quedan atrapadas en el bazo y producen su agrandamiento repentino Los siacutentomas pueden incluir debilidad repentina palidez en los labios respiracioacuten raacutepida sed extrema dolor abdominal (del estoacutemago) o en el costado izquierdo del cuerpo y palpitaciones raacutepidas wwwcdcgov 24 Patologiacutea digestiva y hepatoloacutegica Aumento de volumen o hipertrofia del hiacutegado [hēpat(o)- ἧπα-ρ-τος
gr hiacutegado + -megalia μεγαλ-ία gr cient tamantildeo excesivo] httpDicciomedeusales 25 Patologiacutea neumoloacutegica dificultad para respirar [dys- δυσ- gr dificultad + -pnoi(a) -πνοια gr respiracioacuten] httpDicciomedeusales
Malaria y Plasmodium
27
contraiacuteda Las pruebas maacutes concluyentes son la visualizacioacuten del paraacutesito o
deteccioacuten de antiacutegenos en pruebas raacutepidas
Criterios cliacutenicos Se tendraacuten en cuenta tanto episodios malaacutericos anteriores
del paciente como fiebres actuales o recientes (en menos de un mes) escalofriacuteos
intensos sudoracioacuten profusa naacuteuseas y voacutemitos mialgias siacutentomas
gastrointestinales anemia o esplenomegalia
Criterios epidemioloacutegicos El estudio de antecedentes aporta mucha
informacioacuten para el diagnoacutestico Antecedentes como los de exposicioacuten en los
uacuteltimos quince diacuteas en aacutereas de transmisioacuten activas antecedentes hospitalarios
transfusioacuten sanguiacutenea de medicacioacuten antimalaacuterica o relacioacuten con personas que
hayan sufrido malaria
Criterios de laboratorio La forma maacutes sencilla de detectar la enfermedad
incluyendo casos donde todaviacutea estaacute en estado latente es el Meacutetodo de la Gota
gruesa La toma de muestra se realiza mediante la puncioacuten con una lanceta
esteacuteril normalmente en la yema del dedo Se recogen 3 oacute 4 gotas sobre un
portaobjetos y con la esquina de otro se unen en movimientos raacutepidos
extendieacutendose hasta formar una capa gruesa y uniforme Se usa para la
determinacioacuten de la parasitemia y tiene una sensibilidad del 80 y 100 de
especificidad
Se mide mediante la ecuacioacuten
(Nordm paraacutesitos x 8000) Parasitemia (paraacutesitosμL) =
200 eritrocitos (hematiacutees)
La gota gruesa permite analizar una mayor cantidad
de sangre facilitando la deteccioacuten de parasitemias
bajas menores del 1 (Figura 14) y un ahorro de
tiempo en el examen aunque al romperse los
eritrocitos resulta difiacutecil la identificacioacuten de especie
Figura 14 Vista al microscopio de los eritrocitos26
26 Disponible en
httpdpdcdcgovdpdxhtmlFramesMRMalariaovalebody_malariadfovaringhtm
Malaria y Plasmodium
28
Es una prueba sencilla y poco costosa que muestra los casos positivos En
zonas de alta trasmisioacuten esta prueba no es determinante ya que la deteccioacuten de
paraacutesitos en sangre no significa que la posible fiebre que presente una persona
sea por malaria
Como se ha indicado antes es importante la determinacioacuten de la especie de
Plasmodium y se consigue tambieacuten de una manera sencilla con el Meacutetodo de
frotis donde la muestra se colecta de la misma forma que la gota gruesa pero en
este caso se recoge una gota de sangre en un portaobjetos y con otro se realiza
la extensioacuten en capa fina de la misma El inconveniente para realizar estas dos
teacutecnicas sencillas es que se necesita un laboratorio y personal cualificado no
disponible en muchas de las zonas endeacutemicas
Hay otras teacutecnicas de deteccioacuten maacutes desarrolladas como el sistema QBC
(Quantitative Buffy Coat test) que es un meacutetodo de screening para la deteccioacuten
raacutepida de paraacutesitos en sangre centrifugada en un microcapilar Es un meacutetodo
gravimeacutetrico que usa la fluorescencia para la determinacioacuten Aunque es un
meacutetodo raacutepido son necesarias infraestructuras y es difiacutecil distinguir la especie
Existen tambieacuten otros meacutetodos basados en teacutecnicas inmunocromatograacuteficas
en la deteccioacuten de antiacutegenos parasitarios La HRP-2 y la LDH son proteiacutenas
secretadas por el paraacutesito y por tanto indicadoras de su presencia Son pruebas
raacutepidas y no precisan microscopio Tambieacuten son faacuteciles de interpretar ya que
son test en tiras o tarjetas donde se pone una muestra de sangre y se revelan
Son usados como examen de autodiagnoacutestico y en lugares donde no hay
laboratorios como examen preliminar El problema es que dan falsos negativos
y no es un meacutetodo cuantitativo del grado de infeccioacuten
Por uacuteltimo las teacutecnicas de biologiacutea molecular usadas en casos de baja
parasitemia infecciones mixtas o mutaciones entre otras Aunque presentan
muchas ventajas son teacutecnicas laboriosas caras y poco accesibles ya que se
necesitan medios y personal muy cualificado
Es por tanto la combinacioacuten de los criterios explicados la forma maacutes
concluyente de diagnosticar que tipo de malaria estaacute afectando a un enfermo
IIIIII PPRREEVVEENNCCIIOacuteOacuteNN YY TTRRAATTAAMMIIEENNTTOO
Prevencioacuten y Tratamiento
31
III1 Medidas preventivas
La malaria es una enfermedad que puede prevenirse desde sus dos frentes
principales el vector mosquito y el hospedador humano Las medidas de
prevencioacuten se centran en objetivos distintos como evitar el desarrollo de la
enfermedad con proteccioacuten individual en aacutereas endeacutemicas erradicacioacuten del
mosquito prevencioacuten de la picadura o desarrollo de medicamentos
profilaacutecticos
En lo que a la lucha antivectorial se refiere el uso de mosquiteras en las
camas ha reducido mucho el caso de nuevos contagios de la enfermedad Es
una medida que a simple vista parece muy sencilla pero que en realidad no lo
es El problema estaacute en que en muchos de los paiacuteses endeacutemicos la pobreza es
elevada y por tanto el coste de las mosquiteras no es asumible por las personas
En otras ocasiones no es el coste de dichas mosquiteras lo que impide la
prevencioacuten sino que las redes son usadas con otros fines prioritarios como la
pesca En la actualidad la OMS recomienda el uso de insecticidas como
piretroides para impregnar las mosquiteras
Otra forma eficaz de reducir raacutepidamente la transmisioacuten del paludismo es la
fumigacioacuten de interiores con insecticidas de accioacuten residual Los mejores
resultados se consiguen cuando se fumiga al menos el 80 de las viviendas de
la zona en cuestioacuten La fumigacioacuten de interiores es eficaz de tres a seis meses
dependiendo del insecticida utilizado y del tipo de superficie sobre la que se
aplica En algunos casos el DDT puede ser eficaz de nueve a doce meses
Actualmente se estaacuten desarrollando insecticidas con accioacuten residual maacutes
prolongada para la fumigacioacuten de interiores Se ha comprobado la eficacia de
insecticidas como el DDT que aunque fue prohibido su uso por su alto grado de
toxicidad en plantas y su efecto acumulativo sigue siendo ampliamente
utilizado en la lucha contra la malaria Tambieacuten se cuenta con la ayuda de los
repelentes para la piel (DEET) o tiras insecticidas Finalmente no se deberiacutea
olvidar como arma vaacutelida y primaria para la lucha la educacioacuten en prevencioacuten
y gestioacuten del medio ambiente
En lo que al factor humano se refiere el uso de medicamentos especiacuteficos en
bajas dosis durante largo tiempo es la forma actual de profilaxis En esta liacutenea
se estaacuten desarrollando vacunas y tratamientos actualmente en el campo de la
genoacutemica
Prevencioacuten y Tratamiento
32
III2 Tratamiento
III21 Historia del tratamiento
La malaria es una de las enfermedades mejor estudiadas de la medicina
occidental hasta mediados del siglo XX a pesar de
que no se haya encontrado solucioacuten para su
erradicacioacuten A principios del siglo XVIII el
primer tratamiento conocido se basoacute en el uso de
la corteza de un aacuterbol originario de Sudameacuterica
la Cinchona (Figura 15) En 1820 se consiguioacute
aislar e identificar la quinina como compuesto
activo
Figura 15 Aacuterbol de la Cinchona pubescens
En 1891 el azul de metileno se usoacute para tratar a dos pacientes enfermos de
malaria Asiacute se convierte este compuesto en el primer ldquomedicamento sinteacuteticordquo
Actualmente se conoce que su mecanismo de accioacuten implica la inhibicioacuten de la
glutatioacuten reductasa y posteriormente la interrupcioacuten de la homeostasis redox
del paraacutesito
En 1925 se desarrolloacute la mepraquina para combatir estadios del P falciparum
en sangre Es un compuesto que pertenece al grupo de derivados de acridina
usados en el sudeste asiaacutetico durante la II Guerra Mundial Ya en 1934 se
sintetizoacute la cloroquina (CQ) aunque no es hasta el antildeo 1946 cuando comienza
su uso porque se consideraba demasiado toacutexica Con esta estructura comienza a
desarrollarse el grupo de las 4-aminoquinolinas Desde entonces ha sido el
antimalaacuterico maacutes utilizado En 1969 la guerra del Vietnam conlleva el uso de la
mefloquina y halofantrina que son aminoalcoholes derivados de la quinina
Sin embargo el antimalaacuterico maacutes antiguo puede ser la artemisina descubierta
en el antildeo 1596 a partir de un compuesto de origen natural de China La
Artemisina Annua es una planta originaria oriental que constaba ya siglos atraacutes
en los manuales de procedimientos para el tratamiento de fiebres Aunque no
fue hasta el antildeo 1972 cuando se consiguioacute aislar e identificar Este compuesto es
utilizado en la actualidad y resulta eficaz y poco toacutexico
Prevencioacuten y Tratamiento
33
III22 Clasificacioacuten de los compuestos antimalaacutericos
A lo largo de la historia se han usado diferentes tratamientos derivados del
desarrollo de nuevas estructuras y del mejor conocimiento de la enfermedad y
del paraacutesito
De este modo las estructuras pueden clasificarse por
Actividad antimalaacuterica
o Hombre
Estados pre-eritrociacuteticos profilaxis eventual pero poco praacutecticos
Hipnoticidas para P vivax y P ovale actuacutean a nivel hepaacutetico
Esquizonticidas en sangre para estados eritrociacuteticos asexuales
o Mosquito
Gametocidas destruccioacuten de las formas eritrociacuteticas de la fase
sexual del mosquito Prevencioacuten de la transmisioacuten
Esporonticidas previene el crecimiento de los oocitos en el
mosquito tambieacuten se usa para prevenir transmisioacuten
Mecanismo de accioacuten
o Accioacuten sobre la vacuola digestiva del Plasmodium accioacuten sobre la
degradacioacuten de la Hb detoxificacioacuten de la hematina (por ejemplo la
CQ)
o Enzimas involucradas en la siacutentesis y metabolismo de
macromoleacuteculas
o Accioacuten sobre procesos de membrana
o Siacutentesis de purinas y pirimidinas
o Glucoacutelisis y siacutentesis de ATP mitocondrial
Forman familias de compuestos con actividades diferentes en muacuteltiples aacutereas
y niveles
Metanolquinolinas y arilaminoalcoholes
La metanolquinolinas y arilaminoalcoholes forman una familia de
compuestos de gran importancia Este grupo engloba desde
estructuras con gran relevancia histoacuterica como la quinina hasta
compuestos como la lumefantrina que se usa en terapias combinadas
en la actualidad
Prevencioacuten y Tratamiento
34
Estas dos familias de compuestos estaacuten relacionadas entre siacute Como
primera correspondencia destacar su gran efectividad como
esquizonticidas sanguiacuteneos Intervienen en la digestioacuten de la Hb en
concreto en la detoxificacioacuten especiacutefica de la hemozoiacutena
Pertenecientes a la familia de metanolquinolinas son la quinina y
quinidina (que son isoacutemeros L y D) y mefloquina (Figura 16)
Figura 16 Estructura de metanolquinolinas
El problema de la quinina y la quinidina es sus efectos adversos sin
embargo siguen siendo ampliamente usados debido a su faacutecil acceso
La mefloquina es muy uacutetil en malarias resistentes pero tiene efectos
neurosiquiaacutetricos adversos
Los arilaminoalcoholes como halofantrina y lumefantrina (Figura
17) son estructuras de gran capacidad esquizonticida siendo el
mecanismo de accioacuten en la mayor parte de ellos la intervencioacuten en los
procesos de degradacioacuten de la Hb
Figura 17 Estructura de arilaminoalcoholes
Estas estructuras actuacutean en los paraacutesitos maacutes maduros pero no tienen
capacidad hipnoticida Se desarrollaron tras la aparicioacuten de
resistencias a la quinina y CQ
Prevencioacuten y Tratamiento
35
Aminoquinolinas
En este grupo se engloban compuestos como la familia de las 4-
aminoquinolinas y las 8-aminoquinolinas Las 4ndashaminoquinolinas
actuacutean en las fases endo-eritrociacuteticas del paraacutesito La gran ventaja de
esta familia es que los compuestos son faacuteciles de sintetizar
econoacutemicos y bien tolerados A este grupo pertenecen compuestos tan
relevantes como la cloroquina efectiva en profilaxis pero que en la
actualidad presenta problemas de resistencias o la amodiaquina que
es mejor que la CQ para eliminar parasitemias aunque es
hepatotoacutexica (Figura 18)
Figura 18 Estructura quiacutemica de la cloroquina y la amodiaquina
Al grupo de las 8-aminoquinolinas pertenecen la pamaquina la
primaquina y la tafenoquina (Figura 19) que son el uacutenico grupo de
gametocidas y tambieacuten son usadas como profilaxis El gran problema
de estos compuestos es su alta toxicidad
Figura 19 Estructuras de 8-aminoquinolinas
Prevencioacuten y Tratamiento
36
Derivados de acridina
Son compuestos de relevancia histoacuterica como la mepraquina
compuesto sucesor y de origen muy similar a la CQ que fue el primer
compuesto sinteacutetico usado cliacutenicamente como esquizonticida La
pironaridina que tambieacuten pertenece a esta familia (estructuralmente
relacionado con la amodiaquina) se usa en casos de malaria por P
falciparum resistente pero tiene baja biodisponibilidad oral y su precio
es elevado (Figura 18)
Figura 18 Estructura de derivados de acridina
Antifolatos e inhibidores de la siacutentesis de folatos
El aacutecido foacutelico obtenido mediante la dieta es convertido por el
paraacutesito en aacutecido tetrahidrofoacutelico necesario para su superviviencia
Los antifolatos inhiben el metabolismo del aacutecido foacutelico actuando como
coenzimas de la siacutentesis de ADN y pirimidinas Estos compuestos
actuacutean sobre los estados de crecimiento del paraacutesito en el hiacutegado y
detienen la reinfeccioacuten del mosquito
Pertenecen a esta familia sulfonamidas como sulfadoxina o sulfonas
como dapsona y compuestos como proguanil y pirimetamina (Figura
19)
Figura 19 Estructura de antifolatos
Prevencioacuten y Tratamiento
37
Antibioacuteticos
Son familias de compuestos que actuacutean a nivel celular y de
genoma Una de sus dianas es la inhibicioacuten de la siacutentesis de
proteiacutenas con funciones metaboacutelicas importantes para la
supervivencia del paraacutesito Este es el caso de la inhibicioacuten de la
funcioacuten del apicoplasto que interviene en la siacutentesis del grupo
hemo o liacutepidos Para ello estaacuten los antibioacuteticos del grupo de
tetraciclinas como la doxiciclina (Vibramycinreg) (Figura 20)
Figura 20 Estructura de la doxiciclina
Artemisinas y terapias combinadas de artemisinas (TCA)
Esta familia proviene del compuesto aislado del la planta Artemisia
Annua La artemisina (Figura 21) se obtiene solo por viacutea natural y el
resto de derivados son semisinteacuteticos El mecanismo de accioacuten es el
mismo que el de las 4-Aminoquinolinas solo que en esta ocasioacuten viacutea
radicales libres
Son compuestos muy activos en malaria y aunque sus tiempos de vida
son cortos ofrecen actividad aguda El punto negativo es que en su
tiempo de accioacuten no son capaces de eliminar toda la parasitemia y son
necesarias terapias combinadas con otros compuestos En la
actualidad se ha detectado la aparicioacuten de resistencias debido al uso
de monoterapias
Figura 21 Estructura de la artemisina
Prevencioacuten y Tratamiento
38
III23 Aparicioacuten de resistencias
La OMS ha definido resistencia como la capacidad de una cepa parasitaria de
sobrevivir yo multiplicarse a pesar de la administracioacuten y absorcioacuten de un
medicamento dada a dosis iguales o mayores que aquellas usualmente
recomendadas pero dentro de los liacutemites de tolerancia del sujeto La resistencia
a los antimalaacutericos es un serio problema desde hace antildeos En 1973 la CQ fue
reemplazada por la combinacioacuten de sulfadoxina + pirimetamina (Fansidarreg)
Pero en 1985 eacutesta tambieacuten se volvioacute inefectiva en algunas cepas de P falciparum
Estaacute demostrado que la resistencia a algunos antimalaacutericos se desarrolla cierto
tiempo despueacutes de la introduccioacuten de los mismos como tratamiento uacutenico
Seguacuten la OMS se describen tres grados de resistencia in vivo a las drogas
antimalaacutericas
- Grado I (bajo grado) recurrencia a los 7 y 28 diacuteas del tratamiento completo
siguiendo a una inicial solucioacuten de los siacutentomas y reduccioacuten de la
parasitemia
- Grado II (grado intermedio) reduccioacuten de la parasitemia asexuada en maacutes
de un 75 dentro de las 48 h del tratamiento pero con aumento a los siete
diacuteas
- Grado III (alto grado) el nivel de la parasitemia asexuada no cae en maacutes del
75 dentro de las 48 h despueacutes del tratamiento
En la actualidad uno de los compuestos maacutes utilizados es la quinina que a
pesar de los efectos adversos que tiene es uno de los compuestos maacutes accesibles
en los paiacuteses pobres lo que facilita su uso actual Tambieacuten la artemisina y sus
derivados son ampliamente utilizados ya que estudios recientes demuestran la
gran capacidad antiplasmoacutedica Pero en su contra estaacute la baja vida del
compuesto la parasitemia residual y la aparicioacuten de resistencias Ademaacutes de
estos puntos negativos se une el hecho de que la uacutenica viacutea de obtencioacuten de este
compuesto es por medio natural no es viable su obtencioacuten por siacutentesis quiacutemica
lo que conlleva encarecimiento del producto por su limitada accesibilidad
Estudios actuales han conseguido explicar el origen de alguna de estas
resistencias La CQ es un compuesto que accede a la vacuola digestiva del
paraacutesito para interferir en la detoxificacioacuten de la hemozoiacutena El pH de la
vacuola estaacute en torno a 5 lo que produce una protonacioacuten de la CQ hasta su
forma diproacutetica (CQH2+2) En esta forma protonada la QC queda atrapada
Prevencioacuten y Tratamiento
39
dentro de la vacuola porque no se puede difundir y es asiacute como produce su
accioacuten
El Plasmodium falciparum que ha desarrollado resistencia a la CQ se caracteriza
por la proteiacutena PfCRT (Plasmodium Falciparum Chloroquine Resistance
Transporter) modificada Esta proteiacutena adopta la funcioacuten de unirse a la CQ para
realizar su transporte fuera de la vacuola evitando asiacute la acumulacioacuten y la
realizacioacuten de la funcioacuten del faacutermaco Los primeros estudios realizados en este
tema (Fidock DA et alts 2000) mostraron los primeros datos sobre la relacioacuten
entre las mutaciones el pH de la vacuola digestiva y las concentraciones del
faacutermaco dentro de la vacuola digestiva En un principio se pensoacute que las
mutaciones en los genes del Plasmodium provocaban la acidificacioacuten del medio
interior de la vacuola digestiva alterando la concentracioacuten del faacutermaco o
reduciendo la fijacioacuten a la hematina
Estudios posteriores (Martin R et alts 2009) han llegado a concretar el
mecanismo por el cual se producen resistencias a la CQ La mutacioacuten que le
confiere resistencia a la CQ es el cambio de una lisina (K) por una treonina (T)
en la posicioacuten 76 de la serie de aminoaacutecidos Esta mutacioacuten K76T se da en la
regioacuten de la proteiacutena que se cree involucrada en la unioacuten con la moleacutecula Estaacute
siendo objeto de estudio la creacioacuten de nuevos derivados que favorezcan la
inversioacuten de las mutaciones asiacute como favorecer de nuevo la formacioacuten de la
conformacioacuten T76K Ocurre lo mismo con el intercambio de posicioacuten arginina-
serina (R163S confiere resistencia a la CQ y el cambio a S163R la vuelve
sensible) Este cambio confiere carga positiva al sitio de unioacuten e imposibilita por
repulsioacuten de cargas la unioacuten de la PfCRT con la CQ lo que confiere
sensibilidad a la cepa resistente
La aparicioacuten de resistencias a la artemisina queda registrada en el sudeste
asiaacutetico durante estos uacuteltimos antildeos Se han descrito evidencias cliacutenicas que
concluyen que existen en la actualidad casos de resistencias a la artemisina y a
los TCA promovida principalmente por el extendido uso de las monoterapias
de artemisina pero todaviacutea estaacute en estudio el mecanismo por el que se producen
estas resistencias (OMS Informe 2011) En la actualidad la posibilidad de
estudiar el genoma de los paraacutesitos y los mecanismos de accioacuten de los
diferentes tratamientos da como resultado el conocimiento de las resistencias y
la oportunidad de mejorar los tratamientos existentes
Prevencioacuten y Tratamiento
40
Dentro de las medidas de lucha contra la malaria estaacuten como se ha
comentado las referentes al control de vectores La uacutenica clase de insecticidas
empleados en las mosquiteras actualmente recomendadas incluidos los de
accioacuten prolongada actualmente recomendados son los piretroides En este
aacutembito tambieacuten se han desarrollado resistencias en la actualidad Se carece por
ahora de insecticidas alternativos que sean seguros y con una aceptable relacioacuten
costo-eficacia El desarrollo de nuevos insecticidas alternativos es una tarea de
alta prioridad pero tambieacuten larga y costosa Mientras la deteccioacuten de las
resistencias debe ser un componente esencial de todos los esfuerzos por
controlar el paludismo (OMS 2012)27
III24 Tratamientos actuales
Los regiacutemenes terapeacuteuticos en malaria son muy diversos ya que ademaacutes de
las caracteriacutesticas del paciente dependen del tipo de Plasmodium que infecta y la
zona donde se contrae la enfermedad
Cloroquina
Se usa a dosis maacutexima de 25 mgkg viacutea oral en P ovale y P malariae y cepas
sensibles de P vivax y P falciparum Actuacutea en la vacuola digestiva del
paraacutesito interfiriendo en la detoxificacioacuten de la hematina La alternativa
terapeacuteutica es gluconato de quinidina o quinina
Los efectos adversos que se producen son nauseas irritacioacuten con picor o
desoacuterdenes neuropsiquiaacutetricos La sobredosis se ha de tratar con diazepam
En caso de cepas P vivax resistentes se usa mefloquina halofantrina o
sulfato de quinina combinado con tetraciclinas o sulfonamidas Para tratar
recaiacutedas por hipnozoiacutetos se usa el fosfato de primaquina Para tratar
infeccioacuten por P falciparum resistente se usa sulfato de quinina 250 mgkg
combinado con pirimetamina-sulfadoxina o combiando con doxiclina Para
el tratamiento de nintildeos y embarazadas la quinina se combina con
clindamicina
Quinina
Es usada para el tratamiento de P falciparum resistente a la CQ Actuacutea como
esquizonticida sanguiacuteneo Como alternativa se usa el gluconato de
quinidina que es maacutes potente Las alternativas terapeacuteuticas son mefloquina
27 httpwwwwhointmalariadiagnosis_treatment
Prevencioacuten y Tratamiento
41
halofantrina atovaquona artemisinina y pirimetamina-sulfadoxina Para P
falciparum resistente se usa la artemisina IV combinada con tetraclicina o
mefloquina
Los efectos adversos son sabor metaacutelico tinnitus28 y peacuterdida de audicioacuten
reversible
Pirimetamina-sulfadoxina (Fansidarreg)
Es inhibidor de la siacutentesis de aacutecido foacutelico del ciclo vital del paraacutesito Se
utiliza en paiacuteses en desarrollo por su bajo coste sin embargo el incremento
de la resistencia a los antifolatos lo colocan como agente de segunda liacutenea
Mefloquina (Lariamreg)
Puede administrarse a dosis uacutenica de 25 mg baseKg y actuacutea como
esquizonticida sanguiacuteneo No debe administrarse en nintildeos con menos de 15
Kg de peso ni en pacientes que reciban quimioprofilaxis ni halofantrina
para evitar la resistencia cruzada Puede combinarse con doxiciclina
quinina y derivados de la artemisinina
Los efectos adversos son voacutemitos y toxicidad neuroloacutegica manifiestada en
forma de mareos delirio ataxia29 y convulsiones
Halofantrina
Se administra en dosis de 24 mgKg para intervenir en la degradacioacuten de la
Hb El faacutermaco tiene absorcioacuten oral variable y estaacute contraindicado en
enfermos con afecciones cardiacuteacas embarazadas y durante la lactancia Los
efectos adversos se han asociado con toxicidad cardiacuteaca y arritmias30
Atovaquona ndashproguanil (Malaronereg)
La dosis empleada es de 250 mg atovaquona100 mg proguanil Interviene
en la siacutentesis de aacutecido foacutelico del paraacutesito y en la cadena de transporte
electroacutenico mitocondrial (principal accioacuten de la atovaquona) El faacutermaco se
usa generalmente en profilaxis pero tambieacuten en el tratamiento de malaria
28 Patologia Otorrinolaringologa Estomatologa Percepcioacuten de golpeos o pitidos en el oiacutedo que no proceden de ninguna fuente [ claacutes tinnītus es tintineo] httpdicciomedeusales 29 Patologiacutea Neuroloacutegica Perdida de la capacidad de ejecutar movimientos de manera voluntaria ordenada y suavemente Puede afectar a tronco extremidades faringe laringe etc Se debe a la afectacioacuten de algunas estructuras del sistema nervioso [gr ataxiacuteā ἀταξία [a(n)- ἀ-ἀν- gr no + tag- τάξις gr orden formacioacuten + -siacuteā gr] httpdicciomedeusales 30 Patologiacutea cardiovascular Irregularidad y desigualdad en las contracciones del corazoacuten [gr arrythmiacuteā ἀρρυθμία [a(n)- ἀ-ἀν- gr no + rhythm(o)- ῥυθμός gr cadencia ritmo + -iacuteā gr cualidad] wwwdicciomedeusales
Prevencioacuten y Tratamiento
42
por P falciparum resistente a otros medicamentos No presenta efectos
adversos destacables
Derivados de la artemisina o TCA
La dosis de administracioacuten es de 12 mgKg pero es conveniente que se
combinen preferiblemente con mefloquina tetraciclina o clindamicina
Son el tratamiento de eleccioacuten para P falciparum resistente a quinina ya que
estos eliminan la parasitemia maacutes raacutepidamente que la quinina No se ha
descrito toxicidad severa en humanos aunque algunos estudios
demuestran neurotoxicidad en animales Auacuten no se ha determinado la
seguridad del uso de estos compuestos durante el embarazo
Artemeter-lumefantrina (Coartemreg y Riametreg)
Es una combinacioacuten fija de artemeter (20 mg) y lumefantrina (120 mg) con
accioacuten esquizonticida sanguiacutenea La combinacioacuten es eficaz contra las cepas
de P falciparum resistentes a otros tratamientos sin artemisina
Prevencioacuten y Tratamiento
43
III3 Estrategias mundiales en la lucha contra la malaria
En el antildeo 2008 se formoacute un grupo de estudio y control sobre la malaria
mundial integrado por la OMS Fondo de Naciones Unidas para la infancia
(UNICEF) el Programa de Naciones Unidas para el desarrollo (PNUD) el
Banco Mundial y la Asociacioacuten de la lucha contra el paludismo (FRP) Se crean
una serie de frentes de lucha para combatir y reducir la malaria mundial en un
plazo de 7 antildeos incluiacutedo en los Objetivos de Desarrollo del Milenio propuestos
por la ONU
La estrategia mundial tiene cuatro elementos baacutesicos
o Asegurar el diagnoacutestico precoz y el tratamiento inmediato
o Planificar y aplicar las medidas selectivas y sostenibles de prevencioacuten
incluiacuteda la lucha antivectorial
o Detectar a tiempo contener o prevenir las epidemias
o Reforzar la capacidad local en materia de investigacioacuten baacutesica y aplicada
a fin de permitir y promover la evaluacioacuten regular de la situacioacuten del
paludismo en el paiacutes en particular los factores ecoloacutegicos sociales y
econoacutemicos que influyen en la enfermedad
En el antildeo 2010 se realizoacute una revisioacuten del estado del plan y se propusieron
una serie de adaptaciones para mejorar los buenos resultados obtenidos
teniendo en cuenta la situacioacuten actual de aparicioacuten de resistencias
- Cobertura universal de los programas de prevencioacuten y tratamiento
- En prevencioacuten se proponen
mayores esfuerzos en proporcionar mosquiteras y principalmente un
haacutebito en su uso ya que se habiacutean obtenidos datos concluyentes que
relacionan directamente la disminucioacuten de muertes sobre todo
infantiles con el uso de mosquiteras
mantenimiento del rociado de exteriores con insecticidas de accioacuten
residual aprobadas por la OMS
administracioacuten de tratamiento preventivo intermitente a embarazadas
en zonas endeacutemicas
- En tratamientos se propone
priorizar las confirmaciones parasitoacutelogas de la enfermedad en
pacientes Es decir en la medida de lo posible no administrar
Prevencioacuten y Tratamiento
44
tratamientos sin confirmacioacuten de la enfermedad al microscopio o con
pruebas de diagnostico raacutepido
priorizar al uso de las TCA proponieacutendose la retirada de las
monoterapias orales de artemisina (OMS 2011)
III4 Liacuteneas de investigacioacuten actual
III41 Buacutesqueda de nuevas dianas
En la actualidad la aparicioacuten de resistencias por las mutaciones en el ADN del
paraacutesito obliga a un esfuerzo mayor por encontrar compuestos o asociaciones
de compuestos que sigan siendo efectivos contra el Plasmodium ademaacutes de a la
buacutesqueda de nuevos medicamentos Gracias a los avances de las ciencias
quiacutemicas y tecnologiacuteas actuales y el desarrollo de la Bioquiacutemica y la Genoacutemica
en la lucha contra la malaria posibilitan la determinacioacuten de nuevas dianas Ya
desde hace tiempo se conoce la viacutea de accioacuten de la detoxificacioacuten de la Hb pero
el continuo avance de la ciencia ha llevado al conocimiento del ADN y de las
macromoleacuteculas necesarias para la vida del paraacutesito conocimiento de las
mutaciones que llevan a las resistencias enzimas y otras moleacuteculas que
participan en el desarrollo del paraacutesito
Actualmente diferentes proyectos se encuentran en la fase de identificacioacuten de
cabezas de serie con actividad antimalaacuterica o en periodo de optimizacioacuten con el
fin de generar compuestos con propiedades terapeacuteuticas adecuadas como
inhibidores de proteasas de aacutecidos grasos inhibidores de la ruta de siacutentesis de
isoprenoides o del transporte y metabolismo de fosfoliacutepidos del metabolismo
mitocrondial o pirimidiacutenico
En lo que a inhibidores de proteasas se refiere las hemo-polimerasas como
cistein-proteasas (falcipainas) o aspartil-proteasas (plasmepsinas) son objetivos
primordiales de estudio Es el caso del conocimiento de las proteasas aspaacuterticas
del Plasmodium en los procesos de degradacioacuten de la hemoglobina de los
eritrocitos infectados Se ha determinado bioloacutegicamente que participan 4 tipos
de proteasas en concreto las plasmepsinas I II y IV y la histoaspaacutertica
(Ersmark K et alts 2006)
El mecanismo de accioacuten propuesto es la ruptura inicial de las cadenas α de la
Hb en el enlace peptiacutedico entre Phe-33 y Leu-34 Por meacutetodos computacionales
Prevencioacuten y Tratamiento
45
se genera la estructura tridimensional detallada de las enzimas y se estudia si
los compuestos pueden interaccionar inhibiendo su actividad
En relacioacuten con la siacutentesis de aacutecidos grasos hay que destacar las peculiares
caracteriacutesticas que reviste este proceso en bacterias y en cloroplastos Contienen
un sistema denominado tipo II (FASII) en el que cada reaccioacuten en el proceso de
biosiacutentesis estaacute catalizada por una proteiacutena independiente monofuncional al
contrario que en las ceacutelulas de mamiacutefero donde la siacutentesis estaacute mediada por una
proteiacutena multifuncional conocida como la aacutecido graso sintetasa de tipo I Los
inhibidores de enzimas de la ruta son el triclosan y la tiolactomicina un
metabolito secundario de hongos y estaacuten en desarrollo nuevos compuestos con
potencial terapeacuteutico
En faacutermacos dirigidos a la ruta de biosiacutentesis de isoprenoides vale la pena
destacar que el P falciparum depende de la viacutea 2C-metil-D-eritrol 4-fosfato
(MEP) para la siacutentesis de sus isoprenoides La fosmidomicina un antibioacutetico
natural producido por Streptomyces lavendulae ha demostrado ser un buen
tratamiento en el control de la malaria resistente porque inhibe de manera
especiacutefica la actividad de la enzima DOXP reductoisomerasa y porque controla
el segundo paso de la viacutea MEP
Otro proceso que tiene lugar durante las fases endo-eritrociacuteticas del paraacutesito
es la siacutentesis activa de estructuras de membrana Uno de los componentes
principales de las membranas del paraacutesito es el fosfoliacutepido fosfatidil-colina cuya
siacutentesis a su vez depende de la incorporacioacuten de colina exoacutegena a partir de la
sangre Distintos anaacutelogos de la colina exhiben una potente actividad
antimalaacuterica y se asume que inhiben el transporte de colina que tiene lugar a
traveacutes de un transportador especiacutefico localizado en la membrana del paraacutesito
(Vial HJ et alts 2004)
Existen un conjunto de compuestos que interfieren con la actividad
mitocondrial del paraacutesito Las fases endo-eritrociacuteticas tienen un metabolismo
mitocondrial activo estando presentes todas las enzimas implicadas en el ciclo
de los aacutecidos tricarboxiacutelicos y determinados componentes de la cadena de
transporte electroacutenico Asiacute la cadena respiratoria del paraacutesito constituye un
blanco de accioacuten para los faacutermacos Un ejemplo de desarrollo de faacutermacos por
esta viacutea es el Malaronereg donde la atovaquona se une al sitio de oxidacioacuten del
coenzima Q en el citocromo B del complejo III La accioacuten estaacute complementada
por la combinacioacuten con Proguanilo 45 (antifolato)
Prevencioacuten y Tratamiento
46
III42 Productos naturales
Los productos naturales han sido y son de gran intereacutes en el tratamiento de la
malaria La sociedad apuesta por lo natural y se plantean buacutesquedas de
compuestos activos en diferentes plantas de diferentes regiones africanas
(Magadula JJ y Erasto P 2009) o americanas (Mariath IR et alts 2009) ya
consideradas anteriormente como medicinales
La artemisina y sus derivados es el ejemplo a conseguir con estos
compuestos pero evitando en este caso el inconveniente de que solo puede
obtenerse por viacutea natural o semisinteacutetica
En esta liacutenea se siguen desarrollando derivados de artemisina y peroacutexidos que
tienen el mismo mecanismo de accioacuten que la artemisina viacutea radicales libres
(Muraleedharan KM and Mitchell A 2009) Uno de los muchos resultados de
esta variacioacuten de la estructura base son los compuestos hiacutebridos artemisinas-
quinolinas actualmente en desarrollo que dan lugar a los TCA recomendados
por la OMS Las benzo[c]fenantridinas son un grupo de compuestos
provenientes de extractos de plantas que pueden ser sintetizados y
modificados en un laboratorio (Rivaud M et alts 2012) Su mecanismo de
accioacuten estaacute todaviacutea por confirmar pero se cree que tienen actividad sobre la
inhibicioacuten de la ADN topoisomerasa que participa en la degradacioacuten de la Hb
Siguiendo con la liacutenea de productos naturales un objetivo que no se puede
pasar por alto son los compuestos marinos provenientes de esponjas algas
coraleshellip que contienen compuestos con estudiada actividad antimalaacuterica
(Gademann K y Kobyliska J 2009) Un ejemplo son las esponjas que
contienen diferentes familias de compuestos antimalaacutericos como las
pirroloquinolinas o las manzaminas A (Figura 23) de funcioacuten similar a la CQ y
mejor que la artemisina a igual dosis
Figura 23 Estructuras de compuestos naturales de origen marino
Prevencioacuten y Tratamiento
47
III43 Desarrollo de vacunas
Atendiendo a las observaciones sobre inmunidades que llegan a expresar las
personas que habitan zonas con altas tasas de malaria se van desarrollando las
vacunas Se ha comprobado que los esporozoiacutetos inactivos son muy eficaces
como inductores de la inmunidad en el ser humano Desafortunadamente no es
posible producir esporozoiacutetos inactivos en las enormes cantidades requeridas
para utilizarlos como meacutetodo viable de vacunacioacuten Por otro lado los avances
en materia de genoacutemica permiten identificar prometedoras moleacuteculas
inmunogeacutenicas con una rapidez mucho mayor y eso ampliacutea considerablemente
el nuacutemero de vacunas potenciales (Rojas Rivero L et alts 2005)
Las vacunas experimentales estaacuten basadas en diversos antiacutegenos derivados
de las diferentes formas que adopta el paraacutesito durante su ciclo de desarrollo
Los tipos de vacunas actualmente se clasifican en
Vacunas pre-eritrociacuteticas impiden que los esporozoiacutetos penetren o se
desarrollen en las ceacutelulas hepaacuteticas Estas vacunas prevendriacutean las
consecuencias graves y potencialmente mortales del paludismo en las
personas no inmunizadas Hasta la fecha se han ultimado unos 20 ensayos
cliacutenicos en el hombre con diversas proto-vacunas pre-eritrociacuteticas de
Plasmodium falciparum Una proto-vacuna muy prometedora es la RTS S
que promueve la activacioacuten del sistema inmunitario para que actuacutee contra
el P falciparum (Aponte JJ et alts 2007)
Vacunas contra las formas hemaacuteticas asexuadas son aquellas que impiden
que los merozoiacutetos penetren o se desarrollen en el interior de los hematiacutees
Se han desarrollado varios candidatos Sin embargo la mayoriacutea de esos
preparados se encuentra en estudios precliacutenicos y muy pocos han llegado a
estudios cliacutenicos de fase I debido en parte a la gran variabilidad que
manifiestan estas moleacuteculas en diferentes cepas
Vacunas bloqueadoras de la transmisioacuten son aquellas que estimulan la
produccioacuten de anticuerpos contra antiacutegenos de la fase sexuada del paraacutesito
que puedan impedir el desarrollo de esporozoiacutetos infecciosos en las
glaacutendulas salivales del mosquito Anopheles Teoacutericamente estas vacunas
podriacutean interrumpir el ciclo de transmisioacuten del paraacutesito al paso de este por
el vector y seriacutean de gran utilidad para reducir la diseminacioacuten de paraacutesitos
de cepas resistentes a otros tipos de vacunas El problema es que seriacutea
Prevencioacuten y Tratamiento
48
necesaria una vacunacioacuten masiva durante un largo periodo de tiempo
Actualmente hay algunas en estudios cliacutenicos de fase I
A pesar de todas las prometedoras vacunas que estaacuten en desarrollo
actualmente hay que tener en cuenta que los paraacutesitos desarrollan ingeniosos y
complejos mecanismos para soslayar la respuesta inmunitaria del hueacutesped Por
ejemplo son capaces de expresar diferentes antiacutegenos en cada una de las fases
de su ciclo de vida y a menudo modificar esos antiacutegenos cuando el hueacutesped
activa contra ellos su sistema inmunitario Ademaacutes se ha de vigilar la
complejidad inherente a la realizacioacuten de los propios ensayos cliacutenicos sobre el
terreno por cuanto no es faacutecil para los investigadores determinar la reduccioacuten
de la morbilidad y la mortalidad atribuible a la vacuna experimental
ANTECEDENTES
Antecedentes
51
La Unidad de I+D de Medicamentos de la Universidad de Navarra ha estado
trabajando durante varios antildeos en la siacutentesis de nuevos compuestos duales con
afinidad por los receptores 5-HT1A que fuesen a su vez inhibidores de la
recaptacioacuten de 5-HT para el tratamiento de la depresioacuten (Martinez- Esparza J
et alts 2001 Oruacutes L et alts 2002a Oruacutes L et alts 2002c Perez-Silanes S et
alts 2004)
Se llevaron a cabo estudios de modelizacioacuten molecular (Oruacutes L et alts
2002b) que definieron como farmacoacuteforo la estructura de la figura 24
Figura 24 Elementos farmacofoacutericos para la afinidad por los receptores 5-HT1 e inhibicioacuten del transportador de 5-HT
Los compuestos sintetizados podriacutean definirse como arilaminopropanoles
estructuralmente proacuteximos a las metanolquinolinas y arilaminoalcoholes
usados desde hace antildeos como antimalaacutericos Tal y como se como se ha tratado
en el apartado de introduccioacuten quinina y CQ (metanolquinolinas y
arilaminoalcoholes respectivamente) y halofantrina y lumefantina
(arilaminoalcoholes desarrollados tras la aparicioacuten de resistencias a las
anteriores) son compuestos de gran capacidad esquizonticida
Desde el punto de vista estructural la quinina y cloroquina pueden
considerarse farmacoacuteforos polivalentes ya que a partir de sus estructuras se han
desarrollado muchos de los compuestos que se usan como tratamiento de la
malaria en la actualidad La relacioacuten estructura-actividad de estos farmacoacuteforos
con base de quinolina se puede estudiar en la figura 25 (Konznetsov VV et
alts 2008)
Figura 25 Relacioacuten estructura actividad de la CQ
Antecedentes
52
Viendo la similitud estructural de los compuestos con estas estrucutras y los
aminoalcoholes utilizados en el tratamiento actual se decidioacute ensayar la posible
actividad antiplasmoacutedica de los mismos con buenos resultados en cepas
sensibles a la CQ (Perez-Silanes S et alts 2009)
Figura 26 Estructuras de los arilaminoalcoholes sintetizados como antidepresivos con mejor actividad antimalaacuterica Valores de CI50 en microM La CQ tiene un valor de 008 microM en cepas 3D7 sensibles a la CQ
Surgen asiacute las estructuras a desarrollar en este proyecto enfocado a la siacutentesis
de nuevos derivados de arilamino alcoholes para el tratamiento de la malaria
resistente a la CQ
OBJETIVOS Y
PLAN DE TRABAJO
IIVV OOBBJJEETTIIVVOOSS
Objetivos
57
El presente trabajo tiene como objetivo la buacutesqueda de nuevos derivados para
el tratamiento de la malaria resistente Teniendo en cuenta la estructura de los
aminoalcoholes derivados de la quinina y tomando como referencia la CQ se
propone la siacutentesis de nuevos derivados de arilaminoalcoholes con actividad
antimalaacuterica
El objetivo para llevar a cabo este proyecto estaacute basado en el trabajo detallado
a continuacioacuten
Revisioacuten bibliograacutefica de los faacutermacos con actividad antimalaacuterica
publicada hasta la fecha y planteamiento de un farmacoacuteforo
Disentildeo y siacutentesis de nuevos compuestos derivados de
arilaminoalcoholes con potencial actividad antimalaacuterica
Caracterizacioacuten estructural y evaluacioacuten bioloacutegica y computacional de
cada uno de los nuevos compuestos obtenidos
Estudio de la posible relacioacuten estructura-actividad de los compuestos
sintetizados que permita identificar liacutederes y una optimizacioacuten en el
disentildeo de nuevos derivados
Refinamiento estructural de nuevos compuestos con afinidad mejorada
por las dianas del plasmodio en base a los resultados obtenidos
VV PPLLAANN DDEE TTRRAABBAAJJOO
Plan de Trabajo
61
V1 Disentildeo de nuevos arilaminoalcoholes
Tal y como se ha comentado anteriormente se puede observar en la figura 27
que muchos de los compuestos antimalaacutericos de las diferentes subfamilias
tienen su base de desarrollo en la quinolina De ella surgen los dos compuestos
antimalaacutericos por excelencia
Figura 27 Esquema general del proceso de disentildeo de las moleacuteculas a desarrollar
Teniendo en cuenta todo esto se propone como estructura general de este
proyecto la mostrada en la figura 28
Figura 28 Esquema general de las nuevas estructuras
El proceso de disentildeo estructural de las nuevas moleacuteculas fue el siguiente
1 GRUPO AR1
En muchos de los compuestos antimalaricos mas relevantes como quinina o
cloroquina una constante en la estructura es la presencia del anillo de
quinolina aunque ya en los derivados de la familia de arilaminoalcoholes este
grupo es variable como en la halofantrina donde el grupo quinolina es
Plan de Trabajo
62
sustituido por el grupo fenantreno o el Benflumetol (lumefantrina) que cuenta
con un fluoreno sustituido
De este modo se plantea la posibilidad de la sustitucioacuten de la quinoleiacutena por el
benzo[b]tiofeno (basanda en estudios previos) el naftaleno (bioisoacutemero de la
quinoleiacutena) e incluso se plantea la simplificacioacuten a benceno (por motivos de
reduccioacuten estructurural) Se ha tenido en cuenta tambieacuten que en la familia de las
4-aminoquinolinas asociado a esa quinolina se presenta un grupo
electroatrayente (CF3) Asiacute se propone la introduccioacuten de un aacutetomo de fluacuteor
que es maacutes electronegativo y de menor tamantildeo
2 GRUPO Y
Si bien en la bibliografiacutea el grupo alcohol se considera esencial para la
actividad antimalaacuterica se quiso probar si en nuestros compuestos seguiacutea siendo
grupo esencial en la actividad Se estudioacute la actividad de los carbonilos
precursores de siacutentesis sustituyeacutendolos por un grupo oxima en posicioacuten 1 de la
cadena alifaacutetica en los nuevos derivados
3 CADENA ALIFAacuteTICA (CH2)n
En la familia de las aminoquinolinas y dentro del grupo de
arilaminoalcoholes se observa la presencia de una cadena alifaacutetica como puente
de unioacuten entre el grupo Ar1 y el resto de la moleacutecula De este modo los nuevos
derivados que desarrollar contaraacuten con una variacioacuten de uno a dos carbonos en
la cadena carbonada para determinar la longitud oacuteptima para la actividad
4 AMINA CENTRAL
El grupo amino es constante en todas las familias tomadas como referencia
Del mismo modo las aminoquinolinas tienen como similitud estructural entre
otras un grupo amino unido a la cadena alifaacutetica En este trabajo se plantea el
uso de piperazina homopiperazina (S)-aminopirrolidina aminopiperidina e
tetrahidropiridina para evaluar el efecto del cambio y determinar queacute tipo de
estructuras resulta maacutes conveniente
5 GRUPO AR2
En los compuestos tomados como referencia estructural de partida se observa
la presencia de las cadenas alifaacuteticas en el extremo amino Los nuevos
derivados combinan la amina ciacuteclica con un anillo aromaacutetico sustituido por
grupos electroatrayentes como CF3 (presentes en metanolquinolinas y
Plan de Trabajo
63
arilaminoalcoholes y de efecto positivo deducible para la actividad) el grupo
NO2 o el aacutetomo de F
Figura 29 Disentildeo de nuevas series de derivados de arilaminoalcoholes como nuevos agentes antimalaacutericos
V2 Siacutentesis de los compuestos disentildeados
Una vez disentildeados los compuestos y antes de empezar el trabajo de siacutentesis
se debe dejar claro cuaacutel va a ser el proceso elegido De forma general se puede
definir la siacutentesis de todos los derivados como siacutentesis lineal
La reaccioacuten de Mannnich que se usa para condensar metilcetonas con aminas
y las reacciones de condensacioacuten por sustitucioacuten nucleoacutefila alifaacutetica son
reacciones lineales La posterior reduccioacuten a hidroxilos u oximas se realiza en
un solo paso de reaccioacuten De esta forma nos aseguramos el menor nuacutemero de
pasos de reaccioacuten simplificacioacuten de la siacutentesis disminucioacuten del tiempo
invertido en el mismo y reduccioacuten del coste
V3 Caracterizacioacuten de los compuestos
Todas las reacciones seraacuten seguidas y controladas por cromatografiacutea en capa
fina Una vez obtenidos los compuestos se identificaraacuten por cromatografiacutea en
capa fina espectroscopia infrarroja resonancia magneacutetica nuclear de protoacuten
anaacutelisis elemental y punto de fusioacuten
Plan de Trabajo
64
V4 Evaluacioacuten bioloacutegica ldquoin vitrordquo
Los compuestos finales obtenidos seraacuten enviados a la Universidad de
Antioquiacutea (Medelliacuten Colombia) para la evaluacioacuten in vitro de su actividad
antimalaacuterica Los ensayos de toxicidad de los mismos se realizaraacuten en el
Laboratorio de Farmacologiacutea para el Desarrollo (IRD) de la Universidad Paul
Sabatier en Toulouse (Francia)
V5 Evaluacioacuten bioloacutegica ldquoin vivordquo
Aquellos compuestos que sean seleccionados por sus caracteriacutesticas de
estructura actividad in vitro y toxicidad seraacuten enviados a la Universidad Paul
Sabatier de Toulouse (Francia) para su evaluacioacuten in vivo
V6 Estudios computacionales
Todos los compuestos se someteraacuten a estudios computacionales sobre sus
propiedades fisicoquiacutemicas para obtener datos aproximados de su
comportamiento en solucioacuten (Log P) lipofilia o caraacutecter polar-apolar (presencia
de grupos polares y capacidad de formar enlaces donadores o aceptores) que
aporten datos teoacutericos sobre su absorcioacuten en el organismo A partir de los datos
conformacionales teoacutericos se plantea la unioacuten con una diana Los estudios
computacionales se realizaraacuten en la Unidad de I+D de Medicamentos de la
Universidad de Navarra
MATERIAL Y
MEacuteTODOS
VVII QQUUIacuteIacuteMMIICCAA TTEEOacuteOacuteRRIICCAA
VI1 Esquema general de siacutentesis
Figura 30 Reactivos y condiciones Viacutea 1 Carbonato potaacutesico en tetrahidrofurano a reflujo
Viacutea 2 Dioxolano con aacutecido clorhiacutedrico a reflujo 130-140ordmC
Quiacutemica Teoacuterica
70
VI2 Siacutentesis de precursores
VI21 Siacutentesis de (benzo[b]tiofen-3-il)-3-cloropropan-1-ona
Figura 31 Esquema general de siacutentesis de (benzo[b]tiofen-3-il)-3-cloropropan-1-ona
La siacutentesis de este derivado se lleva a cabo usando tricloruro de aluminio a
temperatura ambiente durante 48 horas (Peacuterez-Silanes S et alts 2001) En vez
de emplear cloroformo como disolvente tal y como describen los autores se
empleoacute diclorometano ya que es menos toacutexico y resulta igualmente efectivo
VI22 Siacutentesis de arilaminas
VI221 Siacutentesis de arilaminas protegidas
Los compuestos sintetizados se ajustan a la estructura general que se muestra
en la figura 32
Figura 32 Estructura general de las arilaminas intermedias sintetizadas
Las arilaminas sintetizadas tienen un extremo amino protegido con un grupo
tert-butiloxicarbonilo (BOC) voluminoso que evita que estas diaminas
reaccionen por ambos extremos con el fluoruro de arilo
Figura 33 Esquema general para la siacutentesis de arilaminas
Este tipo de reacciones raramente transcurren por un mecanismo de
sustitucioacuten nucleofiacutelica aromaacutetica (SNA) Normalmente la SNA dan bajos
rendimientos debido a que el enlace C (sp2)-X es maacutes corto y fuerte que el de un
carbono con hibridacioacuten sp3 La SN2 estaacute impedida por dificultades esteacutericas del
anillo para que se aproxime el nucleoacutefilo y la SN1 estaacute impedida por la
inestabilidad del catioacuten fenilo intermedio
Tras revisar la bibliografiacutea se propone que este tipo de SNA transcurren
seguacuten un mecanismo llamado Sustitucioacuten nucleofiacutelica aromaacutetica viacutea complejos
Quiacutemica teoacuterica
71
de meisenheimer (Figura 34) consistente en una adicioacuten-eliminacioacuten (Bruckner
et alts 2002)
En la primera fase la adicioacuten el nucleoacutefilo ataca al compuesto aromaacutetico en la
que es la etapa lenta de la reaccioacuten Se produce un carbanioacuten que es llamado
Complejo de Meisenheimer La carga negativa queda deslocalizada sobre los
cinco carbonos aromaacuteticos con hibridacioacuten sp2 del anillo pero no lo hace
uniformemente sino que se distribuye tal y como se indica en la figura 34
Figura 34 Primera Etapa Etapa lenta del mecanismo de reaccioacuten de sustitucioacuten nucleofiacutelica viacutea complejos de
Meisenheimer
El aacutetomo unido al nucleoacutefilo tiene hibridacioacuten sp3 ya que tambieacuten se
encuentra unido al sustituyente X que se elimina en una segunda etapa la fase
raacutepida de la reaccioacuten (Figura 35)
Figura 35 Segunda Etapa Etapa raacutepida del mecanismo de reaccioacuten de sustitucioacuten nucleofiacutelica viacutea complejos de
Meisenheimer
Independientemente del haloacutegeno X y del sustituyente R empleados en la
posicioacuten para respecto del aacutetomo de carbono al que ataca el nucleoacutefilo aparece
una carga parcial de -030 del mismo modo en las posiciones orto esta carga
parcial es de -025 y en la posiciones meta la carga es de -010 Como
consecuencia de esto uno de los requisitos maacutes importantes para que se de la
reaccioacuten es que alguacuten grupo electroatrayente estabilice el complejo La mayor
densidad de carga negativa se encuentra en para por lo que los grupos
electroatrayentes en esta posicioacuten estabilizan mucho el compuesto formado Por
esta razoacuten se han empleado grupos nitro o fluacuteor en dicha posicioacuten
El empleo de fluoruros de arilo para la formacioacuten de los intermedios de
aminas protegidas tambieacuten se explica por esta razoacuten El fluacuteor tiene un fuerte
efecto inductivo lo que estabiliza el complejo formado
Quiacutemica Teoacuterica
72
Tras una revisioacuten bibliograacutefica se observoacute que esta reaccioacuten esta favorecida
llevaacutendose a cabo en un medio de acetonitrilo (CH3CN) a reflujo en lugar del
dimetilsulfoacutexido (DMSO) anteriormente descrito usando carbonato potaacutesico
(K2CO3) (Blizzard et alts 2005) lo que facilita el trabajo por el bajo punto de
ebullicioacuten del medio y simplificando la extraccioacuten de los compuestos en este
medio
VI222 Desproteccioacuten de aminas
Las arilaminas sintetizadas tienen un extremo amino protegido con un grupo
BOC asiacute una vez formados los intermedios protegidos el paso siguiente para
continuar con la siacutentesis de los compuestos deseados consiste en eliminar este
grupo protector
Figura 36 Generacioacuten del carbocatioacuten t-butilo y del aacutecido carbaacutemico
La reaccioacuten de las aminas protegidas con aacutecidos acuosos como aacutecido
clorhiacutedrico y aacutecido aceacutetico (HCl y HAc) en condiciones de temperatura
ambiente rinde la consiguiente amina desprotegida en forma de hidrocloruro
Para esta reaccioacuten la amina protegida se disuelve en una disolucioacuten (11) de
HClHAc a temperatura ambiente generaacutendose un aacutecido carbaacutemico (Figura 36)
que es inestable y se descarboxila in situ (Figura 37) dando lugar a la amina
desprotegida en forma de hidrocloruro debido la presencia de HCl en el medio
Figura 37 Descarboxilacioacuten espontaacutenea del aacutecido carbaacutemico
Los hidrocloruros son compuestos poco solubles en muchos de los
disolventes orgaacutenicos y en ocasiones impiden los siguientes pasos de siacutentesis
Asiacute los intermedios se convierten a su forma de base libre por medio de su
disolucioacuten en agua y posterior adicioacuten de una disolucioacuten de hidroacutexido soacutedico
Quiacutemica teoacuterica
73
(NaOH) 2M de forma gradual hasta pH baacutesico para asegurar una completa
eliminacioacuten de HCl de la moleacutecula La disolucioacuten baacutesica se deja en agitacioacuten
durante dos horas aproximadamente Normalmente se observa como al antildeadir
la base se obtiene un precipitado debido a la insolubilidad de la amina en forma
de base libre en el medio acuoso mientras que en forma de hidrocloruro
resultaba soluble
Como uacuteltimo paso de reaccioacuten se procede a la extraccioacuten de la amina con un
disolvente orgaacutenico que suele ser diclorometano En general las aminas
precipitan faacutecilmente en hexano friacuteo como soacutelido Si fuese necesario purificar el
aceite impuro se realiza una cromatografiacutea en columna no flash con
diclorometano basificado con unas gotas de amoniacuteaco
VI3 Siacutentesis de derivados carboniacutelicos (Serie 0)
VI31 Condensacioacuten de 1-(benzo[b]tiofen-3-il)-3-cloropropan-1-ona y
de 2-bromo-2acute-acetonaftona con la amina (Viacutea 1)
En este caso los productos finales se obtienen a traveacutes de una reaccioacuten de
sustitucioacuten nucleofiacutelica alifaacutetica (Figura 38) a partir del 1-(benzo[b]tiofen-3-il)-3-
cloropropan-1-ona o del 2-bromo-2acute-acetonaftona y la correspondiente amina
Al tratarse de un cloruro de alquilo primario el mecanismo maacutes probable de
reaccioacuten es el de una sustitucioacuten nucleofiacutelica de segundo orden (SN2)
Figura 38 Esquema de siacutentesis de cetonas
La mayoriacutea de las veces los reactivos de partida no se llegan a consumir
completamente y se obtienen productos secundarios que no se eliminan con
facilidad Ha sido especialmente costosa la purificacioacuten de algunos compuestos
los que han requerido la purificacioacuten por medio dos columnas cromatograacuteficas
tradicionales consdecutivas columna tradicional seguida de una preparativa o
purificarlos dos veces consecutivas en el equipo de cromatografiacutea flash Todos
estos intentos de purificacioacuten ldquoparcialrdquo hacen disminuiacuter notablemente el
rendimiento de la reaccioacuten Otras veces los compuestos se precipitan como
hidrocloruro consiguiendo al mismo tiempo ser purificados
Quiacutemica Teoacuterica
74
VI32 Reaccioacuten de Mannich Condensacioacuten de metilcetonas con aminas
en medio aacutecido (Viacutea 2)
La reaccioacuten de Mannich consiste en la condensacioacuten de un compuesto que
posea aacutetomos de hidroacutegeno activos (sustrato) con formaldehiacutedo y una amina
para formar una moleacutecula conocida como ldquoBase de Mannichrdquo
En la mayor parte de las reacciones se usoacute el 13-dioxolano que es una amina
secundaria como compuesto generador de formaldehido El sustrato son
arilmetilcetonas donde el anillo aromaacutetico es fluorobenzo[b]tiofeno naftaleno
4-fluoronaftaleno o bencenos para-sustituidos El 13-dioxolano es ademaacutes el
disolvente y como catalizador el aacutecido clorhiacutedrico aporta al medio los protones
necesarios para la reaccioacuten
Las arilmetilcetonas utilizadas presentan hidroacutegenos aacutecidos en posiciones α
con respecto al grupo carboniacutelico (Figura 40) En medio aacutecido la acidez de estos
se debe a la estabilizacioacuten de la base conjugada (forma enoacutelica) por resonancia
La presencia del anillo en α con respecto al carbonilo provoca una situacioacuten de
deslocalizacioacuten electroacutenica π del sistema en su forma enoacutelica que se ve
favorecida por los sustituyentes electroatrayentes unidos al anillo La
reactividad aumenta debido a la retirada de carga del sistema π por estos
sustituyenes que acidifican asiacute los hidrogenos α
El mecanismo de reaccioacuten propuesto transcurre en dos etapas
En una primera etapa la amina reacciona con el formaldehiacutedo generando el
catioacuten iminio El 13 dioxolano es un acetal que en medio aacutecido genera
formaldehiacutedo ldquoin siturdquo para producirse entonces una adicioacuten nucleoacutefila de
la amina al carbonilo del compuesto no enolizable como es el recieacuten
generado formaldehiacutedo (Figura 39) (Tramontini et alts 1973)
Figura 39 Primera etapa del mecanismo de reaccioacuten propuesto para la formacioacuten de la base de Mannich
En la segunda etapa de reaccioacuten la metilcetona en medio aacutecido se protona
dando lugar a un equilibrio ceto-enoacutelico desplazado hacia la forma enoacutelica
(Figura 40)
Quiacutemica teoacuterica
75
Figura 40 Equilibrio ceto-enoacutelico en medio aacutecido
El ion iminio formado en la primera etapa es un buen electroacutefilo que
reacciona con la forma enolica nucleoacutefila obtenieacutendose como resultado la sal del
compuesto final (Figura 41) Asiacute el uacuteltimo paso de reaccioacuten es la basificacioacuten del
medio con una disolucioacuten acuosa de NaOH para la obtencioacuten de la sal
inorgaacutenica y compuesto orgaacutenico libre
Figura 41 Segunda etapa del mecanismo de reaccioacuten de Mannich
Se ha determinado experimentalmente que en la obtencioacuten de la base se
produce la misma reaccioacuten usando como generador de formaldehido el
paraformaldehido Para ella ha de usarse como medio de reaccioacuten un medio
proacutetico como el alcohol etiacutelico y HCl Despueacutes de varios experimentos y
optimizacioacuten de la temperatura necesaria para la reaccioacuten se comproboacute que la
viacutea oacuteptima por rapidez y rendimiento era la del 13 dioxolano
VI4 Siacutentesis de derivados hidroxiacutelicos (Series 1-7)
Los derivados hidroxiacutelicos se sintetizan a traveacutes de la reduccioacuten de las
correspondientes intermedios carboniacutelicos con borohidruro soacutedico (BH4Na) en
metanol a 0ordmC
Figura 42 Esquema general para la siacutentesis de alcoholes desde cetonas
En todas las reducciones que se han realizado se utiliza como agente
reductor el BH4Na que es probablemente el agente reductor maacutes usado en este
tipo de siacutentesis Se trata de un hidruro de reactividad media que presenta alta
quimioselectividad y un manejo sencillo en comparacioacuten con otros hidruros
El disolvente empleado es metanol con el que se logra una buena solubilidad
del BH4Na La temperatura de reaccioacuten se ha de mantener en torno a 0ordmC por
Quiacutemica Teoacuterica
76
tres motivos primero para evitar que la reaccioacuten se deacute demasiado raacutepida lo que
conlleva la aparicioacuten de productos secundarios en segundo lugar para evitar
que sea demasiado lenta lo que favorece la reaccioacuten secundaria entre el
borohidruro y el metanol El tercer motivo es impedir que tenga lugar la
reaccioacuten inversa a la reaccioacuten de Mannich
En general la reaccioacuten entre el BH4Na y el compuesto se da por completo
durante la primera hora de reaccioacuten antes de que tenga lugar la reaccioacuten
inversa de descomposicioacuten del compuesto cetoacutenico El mecanismo de reaccioacuten
no se ha descrito de forma totalmente definitiva aunque siacute que parece seguro el
hecho de que la estequiometriacutea de la reaccioacuten es de cuatro moleacuteculas de cetona
por una de BH4Na
La reaccioacuten transcurre siguiendo una transferencia secuencial de hidruros
desde la moleacutecula de BH4Na hasta cada una de las cuatro cetonas a traveacutes de
sendos ataques nucleofiacutelicos a los carbonos carboniacutelicos que tras estas
transferencias forman la sal soacutedica del tetraborato Este complejo sufre con
posterioridad una hidroacutelisis dando lugar finalmente a la formacioacuten del alcohol
(Figura 43)
Figura 43 Mecanismo de reaccioacuten propuesto para la siacutentesis de los alcoholes
Quiacutemica teoacuterica
77
El disolvente utilizado es el metanol que al ser un disolvente proacutetico cumple
la misioacuten de reducir la energiacutea de activacioacuten que es demasiado grande para que
la reaccioacuten se produzca de forma espontaacutenea a pesar de que el proceso neto es
exoteacutermico Esta cataacutelisis de la reaccioacuten se debe a la estabilizacioacuten que el
disolvente aporta al estado de transicioacuten ademaacutes de estabilizar el borano y el
anioacuten alcoacutexido cuando eacutestos no se hayan unido
Todos los derivados hidroxiacutelicos se han purificado por cromatografiacutea en capa
fina cromatografiacutea de columna cromatografiacutea preparativa o cromatografiacutea
flash Algunos se han precipitado en forma de hidrocloruro mediante la
adicioacuten de eacuteter saturado de aacutecido clorhiacutedrico
Estereoquiacutemica de la reaccioacuten
Las cetonas asimeacutetricas empleadas en estas reacciones son productos
proquirales por lo que dan lugar a las dos configuraciones posibles del
derivado hidroxiacutelico R y S La reaccioacuten rinde una mezcla raceacutemica ya que el
borohidruro soacutedico no es agente estereoselectivo y el grupo carbonilo es plano
con lo que el ion hidruro puede atacar por ambos lados del grupo con igual
probabilidad Ademaacutes estas moleacuteculas no poseen grupos voluminosos que
favorezcan la aparicioacuten de un mayor porcentaje de uno de los enantioacutemeros
Dado que es muy costoso el aislamiento de los isoacutemeros por separado se
replanteariacutea este trabajo en caso de encontrar una moleacutecula especialmente
activa
Reacciones secundarias
Una de las reacciones secundarias maacutes frecuentes es la rotura de la base de
Mannich formada a traveacutes de una desaminacioacuten o de una desaminometilacioacuten
que recibe el nombre de ldquoretro-Mannichrdquo (Tramontini y Angiolono 1990) La
reaccioacuten tiene como productos los reactivos de partida de la condensacioacuten
carboniacutelica
Todaviacutea no queda claro el porqueacute de estas reacciones pero podriacutea deberse a
un aumento de la temperatura del medio provocada por una adicioacuten
demasiado raacutepida de BH4Na o por una excesiva basificacioacuten del medio
ocasionada por un exceso del agente reductor
Quiacutemica Teoacuterica
78
VI5 Siacutentesis de oximas (Serie 8)
La siacutentesis de estos derivados se abordoacute a partir de los derivados carboniacutelicos
mediante una condensacioacuten de estos con hidroxilamina usando etanol (EtOH)
como disolvente (Figura 44)
Figura 44 Esquema general de reduccioacuten de carbonilo a oxima
El mecanismo de la reaccioacuten transcurre en dos etapas a traveacutes de un
intermedio cuya existencia ha sido verificada mediante el uso de teacutecnicas de
espectroscopia de IR (Martinez J 1999)
La primera etapa consiste en la formacioacuten del intermedio de reaccioacuten para lo
cual es necesaria la presencia de hidroxilamina en su forma libre (la forma
protonada no posee caraacutecter nucleofiacutelico) por lo que esta etapa de la reaccioacuten se
veraacute favorecida a pH baacutesico
Figura 45 Mecanismo de reaccioacuten propuesto para la formacioacuten del intermedio de reaccioacuten en la formacioacuten de oximas
La segunda etapa consiste en la deshidratacioacuten del intermedio que estaraacute
favorecida por un pH aacutecido La velocidad de la reaccioacuten dependeraacute del pH de la
misma y asiacute mientras que en un pH baacutesico la adicioacuten de hidroxilamina es un
proceso raacutepido y es la segunda etapa la que controla la velocidad de reaccioacuten lo
contrario ocurre a pH aacutecido siendo entonces la primera etapa la que controla la
velocidad de reaccioacuten
Figura 46 Mecanismo propuesto para la formacioacuten de la oxima por deshidratacioacuten del intermedio de reaccioacuten en media aacutecido
Quiacutemica teoacuterica
79
Estereoquiacutemica de la reaccioacuten
La formacioacuten de oximas puede producir dos isoacutemeros posibles el Z o cis y el
E o trans
Figura 47 Isomeriacutea cis-trans de los derivados oxima31
Se observoacute que seguacuten el derivado carboxiacutelico del que se partiacutea se obteniacutea
mayoritariamente un isoacutemero u otro pero aunque no se ha encontrado
explicacioacuten a esta selectividad
31 El estudio espectroscoacutepico de ambos isoacutemeros se encuentra desarrollado en la tesis del Dr J Martinez Esparza (1999)
VVIIII QQUUIacuteIacuteMMIICCAA EEXXPPEERRIIMMEENNTTAALL
Quiacutemica experimental
83
VII1 Instrumental y reactivos
Los reactivos quiacutemicos utilizados en siacutentesis fueron adquiridos en E Merck
(Darmstadt Alemania) Scharlau (FEROSA Barcelona Espantildea) Panreac
Quiacutemica SA (Montcada i Reixac Barcelona Espantildea) Sigma-Aldrich Quiacutemica
SA (Alcobendas Madrid) Acros Organics (Janssen Pharmaceuticalaan 3a
2440 Geel Beacutelgica) Maybridge (Cornwall Reino Unido) Lancaster (Bischheim-
Strasbourg Francia) y Prolabo (Leuven Belgica)
Las cromatografiacuteas de capa Fina se desarrollan sobre gel de siacutelice de 02 mm de
espesor (Alugram SIL GUV254 [ref 818133] Macherey-Nagel Alemania) Las
placas se desarrollan en diclorometanometanol en diferentes proporciones y
se revelan bajo una laacutempara ultravioleta a longitud de onda 254 y 365 nm
La cromatografiacutea en columna se desarrolla en columnas de vidrio
empaquetadas con siacutelica gel 60 (0040-0063 mm y 0063-0200 mm de tamantildeo
de partiacutecula Merck) con fases moacuteviles diclorometanometanol o
hexanoacetato en diferentes proporciones
La cromatografiacutea preparativa se desarrolla en placas de vidrio rectangulares
sobre las cuales se preparan laacuteminas de siacutelica gel (Siacutelica Gel 60 PF254
cromatografiacutea en capa fina (ref 1077472500) Merck KGaA Darmstadt
Alemania) de 1 mm de grosor La fase moacutevil utilizada en esta metodologiacutea es
diclorometanometanol 973
La cromatografiacutea flash se realiza en un equipo de cromatografiacutea Combiflashreg
Rf 200 (Teledyne Isco Lincoln USA) Se desarrolla en columnas flash de fase
normal de 12 gramos RediSepreg Rf Columns (Teledyne Isco USA) con un
gradiente binario hasta 991 diclorometanometanol (pureza de siacutentesis SDS-
Carlo Erba Reactifs Francia)
Formacioacuten de hidrocloruro algunos de los compuestos fueron purificados o
precipitados en forma de sales Para ellos se utilizoacute eacuteter saturado de HCl
preparado en el laboratorio
VII2 Meacutetodos de elucidacioacuten estructural
Todos los compuestos sintetizados han sido caracterizados quiacutemicamente por
cromatografiacutea en capa fina (CCF) punto de fusioacuten espectroscopia infrarroja
(IR) resonancia magneacutetica nuclear (RMN) anaacutelisis elemental de carbono
Ensayos Bioloacutegicos
84
hidroacutegeno y nitroacutegeno (CHN) y cromatografiacutea liacutequida de alta resolucioacuten
(HPLC)
Los puntos de fusioacuten han sido determinados en un equipo Mettler FP82 +
FP80 (Greifense Suiza) y no han sido corregidos La temperatura de fusioacuten se
muestra en grados centiacutegrados (0C)
Los espectros de IR han sido registrados en un equipo Thermo Nicolet FTIR
Nexus Euro (Madison USA) con el programa informaacutetico OMNIC 60
empleando pastillas de bromuro potaacutesico Las frecuencias se expresan en cm-1 y
las intensidades de sentildeal se representan como md (media deacutebil) d (deacutebil) m
(media) f (fuerte) y mf (muy fuerte)
Los espectros de RMN-1H han sido registrados en un equipo Brucker 400
UltrasieldTM (Brucker BioSpin GmbH Rheinstelten Alemania) utilizando como
referencia interna tetrametilsilano en una concentracioacuten aproximada de 01
gmL de TMS y dimetilsulfoacutexido-d6 (DMSO-d6) o cloroformo deuterado
(CDCl3) como disolventes La concentracioacuten de las muestras ha sido
aproximadamente 20 mgmL Para la deteccioacuten de los protones laacutebiles se
emplean unas gotas de agua deuterada Los desplazamientos quiacutemicos (δ) han
sido expresadas en ppm relativas a tetrametilsilano y las multiplicidades de
sentildeal se han representado como se indican en las siguientes abreviaturas sa
(sentildeal ancha) s (singlete) d (doblete) t (triplete) c (cuadruplete) m
(multiplete) dd (doble doblete) y ddd (doble doblete desdoblado) Las
constantes de acoplamiento J han sido expresadas en Hz Los experimentos
HMBC (espectros en 2D para determinar los acoplamientos de protones a larga
distancia) HMQC (espectros en 2D para observar los acoplamientos C-H en la
moleacutecula) DEPT-135 (espectros en 1D donde los CH y CH3 salen positivos y
los CH2 negativos) DEPT-90 (espectros en 1D donde solo aparecen los grupos
CH) RMN-13C y COSY (espectro 2D para determinar los acoplamientos de los
protones con los protones vecinos) se han registrado en el mismo equipo
empleado para la resonancia de protoacuten utilizando los mismos disolventes
deuterados
Los CHN han sido obtenidos en un microanalizador LECO CHN-900(Tres
cantos Espantildea) a partir de muestras previamente secadas con pentoacutexido de
foacutesforo durante 24-48 horas a vaciacuteo (3-4 mm Hg) y temperatura ambienteEl
intervalo de error admitido para cada producto es de plusmn04 para cada tipo de
aacutetomo determinado
Quiacutemica experimental
85
Los tiempos de retencioacuten y longitudes maacuteximas de absorcioacuten para la
determinacioacuten de pureza y caracterizacioacuten han sido obtenidos en un equipo de
HPLC Los experimentos fueron realizados en un cromatoacutegrafo Ultimate 3000
(DIONEX) controlado por el software Cromeleon versioacuten 68 Las medidas se
obtuvieron con una columna RP18 (LICHROSPHER 100 RP18 EC 5 microm
10x046 TEKNOKROMA) como fase estacionaria y un flujo de 1 mL minuto
con metanolagua (8020) como fase moacutevil Los tiempos de retencioacuten (tR) se
expresan en minutos y las longitudes de onda maacuteximas en nm
VII3 Denominaciones de compuestos
El criterio elegido para la asignacioacuten de las referencias ha sido el siguiente En
primer lugar se dividen los compuestos obtenidos en carbonilos hidroxilos y
oximas Los derivados carboniacutelicos son considerados como intermedios en la
reaccioacuten global asiacute que se les asigna el nombre de Serie 0 Los compuestos
hidroxiacutelicos son los que corresponden estructuralmente con los
arilaminoalcoholes antimalaacutericos objeto central de este trabajo que se divide en
subgrupos En el caso de las oximas se ha denominado al grupo de compuestos
como Serie 8
La primera divisioacuten se realiza seguacuten la naturaleza del Ar1 y de la longitud de la
cadena alifaacutetica
Figura 48 Estructura general de los derivados hidroxiacutelicos sintetizados
Serie 1 2 3 4 5 6 7
Ar1
n 2 2 2 1 2 2 2
Tabla 1 Distribucioacuten de compuestos en series por Ar1
Ademaacutes de la serie numeacuterica una letra diferenciaraacute cada compuesto seguacuten la
amina y los sustituyentes Ra y Rb del benceno de Ar2 que conforman cada
derivado De esta forma
Ensayos Bioloacutegicos
86
a b c d e f g
Amina
RaRb CF3N
O2 NO2CF3 HCF3 CF3NO2 CF3NO2 CF3NO2 HF
Tabla 2 Denominacioacuten de compuestos
Siguiendo este orden alfabeacutetico los derivados que forman la Serie 0 son
numerados seguacuten el mismo criterio
Ejemplo un compuesto hidroxiacutelico que presenta un aacutetomo de fluacuteor en Ar1
unido a un grupo naftaleno con una piperidina central y grupo fenil con Ra
trifluorometil y Rb nitro se denomina como compuesto 5f
Referencia Serie 5f
Ar1= FNFT
(CH2) n n=2
Amina= PIPR
Ar2 Ra=CF3 ndash Rb= NO2
VII4 Descripcioacuten general de meacutetodos de siacutentesis
VII41 Meacutetodo A procedimiento general para la obtencioacuten de las
arilaminas protegidas
En 30 mL de acetonitrilo (CH3CN) se disuelven 1 equivalente de la amina
comercial protegida y 12 equivalentes del halogenuro de arilo correspondiente
seguacuten la arilamina que se desee sintetizar en cada caso Se antildeaden tambieacuten 15
equivalentes de carbonato potaacutesico (K2CO3) para neutralizar el medio de
reaccioacuten Se hace reaccionar a reflujo un maacuteximo de 24 horas tras lo cual se
elimina el CH3CN en el rotavapor El residuo obtenido se disuelve en
diclorometano y se extrae tres veces con agua La fase orgaacutenica obtenida se seca
con sulfato soacutedico anhidro se filtra y se elimina el disolvente a sequedad en el
rotavapor obtenieacutendose la correspondiente BOC-arilamina
Quiacutemica experimental
87
VII42 Meacutetodo B procedimiento general para la desproteccioacuten de
aminas
Se disuelve la amina protegida en 40 mL de disolucioacuten HClAcH (11)
observaacutendose ligera efervescencia por el desprendimiento de H2 Se deja
agitando 2 horas a temperatura ambiente Transcurrido el tiempo se elimina el
disolvente en el rotavapor El clorhidrato obtenido se disuelve en agua y se
antildeade NaOH 2M hasta conseguir pH baacutesico Se agita 2 horas y la mezcla de
reaccioacuten se extrae con DCM La fase orgaacutenica se seca con sulfato soacutedico anhidro
se filtra y se elimina el disolvente a sequedad en el rotavapor obtenieacutendose la
correspondiente arilamina desprotegida
VII43 Meacutetodo C procedimiento general para condensacioacuten de aminas
(Viacutea 1)
Se disuelven en 40 mL de tetrahidrofurano (THF) las cantidades indicadas en
cada caso de 1-(benzo[b]tiofen-3-il)-3-cloropropan-1-ona o 2-bromo-2acute-
acetonaftona y la amina deseada en proporciones 11 Se antildeade la cantidad
equimolecular de carbonato potaacutesico Se deja agitando un maacuteximo de 24 horas a
temperatura ambiente y en el transcurso de ese tiempo se sigue el desarrollo de
la reaccioacuten por CCF Se elimina el THF en el rotavapor a presioacuten reducida y el
residuo obtenido se disuelve en diclorometano para lavarlo tres veces con agua
La fase orgaacutenica se seca con sulfato soacutedico se filtra y se elimina el disolvente en
el rotavapor El residuo obtenido se purifica por el meacutetodo descrito en cada
caso
Esta viacutea se siacutentesis se aplica a la obtencioacuten de los derivados de la Serie 0 1 2
3 14 y 15 que son los intermedios para la obtencioacuten las Series 1 y 4
VII44 Meacutetodo D procedimiento de condensacioacuten de aminas (Viacutea 2)
En un matraz se ponen las cantidades indicadas de 1-(5-fluorobenzo[b]tiofen-
3-il)etanona 2-acetonaftona 4-fluoro-1acute-acetonaftona 4-fluoroacetofenona o 4-
(trifluorometil)acetofenona y la amina deseada en proporciones
equimoleculares Se antildeade 13 dioxolano en una proporcioacuten 14 molar y se
antildeaden varias gotas HCl concentrado Se lleva a reflujo a una temperatura de
bantildeo de 130-140 ordmC siguiendo la reaccioacuten por CCF Finalizada la reaccioacuten se
enfriacutea a temperatura ambiente y se antildeade agua y NaOH 2M hasta pH baacutesico en
agitacioacuten El compuesto se extrae con diclorometano y se seca la fase orgaacutenica
con sulfato soacutedico anhidro Se filtra y elimina el disolvente en el rotavapor a
Ensayos Bioloacutegicos
88
sequedad El residuo obtenido puede precipitar puro o necesitar posterior
purificacioacuten por los meacutetodos descritos en cada caso
Esta viacutea de siacutentesis se aplica para la obtencioacuten de la mayor parte de los
compuestos de la Serie 0 intermedios para la obtencioacuten de las Series 2 35 6 7
y 8
VII45 Meacutetodo E procedimiento general para la reduccioacuten de cetonas
En un bantildeo de hielo a 0 ordmC se pone un matraz con 10 mL de metanol a
enfriar Una vez friacuteo se antildeade el compuesto carboniacutelico al matraz y se deja en
agitacioacuten Se le antildeade a la disolucioacuten enfriada aproximadamente 200 mg de
BH4Na observaacutendose efervescencia Se deja en agitacioacuten un maacuteximo de una
hora manteniendo la temperatura del bantildeo siguiendo la evolucioacuten por CCF
Transcurrido el tiempo se antildeaden 5 mL de agua que inactivan el BH4Na y se
elimina a vaciacuteo el disolvente Se extrae con DCM y la fase orgaacutenica se seca con
sulfato soacutedico anhidro Se filtra y se elimina el disolvente a vaciacuteo El residuo
puede precipitar puro o necesitar purificacioacuten por cromatografiacutea en columna
flash o mediante formacioacuten del correspondiente hidrocloruro
Se obtienen por este meacutetodo los compuestos de las Series 1 a 7
VII46 Meacutetodo F procedimiento general para siacutentesis de oximas desde
carbonilos
En un matraz se pone la cantidad de carbonilo obtenido deseada y se antildeade
el clorhidrato de hidroxilamina en proporcioacuten 1 55 molar respectivamente Por
uacuteltimo se antildeaden 15 mL de EtOH y se lleva a reflujo durante 90 minutos
Pasado el tiempo se retira el reflujo y se deja enfriar unos minutos A
continuacioacuten se antildeaden 30 mL de una disolucioacuten previamente preparada de
NaOH 2M en EtOH hasta que el pH es baacutesico y se lleva media hora maacutes a
reflujo Se deja enfriar la reaccioacuten se antildeade un poco de agua al matraz y se hace
una extraccioacuten acetato de etiloagua Se seca y se elimina el disolvente en el
rotavapor obteniendo un soacutelido impuro que se purifica solubilizando las
impurezas en diclorometano puesto que la oxima no es soluble en ese
disolvente El soacutelido que se obtiene se lava con eacuteter etiacutelico para su purificacioacuten
Se obtienen por este meacutetodo los compuestos de la Serie 8
Quiacutemica experimental
89
VII5 Purificacioacuten por cromatografiacutea flash
La cromatografiacutea manual en columna de vidrio tradicional ha sido uno de los
meacutetodos de purificacioacuten maacutes usados en quiacutemica orgaacutenica por ser un meacutetodo
praacutectico de bajo coste y controlado por el operario Por otro lado lleva asociado
algunos inconvenientes como la baja resolucioacuten y reproducibilidad teacutecnica
costosa en tiempo opciones de tipo de elucioacuten limitadas baja utilidad en
separacioacuten de muestras complejas y baja estandarizacioacuten del sistema por la falta
de automatizacioacuten La evolucioacuten para mejorar todos estos puntos deacutebiles pasa
por la automatizacioacuten del sistema que va desde la inyeccioacuten de la muestra hasta
la coleccioacuten automaacutetica que permite la realizacioacuten de otros trabajos durante la
separacioacuten de los compuestos Ademaacutes aumenta la reproducibilidad y la
productividad Seguacuten la muestra que purificar y sus caracteriacutesticas
fisicoquiacutemicas se ha de seleccionar las condiciones de trabajo del equipo de
cromatografiacutea flash
Fase estacionaria Existen disponibles comercialmente una gran variabilidad
de columnas con distintas fases estacionarias La maacutes usual que es tambieacuten la
empleada en este trabajo es la columna de siacutelica de fase normal Pero tambieacuten
se dispone de columnas C18 fase reversa columnas de aminas aluacutemina baacutesica
aluacutemina neutra ciano diol de intercambio anioacutenico y de intercambio catioacutenico
Las columnas de siacutelica de fase normal estaacuten formadas por un poliacutemero de oacutexido
de silicio entrecruzado tetraeacutedricamente En medio acuoso las valencias libres
de los aacutetomos de silicio adsorben grupos hidroxilos formando grupos silanol
polares en la superficie
Claacutesicamente para cada gramo de compuesto que va a ser purificado se pone
100 g de siacutelica gel (1 de carga) pero en el nuevo sistema las columnas estaacuten
preparadas para el 10 de carga En este trabajo se ha usado columnas de siacutelica
de 12 g de tamantildeo (tamantildeo de partiacutecula 35-70 microm y tamantildeo de poro 60 Aring con
una capacidad de muestra de 12 a 1200 mg con flujo oacuteptimo 25-40 mLmin y
volumen 168 mL
Fase moacutevil Al igual que la fase estacionaria la eleccioacuten de la fase moacutevil
depende de la muestra a purificar Existen diferentes gradientes de elucioacuten
siendo el gradiente binario el maacutes utilizado en la separacioacuten de compuestos
Controlando el gradiente se pueden obtener tiempos de elucioacuten menores
menor dependencia de los factores oacuteptimos de separacioacuten y mayor eficacia
repetitividad y pureza El gradiente elegido en este caso para la purificacioacuten de
compuestos es el isocraacutetico lineal donde se alternan periodos donde las
Ensayos Bioloacutegicos
90
proporciones de mezcla de solventes permanecen constantes en el tiempo con
otros periodos donde aumenta la proporcioacuten del solvente maacutes polar
Para la eleccioacuten del solvente adecuado se realiza un estudio previo del
desarrollo de los componentes en CCF ya que esto da una aproximacioacuten del
comportamiento de los componentes de la muestra en la columna durante la
purificacioacuten Se ha seleccionado la mezcla DCMmetanol en todos los casos de
purificacioacuten de compuestos por la buena separacioacuten de componentes que ha
mostrado No es posible la utilizacioacuten de metanol al 100 ya que se podriacutean
producir dantildeos en las columnas de fases estacionarias Ademaacutes la estabilidad
de las bombas tambieacuten podriacutea verse afectada por tanto ha de utilizarse como
fase moacutevil polar una mezcla DCMmetanol 8020
Longitud de onda de deteccioacuten La longitud de onda de deteccioacuten oacuteptima ha
de ser elegida seguacuten la estructura quiacutemica de la muestra En el caso de
arilaminoalcoholes se ha seleccionado como longitud de onda de deteccioacuten 254
nm que es la oacuteptima para aromaacuteticos En el caso de los derivados de las Series
3 4 y 5 (naftalenos) como el equipo ofrece la posibilidad de detectar dos
longitudes de onda se seleccionoacute la deteccioacuten a 365 nm como complementaria
Teacutecnicas de carga de muestra Las muestras son cargadas en el sistema en
estado soacutelido o en disolucioacuten dependiendo de la solubilidad que presenten a la
fase menos polar con la que se inicia la purificacioacuten En el caso de muestras
solubles al diclorometano se realiza una disolucioacuten con la miacutenima cantidad de
solvente posible y se inyectan en el equipo Si la muestra no es soluble al
diclorometano se realiza una disolucioacuten soacutelida en siacutelica gel 60 (0040-0063 nm
de tamantildeo de poro) Para ello se disuelve la muestra en un solvente adecuado y
se antildeade siacutelica Se elimina el disolvente a sequedad a vaciacuteo y se pone la muestra
en un cartucho vaciacuteo especial para este tipo de muestras desde donde el equipo
inyectaraacute automaacuteticamente la muestra
VVIIIIII EENNSSAAYYOOSS BBIIOOLLOacuteOacuteGGIICCOOSS
Ensayos bioloacutegicos
93
VIII1 Ensayos in vitro
Los compuestos descritos han sido ensayados por el Grupo Malaria de la
Universidad de Antioquiacutea en Medelliacuten (Colombia)
Los ensayos in vitro han sido realizaron en cepas sensibles a la CQ NF-54 y
Colombian FCR-3 de Plasmodium falciparum resistentes a la CQ Los cultivos se
desarrollaron a 37ordmC en una atmoacutesfera de CO2 al 5 y en un medio de glucosa
enriquecida RPMI 1640 con gentamicina a una concentracioacuten de 01 mgmL y
suero humano al 10 inactivado por calor como se describe en la bibliografiacutea
(Trager y Jensen 1976) Los compuestos se disuelven en dimetilsulfoacutexido
(DMSO) hasta completar un rango de concentraciones entre 200 y 01 microM La
concentracioacuten final de DMSO nunca es superior al 01
La actividad antimalaacuterica in vitro se mide utilizando el ensayo de
incorporacioacuten de hipoxantina tritiada (MP Biomedicals USA) seguacuten el meacutetodo
de Desjardins (Desjardins et alts 1979) El meacutetodo consiste en una medicioacuten
indirecta de la actividad metaboacutelica del paraacutesito por medio de la incorporacioacuten
de un precursor de aacutecidos nucleicos marcado radiactivamente El Plasmodium es
incapaz de sintetizar las purinas que necesita para su replicacioacuten obtenieacutendolas
de una fuente externa La utilizacioacuten del precursor de purinas marcadas
permitiraacute determinar la incorporacioacuten del material geneacutetico del paraacutesito y por
tanto se comportaraacute como marcador de la regeneracioacuten del mismo
Los ensayos se realizan por triplicado y los resultados se obtienen por
interpolacioacuten lineal (Huber y Koella 1993) Finalmente se expresan como CI50
(concentracioacuten que produce una inhibicioacuten del 50 del crecimiento plusmn la
desviacioacuten estaacutendar) siendo
Log (IC50) = log (X1) + (50-Y1)(Y2-Y1) [log (X2) ndash log (X1)]
Siendo X1 Concentracioacuten del compuesto que da un de inhibicioacuten de la
parasitemia Y1gt50 X2 Concentracioacuten de compuesto que da un de
inhibicioacuten de la parasitemia Y2lt50
El porcentaje de incorporacioacuten de hipoxantina unida al paraacutesito se calcula con la siguiente ecuacioacuten
hipoxantina incorporada = 100 ndash (PTx100)
Siendo P cuentas por minuto (cpm) para cada concentracioacuten T control
negativo (eritrocitos sin tratar)
Ensayos bioloacutegicos
94
VIII2 Ensayos toxicoloacutegicos
Los ensayos de citotoxicidad de los compuestos se realizaron en dos etapas
Inicialmente se llevaron a cabo en la Universidad Cayetano Heredia (UPCH) en
Lima Peruacute y posteriormente en la Universidad Paul Sabatier (Toulouse III) en
Toulouse Francia
La toxicidad de todos los compuestos se evaluaron en ceacutelulas epiteliales de
rintildeoacuten de mono African (Vero) Estas ceacutelulas fueron cultivadas con medio
DMEN F-12 (Cat Nordm BE12-719F) suplementado con 10 de suero fetal bovino
inactivado por calor NEAA piruvato de Na y mantenidas en una incubadora a
37 ordmC con una atmoacutesfera de 5 de CO2 La evaluacioacuten toxicoloacutegica se realiza en
placas de 96 pocillos de fondo plano adicionando 100 microL de cultivo de ceacutelulas
Vero a cada pocillo a una concentracioacuten de 10x105 ceacutelulaspocillo Los
compuestos se antildeadieron a diferentes concentraciones 100 microgmL 10 microgmL 1
microgmL y 01 microgmL y el efecto se evaluacutea 48 horas despueacutes de haber adicionado
el compuesto
El efecto se determinoacute usando el ensayo de viabilidad celular del MTT que
consiste en adicionar 10 microL de MTT a una concentracioacuten de 10 microgmL en las
placas que son colocadas nuevamente en la incubadora cubiertas con papel
aluminio durante el periodo de incubacioacuten Cuatro horas despueacutes de finalizado
el periodo de incubacioacuten se antildeade 100 microL de una solucioacuten de lisis que contiene
50 de isopropanol 10 de SDS y se deja reposar las placas a temperatura
ambiente en un orbital a 150 rpm durante 30 minutos
Finalmente se lee la densidad oacuteptica con un escaacutener de 96 pocillos a 590 nm
en un equipo Bio-Rad Todos los experimentos se realizan por triplicado
El dato de inhibicioacuten de crecimiento GI50 se determina por anaacutelisis de
regresioacuten linear definido como la concentracioacuten de compuesto que produce el
50 de reduccioacuten de absorbancia comparaacutendola con los controles
VIII3 Ensayos in vivo
Los procedimientos se desarrollaron siguiendo el manual de Teacutecnicas de
laboratorio para la seleccioacuten de sustancias antimalaacutericas (Deharo et alts 2000)
en el Laboratorio de Farmacologiacutea para el Desarrollo perteneciente al Instituto
para el Desarrollo (IRD) de la Universidad Paul Sabatier (Toulouse III) de
Toulouse (Francia)
Ensayos bioloacutegicos
95
VIII31 Instrumental y reactivos
Los estudios in vivo se llevaron a cabo seguacuten la legislacioacuten francesa sobre
cuidado y uso de animales de laboratorio vigente (Ndeg 008430) Se utilizaron
ratones macho IOPF Swiss de 4-6 semanas de vida con un peso de 20 2 g con
certificado negativo para Encephalitozoom cuniculi (Janvier Saint Berthevin
Francia) El animalario-bioterio de la Facultad de Farmacia de la Universidad
Paul Sabatier se encargoacute del cuidado de animales mantenimiento condiciones
ambientales de las instalaciones y eliminacioacuten del material bioloacutegico
Las cepas usadas tanto para los ensayos de virulencia como para los estudios
provienen de la reserva de material bioloacutegico del IRD De ahiacute se descongelaron
una cepa Plasmodium berghei NK65 y otra Plasmodium petteri que se encontraban
bien identificadas dentro de tanques de nitroacutegeno liacutequido en caacutemaras
refrigeradas del IRD
Los materiales empleados en el manejo animal fueron agujas Neolus de 05
mm y jeringas de 1 mL U100 Insulin de Tarumo Europe NV (Beacutelgica) Ademaacutes
se usoacute heparina Sigma H6263 (Alemania) suero fisioloacutegico esteacuteril Baxter
(Francia) y viales de plaacutestico con tapoacuten no esteacuteriles Para los frotis se usaron
laacuteminas portaobjetos de vidrio (Tarumo Europe NV Belgica) y metanol de
calidad HPLC Fisher Chemicals (Leicestershine Reino Unido) Para la
coloracioacuten se usoacute el reactivo Giemsa en polvo con glicerol de Sigma Ultra
(Steinheim Alemania) disolucioacuten tampoacuten de fosfato soacutedico dibaacutesico
heptahidratado y fosfato potaacutesico monobaacutesico anhidro de Sigma Aldrich
(Steinheim Alemania) en agua miliQ
Para la lectura de los frotis y conteo de hematiacutees se ha usado un microscopio
Leica DME (USA)
VIII32 Metodologiacutea
VIII321 Preparacioacuten de disolucioacuten Giemsa
La Giemsa es un colorante neutro compuesto de un colorante aacutecido (azul de
eosinato) y otro baacutesico (azul de metileno) que precipita con agua Lo que se
obtiene es un colorante neutro que no es soluble al agua pero si al alcohol
metiacutelico De forma inversa no es activo en solucioacuten metiacutelica pero siacute en
disolucioacuten acuosa Las ceacutelulas protozoarias disocian el colorante neutro el ADN
se tintildee de rojo y el citoplasma de azul Por las caracteriacutesticas comentadas ha de
Ensayos bioloacutegicos
96
ser utilizado con un tampoacuten para evitar que el pH de los medios de trabajo lo
precipite o inactive y con agua destilada calidad miliQ
Se pesan 076 g de polvo de Giemsa en un erlenmeyer y se pone suavemente
en agitacioacuten con 50 mL de glicerina y se deja hasta completa disolucioacuten a 60 ordmC
Una vez disuelto se deja enfriar y se le antildeaden 50 mL de metanol dejando la
disolucioacuten en agitacioacuten 12 horas Transcurrido el tiempo se deja reposar
protegido de la luz 7 diacuteas para finalizar con una filtracioacuten eliminando asiacute los
restos no disueltos Mientras se prepara una disolucioacuten tampoacuten fosfato con 02 g
de fosfato potaacutesico monobaacutesico anhidro y 05 g de fosfato soacutedico dibaacutesico
heptahidratado en un litro de agua MiliQ ajustaacutendose el pH a 74
Estas dos disoluciones no se mezclaraacuten hasta el momento de ser utilizadas
manteniendo la de Giemsa protegida de la luz Para su utilizacioacuten en un tubo
coacutenico de 50 mL se colocan 45 mL de la disolucioacuten tampoacuten de tampoacuten fosfato
y 5 mL de Giemsa y se homogenizan cuidadosamente dos veces por inversioacuten
Se cubre la muestra con el preparado y lo sobrante se desecha
Las disoluciones preparadas de Giemsa tienen un tiempo de vida corto ya
que con el paso del tiempo van precipitando y formaacutendose cristales que dantildean
la tincioacuten Debido a esto se recomienda preparar perioacutedicamente un nuevo
stock de colorante y nunca mezclar dos tipos diferentes puesto que cada
preparado tiene caracteriacutesticas propias que afectan el resultado en la coloracioacuten
VIII322 Tincioacuten con Panoacuteptico Raacutepido
Esta es una teacutecnica de tincioacuten por inmersioacuten a diferencia de la tincioacuten por
Giemsa que es por cobertura La ventaja es que es maacutes raacutepida y faacutecil de trabajar
cuando no se cuenta con un gran nuacutemero de laacuteminas para colorear El meacutetodo
consiste en la inmersioacuten sucesiva de la laacutemina que tentildeir en tres colorantes
consecutivamente En una primera cubeta Wertheim se pone una solucioacuten
alcohoacutelica de triarilmetano en la segunda cubeta se pone una solucioacuten
tamponada de xanteno y en la tercera una tamponada de tiazina
Las laacuteminas con las muestras fijadas se sumergen verticalmente y en el mismo
sentido que se ha extendido la muestra en la primera cubeta realizando
movimientos regulares verticales durante unos segundos Se sacan de la cubeta
y se espera que escurran el colorante sobrante Este procedimiento se repite en
las tres cubetas teniendo especial cuidado en la uacuteltima donde se debe asegurar
la homogeneidad de la tincioacuten sin exceso de coloracioacuten Finalmente se lava con
agua se dejan secar al aire para ser analizadas al microscopio
Ensayos bioloacutegicos
97
VIII323 Realizacioacuten de un frotis
Se denomina frotis a la extensioacuten de una muestra o cultivo que se realiza
sobre un portaobjetos con objeto de separar lo maacutes posible los microorganismos
o componentes sanguiacuteneos y para obtener de ellos una imagen clara y niacutetida al
microscopio
La muestra ha de ser fijada al vidrio del portaobjetos sin que la muestra sea
arrastrada en los lavados para poder aplicar despueacutes sobre eacutel meacutetodos de
tincioacuten que permiten la observacioacuten al microscopio de las ceacutelulas En la
actualidad los portaobjetos utilizados se comercializan limpios y esterilizados
para su uso inmediato
En primer lugar se toma un portaobjetos nuevo y se rotula adecuadamente
Con unas tijeras esterilizadas se hace un pequentildeo corte en la punta de la cola
del ratoacuten y se presiona para conseguir una gota de sangre que es recogida en el
centro de un extremo del portaobjetos Raacutepidamente con el filo de otro
portaobjetos se extiende la gota arrastraacutendola suavemente por la superficie del
primer portaobjetos para conseguir una peliacutecula lo maacutes homogeacutenea posible
tratando de cubrir toda la superficie de la laacutemina Posteriormente se pone el
portaobjetos horizontal y se cubre con metanol se deja secar con cuidado al aire
y se guarda la muestra hasta la tincioacuten el tiempo que sea necesario
Asiacute tentildeida la muestra se puede proceder a su lectura para calcular el
porcentaje de parasitemia ( parasitemia paraacutemetro que indica el nivel de
infeccioacuten de la sangre de un ratoacuten) mediante el conteo manual de los hematiacutees
sanos y los parasitados Se hace un conteo de veinte campos elegidos de forma
que los hematiacutees no se solapen y aproximadamente contengan la misma
cantidad de unidades El tanto por ciento de parasitemia se calcula aplicando la
siguiente foacutermula
Siendo H infectados hematiacutees infectados H sanos hematiacutees sanos
Ensayos bioloacutegicos
98
iquestQueacute se puede ver en un frotis al microscopio
En un frotis de ratoacuten sano se pueden ver
Trozos de cristales de colorante si el vidrio no ha sido lavado lo
suficiente
Hematiacutees o gloacutebulos rojos o eritrocitos
Leucocitos o gloacutebulos blancos Estos se colorean con la tincioacuten
porque tiene carga geneacutetica y los hematiacutees no En ocasiones puede
confundirse un hematiacutee joven y un leucocito porque los hematiacutees
joacutevenes conservan restos de nuacutecleo pero se diferencian en nuacutemero
y tamantildeo Los leucocitos son menos numerosos y de mayor
tamantildeo ademaacutes en la tincioacuten quedan anteriormente tentildeidos de
morado con una aureola azul
En un ratoacuten infectado se puede observar
Hematiacutees sanos
Hematiacutee joven
Esquizonte joven que puede confundirse con un hematiacutee joven
Esquizonte desarrollado
Esquizonte agotado Es el momento previo a la ruptura del
espacio y la liberacioacuten de trofozoiacutetos libres que continuaran con la
infeccioacuten
Trofozoiacutetos libres que pueden confundirse con plaquetas
Hematiacutees en invasioacuten
Figura 49 Vista al microscopio de un frotis de sangre infectada por Plasmodium32
32 Disponible en httpwwwelrincondelamedicinainternacom2011_05_16_archivehtml
Ensayos bioloacutegicos
99
VIII324 Preparacioacuten y lectura en la caacutemara Malassez
La caacutemara se usa para hacer el conteo de hematiacutees totales Se cubre la
cuadriacutecula de la caacutemara con la muestra de sangre heparinizada con la ayuda de
una micropipeta y por capilaridad se llena la cuadriacutecula de conteo Como la
disolucioacuten tiene caraacutecter tridimensional y en el microscopio las lecturas son
bidimensionales se pone la ceacutelula en una caacutemara huacutemeda durante diez minutos
para que la muestra sedimente y no se deshidrate durante el proceso Pasado el
tiempo se pone la caacutemara de Malassez al microscopio y con cuarenta aumentos
y se hace el recuento manual de hematiacutees por mm3 de sangre Con el valor
promedio y teniendo en cuenta la dilucioacuten y el volumen de la caacutemara es posible
calcular la densidad de gloacutebulos rojos (GR) en la sangre de un ratoacuten sano
mediante la siguiente ecuacioacuten
GRmm3= GR promedio x dilucioacuten muestra x volumen celda
Siendo GR promedio promedio de hematiacutees dilucioacuten muestra valor fijo de
200 (10 microL en 2 mL) volumen volumen de la celda valor fijo 100 mm3
EL valor medio de hematiacutees de un ratoacuten sano es 5 millones de hematiacutees por
mm3
Una caracteriacutestica de la enfermedad es la anemia asiacute un ratoacuten infectado que
ha desarrollado la enfermedad presenta una disminucioacuten aproximada de un 75
en el nuacutemero de hematiacutees con respecto al ratoacuten sano por conteo en caacutemara
Malassez
VIII325 Ensayos de virulencia
Para este estudio es necesario tener al paraacutesito y al hueacutesped En este caso se
utilizaraacuten dos especies diferentes de paraacutesito que producen la enfermedad de la
malaria como son Plasmodium berghei NK65 y Plasmodium vinckei petteri
provenientes de la reserva del IRD Estas dos especies son capaces de infectar
roedores por lo que el hueacutesped seraacute un grupo de veinte ratones machos IOPF
Swiss
Descongelacioacuten de cepas y activacioacuten de paraacutesitos
Cuando se descongela una cepa no tiene mucha capacidad de infeccioacuten
(virulencia) sino que esta va en aumento con el paso de los diacuteas Por otro lado
es probable que los ratones inoculados no lleguen a desarrollar la enfermedad
porque la muestra haya sido mal conservada o se haya degradado demasiado
Ensayos bioloacutegicos
100
en el friacuteo que es lo que ocurrioacute experimentalmente con la cepa de P vinckei
petteri En este caso se esperan 10 diacuteas despueacutes de la inoculacioacuten y se
monitoriza al ratoacuten para observar si hay progresioacuten de la infeccioacuten de no ser
asiacute debe realizarse una revisioacuten de los tanques de almacenamiento para
descartar las muestras anteriores a la fecha de congelacioacuten de la muestras que
presentaron problemas ya que pueden estar en igual o en peores condiciones
El estudio comienza con la descongelacioacuten de una cepa de Plasmodium berghei
NK65 a temperatura ambiente mientras se extraen 10-20 microL (45 gotas) de sangre
de cola de ratoacuten sano Este volumen se mezcla inmediatamente con una gota de
heparina con el fin de evitar la coagulacioacuten de la sangre extraiacuteda La sangre
heparinizada se diluye 1200 en un vial esteacuteril con tapoacuten con 4 mL de suero
fisioloacutegico para devolver las ceacutelulas sanguiacuteneas a un medio parecido al normal
y que no se produzcan procesos de oacutesmosis que destruyan la muestra Cerrar el
vial y guardar la muestra
Cuando este descongelado el vial con la cepa se toma con una jeringa el
volumen contenido en el vial y se divide en dos para ser inyectado viacutea
intraperitoneal en dos ratones separados previamente del grupo Estos ratones
se separan del grupo en una celda identificada con la fecha de infeccioacuten la cepa
y la especie que contiene para observar la progresioacuten de la infeccioacuten La sangre
heparinizada se usa para un primer conteo del nuacutemero de hematiacutees en
ejemplares sanos cuyo recuento se realiza con cuadriacutecula doble en la ceacutelula o
caacutemara de Malassez A los tres diacuteas de la inoculacioacuten se hace un control del
estado de los dos ratones infectados tanto visual como sanguiacuteneo Los siacutentomas
externos de la enfermedad son peacuterdida de coloracioacuten en los ojos y orejas pelo
erizado ademaacutes de peacuterdida de peso y aglomeracioacuten entre ellos por causa de la
fiebre Tambieacuten se realiza un frotis para calcular la parasitemia
Cuando los ratones infectados desarrollen la enfermedad se infecta con su
sangre a otros dos ratones sanos de forma que ademaacutes de conocer coacutemo se
desarrolla el paraacutesito se garantice que tendraacuten la fuerza suficiente para
comenzar los ensayos de actividad De esta forma no es necesario conocer la
parasitemia basta con saber que la cepa estaacute viva Asiacute se realiza un frotis
control positivo con sangre de la cola del ratoacuten y del mismo sitio se obtendraacuten
20 microL de sangre que se hepariniza y disuelve en 1 mL de suero Se puede
conocer el buen estado de esta disolucioacuten visualmente si se observa un color
rojo muy claro ya que indica que no se ha producido hemoacutelisis Este nuevo
grupo de ratones infectados son los ratones fuente
Ensayos bioloacutegicos
101
El volumen de la disolucioacuten anterior se pone en una jeringa para ser
inyectado en dos ratones sanos que tambieacuten se aiacuteslan para controlar coacutemo
evoluciona la infeccioacuten
Diariamente se realiza un frotis control a los diferentes grupos de ratones
infectados para registrar la evolucioacuten de la parasitemia ya que algunos
evolucionaraacuten muy raacutepido y moriraacuten mientras que otros no mostraraacuten la
enfermedad
Ensayos de virulencia
El quinto diacutea desde la inoculacioacuten del paraacutesito vivo en los ratones fuente se
procede a calcular la parasitemia En este momento se infecta a un nuevo grupo
de 5 ratones En esta ocasioacuten la infeccioacuten seraacute controlada y se procederaacute a una
infeccioacuten con un nuacutemero de paraacutesitos determinado Para estos ensayos
normalmente se inoculan 107 paraacutesitos por ratoacuten por tal motivo es necesario
conocer previamente el nuacutemero de paraacutesitos en la sangre del ratoacuten fuente
sabiendo esto se puede calcular la cantidad de paraacutesitos necesarios para
inocular a todos los grupos de ratones experimentales seguacuten la siguiente
ecuacioacuten
Para preparar las cantidades necesarias de sangre infectada heparina y suero
fisioloacutegico necesarias para desarrollar el ensayo de virulencia se deben tener en
cuenta los cinco ratones disponibles a los que se antildeade un sexto ratoacuten hipoteacutetico
con el que se tienen en cuenta las peacuterdidas de disoluciones durante los
procedimientos experimentales Seraacuten necesarios 10 microL de sangre del ratoacuten
fuente para inyectar a cada ratoacuten del ensayo El procedimiento de extraccioacuten de
sangre e infeccioacuten del grupo es el mismo
Durante todo este proceso es preciso llevar un seguimiento diario de la
parasitemia para observar el grado de virulencia del paraacutesito Los resultados
del comportamiento del paraacutesito son aproximados debido al aumento de la
parasitemia en los sucesivos ensayos
Por queacute un seguimiento previo del desarrollo de la infeccioacuten
El desarrollo de los paraacutesitos en individuos infectados no se produce siempre
de igual forma por lo que si se parte de cepas congeladas es necesaria una
primera activacioacuten del paraacutesito (primera infeccioacuten) y una posterior reactivacioacuten
del paraacutesito (infecciones sucesivas) a partir de la primera infeccioacuten
Ensayos bioloacutegicos
102
Las diferencias de desarrollo se deben a tres factores principalmente
1- Viacutea intraperitoneal Es una viacutea menos precisa que la viacutea intravenosa
porque no hay una localizacioacuten exacta de la inyeccioacuten de la sangre
infectada Todos los ratones tienen la misma capacidad de respuesta pero
no se puede controlar la respuesta del ratoacuten por esta viacutea de inoculacioacuten
Por viacutea intravenosa se asegurariacutea su introduccioacuten en el hiacutegado pero por
las por las caracteriacutesticas aproximativas de los ensayos y queda
descartada
2- Raza Swiss Este tipo de ratoacuten no es monoclonal por tanto todos los
individuos son diferentes entre siacute De ahiacute se deduce que la respuesta seraacute
distinta en cada uno de ellos El objetivo de los ensayos realizados es
encontrar un nuevo compuesto que revierta cualquier tipo de
parasitemia como hace la CQ de manera que la variabilidad del sistema
no sea influyente
3- Enzephalitozoom Cuniculli Es un paraacutesito de roedor que puede interferir
cruzadamente con el Plasmodium lo que hace que los ensayos no sean
fiables En la actualidad este factor no se tiene en cuenta ya que todos los
lotes de ratones adquiridos traen consigo el certificado de anaacutelisis de la
empresa que los suministra
Una vez conocido coacutemo se desarrolla el paraacutesito de la cepa elegida se
comienza con la infeccioacuten de otro grupo de ratones Esta infeccioacuten se realiza con
el objetivo de tener ratones fuente disponibles el diacutea que se ha de comenzar el
ensayo Del mismo modo la sangre de los ratones infectados es usada para la
congelacioacuten de nuevas cepas
VIII326 Ensayos de actividad Test de Peters
El test claacutesico de supresioacuten de 4 diacuteas (Peters y Robinson 1999) da comienzo
una vez que se conoce coacutemo se va a desarrollar previsiblemente la cepa elegida
En este ensayo dicha cepa es Plasmodium berghei NK65 inoculada en 100 ratones
macho tipo Swiss con un peso de 20 2 g Se distribuyen en 10 grupos de 10
individuos identificados de la siguiente manera
-Grupo Negativo 10 ratones que seraacuten tratados con el medio de dilucioacuten de
los compuestos que ensayar En esta ocasioacuten el medio de dilucioacuten es DMSO
utilizado a una dosis maacutexima de 100 microL por ratoacuten y diacutea
Ensayos bioloacutegicos
103
-Grupo Positivo 10 ratones que seraacuten tratados con 40 microg de CQ en 100 microL
DMSO (2 mg por kg)
-Grupos de A1 al A4 Cuatro grupos de 10 ratones que seraacuten tratados con uno
de los compuestos que ensayar a dosis de 40 20 10 y 5 mgkg respectivamente
-Grupos del B1 al B4 Cuatro grupos de 10 ratones que seraacuten tratados con el
otro compuesto que ensayar a dosis 40 20 10 y 5 mgkg respectivamente
El ensayo parte de la determinacioacuten de la parasitemia y de un conteo de
hematiacutees por ceacutelula Malassez de ratones fuente para conocer queacute cantidad de
sangre se necesita para realizar una infeccioacuten controlada y simultaacutenea de los
cien ratones con ceacutelulas parasitadas con 107 ceacutelulas parasitadasratoacuten en una
solucioacuten salina al 09 por viacutea intraperitoneal
La extraccioacuten se realiza por puncioacuten seno retro-orbital ya que el volumen de
sangre que se necesita es superior al que se puede obtener por puncioacuten de la
vena de la cola La muestra se trata de la misma forma que lo explicado
anteriormente y se procede a la infeccioacuten de la totalidad de los individuos
Trascurridas dos horas se comienza con la administracioacuten del tratamiento
especiacutefico de cada grupo en lo que se denomina Diacutea 0 En dicho momento se
realiza la administracioacuten del tratamiento todos los diacuteas siguientes a la misma
hora y con el mismo procedimiento El tratamiento se aplica viacutea subcutaacutenea en
la parte interna de las patas traseras Con esto evitamos que se produzca
toxicidad o necropsia de alguacuten oacutergano del peritoneo Tambieacuten se alterna la pata
donde se inyecta el tratamiento para asegurarse de que no se produzca una
necrosis por toxicidad debida a la acumulacioacuten del producto por una mala
difusioacuten Si un producto no es toacutexico podriacutea acumularse pero no necrosar y
esto tambieacuten podriacutea observarse como un bulto debajo de la piel
Durante el transcurso del test se ha de llevar a cabo un seguimiento visual de
la posible respuesta externa de los ratones a la administracioacuten de los
compuestos anotando cambios en el comportamiento de los ratones
irritaciones deacutermicas en diferentes zonas prestando especial atencioacuten a la zona
donde se produce la inyeccioacuten del tratamiento falta de movilidad y cambios
morfoloacutegicos como disminucioacuten de la temperatura peacuterdida de peso o pelo
cambios en la pigmentacioacuten de la piel
Pasados cinco diacuteas o Diacutea 4 se realiza un frotis a todos los ratones
supervivientes para calcular la parasitemia en sangre perifeacuterica Se comprueba
la inhibicioacuten de la parasitemia para calcular la dosis letal (DL50) determinada
Ensayos bioloacutegicos
104
por anaacutelisis de regresioacuten lineal de miacutenimos cuadrados Una vez pasado el
tiempo del Test de Peters los ratones supervivientes seguiraacuten siendo
observados en los siguientes diacuteas lo que se denomina Test Rane Esto sirve para
la determinacioacuten de la actividad esquizonticida en vivo comparando de la
mortalidad de los ratones del grupo negativo con el resto de grupos
Durante la realizacioacuten de los ensayos los ratones que mueren son desechados
seguacuten los protocolos normalizados del animalario (bioterio) en el que se
realizan todos los procedimientos experimentales
IIXX EESSTTUUDDIIOOSS CCOOMMPPUUTTAACCIIOONNAALLEESS
Estudios Computacionales
107
IX1 Propiedades fisicoquiacutemicas de los compuestos
Para los caacutelculos de las propiedades fisicoquiacutemicas de los compuestos se
utilizoacute el Laboratorio de Quiacutemica Computacional Virtual33 (Tetko et alts 2005)
y la herramienta de caacutelculo de propiedades online Molinspiration34 (Ertl et alts
2000)
Los datos obtenidos fueron utilizados para establecer una aproximacioacuten
teoacuterica del comportamiento de los compuestos en tratamientos orales Los
estudios se centraron en la obtencioacuten de las caracteriacutesticas de absorcioacuten de cada
compuesto que depende de otros factores como liposolubilidad fuerzas polares
moleculares y caracteriacutesticas propias de la estructura molecular
El coeficiente de particioacuten octanolagua estaacute asociado a la solubilidad y se
calculoacute desde MLog P miLogP AlogP KOWLogP y ABlogP Las
caracteriacutesticas estructurales de la moleacutecula como tamantildeo y posibilidad de giro
de enlaces tambieacuten influyen en la absorcioacuten Las caracteriacutesticas polares son
importantes para la absorcioacuten porque intervienen en la lipofilia de los
compuestos asiacute se desprende del estudio de los enlaces aceptores y receptores
de enlaces polares y del TPSA Se puede obtener asiacute una aproximacioacuten al
porcentaje de absorcioacuten (Zhao et alts 2002) de los compuestos en la membranas
celulares
Los compuestos que a su vez cumplen las Reglas de Lipinski (Lipinski et alts
1997) son buenos candidatos para ofrecer buenas cualidades en la
administracioacuten oral
IX2 Optimizacioacuten geomeacutetrica
Los estudios computacionales de Modelizacioacuten y Docking35 se llevaron a
cabo para compuestos liacutederes en los Laboratorios de Investigacioacuten y Desarrollo
de la Facultad de Ciencias y Filosofiacutea de la Universidad Peruana Cayetano
Heredia (UPCH) Lima (Peruacute)
33 httpwwwvcclaborg 34 httpwwwmolinspirationcomservicespropertieshtml 35 Docking (del ingleacutes anclarse) En el campo del Modelado molecular este es un meacutetodo que predice la conformacioacuten preferida de un moleacutecula al estar unida a otra con el fin de formar un complejo estable1 El conocimiento de la orientacioacuten preferida a su vez puede ser usada para predecir la fuerza de la asociacioacuten o la afinidad de enlace entre dos moleacuteculas usando por ejemplo las funciones de puntuacioacuten (o funciones de scoring)
Estudios Computacionales
108
El compuesto maacutes activo se sometioacute a estudios de modelizacioacuten para
optimizar la geometriacutea y determinar los potenciales electrostaacuteticos de la
moleacutecula Para esto se usoacute el caacutelculo mecaacutenico Quantum en concreto el
programa Gaussian36 de quiacutemica cuaacutentica y el set baacutesico HF3-21G El Potencial
molecular electrostaacutetico (MEP) fue computerizado por la densidad electroacutenica
y fue calculado a partir de datos del software Molekel37 (Fluumlckigel et alts 2008)
IX3 Estudios de Acoplamiento Molecular (Docking)
El programa ICM38 de modelizacioacuten se usoacute para determinar el potencial
modo de unioacuten entre los compuestos maacutes activos y la enzima diana
previamente estudiada en estudios anteriores la plasmepsina II del Plasmodium
Ensayos anteriores mostraban la cristalizacioacuten de la enzima plasmepsina II con
un compuesto denominado EH58 (N-(3-[(2-benzo[13]dioxol-5-yl-ethyl)[3-(1-
methyl-3-oxo-13-dihydro-isoindol-2-yl)-propionyl]-amino]-1-benzyl-2-
(hydroxypropyl)-4-benzyloxy-35-dimethoxy-benzamide Figura 50) (Asojo et
alts 2003)
Figura 50 Imagen de la interaccioacuten del compuesto EH-58 y la plasmepsina II39
Seguacuten datos publicados posteriormente se demostroacute que la enzima presenta
un hueco activo donde pueden introducirse diferentes moleacuteculas y establecer
interacciones que inhiben su actividad En el caso de los derivados estudiados
se planteoacute la posible unioacuten de estos al resto polar del aminoaacutecido aspartato
(ASP) de las posiciones 214 y 34 de sitio activo de la enzima (Bjelic et alts
36 Gaussian Inc Pittsburg PA 2003 37 httpwwwcscschmolekel 38 versioacuten3 4-8 La Jolla CA Molsoft LLC 2006 39 Disponible en Asojo et alts 2003
Estudios Computacionales
109
2007) En primer lugar para validar la metodologiacutea y comprobar la capacidad
del programa ICM para estudiar los modos de enlace de los inhibidores en el
sitio de unioacuten de la enzima el complejo EH50-plasmepsina II40 fue reacoplado
mediante caacutelculos computacionales De acuerdo con la bibliografiacutea (Cunico et
alts 2009a b y Mendoza et alts 2011) en los estudios de acoplamiento se
considera como vaacutelidos los valores de desviacioacuten de la media cuadraacutetica
(RMSD) entre 30 a 40 Aring
Las estructuras se prepararon siguiendo la metodologiacutea ICM (Abagyan et
alts 1994) y se dibujaron con el editor molecular del software41 Asiacute las
estructuras de los compuestos y la proteiacutena fueron convertidas a objetos ICM
Durante este proceso de conversioacuten de la proteiacutena se antildeadieron hidroacutegenos
para proceder despueacutes con una optimizacioacuten geomeacutetrica Ademaacutes las
representaciones en dos dimensiones fueron convertidas a tres dimensiones
asignando cargas parciales y asignando enlaces rotatorios
De acuerdo con estudios previos (Mendoza et al 2011 y Cunico et al 2009b)
los aminoaacutecidos que conforman el sitio activo son la ASP 34 y la ASP 214
El programa buscador de cavidades del sistema ICM42 se usoacute para identificar
el sitio activo con un valor de tolerancia de 46 Aring La posicioacuten y orientacioacuten
inicial del ligando y el tamantildeo y posicioacuten del hueco fueron escogidos de
acuerdo con los valores sugeridos por el sistema
Los modos de unioacuten calculados con al menos un enlace por puentes de
hidroacutegeno con alguno de los aspartatos que conforman el sitio cataliacutetico se
consideraron como los maacutes representativos y tomados en cuenta para su
anaacutelisis (Kasam et alts 2007 y Aringqvist et alts 1994) El acoplamiento planteado
para cada ligando fue analizado estudiaacutendose su energiacutea total relativa La
conformacioacuten maacutes favorable energeacuteticamente se seleccionoacute como mejor
posicioacuten espacial
40 Protein Data Bank PDB code 1LF3 wwwrcsborg 41 Molecular Editor versioacuten 25 La jolla CA Molsoft LLC 2006 42 ICM Pocket Finder An et alts 2005
RESULTADOS Y
DISCUSIOacuteN
XX DDEESSCCRRIIPPCCIIOacuteOacuteNN DDEE CCOOMMPPUUEESSTTOOSS
Descripcioacuten de Compuestos
115
X1 Siacutentesis de precursores
(Benzo[b]tiofen-3-il)-3-cloropropan-1-ona
Procedimiento experimental
Sobre 205 g de AlCl3 (015 mmol) disueltos en 150 mL de diclorometano seco y
en atmoacutesfera de N2 se antildeade gota a gota una disolucioacuten de 1878 g de
benzo[b]tiofeno (140 mmol) y 159 mL de cloruro de 3-cloropropionilo (140
mmol) disueltos en 50 mL de diclorometano seco A continuacioacuten se antildeaden
tambieacuten gota a gota 95 mL de aacutecido sulfuacuterico en 150 mL de agua Se realiza
extracciones con diclorometano La fase orgaacutenica se seca con trazas de sulfato
soacutedico anhidro y se elimina el disolvente a presioacuten reducida Se obtiene un
aceite que se purifica por cromatografiacutea en columna empleando una mezcla de
hexanoacetato de etilo como fase moacutevil en gradiente hasta (955) El producto
se precipita con hexano friacuteo
Punto de fusioacuten 55-57ordmC
IR (cm-1) 1655 (mf CO)
RMN-1H (CDCl3 400 MHz) δ (ppm) 343 (m 2H CH2-CO) 386 (c 2H CH2-
Cl) 732-748 (m 2H H5 + H6) 780 (d 1H H4 J45= 76 Hz) 824 (s 1H H2 ) 847
(d 1H H7 J76= 73 Hz)
Anaacutelisis elemental (CHN)
Calculado Hallado
C 5879 5845
H 400 396
N 000 000
FM C11H9 ClOS PM 2245 APARIENCIA Soacutelido blanco RENDIMIENTO 86
Descripcioacuten de Compuestos
116
Tert-butil 4-(4-nitro-2-trifluorometilfenil)piperazin-1-carboxilato
Procedimiento experimental
Seguacuten el meacutetodo A a partir de 2 g de 2-fluacuteor-5-nitro-1-(trifluorometil)benceno
(956 mmol) y 25 g de tert-butil piperacin-1-carboxilato (1342 mmol) se obtiene
un residuo que se lava con hexano y se usa en la reaccioacuten siguiente sin maacutes
purificaciones
Punto de fusioacuten 136ndash138 ordmC
IR (cm-1) 2982-2751 (m C-H alifaacuteticos) 1685 (mf CO) 1530 y 1350 (m NO2)
1280 y 1155 (mf CF3)
RMN-1H (CDCl3 400 MHz) δ (ppm) 150 (s 9H C(CH3)3) 308 (dd 4H H3+H5
PIPZ) 362 (dd 4H H2+H6 PIPZ) 732 (d 1H H6 FENIL J65= 90 Hz) 837 (dd
1H H5 FENIL J56= 90 Hz J53= 28 Hz) 855 (d 1H H3 FENIL J35= 27 Hz)
(4-nitro-2-trifluorometilfenil)piperazina
Procedimiento experimental
Seguacuten el meacutetodo B usando amina protegida se obtiene un aceite que precipita
con hexano en friacuteo obtenieacutendose un polvo amarillo intenso
Punto de fusioacuten 97-99ordmC
IR (cm-1) 3380 (f NH) 2982-2751 (m C-H alifaacuteticos) 1685 (mf CO) 1530 y 1350
(m NO2) 1280 y 1155 (mf CF3)
RMN-1H (CDCl3 400 MHz) δ (ppm) 212 (s 1H NH) 306-308 (m 4H H2+H6
PIPZ) 313-315 (m 4H H3+H5 PIPZ) 730 (d 1H H6 FENIL J65= 90 Hz) 835
(dd 1H H5 FENIL J56= 90 Hz J53= 26 Hz) 853 (d 1H H3 FENIL J35= 26 Hz)
FM C16H20N3F3O4
PM 3751 Apariencia Soacutelido amarillo Rendimiento 75
FM C11H12N3F3O2
PM 2751 Apariencia Soacutelido amarillo Rendimiento 75
Descripcioacuten de Compuestos
117
Tert-butil 4-(4-nitro-2-trifluorometilfenil)-14-diazepan-1-carboxilato
Procedimiento experimental
Seguacuten el meacutetodo A a partir de 2 g de tert-butil 14-diazepan-1-carboxilato (999
mmol) y 108 g de 1-fluacuteor-2-nitro-4-(trifluorometil)benceno (516 mmol) se
obtiene un residuo que se lava con eacuteter etiacutelico y se usa en la reaccioacuten siguiente
sin maacutes purificacioacuten
Punto de fusioacuten 197ndash198 ordmC
IR (cm-1) 2982-2751 (m C-H alifaacuteticos) 1694 (mf CO) 1524 y 1346 (m NO2)
1283 y 1154 (mf CF3)
RMN-1H (DMSO-d6 400 MHz) δ (ppm) 208-211 (q 2H H6 DZP) 324 (sa
2H H2 DZP) 330 (sa 2H H7 DZP) 344 (t 2H H5 DZP) 363 (t 2H H3 DZP)
756 (d 1H H6 FENIL J65= 99Hz) 839-845 (m 2H H3+H5 FENIL)
(4-nitro-2-trifluorometil)fenil)-14-diazepan
Procedimiento experimental
Seguacuten el meacutetodo B usando amina protegida se obtiene un aceite que precipita
con eacuteter etiacutelico en friacuteo
Punto de fusioacuten 121ndash123 ordmC
IR (cm-1) 3352 (m NH) 2938-2850 (m C-H alifaacuteticos) 1581 y 1331 (mf CF3)
RMN-1H (CDCl3 400 MHz) δ (ppm) 174 (sa 1H NH) 192-197 (m 2H H6
DZP) 303-309 (m 4H H3+H5 DZP) 350-357 (m 4H H2+H7 DZP) 721 (d 1H
H6 FENIL J65= 93 Hz) 825 (dd 1H H5 FENIL J56= 92 Hz J53= 28 Hz) 853
(d 1H H3 FENIL J35= 28 Hz)
FM C17H22N3F3O4
PM 3893 Apariencia Soacutelido amarillo Rendimiento 77
FM C12H14N3F3O2
PM 2893 Apariencia Soacutelido amarillo Rendimiento 75
Descripcioacuten de Compuestos
118
Tert-butil 1-(4-nitro-2-trifluorometilfenil)-(S)-pirrolodin-3-ilcarbamato
Procedimiento experimental
Seguacuten el meacutetodo A a partir de 127 g (686 mmol) de tert-butil-(S)-pirrolidin-3-ilcarbamato y
072 g (343 mmol) de 2-fluor-5-nitro-1-(trifluorometil) benceno El residuo obtenido se precipita
y se lava con hexano
Punto de fusioacuten 115 ndash 117 ordmC
IR (cm-1) 3349 (f NH) 2981-2880 (d C-H alifaacuteticos) 1680 (mf CO) 1507 y 1326 (m NO2) 1273 y
1120 (f CF3)
RMN-1H (CDCl3 400 MHz) δ (ppm) 148 (s 9H C(CH3)3) 199-207 (m 1H H4ec PIRR) 226-
235 (m 1H H4ax PIRR) 342(c 1H H2ec PIRR) 359-365 (m 1H H5ax PIRR) 368-374 (m 1H
H5ec PIRR) 384 (c 1H H2ax PIRR) 438 (sa 1H NH) 470 (sa 2H H3 PIRR) 683 (d 1H H6
FENIL J65 = 95 Hz) 820 (dd 1H H5 FENIL J56 = 94 Hz J53 = 27Hz) 856 (d 1H H3 FENIL
J35= 27 Hz)
1-(4-nitro-2-trifluorometilfenil)-(S)-pirrolidin-3-il amina
Procedimiento experimental
Seguacuten el meacutetodo B usando la amina protegida se obtiene un aceite que precipita
con hexano en friacuteo Se identifica y se usa sin maacutes purificaciones en la siguiente
reaccioacuten
Punto de fusioacuten 64ndash66 ordmC
IR (cm-1) 3359 (d NH) 2943-2851 (d C-H alifaacuteticos) 1505 y 1317 (mf NO2) 1105 (mf CF3)
RMN-1H (CDCl3 400 MHz) δ (ppm) 149 (sa 2H NH2) 183-191 (m 1H H4ec
PIRR) 219-226 (m 1H H4ax PIRR) 327-330 (m 1H H2ec PIRR) 358-363 (m
1H H5ax PIRR) 375-381 (m 4H H2ax+H3+H5ec PIRR) 683 (d 1H H6 FENIL
J65= 95 Hz) 819 (dd 1H H5 FENIL J56= 95 Hz J53= 27 Hz) 856 (d 1H H3
FENIL J35= 27 Hz)
FM C16H20N3F3O4
PM 37521 Apariencia Soacutelido amarillo Rendimiento 71
FM C11H12N3F3O2
PM 2751 Apariencia Soacutelido marroacuten claro Rendimiento 83
Descripcioacuten de Compuestos
119
Tert-butil 1-(4-nitro-2-trifluorometilfenil)piperidin-4-ilcarbamato
Procedimiento experimental
Seguacuten el meacutetodo A a partir de 241 g de tert-butil piperidin-4-ilcarbamato (1203 mmol) y 214 g
de 1-fluacuteor-4-nitro-2-(trifluorometil)benceno (1023 mmol) El residuo obtenido se lava con
hexano
Punto de fusioacuten 120ndash122 ordmC
IR (cm-1) 3431 (m NH) 2979-2798 (m C-H alifaacuteticos) 1707 (mf CO) 1500 y 1341 (mf NO2)
1118 (f CF3)
RMN-1H (CDCl3 400 MHz) δ (ppm) 147 (s 9H C(CH3)3) 162 (dd 2H H3ax+H5ax PIPR J3ax3ec
= J5ax5ec = 113 Hz J3ax2ax = J5ax6ax = 35 Hz) 209 (d 2H H3ec+H5ec PIPR J3ec3ax = J5aec5ax = 121 Hz)
296 (td 2H H2ax+H6ax PIPR J2ax2ec = J6ax6ec = J2ax3ax = J6ax5ax = 125 Hz J2ax3ec = J6ax5ec = 19 Hz) 335
(d 2H H2ec+H6ec PIPR J2ec2ax = J6ex6ac =125 Hz) 366 (sa 1H H4 PIPR) 456 (sa 1H HN) 728 (d
1H H6 PIPR J65= 90 Hz) 832 (dd 1H H5 FENIL J56= 90 Hz J53 = 27 Hz) 851 (d 1H H3
FENIL J35 = 27 Hz)
1-(4-nitro-2-trifluorometilfenil)piperidin-4-il amina
Procedimiento experimental
Seguacuten el meacutetodo B usando la amina protegida se obtiene un aceite que precipita con
hexano en friacuteo Se identifica y se usa sin maacutes purificaciones en la siguiente reaccioacuten
Punto de fusioacuten 24-25 ordmC
IR (cm-1) 2938-2847 (m C-H alifaacuteticos) 1499 y 1334 (mf NO2) 1119 (mf CF3)
RMN-1H (CDCl3 400 MHz) δ (ppm) 152 (sa 1H NH2) 151-162 (m 2H H3ax+H5ax
PIPR) 195 (d 2H H3ec+H5ec PIPR J3ax3ec = J5ax5ec = 126 Hz) 287-296 (m 3H
H2ax+H6ax+H4 PIPR) 339 (d 2H H2ec+H6ec PIPR J2ec2ax = J6ec6ax = 127 Hz) 725 (d 1H
H6 FENIL J65= 91 Hz) 830 (dd 2H H5 FENIL J56= 90 Hz J53= 25 Hz) 851 (d 1H H3
FENIL J35= 26 Hz)
FM C17H22N3F3O4
PM 3892 Apariencia Soacutelido amarillo Rendimiento 93
FM C12H14N3O2F3
PM 2891 Apariencia Soacutelido amarillo Rendimiento 88
Descripcioacuten de Compuestos
120
X2 Siacutentesis de derivados carboniacutelicos (Serie 0)
1-(benzo[b]tiofen-3-il)-3-[4-(4-nitro-2-trifluorometilfenil)piperazin-1-
il]propan-1-ona
Procedimiento experimental
Seguacuten el meacutetodo general C a partir de 104 g (378 mmol) de (4-nitro-2-
trifluorometilfenil)piperazina y 085 g (370 mmol) de 1-(benzo[b]tiofen-3-il)-3-
cloropropan-1-ona Se elimina el disolvente a presioacuten reducida y se precipita el
soacutelido con hexanoeacuteter en friacuteo El soacutelido obtenido se purifica en columna
cromatograacutefica usando como fase moacutevil diclorometanometanol (991) Se
elimina el disolvente de las fracciones adecuadas a presioacuten reducida
obtenieacutendose el compuesto de forma soacutelida
Punto de fusioacuten 153-154ordmC
IR (cm-1) 2952-2815 (m C-H alifaacuteticos) 1673 (mf CO) 1457 y 1332 (mf NO2)
1281 y 1131 (m CF3)
RMN-1H (CDCl3 400 MHz) δ (ppm) 276-277 (m 4H H3+H5 PIPZ) 298-312
(m 2H CO-CH2-CH2) 319-321 (t 4H H2+H6 PIPZ) 327-330 (m 2H CO-CH2-
CH2) 729 (dd 1H H5rsquo FENIL J5acute6acute= 94 Hz J5acute3acute= 25 Hz) 746 (t 1H H6 BZT
J65= 80 Hz) 752 (t 1H H5 BZT J56= J54= 81 Hz) 790 (d 1H H4 BZT J45= 80
Hz) 833-836 (m 2H H6rsquo FENIL+ H7 BZT) 853 (s 1H H2 BZT) 878 (d 1H H3rsquo
FENIL J3acute5acute= 26 Hz)
Anaacutelisis elemental (CHN)
HPLC (RP-18 1 mLmin metanol-agua (8020)) tr 713 min ʎmax 2196 nm
Calculado Hallado
C 5720 5677
H 432 457
N 916 908
FM C22H20N3F3O3S PM 4635 Apariencia Soacutelido amarillo
Rendimiento 13
01
Descripcioacuten de Compuestos
121
Hidrocloruro de 1-(benzo[b]tiofen-3-il)-3-[4-(2-nitro-4-
trifluorometilfenil)piperazin-1-il]propan-1-ona
Procedimiento experimental
Seguacuten el meacutetodo general C a partir de 147 g (534 mmol) de 4-(2-nitro-4-
trifluorometilfenil) piperazina comercial y 104 g (445 mmol) de 1-
(benzo[b]tiofen-3-il)-3-cloropropan-1-ona Se elimina el disolvente a presioacuten
reducida y precipita con hexano El soacutelido obtenido no es del todo puro por lo
que se purifica por columna cromatograacutefica usando como fase moacutevil
diclorometanometanol (991) Se elimina el disolvente de las fracciones
adecuadas a presioacuten reducida obteniendo un aceite claro que se precipita como
hidrocloruro
Punto de fusioacuten 207-209 ordmC
IR (cm-1) 2970-2930 (d C-H alifaacuteticos) 1657 (mf CO) 1447 y 1332 (mf NO2)
1253 y 1120 (m CF3)
RMN-1H (DMSO 400 MHz) δ (ppm) 326 (d 2H CO-CH2-CH2 JCHCH= 98
Hz) 351 (d 2H H3ax + H5ax PIPZ Jaxec= 128 Hz) 355 (d 4H
H3ec+H5ec+H2ax+H6ax PIPZ Jaxec= 129 Hz) 367 (d 2H H2ec+H6ec PIPZ Jecec=
122 Hz) 377 (t 2H CO-CH2 JCHCH= 100 Hz) 749 (ddd 1H H5 BZT J54= 84
Hz J56= 68 Hz) 754 (ddd 1H H6 BZT J67= 82 Hz J65= 70 Hz) 758 (d 1H
H6rsquo FENIL J6acute5acute= 88 Hz) 797 (dd 1H H5rsquo FENIL J5acute6acute= 89 Hz J5acute3acute= 21 Hz)
812 (d 1H H4 BZT J45= 79 Hz) 830 (sa 1H H3rsquo FENIL) 862 (d 1H H7 BZT
J76= 78 Hz) 909 (sa 1H H2 BTZ) 1145 (sa 1H HCl)
Anaacutelisis elemental (CHN)
HPLC (RP-18 1 mLmin metanol-agua (8020)) tr 523 min ʎmax 2181 nm
Calculado Hallado
C 5285 5301
H 400 416
N 841 831
FMC22H20N3F3O3SHCl PM 4999 Apariencia Soacutelido beige Rendimiento 60
02
Descripcioacuten de Compuestos
122
1-(benzo[b]tiofen-3-il)-3-[4-(4-fluorofenil)-36-dihidropiridin-
1(2H)-il]propan-1-ona
Procedimiento experimental
Seguacuten el meacutetodo general C a partir de 1 g (567 mmol) de 4-(4-fluorofenil)-
1236-tetrahidropiridina y 12 g (534 mmol) de 1-(benzo[b]tiofen-3-il)-3-
cloropropan-1-ona Se elimina el disolvente a presioacuten reducida y se precipita el
soacutelido con eacuteter El soacutelido obtenido se purifica por cromatografiacutea flash usando
como fase moacutevil diclorometanometanol (991) Se elimina el disolvente de las
fracciones adecuadas a presioacuten reducida obtenieacutendose el compuesto de forma
soacutelida
Punto de fusioacuten 79-80 ordmC
IR (cm-1) 2780-2775 (d C-H alifaacuteticos) 1664 (mf CO)
RMN-1H (CDCl3 400 MHz) δ (ppm) 261 (sa 2H H6 PIRD) 285 (t 2H H2
PIRD J2ec3ec= J2ax3ax= 57 Hz) 306 (t 2H CO-CH2-CH2 JCHCH= 74 Hz) 330 (sa
2H H5 PIRD) 335 (t 2H CO-CH2 JCHCH= 73 Hz) 603 (t 1H H3 PIRD J56ec=
J56ax= 40 Hz) 702 (dd 2H H3rsquo+ H5rsquo FENIL J3acute2acute= J5acute6acute= 87 Hz) 736 (dd 2H
H2rsquo+ H6rsquo FENIL J3acute2acute= J6acute5acute= 86 Hz) 745 (t 1H H6 BZT J65= J67= 76 Hz) 752 (t
1H H5 BZT J56= J54= 77 Hz) 790 (d 1H H4 BZT J45 = 73 Hz) 839 (s H2 BZT)
879 (d 1H H7 BZT J76= 75 Hz)
Anaacutelisis elemental (CHN)
HPLC (RP-18 1 mLmin metanol-agua (8020)) tr 561 min ʎmax 2196 nm
Calculado Hallado
C 7232 7214
H 548 549
N 383 369
FM C22H20NFOS PM 3655 Apariencia Soacutelido amarillo Rendimiento 15
03
Descripcioacuten de Compuestos
123
1-(5-fluorobenzo[b]tiofen-3-il)-3[4-(4-nitro-2-
(trifluorometilfenil)piperazin-1-il]propan-1-ona
Procedimiento experimental
Seguacuten el meacutetodo general D a partir de 048 g (174 mmol) de 4-(4-nitro-2-
trifluorometilfenil) piperazina y 035 g (179 mmol) de 1-(5-fluorobenzo[b]tiofen-
3-il) etanona se elimina el disolvente a presioacuten reducida y se precipita el soacutelido
con hexanoeacuteter en friacuteo
IR (cm-1) 2976-2832 (d C-H alifaacuteticos) 1671 (mf CO) 1330 (f NO2) 1281 y 1127
(m CF3)
RMN-1H (CDCl3 400 MHz) δ (ppm) 296 (sa 4H H3+H5 PIPZ) 320 (sa 2H
CO-CH2-CH2) 331 (sa 4H H2+H6 PIPZ) 346 (sa 2H CO-CH2) 723 (dt 1H
H6 FBZT J65= J67= 86 Hz J64= 25 Hz) 739 (d 1H H6acute FENIL J6acute5acute= 88 Hz)
783 (dd 1H H7 FBZT J76= 88 Hz J75= 48 Hz) 837 (dd 1H H5acute FENIL J5acute6acute=
89 Hz J5acute3acute= 26 Hz) 848 (dd 1H H4 FBZT J4F= 104 Hz J46= 25 Hz) 853 (s
1H H2 FBZT) 854 (d 1H H3rsquo FENIL)
Anaacutelisis elemental (CHN)
HPLC (RP-18 1 mLmin metanol-agua (8020)) tr 703 min ʎmax 2159 nm
Calculado Hallado
C 5101 5055
H 387 390
N 811 786
FM C22H19N3F4O3S PM 4815 Apariencia Soacutelido amarillo Rendimiento 35
04
Descripcioacuten de Compuestos
124
1-(5-fluorobenzo[b]tiofen-3-il)-3-[4-(2-nitro-4-
(trifluorometilfenil)piperazin-1-il]propan-1-ona
Procedimiento experimental
Seguacuten el meacutetodo general D a partir de 058 g (209 mmol) de 4-(2-nitro-4-
trifluorometilfenil) piperazina y 043 g (222 mmol) de 1-(5-fluorobenzo[b]tiofen-
3-il) etanona Se elimina el disolvente a presioacuten reducida y el residuo se
precipita con eacuteter en friacuteo
RMN-1H (CDCl3 400 MHz) δ (ppm) 280 (sa 4H H3+H5 PIPZ) 303 (t 2H
CO-CH2-CH2 JCHCH= JCHCH= 74 Hz) 323 (sa 4H H2+H6 PIPZ) 328 (t 2H
CO-CH2 JCHCH= JCHCH = 73 Hz) 719 (d 1H H6rsquo FENIL J6acute5acute= 84 Hz) 722-725
(m 1H H6 FBZT) 769 (dd 1H H5acute FENIL J5acute6acute= 87 Hz J5acute3acute= 20 Hz) 782 (dd
1H H7 FBZT J76= 89 Hz J7F= 49 Hz) 843 (s 1H H2 FBZT) 808 (d 1HH3acute
FENIL J3acute5acute= 16 Hz) 850 (dd 1H H4 FBZT J4F= 104 Hz J46= 26 Hz)
Anaacutelisis elemental (CHN)
HPLC (RP-18 1 mLmin metanol-agua (8020)) tr 542 min ʎmax 2196 nm
Calculado Hallado
C 5101 5102
H 386 384
N 811 798
FM C22H19N3F4O3S PM 4815 Apariencia Soacutelido naranja Rendimiento 51
05
Descripcioacuten de Compuestos
125
1-(5-fluorobenzo[b]tiofen-3-il)-3-[4-(4-(trifluorometilfenil)
piperazin-1-il]propan-1-ona
Procedimiento experimental
Seguacuten el meacutetodo general D a partir de 036 g (130 mmol) de 4-(4-
trifluorometilfenil) piperazina y 033 g (170 mmol) de 1-(5-fluorobenzo[b]tiofen-
3-il)etanona Se elimina el disolvente a presioacuten reducida y se precipita el soacutelido
con hexanoeacuteter El soacutelido obtenido no es del todo puro por lo que se purifica
por cromatografiacutea flash usando como fase moacutevil diclorometanometanol (991)
Se elimina el disolvente de las fracciones adecuadas a presioacuten reducida
obtenieacutendose un aceite claro
Debido al bajo rendimiento de la reaccioacuten el aceite puro obtenido se identifica
por CCF y se usa en su totalidad para la siacutentesis del derivado hidroxiacutelico 2c
FM C22H20N2F4OS PM 4815 Apariencia Aceite incoloro Rendimiento 15
06
Descripcioacuten de Compuestos
126
Hidrocloruro de 1-(5-fluorobenzo[b]tiofen-3-il)-3-[4-(4-nitro-2-
(trifluorometilfenil)-14-diazepan-1-il]propan-1-ona
Procedimiento experimental
Seguacuten el meacutetodo general D a partir de 051 g (177 mmol) de 4-(2-nitro-4-
trifluorometilfenil) piperazina comercial y 035 g (179 mmol) de 1-(5-
fluorobenzo[b]tiofen-3-il)etanona se elimina el disolvente a presioacuten reducida y
se precipita con hexanoeacuteter etiacutelico
IR (cm-1) 2938 (d C-H alifaacuteticos) 1663 (m CO) 1449 y 1332 (mf NO2) 1281 y
1120 (m CF3)
RMN-1H (DMSO-d6 400 MHz) δ (ppm) 290-297 (m 6H H3+H5+H6 DZP)
310 (t 2H CO-CH2-CH2 JCHCH= 69 Hz) 322 (t 2H CO-CH2 JCHCH= 71 Hz)
353 (d 2H H7 DZP J76= 78 Hz) 356 (d 2H H2 DZP J23= 81 Hz) 712 (d 1H
H6acute FENIL J6acute5acute= 90 Hz) 722 (dd 1H H6 FBZT J67= 83 Hz J64= 23 Hz) 781
(dd 1H H5acute FENIL J5acute6acute= 93 Hz J5acute3acute= 28 Hz ) 820 (d 1H H7rsquo FBZT J76= 80
Hz) 841 (sa 1H H2 FBZT) 848 (d 1H H3acute FENIL J3acute5acute= 26 Hz) 850 (d 1H H4
FBTF J4F= 102 Hz)
Anaacutelisis elemental (CHN)
HPLC (RP-18 1 mLmin metanol-agua (8020)) tr 239 min ʎmax 2235 nm
Calculado Hallado
C 519lt3 5094
H 414 413
N 790 760
FM C23H21N3F4O3SHCl PM 5320 Apariencia Soacutelido amarillo
Rendimiento 80
07
Descripcioacuten de Compuestos
127
1-(5-fluorobenzo[b]tiofen-3-il)-3-[1-(4-nitro-2-
(trifluorometilfenil)piperidin-4-ilamino]propan-1-ona
Procedimiento experimental
Seguacuten el meacutetodo general D a partir de 030 g (155 mmol) de 1-(4-nitro-2-
trifluorometilfenil) piperidin-4-il amina y 033 g (172 mmol) de 1-(5-
fluorobenzo[b]tiofen-3-il) etanona se elimina el disolvente a presioacuten reducida y
se purifica el aceite impuro por cromatografiacutea flash usando como fase moacutevil
diclorometanometanol (991) Se elimina el disolvente de las fracciones
adecuadas a presioacuten reducida obtenieacutendose un aceite claro aacutembar intenso
Debido al bajo rendimiento de la reaccioacuten el intermedio obtenido se identifica
por CCF y se usa en su totalidad para la siacutentesis del derivado hidroxiacutelico 2f
FM C23H21N3F4O3S PM 4955 Apariencia Aceite aacutembar Rendimiento 20
08
Descripcioacuten de Compuestos
128
Hidrocloruro de 1-(2-naftil)-3-[4-(4-nitro-2-trifluorometilfenil)
piperazin-1-il] propan-1-ona
Procedimiento experimental
Seguacuten el meacutetodo general D partiendo de 031 g (181 mmol) de 2-acetonaftona
comercial y 050 g (181 mmol) de 4-(4-nitro-2-trifluorometilfenil) piperazina
Despueacutes de la extraccioacuten y eliminacioacuten a presioacuten reducida del disolvente se
obtiene un aceite impuro El compuesto se purifica y precipita con eacuteter saturado
de clorhiacutedrico para la obtencioacuten del hidrocloruro
Punto de fusioacuten 181-183ordmC
IR (cm-1) 2922-2844 (d C-H alifaacuteticos) 1680 (mf CO) 1521 y 1347 (mf NO2)
1279 y 1151 (m CF3)
RMN-1H (DMSO-d6 400 MHz) δ (ppm) 321 (d 2H H3ax+H5ax PIPZ) 327 (d
2H H3ec+H5ec PIPZ) 364 (sa 2H H2ax+H6ax PIPZ) 367 (sa 2H H2ec+H6ec PIPZ)
390 (t 2H CO-CH2-CH2 JCH-CH= 118 Hz) 403 (t 2H CO-CH2 JCH-CH= 64 Hz)
765-759 (m 3H H6+H7 NFT+H6acute FENIL) 792 (d 1H H4 NFT J43= 79 Hz)
795 (d 1H H5 NFT J56= 87 Hz) 804 (d 1H H8 NFT J87= 83 Hz) 806 (d 1H
H3 NFT J34= 79 Hz) 846 (dd 1H H5acute FENIL J5acute6acute= 88 Hz J5acute3acute= 25 Hz) 858
(d 1H H3acute FENIL J3acute5acute= 25 Hz) 862 (sa 1H H1 NFT)
Anaacutelisis elemental (CHN)
HPLC (RP-18 1 mLmin metanol-agua (8020)) tr 252 min ʎmax 2134 nm
Calculado Hallado
C 5434 5410
H 434 455
N 790 765
FM C24H22N3F3O3HCl PM 4940 Apariencia Soacutelido beige Rendimiento 17
09
Descripcioacuten de Compuestos
129
Hidrocloruro de 1-(2-naftil)-3-[4-(2-nitro-4-
trifluorometilfenil)piperazin-1-il]propan-1-ona
Procedimiento experimental
Seguacuten el meacutetodo general D partiendo de 062 g (363 mmol) de 2-acetonaftona
comercial y 100 g (363 mmol) de 4-(2-nitro-4-trifluorometilfenil) piperazina
Despueacutes de extraer y eliminar a presioacuten reducida el disolvente se obtiene un
aceite impuro El compuesto se purifica y precipita con eacuteter saturado de
clorhiacutedrico para la obtencioacuten del hidrocloruro
Punto de fusioacuten 152ndash153 ordmC
IR (cm-1) 2953-2838 (md C-H alifaacuteticos) 1672 (mf CO) 1535 y 1329 (mf NO2)
1278 y 1169 (m CF3)
RMN-1H (DMSO-d6 400 MHz) δ (ppm) 324ndash331 (m 2H CO-CH2-CH2)
345ndash361(m 6H H3+H5+H2ax+H2ax PIPZ) 371 (d 2H H2ec+H6ec PIPZ Jec-ax=
1148 Hz) 387 (t 2H CO-CH2 JCH-CH= 111 Hz) 756 (d 1H H6acute FENIL J6acute5acute=
87 Hz) 767 (ddd 1H H6 NFT J65= 82 Hz J67= 68 Hz J68= 13 Hz) 771 (ddd
1H H7 NFT J78= 83 Hz J76= 71 Hz J75= 13 Hz) 797 (dd 1H H5acute FENIL J5acute6acute=
89 Hz) 803 (d 1H H4 NFT J43= 84 Hz) 804 (d 1H H5 NFT J56= 85 Hz) 808
(d 1H H8 NFT J87= 85 Hz) 815 (d 1H H3 NFT J34= 80 Hz) 828 (d 1H H3acute
FENIL J3acute5acute= 13 Hz) 877 (sa 1H H1 NFT) 1135 (sa 1H HCl)
Anaacutelisis elemental (CHN)
HPLC (RP-18 1 mLmin metanol-agua (8020)) tr 528 min ʎmax 2475 nm
Calculado Hallado
C 5836 5842
H 466 471
N 850 843
FM C24H22N3F3O3HCl PM 4940 Apariencia Soacutelido amarillo Rendimiento 41
010
Descripcioacuten de Compuestos
130
Hidrocloruro de 1-(2-naftil)-3-[1-(4-nitro-2-
trifluorometilfenil)pirrolidin-3-ilamino]propan-1-ona
Procedimiento experimental
Seguacuten el meacutetodo general D partiendo de 067 g (394 mmol) de 2-acetonaftona y
095 g de 1-(4-nitro-2-(trifluorometilfenil)-(S)-pirrolidin-3-amina Despueacutes de
extraer con acetato de etilo y eliminar a presioacuten reducida el disolvente se
obtiene un soacutelido fino que se lava con eacuteter
Punto de fusioacuten 170-171ordmC
IR (cm-1) 2942-2716 (m C-H alifaacuteticos) 1681 (m CO) 1504 y 1324 (mf NO2)
1285 y 1121 (m CF3)
RMN-1H (DMSO-d6 400 MHz) δ (ppm) 238 (dd 1H H4ec PIRR) 245 (dd 1H
H4ax PIRR) 342 (d 2H CO-CH2-CH2) 364 (dd 1H H2ec PIRR) 375 (t 2H CO-
CH2) 381- 386 (m 2H H5ec+ H2ax PIRR) 394 (dd 1H H5ax PIRR) 408 (s 1H
H3 PIRR) 712 (d 1H H6acute FENIL J6acute5acute= 96 Hz) 765 (dd 1H H6 NFT J67= 78
Hz J65= 68 Hz) 769 (dd 1H H7 NFT J78= 83 Hz J76= 78 Hz) 800 (d 1H H4
NFT J43= 65 Hz) 802 (d 1H H3 NFT J34= 65 Hz) 806 (d 1H H5acute FENIL
J5acute6acute= 86 Hz) 816 (d 1H H5 NFT J56= 68 Hz) 825 (d 1H H8 NFT J87= 84
Hz) 839 (sa 1H H3acute FENIL) 869 (sa 1H H1 NFT) 980 (sa 2H NH+ HCl)
Anaacutelisis elemental (CHN)
HPLC (RP-18 1 mLmin metanol-agua (8020)) 25 min ʎmax= 2141 nm
Calculado Hallado
C 5836 5794
H 466 475
N 851 837
FM C24H22N3F3O3HCl PM 4935 Apariencia Soacutelido anaranjado
Rendimiento 38
011
Descripcioacuten de Compuestos
131
3-[4-(4-fluorofenil)-36-dihidropiridin-1(2H)-il]-1-(naftalen-2-
il)propan-1-ona
Procedimiento experimental
Seguacuten el meacutetodo general D a partir de 082 g (463 mmol) de 4-(4-fluorofenil)-
1236-tetrahidropiridina y 070 g (411 mmol) de 2-acetonaftona Se elimina el
disolvente a presioacuten reducida y se precipita el soacutelido con eacuteter El soacutelido
obtenido se purifica por cromatografiacutea flash usando como fase moacutevil
diclorometanometanol (991) Se elimina el disolvente de las fracciones
adecuadas a presioacuten reducida obtenieacutendose un soacutelido
Punto de fusioacuten 172ndash175 ordmC
IR (cm-1) 2780-2775 (d C-H alifaacuteticos) 1677 (f CO) 1510 (f C=C)
RMN-1H (CDCl3 400 MHz) δ (ppm) 161 (sa 2H H6 PIRD) 214 (sa 2H H2
PIRD) 272 (sa 2H CO-CH2-CH2) 292-299 (m 2H H5 PIRD) 345 (d 2H CO-
CH2) 602 (sa 1H H3 PIRD) 705 (t 2H H3rsquo+ H5rsquo FENIL J3acute2acute= J5acute6acute= 86 Hz)
735 (d 1H H6acute FENIL J6acute5acute= 86 Hz) 739 (sa 1H H2acute FENIL) 748-751 (m 3H
H5+H6+H7 NFT) 784-786 (m 3H H3+H4+H8 NFT) 791 (s 1H H1 NFT)
Anaacutelisis elemental (CHN)
HPLC (RP-18 1 mLmin metanol-agua (8020)) tr 557 min ʎmax 2455 nm
Calculado Hallado
C 7182 7125
H 581 573
N 354 350
FM C24H22NFO PM 3595 Apariencia Soacutelido beige Rendimiento 24
012
Descripcioacuten de Compuestos
132
3-[4-(4-fluorofenil)-36-dihidropiridin-1(2H)-il]-1-(4-
trifluorometilfenil)propan-1-ona
Procedimiento experimental
Seguacuten el meacutetodo general D a partir de 054 g (293 mmol) de 4-(4-fluorofenil)-
1236-tetrahidropiridina y 052 g (276 mmol) de 1-(4-trifluorometilfenil)
etanona se elimina el disolvente a presioacuten reducida y el aceite se purifica por
cromatografiacutea flash usando como fase moacutevil diclorometanometanol (991) Se
elimina el disolvente de las fracciones adecuadas a presioacuten reducida obteniendo
el compuesto puro
RMN-1H (DMSO-d6 400 MHz) δ (ppm) 284 (sa 2H H6 PIRD) 355 (t 2H H2
PIRD) 382 (t 4H CO-CH2 +CO-CH2-CH2) 406 (sa 2H H5 PIRD) 621 (sa 1H
H3 PIRD) 723 (t 2H H2+ H6 TFBZN J23= J65= 88 Hz) 756 (dd 2H H3acute+ H5acute
FENIL J3acute2acute= J5acute6acute= 87 Hz J3acute5acute= J5acute3acute= 54 Hz) 797 (d 2H H2acute+ H6acute FENIL J2acute3acute=
J6acute5acute= 83 Hz) 823 (d 2H H3+H5 TFBZN J32= J56= 86 Hz)
FM C21H19NF4O
PM 3774 Apariencia Aceite beige Rendimiento 13
013
Descripcioacuten de Compuestos
133
1-(2-naftil)-2-[4-(4-nitro-2-trifluorometilfenil)piperazin-1-il]etan-1-
ona
Procedimiento experimental
Seguacuten el meacutetodo general C a partir de 070 g (254 mmol) de 4-(4-nitro-2-
trifluorometilfenil) piperazina y 053 g (211 mmol) de 2-bromo-2acute-acetonaftona
Se elimina el disolvente a presioacuten reducida obteniendo un aceite que se purifica
por columna cromatograacutefica usando como fase moacutevil diclorometanometanol
(973) Se elimina el disolvente de las fracciones adecuadas a presioacuten reducida
obteniendo compuesto puro en forma soacutelida
Punto de fusioacuten 167-168ordmC
IR (cm-1) 2925-2873 (d C-H alifaacuteticos) 1669 (mf CO) 1499 y 1334 (mf NO2)
1281 y 1124 (m CF3)
RMN-1H (DMSO-d6 400 MHz) δ (ppm) 309 (sa 4H H2+H6 PIPZ) 336 (sa
4H H3+H5 PIPZ) 428 (sa 2H COCH2) 739 (d 1H H6acute FENIL J6acute5acute= 88 Hz)
760-765 (m 1H H6 NFT) 766-771 (m 1H H7 NFT) 792 (d 1H H3 NFT J34=
81 Hz) 794 (d 1H H5acute FENIL J5acute6acute= 89 Hz) 800 (d 1H H4 NFT J43= 81 Hz)
805 (dd 1H H5 NFT J56= 85 Hz J57= 12 Hz) 837 (dd 1H H8 NFT J87= 90
Hz J86= 19 Hz) 856 (sa 2H H2 NFT+ H3acute FENIL)
Anaacutelisis elemental (CHN)
HPLC (RP-18 1 mLmin metanol-agua (8020)) tr 69 min ʎmax 2477 nm
Calculado Hallado
C 6225 602
H 451 421
N 948 925
FM C23H20N3F3O3 PM 4434 Apariencia Soacutelido beige Rendimiento 13
014
Descripcioacuten de Compuestos
134
1-(2-naftil)-2-[4-(2-nitro-4-trifluorometilfenil)piperazin-1-il]etan-1-
ona
Procedimiento experimental
Seguacuten el meacutetodo general C a partir de 135 g (481 mmol) de 4-(2-nitro-4-
trifluorometilfenil) piperazina y 104 g (417 mmol) de 2-bromo-2acute-acetonaftona
Se elimina el disolvente a presioacuten reducida obteniendo un aceite que se
precipita con una mezcla de hexanoeacuteter etiacutelico en frio
Punto de Fusioacuten 105-106ordmC
IR (cm-1) 2943-2854 (d alifaacuteticos) 1686 (f CO) 1532 y 1329 (m NO2) 1295 y
1118 (m CF3)
RMN-1H (CDCl3 400 MHz) δ (ppm) 290 (t 4H H3+H5 PIPZ) 331 (t 4H
H2+H6 PIPZ) 410 (sa 2H CO-CH2) 721 (d 1H H6acute FENIL J6acute5acute= 86 Hz) 760
(dd 1H H7 NFT J78= 85 Hz J75= 84 Hz) 764 (dd 1H H4 NFT J43= 81 Hz
J45= 14 Hz) 769 (ddd 1H H6 NFT J65= 95 Hz J67= 84 Hz J68= 16 Hz) 791
(d 1H H5 NFT J56= 95 Hz) 794 (d 1H H8 NFT J87= 84 Hz) 800 (d 1H H3
NFT J34= 81 Hz) 806 (dd 1H H5acute FENIL J5acute6acute= 86 Hz J5acute3acute= 16 Hz) 809 (d
1H H3acute FENIL J3acute5acute= 16 Hz) 856 (sa 1H H1 NFT)
Anaacutelisis elemental (CHN)
Calculado Hallado
C 6230 6173
H 451 481
N 948 933
FM C23H20N3F3O3 PM 44340 Apariencia Soacutelido naranja Rendimiento 60
015
Descripcioacuten de Compuestos
135
1-(4-fluoronaftil)-3-[4-(4-nitro-2-trifluorometilfenil)piperazin-1-
il]propan-1-ona
Procedimiento experimental
Seguacuten el meacutetodo general D a partir de 063 g (229 mmol) de 4-(4-nitro-2-
trifluorometilfenil) piperazina y 056 g (299 mmol) de 4acute-fluoro-1acute-acetonaftona
comercial se elimina el disolvente a presioacuten reducida obteniendo un aceite que
se purifica por cromatografiacutea flash usando como fase moacutevil
diclorometanometanol (955) Se elimina el disolvente de las fracciones
adecuadas a presioacuten reducida obtenieacutendose el compuesto en forma de aceite
que se usa en su totalidad despueacutes de su identificacioacuten por CCF para la siacutentesis
del derivado hidroxiacutelico 5a
FM C24H21N3F4O3 PM 4754 Apariencia Aceite amarillo Rendimiento 53
016
Descripcioacuten de Compuestos
136
1-(4-fluoronaftil)-3-[4-(2-nitro-4-trifluorometilfenil) piperazin-1-il]
propan-1-ona
Procedimiento experimental
Seguacuten el meacutetodo general D partiendo de 144 g (523 mmol) de 4-(2-nitro-4-
trifluorometilfenil) piperazina y 098 g (522 mmol) de 4acute-fluoro-1acute-acetonaftona
comercial Despueacutes de extraer y eliminar a presioacuten reducida el disolvente se
obtiene un aceite que al antildeadir hexano friacuteo precipita el compuesto puro como
soacutelido fino
Punto de fusioacuten 106ndash107 ordmC
IR (cm-1) 2924-2854 (f C-H alifaacuteticos) 1675 (mf CO) 1531 y 1326 (m NO2)
1278 y 1123 (m CF3)
RMN-1H (DMSO 400 MHz) δ (ppm) 270 (sa 4H H3+H5 PIPZ) 304 (sa 2H
CO-CH2-CH2) 319 (sa 4H H2+H6 PIPZ) 335 (sa 2H CO-CH2) 717 (d 1H H6acute
FENIL J6acute5acute= 88 Hz) 720 (dd 1H H7 FNFT J78= 90 Hz J76= 80 Hz) 763 (ddd
1H H6 FNFT) 768 (dd 1H H5acute FENIL J5acute6acute= 88 Hz J5acute3acute= 16 Hz) 769 (dd 1H
H5 FNFT J56= 73 Hz J5F= 27 Hz) 794 (dd 1H H3 FNFT J32= 79 Hz J3F= 54
Hz) 807 (d 1H H3acute FENIL J3acute5acute= 15 Hz) 819 (d 1H H2 FNFT J23= 79 Hz)
873 (d 1H H8 FNFT J87= 90 Hz)
Anaacutelisis elemental (CHN)
HPLC (RP-18 1 mLmin metanol-agua (8020)) 243 min ʎmax= 2200 nm
Calculado Hallado
C 6063 6100
H 442 459
N 884 867
FM C24H21N3F4O3 PM 4754 Apariencia Soacutelido anaranjado Rendimiento 73
017
Descripcioacuten de Compuestos
137
1-(4-fluoronaft-1-il)-3-[4-(4-trifluorometilfenil)piperazin-1-
il]propan-1-ona
Procedimiento experimental
Seguacuten el meacutetodo general D a partir de 037 g (187 mmol) de 4-(4-
trifluorometilfenil) piperazina y 032 g (169 mmol) de 4acute-fluoro-1acute-acetonaftona
se elimina el disolvente a presioacuten reducida y precipita un soacutelido impuro con
hexanoeacuteter Se purifica por cromatografiacutea flash usando como fase moacutevil
diclorometanometanol (991) y se elimina el disolvente de las fracciones
adecuadas a presioacuten reducida obtenieacutendose el compuesto en forma de aceite
que despueacutes de su identificacioacuten por CCF se usa en su totalidad para la siacutentesis
del derivado hidroxiacutelico 5c
FM C24H22N2F4O PM 4305 Apariencia Aceite beige Rendimiento 23
018
Descripcioacuten de Compuestos
138
1-(4-fluoronaft-1-il)-3-[1-(4-nitro-2-trifluorometilfenil)piperidin-4-
ilamino]propan-1-ona
Procedimiento experimental
Seguacuten el meacutetodo general D a partir de 085 g (293 mmol) de 1-(4-nitro-2-
trifluorometilfenil)piperidin-4-il amina y 100 g (531 mmol) de 4acute-fluoro-1acute-
acetonaftona Se elimina el disolvente a presioacuten reducida y se purifica el aceite
impuro por cromatografiacutea flash usando como fase moacutevil
diclorometanometanol (991) Se elimina el disolvente de las fracciones
adecuadas a presioacuten reducida obtenieacutendose un soacutelido amarillo
IR (cm-1) 2950-2732 (d C-H alifaacuteticos) 1673 (mf CO) 1508 y 1334 (m NO2)
1284 y 1119 (m CF3)
RMN-1H (DMSO 400 MHz) δ (ppm) 180 (d 2H H3ax+ H5ax PIPR J3ax5ax=
J5ax3ax= 116 Hz) 224 (d 2H H3ec+H5ec PIPR J3ec5ec= J5ec3ec= 116 Hz) 300 (t 2H
CO-CH2-CH2 JCHCH= 118 Hz) 336-343 (m 5H H2+H4+H6 PIPR) 366 (t 2H
CO-CH2 JCHCH= 62 Hz) 753 (ddd 1H H3 FNFT J3F= 106 Hz J32= 85 Hz J35=
157 Hz) 760 (d 1H H6acute FENIL J6acute5acute= 89 Hz) 774 (ddd 1H H6 FNFT J65= 79
Hz J67= 69 Hz J68= 12 Hz) 779 (ddd 1H H7 FNFT J78= 85 Hz J76= 70 Hz
J75= 14 Hz) 818 (d 1H H2 FNFT J23= 81 Hz) 826 (dd 1H H5 FNFT J56= 74
Hz J5F= 56 Hz J57= 14 Hz) 840 (d 1H H3acute FENIL J3acute5acute= 24 Hz ) 844 (dd 1H
H5acute FENIL J5acute6acute= 87 Hz J5acute3acute= 26 Hz) 880 (d 1H H8 FNFT J87= 83 Hz)
FM C25H23N3F4O3 PM 4895 Apariencia Soacutelido amarillo Rendimiento 52
019
Descripcioacuten de Compuestos
139
1-(4-fluoronaft-1-il)-3-[4-(4-fluorofenil)-36-dihidropiridin-1(2H)-
il]propan-1-ona
Procedimiento experimental
Seguacuten el meacutetodo general D a partir de 143 g (669 mmol) de 4-(4-fluorofenil)-
1236-tetrahidropiridina y 097 g (518 mmol) de 4acute-fluoro-1acute-acetonaftona Se
elimina el disolvente a presioacuten reducida y el aceite se purifica por cromatografiacutea
flash usando como fase moacutevil diclorometanometanol (955) Se elimina el
disolvente de las fracciones adecuadas a presioacuten reducida obteniendo un soacutelido
puro
Punto de fusioacuten 127-128ordmC
IR (cm-1) 2536 (d C-H alifaacuteticos) 1672 (f CO)
RMN-1H (DMSO-d6 400 MHz) δ (ppm) 263 (s 2H H5 PIRD) 314-335 (m
6H H2+ H6 PIRD+ CO-CH2-CH2) 361 (s 2H CO-CH2) 616 (s 1H H3 PIRD)
719 (t 2H H3acute+ H5acute FENIL J3acute2acute= J6acute5acute= 89 Hz) 749 (d 1H H3 FNFT J32= 80
Hz) 751 (d 2H H2acute+H6acute FENIL J2acute3acute= J6acute5acute= 87 Hz) 773 (t 2H H6+H7 FNFT
J67= J76= 71 Hz) 815 (d 1H H5 FNFT J56= 75 Hz) 828 (dd 1H H2 FNFT J23=
78 Hz J2F= 43 Hz) 868 (d 1H H8 FNFT J87= 81 Hz)
FM C24H21NF2O
PM 3775 Apariencia Soacutelido blanco Rendimiento 44
020
Descripcioacuten de Compuestos
140
1-(4-fluorofenil)-3-[4-(4-nitro-2-trifluorometilfenil) piperazin-1-il]
propan-1-ona
Procedimiento experimental
Seguacuten el meacutetodo general D a partir de 026 g (093 mmol) de 4-(4-nitro-2-
trifluorometilfenil) piperazina y 025 g (180 mmol) de 1-(4-fluorofenil) etanona
se elimina el disolvente a presioacuten reducida obtenieacutendose un aceite que se
purifica por cromatografiacutea flash usando como fase moacutevil
diclorometanometanol (991) Se elimina el disolvente de las fracciones
adecuadas a presioacuten reducida obteniendo el compuesto en forma de aceite que
se usa en su totalidad despueacutes de su identificacioacuten por CCF para la siacutentesis del
derivado hidroxiacutelico 6a
FM C20H19N3F4O3 PM 4254 Apariencia Aceite amarillo Rendimiento 63
021
Descripcioacuten de Compuestos
141
1-(4-fluorofenil)-3-[1-(4-nitro-2-trifluorometilfenil)piperidin-4-il-
amino]propan-1-ona
Procedimiento experimental
Seguacuten el meacutetodo general D a partir de 025 g (853 mmol) de 1-(4-nitro-2-
trifluorometilfenil) piperidin-4-il amina y 022 g (160 mmol) de 1-(4-
fluorofenil)etanona Se elimina el disolvente a presioacuten reducida y se purifica el
aceite impuro por cromatografiacutea flash usando como fase moacutevil
diclorometanometanol (991) Se elimina el disolvente de las fracciones
adecuadas a presioacuten reducida obtenieacutendose un aceite
RMN-1H (DMSO-d6 400 MHz) δ (ppm) 250 (sa 1H H4 PIPR) 263-256 (m
4H H3+ H5 PIPR) 275 (t 2H CO-CH2-CH2) 314-309 (m 4H H2 +H6 PIPR)
324 (t 2H CO-CH2) 736 (t 2H H2 +H6 FBZN J23= J65=80 Hz) 754 (d 1H H6acute
FENIL J6acute5acute= 79 Hz) 808 (d 1H H5 FBZN J56= 79 Hz) 810 (d 1H H3 FBZN
J32= 76 Hz) 838 (s 1H H3acute FENIL) 839 (sa 1H H5acute FENIL)
FM C21H21N3F4O3 PM 4394 Apariencia Aceite amarillo Rendimiento 12
022
Descripcioacuten de Compuestos
142
1-(4-fluorofenil)-3-[4-(4-fluorofenil)-36-dihidropiridin-1(2H)-il]
propan-1-ona
Procedimiento experimental
Seguacuten el meacutetodo general D a partir de 050 g (288 mmol) de 4-(4-fluorofenil)-
1236-tetrahidropiridina y 034 g (245 mmol) de 1-(4-fluorofenil)etanona Se
elimina el disolvente a presioacuten reducida y el aceite se purifica por cromatografiacutea
flash usando como fase moacutevil diclorometanometanol (991) Se elimina el
disolvente de las fracciones adecuadas a presioacuten reducida obteniendo un aceite
amarillo
Despueacutes de identificar el compuesto por CCF debido al bajo rendimiento se usa
todo el aceite obtenido para la siacutentesis del derivado hidroxiacutelico 6g
FM C20H19NF2O
PM 32740 Apariencia Aceite amarillo Rendimiento 10
023
Descripcioacuten de Compuestos
143
X3 Siacutentesis de derivados hidroxiacutelicos
1-(benzo[b]tiofen-3-il)-3-[4-(4-nitro-2-
trifluorometilfenil)piperazin-1-il] propan-1-ol
Procedimiento experimental
Seguacuten el meacutetodo general E partiendo de 050 g (107 mmol) de 1-
(benzo[b]tiofen-3-il)-3-[4-(4-nitro-2-trifluorometilfenil)piperazin-1-il]propan-1-
ona se obtiene tras la eliminacioacuten del disolvente un soacutelido que se purifica por
columna cromatograacutefica de fase moacutevil diclorometanometanol (991) y se
obtiene el compuesto puro
Punto de fusioacuten 157ndash158 ordmC
IR (cm-1) 3365 (m OH) 2998-2830 (m C-H alifaacuteticos) 1524 y 1349 (mf NO2)
1282 y 1128 (f CF3)
RMN-1H (CDCl3 400 MHz) δ (ppm) 214-216 (m 2H CHOH-CH2) 277-287
(m 6H CHOH-CH2-CH2+H3+H5 PIPZ) 320-329 (m 4H H2 +H6 PIPZ) 538
(dd 1H CHOH) 733-742 (m 3H H6rsquo FENIL +H6+H5 BZT) 745 (s 1H H2
BZT) 782 (d 1H H4 BZT J45 = 84 Hz) 788 (d 1H H7 BZT J76= 80 Hz) 837
(dd 1H H5rsquo FENIL J5rsquo6rsquo = 92 Hz J5rsquo3rsquo = 28 Hz) 855 (d 1H H3rsquo FENIL)
Anaacutelisis elemental (CHN)
HPLC (RP-18 1 mLmin metanol-agua (8020)) 54 min ʎmax= 2281 nm
Calculado Hallado
C 5677 5701
H 473 485
N 903 853
FM C22H22N3F3O3S PM 4655 Apariencia Soacutelido amarillo Rendimiento 13
1a
Descripcioacuten de Compuestos
144
Hidrocloruro de 1-(benzo[b]tiofen-3-il)-3-[4-(2-nitro-4-
trifluorometilfenil)piperazin-1-il]propan-1-ol
Procedimiento experimental
Seguacuten el meacutetodo general E se parte de 041 g (082 mmol) de 1-(benzo[b]tiofen-
3-il)-3-[4-(2-nitro-4-trifluorometilfenil)piperazin-1-il]propan-1-ona Tras la
eliminacioacuten del disolvente se obtiene un aceite impuro que se purifica por
cromatografiacutea flash con diclorometanometanol (991) El aceite puro precipita
con eacuteter clorhiacutedrico como hidrocloruro
Punto de fusioacuten 176-178ordmC
IR (cm-1) 3185 (d OH) 2924-2851 (f C-H alifaacuteticos) 1509 y 1346 (mf NO2) 1279
y 1119 (f CF3)
RMN-1H (DMSO-d6 400 MHz) δ (ppm) 223ndash232 (m 2H CHOH-CH2) 317
(sa 2H CHOH-CH2-CH2) 335 (sa 2H H3ax+H5ax PIPZ) 349 (sa 4H
H2ax+H6ax+ H3ec+H5ec PIPZ) 359 (d 2H H2ec+H6ec PIPZ) 501 (m 1H CH-OH)
743ndash736 (m 2H H5+H6 BZT) 754 (d 1H H6acute FENIL J6acute5acute = 80 Hz) 764 (sa
1H H2 BZT) 794 (dd 1H H5acute FENIL J5acute6acute = 81 Hz J5acute3acute = 16 Hz) 798-801 (m
2H H7+ H4 BZT) 825 (sa 1H H3acute FENIL) 1111 (sa 1H HCl)
Anaacutelisis elemental (CHN)
HPLC (RP-18 1 mLmin metanol-agua (8020)) 433 min ʎmax= 2290 nm
Calculado Hallado
C 5264 5253
H 439 428
N 838 826
FM C22H22N3F3O3SHCl PM 502 Apariencia Soacutelido camel Rendimiento 16
1b
Descripcioacuten de Compuestos
145
Hidrocloruro de 1-(benzo[b]tiofen-3-il)-3-[4-(4-fluorofenil)-36-
dihidropiridin-1(2H)-il)propan-1-ol
Procedimiento experimental
Seguacuten el meacutetodo general E partiendo de 015 g (041 mmol) de 1-
(benzo[b]tiofen-3-il)-3-[4-(4-fluorofenil)-36-dihidropiridin-1(2H)-il] propan-1-
ona Despueacutes se elimina el disolvente y se obtiene un soacutelido impuro que se
purifica precipitando el hidrocloruro con eacuteter clorhiacutedrico
Punto fusioacuten 204-206ordmC
IR (cm-1) 3385 (d OH) 2924-2851 (f C-H alifaacuteticos)
RMN-1H (DMSO 400 MHz) δ (ppm) 229-30 (m 2H CHOH-CH2) 274- 281
(m 2H CHOH-CH2-CH2) 337-340 (m 2H H6 PIRD) 366-377 (m 3H
H2+H5ax PIRD) 40 (d 1H H5ec PIRD) 509 (sa 1H CHOH) 620 (s 1H H3
PIRD) 723 (d 2H H3rsquo+ H5rsquo FENIL J3acute2acute= J5acute6acute= 90 Hz) 738-74 (m 2H H2rsquo+ H6rsquo
FENIL) 750 (dd 2H H6+H5 BTF J65= J56= 80 Hz J54= J67= 71 Hz) 760 (s 1H
H2 BTF) 800 (dd 2H H4 +H7 BTF J45= J76= 70 Hz J6= J75= 18 Hz) 105 (sa
1H HCl)
Anaacutelisis elemental (CHN)
HPLC (RP-18 1 mLmin metanol-agua (8020)) tr 426 min ʎmax 2282 nm
Calculado Hallado
C 640 6389
H 551 575
N 339 325
FM C22H22NFOSHCl PM 4405 Apariencia Soacutelido blanco
Rendimiento 65
1g
Descripcioacuten de Compuestos
146
1-(5-fluorobenzo[b]tiofen-3-il)-3-[4-(4-nitro-2-
trifluorometilfenil)piperazin-1-il]propan-1-ol
Procedimiento experimental
Seguacuten el meacutetodo general E partiendo de 040 g (092 mmol) de 1-(5-
fluorobenzo[b]tiofen-3-il)-3-[4-(4-nitro-2-trifluorometilfenil)piperazin-1-
il]propan-1-ona Despueacutes de eliminar el disolvente se obtiene un soacutelido marroacuten
impuro que purificamos por cromatografiacutea flash en diclorometanometanol
(991)
Punto fusioacuten 140-142ordmC
IR (cm-1) 3426 (d OH) 2826 (d C-H alifaacuteticos) 1507 y 1329 (mf NO2) 1283 (mf
F-BZT)1240 y 1122 (f CF3)
RMN-1H (CDCl3 400 MHz) δ (ppm) 206-215 (m 2H CHOH-CH2) 274-283
(sa 3H H3ax+H5ax PIPZ+ CHOH-CH2-CH2) 292-386 (m 3H H3ec+H5ec PIPZ+
CHOH-CH2-CH2) 324 (t 4H H2+H6 PIPZ) 530 (dd 1H CHOH JCH-OH = 74
Hz JCH-CH = 39 Hz) 713 (dt 1H H6 FBZT J67 = 87 Hz J6F = 83 Hz J64 = 25
Hz) 735 (d 1H H6acute FENIL J6acute5acute= 90 Hz) 752 (dd 1H H4 FBZT J4F = 95 Hz J46
= 28 Hz) 751 (s 1H H2 FBZT) 780 (dd 1H H7 FBZT J76 = 88 Hz J7F = 49
Hz) 838 (dd 1H H5rsquo FENIL J5acute6acute = 89 Hz J5acute3acute = 27 Hz) 855 (d 1H H3rsquo FENIL
J3acute5acute = 27 Hz)
Anaacutelisis elemental (CHN)
HPLC (RP-18 1 mLmin metanol-agua (8020)) 554 min ʎmax= 2283 nm
Calculado Hallado
C 5446 5483
H 434 444
N 869 920
FM C22H21N3F4O3S PM 4835 Apariencia Soacutelido amarillo Rendimiento 21
2a
Descripcioacuten de Compuestos
147
Hidrocloruro de 1-(5-fluorobenzo[b]tiofen-3-il)-3-[4-(2-nitro-4-
trifluorometilfenil)piperazin-1-il]propan-1-ol
Procedimiento experimental
Seguacuten el meacutetodo general E partiendo de 031 g (086 mmol) de 1-(5-
fluorobenzo[b]tiofen-3-il)-3-[4-(2-nitro-4-trifluorometilfenil)piperazin-1-
il]propan-1-ona se obtiene tras la eliminacioacuten del disolvente un aceite impuro
que se purifica por cromatografiacutea flash con diclorometanometanol (991) El
aceite puro precipita como hidrocloruro con eacuteter clorhiacutedrico
Punto de fusioacuten 196-198ordmC
IR (cm-1) 3408 (d OH) 2968-2814 (d C-H alifaacuteticos) 1533 y 1329 (mf NO2)
1230 y 1112 (f CF3)
RMN-1H (DMSO-d6 400 MHz) δ (ppm) 206 (sa 2H CHOH-CH2) 292 (sa
4H H2+H6 PIPZ) 324 (sa 4H H3+H5 PIPZ) 37 (sa 2H CHOH-CH2-CH2) 50
(sa 1H CHOH) 726 (dt 1H H6 FBZT J6F = 91 Hz J67 = 88 Hz J64 = 22 Hz)
749 (d 1H H6acute FENIL J6acute5acute= 85 Hz) 772 (s 1H H2 FBZT) 777 (d 1H H4
FBZT J4F = 102 Hz) 790 (d 1H H5acute FENIL J5acute6acute = 84 Hz) 802 (dd 1H H7
FBZT J76 = 89 Hz J7F = 51 Hz ) 820 (s 1H H3acute FENIL)
Anaacutelisis elemental (CHN)
HPLC (RP-18 1 mLmin metanol-agua (8020)) 445 min ʎmax=2308 nm
Calculado Hallado
C 5081 5121
H 423 375
N 808 811
FM C22H21N3F4O3S HCl PM 5195 Apariencia Soacutelido amarillo Rendimiento 20
2b
Descripcioacuten de Compuestos
148
1-(5-fluorobenzo[b]tiofen-3-il)-3-[4-(4-
trifluorometilfenil)piperazin-1-il]propan-1-ol
Procedimiento experimental
Seguacuten el meacutetodo general E partiendo de 053 g de 1-(5-fluorobenzo[b]tiofen-3-
il)-3-[4-(4-trifluorometilfenil)piperazin-1-il]propan-1-ona se obtiene en la
eliminacioacuten del disolvente un aceite impuro que se purifica por cromatografiacutea
flash con diclorometanometanol (991)
Punto de fusioacuten 158-160ordmC
IR (cm-1) 2961-2831 (d C-H alifaacuteticos) 1248 y 1115 (f CF3)
RMN-1H (CDCl3 400 MHz) δ (ppm) 221 (sa 2H CHOH-CH2) 282 (sa 3H
H3ax+H5ax PIPZ +CHOH-CH2-CH2) 293-294 (m 3H H3ec+H5ec PIPZ + CHOH-
CH2-CH2) 345 (sa 4H H2+H6 PIPZ) 532 (dd 1H CHOH JCH-OH = 41 Hz JCH-
CH = 67 Hz) 696 (d 2H H6+H7 FBZT J67 = J76 = 84 Hz) 710-715 (m 1H H4
FBZT) 750-754 (m 4H H2acute+H3acute+H5acute+H6acute FENIL) 780 (sa 1H H2 FBZT)
Anaacutelisis elemental (CHN)
HPLC (RP-18 1 mLmin metanol-agua (8020)) tr 466 min ʎmax 2005 nm
Calculado Hallado
C 6027 5930
H 502 495
N 639 624
FM C22H22N2F4OS
PM 4385 Apariencia Soacutelido blanco Rendimiento 15
2c
Descripcioacuten de Compuestos
149
1-(5-fluorobenzo[b]tiofen-3-il)-3-[4-(4-nitro-2-trifluorometilfenil)-
14-diazepan-1-il]propan-1-ol
Procedimiento experimental
Seguacuten el meacutetodo general E partiendo de 039 g (080 mmol) de 1-(5-
fluorobenzo[b]tiofen-3-il)-3-[4-(4-nitro-2-trifluorometilfenil)-14-diazepan-1-
il]propan-1-ona se obtiene tras la eliminacioacuten del disolvente un aceite impuro
que se purifica por cromatografiacutea flash en diclorometanometanol (991)
Punto de fusioacuten 110-111ordmC
IR (cm-1) 3425 (m OH) 1500 y 1338 (mf NO2) 1280 (mf F-BZT)1257 y 1106 (f
CF3)
RMN-1H (CDCl3 400 MHz) δ (ppm) 208 (sa 4H CHOH-CH2+H6 DZP) 287-
293 (m 4H H2+H7 DZP) 298-299 (m 2H CHOH-CH2-CH2) 354 (sa 2H H5
DZP) 562 (sa 2H H3 DZP) 530 (t 1H CHOH JCH-OH = JCH-CH = 57 Hz) 712
(dd 1H H7 BZT J76= 88 Hz J7F= 24 Hz) 722 (d 1H H6acute FENIL J65acuteacute= 92 Hz)
750 (s 1H H2 FBZT) 751 (dd 1H H4 FBZT J4F= 98 Hz J46= 15 Hz) 780 (dd
1H H6 FBZT J67= 88 Hz J6F= 50 Hz) 828 (dd 1H H5acute FENIL J5acute6acute= 92 Hz
J5acute3acute= 27 Hz) 854 (s 1H H3acute FENIL)
Anaacutelisis elemental (CHN)
HPLC (RP-18 1 mLmin metanol-agua (8020)) 557 min ʎmax= 2308 nm
Calculado Hallado
C 5548 5515
H 462 464
N 844 826
FM C23H23N3O3F4S PM 4975 Apariencia Soacutelido amarillo Rendimiento 25
2d
Descripcioacuten de Compuestos
150
1-(5-fluorobenzo[b]tiofen-3-il)-3-[1-(4-nitro-2-
trifluorometilfenil)piperidin-4-il]amino propan-1-ol
Procedimiento experimental
Seguacuten el meacutetodo general E partiendo de 017 g (034 mmol) de 1-(5-
fluorobenzo[b]tiofen-3-il)-3-[1-(4-nitro-2-trifluorometilfenil)piperidin-4-
il]aminopropan-1-ona se obtiene tras la eliminacioacuten del disolvente un aceite
impuro que se purifica por cromatografiacutea flash en diclorometanometanol
(991)
Punto de fusioacuten 140-142ordmC
IR (cm-1) 3425 (m OH) 1498 y 1334 (mf NO2) 1283 (mf F-BTF)1283 y 1106 (f
CF3)
RMN-1H (CDCl3 400 MHz) δ (ppm) 156-171 (m 2H H3ax+H5ax PIPR) 195-
197 (m 2H CHOH-CH2) 211 (sa 2H H3ec+H5ec PIPR) 275 (sa 1H H4 PIPR)
295 (t 2H H2ax+H6ax PIPR J2ax2ec= J6ax6ec= 97 Hz) 313 (sa 2H CHOH-CH2-
CH2) 342 (d 2H H2ec+H6ec PIPR J2ec2ax= J6ec6ax= 90 Hz) 530 (d 1H CHOH JCH-
OH = 77 Hz) 712 (t 1H H6 FBZT J6F = J67 = 77 Hz) 729 (d 1H H6acute FENIL J6acute5acute=
86 Hz) 750 (dd 1H H4 FBZT J4F = 85 Hz J46 = 49 Hz) 752 (s 1H H2 FBZT)
779 (dd 1H H7 FBZT J76 = 82 Hz J7F = 31 Hz) 833 (dd 1H H5rsquo FENIL J5acute6acute =
85 Hz J5acute3acute = 18 Hz) 853 (sa 1H H3rsquo FENIL)
Anaacutelisis elemental (CHN)
HPLC (RP-18 1 mLmin metanol-agua (8020)) 443 min ʎmax= 2299 nm
Calculado Hallado
C 5548 5555
H 481 462
N 826 844
FM C23H23N3O3F4S PM 49751 Apariencia Soacutelido amarillo Rendimiento 37
2f
Descripcioacuten de Compuestos
151
Hidrocloruro de 1-(2-naftil)-3-[4-(4-nitro-2-
trifluorometilfenil)piperazin-1-il]propan-1-ol
Procedimiento experimental
Seguacuten el meacutetodo general E partiendo de 033 g (066 mmol) de 1-(2-naftil)-3-[4-
(4-nitro-2-trifluorometilfenil)piperazin-1-il]propan-1-ona tras la eliminacioacuten del
disolvente se obtiene un aceite que precipita en forma de hidrocloruro con eacuteter
saturado de HCl
Punto de fusioacuten 183-185ordmC
IR (cm-1) 3185 (d OH) 2924-2851 (f C-H alifaacuteticos) 1509 y 1346 (mf NO2) 1279
y 1119 (f CF3)
RMN-1H (DMSO-d6 400 MHz) δ (ppm) 214 (sa 2H CHOH-CH2) 317 (sa
2H CHOH-CH2-CH2) 329-335 (m 6H H3ax+ H5ax+ H2+H6 PIPZ) 360 (sa 2H
H3ec+ H5ec PIPZ) 483-485 (m 1H CHOH) 749-752 (m 3H H6rsquo FENIL + H6+H7
NFT) 764 (d 1H H3 NFT J34 = 91 Hz) 786 (sa 1H H1 NFT) 788-792 (m 3H
H4+H5+H8 NFT ) 841 (d 1H H3acute FENIL J3acute5acute = 21 Hz) 846 (dd 1H H5rsquo FENIL
J5rsquo6rsquo = 92 Hz J5rsquo3rsquo = 19 Hz)
Anaacutelisis elemental (CHN)
HPLC (RP-18 1 mLmin metanol-agua (8020)) 762 min ʎmax= 2236 nm
Calculado Hallado
C 5812 5770
H 484 520
N 847 801
FM C24H24N3F3O3HCl PM 5325 Apariencia Soacutelido amarillo Rendimiento 50
3a
Descripcioacuten de Compuestos
152
Hidrocloruro de 1-(2-naftil)-3-[4-(2-nitro-4-trifluorometilfenil)
piperazin-1-il] propan-1-ol
Procedimiento experimental
Seguacuten el meacutetodo general E partiendo de 036 g (083 mmol) de 1-(2-naftil)-3-[4-
(2-nitro-4-trifluorometilfenil)piperazin-1-il]propan-1-ona tras la eliminacioacuten del
disolvente se obtiene un aceite que precipita en forma de hidrocloruro con eacuteter
saturado de HCl
Punto de fusioacuten 165ndash166 ordmC
IR (cm-1) 3250 (m OH) 2927-2873 (d C-H alifaacuteticos) 1534 y 1327 (mf NO2)
1280 y 1123 (f CF3)
RMN-1H (DMSO-d6 400 MHz) δ (ppm) 219-222 (m 2H CHOH-CH2) 316
(sa 4H H3+H5 PIPZ) 348 (sa 4H H2+H6 PIPZ) 358 (d 2H CHOH-CH2-CH2)
484-487 (m 1H CHOH) 574 (sa 1H OH) 747-752 (m 2H H6acuteFENIL+H3
NFT) 754 (sa 1H H7 NFT) 756 (sa 1H H6 NFT) 788-795 (m 5H
H1+H4+H5+H8 NFT+H5acute FENIL) 825 (sa 1H H3acute FENIL) 1110 (sa 1H HCl)
Anaacutelisis elemental (CHN)
HPLC (RP-18 1 mLmin metanol-agua (8020)) 457 min ʎmax= 2220 nm
Calculado Hallado
C 5663 5682
H 469 458
N 821 813
FM C24H24N3F3O3HCl PM 4960 Apariencia Soacutelido camel Rendimiento 63
3b
Descripcioacuten de Compuestos
153
Hidrocloruro de 1-(2-naftil)-3-[3-(4-nitro-2-trifluorometilfenil)-
pirrolidin-3-ilamino]propan-1-ol
Procedimiento experimental
Seguacuten el meacutetodo general E partiendo de 025 g (0546 mmol) de 1-(2-naftil)-3-[3-
(4-nitro-2-trifluorometilfenil)pirrolidin-3-ilamino]propan-1-ona tras la
eliminacioacuten del disolvente se obtiene un aceite que se precipita en forma de
hidrocloruro con eacuteter saturado de HCl
Punto de fusioacuten 180-182ordmC
IR (cm-1) 3422 (m OH) 2951-2793 (d C-H alifaacuteticos) 1580 y 1327 (mf NO2)
1286 y 1122 (f CF3)
RMN-1H (DMSO-d6 400 MHz) δ (ppm) 207-214 (m 2H CHOH-CH2) 229-
231 (m 1H H4ax PIRR) 236-241 (m 1H H4ec PIRR) 311 (sa 2H CHOH-CH2-
CH2) 357-364 (m 1H H2ax PIRR) 375-379 (m 2H H5ax+ H2ec PIRR) 385-389
(m 1H H5ec PIRR) 397 (sa 1H H3 PIRR) 590 (sa 1H CHOH) 576 (s 1H
OH) 710 (d 1H H6rsquo FENIL J6rsquo5rsquo = 87 Hz) 747-755 (m 3H H3 + H6+ H7 NFT)
786 (sa 1H H1 NFT) 790-792 (m 3H H4+ H5+ H8 NFT) 824-890 (d 1H H5rsquo
FENIL J5rsquo6rsquo = 89 Hz) 840 (sa 1H H3rsquo FENIL) 949 (sa 1H NH)
Anaacutelisis elemental (CHN)
HPLC (RP-18 1 mLmin metanol-agua (8020)) 115 min ʎmax= 2238 nm
Calculado Hallado
C 5631 5650
H 492 523
N 821 821
FM C24H24N3F3O3HCl PM 4961 Apariencia Soacutelido anaranjado
Rendimiento 38
3e
Descripcioacuten de Compuestos
154
3-[4-(4-fluorofenil)-36-dihidropiridin-1(2H)-il]-1-(naftalen-2-
il)propan-1-ol
Procedimiento experimental
Seguir el meacutetodo general E partiendo de 030 g (084 mmol) de 3-[4-(4-
fluorofenil)-36-dihidropiridin-1(2H)-il)]-1-(naftalen-2-il)propan-1-ona se
obtiene tras la eliminacioacuten del disolvente un aceite impuro que puede
purificarse por cromatografiacutea flash en diclorometano-metanol (991)
Punto de fusioacuten 127-129ordmC
IR (cm-1) 3510 (d OH) 2833 (m C-H alifaacuteticos)
RMN-1H (CDCl3 400 MHz) δ (ppm) 199-212 (m 2H CHOH-CH2) 264 (s
2H H6 PIRD) 272-296 (m 4H H2+H5 PIRD) 331 (d 2H CHOH-CH2-CH2 JCH-
CH= 167 Hz) 517 (sa 1H CH-OH) 602 (s 1H H3 PIRD) 704 (t 2H H3acute+ H5acute
FENIL J3acute2acute= J5acute6acute= 87 Hz) 737 (dd 2H H2acute+ H6acute FENIL J2acute3acute= J6acute5acute= 87 Hz
J2acuteF= J6acuteF= 54 Hz) 745-750 (m 2H H6 + H7 NFT) 751 (dd 1H H8 NFT J87= 74
Hz J86=16 Hz) 785 (d 2H H3+ H4 NFT J34acute= J43acute=83 Hz) 787 (dd 1H H5
NFT J56= 78 Hz J57=23 Hz) 791 (s 1H H1 NFT)
Anaacutelisis elemental (CHN)
HPLC (RP-18 1 mLmin metanol-agua (8020)) tr 468 min ʎmax 2196 nm
Calculado Hallado
C 7783 7787
H 662 682
N 378 330
FM C24H24NFO PM 3615 Apariencia Soacutelido blanco Rendimiento 23
3g
Descripcioacuten de Compuestos
155
1-(2-naftil)-2-[4-(2-nitro-4-trifluorometilfenil)piperazin-1-il]etan-1-
ol
Procedimiento experimental
Seguacuten el meacutetodo general E partiendo de 038 g (086 mmol) de 1-(2-naftil)-2-[4-
(2-nitro-4-trifluorometilfenil)piperazin-1-il]propan-1-ona se obtiene tras la
eliminacioacuten del disolvente un aceite impuro que se puede purificar
precipitando el compuesto con hexano
Punto de fusioacuten 134ndash135 ordmC
IR (cm-1) 3408 (d OH) 2968-2814 (d C-H alifaacuteticos) 1533 y 1329 (mf NO2)
1230 y 1112 (f CF3)
RMN-1H (DMSO-d6 400 MHz) δ (ppm) 275-281 (m 4H H3+H5 PIPZ) 303
(sa 2H CHOH-CH2) 326-331 (m 2H H2+H6 PIPZ) 504 (dd 1H CHOH) 721
(d 1H H6acute FENIL J6acute5acute = 87 Hz) 749-752 (m 3H H3+H6+H7 NFT) 771 (dd
1H H5acute FENIL J5acute6acute = 87 Hz J5acute3acute = 19 Hz) 786 (sa 1H H1 NFT) 787 (dd 1H
H8 NFT J87 = 79 Hz J86 = 15 Hz) 788 (d 1H H4 NFT J43 = 55 Hz) 790 (sa
1H H5 NFT) 811 (d 1H H3acute FENIL J3acute5acute = 19 Hz)
Anaacutelisis elemental (CHN)
HPLC (RP-18 1 mLmin metanol-agua (8020)) 566 min ʎmax= 2228 nm
Calculado Hallado
C 6202 6226
H 494 512
N 944 914
FM C23H22N3F3O3 PM 4454 Apariencia Soacutelido amarillo Rendimiento 78
4b
Descripcioacuten de Compuestos
156
1-(4-fluoronaftil)-3-[4-(4-nitro-2-trifluorometilfenil)piperazin-1-
il]propan-1-ol
Procedimiento experimental
Seguacuten el meacutetodo general E partiendo de 053 g (107 mmol) de 1-(4-
fluoronaftil)-3-[4-(4-nitro-2-trifluorometilfenil)piperazin-1-il]propan-1-ona se
obtiene tras la eliminacioacuten del disolvente un aceite impuro que se purifica por
cromatografiacutea flash usando como fase moacutevil diclorometanometanol (991)
Punto de fusioacuten 183-184ordmC
IR (cm-1) 3447 (d OH) 2931-2836 (d C-H alifaacuteticos) 1513 y 1338 (f NO2) 1283
y 1119 (f CF3)
RMN-1H (CDCl3 400 MHz) δ (ppm) 206-214 (m 2H CHOH-CH2) 274-280
(m 3H H5 PIPZ+ CHOH-CH2-CH2) 288-294 (m 3H H3 PIPZ+ CHOH-CH2-
CH2) 327 (t 4H H2+H6 PIPZ J23= J65= 467 Hz) 571 (dd 1H CHOH JCH-CH =
81 Hz JCH-CH = 27 Hz) 718 (dd 1H H3 FNFT J3F = 102 Hz J32= 80 Hz) 735
(d 1H H6acute FENIL J6acute5acute = 89 Hz) 767-771 (m 2H H6+H7 FNFT) 769 (dd 1H
H2 FNFT J23 = 79 Hz J2F= 56 Hz) 804 (d 1H H8 FNFT J87 = 80 Hz) 817 (dd
1H H5 FNFT J56 = 76 Hz J5F = 21 Hz) 838 (dd 1H H5acute FENIL J5acute6acute = 89 Hz
J5acute3acute = 27 Hz) 855 (d 1H H3acute FENIL J3acute5acute = 27 Hz)
Anaacutelisis elemental (CHN)
HPLC (RP-18 1 mLmin metanol-agua (8020)) 703 min ʎmax= 2217 nm
Calculado Hallado
C 6038 6015
H 482 486
N 880 878
FM C24H23N3F4O3 PM 4775 Apariencia Cristales amarillos Rendimiento 51
5a
Descripcioacuten de Compuestos
157
1-(4-fluoronaftil)-3-[4-(2-nitro-4-trifluorometilfenil)piperazin-1-
il]propan-1-ol
Procedimiento experimental
Seguacuten el meacutetodo general E partiendo de 049 g (102 mmol) de 1-(4-
fluoronaftil)-3-[4-(2-nitro-4-trifluorometilfenil)piperazin-1-il]propan-1-ona se
obtiene tras la eliminacioacuten del disolvente un aceite impuro que se purifica al
lavarlo con hexano
Punto de fusioacuten 147ndash148 ordmC
IR (cm-1) 3430 (m OH) 2957-2835 (d C-H alifaacuteticos) 1533 y 1330 (mf NO2)
1278 y 1125 (f CF3)
RMN-1H (DMSO-d6 400 MHz) δ (ppm) 208-218 (m 2H CHOH-CH2) 283
(sa 3H H5 PIPZ+ CHOH-CH2-CH2) 295 (sa 3H H3 PIPZ+ CHOH-CH2-CH2)
332 (sa 4H H2+H6 PIPZ) 571 (dd 1H CHOH) 718 (dd 1H H3 FNFT J3F =
102 Hz J32 = 81 Hz) 723 (d 1H H6acute FENIL J6acute5acute = 87 Hz) 754-762 (m 2H
H6+H7 FNFT) 768 (dd 1H H2 FNFT J23 = 80 Hz J2F = 56 Hz) 774 (dd 1H
H5acute FENIL J5acute6acute = 87 Hz J5acute3acute = 19 Hz) 805 (dd 1H H5 FNFT J56 = 82 Hz J5F =
17 Hz) 811 (d 1H H3acute FENIL J3acute5acute = 19 Hz) 817 (dd 1H H8 FNFT J87 = 86
Hz J86 = 29 Hz)
Anaacutelisis elemental (CHN)
HPLC (RP-18 1 mLmin metanol-agua (8020)) 556 min ʎmax= 2222 nm
Calculado Hallado
C 6038 6012
H 482 505
N 881 862
FM C24H23N3F4O3 PM 4775 Apariencia Soacutelido amarillo Rendimiento 90
5b
Descripcioacuten de Compuestos
158
Hidrocloruro de 1-(4-fluoronaft-1-il)-3-[4-(4-trifluorometilfenil)
piperidin-1-il] propan-1-ol
Procedimiento experimental
Seguacuten el meacutetodo general E partiendo de 010 g de 1-(4-fluoronaftalen-1-il)-3-[1-
(4-trifluorometilfenilpiperidin-4-il)amino]propan-1-ona se obtiene tras la
eliminacioacuten del disolvente un aceite impuro que se purifica por cromatografiacutea
flash en diclorometanometanol (991) y se precipita como hidrocloruro con
eacuteter saturado de HCl
Punto de fusioacuten 174-175ordmC
IR (cm-1) 3436 (m OH) 2983 (d C-H alifaacuteticos) 2396 (d HCl) 1333 (f N-C)
1118 (mf CF3)
RMN-1H (DMSO-d6 400 MHz) δ (ppm) 221 (d 2H CHOH-CH2) 320-360
(m 6H CHOH-CH2-CH2+ H3+H5 PIPZ) 355 (sa 2H H2ax+H6ax PIPZ) 397 (sa
2H H2ec+H6ec PIPZ) 541 (d 1H CH-OH JCH-CH=75 Hz) 590 (sa 1H OH) 713
(d 2H H6acute+H2acute FENIL J6acute5acute= J2acute3acuteacute= 81 Hz) 736 (dd 1H H3 FNFT J32= 82 Hz
J3F= 97 Hz) 756 (d 2H H6+H7 FNFT J67= J76acute= 84 Hz) 767 (sa 3H H2
FNFT+H3acute+H5acute FENIL) 810 (d 1H H5 FNFT J56 = 66 Hz) 829 (d 1H H8
FNFT J87= 88 Hz) 1112 (sa 1H HCl)
Anaacutelisis elemental (CHN)
HPLC (RP-18 1 mLmin metanol-agua (8020)) 850 min ʎmax= 2266 nm
Calculado Hallado
C 6147 6135
H 539 482
N 598 596
FM C24H24N2F4OHCl PM 4690 Apariencia Soacutelido blanco Rendimiento 45
5c
Descripcioacuten de Compuestos
159
1-(4-fluoronaft-1-il)-3-[1-(4-nitro-2-trifluorometilfenilpiperidin-4-
il)amino]propan-1-ol
Procedimiento experimental
Seguacuten el meacutetodo general E partiendo de 04106 g (084 mmol) de 1-(4-
fluoronaft-1-il)-3-[1-(4-nitro-2-trifluorometilfenilpiperidin-4-il)amino] propan-1-
ona se obtiene tras la eliminacioacuten del disolvente un aceite impuro que se
purifica por cromatografiacutea flash en diclorometanometanol (991)
Punto de fusioacuten 93-95ordmC
IR (cm-1) 3352 (m OH) 1524 y 1318 (mf NO2) 1280 y 1171 (f CF3)
RMN-1H (CDCl3 400 MHz) δ (ppm) 168-183 (m 2H H3ax+ H5ax PIPR) 186-
201 (m 2H CHOH-CH2) 215-223 (m 2H H3ec+H5ec PIPR) 212 (d 1H CH-
OH JCH-CH= 127 Hz) 275-284 (m 1H H4 PIPR) 298 (t 2H H2ax+ H6ax PIPR
J2ax2ec = J6ax6ec = 115 Hz) 300-303 (m 1H CHOH-CH2-CH2) 308-315 (m 1H
CHOH-CH2-CH2) 342 (d 2H H2ec+H6ec PIPR) 571 (dd 1H CHOH JCHCH =
82 Hz JCH-CH2 = 23 Hz) 717 (dd 1H H3 FNFT J3F = 102 Hz J32 = 81 Hz)
727-730 (m 1H H6acute FENIL) 753-761 (m 2H H6+H7 FNFT) 767-772 (m 1H
H2 FNFT) 804 (d 1H H8 FNFT J87 = 78 Hz) 816 (dd 1H H5 FNFT J56 =72 Hz
J5F = 33 Hz ) 833 (dd 1H H5acute FENIL J5acute6acute = 90 Hz J5acute3acute = 27 Hz ) 853 (d 1H
H3acute FENIL J3acute5acute = 27 Hz)
Anaacutelisis elemental (CHN)
HPLC (RP-18 1 mLmin metanol-agua (8020)) tr 464 min ʎmax 2230 nm
Calculado Hallado
C 6111 6077
H 543 543
N 855 830
FM C25H25N3O3F4 PM 4910 Apariencia Soacutelido amarillo Rendimiento 90
5f
Descripcioacuten de Compuestos
160
1-(4-fluoronaftalen-1-il)-3-[4-(4-fluorofenil)-36-dihidropiridin-
1(2H)-il]propan-1-ol
Procedimiento experimental
Seguacuten el meacutetodo general E partiendo de 043 g (114 mmol) de 1-(4-
fluoronaftalen-1-il)-3-[4-(4-fluorofenil)-36-dihidropiridin-1(2H)-il]propan-1-
ona se obtiene tras la eliminacioacuten del disolvente un soacutelido blanco que precipita
con hexanoeacuteter
Punto de fusioacuten 162-163ordmC
IR (cm-1) 2828 (d C-H alifaacuteticos) 1509 (f F-BZN) 1227 (mf F-NFT)
RMN-1H (DMSO-d6 400 MHz) δ (ppm) 214-220 (m 2H CHOH-CH2) 273
(sa 2H H6 PIRD) 284-312 (m 4H CHOH-CH2-CH2+H5 PIRD) 341 (d 1H
H2ax PIRD J2ax 2ec=164 Hz) 347 (d 1H H2ec PIRD J2ec2ax=161 Hz) 574 (sa 1H
CHOH) 600-605 (m 1H H3 PIRD) 700-708 (m 2H H2acute+H6acute FENIL) 718 (dd
1H H3 FNFT J3F= 102 Hz J32 = 81 Hz) 735-740 (m 2H H6+H7 FNFT) 754-
761 (m 2H H5acute+H3acute FENIL) 770 (dd 1H H2 FNFT J23= 80 Hz J2F = 56 Hz)
807 (d 1H H5 FNFT J56 = 82 Hz) 82 (dd 1H H8 FNFT J87= 70 Hz J86 = 25
Hz)
Anaacutelisis elemental (CHN)
Calculado Hallado
C 7595 7525
H 606 645
N 369 350
FM C24H23NF2O PM 3792 Apariencia Soacutelido blanco Rendimiento 82
5g
Descripcioacuten de Compuestos
161
Hidrocloruro de 1-(4-fluorofenil)-3-[4-(4-nitro-2-
trifluorometilfenilpiperazin-1-il]propan-1-ol
Procedimiento experimental
Seguacuten el meacutetodo general E partiendo de 036 g (107 mmol) de 1-(4-fluorofenil)-
3-[4-(4-nitro-2-trifluorometilfenil)piperazin-1-il]propan-1-ona se obtiene tras la
eliminacioacuten del disolvente un aceite impuro que se precipita con hexanoeacuteter
El soacutelido que se obtiene se lava con eacuteter saturado de HCl
Punto de fusioacuten 163-165ordmC
IR (cm-1) 3348 (m OH) 2928-2848 (d C-H alifaacuteticos) 1519 y 1352 (f NO2) 1284
y 1120 (f CF3)
RMN-1H (DMSO-d6 400 MHz) δ (ppm) 209 (sa 2H CHOH-CH2) 315-320
(m 4H H3+H5 PIPZ) 335-344 (m 4H H2+H6 PIPZ) 360 (sa 2H CHOH-CH2-
CH2) 469 (s 1H CHOH) 565 (s 1H OH) 718 (t 2H H3+H5 FBZN J32 = J56=
81 Hz) 742 (dd 2H H2+H6 FBZN J23 = J65= 80 Hz J2Facute= J6F= 66 Hz) 764 (d
1H H6acute FENIL J6acute5acute = 90 Hz) 842 (s 1H H3acute FENIL) 847 (d 1H H5acute FENIL
J5acute6acute = 88 Hz) 1120 (sa 1H HCl)
Anaacutelisis elemental (CHN)
HPLC (RP-18 1 mLmin metanol-agua (8020)) tr 206 min ʎmax 2011 nm
Calculado Hallado
C 4984 4950
H 477 476
N 872 863
FM C20H21N3F4O3HCl PM 4659 Apariencia Soacutelido amarillo Rendimiento 20
6a
Descripcioacuten de Compuestos
162
Hidrocloruro de 1-(4-fluorofenil)-3-[1-(4-nitro-2-
trifluorometilfenil)piperidin-4-il)amino]propan-1-ol
Procedimiento experimental
Seguacuten el meacutetodo general E partiendo de 010 g (021 mmol) de 1-(4-fluorofenil)-
3-[1-(4-nitro-2-trifluorometilfenilpiperidin-4-il)amino]propan-1-ona se obtiene
en la eliminacioacuten del disolvente un aceite impuro que se purifica como
hidrocloruro lavando con eacuteter saturado de HCl
Punto de fusioacuten 185-187ordmC
IR (cm-1) 3425 1498 y 1334 (mf NO2) 1283 (mf F BZN)1283 y 1106 (f CF3)
RMN-1H (DMSO-d6 400 MHz) δ (ppm) 138 (sa 2H H3ax+ H5ax PIPR) 170
(sa 2H H3ec+H5ec PIPD) 190 (d 2H CHOH-CH2 JCH-CH= 110 Hz) 258 (sa 1H
H4 PIPR) 263-264 (m 2H H2ax+ H6ax PIPR) 295 (t 2H H2ec+H6ec PIPR J2ec2ax =
J6ec6ax = 121 Hz) 320-330 (m 2H CHOH-CH2-CH2) 469 (t 1H CHOH JCHOH-
CHCH = 90 Hz) 713 (t 2H H3+H5 FBZN J32 = J56= 81 Hz) 736 (sa 2H H2+H6
FBZN) 750 (d 1H H6acute FENIL J6acute5acute = 80 Hz) 837 (sa 2H H3acute+H5acute FENIL)
Anaacutelisis elemental (CHN)
HPLC (RP-18 1 mLmin metanol-agua (8020)) tr 1977 min ʎmax 2011 nm
Calculado Hallado
C 5251 5213
H 503 491
N 880 849
FM C21H23N3F4O3HCl PM 4799 Apariencia Soacutelido amarillo Rendimiento 11
6f
Descripcioacuten de Compuestos
163
1-(4-fluorofenil)-3-[4-(4-fluorofenil)-36-dihidropiridin-1(2H)-
il]propan-1-ol
Procedimiento experimental
Seguir el meacutetodo general E partiendo de 090 g (027 mmol) de 1-(4-fluorofenil)-
3-(4-(4-fluorofenil)-56-dihidropiridin-1(2H)-il)propan-1-ona y se obtiene tras la
eliminacioacuten del disolvente un aceite impuro que se purifica por cromatografiacutea
flash en diclorometanometanol (991) El soacutelido obtenido se recristaliza de
hexano para su total purificacioacuten
Punto de fusioacuten 199-201ordmC
RMN-1H (DMSO-d6 400 MHz) δ (ppm) 176-180 (m 2H CHOH-CH2) 245
(sa 4H CHOH-CH2-CH2+H5 PIRD) 257-262 (m 2H H6 PIRD) 306 (sa 2H
H2 PIRD) 466 (t 1H CHOH JCH-OH=63 Hz) 549 (sa 1H OH) 612 (sa 1H H3
PIRD) 714 (dd 4H H3acute+H5acute FENIL+ H3+H5 FBZN J3acuteF= J5acuteF= J3F= J5F = 126 Hz
J3acute2acute= J5acute6acute= J32= J56 = 80 Hz) 737 (dd 2H H2+H6 FBZN J23= J65= 79 Hz J2F=
J6F= 60 Hz) 746 (dd 2H H2acute+H6acute FENIL J2acute3acute= J6acute5acute= 77 Hz J2acuteF= J6acuteF= 55 Hz)
Anaacutelisis elemental (CHN)
Calculado Hallado
C 7242 7196
H 634 633
N 422 403
FM C20H21NF2O PM 3314 Apariencia Soacutelido blanco Rendimiento 2
6g
Descripcioacuten de Compuestos
164
3-[4-(4-fluorofenil)-36-dihidropiridin-1(2H)-il]-1-(4-
trifluorometilfenil)propan-1-ol
Procedimiento experimental
Seguacuten el meacutetodo general E partiendo de 013 g (034 mmol) de 1-(4-
fluoronaftalen-1-il)-3-[1-(4-nitro-2-trifluorometilfenilpiperidin-4-
il)amino]propan-1-ona se obtiene tras la eliminacioacuten del disolvente se obtiene
un soacutelido blanco que se lava con hexano eacuteter y se recristaliza de hexano
Punto de fusioacuten 116-117ordmC
IR (cm-1) 2912- 2761 (C-H alifaacuteticos) 1511 (f F) 1328 y 1127 (f CF3)
RMN-1H (DMSO-d6 400 MHz) δ (ppm) 181 (dd 2H CHOH-CH2 JCH-CH=
137 Hz JCH-CHOH= 73 HZ) 245-250 (m 4H CHOH-CH2-CH2+H5 PIRD) 262 (t
2H H6 PIRD JCH-CH= JCH-CH=55 Hz) 308 (s 2H H2 PIRD) 475-480 (m 1H
CHOH) 570 (sa 1H OH) 612 (s 1H H3 PIRD) 715 (t 2H H5acute+H3acute FENIL
J5acuteF=J3acuteF= 88 Hz J5acute6acute= J3acute2acute =88 Hz) 747 (dd 2H H6acute+H2acute FENIL J6acute5acute=J2acute3acute= 84
Hz J6acuteF= J2acuteF =56 Hz) 757 (d 2H H2+H6 TFBZN J23acute=J65= 79 Hz) 768 (d 2H
H3+H5 TFBZN J32acute=J56= 81 Hz)
Anaacutelisis elemental (CHN)
HPLC (RP-18 1 mLmin metanol-agua (8020)) tr 1027 min ʎmax 2418 nm
Calculado Hallado
C 6649 6601
H 554 567
N 370 381
FM C21H21NF4O
PM 379 Apariencia Agujas blancas Rendimiento 40
7g
Descripcioacuten de Compuestos
165
X4 Siacutentesis de Oximas (Serie 8)
1-(naftalen-2-il)-3-[4-(2-nitro-4-trifluorometilfenil)piperazin-1-
il]propan-1-oxima
Procedimiento experimental
Seguacuten el meacutetodo general F partiendo de 023 g (050 mmol) de 1-(2-naftil)-3-[4-
(2-nitro-4-trifluorometilfenil)piperazin-1-il]propan-1-ona se obtiene tras la
eliminacioacuten del disolvente un aceite impuro que se purifica por columna
cromatograacutefica con diclorometanometanol (973)
Punto de fusioacuten 185-187 ordmC
IR (cm-1) 1560 y 1328 (mf NO2) 1283 y 1120 (f CF3)
RMN-1H (DMSO-d6 400 MHz) δ (ppm) 254-264 (m 6H CNOH-CH2-
CH2+H3+H5 PIPZ) 303-309 (m 2H CNOH-CH2) 311-317 (m 4H H2+H6
PIPZ) 743 (d 1H H6acuteFENIL J6acute5acute= 88 Hz) 751-756 (m 2H H6+H7 NFT) 784
(dd 1H H5acute FENIL J5acute6acuteacute= 88 Hz J5acute3acuteacute= 17 Hz) 788-793 (m 3H H4+H5+H8
NFT) 798-802 (m 1H H3 NFT) 814 (sa 2H H1 NFT+H3acute FENIL) 1140 (sa
1H OH)
Anaacutelisis elemental (CHN)
HPLC (RP-18 1 mLmin metanol-agua (8020)) tr 464 min ʎmax 2391 nm
Calculado Hallado
C 6102 6114
H 487 521
N 1186 1163
FM C24H23N4F3O3 PM 4720 Apariencia Soacutelido camel Rendimiento 54
81
Descripcioacuten de Compuestos
166
1-(2-naftil)-3-[3-(4-nitro-2-trifluorometilfenil)pirrolidin-3-
ilamino]propan-1-oxima
Procedimiento experimental
Seguir el meacutetodo general F partiendo de 0350 g (0769 mmol) de 1-(2-naftil)-3-
[3-(4-nitro-2-trifluorometilfenil)pirrolidin-3-ilamino]propan-1-ona se obtiene
tras la eliminacioacuten del disolvente un soacutelido anaranjado que se lava con
diclorometano y eacuteter etiacutelico obtenieacutendose el compuesto puro
Punto de fusioacuten 129 - 130ordfC
IR (cm-1) 3441 (d OH) 2951-2834 (d C-H alifaacuteticos) 1503 y 1323 (mf NO2)
1285 y 1112 (f CF3)
RMN-1H (DMSO-d6 400 MHz) δ (ppm) 178-185 (m 1H H4ax PIRR) 202-209
(m 1H H4ec PIRR) 221 (sa 1H -NH-) 270-282 (m 2H CNOH-CH2-CH2) 300
(t 2H CNOH-CH2) 325 (dd 1H H3 PIRR) 343-351 (m 2H H2ax+ H2ec PIRR)
358-361 (m 2H H5 PIRR) 697 (d 1H H6acute FENIL J6acute5acute = 96 Hz) 751 (d 1H
H5 NFT J56 = 61 Hz) 752 (d 1H H8 NFT J87 = 61 Hz) 786 (sa 2H H3+H4
NFT) 788-794 (m 2H H6+H7 NFT) 813 (sa 1H H1 NFT) 815 (dd 1H H5acute
FENIL J5acute6acute = 94 Hz J5acute3acute = 27 Hz) 835 (d 1H H3acute FENIL J3acute5acute = 27 Hz)
Anaacutelisis elemental (CHN)
HPLC (RP-18 1 mLmin metanol-agua (8020)) 365 min ʎmax= 2360 nm
Calculado Hallado
C 5987 5954
H 502 474
N 1164 1157
FM C24H23N4O3F3 PM 472 Apariencia Soacutelido amarillo Rendimiento 45
82
Descripcioacuten de Compuestos
167
X5 Purificacioacuten de compuestos por cromatografiacutea flash
La cromatografiacutea flash ha sido utilizada como meacutetodo de purificacioacuten de
muchos de los compuestos de este trabajo Las condiciones elegidas para la
purificacioacuten han sido
- Fase Estacionaria Columnas de Siacutelica gel Rf RediSepreg de tamantildeo de
partiacutecula entre 35 y 70 micras y tamantildeo de poro 60 Aring
- Fase Moacutevil Diclorometanometanol de flujo isocraacutetico linear (Figuras 51 y
52) con un volumen de equilibrado de 20 mL
- Longitud de onda de deteccioacuten 254 nm en todas las muestras y 365 nm en
los compuestos que contienen el grupo naftaleno
- Tipo de muestra Liacutequidas cuando no
son muy complejas y soacutelidas cuando se
trata de purificacioacuten de mezclas
complejas e hidrocloruros
Figura 51 Informe graacutefico de la purificacioacuten compuesto 023
Figura 52 Informe graacutefico de la purificacioacuten compuesto 5f
De los 47 compuestos sintetizados 23 han sido purificados mediante
cromatografiacutea flash Este meacutetodo ha supuesto una mejora y simplificacioacuten del
proceso de siacutentesis asiacute como un ahorro de costes por la reduccioacuten de tiempos
solventes y residuos La purificacioacuten del resto ha sido realizada por
precipitacioacuten como hidrocloruros lavado del compuesto con hexanoeacuteter o
recristalizacioacuten con hexano
Tabla 3
Condiciones de trabajo empleadas en la figuras 51 y 52
Tiempo (min)
Metanol (B)
Teacutecnica de flujo
Compuesto 023
10 00 Isocraacutetico
1 25 Linear
15 25 Isocratico
1 5 Linear
30 5 isocraacutetico
Compuesto 5f
5 0 Isocraacutetico
1 25 Linear
15 25 Isocratico
1 5 Linear
30 5 isocraacutetico
Descripcioacuten de Compuestos
168
X6 Elucidacioacuten estructural de compuestos por RMN
Todos los compuestos sintetizados han sido identificados a traveacutes de teacutecnicas
de CCF IR y RMN-1H Los compuestos finales han sido caracterizados ademaacutes
mediante anaacutelisis elemental de CHN De este modo se ha podido determinar
inequiacutevocamente las estructuras orgaacutenicas de las moleacuteculas obtenidas y formar
un ldquoficha de identidadrdquo de cada compuesto
X61 Elucidacioacuten estructural para los derivados de piperazina
En el caso de que las teacutecnicas anteriores fueran insuficientes para la
caracterizacioacuten exacta de la moleacutecula se han empleado teacutecnicas
complementarias de RMN como RMN-13C 2D 1H-1H COSY y 2D HMQC Este
ha sido el caso del compuesto 5a (figura 53)
Figura 53 Estructura molecular del compuesto 5a ejemplo escogido para un anaacutelisis maacutes exhaustivo mediante experimentos de RMN
La espectroscopia de RMN revela el nuacutemero de hidroacutegenos o carbonos de la
moleacutecula y su posible posicioacuten A traveacutes de los distintos experimentos esta
teacutecnica permite identificar y asignar los distintos protones y carbonos presentes
en la moleacutecula mediante el anaacutelisis de los desplazamientos y multiplicidades
que muestra cada uno de ellos
Figura 54 RMN-1H del compuesto 5a
Descripcioacuten de Compuestos
169
Zona alifaacutetica
En la zona de hidroacutegenos alifaacuteticos se observan cuatro sentildeales
Figura 55 Regioacuten alifaacutetica de la RMN-1H
Los hidroacutegenos alifaacuteticos aparecen a desplazamientos bajos porque estaacuten
muy apantallados
El C1 es un carbono terciario y por tanto tiene un hidroacutegeno muy
desapantallado por el efecto del grupo OH dando una sentildeal a altos ppm como
queda sentildealada en naranja en la figura 55 Esta asignacioacuten facilita el poder
asociar los picos sentildealados en morado (Figura 55) con el metileno vecino C2 ya
que aparece a bajos ppm debido a su aumentado caraacutecter alifaacutetico El multiplete
obtenido integrado por dos hidroacutegenos aparece a 210 ppm Mediante el
espectro COSY (Figura 56) se puede comprobar siguiendo el trazado naranja
coacutemo siendo la sentildeal de CHOH la de 571 ppm se acopla con ella uacutenicamente la
de su vecino CHOH-CH2
Los hidroacutegenos pertenecientes al ciclo de piperazina se diferencian entre siacute por
el desplazamiento de las sentildeales seguacuten esteacuten maacutes o menos cercanos al grupo
fenilo Asiacute los protones H3p y H5p son los que aparecen a menores ppm A 277
ppm y a 291 ppm aparecen dos multipletes (sentildealados con azul en la figura 55)
que integran a tres hidroacutegenos cada uno lo cual resulta extrantildeo ya que en la
moleacutecula no hay ninguacuten CH3 Esto se debe a la diastereotopiacutea del carbono
hidroxiacutelico que hace que los 4 hidroacutegenos salgan divididos en dos sentildeales que
integran a dos hidroacutegenos cada una y a ambas se les suma uno de los
hidroacutegenos del C3 alifaacutetico Esto hace que aparezcan dos sentildeales que integran a
tres hidroacutegenos correspondientes a 2H3p 2H5p y los dos hidroacutegenos alifaacuteticos
Descripcioacuten de Compuestos
170
de C3 Si se siguen ahora las
liacuteneas moradas de la figura
55 se corrobora la
informacioacuten de que los
protones del C3 salen unidos
a las sentildeales de los protones
de H3 y H5 porque hay un
acoplamiento entre el C2 y
esas sentildeales
Figura 56 Espectro COSY Acoplamientos entre metilenos
Por uacuteltimo a 327 ppm se encuentra la sentildeal marcada con verde (figura 55)
correspondiente a 2H2 y 2H6 que integra por cuatro hidroacutegenos y aparece como
triplete debido a los acoplamientos con 2H3 y 2H5
Zona aromaacutetica
En esta moleacutecula se encuentran 9 hidroacutegenos aromaacuteticos no equivalentes lo
que dificulta la asignacioacuten de las sentildeales Como en el apartado anterior se
recurriraacute para estudiar los acoplamientos protoacuten-protoacuten y protoacuten-carbono a la
resonancia magneacutetica nuclear en dos dimensiones con el fin de asignar
inequiacutevocamente cada sentildeal
Figura 57 Resonancia magneacutetica nuclear de protoacuten de la zona aromaacutetica de la moleacutecula 5a
La dificultad de la asignacioacuten en esta moleacutecula se ve aumentada por la
presencia de un aacutetomo de fluacuteor en la parte del naftaleno En el espectro de
Descripcioacuten de Compuestos
171
RMN-1H el aacutetomo de fluacuteor no produce sentildeal pero siacute acoplamientos con los
hidroacutegenos vecinos obtenieacutendose constantes de acoplamiento (J) bastantes altas
y sentildeales desdobladas no esperadas en protones de su entorno
En la figura 57 lo primero que se observa son los altos desplazamientos de los
hidroacutegenos aromaacuteticos debido al menor apantallamiento de estos por su
naturaleza aromaacutetica
Teoacutericamente el espectro deberiacutea tener un singlete claro perteneciente a H3acute
pero no se encuentra ninguno en la figura 57 Asiacute que se puede pensar en un
desdoblamiento de la sentildeal por acoplamiento deacutebil a larga distancia con el H5acute
lo que mostrariacutea un doblete con acoplamiento muy bajo
En el espectro se encuentran tres dobletes sencillos Con las constantes de
acoplamiento a 850 ppm se ve este doblete que integra por uno y que tiene
una J = 27 Hz El otro doblete se encuentra a 804 ppm con una J = 80 Hz y el
maacutes bajo estaacute en 735 ppm con una J = 89 Hz Por el razonamiento inicial la
sentildeal a 850 ppm es la que deberiacutea asociarse con un acoplamiento a larga
distancia y por tanto con H3acute Esta informacioacuten puede ser contrastada con el
COSY
En el espectro bidimensional COSY se ha marcado en rojo el uacutenico
acoplamiento de H3acute que solo
pueda asociarse con la sentildeal
de H5acute Por tanto el doble
doblete a 838 ppm sentildealado
en la figura 56 de azul se
corresponde con H5acute
(informacioacuten verificada por
su constante de acoplamiento
menor J = 27Hz igual a la de
H3acute)
Figura 58 Espectro COSY de la zona aromaacutetica de la moleacutecula
Si ahora se sigue la liacutenea azul de la figura 58 donde se sentildealan los
acoplamientos de H5acute se puede ver un acoplamiento mayor con su uacutenico
hidroacutegeno vecino H6acute Asiacute tambieacuten queda asignada la sentildeal de este uacuteltimo que
se puede comprobar por comparacioacuten de las constantes de acoplamiento
(J5acute6acute=89 Hz y J6acute5acute=90 Hz)
Descripcioacuten de Compuestos
172
Para asignar los hidroacutegenos del naftaleno se debe tener en cuenta la presencia
del aacutetomo de fluacuteor De esta forma para los hidroacutegenos H2 H3 y H5 se puede
establecer teoacutericamente
que no se veraacuten como
dobletes sino dobles
dobletes en el espectro
de protoacuten En el COSY
(Figura 58) para una
primera aproximacioacuten
se seleccionan los tres
dobles dobletes de
protoacuten que solo tengan
un acoplamiento
Figura 59 Espectro COSY Zona aromaacutetica de la moleacutecula
Seguacuten la posicioacuten de H2 y H3 con por efecto del fluacuteor de la moleacutecula ademaacutes de
ser dobles dobletes el espectro COSY (Figura 58) debe mostrar dos sentildeales que
se acoplan entre ellas Por lo que se deduce que estos protones seraacuten los
sentildealados en azul y morado (figura 57) Si se recurre ahora a los valores de
acoplamiento se justifica la asignacioacuten ya que la sentildeal morada a 770 ppm
tiene una J = 79 Hz que se corresponde con la J = 81 Hz de la sentildeal azul a 720
ppm Ademaacutes estas sentildeales por la proximidad del fluacuteor tienen un segundo
valor de acoplamiento que en el caso de H3 seraacute muy alto y en H2 menor De
este modo se concluye que la sentildeal a 770 ppm corresponde a H2 y la sentildeal a
720 ppm a H3
La continuacioacuten de la asignacioacuten se centra en H6 y H7 Estos dos protones
teoacutericamente produciraacuten sentildeales como miacutenimo con multiplicidad de triplete ya
que son los uacutenicos que presentan tres protones diferentes en su entorno Como
no hay ninguacuten triplete en el espectro podemos pensar que sus sentildeales pudieran
aparecer juntas en el multiplete que se observa sentildealado en verde en la figura
57 a 750 ppm
Por otro lado queda por asociar las sentildeales a 817 ppm y a 804 ppm (Figura
57) correspondientes a un doble doblete y un doblete respectivamente Los
protones que quedan por asignar son H5 y H8 Se podriacutea pensar que H8 seriacutea un
doblete y H5 un doble doblete por efecto del fluacuteor como el caso de H2 Si se
estudian las J se verifica esta informacioacuten ya que la sentildeal a 817 ppm tiene una
constante de acoplamiento de 21 Hz muy pequentildea para pertenecer a un
Descripcioacuten de Compuestos
173
acoplamiento protoacutenndashprotoacuten aromaacutetico Por tanto se asigna a un acoplamiento a
larga distancia del H5 con
el fluacuteor sustituido en
posicioacuten 4 del NFT
Recurriendo al espectro
COSY (Figura 60) se
puede visualizar y
verificar estas cuatro
asignaciones ya que en
caso de ser correctas
deben acoplarse las
sentildeales doblete con el
uacutenico multiplete
Figura 60 Espectro COSY para la asignacioacuten de los H del naftaleno
Identificados todos los hidroacutegenos de la moleacutecula si se recurre ahora al
espectro HMQC (Figura 61) se pueden asignar directamente los carbonos no
cuaternarios presentes en la estructura esto se debe a que este experimento
bidimensional muestra el acoplamiento entre cada carbono y los protones
directamente unidos al mismo
Lo anterior se realiza siguiendo las liacuteneas de unioacuten entre el eje horizontal
espectro de RMN- 1H y el vertical que es el espectro de RMN-13C
Figura 61 Espectro HMQC Acoplamientos protoacuten-carbono
Descripcioacuten de Compuestos
174
Las asignaciones quedan de la siguiente forma
Zona aromaacutetica
C2
FNFT
C3
FNFT
C5
FNFT
C6
FNFT
C7
FNFT
C8
FNFT
C3
FENIL
C5
FENIL
C6
FENIL
RMN-
13C
(ppm)
12320 10912 12840 12725 12611 12311 12180 12491 12332
RMN-
1H
(ppm)
770 720 817 750 750 804 805 838 735
Zona alifaacutetica
C1
alifaacutetico
C2
alifaacutetico
C3
alifaacutetico C2 PIPZ C3 PIPZ C5 PIPZ C6 PIPZ
RMN-13C
(ppm) 7232 3295 5743 5350 5310 5310 5350
RMN-1H
(ppm) 571 210
Ha 290
Hb 278 291 327 327 270
De esta forma queda correctamente determinada la estructura de la moleacutecula
Con el anaacutelisis elemental (CHN) en uacuteltimo lugar se verifica el compuesto y se
determina la pureza del mismo
Descripcioacuten de Compuestos
175
X62 Elucidacioacuten estructural para los derivados de piperidina
El compuesto que se ha tomado como referencia en este caso es el 5f Se trata
de un derivado de FNFT que tiene como amina central una amino piperidina
En la figura 62 se muestra la estructura plana de la moleacutecula con los carbonos
alifaacuteticos diferenciados
Figura 62 Estructura del compuesto 5f con los diferentes carbonos alifaacuteticos coloreados
El espectro de protoacuten del compuesto se muestra en la figura 62
Figura 63 Resonancia de protoacuten del compuesto 5f
Por pertenencia al mismo grupo estructural el derivado 5f y el 5a tienen en
comuacuten los grupos aromaacuteticos de la estructura en consecuencia la zona
aromaacutetica de la moleacutecula ya ha quedado elucidada en el apartado anterior En
este apartado los estudios se centran en la descripcioacuten y asignacioacuten de sentildeales
de la regioacuten alifaacutetica que corresponden a la aminopiperidina En la figura 64 se
han destacado en distintos colores las diferentes sentildeales correspondientes a los
carbonos alifaacuteticos de la moleacutecula 5f
Descripcioacuten de Compuestos
176
Figura 64 Ampliacioacuten zona alifaacutetica de la resonancia de protoacuten del compuesto 5f
Para comenzar con la explicacioacuten de la asignacioacuten se revisa en primer lugar el
espectro DEPT-135 (Figura 65) de resonancia de la zona alifaacutetica donde quedan
diferenciados los carbonos terciarios que dan lugar a sentildeales positivas de los
secundarios que dan lugar a sentildeales negativas
Figura 65 DEPT 135 de la regioacuten aromaacutetica del compuesto 5f Coloreados los carbonos terciarios
En el espectro quedan sentildealados los carbonos terciarios que corresponden al
C1 y a C4p Los
desplazamientos se
mantienen en el espectro de
RMN-13C simple por lo que
en el espectro de HMQC se
puede obtener a queacute
hidroacutegenos van asociadas
las sentildeales de esos carbonos
(Figura 66)
Figura 66 HMQC alifaacutetica asignacioacuten de los carbonos terciarios
Descripcioacuten de Compuestos
177
Al trazar las liacuteneas de unioacuten se observa que la sentildeal de carbono a mayores ppm
corresponde con la de un H que integra a uno y que corresponde a la sentildeal que
aparece a mayores ppm Los H de C1 estaacuten muy desapantallados por el efecto
del OH asiacute la sentildeal a 571 ppm del espectro de protoacuten (Figura 64) corresponde al
CHOH De esta forma la otra sentildeal del C terciario corresponde con el H4 asiacute
trazando una liacutenea amarilla en el HMQC se puede asignar con seguridad la
sentildeal de ese H
Seguacuten el DEPT-135 (Figura 65) en torno a 30 ppm se pueden ver dos singletes
muy proacuteximos que corresponden a dos C secundarios y en torno a 50 ppm
aparece un singlete que integra dos sentildeales Seguacuten la estructura del compuesto
hay cuatro carbonos equivalentes dos a dos los CH2 y CH2 de la piperidina
que aparecen como singletes muy proacuteximos
Los carbonos C2p y C6p (H2+H6) aparecen a desplazamientos mayores como
C4p En el espectro de carbono el desplazamiento a 5230 ppm cumple estas
especificaciones y por tanto puede ser asignado a los CH2 En el HMQC
(Figura 67) al trazar una liacutenea verde desde RMN-13C al RMN-1H para unir las
sentildeales de acoplamiento C-H se comprueba que hay dos acoplamientos de
protoacuten con el mismo carbono Esta situacioacuten se produce porque los hidroacutegenos
de los metilenos no son equivalentes ya que espacialmente se disponen en
planos axiales y ecuatoriales seguacuten se representa en la figura 67
Figura 67 HMQC del compuesto 5f asignacioacuten H piperidina
Descripcioacuten de Compuestos
178
En la disposicioacuten espacial de miacutenima energiacutea en el vaciacuteo (Figura 68) los
hidroacutegenos de los carbonos de piperazina se disponen en diferentes planos Los
H axiales se encuentran
perpendiculares al plano del ciclo de
amina y los H ecuatoriales se
disponen en el mismo plano lo que
produce cambios en el entorno
quiacutemico que quedan reflejados en el
espectro de protoacuten (Figura 64)
Figura 68 Imagen 3D del compuesto 5f obtenida con Chemdraw 3D
La disposicioacuten adoptada hace que los H axiales esteacuten maacutes cerca entre siacute y se
produzcan acoplamientos fuertes con los H axiales vecinos y deacutebiles con los H
ecuatoriales del carbono al que pertenecen En el caso de los H ecuatoriales los
acoplamientos que se generan son deacutebiles con el H en axial del carbono propio
y en ocasiones acoplan muy deacutebilmente con los H ecuatoriales de carbonos
vecinos ya que se encuentran maacutes alejados Por esto en el espectro de esta
moleacutecula no se obtiene una uacutenica sentildeal que integra por cuatro hidroacutegenos sino
que se obtienen dos sentildeales que integran a dos H y que tienen distintas
multiplicidades
En el espectro de protoacuten en HMQC (Figura 67) siguiendo la liacutenea verde que
muestra el acoplamiento de C2p y C6p con los H se ven dos sentildeales a 342 ppm
y 291 ppm La sentildeal a 342 ppm es un doblete ancho con una J =121Hz que
seguacuten lo explicado corresponde a los CH2 (H2+H6) ecuatoriales El H2ec (y por
analogiacutea H6ec) se acopla solo con H2ax la amplitud de la sentildeal podriacutea explicarse
por el acoplamiento deacutebil con H3ec La sentildeal a 291 ppm es un triplete que se
asocia a H2 Y H6 axial ya que H2ax de acoplamientos fuertes con H3ax y H2ec
Las sentildeales de carbonos en 3274 ppm y 3303 ppm corresponden a los CH2 (H3
y H5) Por el razonamiento seguido para los metilenos 2 y 6 las sentildeales a 210
ppm y 160 ppm en el espectro de protoacuten corresponden a los H ecuatoriales y
axiales respectivamente
Los carbonos de la cadena alifaacutetica quedan asignados tambieacuten en base a los
desplazamientos del RMN-13C El C2 estaacute maacutes apantallado por el caraacutecter
alifaacutetico del entorno por lo que de las dos sentildeales que quedan por asignar la
que se obtiene a 3676 ppm corresponde al CHOH-CH2
Descripcioacuten de Compuestos
179
En el espectro HMQC (Figura 69) se obtiene para esta sentildeal CHOH-CH2
varios acoplamientos
correspondientes a
diferentes sentildeales
muacuteltiples a 200 ppm
y 212 ppm en el
espectro de protoacuten
Esto se debe tambieacuten
a la disposicioacuten
espacial de ambos H
como ocurre en el
caso de los H de la
amina
Figura 69 HMQC Asignacioacuten de los carbonos del puente de metilenos
Las sentildeales que quedan sin asignar pertenecen a C3 (sentildealado en rosa en la
figura CH2) a 4575 ppm que seguacuten el HMQC corresponde a los dos protones
que dan sentildeales como multipletes a 310 ppm y 300 ppm
La asignacioacuten de las sentildeales queda de la siguiente manera
Zona aromaacutetica
C2
FNFT
C3
FNFT
C5
FNFT
C6
FNFT
C7
FNFT
C8
FNFT
C3
FENIL
C5
FENIL
C6
FENIL
RMN-13C
(ppm) 12320 10912 12840 12725 12611 12311 12180 12491 12332
RMN-1H
(ppm) 770 720 817 750 750 804 805 838 735
Zona alifaacutetica
C1
alifaacutetico
C2
alifaacutetico
C3
alifaacutetico C2 PIPR C3 PIPR
C4
PIPR C5 PIPR C6 PIPR
RMN-13C
(ppm) 7259 3676 4575 5230 3303 5456 3274 5230
RMN-1H
(ppm) 571
Ha 212
Hb 200
Ha 319
Hb 300
Ha 342
Hb 298
Ha 210
Hb 160 280
Ha 210
Hb 160
Ha 342
Hb 298
De esta forma queda correctamente identificada la estructura del compuesto
5f
Descripcioacuten de Compuestos
180
X63 Elucidacioacuten estructural para los derivados de tetrahidropiridina
En este apartado se describen los compuestos 6g y 7g derivados de benceno
que tienen como amina central una tetrahidropiridina y como resto Ar2 un
benceno para-fluacuteor-sustituido En estos derivados la diferencia estructural que
cabe destacar estaacute en el resto Ar1 donde el 6g presenta un p-fluorobenceno
sustituido y el 7g un p-trifluorometileno (Figura 70)
Figura 70 Estructuras del compuesto 7g y 6g
Para la determinacioacuten estructural de estos compuestos se toma como punto
de partida la RMN-1H asignando las posibles sentildeales con sus correspondientes
protones El espectro de protoacuten de los compuestos se muestra en la figura 71
pudieacutendose comprobar su similitud
Figura 71 Espectro de RMN 1H del compuesto 6g y 7g respectivamente
Descripcioacuten de Compuestos
181
Zona Alifaacutetica
La regioacuten alifaacutetica de estas dos moleacuteculas son ideacutenticas por tanto las sentildeales
estaacuten a desplazamientos similares Estas moleacuteculas cuentan con cinco metilenos
de caraacutecter alifaacutetico y dos carbonos terciarios de los cuales C1 y C3p estaacuten muy
desapantallados por efecto tanto del OH
como por la pertenencia a una insaturacioacuten
como es el doble enlace de la
tetrahidropiridina Por las descripciones de
las zonas alifaacuteticas anteriores se puede
aproximar que el H perteneciente al C1
tendraacute un desplazamiento en torno a 500
ppm En la figura 72 queda sentildealada en
amarillo esta sentildeal a 470 ppm la otra sentildeal
de H sentildealada en naranja a un
desplazamiento 61 ppm corresponde al
protoacuten H3 de la tetrahidropiridina
Figura 72 Ampliacioacuten de RMN- 1H
La sentildeal pequentildea y ancha de entre ambas
sentildeales desaparece con agua deuterada por lo
que se identifica con el protoacuten del OH
El resto de sentildeales corresponden a la
tetrahidropiridina y el puente alifaacutetico En la
figura 73 se muestra ampliada la zona alifaacutetica
del espectro El estudio del espectro COSY
(Figura 74) ayudaraacute en la asignacioacuten de las
sentildeales
Figura 73 Ampliacioacuten RMN- 1H zona alifaacutetica
Habiendo asociado las sentildeales de C1 y C3p seguacuten los acoplamientos
mostrados se puede asignar las sentildeales de los carbonos contiguos con los que se
acopla De esta manera en la figura 74 puede observarse seguacuten los
acoplamientos cuaacuteles son los H contiguos al grupo hidroxilo que son los
pertenecientes a C2
Descripcioacuten de Compuestos
182
Figura 74 Asignacioacuten de las sentildeales de la cadena alifaacutetica
Se asigna la sentildeal que se observa a
180 ppm a C2 (CH2) puesto que es de
los dos el de mayor caraacutecter alifaacutetico
Integrado en el multiplete de 250 ppm
queda la sentildeal del otro CH2
correspondiente a C3 Si se traslada
esta asignacioacuten al HMQC (Figura 75) se
pueden asignar por las sentildeales a queacute C
pertenecen
Figura 75 Espectro HMQC- 1H-13C alifaacuteticos
Tomando como referencia el CH
de C3p (Figura 76) seguacuten los
acoplamientos mostrados en el
espectro COSY se determina
claramente cuaacutel es la sentildeal del CH2
de C2p
Figura 76 Ampliacioacuten zona alifaacutetica del espectro COSY
Si se continuacutea analizando los acoplamientos desde la sentildeal de H2 sentildealados
en morado se corresponde con el multiplete de 260 ppm de la RMN de protoacuten
Descripcioacuten de Compuestos
183
Como se ha explicado en el apartado anterior la posicioacuten espacial de la
moleacutecula genera acoplamientos deacutebiles de los H entre carbonos que no estaacuten
contiguos pero si espacialmente proacuteximos Por ello el multiplete genera
acoplamiento deacutebil con el hidroacutegeno del doble enlace y con los H2 y con una
tercera sentildeal que
pertenece a los H que
quedan por describir
Si se recurre al
espectro HMQC
(Figura 77) de esa
parte de la moleacutecula se
puede asignar las
sentildeales con seguridad
teniendo en cuenta los
desplazamientos
quiacutemicos de los
carbonos
Figura 77 Ampliacioacuten del espectro HMQC en la parte de la piridina
Habieacutendose asignado el H2 de C2p se puede ver el acoplamiento con el
carbono correspondiente Los dos carbonos que quedan por asignar
corresponden a las posiciones C5p y C6p El C5p teoacutericamente deberaacute aparecer a
desplazamientos menores pero la presencia del doble enlace hace que aparezca
a mayores desplazamientos Por tanto trazando las liacuteneas de unioacuten con la RMN
de protoacuten quedan justificadas todas las asignaciones realizadas al comienzo
sobre la resonancia de protoacuten
Zona aromaacutetica
Los protones aromaacuteticos de los compuestos 6g y 7g muestran diferentes
desplazamientos en la RMN- 1H (Figura 78)
Figura 78 Zona aromaacutetica de las RMN- 1H de los compuestos 6g y 7g respectivamente
Descripcioacuten de Compuestos
184
Sin embargo en una primera aproximacioacuten se puede comprobar que hay
sentildeales que se mantienen de una moleacutecula a otra La diferencia estructural entre
los dos compuestos estaacute en el sustituyente Ar1 donde se intercambian un fluacuteor y
un trifluorometil Por tanto las sentildeales que se conservan con desplazamientos a
710 ppm y 740 ppm pertenecen al benceno para sustituido de Ar2 (unido a la
amina) comuacuten en las dos estructuras Se recurre a los espectros bidimensionales
para la asignacioacuten de las sentildeales
En el espectro COSY del compuesto 7g (Figura 79) se puede determinar queacute
hidroacutegenos pertenecen a carbonos del mismo ciclo por sus acoplamientos
vecinales En la RMN- 1H del compuesto 7g a 710 ppm hay un triplete que
integra por dos hidroacutegenos Teoacutericamente la sentildeal obtenida deberiacutea ser un
doblete ya que los hidroacutegenos del los anillos solo se ven afectados por un
hidroacutegeno vecino La explicacioacuten de esta multiplicidad es la presencia del
aacutetomo de fluacuteor que no genera sentildeal pero si influencia en los hidroacutegenos vecinos
De esta forma se asigna esa sentildeal a 710 ppm a los hidroacutegenos 3acute y 5acute del anillo
de Ar2 Con el espectro COSY quedan descritos los correspondientes vecinos
H2acute y H6acute a 740 ppm
Figura 79 Espectro COSY del compuesto 6g
De esta manera queda claro que las otras dos sentildeales pertenecen a Ar1 Si se
recurre de nuevo a la RMN- 1H del compuesto 6g se puede observar una sentildeal
intensa que integra cuatro protones a 710 ppm Conociendo que dos
hidroacutegenos son H3acute y H5acute que pertenecen a Ar2 los otros dos seraacuten H3 y H5
pertenecientes al benceno unido al hidroxilo Ar1 que en este compuesto
tambieacuten tienen un aacutetomo de fluacuteor contiguo
Descripcioacuten de Compuestos
185
En el espectro COSY del compuesto 7g la sentildeal a 750 ppm se ha asignado a
H2acute y H6acute de Ar2 El compuesto 6g tiene los mismos protones H2acute y H6acute de Ar2 a
igual desplazamiento por lo que la sentildeal a 740 ppm perteneceraacute a los protones
H2 y H6 que faltaban por designar en el compuesto 6g Los uacutenicos protones que
no comparten 6g y 7g son H3 y H5 Por RMN- 1H del compuesto 6g se ha deduce
que estos hidroacutegenos dan una sentildeal a 71 ppm En el espectro del compuesto 7g
a 770 ppm hay una sentildeal que por lo explicado se asigna a estos hidroacutegenos
vecinos del grupo trifluorometil de Ar1
Las asignaciones son
Zona aromaacutetica
6g C2
FBZN
C3
FBZN
C5
FBZN
C6
FBZN
C2
FENIL
C3
FENIL
C5
FENIL
C6
FENIL
RMN-13C
(ppm) 12730 11580 11580 12730 12730 11580 11580 12730
RMN-1H
(ppm) 740 710 710 740 750 710 710 750
7g C2
TBZN
C3
TBZN
C5
TBZN
C6
TBZN
C2
FENIL
C3
FENIL
C5
FENIL
C6
FENIL
RMN-13C
(ppm) 12730 12570 12570 12730 12730 11580 11580 12730
RMN-1H
(ppm) 750 770 770 750 740 710 710 740
Zona alifaacutetica comuacuten
C1
alifaacutetico
C2
alifaacutetico
C3
alifaacutetico
C2
PIRD
C3
PIRD
C5
PIRD
C6
PIRD
RMN-13C
(ppm) 7149 3696 2836 5360 12280 5531 5074
RMN-1H
(ppm) 470 180 250 306 610 245 260
XXII EENNSSAAYYOOSS BBIIOOLLOacuteOacuteGGIICCOOSS
Ensayos Bioloacutegicos
189
XI1Ensayos de actividad antiplasmoacutedica in vitro
Se determinoacute como se describe en el apartado de material y meacutetodos la
actividad antimalaacuterica in vitro y la citotoxicidad de la mayor parte de los
compuestos obtenidos y los resultados se muestran en las siguiente tablas
(Tabla 4 5 y 6)
Compuesto Ar1 n Amina RaRb CI50
NF54 microM
CI50 FCR3 microM
DT50
Vero microM
IS VeroFCR3
1
2 PIPZ CF3NO2 1250 10310 3610 035
2 2 PIPZ NO2CF3 ND 090 490 544
9
2 PIPZ CF3NO2 830 4205 1890 045
11 2 PIRR CF3NO2 390 4605 7040 150
14
1 PIPZ CF3NO2 23260 19020 gt100 065
15 1 PIPZ NO2CF3 10320 18615 gt100 053
17
2 PIPZ NO2CF3 1700 7300 949 013
Referencia QC 004 013 gt50 gt350
Tabla 4 Tabla de resultados de actividad y citotoxicidad de los compuestos de la Serie 0 derivados carboniacutelicos CQ Cloroquina CI50 valores medios del ensayo realizado por triplicado expresados en microM de la inhibicioacuten del 50 del
crecimiento celular de cepas FCR-3 de Plasmodium falciparum DT50 concentracioacuten citotoacutexica media de los compuestos en ceacutelulas Vero IS Iacutendice de Selectividad de los compuestos obtenido del cociente de DT50 de ceacutelulas Vero y la CI50 en
cepas FCR3 ND No determinado
Ensayos Bioloacutegicos
190
Series Ar1 Comp n Amina RaRb CI50
NF54 microM
CI50
FCR3 microM
DT50 Vero microM
IS VeroFCR3
Serie 1
1a 2 PIPZ CF3NO2 230 400 2420 605
1b 2 PIPZ NO2CF3 420 645 gt100 gt100
1g 2 PIRD HF ND 1689 1790 106
Serie 2
2a 2 PIPZ CF3NO2 ND 130 gt200 gt100
2b 2 PIPZ NO2CF3 ND 223 gt150 8598
2c 2 PIPZ HCF3 ND 105 gt250 gt100
2d 2 DZP CF3NO2 ND 075 133 1770
2f 2 PIPR CF3NO2 ND 070 660 670
Serie 3
3b 2 PIPZ NO2CF3 1670 3615 gt100 380
3e 2 PIRR CF3NO2 610 1050 2970 190
3g 2 PIRD HF ND 1403 2460 175
Serie 4
4b 1 PIPZ NO2CF3 2170 10225 7460 070
Serie 5
5a 2 PIPZ CF3NO2 130 050 2090 4180
5b 2 PIPZ NO2CF3 170 490 7570 1540
5c 2 PIPZ HCF3 ND 093 gt200 gt100
5f 2 PIPR CF3NO2 ND 015 550 5500
5g 2 PIRD HF ND 040 3430 8590
Serie 6
6a 2 PIPZ CF3NO2 ND 036 8798 gt100
6f 2 PIPR CF3NO2 ND 048 3000 gt100
6g 2 PIRD HF ND 066 gt1000 gt1000
Serie 7
7g 2 PIRD HF ND 560 gt300 gt100
Referencia CQ 004 013 gt50 gt300
Tabla 5 Tabla de resultados de actividad y citotoxicidad de los compuestos hidroxiacutelicos CQ Cloroquina CI50 valores medios del ensayo realizado por triplicado expresados en microM de la inhibicioacuten del 50 del crecimiento celular de cepas FCR-3 de Plasmodium falciparum DT50 concentracioacuten citotoacutexica media de los compuestos en ceacutelulas Vero IS Iacutendice de
Selectividad de los compuestos obtenido del cociente de DT50 de ceacutelulas Vero y la CI50 en cepas FCR3 ND No determinado
Ensayos Bioloacutegicos
191
Serie 8
Ar1 Amina RaRb IC50
NF54 microM
IC50
FCR3 microM
DT50 Vero
microM
DT50 MCF7
microM
IS VeroFCR3
1
PIPZ NO2CF3 ND SA 150 471 ND
2 PIRR CF3NO2 214 465 101 ND 022
Referencia CQ 004 013 gt50 ND gt400
Tabla 6 Tabla de resultados de actividad y citotoxicidad de los compuestos de la Serie 8 derivados oxima CQ Cloroquina CI50 valores medios del ensayo realizado por triplicado expresados en microM de la inhibicioacuten del 50 del
crecimiento celular de cepas FCR-3 de Plasmodium falciparum DT50 concentracioacuten citotoacutexica media de los compuestos en ceacutelulas Vero IS Iacutendice de Selectividad de los compuestos obtenido del cociente de DT50 de ceacutelulas Vero y la CI50 en
cepas FCR3 ND No determinado SA sin actividad
XI2 Ensayos de actividad antiplasmoacutedica in vivo
Los ensayos in vivo comenzaron con los ensayos de virulencia para obtener
una aproximacioacuten del comportamiento de la cepa elegida Fueron desarrollados
como se muestra en la figura 80
Figura 80 Desarrollo del ensayo de virulencia previo al ensayo de actividad in vivo de los compuestos
En ratones parasitados al 50 hay 24x106 hematiacutees infectados por microL y son
necesarios 107 hematiacutees totales por ratoacuten Para el test de Peters se dispuso de
Ensayos Bioloacutegicos
192
100 ratones pero en los caacutelculos teniendo en cuenta las posibles peacuterdidas se
contoacute con 110 ratones en total Asiacute fueron necesarios 110x107 paraacutesitos para
comenzar la experimentacioacuten El volumen maacuteximo que inyectar es 100 microL de
solucioacuten lo que supone preparar 11 mL de solucioacuten de sangre parasitada al
comienzo del ensayo
Teniendo en cuenta estos tres datos fueron necesarios 458 microL de sangre
infectada al 50 en un volumen de 11 mL de suero fisioloacutegico Con la
inoculacioacuten de los ratones da comienzo el Test de Peters
Los resultados a lo largo del test se ofrecen en la Tabla 7
Test de Peters (respuesta visual externa) P Supervivencia
Grupo Diacutea 0 Diacutea 1 Diacutea 2 Diacutea 3 Diacutea 4 Diacutea 5 Diacutea 7 Diacutea 9 Diacutea 11 Diacutea 12
Control negativo - - + AC + AC + AC 23 910 35 13 11 1
Control positivo - - + AC + AC + AC 19 1010 68 44 44 2
Grupo 2a1 - - + AC + AC + AC 24 710 34 12 - -
Grupo 2a2 - - + AC + AC + AC 32 810 22 22 - -
Grupo 2a3 - - + AC + AC + AC 14 1010 66 55 13 1
Grupo 2a4 - - + AC + AC + AC 31 910 45 22 12 1
Grupo 5f1 - +AC +AC
ID
+AC
BMBO
+AC
BMBO 6 510 35 33 23 2
Grupo 5f2 - +AC + AC +AC
BMBO
+AC
BMBO 15 1010 67 45 23 -
Grupo 5f3 - +AC + AC + AC + AC 32 910 44 23 - -
Grupo 5f4 - +AC + AC + AC + AC 18 1010 67 44 - -
Tabla 7 Resultados de los ensayos in vivo para los compuestos 2a y 5f P porcentaje de parasitemia (-) sin respuesta visual externa (+) respuesta externa AC alteracioacuten momentaacutenea del comportamiento en el momento de la inyeccioacuten del tratamiento BM baja movilidad BO baja oxigenacioacuten principios de cianosis parasitemia medida al cuarto diacutea
Supervivencia expresada en ratones supervivientes con respecto al grupo el diacutea determinado
XI3 Discusioacuten de ensayos bioloacutegicos
Los resultados bioloacutegicos obtenidos ofrecen datos de estructura-actividad
suficientemente consistentes como para proseguir con un refinamiento
estructural de los compuestos El estudio del comportamiento de los
compuestos de las diferentes series en el ensayo de actividad antiplasmoacutedica in
vitro en la cepa FCR3 ha sido suficiente para comprobar que (Series 1-7) son
mucho maacutes activos en todos los casos los derivados hidroxiacutelicos (CHOH) que
un reducido nuacutemero de derivados carboniacutelicos (Serie 0) Por esto no fueron
ensayados el resto de compuestos de la Serie 0
Ensayos Bioloacutegicos
193
Los mismos resultados se obtuvieron para las dos oximas de la Serie 8 por lo
que se paroacute su siacutentesis Sin embargo esto no es extensible a los datos de
toxicidad que se ve influenciada por otros sustituyentes en la moleacutecula Por esto
se centraraacute el estudio en los resultados de las modificaciones estructurales de
los derivados hidroxiacutelicos pertenecientes a las Series 1 a 7
En referencia al sustituyente en la posicioacuten Ar1 comparando series como 1 vs
2 y 3 vs 5 se puede destacar que las series con un grupo fluacuteor en Ar1 aumentan
significativamente su actividad sin ser extensible este dato a la toxicidad (veacutease
compuestos 1a vs 2a 1b vs 2b 3b vs 5b y 3g vs 5g) La siguiente comparativa se
basa en la naturaleza de los anillos condensados (benzo[b]tiofeno y naftaleno)
respecto del benceno sustituido que forman el nuacutecleo del sustituyente Ar1 En
una primera aproximacioacuten se puede ver que la actividad desciende en orden
derivados de FNFTgtderivados de FBZNgtderivados de FBTF Comparando
ahora la actividad de los compuestos 1a vs 2a vs 3a vs 5a vs 6a puede verse que
el compuesto 5f (derivado de FNFT) tiene el mejor dato de CI50 pero el
compuesto 6a (derivado de FBZN) es el que mejor actividad in vitro ha
mostrado siendo soacutelo 3 veces menos activo que la CQ usada como referencia Si
se comparan los derivados de FBTF (Serie 2) y FNFT (Serie 5) en general los
compuestos de la Serie 5 son maacutes activos que sus homoacutelogos de la Serie 2
excepto en el caso de los compuestos 2b vs 5b
En cuanto a toxicidad aunque de forma menos marcada se observa un
aumento en los derivados de FNFT respecto de sus homoacutelogos de FBTF
Centrando el estudio en la variacioacuten de la longitud de la cadena alifaacutetica se
comparan los compuestos 3b y 4b La mayor parte de los compuestos
sintetizados contienen dos carbonos en la cadena alifaacutetica La disminucioacuten en
un aacutetomo de carbono en esta cadena (Compuestos de la Serie 0 14 y 015 y Serie
4) supone una peacuterdida muy considerable de la actividad de los compuestos
Este dato de menor actividad condujo a cerrar esta serie
La naturaleza de la amina central ademaacutes de influir claramente en la
actividad tiene gran influencia en la toxicidad in vitro de los derivados De
forma que se puede ver como la mayoriacutea de derivados de piperazina muestran
una toxicidad bastante baja en comparacioacuten con compuestos derivados de otras
aminas Por el contrario exceptuando el compuesto 6a estos derivados tienen
menor actividad que sus anaacutelogos con otras aminas como homopiperazinas
(compuestos 2a vs 2d) o piperidinas (compuestos 2a vs 2f o 5a vs 5f)
Ensayos Bioloacutegicos
194
Se puede plantear como hipoacutetesis que la presencia de un grupo NH libre en la
estructura aumenta considerablemente la toxicidad de los compuestos Este
caso se observa en los derivados de la Serie 2 y Serie 3 donde los compuestos
con piperazina no son toacutexicos pero al introducir una amina con un NH libre
aumenta su toxicidad a la vez que lo hace la actividad Esto no es de aplicacioacuten
en los anaacutelogos de la Serie 5 (ya que el compuesto 5a contiene el anillo de
piperazina y muestra toxicidad) por lo que se podriacutea deducir que el grupo FNFT
confiere por si mismo cierta toxicidad Con respecto a los derivados de
tetrahidropiridina no se tienen suficientes datos como para extraer conclusiones
claras en la relacioacuten estructura-actividad
Por uacuteltimo se estudia la variacioacuten de la actividad y citotoxicidad en relacioacuten a
los sustituyentes en Ar2 Si se comparan los compuestos a y b de las diferentes
series se deduce que es conveniente para la actividad que el grupo CF3 esteacute en
posicioacuten orto con respecto a la amina (compuestos ldquoardquo de las diferentes series)
Los compuestos con CF3 en para (compuestos ldquobrdquo) son menos activos pero
tambieacuten menos toacutexicos Los anaacutelogos que carecen de grupo NO2 (compuestos 2c
y 5c) aumentan la actividad y cabe destacar el descenso en la toxicidad por lo
que se deduce que el grupo NO2 confiere toxicidad no ligada a la actividad
como el caso de los grupos NH libres Los datos obtenidos permiten una
aproximacioacuten al comportamiento de los compuestos in vivo Para estos ensayos
de los compuestos disponibles se seleccionaron dos el 5f el maacutes activo
(proacuteximo al compuesto de referencia) y 2a el de mejor perfil de toxicidad
En la Tabla 4 se muestran los datos experimentales obtenidos durante la
realizacioacuten del Test de Peters El compuesto 5f disminuye en gran medida la
parasitemia a altas concentraciones pero por acumulacioacuten en el tratamiento
diario provoca diferentes muestras de toxicidad como mala oxigenacioacuten o
alteraciones de conducta de los ratones A concentraciones menores los
resultados desafortunadamente no son tan relevantes como cabiacutea esperar ni en
cuanto a parasitemias ni a supervivencia
El compuesto 2a si bien no muestra indicios de toxicidad no mejora los
resultados con respecto a la CQ en datos de parasitemia ni de supervivencia
XXIIII EENNSSAAYYOOSS CCOOMMPPUUTTAACCIIOONNAALLEESS
Ensayos Computacionales
197
XII1 Propiedades fisicoquiacutemicas de los compuestos
Todos los valores obtenidos en relacioacuten a las propiedades fisicoquiacutemicas de
los compuestos sintetizados se exponen en la tabla siguiente (Tabla 8)
ABS TPSA (Ǻ2)
n-ROTB
PM miLogP KOWLogP ALogPS
21 MLogP
n-OHNH n-ON aceptores
Lipinskis violations ID donadores
rule
gt500 lt5 lt5 lt5 lt415 lt5 lt10 le1
01 8506 6940 7 46350 503 486 480 414 0 6 1
02 8507 6937 7 gt500 503 486 476 414 0 6 1
03 10000 2031 5 36450 481 548 52 442 0 2 0
04 8507 6937 7 48151 419 506 476 424 0 6 0
05 8507 6937 7 48151 419 506 476 424 0 6 0
06 10000 2355 6 43651 431 525 502 451 0 3 0
07 8703 6368 7 49554 401 543 504 485 0 5 0
08 8203 7816 8 49554 448 576 463 445 1 6 0
09 8506 6940 7 4940 532 504 479 448 0 6 1
010 8507 6937 8 gt500 489 504 520 448 0 6 0
011 8202 7820 8 4940 533 525 435 448 1 6 1
012 10000 2031 5 35947 510 566 507 477 0 2 1
013 10000 2031 6 37741 481 544 461 487 0 2 0
014 8506 6940 6 44340 505 531 458 427 0 6 1
015 8506 6940 6 44340 505 531 461 427 0 6 1
016 8507 6937 7 47548 541 524 457 458 0 6 1
017 8506 6940 7 47540 541 524 458 458 0 6 1
018 10000 2355 6 43048 552 543 504 485 0 3 1
019 8203 7816 8 48951 463 594 461 478 1 6 0
020 10000 2031 5 37746 519 580 490 514 0 2 1
021 8507 6937 7 42542 430 407 372 390 0 6 0
022 8203 7816 8 43945 458 477 373 411 1 6 0
023 10000 2031 5 32740 408 468 422 411 0 2 0
81 7971 8489 7 47247 538 468 463 395 1 7 1
82 7668 9368 8 47247 469 458 463 395 1 6 0
CQ 9930 2820 8 31990 501 450 528 352 1 3 1
Tabla 8 Datos computacionales de las propiedades fisicoquiacutemicas de los derivados de la Serie 0 y Serie 8 ABS porcentaje de absorcioacuten calculado como 109 ndash (0345 x TPSA) siendo TPSA el Aacuterea Superficial Polar Topoloacutegica n-
ROTB es el nuacutemero de enlaces de giro permitido Log P es el coeficiente de particioacuten del compuesto en octanol-agua n-OHNH es nuacutemero de enlaces de hidrogeno donadores n-ON es el nuacutemero de enlaces de hidroacutegeno aceptores CQ
cloroquina
ID ABS TPSA (Ǻ2) n-ROTB PM miLogP KOWLogP ALogPS 21 MLogP n-OHNH n-ON
aceptores Lipinskis violations donadores
rule
gt500 lt5 lt5 lt5 lt415 lt5 lt10 le1
1a 8398 7253 7 46550 469 468 463 395 1 6 0
1b 8398 7253 7 gt500 469 458 463 395 1 6 0
1g 10000 2347 5 40399 447 530 461 423 1 2 0
2a 8398 7253 7 48349 407 488 499 432 1 6 0
2b 8398 7253 7 gt500 478 488 499 432 1 6 0
2c 9979 2670 6 43849 397 507 509 432 1 3 0
2d 8398 7253 7 49751 413 538 505 453 1 6 0
2f 8095 8132 8 49751 414 558 461 453 2 6 0
3b 8398 7253 7 49600 498 486 483 429 1 6 0
3e 8095 8132 8 49607 499 506 439 429 1 6 0
3g 10000 2347 5 36146 476 548 466 457 1 2 0
4b 8399 7250 6 44540 471 415 477 408 1 6 0
5a 8399 7250 7 47750 507 506 503 466 1 6 1
5b 8399 7250 7 47750 507 424 384 546 1 6 1
5c 9979 2670 6 46896 519 525 514 466 1 3 1
5f 8095 8132 8 49147 536 576 465 486 2 6 1
5g 10000 2347 5 37945 485 568 488 495 1 2 0
6a 8398 7253 7 46591 337 389 413 398 1 6 0
6f 8095 8132 8 47994 424 459 374 419 2 6 0
6g 10000 2347 5 329 39 374 450 395 425 1 2 0
7g 10000 2347 6 37974 447 526 469 468 1 2 0
CQ 9930 2820 8 31990 501 450 528 352 1 3 1
Tabla 9 Datos computacionales de las propiedades fisicoquiacutemicas de los derivados hidroxiacutelicos ABS porcentaje de absorcioacuten calculado como 109 ndash (0345 x TPSA) siendo TPSA el Aacuterea Superficial Polar Topoloacutegica n- ROTB es el nuacutemero de enlaces de giro permitido Log P es el coeficiente de particioacuten del compuesto en octanol-agua n-OHNH es nuacutemero de enlaces de hidrogeno donadores n-
ON es el nuacutemero de enlaces de hidroacutegeno aceptores CQ cloroquina
Ensayos Computacionales
199
XII2 Discusioacuten de propiedades fisicoquiacutemicas
Los estudios teoacutericos de los paraacutemetros fiacutesico-quiacutemicos muestran que los
compuestos cumplen las Reglas de Lipinski ya que tienen un peso molecular
menor de 500 Daltons los coeficientes de particioacuten octanolagua estaacuten dentro
de los liacutemites admitidos (entre -04 y 56) lejos de los cinco enlaces donadores
de hidroacutegeno (suma de los OH y NH) y de los 10 aceptores (suma de O y N)
Las caracteriacutesticas estructurales han de ser tenidas en cuenta para predecir la
solubilidad de los compuestos
El tamantildeo de las estructuras influye de manera directa en la absorcioacuten de un
compuesto puesto que los de bajo peso molecular difunden mejor pasivamente
Todos los compuestos de este trabajo presentan bajos pesos moleculares
La polaridad de las estructuras tambieacuten juega un papel importante en las
caracteriacutesticas farmacocineacuteticas Las moleacuteculas apolares difunden con mayor
facilidad que las polares ya que son maacutes lipoacutefilas Los coeficientes de reparto
octanolagua determinan esta caracteriacutestica de la moleacutecula teniendo en cuenta
el medio Es decir los compuestos con altos coeficientes de particioacuten son maacutes
hidroacutefobos y por tanto tendraacuten buena difusioacuten Los valores obtenidos para los
distintos compuestos en las diferentes aplicaciones utilizadas no muestran una
tendencia clara que permita distinguir entre estructuras Lo que siacute cabe destacar
es que todos cuentan con valores altos proacuteximos a 5 que les confiere buena
difusioacuten
Los aacutetomos que conforman las moleacuteculas estaacuten cargados y confieren
polaridad a la estructura Esta caracteriacutestica estaacute distribuida en el espacio de
diferente forma seguacuten los aacutetomos de O N y F que posea la moleacutecula dando
lugar al TPSA (suma de superficie de todos los aacutetomos polares) La bibliografiacutea
(Palm et alts 1997) demuestra que la liposolubilidad estaacute relacionada con los
valores de TPSA Los valores de TPSA entre 63 y 139 Aring2 predicen una buena
absorcioacuten de los compuestos La mayoriacutea de las estructuras del trabajo estaacuten
dentro de esos paraacutemetros incluso hay estructuras que como la CQ tienen
TPSA menores de 63 Aring2 que indican que el porcentaje de absorcioacuten de los
compuestos seraacute oacuteptimo
Todos los paraacutemetros fisicoquiacutemicos proponen unas buenas cualidades de
absorcioacuten de los compuestos de este trabajo
Ensayos computacionales
200
XII3 Estudios de Modelizacioacuten y Acoplamiento Molecular
Se realiza una primera aproximacioacuten para la validacioacuten de la diana propuesta
usando el programa Autodock donde se analizan los modos de unioacuten maacutes
representativos de las diez conformaciones calculadas del compuesto EH58 y del
5a con al menos un enlace de hidroacutegeno con uno de los aspartatos del sitio
cataliacutetico Las energiacuteas de unioacuten y los valores de RMSD de EH58 y las energiacuteas de
unioacuten del compuesto 5a para esas diez conformaciones se muestran en la
siguiente tabla
EH58 5a
Confa Energiacutea
b RMSD
c Energiacutea
b
1 -406 453 -616
2 -250 361 -607
3 -245 559 -585
4 -230 393 -584
5 -232 299 -570
6 -232 632 -556
7 -209 551 -556
8 -197 557 -545
9 -162 556 -525
10 -121 733 -478
Tabla 10 Datos de energiacutea de las distintas conformaciones de los compuestos EH58 y 5a a Mejores conformaciones obtenidas por docking ordenadas seguacuten la energiacutea b energiacutea de unioacuten en in Kcalmol calculadas con el programa
Autodock c Valores RMSD en Aring
Los resultados de los ensayos computacionales realizados al compuesto 5a
producen representaciones graacuteficas tridimensionales del MEP (Figura 81) de la
conformacioacuten de miacutenima energiacutea obtenida seguacuten los datos mostrados en la
anterior Tabla 10
En el MEP se observa una red de potencial electronegativo alrededor del fluacuteor
los grupos OH y los NO2 Asiacute se puede deducir que los compuestos maacutes activos
los derivados hidroxiacutelicos tendraacuten un potencial electronegativo y un modo de
accioacuten similar
Ensayos Computacionales
201
Figura 81 MEP de la mejor conformacioacuten del compuesto 5g
Los estudios de docking se orientaron a la unioacuten entre el compuesto liacuteder y la
plasmepsina II como se ha explicado anteriormente Se llegoacute a la conclusioacuten que
se forma un puente de hidroacutegeno con el sitio activo de la aspartato cataliacutetica de
la enzima (ASP 214 y ASP 34) Esta interaccioacuten se da sobre el uacutenico grupo
hidroxilo de la moleacutecula y el residuo ASP 214
Todo esto nos aporta representaciones graacuteficas como la obtenida para la mejor
conformacioacuten encontrada para el compuesto 5a dentro del sitio activo de la
plasmepsina II (figura 82)
Figura 82 Representacioacuten de la unioacuten del compuesto 5a y la Plasmepsina Sentildealado con raya discontinua amarilla la unioacuten del OH y la ASP 214 Tambieacuten se puede ver dibujadas en rama otras terminaciones de la enzima
En base al resultado obtenido en la primera aproximacioacuten con el programa
Autodock que valida como diana la plasmepsina se realiza una segunda
aproximacioacuten con el programa ICM que emplea menos tiempo para sus caacutelculos
una vez conocidos los paraacutemetros de buacutesqueda base
Ensayos computacionales
202
Para este segundo estudio se emplearon las estructuras de los derivados 5a 5c
5g 6a 6g y 6f Una de las hipoacutetesis base del estudio es que partiendo de que
habiacutea comprobado que el compuesto 5a encaja en el sitio activo los demaacutes
derivados deberaacuten encajar tambieacuten Esto se confirma en la figura 83 donde se
muestra como los diferentes derivados solapan estructuralmente en el hueco del
sitio activo de la moleacutecula
Figura 83 Imagen de la plasmepsina donde se muestra el solapamiento de las diferentes estructuras estudiadas
El programa ICM realizoacute caacutelculos para obtener las energiacuteas de las mejores
conformaciones de las moleacuteculas propuestas (Tabla 11)
Compuesto Energiacutea
(Kcalmol) Actividad
uM
5f -917627 015
5a -867278 05
6f -815261 048
6a -764088 036
5c -751448 093
6g -681119 066
Tabla 11 Energiacutea de las conformaciones oacuteptimas de los diferentes compuestos estudiados
Teniendo en cuenta los datos de energiacutea y las configuraciones espaciales maacutes
estables para el sitio de unioacuten de las moleacuteculas se obtuvo la representacioacuten de las
interacciones que realiza cada moleacutecula en el sitio activo de la enzima
plasmepsina (Figuras 84 a 89)
En la figura 84 se puede ver la representacioacuten de las interacciones del
compuesto 5a en el sitio activo En amarillo quedan sentildealadas las interacciones
hidrofoacutebicas (interacciones de Van der Waals) entre restos apolares de la
Ensayos Computacionales
203
moleacutecula y de los restos de la enzima
En verde se sentildeala el puente de
hidroacutegeno entre el grupo OH y la
ASP 214 En este compuesto el
programa plantea otra posible unioacuten
con el resto THR 217 En azul se
resalta la regioacuten ionizable la amina
Los restos libres que podriacutean
interaccionar con las moleacuteculas
propuestas se plantean en recuadros
alrededor de ella
Figura 84 Representacioacuten de las interacciones de 5a
En la figura 85 se puede estudiar la
variacioacuten en las interacciones con el
cambio de posicioacuten del grupo CF3 y la
desaparicioacuten del grupo NO2 del
compuesto 5c Ahora el programa
plantea la posibilidad de la interaccioacuten
del OH con ASP 34 ademaacutes de la
interaccioacuten con ASP 214
Figura 85 Representacioacuten de las interacciones de 5c
En la figura 86 se muestra el compuesto 5f y se aprecia el cambio los aacutengulos de
conformacioacuten de la estructura
cuando la amina PIPZ central se
cambia por PIPR Se observa como
se establecen muchas maacutes
interacciones apolares del grupo
FNFT y del CF3 en orto pero
disminuyen las del ciclo de la amina
con respecto a la piperazina
Ademaacutes se plantea una nueva unioacuten
por puente de hidroacutegeno entre el
NH libre y la ASP 34
Figura 86 Representacioacuten de las interacciones de 5f
Ensayos computacionales
204
En la figura 87 el compuesto 6f se
diferencia del anterior en que en lugar de
un FNFT se tiene un FBZN que plantea
una unioacuten con el resto TYR 192 Se ve a
simple vista la disminucioacuten en la cantidad
de interacciones apolares que hay en la
moleacutecula
Figura87 Representacioacuten de las interacciones de 6f
En la figura 88 se representa el
compuesto 6a Se puede ver como de
nuevo el anillo de PIPZ vuelve a dar
interacciones apolares y aporta
regiones ionizables aunque se pierde
el puente de hidroacutegeno con ASP 34
Figura 88 Representacioacuten de las interacciones de 6a
En esta uacuteltima figura 89 se
representa el compuesto 6g que se
diferencia del anterior en que la
amina central es la PIRD Este ciclo
posibilita una interaccioacuten con TYR 77
y VAL 78 La distribucioacuten de
interacciones apolares se asemeja a la
de la moleacutecula 5c ya que el
sustituyente tambieacuten de caraacutecter
electro-atrayente se encuentra en
posicioacuten para del anillo
Figura 89 Representacioacuten de las interacciones de 6g
En este estudio se incluyoacute una seacuteptima moleacutecula el derivado 4b Este
compuesto se diferencia del resto de los sintetizados en que su cadena alifaacutetica
cuenta con dos aacutetomos de carbono lo que significa que la separacioacuten entre el OH
y la amina es de un uacutenico carbono Los caacutelculos sobre energiacuteas y configuraciones
espaciales de maacutexima estabilidad para una correcta interaccioacuten con la diana
Ensayos Computacionales
205
propuesta mostraron que el compuesto 4b puede adoptar una conformacioacuten que
le permitiriacutea acceder al hueco activo de la plasmepsina pero no se produciriacutea la
interaccioacuten caracteriacutestica del grupo OH y la ASP 214
Estos datos ofrecen la posibilidad de un farmacoacuteforo que se muestra en la
figura 90
Figura 90 Farmacoacuteforo propuesto para los derivados de arilaminoalcoholes con actividad antimalaacuterica que tienen como diana propuesta la plasmepsina II
En la imagen del farmacoacuteforo quedan destacadas en amarillo las zonas
apolares que establecen interacciones hidrofoacutebicas con los aminoaacutecidos del sitio
activo de la plasmepsina y que se corresponden con la zona aromaacutetica Ar1 Las
flechas granate sentildealan las posibles interacciones que establece el aacutetomo de fluacuteor
Las flechas verdes sentildealan las interacciones polares entre los grupos polares y la
ASP 214 Asiacute de la zona azul correspondiente a las interacciones de la amina se
destaca una segunda interaccioacuten de los NH libres con la enzima en el resto ASP
34 El resto del ciclo de amina establece interacciones apolares
En la imagen la parte de Ar2 por su naturaleza aromaacutetica tambieacuten plantea
interacciones apolares con la enzima propuesta
Con los datos obtenidos y tomando como diana la enzima plasmepsina se puede
proponer un nuevo esquema para seguir con el refinamiento estructural
Ensayos computacionales
206
Figura 91 Estructura general planteada para el refinamiento estructural
Las nuevas estructuras deberaacuten contar con un grupo hidroxilo separado por un
espaciador alifaacutetico de una longitud miacutenima de dos carbonos con una amina A
ambos lados de la moleacutecula se dispondraacuten las zonas de interaccioacuten apolar
formadas por sistemas aromaacuteticos sencillos o conjugados sutituidos por grupos
de caraacutecter electroatrayente como haloacutegenos metoxi o trifluorometoxi
Ensayos Computacionales
207
XII4 Discusioacuten de resultados de modelizacioacuten
Los estudios computacionales proponen como diana de los compuestos
desarrollados en este trabajo la plasmepsina II Seguacuten los datos obtenidos para
las diferentes estructuras estudiadas se pueden establecer relaciones
estructura-actividad Estos resultados se ven confirmados por las distintas
interacciones de los compuestos en su conformacioacuten maacutes estable dentro de
hueco activo de la enzima
Al estudiar los resultados de las diferentes interacciones por zonas de las
moleacuteculas en las figuras 84 a 89 se podriacutea dar una explicacioacuten de la diferente
actividad mostrada por los compuestos ensayados
Queda evidenciado desde la primera aproximacioacuten computacional que el
puente de hidroacutegeno entre el grupo OH y la ASP 214 es el punto clave en la
validacioacuten de la plasmepsina II como diana de los compuestos Esta interaccioacuten
confirma que es requisito indispensable para la actividad de los derivados la
presencia de un grupo OH en la estructura
Los sistemas aromaacuteticos conjugados o anillo aromaacutetico que conforman Ar1
son sistemas completamente apolares que ejercen interacciones hidrofoacutebicas
con los restos apolares del bolsillo activo de la enzima como isoleucina (ILE)
fenilalanina (PHE) o leucina (LEU) Cuanto mayor es la nube de electrones π del
sistema Ar1 mayores son las interacciones con los sistemas π de los
aminoaacutecidos que explica porqueacute los derivados de la Serie 5 tienen maacutes
actividad que los de la Serie 6 Varias representaciones plantean una posible
unioacuten polar del aacutetomo de fluacuteor con tirosina (TYR) que aumentariacutea la interaccioacuten
global de la moleacutecula y aclara el porqueacute los derivados fluorados son maacutes afines
que los no fluorados
La longitud de la cadena alifaacutetica tambieacuten juega un papel importante en la
actividad de los derivados la disminucioacuten de tres aacutetomos de carbono a dos de
la cadena alifaacutetica ha supuesto una disminucioacuten draacutestica de la actividad (veacuteanse
los compuestos 3b y 4b) Los estudios realizados al compuesto 4b podriacutean
explicar esta disminucioacuten Los carbonos de la cadena alifaacutetica tienen capacidad
de rotar lo que confiere a la estructura mayor capacidad para adoptar
diferentes conformaciones que le permiten llegar a la disposicioacuten de miacutenima
energiacutea Los derivados ensayados con un carbono alifaacutetico menos seguacuten las
previsiones teoacutericas adoptan una conformacioacuten que les permite acceder al
Ensayos computacionales
208
hueco activo de la plasmepsina II pero no permite la unioacuten del grupo OH con
el resto ASP 214 que se predice como esencial para la actividad de los
compuestos presentados en este trabajo Se puede predecir que teoacutericamente la
plasmepsina II no es la diana adecuada para los derivados de la Serie 0 14 y 15
y 4b
La naturaleza de la amina central juega un papel muy importante en este tipo
de estudios Puede verse en las representaciones que seguacuten sea la amina
piperazina o amino-piperidina las interacciones con el entorno son muy
diferentes Centrando la atencioacuten en los derivados de PIPZ se observa que el
ciclo por completo da lugar a una regioacuten ionizable por el efecto del N y las
interacciones electrostaacuteticas del ciclo debidas al plegamiento espacial que
confiere estabilidad Si ahora se estudian las PIPR lo que se puede ver es que el
ciclo pierde interaccioacuten apolar con el medio ya que se plantea un nuevo puente
de hidroacutegeno del grupo NH libre con el resto ASP 34 Esta segunda unioacuten polar
hace que la moleacutecula adquiera menos energiacutea y maacutes estabilidad dentro del
hueco activo que justifica por queacute los derivados de amino-piperidina muestran
maacutes actividad (compuestos 2a y 2f 5a y 5f 6a y 6f)
Los grupos CF3 y NO2 presentes en Ar2 y OH seguacuten el mapa MEP de
potenciales electrostaacuteticos son restos que aportan polaridad a las moleacuteculas La
posibilidad de establecer nuevas interacciones polares maacutes fuertes con sitios del
hueco de la plasmepsina podriacutea explicar por queacute son maacutes activos los
compuestos con estos restos
Con los datos obtenidos en los estudios computacionales se puede proponer
un posible farmacoacuteforo para la plasmepsina II En la figura 89 se ve como las
interacciones maacutes importantes son las descritas teoacutericamente para los enlaces
polares del OH con la ASP214 NH libre con ASP 34 y la posible interaccioacuten del
aacutetomo de fluacuteor de Ar1 con otros restos como tirosina lo que justifica los datos de
actividad de los derivados El resto de interacciones con el sitio activo son
producidas por los restos apolares de la estructura lo que sugiere que es
necesaria la presencia de zonas aromaacuteticas terminales como son los NFT o BZN
en Ar1 y Ar2 Los datos disponibles no permiten establecer una hipoacutetesis sobre
la influencia del tamantildeo de las zonas aromaacuteticas ni de los sustituyentes
presentes en la zona aromaacutetica de Ar2
CONCLUSIONES
Conclusiones
211
El objetivo de este trabajo ha sido la obtencioacuten de nuevos arilaminoalcoholes
como agentes antimalaacutericos para el tratamiento de la malaria resistente al
tratamiento con cloroquina
En las paacuteginas de esta memoria se han presentado los antecedentes del tema
los objetivos fijados y el plan de trabajo para su desarrollo Se ha realizado la
parte experimental correspondiente y ha sido descrito el trabajo realizado en la
preparacioacuten de los compuestos asiacute como en los ensayos bioloacutegicos y
computacionales Finalmente se ha realizado la discusioacuten de los diferentes
resultados obtenidos para obtener unas conclusiones estructura actividad de los
compuestos que se presentan
Desde el punto de vista quiacutemico las aportaciones son las siguientes
1 Se ha sintetizado cuarenta y siete nuevos compuestos derivados de
arilaminas identificados mediante teacutecnicas claacutesicas de elucidacioacuten
estructural como cromatografiacutea de capa fina espectroscopia infrarroja
resonancia magneacutetica nuclear de protoacuten anaacutelisis elemental y punto de
fusioacuten
2 Se ha logrado optimizar rutas sinteacuteticas anteriormente utilizadas para
obtener derivados con mejores rendimientos En el caso de la siacutentesis de
aminas sustituidas se ha comprobado que una relacioacuten molar de amina
protegida-halogenuro de arilo 151 mejora considerablemente los tiempos
de reaccioacuten El uso de esta proporcioacuten de reactivos de partida favorece que
la reaccioacuten finalice en una hora En la obtencioacuten de los derivados
carboniacutelicos por siacutentesis de Mannich la reaccioacuten se optimiza cuando la
temperatura de reflujo se mantiene entre 130 y 140 ordmC De esta forma el
tiempo necesario para completar la reaccioacuten se reduce a un maacuteximo de tres
horas
3 La aplicacioacuten de la cromatografiacutea en columna flash para la purificacioacuten de
23 de los 47 compuestos ha supuesto un notable avance en la obtencioacuten de
los derivados Las condiciones de trabajo se han adaptado a las necesidades
de cada reaccioacuten reducieacutendose asiacute los tiempos globales de siacutentesis
aumentando los rendimientos y disminuyendo los costes
Desde el punto de vista bioloacutegico las aportaciones son las siguientes
1 Diez de los treinta compuestos evaluados in vitro frente a cepas de
Plasmodium falciparum FCR-3 cloroquino resistentes presentan un valor de
CI50 inferior a 1 microM Quince derivados muestran un nivel de citotoxicidad
en ceacutelulas VERO menor de 50 microM Estos resultados permiten confirmar que
la hipoacutetesis de trabajo planteada fue bien dirigida hacia los objetivos
establecidos
2 Los compuestos 2a y 5f fueron seleccionados para desarrollar ensayos in
vivo Los resultados obtenidos no superan los datos de parasitemia y
supervivencia obtenidos en el tratamiento con CQ
3 Los datos obtenidos en los estudios realizados a la totalidad de los
compuestos presentados en este trabajo indican buenas propiedades
fisicoquiacutemicas de solubilidad y distribucioacuten de cargas electrostaacuteticas Con
estos datos teoacutericos se predice un buen perfil de absorcioacuten en el caso de
tratamientos por viacutea oral
4 Los estudios computacionales proponen como diana de los compuestos
desarrollados en este trabajo la enzima Plasmepsina II que interviene en
los procesos de degradacioacuten de la Hb Quedando pendiente su validacioacuten
experimental
5 Siete de los veintiuacuten derivados hidroxiacutelicos que mostraron buenas
actividades in vitro fueron seleccionados para los estudios de acoplamiento
(docking) con la enzima diana plasmepsina II Se obtuvieron buenos
resultados de acoplamiento de los derivados seleccionados en el sitio activo
de la enzima debido a la unioacuten por puente de hidroacutegeno del grupo
hidroxilo con el resto ASP 214 reforzado por el resto de interacciones
electrostaacuteticas de las zonas apolares de la moleacutecula y restos apolares del
hueco activo de la plasmepsina II
De los resultados bioloacutegicos obtenidos se puede establecer la siguiente
relacioacuten estructura-actividad
1 El estudio de la actividad antimalaacuterica ha demostrado que es esencial la
presencia de un grupo hidroxilo en la estructura Queda demostrado que
los compuestos de las Series 1 a 7 muestran actividad significativa frente al
Plasmodium falciparum resistente a la CQ Los derivados cetona (Serie 0) y
oxima (Serie 8) carecen de intereacutes seguacuten los datos de actividad
Conclusiones
213
2 Entre los derivados hidroxiacutelicos los compuestos de las Series 2 5 y 6 son
los que muestran mejores actividades debido a la presencia de un aacutetomo de
fluacuteor en la posicioacuten 5 del benzo[b]tiofeno en la posicioacuten 4 del naftaleno y
para del benceno respectivamente A su vez son los derivados de las Series
5 y 6 (naftalenos y bencenos) los que han mostrado mejores potenciales
antimalaacuterico
3 La longitud miacutenima de la cadena alifaacutetica debe ser tres unidades que
permitan la libre rotacioacuten estructural Los estudios computacionales
plantean que la disminucioacuten de un aacutetomo de carbono de la cadena alifaacutetica
imposibilita la unioacuten esencial de la estructura a la diana propuesta
4 La amina central juega un papel importante en la actividad-toxicidad de las
estructuras Los resultados obtenidos apuntan a que las piperazinas y
tetrahidropiridinas (compuestos 5a 5b 5c 5g 6a y 6g) son las aminas maacutes
adecuadas para formar parte de los compuestos antimalaacutericos por su buena
relacioacuten toxicidad y actividad in vitro Las piperidinas han resultado maacutes
activas (5f y 6f) pero a su vez mas toacutexicas
5 Los sustituyentes o-trifluorometil y p-nitro benceno (compuestos 5a 5f 6a y
6f) confieren en general buena actividad a los derivados estudiados Los
derivados de aril-tetrahidropiridinas sustituidos con un fluacuteor en para
(compuestos 5g y 6g) tambieacuten demuestran buena actividad antimalaacuterica
Con los datos obtenidos del estudio de los derivados sintetizados se ha
establecido un farmacoacuteforo que permite continuar con el refinamiento
estructural de estos nuevos arilaminoalcoholes Queda abierta la viacutea a la
optimizacioacuten de las estructuras la profundizacioacuten en ensayos bioloacutegicos y en el
mecanismo de accioacuten propuesto para la validacioacuten de la diana plasmepsina II
Conclusions
215
CONCLUSIONS
The objective of this work was to obtain new arylamino alcohols as
antimalarial agents for treating chloroquine-resistant malaria
This thesis presents general background information the proposed objectives
and the plan established for developing the work The experimental part was
carried out and a description of the work involved in preparing the
compounds and in performing biological assays and computational analysis
has also been provided Finally this thesis includes a discussion of the all
results obtained and the structure-activity conclusions reached regarding the
compounds presented here
From a chemical standpoint the work carried out made the following
contributions
1 Forty-seven new arylamino-derived compounds (identified by classical
structural elucidation techniques such as thin layer chromatography
infrared spectroscopy proton nuclear magnetic resonance elemental
analysis and melting point) were synthesized
2 Previously used synthetic routes were optimized so as to obtain derivatives
with better yields In the case of the synthesis of substituted amines a molar
ratio of protected amine to aryl halide 151 improves the reaction times
considerably The use of this proportion of starting reagents helps the
reaction to finish in just one hour In obtaining the carbonyl derivatives by
Mannich reaction the reaction is optimized when the reflux temperature is
maintained between 130 and 140 ordmC Therefore time needed to complete the
reaction is reduced to a maximum of three hours
3 Applying flash column chromatography for the purification of 23 out of the
47 compounds has made a notable advance in obtaining the derivatives
The work conditions have been adapted to the specific needs of each
reaction thereby reducing the time needed for syntheses increasing the
yields and bringing down the costs involved
From a biological point of view contributions from this work included the
following
4 Ten out of the thirty compounds evaluated in vitro against chloroquine-
resistant Plasmodium falciparum strain FCR-3 presented an IC50 value less
Conclusions
216
than 1 microM Fifteen derivatives showed a toxicity level in VERO cells that is
less than 50 microM These results show that the established work hypothesis
was a good approach for attaining the proposed objectives
5 Compounds 2a and 5f were selected for developing in vivo assays The
results obtained do not improve the parasitemia and survival data obtained
in treatment with CQ
6 The data obtained from the assays that were performed on all the
compounds presented in this work indicate good physicocochemical
properties of solubility and good electrostatic charge distribution With this
theoretical data a good absorption profile is predicted in the case of orally
administered treatments
7 The computational studies propose the enzyme plasmepsin II as the target
of the compounds that were developed in this study this enzyme is
involved in the degradation processes of Hb although experimental
validation is still pending
8 Seven out of the twenty-one hydroxyl derivatives which showed good in
vitro activity were chosen for docking studies with the target enzyme
plasmepsin II Good docking results were obtained from the selected
derivatives in the active site of the enzyme due to the bonding of the
hydroxyl group with the ASP 214 by means of a hydrogen bridge
reinforced by the rest of the electrostatic interactions from the nonpolar
areas of the molecule and nonpolar rests from the active gap of plasmepsin
II
The following structure-activity relationship has been established from the
biological results that were obtained in the study
9 The antimalarial activity study has demonstrated that the presence of a
hydroxyl group is essential in the study It has been demonstrated that the
compounds from Series 1 to 7 show significant activity against CQ-resistant
Plasmodium falciparum Based on their activity data the ketone (Series 0)
and oxime (Series 8) derivatives are not of interest
10 From among the hydroxyl derivatives compounds from the Series 2 5 and
6 show the best activity due to the presence of a fluorine atom in position 5
of the benzo[b]thiophene in position 4 of the naphthalene and in para
position of the benzene respectively In addition derivatives from the
Conclusions
217
Series 5 and 6 (naphthalenes and benzenes) have shown better antimalarial
potential
11 The minimum length of the aliphatic chain should be three units that
permit free rotation The computational studies suggest that a decrease of
one carbon atom from the aliphatic chain impedes the essential linking of
the structure to the proposed target
12 The central amine plays an important roll in the toxicity-activity of the
structures The obtained results appear to indicate that the piperazines and
tetrahydropyridines (compounds 5a 5b 5c 5g 6a and 6g) are the most
adequate amines for forming part of the antimalarial compounds due to
their good activity-toxicity relationships in vitro The piperidines were more
active (5f and 6f) but they were also more toxic
13 In general the o-trifluoromethyl y p-nitro benzene substituents (compounds
5a 5f 6a and 6f) give good activity to the derivatives that were studied The
aryl-tetrahydropyridine derivatives that are substituted with fluorine in
para position (compounds 5g and 6g) also show good antimalarial activity
With the data obtained from the study carried out on the synthesized
derivatives a pharmacophore has been established which permits continuing
with the structural refinement of these new arylamino alcohols The road for
optimizing structures and advancing in biological testing and in the mechanism
of action proposed for validating the target plasmepsin II remains wide open
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prehensive20identification20and20classification20of20ligand2
0binding20envelopes
ANEXOS
A mis padres y mi hermana
A Javi y Julen
ldquoPuede que los ideales que albergamos
nuestros suentildeos maacutes anhelados y nuestras maacutes fervientes esperanzas
no lleguen a cumplirse mientras vivimos
Pero eso no importa
Saber que en tu diacutea cumpliste con tu deber y
estuviste a la altura de las expectativas de tus congeacuteneres
es por siacute misma una experiencia gratificante y un logro magniacuteficordquo
Nelson Mandela
Agradecimientos
La realizacioacuten de esta tesis doctoral no hubiese podido llevarse a cabo sin la ayuda y
el apoyo de las personas que han compartido conmigo estos uacuteltimos antildeos A todos
ellos que han hecho posible hoy la presentacioacuten de este trabajo deseo expresar mi maacutes
sincero agradecimiento
Mi agradecimiento especial al Dr Antonio Monge la persona de referencia durante
el desarrollo de todo este trabajo Por apostar por miacute y mi trabajo en momentos en que
todo pareciacutea que no llegariacutea a teacutermino Por ensentildearme que todo el trabajo merece la
pena que la contribucioacuten de todos es igual de vaacutelida que somos una familia Gracias
por su apoyo en los buenos y malos momentos personales
Mi gratitud a la Dra Silvia Peacuterez Silanes por estar siempre dispuesta a ayudarme en
todo lo que fuese necesario en todos los planos de la vida durante estos antildeos por su
gran implicacioacuten en este proyecto por transmitirme tesoacuten orden correccioacuten y sobre
todo optimismo durante todo este tiempo que he tenido el honor de trabajar a su lado
Gracias al Dr Ignacio Aldana la persona que me ofrecioacute la oportunidad de
introducirme en el mundo de la investigacioacuten por ayudarme y apoyarme en todo
momento y transmitirme que en investigacioacuten tambieacuten es importante la tranquilidad
I wish to express my gratitude to Dr Valerie Jullian for being such a splendid host
during my first few days in Toulouse and for considering my small contribution to his
magnificent work to be of importance
I would also like to thank Dr Michel Sauvain for introducing me into the world of in
vivo biological research He accepted the challenge of introducing a chemist into his
specialized area of experimentation with live rodents showing a great amount of
patience with me
I want to give a special thanks to Dr Eric Deharo who had faith in this work and
whose collaboration was immensely helpful He provided the necessary contacts of
other researchers outside the University of Navarras RampD department and
coordinated the project contributing to the success of this work
I would also like to give a special mention to Adriana Pabon from Colombia and to
German Gonzalez Giovanni Garavito and Miguel Quiliano from Peru for their active
participation in this project
A todos los compantildeeros de laboratorio con los que he trabajado estos antildeos
A mi familia por animarme a seguir siempre adelante al hacerme sentir en todo
momento que todo este trabajo es algo de gran importancia y valor humano
ABREVIATURAS
ABS Porcentaje de absorcioacuten
ADN Aacutecido desoxirribonucleico
AMREF African Medical and Reserch Foundation
ARN Aacutecido ribonucleico
ASP 214 Aspartato 214
ASP 34 Asptartato 34
ATP Adenosin trifosfato
BZN Benceno
BZT Benzotiofeno
CCF Cromatografiacutea en capa fina
CDCl3 Triclorometano deuterado
CI50 Concentracioacuten Inhibitoria al 50
COSY Correlated Espectroscopy H-H
CQ Cloroquina
CSP Proteina circumsporozito
DDT Dicloro-difenil-Tricloroetano
DEET NN-dimetil-meta-toluamida
DEPT 90 Distorsionless Enhancement by Polarization Transfer (CH)
DEPT-135 Distorsionless Enhancement by Polarization Transfer
DMEN F-12 Medio de cultivo con mezcla de nutrientes
DMSO Dimetilsulfoacutexido
DOXP Enzima 1-desoxi-D-xilulosa-5-fosfato
DT50 Dosis Toacutexica al 50
ECDC European Centre for Disease Prevention and Control
EMP-1 Proteiacutena de la membrana epitelial
FM Foacutermula Molecular
FAS II Siacutentesis de aacutecidos grasos II
FBZT Fluoro-benzotiofeno
FCR-3 Cepas Plasmodium Falciparum Cloroquino-resistente
FNFT Fluoro-naftaleno
FRP Asociacioacuten de la lucha contra el Paludismo
Hb Hemoglobina
HMBC Heteronuclear Multiple Bond Correlation
HMQC Heteronuclear Multiple Quantum Correlation
HPLC High Performance Liquid Chromatography
HRP-2 Proteiacutena Rica en Histidina
IC50 Concentracioacuten Inhibitoria del 50
IR Espectroscopia Infrarroja
IS Iacutendice de Selectividad
J Constante de Acoplamiento
K Lisina (coacutedigo de una letra)
LDH Lactato Deshidrogenasa
MSP-1 Proteiacutena de superficie del merozoiacuteto
MTT Bromuro de 3-(45- dimetiltiazol-2-ilo)-25-difeniltetrazol
NaOH Hidroacutexido de sodio
NEAA Nonessential amino-acids
NFT Naftalenos
OMS Organizacioacuten Mundial de la Salud (en ingleacutes WHO)
PM Peso Molecular
PENUD Programa de Naciones Unidas para el Desarrollo
PfCRT Proteiacutena Transportadora del Plasmodium falciparum causante
de la resistencia a la Cloroquina
PIPR Piperidina
PIPZ Piperazina
PIRD Tertrahidropiridina
PIRR Pirrolidina
R Arginina (coacutedigo de una letra)
RMN Resonancia Magneacutetica Nuclear
RMSD (Root-mean-square derivation) Desviacioacuten de la media
cuadraacutetica
S Serina (coacutedigo de una letra)
S163R Mutacioacuten arginina-serina en posicioacuten 163 que invierte la
resistencia a la Cloroquina
T Treonina (simplificacioacuten para codificacioacuten en aminoaacutecidos)
TCA Terapias Combinadas de Artemisina
THR Treonina
TNFα Factor de Necrosis tumoral
TPSA Aacuterea superficial Topoloacutegica
TYR Tirosina
UNICEF Fondo de Naciones Unidas para la Infancia
Iacutendice
INTRODUCCIOacuteN 1
I MALARIA 3
I1 Definicioacuten 5
I2 Historia de la enfermedad 5
I3 Epidemiologiacutea 7
I31 Situacioacuten global de la enfermedad 7
I32 Factores epidemioloacutegicos 11
I33 Tipologiacutea de aacutereas endeacutemicas 11
I34 Zonas endeacutemicas e inmunidad 12
II MALARIA Y PLASMODIUM 13
II1 El Plasmodium 15
II11 Caracteriacutesticas morfoloacutegicas 15
II12 Mecanismo de movilidad 16
II13 Mecanismo de invasioacuten celular 16
II14 Metabolismo para el crecimiento 17
II2 Ciclo de la malaria 18
II21 Ciclo de vida del paraacutesito 18
II22 Desarrollo de los esquizontes 20
II3 Especies de Plasmodium 22
II4 Sintomatologiacutea 25
II5 Deteccioacuten y diagnoacutestico 26
III PREVENCIOacuteN Y TRATAMIENTO 29
III1 Medidas preventivas 31
III2 Tratamiento 32
III21 Historia del tratamiento 32
III22 Clasificacioacuten de los compuestos antimalaacutericos 33
III23 Aparicioacuten de resistencias 38
III24 Tratamientos actuales 40
III3 Estrategias mundiales en la lucha contra la malaria 43
III4 Liacuteneas de investigacioacuten actual 44
III41 Buacutesqueda de nuevas dianas 44
III42 Productos naturales 46
III43 Desarrollo de vacunas 47
ANTECEDENTES 49
OBJETIVOS Y PLAN DE TRABAJO 53
IV OBJETIVOS 55
V PLAN DE TRABAJO 59
V1 Disentildeo de nuevos arilaminoalcoholes 61
V2 Siacutentesis de los compuestos disentildeados 63
V3 Caracterizacioacuten de los compuestos 63
Iacutendice
V4 Evaluacioacuten bioloacutegica ldquoin vitrordquo 64
V5 Evaluacioacuten bioloacutegica ldquoin vivordquo 64
V6 Estudios computacionales 64
MATERIAL Y MEacuteTODOS 65
VI QUIacuteMICA TEOacuteRICA 67
VI1 Esquema general de siacutentesis 69
VI2 Siacutentesis de precursores 70
VI21 Siacutentesis de (benzo[b]tiofen-3-il)-3-cloropropan-1-ona 70
VI22 Siacutentesis de arilaminas 70
VI3 Siacutentesis de derivados carboniacutelicos (Serie 0) 73
VI31 Condensacioacuten de 1-(benzo[b]tiofen-3-il)-3-cloropropan-1-ona y de 2-bromo-2acute-acetonaftona
con la amina (Viacutea 1) 73
VI32 Reaccioacuten de Mannich Condensacioacuten de metilcetonas con aminas en medio aacutecido (Viacutea 2) 74
VI4 Siacutentesis de derivados hidroxiacutelicos (Series 1-7) 75
VI5 Siacutentesis de oximas (Serie 8) 78
VII QUIacuteMICA EXPERIMENTAL 81
VII1 Instrumental y reactivos 83
VII2 Meacutetodos de elucidacioacuten estructural 83
VII3 Denominaciones de compuestos 85
VII4 Descripcioacuten general de meacutetodos de siacutentesis 86
VII41 Meacutetodo A procedimiento general para la obtencioacuten de las arilaminas protegidas 86
VII42 Meacutetodo B procedimiento general para la desproteccioacuten de aminas 87
VII43 Meacutetodo C procedimiento general para condensacioacuten de aminas (Viacutea 1) 87
VII44 Meacutetodo D procedimiento de condensacioacuten de aminas (Viacutea 2) 87
VII45 Meacutetodo E procedimiento general para la reduccioacuten de cetonas 88
VII46 Meacutetodo F procedimiento general para siacutentesis de oximas desde carbonilos 88
VII5 Purificacioacuten por cromatografiacutea flash 89
VIII ENSAYOS BIOLOacuteGICOS 91
VIII1 Ensayos in vitro 93
VIII2 Ensayos toxicoloacutegicos 94
VIII3 Ensayos in vivo 94
VIII31 Instrumental y reactivos 95
VIII32 Metodologiacutea 95
IX ESTUDIOS COMPUTACIONALES 105
IX1 Propiedades fisicoquiacutemicas de los compuestos 107
IX2 Optimizacioacuten geomeacutetrica 107
IX3 Estudios de Acoplamiento Molecular (Docking) 108
RESULTADOS Y DISCUSIOacuteN 111
X DESCRIPCIOacuteN DE COMPUESTOS 113
Iacutendice
X1 Siacutentesis de precursores 115
X2 Siacutentesis de derivados carboniacutelicos (Serie 0) 120
X3 Siacutentesis de derivados hidroxiacutelicos 143
X4 Siacutentesis de Oximas (Serie 8) 165
X5 Purificacioacuten de compuestos por cromatografiacutea flash 167
X6 Elucidacioacuten estructural de compuestos por RMN 168
X61 Elucidacioacuten estructural para los derivados de piperazina 168
X62 Elucidacioacuten estructural para los derivados de piperidina 175
X63 Elucidacioacuten estructural para los derivados de tetrahidropiridina 180
XI ENSAYOS BIOLOacuteGICOS 187
XI1 Ensayos de actividad antiplasmoacutedica in vitro 189
XI2 Ensayos de actividad antiplasmoacutedica in vivo 191
XI3 Discusioacuten de ensayos bioloacutegicos 192
XII ENSAYOS COMPUTACIONALES 195
XII1 Propiedades fisicoquiacutemicas de los compuestos 197
XII2 Discusioacuten de propiedades fisicoquiacutemicas 199
XII3 Estudios de Modelizacioacuten y Acoplamiento Molecular 200
XII4 Discusioacuten de resultados de modelizacioacuten 207
CONCLUSIONES 209
BIBLIOGRAFIacuteA 219
ANEXOS 231
INTRODUCCIOacuteN
II MMAALLAARRIIAA
Malaria
5
I1 Definicioacuten
La malaria fiebre paluacutedica o tambieacuten llamada paludismo es una enfermedad
infecciosa causada por el paraacutesito protozoario del filo Apicomplexa clase
Aconoidasida orden Haemosporididae de la familia Plasmodiidae del geacutenero
Plasmodium1 y es transmitido por la hembra del mosquito del geacutenero Anopheles
La malaria es una de las enfermedades tropicales maacutes importante del mundo
que provoca la muerte de miles personas Estaacute estrechamente ligada a la
pobreza y a la evolucioacuten y el desarrollo del hombre
Los mayores problemas en la lucha contra la enfermedad ademaacutes de la crisis
actual que reduce los fondos destinados a los paiacuteses en viacuteas de desarrollo (que
son los maacutes afectados) son la constante aparicioacuten de resistencias por el uso de
monoterapias en tratamientos y debido a los insecticidas utilizados
I2 Historia de la enfermedad
La historia de la malaria es tan antigua como la historia de la civilizacioacuten ya
que se tiene constancia de la presencia de la enfermedad en manuscritos
originarios de China la India o el Antiguo Egipto
Teniendo en cuenta esto se puede entender de donde proviene el nombre de
la enfermedad La palabra malaria proviene de las palabras ldquomal ndashairerdquo que
fueron empleadas en Italia para describir las fiebres intermitentes asociadas a la
exposicioacuten al ambiente de las marismas o cieacutenagas El otro nombre por el que
nos referimos a la enfermedad proviene del latiacuten ldquopalusrdquo que significa pantano
cieacutenaga de ahiacute la denominacioacuten de fiebres paluacutedicas o paludismo
Aunque su nombre tiene su origen en Europa se cree que los paraacutesitos se
desarrollaron en el oeste y centro oeste de Aacutefrica y en el sudeste asiaacutetico Es
importante tener en cuenta su estrecha relacioacuten con la historia natural Ha sido
la evolucioacuten del hombre la que ha expandido la enfermedad de ahiacute que hay
que ser muy conscientes de que durante la historia de la humanidad ha habido
picos de enfermedad ocasionados por la accioacuten del hombre y su desarrollo No
es de extrantildear dicha variacioacuten en la incidencia cuando en China hace maacutes de
5000 antildeos que se conoce la enfermedad2 y los textos egipcios dejan constancia
1httpwwwncbinlmnihgovTaxonomy 2 httpwwwmalariasitecommalariahistory_literaturehtm
Malaria
6
de ella desde hace ya 4000 antildeos Se puede saber por textos antiguos que la
enfermedad se extiendioacute por el mar Mediterraacuteneo hace 2000 antildeos y que al Norte
de Europa llegoacute hace aproximadamente 1000 antildeos Podemos darnos cuenta de
que la malaria ha avanzado unida a la historia del hombre si se tiene en cuenta
que cada vez es mayor la intercomunicacioacuten de sociedades alejadas
geograacuteficamente las continuas guerras e invasiones las rutas comerciales el
comercio de esclavos la profundizacioacuten y especializacioacuten de cultivos propensos
a la criacutea del paraacutesito como arrozales (humedales) el desarrollo de los medios de
transporte que permiten viajar a grandes distancias el aumento y la lejaniacutea de
las migraciones la democratizacioacuten de las vacaciones el comercio-intercambio
de grandes cantidades de alimentos el cada vez mayor trasiego de animales
vivos
Alrededor de 400 aC en la antigua Roma Hipoacutecrates fue el primero en
describir las manifestaciones tiacutepicas de la malaria que la diferenciaba de otras
enfermedades estudioacute la eacutepoca del antildeo donde aumentaba la enfermedad y el
lugar de vida de los enfermos Con ello establecioacute una relacioacuten enfermedad-
agua estancada que dio lugar a los primeros programas de drenaje de agua en
Roma y a la primera intervencioacuten contra la malaria
La escuela hipocraacutetica sosteniacutea que la enfermedad era el resultado de un
desequilibrio en el cuerpo de los cuatro humores unos fluidos que en las
personas sanas se encontraban naturalmente en una proporcioacuten semejante
Cuando los cuatro humores (sangre bilis negra bilis amarilla y flema) se
desequilibraban (laquodyscrasiaraquo mala mezcla) el individuo enfermaba y
permaneciacutea enfermo hasta que se recuperaba el equilibrio La terapia
hipocraacutetica se concentraba en restaurar este equilibrio El tratamiento maacutes
administrado era la purga de la sangre
No seriacutea hasta el antildeo 100 dC cuando se pensoacute que la enfermedad se
transmitiacutea por inhalacioacuten de vapores de la enfermedad el ldquomal airardquo italiano
No era tan errado el diagnoacutestico ya que por el aire vuelan los responsables de
transmitir los paraacutesitos que ocasionan la enfermedad Del otro sinoacutenimo de
malaria se deriva una confusioacuten semejante que llega tambieacuten indirectamente
del aire el paludismo rdquopalusrdquo en latiacuten designa a los pantanos que se creiacutean
responsables de la dolencia pero en realidad era donde proliferaban los
mosquitos Habraacute que esperar hasta 1898 en que se demostroacute que la malaria era
Malaria
7
transmitida por estos cuando ya se relacionaba la enfermedad con larvas del
moquito y microorganismos involucrados en la infeccioacuten
El nacimiento y desarrollo de la microbiologiacutea supuso un salto importante en
el conocimiento de las ciencias y como no podiacutea ser menos impulsoacute el
conocimiento de la enfermedad Asiacute en el antildeo 1880 el cirujano franceacutes Charles
Louis Alphonse Laveran (disciacutepulo de Pasteur) observoacute en Argelia los paraacutesitos
dentro de los gloacutebulos rojos de personas infectadas Planteoacute entonces que la
enfermedad era causada por protozoos siendo esta la primera vez que se
asociaba un protozoo con una enfermedad humana Posteriormente sus
estudios sobre protozoos le reportaron el Nobel de Medicina en 1907 aunque
fueron los cientiacuteficos italianos Ettore Marchiafava y Angelo Celli los que
bautizaron a estos protozoos con el nombre de ldquoPlasmodiumrdquo Carlos Finlay
meacutedico cubano sugirioacute por sus conocimientos sobre la fiebre amarilla que la
malaria podiacutea ser transmitida tambieacuten por mosquitos Hipoacutetesis confirmada en
el antildeo 1898 por Sir Ronald Ross en la India por lo que le fue concedido el
premio Nobel de medicina en 1902 Desde ese momento los estudios
protozoarios fueron avanzando y al poco tiempo en el antildeo 1899 Grassi
Bignami y Basianelli descubrieron el ciclo completo de la enfermedad el ciclo
celular protozoario y su transmisioacuten3
Desde entonces hasta la actualidad se han desarrollado diferentes
conocimientos y modos de prevencioacuten y tratamiento Un caso muy interesante
y uacutetil de estos avances fue el hecho de que los trabajos realizados por Finlay y
Ross sirvieron para crear las primeras guiacuteas de salud muy uacutetiles en eventos tan
importantes para el mundo como la construccioacuten del Canal de Panamaacute
I3 Epidemiologiacutea
I31 Situacioacuten global de la enfermedad
Seguacuten el informe de 2011 de la OMS4 sobre malaria son 106 paiacuteses los que
incluyen esta enfermedad como endeacutemica Se estima en 216 millones los casos
registrados a nivel mundial de los que se han producido 266 mil muertes Los
esfuerzos en la lucha contra la enfermedad de los diferentes organismos
3 httpwwwmedicinamcom 4httpwwwwhointmalariaes
Malaria
8
internacionales han dado como resultado un descenso de un 25 de las tasas de
mortalidad por malaria en la uacuteltima deacutecada5
Figura 1 Distribucioacuten mundial de la malaria paiacuteses libres endeacutemicos y en tratamiento6
En la figura 1 se observa coacutemo la malaria es una enfermedad asociada a la
pobreza y a los climas tropicales El 81 de los casos detectados provienen de
Aacutefrica subsahariana aunque a nivel mundial el 86 de las viacutectimas de la
malaria son nintildeos menores de cinco antildeos
De los 3300 millones de personas en riesgo de contraer la malaria 2100
millones se encuentran en situacioacuten de alto riego de los que el 47 pertenecen
al continente africano y el 37 al asiaacutetico De los 1200 millones restantes que
estaacuten en bajo riesgo de contraer malaria el 94 no son africanos En Aacutefrica
seguacuten los datos del informe de la Fundacioacuten para la investigacioacuten y la medicina
africana (AMREF) de 20117 se concentra la mayor poblacioacuten en riesgo donde el
apoyo externo es mayor y donde por el contrario se invierte el menor gasto
puacuteblico El 90 de los casos de malaria los produce el plasmodio maacutes agresivo
el P falciparum Seguacuten la OMS muchos paiacuteses de la regioacuten africana han
registrado desde el antildeo 2000 hasta 2010 un descenso mayor del 50 de casos
confirmados ingresos y muertes Esto se debe a los cada vez maacutes eficaces
sistemas de vigilancia Del 25 de la disminucioacuten mundial de las muertes
causadas por la malaria un 33 corresponde a Aacutefrica8 En el continente
americano la malaria se centra en la zona amazoacutenica y de Centroameacuterica En
5 Centro de prensa de la OMS (dic 2011) 6 Disponible en httpwwwwhointmalariaworld_malaria_report_2009 7httpwwwamrefesuploadsdocumento 8 Diez datos sobre el paludismo (OMS abril 2012)
Malaria
9
estas zonas se dan menos casos de malaria que en la regioacuten africana pero la
inversioacuten del gasto puacuteblico para erradicarla es mucho mayor La mayoriacutea de los
casos son producidos por el P vivax aunque tambieacuten se dan casos de P
falciparum Del 25 de la disminucioacuten mundial el 55 corresponde a este
continente
En Asia la situacioacuten es maacutes complicada de definir porque depende mucho de
la zona geograacutefica En la zona del sudeste asiaacutetico la situacioacuten es maacutes grave
maacutes parecida a Aacutefrica donde predominan los casos de P falciparum En el resto
de Asia predomina sin embargo el P vivax como en centro y Sudameacuterica En
Oceaniacutea la situacioacuten es muy parecida a la zona de Asia donde la malaria no es
tan grave La disminucioacuten de las muertes supone un 42 de la disminucioacuten de
mortalidad por malaria en este continente
El continente europeo se consideraba libre de malaria desde hace unos antildeos
pero en la actualidad se han registrado nuevos datos El 80 de los casos de la
Europa Occidental se registran en Francia Inglaterra Italia y Alemania Son
zonas donde la malaria se produce de forma ocasional estacional o por razones
de migraciones humanas (ECDC 20119) La zona de Oriente medio concentran
el mayor nuacutemero de casos ocasionados por P vivax La tasa de mortalidad por
malaria en Europa ha disminuido hasta el 1 de los casos
I311 La malaria en Espantildea
La lucha antipaluacutedica fue la primera intervencioacuten sanitaria espantildeola que se
basoacute en criterios epidemioloacutegicos es decir se planificoacute en base a datos de
prevalencia de la enfermedad En 1920 se realizoacute una organizacioacuten de Lucha
Antiplasmoacutedica que consiguioacute con la creacioacuten de dispensarios antipaluacutedicos el
estudio del vector con la participacioacuten y asesoramiento de entomoacutelogos
especialistas en saneamiento ambiental dieron como resultado en los antildeos 30
una disminucioacuten de los datos endeacutemicos en Espantildea En la guerra civil espantildeola
por el debilitamiento socioeconoacutemico y las circunstancias propias de una guerra
se produjo un recrudecimiento de la malaria
9 ECDC European Centre for Disease Prevention and Control Centro de la Unioacuten Europea creado en 2005 para el control de las enfermedades infecciosas con sede en Suecia
Malaria
10
Figura 2 Distribucioacuten de la malaria en Espantildea en el antildeo 193310
En el antildeo 1943 ante la evidente gravedad sanitaria del paiacutes se produce una
reactivacioacuten del Dispensario y un uso masivo de insecticidas A esto se le suma
la firma del convenio con la OMS para potenciar la erradicacioacuten de la malaria
en Espantildea
En 1943 se da por finalizada la campantildea entrando en fase de mantenimiento
que da paso en 1964 a la declaracioacuten de paiacutes libre de malaria por la OMS
siempre teniendo en cuenta que se han de mantener los sistemas de vigilancia
de la enfermedad
En 1961 se registra el uacuteltimo caso de malaria autoacutectona en Espantildea aunque desde
la declaracioacuten de zona libre se han descrito por parte de la Red nacional de
vigilancia epidemioloacutegica varios casos de malaria En el antildeo 2001 se registraron
466 casos diagnosticados en Espantildea asociados a inmigrantes y turistas ademaacutes
se debe tener en cuenta la posibilidad de producirse casos por transfusiones
sanguiacuteneas trasiego de jeringuillas de pacientes drogadictos o malaria de
aeropuerto (Bueno Mari R y Jimenez Peydro R 2008)
El uacuteltimo caso de malaria en Espantildea se diagnosticoacute en una mujer en Aragoacuten en
2009 Por esto se incrementaron las alertas pero no han quedado registrados
maacutes casos (Santa Olalla et alts 201011)
10 Disponible en httpscieloisciiiesscielophppid=s1135-57272008000500003ampscript=sci_arttext 11 httpwwweurosurveillanceorgViewArticleASPxArticleId=19684
Malaria
11
I32 Factores epidemioloacutegicos
La epidemiologiacutea de esta enfermedad depende principalmente de dos
factores
- Primarios
o Hueacutesped o fuente de infeccioacuten hombre portador
o Vector hembras de ciertas especies de mosquito Anopheles
o Susceptibilidad humana este es el factor maacutes variable ya que
depende de factores de inmunidad natural o adquirida factores
geneacuteticos edad (los nintildeos estaacuten maacutes expuestos) migraciones
ocupacioacuten y caracteriacutesticas socioeconoacutemicas
- Secundarios son los que ayudan a la transmisioacuten de la enfermedad como
los factores geograacuteficos (altura sobre el nivel del mar) o climatoloacutegicos
(temperatura humedad atmosfeacuterica o lluvias)
I33 Tipologiacutea de aacutereas endeacutemicas
Seguacuten la proporcioacuten de poblacioacuten que se encuentre afectada las aacutereas donde
la enfermedad estaacute considerada como endeacutemica se dividen en cuatro12
- Aacutereas hipo-endeacutemicas son aquellas donde la malaria afecta a menos del
10 de la poblacioacuten
- Aacutereas meso-endeacutemicas aquellas donde la poblacioacuten afectada estaacute entre el
11 y el 50
- Aacutereas hiper-endeacutemicas son las aacutereas donde el porcentaje de poblacioacuten
afectada estaacute entre el 51 y el 75
- Aacutereas holo-endeacutemicas aquellas donde maacutes del 75 de la poblacioacuten es
portadora de la enfermedad Estas aacutereas estaacuten asociadas a malaria latente
Las hiper y holo-endeacutemicas se caracterizan por alta mortalidad infantil y
juvenil pero los adultos suelen ser asintomaacuteticos por la inmunidad especiacutefica
que generan algunos humanos al sufrir maacutes de una picadura por mosquito
infectado al diacutea
12httpwwwmonografiascomtrabajos77paludismo-enfermedad-tercer-mundopaludismo-enfermedad-tercer-mundo2shtml
Malaria
12
I34 Zonas endeacutemicas e inmunidad
El ciclo de vida del paraacutesito es complejo e involucra distintos medios lo que
demuestra su capacidad para entrar y salir de diferentes ceacutelulas tanto del
hueacutesped como del vector Para ello el paraacutesito debe cambiar su forma la
constitucioacuten y el modo de presentacioacuten de sus proteiacutenas y receptores asiacute se
pone de manifiesto que su respuesta inmune a los tratamientos es muy
compleja A su vez la respuesta inmune del hueacutesped debe generar respuestas
especiacuteficas para las diferentes formas del paraacutesito lo que se denomina
Inmunidad adaptada
Los tipos de inmunidad consideradas para la enfermedad son tres
- Natural ciertos grupos de poblacioacuten poseen alguacuten grado de resistencia
conferida por factores geneacuteticos como la deficiencia de la G6PDH que
confiere resistencia al paraacutesito o la mutacioacuten Hemoglobina E (Hb E la
mutacioacuten del gen que codifica la cadena β-globina que compone la Hb
tambieacuten conocido como talasemia) Hb S (anemia drepanociacutetica) o Hb
fetal
- Adquirida con este tipo de infeccioacuten se produce premunicioacuten13 Se da en
personas de exposicioacuten prolongada como los habitantes de zonas holo-
endeacutemicas El problema estaacute en que la inmunidad adquirida es una
inmunidad parcial y relativa y no garantiza la inmunidad esterilizante
Es una inmunidad especiacutefica a un lugar determinado que en muchos
casos se pierde tras el cambio de haacutebitat a zonas donde la malaria no es
endeacutemica Esto conlleva que el individuo sea vulnerable si vuelve
posteriormente a zonas endeacutemicas
- Pasiva es la que suele relacionarse con el embarazo La conferida por la
madre al feto en muchos lugares donde la enfermedad es endeacutemica
13 (Edm Sergent L Parrot y A Donatien 1924) (Del latiacuten prae antes y munire fortificar) Sinoacutenimo inmunidad de infeccioacuten o de sobreinfeccioacuten (R Debreacute y Bonnet 1927) inmunidad no esterilizante inmunidad relativa (Pasteur 1881 Plehn 1901 von Wasielewski 1901-1908) inmunidad parcial (J Bordet 1920) inmunidad- tolerancia premunidad (Ch Nicolle) laquoEstado de resistencia a toda sobreinfeccioacuten de un organismo ya infectado La premunicioacuten que es simultaacutenea a la infeccioacuten y cesa con ella es conferida por diversas enfermedades infecciosas croacutenicas (paludismo piroplasmosis tuberculosis siacutefilis brucelosis etc) Se opone a la inmunidad verdadera que caracteriza la resistencia del organismo curado a toda reinfeccioacuten es generalmente durable y consecutiva a ciertas infecciones agudas (sarampioacuten escarlatina viruela carbunco fiebre tifoidea etc)raquo (Edm Sergent)
IIII MMAALLAARRIIAA YY PPLLAASSMMOODDIIUUMM
Malaria y Plasmodium
15
II1 El Plasmodium
El Plasmodium es un protozoo eucariota unicelular esporozoario que se
caracteriza por un estilo de vida intracelular obligado con orgaacutenulos
especializados en las diferentes funciones vitales La proliferacioacuten se produce
por invasioacuten celular crecimiento y divisioacuten celular hasta que las reacuteplicas
destruyen la ceacutelula hueacutesped Ademaacutes es el miembro maacutes importante de los
Apicomplexa grupo de clasificacioacuten al que pertenecen tambieacuten otros paraacutesitos
como el toxoplasma o el criptosporium De las 175 especies de Plasmodium son 4
especies las que pueden infectar a humanos P vivax P ovale P falciparum y P
malariae Las tres primeras son las que afectan en mayor grado al hombre
siendo el P falciparum el maacutes violento y resistente Existe una quinta P
knowlesi que afecta maacutes a los grandes simios pero desde hace pocos antildeos se ha
registrado alguacuten caso de infeccioacuten humana por este tipo de paraacutesitos (Figtree et
alts 2010)
El paludismo es causado por paraacutesitos del geacutenero Plasmodium que se
transmiten al ser humano por la picadura de mosquitos infectados de las 20
especies del geacutenero Anopheles los llamados vectores del paludismo que pican
sobre todo entre el anochecer y el amanecer en zonas con climas tropicales
II11 Caracteriacutesticas morfoloacutegicas
El Plasmodium es un protozoo con orgaacutenulos especializados suspendidos en el
citoplasma que se encargan de sus diferentes necesidades como movimiento
invasioacuten celular penetracioacuten de membranas celulares expulsioacuten enzimas
eliminacioacuten de metabolitos o nutricioacuten por fagocitosis
Los trofozoiacutetos son las formas vegetativas moacuteviles que constan de membrana
citoplasma y nuacutecleo La membrana limita el contorno celular protege y permite
el intercambio de sustancias Aquiacute se produce el metabolismo de fosfoliacutepidos y
el mecanismo de transporte de protones y sodio El citoplasma es un sistema
coloidal que representa el cuerpo donde se desarrollan funciones como siacutentesis
de folatos y glicoacutelisis ademaacutes de biosiacutentesis de nucleoacutetidos necesarios para la
reproduccioacuten El nuacutecleo eucarionte contiene el ARN y ADN del paraacutesito
Malaria y Plasmodium
16
II12 Mecanismo de movilidad
Una de las principales caracteriacutesticas del paraacutesito es que no tiene sistema de
locomocioacuten (cilios ni flagelos) su movilidad se produce por deslizamiento Se
ha estudiado (Casanova Morales 2010) que la membrana del paraacutesito tiene dos
dimensiones citoesqueleto y submembrana El movimiento se produce gracias
al citoesqueleto en concreto al sistema actina-miosina que actuacutea como motor
molecular La miosina se transporta a lo largo de los filamentos de la actina con
la energiacutea obtenida de la hidroacutelisis de ATP e interacciona con las adhesinas
transmembrana de la superficie de la ceacutelula hueacutesped Por medio de una
trayectoria helicoidal generada con estas interacciones se produce el
desplazamiento
II13 Mecanismo de invasioacuten celular
Uno de los organelos funcionales maacutes caracteriacutesticos es el orgaacutenulo o
complejo apical que se localiza en un extremo del paraacutesito y estaacute involucrado en
la interaccioacuten hueacutesped paraacutesito durante la invasioacuten celular Su funcioacuten se
relaciona con la adherencia y perforacioacuten de membrana eritrociacutetica ya que
excreta una sustancia que facilita la penetracioacuten celular imprescindible para la
supervivencia del paraacutesito Este orgaacutenulo estaacute presente en las formas
esporozoiacuteto merozoiacuteto y ookinete
La invasioacuten de un eritrocito induce un proceso controlado y transitorio de
rotura de la membrana y reorganizacioacuten de la ceacutelula Es un proceso complicado
(Gratzer y Dluzewski 1993) que conlleva un contacto inicial reorientacioacuten y
deformacioacuten del eritrocito unioacuten de formacioacuten y entrada del paraacutesito Las
interacciones con el eritrocito se piensa que son al azar y que son interacciones
reversibles entre proteiacutenas de superficie del paraacutesito y del gloacutebulo rojo
Son muchas las proteiacutenas implicadas en estos procesos como la proteiacutena de
superficie del merozoiacuteto 1 (MSP-1) que participa directamente en el paso de
invasioacuten y es una de las dianas terapeacuteuticas planteadas actualmente Otra
proteiacutena diana es la proteiacutena circumsporozoiacuteto (CSP) que estaacute implicada en los
procesos de reorientacioacuten del complejo apical En la invasioacuten se producen
cambios en la composicioacuten lipiacutedica de la membrana El paraacutesito una vez
realizada la invasioacuten exporta proteiacutenas como la proteiacutena de membrana epitelial
(EMP) a la membrana eritrociacutetrica que evita que se produzca la depuracioacuten de
los eritrocitos infectados en el bazo Durante la invasioacuten de la membrana
Malaria y Plasmodium
17
diferentes orgaacutenulos del paraacutesito van introducieacutendose en el eritrocito y
producen la unioacuten con la ceacutelula hueacutesped
II14 Metabolismo para el crecimiento
La caracteriacutestica principal del paraacutesito es la dependencia total del hueacutesped
para la supervivencia Como consecuencia de la invasioacuten aumenta la tasa
metaboacutelica de los eritrocitos infectados con cambios en la permeabilidad de
membrana que permiten por fagocitosis el ingreso de solutos necesarios para el
desarrollo del Plasmodium Este cambio de permeabilidad da preferencia al paso
de aniones y solutos como monosacaacuteridos aminoaacutecidos nucleoacutesidos lactato
acido pantoteacutenico y amonio cuaternario La composicioacuten ioacutenica del paraacutesito
depende del proceso de transporte a traveacutes de tres membranas la membrana
plasmaacutetica del eritrocito la vacuola digestiva y la membrana digestiva del
paraacutesito
Las alteraciones proteicas de la membrana intervienen en el transporte de
nutrientes y productos de desecho ademaacutes de evitar la accioacuten del sistema
inmune del hueacutesped Mediante endocitosis el Plasmodium retiene porciones del
citoplasma del eritrocito dentro de vesiacuteculas que se fusionan con la vacuola
digestiva El paraacutesito tiene mitocondria pero carece de ciclo de aacutecido ciacutetrico
funcional por lo que se piensa que es totalmente dependiente de la glucoacutelisis
para su abastecimiento energeacutetico (Dario Mendez 2010) Durante el periodo de
maduracioacuten del paraacutesito se produce un aumento en el uso de glucosa y la
produccioacuten de aacutecido laacutectico en la ceacutelula hueacutesped en detrimento de la capacidad
de la ceacutelula de sintetizar macromoleacuteculas Para su crecimiento y replicacioacuten en
el eritrocito requiere purinas y pirimidinas Las purinas provenientes del
eritrocito son recicladas por el propio paraacutesito para su uso En cambio las
pirimidinas han de ser sintetizadas a partir de sustancias como carbonatos o
adenosiacuten trifosfato (ATP) y mediante la accioacuten de enzimas como dihidrofolato
reductasa o dihidrooroato dihidrogenasa (DHOD) que se convierten asiacute en
dianas terapeacuteuticas La atovaquona es un ejemplo de inhibidor de la DHOD
En la vacuola digestiva del paraacutesito se producen enzimas digestivas y
residuos que se eliminan a traveacutes de la membrana celular Dentro de los
gloacutebulos rojos los paraacutesitos se alimentan de la Hb En primer lugar se produce
la endocitosis de la moleacutecula hasta la vacuola digestiva donde las
endopeptidasas cisteiacutenicas y aspaacuterticas continuacutean con la degradacioacuten de la Hb
Malaria y Plasmodium
18
hasta pequentildeos aminoaacutecidos que el paraacutesito requiere para sus muacuteltiples
funciones de desarrollo En la ruptura celular se produce la liberacioacuten de los
residuos generados durante los diferentes procesos del metabolismo de
nutrientes Algunos siacutentomas de la enfermedad se ocasionan por esta liberacioacuten
En todos estos procesos de cambio de permeabilidad celular necesarios para
la supervivencia del paraacutesito el pH juega un papel fundamental El Plasmodium
desarrolla diferentes sistemas de control y autorregulacioacuten que estaacuten siendo
estudiados y propuestos como diana terapeacuteutica (Loacutepez y Segura 2008)
II2 Ciclo de la malaria
II21 Ciclo de vida del paraacutesito
Para referirnos al ciclo de la enfermedad hablaremos en todo momento del
ciclo de vida del paraacutesito (Figura 5) El Plasmodium falciparum es un organismo
eucariota que cuenta con 14 cromosomas y es transmitido como hemos
comentado al comienzo por los mosquitos Anopheles hembra Pero no son los
mosquitos los que tienen el paraacutesito inicialmente ya que en la picadura a un ser
humano infectado adquieren los paraacutesitos presentes en las sangre (en forma de
gametocitos) dando comienzo la fase Esporogoacutenica (fase sexual) del ciclo de
vida del paraacutesito en el mosquito
En esta sangre infectada hay microgametocitos (macho) y macrogametocitos
(hembra) Los gametocitos macho fertilizan a los hembra formando un cigoto
que recibe el nombre de ookinete el cual penetra en la pared celular de los
mosquitos para desarrollarse hasta formar un oocito Los oocitos desarrollados
se almacenan en sus glaacutendulas salivares Es ahiacute donde estaacuten listos para infectar
a otro humano con su picadura liberando esporozoiacutetos a traveacutes de la saliva
Esta fase esporogoacutenica se da a gran velocidad y se completa en dos semanas si
las condiciones son las idoacuteneas Queda claro de esta forma que el mosquito es el
vector que transporta la enfermedad y los humanos son los hueacutespedes
En este punto la enfermedad se desarrolla en el hombre por medio de dos
viacuteas Exo-eritrociacutetica (hepaacutetica) y Endo-eritrociacutetica La viacutea exo-eritrociacutetica es la
fase del ciclo de vida del paraacutesito que comienza en el momento que el mosquito
infectado pica a un humano y transfiere en la saliva ademaacutes de los esporozoiacutetos
del paraacutesito otros compuestos anti hemostaacuteticos y vasodilatadores al torrente
sanguiacuteneo humano
Malaria y Plasmodium
19
Los esporozoiacutetos son formas alargadas que miden
11 microm de ancho por 1 microm de largo con extremidades
afiladas (Figura 3) Se mueven por deslizamiento y
poseen una gruesa membrana cuya extremidad
anterior se transforma en una caacutepsula apical provista
de anillos polares y de un conoide que favorece la
penetracioacuten celular
Figura 3 Imagen de un esporozoiacuteto14
En treinta minutos los esporozoiacutetos llegan al hiacutegado humano e infectan los
hepatocitos Asiacute durante un periodo de 6 a 15 diacuteas se van a multiplicar
asexualmente (en este periodo de latencia de la enfermedad se llaman
hipnozoiacutetos) Estos daraacuten lugar a miles de merozoiacutetos que rompen las ceacutelulas
hepaacuteticas e para invadir el torrente sanguiacuteneo
En la viacutea endo-eritrociacutetrica los merozoiacutetos del torrente sanguiacuteneo invaden
los eritrocitos (gloacutebulos rojos o hematiacutees) para convertirse en trofozoiacutetos
(formas paraeritrociacuteticas Figura 4) Esta forma madura
y se multiplica asexualmente para formar los
esquizontes Estos a su vez se rompen liberando de
nuevo merozoiacutetos (en su forma endo-eritrociacutetica) que
repetiraacuten el ciclo de los hematiacutees Es la formacioacuten de
los esquizontes la que causaraacute la aparicioacuten de los
siacutentomas cliacutenicos A la vez que esto ocurre unos pocos
merozoiacutetos sufren gametocitogeacutenesis dando lugar a los
gametocitos que infectaraacuten nuevos mosquitos
Figura 4 Imagen de trofozoiacutetos15
En el caso de Plasmodium vivax y ovale se producen hipnozoiacutetos en la fase exo-
eritrociacutetica que permanecen en estado latente y durante un periodo de hasta
tres antildeos sin manifestarse siacutentomas En liacuteneas generales la duracioacuten del ciclo
eritrociacutetico del P ovale es de 50 horas el de P malarie de 72 horas y el de P vivax
y falciparum de 48 horas
14 Disponible en wwwfabaorg 15 Disponible en wwwdfarmaciacom
Malaria y Plasmodium
20
Figura 5 Ciclo de vida completo del plasmodio El mosquito Anopheles infectado en su picadura transmite los
esporocitos del parasito Plasmodio Esporocitos infectan ceacutelulas hepaacuteticas que maduran hasta esquizontes y
que liberaran despueacutes merozoitos Fase exo-eritrociacutetica y fase endo-eritrociacutetica Los merozoitos infectan los
hematiacutees Los trofozoiacutetos maduros daraacuten esquizontes que se rompen para dar maacutes merozoitos Algunos
merozoitos pasan a ser nuevos gametocitos Los gametocitos sexuados son ingeridos por el mosquito La Fase
esporogoacutenica Microgametos y macrogametos forman cigotos que evolucionan hasta ookinete Estos a su vez se
desarrollan hasta Los oocitos se rompen dando esporocitos que se almacenan en las glaacutendulas salivares del mosquito
esperando a ser inoculadas a otro humano 16
II22 Desarrollo de los esquizontes
Los merozoiacutetos provenientes de las ceacutelulas hepaacuteticas viajan al torrente
sanguiacuteneo para infectar a los eritrocitos que contienen la Hb En concreto es la
degradacioacuten de la Hb el factor fundamental para el desarrollo de los
esquizontes ya que este proceso conlleva la obtencioacuten de ldquonutrientesrdquo como
aminoaacutecidos esenciales para el desarrollo de las nuevas formas del paraacutesito En
el citoplasma de los eritrocitos se encuentra la Hb que es ingerida por
endocitosis al citostoma del paraacutesito y comprimida en vesiacuteculas transportadoras
que la conducen hasta las vacuolas digestivas del merozoiacuteto (Figura 6)
16 Citado de wwwdpdcdcgovdpdxHTMLMalariahtm
Malaria y Plasmodium
21
Figura 6 Transporte de membrana de la Hb a la vacuola del merozoiacuteto
Una vez dentro de la vacuola comienza su digestioacuten o degradacioacuten en un
proceso en el que intervienen varias proteasas y peptidasas que generan
diferentes subproductos Del conocimiento de estas enzimas surgen las
muacuteltiples dianas terapeacuteuticas para combatir este proceso y por tanto la
enfermedad ya que el proceso es clave para la supervivencia del paraacutesito Una
vez que la moleacutecula de Hb es introducida en la vacuola digestiva se produce la
ruptura de la estructura (Figura 7) en porcioacuten proteica la globina y en el
producto de degradacioacuten el grupo hemo La globina a su vez se degrada por
medio de peptidasas especiacuteficas (cisteiacutenas y aspartatos) que generan peacuteptidos
maacutes pequentildeos que seraacuten transportados en forma de aminoaacutecidos (los α-Aa) al
citoplasma del paraacutesito (citosol del merozoiacuteto)
Figura 7 Proceso de digestioacuten de la Hb en la vacuola digestiva del paraacutesito
Otro producto de dicha reaccioacuten de degradacioacuten es el grupo hemo libre que
se oxida hasta formar hematina (Figura 8) compuesto muy toacutexico debido a que
puede generar especies reactivas de oxiacutegeno como peroacutexido de hidroacutegeno
(H2O2) radicales superoacutexido y radicales hidroxilo Estos radicales son
mediadores directos de ciertos procesos bioquiacutemicos que ocasionan la ruptura
Malaria y Plasmodium
22
celular y en uacuteltima instancia la muerte del paraacutesito De este modo la siguiente
reaccioacuten es el proceso de detoxificacioacuten de dicho compuesto Esta reaccioacuten
consiste en una biomineralizacioacuten o biocristalizacioacuten donde la hematina
cristaliza como diacutemero cristalino llamado β-hematina (la unioacuten por puentes de
hidroacutegeno de los cristales recibe el nombre de hemozoiacutena) que no es toacutexica para
el paraacutesito
Figura 8 Compuestos obtenidos en la degradacioacuten de la Hb
Para el final del estado trofozoiacutetico del ciclo han sido consumidas muchas
unidades de Hb
II3 Especies de Plasmodium
Son muchas las variables de las que depende el desarrollo de la enfermedad
comenzando por la especie de paraacutesito que infecta
Plasmodium vivax esta especie estaacute presente en casi todas las zonas donde el
paludismo es endeacutemico y su aacuterea de distribucioacuten se extiende
principalmente en Ameacuterica Central y la India La duracioacuten de su ciclo exo-
eritrociacutetico variacutea seguacuten la cepa desde 20 diacuteas a 9 meses Los paraacutesitos
pueden permanecer en el hiacutegado en estado latente maacutes de 2 antildeos y ser
responsable de recaiacuteda La parasitemia raramente excede de 2 paraacutesitos en
100 gloacutebulos rojos y el proceso de formacioacuten de esquizontes dura 48 horas
P vivax parasita sobre todo los hematiacutees joacutevenes (reticulocitos) el hematiacutee
parasitado es maacutes grande que los hematiacutees normales y contiene numerosos
graacutenulos de Schuumlffner que resultan de la degradacioacuten de la Hb y le dan un
aspecto punteado Las formas endo-eritrociacuteticas son grandes (llegan a
ocupar hasta 23 partes del eritrocito) y estaacuten provistas de movimientos
ameboides vivaces (de ahiacute el nombre vivax) los esquizontes presentan
Malaria y Plasmodium
23
hasta 16 merozoiacutetos los gametocitos son redondos frecuentemente
exceacutentricos y con pigmento abundante
Figura 9 Formas endo-eritrociacuteticas del P vivax17
Plasmodium ovale es muy proacuteximo a P vivax con el cual fue confundido por
mucho tiempo Su incubacioacuten variacutea de 15 diacuteas a varios meses P ovale
parasita los hematiacutees joacutevenes el
hematiacutee parasitado es de talla grande
ovalado (es el porqueacute del nombre
ovale) sus bordes estaacuten recortados y
contiene tempranamente numerosos
graacutenulos de Schuumlffner El poli-
parasitismo es posible Los trofozoiacutetos
son ovalados los esquizontes son
irregulares y tienen de 8 hasta 16
merozoiacutetos
Figura 10 Formas endo-eritrociacuteticas del P ovale
Plasmodium malariae es menos frecuente que P vivax o P falciparum y se
encuentra principalmente en zonas como Aacutefrica subsahariana o sudeste
asiaacutetico Su incubacioacuten dura alrededor de 3 a 4 semanas Puede permanecer
en estado latente hasta 20 antildeos El ciclo de maduracioacuten eritrociacutetica dura 72
horas Parasita los hematiacutees viejos (1 a 2) los que son de tamantildeo normal o
retractado y monocromaacutetico Morfoloacutegicamente P malariae estaacute
caracterizado por la disposicioacuten en banda cuadrilaacutetera o ecuatorial de los
17 Imaacutegenes extraiacuteda de wwwgefor4tcom
Malaria y Plasmodium
24
trofozoiacutetos con esquizontes que presentan 8 merozoiacutetos y con gametocitos
semejantes a los de P vivax pero maacutes pequentildeos
Figura 11 Formas endo-eritrociacuteticas del P malariae
Plasmodium falciparum es la especie maacutes temible y mortal Se encuentra en
las regiones tropicales y subtropicales de Aacutefrica en Nueva Guinea y Haitiacute
El desarrollo de su ciclo en el mosquito necesita una temperatura superior a
los 18 degC a esto se debe su ausencia en las montantildeas tropicales y en las
regiones templadas Su ciclo exo-eritrociacutetico es el periodo maacutes corto dura
solamente de 7 a 15 diacuteas de promedio La longevidad del paraacutesito no pasa
habitualmente de 2 meses aunque puede llegar a un antildeo P falciparum
parasita todos los hematiacutees por esto maacutes del 10 de los gloacutebulos rojos
pueden ser parasitados En el frotis de sangre se observa la presencia
uniforme de trofozoiacutetos anulares (los esquizontes se encuentran en
capilares profundos y presentan hasta 16 merozoiacutetos) el poliparasitismo de
un gloacutebulo rojo es frecuente Los gametocitos tienen la forma de banana o
pequentildea hoz (del latino falx falcis) a esto se debe el nombre de esta especie
Figura 12 Formas endo-eritrociacuteticas del P falciparum
Malaria y Plasmodium
25
II4 Sintomatologiacutea
La infeccioacuten por malaria se puede confundir faacutecilmente con un catarro o gripe
comuacuten ya que como se describe en apartados anteriores es el desarrollo de los
esquizontes y la posterior ruptura de los hematiacutees (Figura 13) para seguir
infectando hematiacutees sanos lo que causa la aparicioacuten de sintomatologiacutea cliacutenica
Aunque en la liberacioacuten de nuevos merozoiacutetos tambieacuten se produce la liberacioacuten
de otras sustancias que producen la
sintomatologiacutea caracteriacutestica como los dolores
musculares dolor de cabeza naacuteuseas y voacutemitos
fiebres sudoraciones secuenciales y escalofriacuteos
La sintomatologiacutea observada en la infeccioacuten por
Plasmodium variacutea seguacuten el tipo de malaria que
desarrolla el enfermo
Figura 13 Ruptura de los Eritrocitos infectados18
En Malaria no complicada los siacutentomas caracteriacutesticos son acceso malaacuterico
anemia19 esplenomegalia20 (por la funcioacuten de limpieza de la sangre de
geacutermenes e impurezas por fagocitosis y la produccioacuten de linfocitos la funcioacuten
inmune produce este marcador interno de la infeccioacuten) y en ocasiones
ictericia21 Los picos de fiebre se correlacionan con altos niveles seacutericos de TNF-
α por la liberacioacuten de proteiacutenas del paraacutesito en la ruptura de los eritrocitos que
crea la anemia Ademaacutes de esto se asocia una creacioacuten de anticuerpos contra los
hematiacutees diseritropoyesis22 y secuestro espleacutenico23
18 Imagen extraida de wwwimmuninforu 19 Patologiacutea general Empobrecimiento de la sangre por disminucioacuten de su cantidad total o cantidad de hemoglobina [a(n)- ἀ-ἀν- gr no + -haimiacuteā -αιμία gr sangre] httpDicciomedeusales 20 Patolgiacutea general Aumento de volumen o hipertrofia del bazo[ splēn(o)- σπλή-ν-νός gr bazo + -megalia μεγαλ-ία gr cient tamantildeo excesivo] httpDicciomedeusales 21 Patologiacutea digestiva y hepatoloacutegica Enfermedad producida por acumulacioacuten de pigmentos biliares en la sangre cuya sentildeal exterior maacutes visibles es la amarillez de la piel y las conjuntivas [ikter(o)- ἴκτερος gr ictericia (amarillo) + -ik-os-ik-ē gr + -ia(m) lat cualidad] httpDicciomedeusales 22 (Del griego an- privacioacuten y haima sangre) Sinoacutenimo OLIGOHEMIA ESPANEMIA Empobrecimiento de la sangre caracterizado por la disminucioacuten de uno de varios o de todos sus elementos (anemia total anemias parciales) Esta palabra se aplica generalmente cuando se emplea sin epiacuteteto a una anemia parcial caracterizada por la disminucioacuten del nuacutemero de gloacutebulos rojos o maacutes exactamente por la disminucioacuten de la cantidad de hemoglobina contenida en la unidad de volumen de sangre no estando aumentado el volumen plasmaacutetico (Jean Bernard) Se emplea tambieacuten para designar el estado del organismo privado de sangre y desde este punto de vista la anemia puede ser general o local Se dice que la anemia es hemotiacutesica cuando obedece a la destruccioacuten exagerada de los hematiacutees y mielotiacutesica cuando resulta de la detencioacuten de su formacioacuten por insuficiencia del tejido mieloide (Pappenheim) wwwportalesmedicoscom
Malaria y Plasmodium
26
En Malaria croacutenica se produce esplenomegalia y hepatomegalia24 asiacute como
accesos febriles irregulares y de baja intensidad La piel se torna amarillo-
terrosa se producen palpitaciones somnolencia y fatiga Una caracteriacutestica muy
comuacuten es la baja parasitemia que presentan los pacientes
En el embarazo la malaria produce alta mortalidad materna por anemia
partos prematuros por insuficiencia cardiacuteaca palpitaciones mareos y disnea25
Esto repercute en el bebeacute de forma que producen muertes neonatales y dantildeos
cerebrales
La Malaria severa es producida por Plasmodium falciparum que ocasiona
disfuncioacuten de oacuterganos vitales altas parasitemias imposibilidad de tratamiento
por viacutea oral y hemoacutelisis intravascular
Los casos maacutes graves son los de Malaria cerebral Los nintildeos son el grupo maacutes
susceptible de contraer este tipo de malaria Los hematiacutees infectados se tornan
maacutes adhesivos y se pegan a las paredes de los vasos capilares entre otros a los
del cerebro Se produce anemia grave fallos renales y pulmonares agudos
convulsiones trastornos de movilidad y neuroloacutegicos El paciente entra en
coma pudiendo fallecer en 24 horas Si se logra un retorno del coma los dantildeos
cerebrales residuales son permanentes
II5 Deteccioacuten y diagnoacutestico
Es relativamente sencillo diagnosticar malaria pero lo realmente complicado
y uacutetil es el diagnostico concreto del tipo de malaria Ejemplo de ello es que una
caracteriacutestica de la infeccioacuten por P falciparum es la alta parasitemia donde
hasta 3 trofozoiacutetos se encuentran invadiendo un eritrocito o la aparicioacuten de
gametocitos con forma alargada que no se da en otros tipos de plasmodio
El diagnoacutestico de la malaria se realiza basaacutendose en una serie de criterios
cliacutenicos epidemioloacutegicos y de laboratorio que con una adecuada anamnesis y
examen fiacutesico pueden orientar con alto grado de certeza sobre el tipo de malaria
23 Un gran nuacutemero de ceacutelulas falciformes quedan atrapadas en el bazo y producen su agrandamiento repentino Los siacutentomas pueden incluir debilidad repentina palidez en los labios respiracioacuten raacutepida sed extrema dolor abdominal (del estoacutemago) o en el costado izquierdo del cuerpo y palpitaciones raacutepidas wwwcdcgov 24 Patologiacutea digestiva y hepatoloacutegica Aumento de volumen o hipertrofia del hiacutegado [hēpat(o)- ἧπα-ρ-τος
gr hiacutegado + -megalia μεγαλ-ία gr cient tamantildeo excesivo] httpDicciomedeusales 25 Patologiacutea neumoloacutegica dificultad para respirar [dys- δυσ- gr dificultad + -pnoi(a) -πνοια gr respiracioacuten] httpDicciomedeusales
Malaria y Plasmodium
27
contraiacuteda Las pruebas maacutes concluyentes son la visualizacioacuten del paraacutesito o
deteccioacuten de antiacutegenos en pruebas raacutepidas
Criterios cliacutenicos Se tendraacuten en cuenta tanto episodios malaacutericos anteriores
del paciente como fiebres actuales o recientes (en menos de un mes) escalofriacuteos
intensos sudoracioacuten profusa naacuteuseas y voacutemitos mialgias siacutentomas
gastrointestinales anemia o esplenomegalia
Criterios epidemioloacutegicos El estudio de antecedentes aporta mucha
informacioacuten para el diagnoacutestico Antecedentes como los de exposicioacuten en los
uacuteltimos quince diacuteas en aacutereas de transmisioacuten activas antecedentes hospitalarios
transfusioacuten sanguiacutenea de medicacioacuten antimalaacuterica o relacioacuten con personas que
hayan sufrido malaria
Criterios de laboratorio La forma maacutes sencilla de detectar la enfermedad
incluyendo casos donde todaviacutea estaacute en estado latente es el Meacutetodo de la Gota
gruesa La toma de muestra se realiza mediante la puncioacuten con una lanceta
esteacuteril normalmente en la yema del dedo Se recogen 3 oacute 4 gotas sobre un
portaobjetos y con la esquina de otro se unen en movimientos raacutepidos
extendieacutendose hasta formar una capa gruesa y uniforme Se usa para la
determinacioacuten de la parasitemia y tiene una sensibilidad del 80 y 100 de
especificidad
Se mide mediante la ecuacioacuten
(Nordm paraacutesitos x 8000) Parasitemia (paraacutesitosμL) =
200 eritrocitos (hematiacutees)
La gota gruesa permite analizar una mayor cantidad
de sangre facilitando la deteccioacuten de parasitemias
bajas menores del 1 (Figura 14) y un ahorro de
tiempo en el examen aunque al romperse los
eritrocitos resulta difiacutecil la identificacioacuten de especie
Figura 14 Vista al microscopio de los eritrocitos26
26 Disponible en
httpdpdcdcgovdpdxhtmlFramesMRMalariaovalebody_malariadfovaringhtm
Malaria y Plasmodium
28
Es una prueba sencilla y poco costosa que muestra los casos positivos En
zonas de alta trasmisioacuten esta prueba no es determinante ya que la deteccioacuten de
paraacutesitos en sangre no significa que la posible fiebre que presente una persona
sea por malaria
Como se ha indicado antes es importante la determinacioacuten de la especie de
Plasmodium y se consigue tambieacuten de una manera sencilla con el Meacutetodo de
frotis donde la muestra se colecta de la misma forma que la gota gruesa pero en
este caso se recoge una gota de sangre en un portaobjetos y con otro se realiza
la extensioacuten en capa fina de la misma El inconveniente para realizar estas dos
teacutecnicas sencillas es que se necesita un laboratorio y personal cualificado no
disponible en muchas de las zonas endeacutemicas
Hay otras teacutecnicas de deteccioacuten maacutes desarrolladas como el sistema QBC
(Quantitative Buffy Coat test) que es un meacutetodo de screening para la deteccioacuten
raacutepida de paraacutesitos en sangre centrifugada en un microcapilar Es un meacutetodo
gravimeacutetrico que usa la fluorescencia para la determinacioacuten Aunque es un
meacutetodo raacutepido son necesarias infraestructuras y es difiacutecil distinguir la especie
Existen tambieacuten otros meacutetodos basados en teacutecnicas inmunocromatograacuteficas
en la deteccioacuten de antiacutegenos parasitarios La HRP-2 y la LDH son proteiacutenas
secretadas por el paraacutesito y por tanto indicadoras de su presencia Son pruebas
raacutepidas y no precisan microscopio Tambieacuten son faacuteciles de interpretar ya que
son test en tiras o tarjetas donde se pone una muestra de sangre y se revelan
Son usados como examen de autodiagnoacutestico y en lugares donde no hay
laboratorios como examen preliminar El problema es que dan falsos negativos
y no es un meacutetodo cuantitativo del grado de infeccioacuten
Por uacuteltimo las teacutecnicas de biologiacutea molecular usadas en casos de baja
parasitemia infecciones mixtas o mutaciones entre otras Aunque presentan
muchas ventajas son teacutecnicas laboriosas caras y poco accesibles ya que se
necesitan medios y personal muy cualificado
Es por tanto la combinacioacuten de los criterios explicados la forma maacutes
concluyente de diagnosticar que tipo de malaria estaacute afectando a un enfermo
IIIIII PPRREEVVEENNCCIIOacuteOacuteNN YY TTRRAATTAAMMIIEENNTTOO
Prevencioacuten y Tratamiento
31
III1 Medidas preventivas
La malaria es una enfermedad que puede prevenirse desde sus dos frentes
principales el vector mosquito y el hospedador humano Las medidas de
prevencioacuten se centran en objetivos distintos como evitar el desarrollo de la
enfermedad con proteccioacuten individual en aacutereas endeacutemicas erradicacioacuten del
mosquito prevencioacuten de la picadura o desarrollo de medicamentos
profilaacutecticos
En lo que a la lucha antivectorial se refiere el uso de mosquiteras en las
camas ha reducido mucho el caso de nuevos contagios de la enfermedad Es
una medida que a simple vista parece muy sencilla pero que en realidad no lo
es El problema estaacute en que en muchos de los paiacuteses endeacutemicos la pobreza es
elevada y por tanto el coste de las mosquiteras no es asumible por las personas
En otras ocasiones no es el coste de dichas mosquiteras lo que impide la
prevencioacuten sino que las redes son usadas con otros fines prioritarios como la
pesca En la actualidad la OMS recomienda el uso de insecticidas como
piretroides para impregnar las mosquiteras
Otra forma eficaz de reducir raacutepidamente la transmisioacuten del paludismo es la
fumigacioacuten de interiores con insecticidas de accioacuten residual Los mejores
resultados se consiguen cuando se fumiga al menos el 80 de las viviendas de
la zona en cuestioacuten La fumigacioacuten de interiores es eficaz de tres a seis meses
dependiendo del insecticida utilizado y del tipo de superficie sobre la que se
aplica En algunos casos el DDT puede ser eficaz de nueve a doce meses
Actualmente se estaacuten desarrollando insecticidas con accioacuten residual maacutes
prolongada para la fumigacioacuten de interiores Se ha comprobado la eficacia de
insecticidas como el DDT que aunque fue prohibido su uso por su alto grado de
toxicidad en plantas y su efecto acumulativo sigue siendo ampliamente
utilizado en la lucha contra la malaria Tambieacuten se cuenta con la ayuda de los
repelentes para la piel (DEET) o tiras insecticidas Finalmente no se deberiacutea
olvidar como arma vaacutelida y primaria para la lucha la educacioacuten en prevencioacuten
y gestioacuten del medio ambiente
En lo que al factor humano se refiere el uso de medicamentos especiacuteficos en
bajas dosis durante largo tiempo es la forma actual de profilaxis En esta liacutenea
se estaacuten desarrollando vacunas y tratamientos actualmente en el campo de la
genoacutemica
Prevencioacuten y Tratamiento
32
III2 Tratamiento
III21 Historia del tratamiento
La malaria es una de las enfermedades mejor estudiadas de la medicina
occidental hasta mediados del siglo XX a pesar de
que no se haya encontrado solucioacuten para su
erradicacioacuten A principios del siglo XVIII el
primer tratamiento conocido se basoacute en el uso de
la corteza de un aacuterbol originario de Sudameacuterica
la Cinchona (Figura 15) En 1820 se consiguioacute
aislar e identificar la quinina como compuesto
activo
Figura 15 Aacuterbol de la Cinchona pubescens
En 1891 el azul de metileno se usoacute para tratar a dos pacientes enfermos de
malaria Asiacute se convierte este compuesto en el primer ldquomedicamento sinteacuteticordquo
Actualmente se conoce que su mecanismo de accioacuten implica la inhibicioacuten de la
glutatioacuten reductasa y posteriormente la interrupcioacuten de la homeostasis redox
del paraacutesito
En 1925 se desarrolloacute la mepraquina para combatir estadios del P falciparum
en sangre Es un compuesto que pertenece al grupo de derivados de acridina
usados en el sudeste asiaacutetico durante la II Guerra Mundial Ya en 1934 se
sintetizoacute la cloroquina (CQ) aunque no es hasta el antildeo 1946 cuando comienza
su uso porque se consideraba demasiado toacutexica Con esta estructura comienza a
desarrollarse el grupo de las 4-aminoquinolinas Desde entonces ha sido el
antimalaacuterico maacutes utilizado En 1969 la guerra del Vietnam conlleva el uso de la
mefloquina y halofantrina que son aminoalcoholes derivados de la quinina
Sin embargo el antimalaacuterico maacutes antiguo puede ser la artemisina descubierta
en el antildeo 1596 a partir de un compuesto de origen natural de China La
Artemisina Annua es una planta originaria oriental que constaba ya siglos atraacutes
en los manuales de procedimientos para el tratamiento de fiebres Aunque no
fue hasta el antildeo 1972 cuando se consiguioacute aislar e identificar Este compuesto es
utilizado en la actualidad y resulta eficaz y poco toacutexico
Prevencioacuten y Tratamiento
33
III22 Clasificacioacuten de los compuestos antimalaacutericos
A lo largo de la historia se han usado diferentes tratamientos derivados del
desarrollo de nuevas estructuras y del mejor conocimiento de la enfermedad y
del paraacutesito
De este modo las estructuras pueden clasificarse por
Actividad antimalaacuterica
o Hombre
Estados pre-eritrociacuteticos profilaxis eventual pero poco praacutecticos
Hipnoticidas para P vivax y P ovale actuacutean a nivel hepaacutetico
Esquizonticidas en sangre para estados eritrociacuteticos asexuales
o Mosquito
Gametocidas destruccioacuten de las formas eritrociacuteticas de la fase
sexual del mosquito Prevencioacuten de la transmisioacuten
Esporonticidas previene el crecimiento de los oocitos en el
mosquito tambieacuten se usa para prevenir transmisioacuten
Mecanismo de accioacuten
o Accioacuten sobre la vacuola digestiva del Plasmodium accioacuten sobre la
degradacioacuten de la Hb detoxificacioacuten de la hematina (por ejemplo la
CQ)
o Enzimas involucradas en la siacutentesis y metabolismo de
macromoleacuteculas
o Accioacuten sobre procesos de membrana
o Siacutentesis de purinas y pirimidinas
o Glucoacutelisis y siacutentesis de ATP mitocondrial
Forman familias de compuestos con actividades diferentes en muacuteltiples aacutereas
y niveles
Metanolquinolinas y arilaminoalcoholes
La metanolquinolinas y arilaminoalcoholes forman una familia de
compuestos de gran importancia Este grupo engloba desde
estructuras con gran relevancia histoacuterica como la quinina hasta
compuestos como la lumefantrina que se usa en terapias combinadas
en la actualidad
Prevencioacuten y Tratamiento
34
Estas dos familias de compuestos estaacuten relacionadas entre siacute Como
primera correspondencia destacar su gran efectividad como
esquizonticidas sanguiacuteneos Intervienen en la digestioacuten de la Hb en
concreto en la detoxificacioacuten especiacutefica de la hemozoiacutena
Pertenecientes a la familia de metanolquinolinas son la quinina y
quinidina (que son isoacutemeros L y D) y mefloquina (Figura 16)
Figura 16 Estructura de metanolquinolinas
El problema de la quinina y la quinidina es sus efectos adversos sin
embargo siguen siendo ampliamente usados debido a su faacutecil acceso
La mefloquina es muy uacutetil en malarias resistentes pero tiene efectos
neurosiquiaacutetricos adversos
Los arilaminoalcoholes como halofantrina y lumefantrina (Figura
17) son estructuras de gran capacidad esquizonticida siendo el
mecanismo de accioacuten en la mayor parte de ellos la intervencioacuten en los
procesos de degradacioacuten de la Hb
Figura 17 Estructura de arilaminoalcoholes
Estas estructuras actuacutean en los paraacutesitos maacutes maduros pero no tienen
capacidad hipnoticida Se desarrollaron tras la aparicioacuten de
resistencias a la quinina y CQ
Prevencioacuten y Tratamiento
35
Aminoquinolinas
En este grupo se engloban compuestos como la familia de las 4-
aminoquinolinas y las 8-aminoquinolinas Las 4ndashaminoquinolinas
actuacutean en las fases endo-eritrociacuteticas del paraacutesito La gran ventaja de
esta familia es que los compuestos son faacuteciles de sintetizar
econoacutemicos y bien tolerados A este grupo pertenecen compuestos tan
relevantes como la cloroquina efectiva en profilaxis pero que en la
actualidad presenta problemas de resistencias o la amodiaquina que
es mejor que la CQ para eliminar parasitemias aunque es
hepatotoacutexica (Figura 18)
Figura 18 Estructura quiacutemica de la cloroquina y la amodiaquina
Al grupo de las 8-aminoquinolinas pertenecen la pamaquina la
primaquina y la tafenoquina (Figura 19) que son el uacutenico grupo de
gametocidas y tambieacuten son usadas como profilaxis El gran problema
de estos compuestos es su alta toxicidad
Figura 19 Estructuras de 8-aminoquinolinas
Prevencioacuten y Tratamiento
36
Derivados de acridina
Son compuestos de relevancia histoacuterica como la mepraquina
compuesto sucesor y de origen muy similar a la CQ que fue el primer
compuesto sinteacutetico usado cliacutenicamente como esquizonticida La
pironaridina que tambieacuten pertenece a esta familia (estructuralmente
relacionado con la amodiaquina) se usa en casos de malaria por P
falciparum resistente pero tiene baja biodisponibilidad oral y su precio
es elevado (Figura 18)
Figura 18 Estructura de derivados de acridina
Antifolatos e inhibidores de la siacutentesis de folatos
El aacutecido foacutelico obtenido mediante la dieta es convertido por el
paraacutesito en aacutecido tetrahidrofoacutelico necesario para su superviviencia
Los antifolatos inhiben el metabolismo del aacutecido foacutelico actuando como
coenzimas de la siacutentesis de ADN y pirimidinas Estos compuestos
actuacutean sobre los estados de crecimiento del paraacutesito en el hiacutegado y
detienen la reinfeccioacuten del mosquito
Pertenecen a esta familia sulfonamidas como sulfadoxina o sulfonas
como dapsona y compuestos como proguanil y pirimetamina (Figura
19)
Figura 19 Estructura de antifolatos
Prevencioacuten y Tratamiento
37
Antibioacuteticos
Son familias de compuestos que actuacutean a nivel celular y de
genoma Una de sus dianas es la inhibicioacuten de la siacutentesis de
proteiacutenas con funciones metaboacutelicas importantes para la
supervivencia del paraacutesito Este es el caso de la inhibicioacuten de la
funcioacuten del apicoplasto que interviene en la siacutentesis del grupo
hemo o liacutepidos Para ello estaacuten los antibioacuteticos del grupo de
tetraciclinas como la doxiciclina (Vibramycinreg) (Figura 20)
Figura 20 Estructura de la doxiciclina
Artemisinas y terapias combinadas de artemisinas (TCA)
Esta familia proviene del compuesto aislado del la planta Artemisia
Annua La artemisina (Figura 21) se obtiene solo por viacutea natural y el
resto de derivados son semisinteacuteticos El mecanismo de accioacuten es el
mismo que el de las 4-Aminoquinolinas solo que en esta ocasioacuten viacutea
radicales libres
Son compuestos muy activos en malaria y aunque sus tiempos de vida
son cortos ofrecen actividad aguda El punto negativo es que en su
tiempo de accioacuten no son capaces de eliminar toda la parasitemia y son
necesarias terapias combinadas con otros compuestos En la
actualidad se ha detectado la aparicioacuten de resistencias debido al uso
de monoterapias
Figura 21 Estructura de la artemisina
Prevencioacuten y Tratamiento
38
III23 Aparicioacuten de resistencias
La OMS ha definido resistencia como la capacidad de una cepa parasitaria de
sobrevivir yo multiplicarse a pesar de la administracioacuten y absorcioacuten de un
medicamento dada a dosis iguales o mayores que aquellas usualmente
recomendadas pero dentro de los liacutemites de tolerancia del sujeto La resistencia
a los antimalaacutericos es un serio problema desde hace antildeos En 1973 la CQ fue
reemplazada por la combinacioacuten de sulfadoxina + pirimetamina (Fansidarreg)
Pero en 1985 eacutesta tambieacuten se volvioacute inefectiva en algunas cepas de P falciparum
Estaacute demostrado que la resistencia a algunos antimalaacutericos se desarrolla cierto
tiempo despueacutes de la introduccioacuten de los mismos como tratamiento uacutenico
Seguacuten la OMS se describen tres grados de resistencia in vivo a las drogas
antimalaacutericas
- Grado I (bajo grado) recurrencia a los 7 y 28 diacuteas del tratamiento completo
siguiendo a una inicial solucioacuten de los siacutentomas y reduccioacuten de la
parasitemia
- Grado II (grado intermedio) reduccioacuten de la parasitemia asexuada en maacutes
de un 75 dentro de las 48 h del tratamiento pero con aumento a los siete
diacuteas
- Grado III (alto grado) el nivel de la parasitemia asexuada no cae en maacutes del
75 dentro de las 48 h despueacutes del tratamiento
En la actualidad uno de los compuestos maacutes utilizados es la quinina que a
pesar de los efectos adversos que tiene es uno de los compuestos maacutes accesibles
en los paiacuteses pobres lo que facilita su uso actual Tambieacuten la artemisina y sus
derivados son ampliamente utilizados ya que estudios recientes demuestran la
gran capacidad antiplasmoacutedica Pero en su contra estaacute la baja vida del
compuesto la parasitemia residual y la aparicioacuten de resistencias Ademaacutes de
estos puntos negativos se une el hecho de que la uacutenica viacutea de obtencioacuten de este
compuesto es por medio natural no es viable su obtencioacuten por siacutentesis quiacutemica
lo que conlleva encarecimiento del producto por su limitada accesibilidad
Estudios actuales han conseguido explicar el origen de alguna de estas
resistencias La CQ es un compuesto que accede a la vacuola digestiva del
paraacutesito para interferir en la detoxificacioacuten de la hemozoiacutena El pH de la
vacuola estaacute en torno a 5 lo que produce una protonacioacuten de la CQ hasta su
forma diproacutetica (CQH2+2) En esta forma protonada la QC queda atrapada
Prevencioacuten y Tratamiento
39
dentro de la vacuola porque no se puede difundir y es asiacute como produce su
accioacuten
El Plasmodium falciparum que ha desarrollado resistencia a la CQ se caracteriza
por la proteiacutena PfCRT (Plasmodium Falciparum Chloroquine Resistance
Transporter) modificada Esta proteiacutena adopta la funcioacuten de unirse a la CQ para
realizar su transporte fuera de la vacuola evitando asiacute la acumulacioacuten y la
realizacioacuten de la funcioacuten del faacutermaco Los primeros estudios realizados en este
tema (Fidock DA et alts 2000) mostraron los primeros datos sobre la relacioacuten
entre las mutaciones el pH de la vacuola digestiva y las concentraciones del
faacutermaco dentro de la vacuola digestiva En un principio se pensoacute que las
mutaciones en los genes del Plasmodium provocaban la acidificacioacuten del medio
interior de la vacuola digestiva alterando la concentracioacuten del faacutermaco o
reduciendo la fijacioacuten a la hematina
Estudios posteriores (Martin R et alts 2009) han llegado a concretar el
mecanismo por el cual se producen resistencias a la CQ La mutacioacuten que le
confiere resistencia a la CQ es el cambio de una lisina (K) por una treonina (T)
en la posicioacuten 76 de la serie de aminoaacutecidos Esta mutacioacuten K76T se da en la
regioacuten de la proteiacutena que se cree involucrada en la unioacuten con la moleacutecula Estaacute
siendo objeto de estudio la creacioacuten de nuevos derivados que favorezcan la
inversioacuten de las mutaciones asiacute como favorecer de nuevo la formacioacuten de la
conformacioacuten T76K Ocurre lo mismo con el intercambio de posicioacuten arginina-
serina (R163S confiere resistencia a la CQ y el cambio a S163R la vuelve
sensible) Este cambio confiere carga positiva al sitio de unioacuten e imposibilita por
repulsioacuten de cargas la unioacuten de la PfCRT con la CQ lo que confiere
sensibilidad a la cepa resistente
La aparicioacuten de resistencias a la artemisina queda registrada en el sudeste
asiaacutetico durante estos uacuteltimos antildeos Se han descrito evidencias cliacutenicas que
concluyen que existen en la actualidad casos de resistencias a la artemisina y a
los TCA promovida principalmente por el extendido uso de las monoterapias
de artemisina pero todaviacutea estaacute en estudio el mecanismo por el que se producen
estas resistencias (OMS Informe 2011) En la actualidad la posibilidad de
estudiar el genoma de los paraacutesitos y los mecanismos de accioacuten de los
diferentes tratamientos da como resultado el conocimiento de las resistencias y
la oportunidad de mejorar los tratamientos existentes
Prevencioacuten y Tratamiento
40
Dentro de las medidas de lucha contra la malaria estaacuten como se ha
comentado las referentes al control de vectores La uacutenica clase de insecticidas
empleados en las mosquiteras actualmente recomendadas incluidos los de
accioacuten prolongada actualmente recomendados son los piretroides En este
aacutembito tambieacuten se han desarrollado resistencias en la actualidad Se carece por
ahora de insecticidas alternativos que sean seguros y con una aceptable relacioacuten
costo-eficacia El desarrollo de nuevos insecticidas alternativos es una tarea de
alta prioridad pero tambieacuten larga y costosa Mientras la deteccioacuten de las
resistencias debe ser un componente esencial de todos los esfuerzos por
controlar el paludismo (OMS 2012)27
III24 Tratamientos actuales
Los regiacutemenes terapeacuteuticos en malaria son muy diversos ya que ademaacutes de
las caracteriacutesticas del paciente dependen del tipo de Plasmodium que infecta y la
zona donde se contrae la enfermedad
Cloroquina
Se usa a dosis maacutexima de 25 mgkg viacutea oral en P ovale y P malariae y cepas
sensibles de P vivax y P falciparum Actuacutea en la vacuola digestiva del
paraacutesito interfiriendo en la detoxificacioacuten de la hematina La alternativa
terapeacuteutica es gluconato de quinidina o quinina
Los efectos adversos que se producen son nauseas irritacioacuten con picor o
desoacuterdenes neuropsiquiaacutetricos La sobredosis se ha de tratar con diazepam
En caso de cepas P vivax resistentes se usa mefloquina halofantrina o
sulfato de quinina combinado con tetraciclinas o sulfonamidas Para tratar
recaiacutedas por hipnozoiacutetos se usa el fosfato de primaquina Para tratar
infeccioacuten por P falciparum resistente se usa sulfato de quinina 250 mgkg
combinado con pirimetamina-sulfadoxina o combiando con doxiclina Para
el tratamiento de nintildeos y embarazadas la quinina se combina con
clindamicina
Quinina
Es usada para el tratamiento de P falciparum resistente a la CQ Actuacutea como
esquizonticida sanguiacuteneo Como alternativa se usa el gluconato de
quinidina que es maacutes potente Las alternativas terapeacuteuticas son mefloquina
27 httpwwwwhointmalariadiagnosis_treatment
Prevencioacuten y Tratamiento
41
halofantrina atovaquona artemisinina y pirimetamina-sulfadoxina Para P
falciparum resistente se usa la artemisina IV combinada con tetraclicina o
mefloquina
Los efectos adversos son sabor metaacutelico tinnitus28 y peacuterdida de audicioacuten
reversible
Pirimetamina-sulfadoxina (Fansidarreg)
Es inhibidor de la siacutentesis de aacutecido foacutelico del ciclo vital del paraacutesito Se
utiliza en paiacuteses en desarrollo por su bajo coste sin embargo el incremento
de la resistencia a los antifolatos lo colocan como agente de segunda liacutenea
Mefloquina (Lariamreg)
Puede administrarse a dosis uacutenica de 25 mg baseKg y actuacutea como
esquizonticida sanguiacuteneo No debe administrarse en nintildeos con menos de 15
Kg de peso ni en pacientes que reciban quimioprofilaxis ni halofantrina
para evitar la resistencia cruzada Puede combinarse con doxiciclina
quinina y derivados de la artemisinina
Los efectos adversos son voacutemitos y toxicidad neuroloacutegica manifiestada en
forma de mareos delirio ataxia29 y convulsiones
Halofantrina
Se administra en dosis de 24 mgKg para intervenir en la degradacioacuten de la
Hb El faacutermaco tiene absorcioacuten oral variable y estaacute contraindicado en
enfermos con afecciones cardiacuteacas embarazadas y durante la lactancia Los
efectos adversos se han asociado con toxicidad cardiacuteaca y arritmias30
Atovaquona ndashproguanil (Malaronereg)
La dosis empleada es de 250 mg atovaquona100 mg proguanil Interviene
en la siacutentesis de aacutecido foacutelico del paraacutesito y en la cadena de transporte
electroacutenico mitocondrial (principal accioacuten de la atovaquona) El faacutermaco se
usa generalmente en profilaxis pero tambieacuten en el tratamiento de malaria
28 Patologia Otorrinolaringologa Estomatologa Percepcioacuten de golpeos o pitidos en el oiacutedo que no proceden de ninguna fuente [ claacutes tinnītus es tintineo] httpdicciomedeusales 29 Patologiacutea Neuroloacutegica Perdida de la capacidad de ejecutar movimientos de manera voluntaria ordenada y suavemente Puede afectar a tronco extremidades faringe laringe etc Se debe a la afectacioacuten de algunas estructuras del sistema nervioso [gr ataxiacuteā ἀταξία [a(n)- ἀ-ἀν- gr no + tag- τάξις gr orden formacioacuten + -siacuteā gr] httpdicciomedeusales 30 Patologiacutea cardiovascular Irregularidad y desigualdad en las contracciones del corazoacuten [gr arrythmiacuteā ἀρρυθμία [a(n)- ἀ-ἀν- gr no + rhythm(o)- ῥυθμός gr cadencia ritmo + -iacuteā gr cualidad] wwwdicciomedeusales
Prevencioacuten y Tratamiento
42
por P falciparum resistente a otros medicamentos No presenta efectos
adversos destacables
Derivados de la artemisina o TCA
La dosis de administracioacuten es de 12 mgKg pero es conveniente que se
combinen preferiblemente con mefloquina tetraciclina o clindamicina
Son el tratamiento de eleccioacuten para P falciparum resistente a quinina ya que
estos eliminan la parasitemia maacutes raacutepidamente que la quinina No se ha
descrito toxicidad severa en humanos aunque algunos estudios
demuestran neurotoxicidad en animales Auacuten no se ha determinado la
seguridad del uso de estos compuestos durante el embarazo
Artemeter-lumefantrina (Coartemreg y Riametreg)
Es una combinacioacuten fija de artemeter (20 mg) y lumefantrina (120 mg) con
accioacuten esquizonticida sanguiacutenea La combinacioacuten es eficaz contra las cepas
de P falciparum resistentes a otros tratamientos sin artemisina
Prevencioacuten y Tratamiento
43
III3 Estrategias mundiales en la lucha contra la malaria
En el antildeo 2008 se formoacute un grupo de estudio y control sobre la malaria
mundial integrado por la OMS Fondo de Naciones Unidas para la infancia
(UNICEF) el Programa de Naciones Unidas para el desarrollo (PNUD) el
Banco Mundial y la Asociacioacuten de la lucha contra el paludismo (FRP) Se crean
una serie de frentes de lucha para combatir y reducir la malaria mundial en un
plazo de 7 antildeos incluiacutedo en los Objetivos de Desarrollo del Milenio propuestos
por la ONU
La estrategia mundial tiene cuatro elementos baacutesicos
o Asegurar el diagnoacutestico precoz y el tratamiento inmediato
o Planificar y aplicar las medidas selectivas y sostenibles de prevencioacuten
incluiacuteda la lucha antivectorial
o Detectar a tiempo contener o prevenir las epidemias
o Reforzar la capacidad local en materia de investigacioacuten baacutesica y aplicada
a fin de permitir y promover la evaluacioacuten regular de la situacioacuten del
paludismo en el paiacutes en particular los factores ecoloacutegicos sociales y
econoacutemicos que influyen en la enfermedad
En el antildeo 2010 se realizoacute una revisioacuten del estado del plan y se propusieron
una serie de adaptaciones para mejorar los buenos resultados obtenidos
teniendo en cuenta la situacioacuten actual de aparicioacuten de resistencias
- Cobertura universal de los programas de prevencioacuten y tratamiento
- En prevencioacuten se proponen
mayores esfuerzos en proporcionar mosquiteras y principalmente un
haacutebito en su uso ya que se habiacutean obtenidos datos concluyentes que
relacionan directamente la disminucioacuten de muertes sobre todo
infantiles con el uso de mosquiteras
mantenimiento del rociado de exteriores con insecticidas de accioacuten
residual aprobadas por la OMS
administracioacuten de tratamiento preventivo intermitente a embarazadas
en zonas endeacutemicas
- En tratamientos se propone
priorizar las confirmaciones parasitoacutelogas de la enfermedad en
pacientes Es decir en la medida de lo posible no administrar
Prevencioacuten y Tratamiento
44
tratamientos sin confirmacioacuten de la enfermedad al microscopio o con
pruebas de diagnostico raacutepido
priorizar al uso de las TCA proponieacutendose la retirada de las
monoterapias orales de artemisina (OMS 2011)
III4 Liacuteneas de investigacioacuten actual
III41 Buacutesqueda de nuevas dianas
En la actualidad la aparicioacuten de resistencias por las mutaciones en el ADN del
paraacutesito obliga a un esfuerzo mayor por encontrar compuestos o asociaciones
de compuestos que sigan siendo efectivos contra el Plasmodium ademaacutes de a la
buacutesqueda de nuevos medicamentos Gracias a los avances de las ciencias
quiacutemicas y tecnologiacuteas actuales y el desarrollo de la Bioquiacutemica y la Genoacutemica
en la lucha contra la malaria posibilitan la determinacioacuten de nuevas dianas Ya
desde hace tiempo se conoce la viacutea de accioacuten de la detoxificacioacuten de la Hb pero
el continuo avance de la ciencia ha llevado al conocimiento del ADN y de las
macromoleacuteculas necesarias para la vida del paraacutesito conocimiento de las
mutaciones que llevan a las resistencias enzimas y otras moleacuteculas que
participan en el desarrollo del paraacutesito
Actualmente diferentes proyectos se encuentran en la fase de identificacioacuten de
cabezas de serie con actividad antimalaacuterica o en periodo de optimizacioacuten con el
fin de generar compuestos con propiedades terapeacuteuticas adecuadas como
inhibidores de proteasas de aacutecidos grasos inhibidores de la ruta de siacutentesis de
isoprenoides o del transporte y metabolismo de fosfoliacutepidos del metabolismo
mitocrondial o pirimidiacutenico
En lo que a inhibidores de proteasas se refiere las hemo-polimerasas como
cistein-proteasas (falcipainas) o aspartil-proteasas (plasmepsinas) son objetivos
primordiales de estudio Es el caso del conocimiento de las proteasas aspaacuterticas
del Plasmodium en los procesos de degradacioacuten de la hemoglobina de los
eritrocitos infectados Se ha determinado bioloacutegicamente que participan 4 tipos
de proteasas en concreto las plasmepsinas I II y IV y la histoaspaacutertica
(Ersmark K et alts 2006)
El mecanismo de accioacuten propuesto es la ruptura inicial de las cadenas α de la
Hb en el enlace peptiacutedico entre Phe-33 y Leu-34 Por meacutetodos computacionales
Prevencioacuten y Tratamiento
45
se genera la estructura tridimensional detallada de las enzimas y se estudia si
los compuestos pueden interaccionar inhibiendo su actividad
En relacioacuten con la siacutentesis de aacutecidos grasos hay que destacar las peculiares
caracteriacutesticas que reviste este proceso en bacterias y en cloroplastos Contienen
un sistema denominado tipo II (FASII) en el que cada reaccioacuten en el proceso de
biosiacutentesis estaacute catalizada por una proteiacutena independiente monofuncional al
contrario que en las ceacutelulas de mamiacutefero donde la siacutentesis estaacute mediada por una
proteiacutena multifuncional conocida como la aacutecido graso sintetasa de tipo I Los
inhibidores de enzimas de la ruta son el triclosan y la tiolactomicina un
metabolito secundario de hongos y estaacuten en desarrollo nuevos compuestos con
potencial terapeacuteutico
En faacutermacos dirigidos a la ruta de biosiacutentesis de isoprenoides vale la pena
destacar que el P falciparum depende de la viacutea 2C-metil-D-eritrol 4-fosfato
(MEP) para la siacutentesis de sus isoprenoides La fosmidomicina un antibioacutetico
natural producido por Streptomyces lavendulae ha demostrado ser un buen
tratamiento en el control de la malaria resistente porque inhibe de manera
especiacutefica la actividad de la enzima DOXP reductoisomerasa y porque controla
el segundo paso de la viacutea MEP
Otro proceso que tiene lugar durante las fases endo-eritrociacuteticas del paraacutesito
es la siacutentesis activa de estructuras de membrana Uno de los componentes
principales de las membranas del paraacutesito es el fosfoliacutepido fosfatidil-colina cuya
siacutentesis a su vez depende de la incorporacioacuten de colina exoacutegena a partir de la
sangre Distintos anaacutelogos de la colina exhiben una potente actividad
antimalaacuterica y se asume que inhiben el transporte de colina que tiene lugar a
traveacutes de un transportador especiacutefico localizado en la membrana del paraacutesito
(Vial HJ et alts 2004)
Existen un conjunto de compuestos que interfieren con la actividad
mitocondrial del paraacutesito Las fases endo-eritrociacuteticas tienen un metabolismo
mitocondrial activo estando presentes todas las enzimas implicadas en el ciclo
de los aacutecidos tricarboxiacutelicos y determinados componentes de la cadena de
transporte electroacutenico Asiacute la cadena respiratoria del paraacutesito constituye un
blanco de accioacuten para los faacutermacos Un ejemplo de desarrollo de faacutermacos por
esta viacutea es el Malaronereg donde la atovaquona se une al sitio de oxidacioacuten del
coenzima Q en el citocromo B del complejo III La accioacuten estaacute complementada
por la combinacioacuten con Proguanilo 45 (antifolato)
Prevencioacuten y Tratamiento
46
III42 Productos naturales
Los productos naturales han sido y son de gran intereacutes en el tratamiento de la
malaria La sociedad apuesta por lo natural y se plantean buacutesquedas de
compuestos activos en diferentes plantas de diferentes regiones africanas
(Magadula JJ y Erasto P 2009) o americanas (Mariath IR et alts 2009) ya
consideradas anteriormente como medicinales
La artemisina y sus derivados es el ejemplo a conseguir con estos
compuestos pero evitando en este caso el inconveniente de que solo puede
obtenerse por viacutea natural o semisinteacutetica
En esta liacutenea se siguen desarrollando derivados de artemisina y peroacutexidos que
tienen el mismo mecanismo de accioacuten que la artemisina viacutea radicales libres
(Muraleedharan KM and Mitchell A 2009) Uno de los muchos resultados de
esta variacioacuten de la estructura base son los compuestos hiacutebridos artemisinas-
quinolinas actualmente en desarrollo que dan lugar a los TCA recomendados
por la OMS Las benzo[c]fenantridinas son un grupo de compuestos
provenientes de extractos de plantas que pueden ser sintetizados y
modificados en un laboratorio (Rivaud M et alts 2012) Su mecanismo de
accioacuten estaacute todaviacutea por confirmar pero se cree que tienen actividad sobre la
inhibicioacuten de la ADN topoisomerasa que participa en la degradacioacuten de la Hb
Siguiendo con la liacutenea de productos naturales un objetivo que no se puede
pasar por alto son los compuestos marinos provenientes de esponjas algas
coraleshellip que contienen compuestos con estudiada actividad antimalaacuterica
(Gademann K y Kobyliska J 2009) Un ejemplo son las esponjas que
contienen diferentes familias de compuestos antimalaacutericos como las
pirroloquinolinas o las manzaminas A (Figura 23) de funcioacuten similar a la CQ y
mejor que la artemisina a igual dosis
Figura 23 Estructuras de compuestos naturales de origen marino
Prevencioacuten y Tratamiento
47
III43 Desarrollo de vacunas
Atendiendo a las observaciones sobre inmunidades que llegan a expresar las
personas que habitan zonas con altas tasas de malaria se van desarrollando las
vacunas Se ha comprobado que los esporozoiacutetos inactivos son muy eficaces
como inductores de la inmunidad en el ser humano Desafortunadamente no es
posible producir esporozoiacutetos inactivos en las enormes cantidades requeridas
para utilizarlos como meacutetodo viable de vacunacioacuten Por otro lado los avances
en materia de genoacutemica permiten identificar prometedoras moleacuteculas
inmunogeacutenicas con una rapidez mucho mayor y eso ampliacutea considerablemente
el nuacutemero de vacunas potenciales (Rojas Rivero L et alts 2005)
Las vacunas experimentales estaacuten basadas en diversos antiacutegenos derivados
de las diferentes formas que adopta el paraacutesito durante su ciclo de desarrollo
Los tipos de vacunas actualmente se clasifican en
Vacunas pre-eritrociacuteticas impiden que los esporozoiacutetos penetren o se
desarrollen en las ceacutelulas hepaacuteticas Estas vacunas prevendriacutean las
consecuencias graves y potencialmente mortales del paludismo en las
personas no inmunizadas Hasta la fecha se han ultimado unos 20 ensayos
cliacutenicos en el hombre con diversas proto-vacunas pre-eritrociacuteticas de
Plasmodium falciparum Una proto-vacuna muy prometedora es la RTS S
que promueve la activacioacuten del sistema inmunitario para que actuacutee contra
el P falciparum (Aponte JJ et alts 2007)
Vacunas contra las formas hemaacuteticas asexuadas son aquellas que impiden
que los merozoiacutetos penetren o se desarrollen en el interior de los hematiacutees
Se han desarrollado varios candidatos Sin embargo la mayoriacutea de esos
preparados se encuentra en estudios precliacutenicos y muy pocos han llegado a
estudios cliacutenicos de fase I debido en parte a la gran variabilidad que
manifiestan estas moleacuteculas en diferentes cepas
Vacunas bloqueadoras de la transmisioacuten son aquellas que estimulan la
produccioacuten de anticuerpos contra antiacutegenos de la fase sexuada del paraacutesito
que puedan impedir el desarrollo de esporozoiacutetos infecciosos en las
glaacutendulas salivales del mosquito Anopheles Teoacutericamente estas vacunas
podriacutean interrumpir el ciclo de transmisioacuten del paraacutesito al paso de este por
el vector y seriacutean de gran utilidad para reducir la diseminacioacuten de paraacutesitos
de cepas resistentes a otros tipos de vacunas El problema es que seriacutea
Prevencioacuten y Tratamiento
48
necesaria una vacunacioacuten masiva durante un largo periodo de tiempo
Actualmente hay algunas en estudios cliacutenicos de fase I
A pesar de todas las prometedoras vacunas que estaacuten en desarrollo
actualmente hay que tener en cuenta que los paraacutesitos desarrollan ingeniosos y
complejos mecanismos para soslayar la respuesta inmunitaria del hueacutesped Por
ejemplo son capaces de expresar diferentes antiacutegenos en cada una de las fases
de su ciclo de vida y a menudo modificar esos antiacutegenos cuando el hueacutesped
activa contra ellos su sistema inmunitario Ademaacutes se ha de vigilar la
complejidad inherente a la realizacioacuten de los propios ensayos cliacutenicos sobre el
terreno por cuanto no es faacutecil para los investigadores determinar la reduccioacuten
de la morbilidad y la mortalidad atribuible a la vacuna experimental
ANTECEDENTES
Antecedentes
51
La Unidad de I+D de Medicamentos de la Universidad de Navarra ha estado
trabajando durante varios antildeos en la siacutentesis de nuevos compuestos duales con
afinidad por los receptores 5-HT1A que fuesen a su vez inhibidores de la
recaptacioacuten de 5-HT para el tratamiento de la depresioacuten (Martinez- Esparza J
et alts 2001 Oruacutes L et alts 2002a Oruacutes L et alts 2002c Perez-Silanes S et
alts 2004)
Se llevaron a cabo estudios de modelizacioacuten molecular (Oruacutes L et alts
2002b) que definieron como farmacoacuteforo la estructura de la figura 24
Figura 24 Elementos farmacofoacutericos para la afinidad por los receptores 5-HT1 e inhibicioacuten del transportador de 5-HT
Los compuestos sintetizados podriacutean definirse como arilaminopropanoles
estructuralmente proacuteximos a las metanolquinolinas y arilaminoalcoholes
usados desde hace antildeos como antimalaacutericos Tal y como se como se ha tratado
en el apartado de introduccioacuten quinina y CQ (metanolquinolinas y
arilaminoalcoholes respectivamente) y halofantrina y lumefantina
(arilaminoalcoholes desarrollados tras la aparicioacuten de resistencias a las
anteriores) son compuestos de gran capacidad esquizonticida
Desde el punto de vista estructural la quinina y cloroquina pueden
considerarse farmacoacuteforos polivalentes ya que a partir de sus estructuras se han
desarrollado muchos de los compuestos que se usan como tratamiento de la
malaria en la actualidad La relacioacuten estructura-actividad de estos farmacoacuteforos
con base de quinolina se puede estudiar en la figura 25 (Konznetsov VV et
alts 2008)
Figura 25 Relacioacuten estructura actividad de la CQ
Antecedentes
52
Viendo la similitud estructural de los compuestos con estas estrucutras y los
aminoalcoholes utilizados en el tratamiento actual se decidioacute ensayar la posible
actividad antiplasmoacutedica de los mismos con buenos resultados en cepas
sensibles a la CQ (Perez-Silanes S et alts 2009)
Figura 26 Estructuras de los arilaminoalcoholes sintetizados como antidepresivos con mejor actividad antimalaacuterica Valores de CI50 en microM La CQ tiene un valor de 008 microM en cepas 3D7 sensibles a la CQ
Surgen asiacute las estructuras a desarrollar en este proyecto enfocado a la siacutentesis
de nuevos derivados de arilamino alcoholes para el tratamiento de la malaria
resistente a la CQ
OBJETIVOS Y
PLAN DE TRABAJO
IIVV OOBBJJEETTIIVVOOSS
Objetivos
57
El presente trabajo tiene como objetivo la buacutesqueda de nuevos derivados para
el tratamiento de la malaria resistente Teniendo en cuenta la estructura de los
aminoalcoholes derivados de la quinina y tomando como referencia la CQ se
propone la siacutentesis de nuevos derivados de arilaminoalcoholes con actividad
antimalaacuterica
El objetivo para llevar a cabo este proyecto estaacute basado en el trabajo detallado
a continuacioacuten
Revisioacuten bibliograacutefica de los faacutermacos con actividad antimalaacuterica
publicada hasta la fecha y planteamiento de un farmacoacuteforo
Disentildeo y siacutentesis de nuevos compuestos derivados de
arilaminoalcoholes con potencial actividad antimalaacuterica
Caracterizacioacuten estructural y evaluacioacuten bioloacutegica y computacional de
cada uno de los nuevos compuestos obtenidos
Estudio de la posible relacioacuten estructura-actividad de los compuestos
sintetizados que permita identificar liacutederes y una optimizacioacuten en el
disentildeo de nuevos derivados
Refinamiento estructural de nuevos compuestos con afinidad mejorada
por las dianas del plasmodio en base a los resultados obtenidos
VV PPLLAANN DDEE TTRRAABBAAJJOO
Plan de Trabajo
61
V1 Disentildeo de nuevos arilaminoalcoholes
Tal y como se ha comentado anteriormente se puede observar en la figura 27
que muchos de los compuestos antimalaacutericos de las diferentes subfamilias
tienen su base de desarrollo en la quinolina De ella surgen los dos compuestos
antimalaacutericos por excelencia
Figura 27 Esquema general del proceso de disentildeo de las moleacuteculas a desarrollar
Teniendo en cuenta todo esto se propone como estructura general de este
proyecto la mostrada en la figura 28
Figura 28 Esquema general de las nuevas estructuras
El proceso de disentildeo estructural de las nuevas moleacuteculas fue el siguiente
1 GRUPO AR1
En muchos de los compuestos antimalaricos mas relevantes como quinina o
cloroquina una constante en la estructura es la presencia del anillo de
quinolina aunque ya en los derivados de la familia de arilaminoalcoholes este
grupo es variable como en la halofantrina donde el grupo quinolina es
Plan de Trabajo
62
sustituido por el grupo fenantreno o el Benflumetol (lumefantrina) que cuenta
con un fluoreno sustituido
De este modo se plantea la posibilidad de la sustitucioacuten de la quinoleiacutena por el
benzo[b]tiofeno (basanda en estudios previos) el naftaleno (bioisoacutemero de la
quinoleiacutena) e incluso se plantea la simplificacioacuten a benceno (por motivos de
reduccioacuten estructurural) Se ha tenido en cuenta tambieacuten que en la familia de las
4-aminoquinolinas asociado a esa quinolina se presenta un grupo
electroatrayente (CF3) Asiacute se propone la introduccioacuten de un aacutetomo de fluacuteor
que es maacutes electronegativo y de menor tamantildeo
2 GRUPO Y
Si bien en la bibliografiacutea el grupo alcohol se considera esencial para la
actividad antimalaacuterica se quiso probar si en nuestros compuestos seguiacutea siendo
grupo esencial en la actividad Se estudioacute la actividad de los carbonilos
precursores de siacutentesis sustituyeacutendolos por un grupo oxima en posicioacuten 1 de la
cadena alifaacutetica en los nuevos derivados
3 CADENA ALIFAacuteTICA (CH2)n
En la familia de las aminoquinolinas y dentro del grupo de
arilaminoalcoholes se observa la presencia de una cadena alifaacutetica como puente
de unioacuten entre el grupo Ar1 y el resto de la moleacutecula De este modo los nuevos
derivados que desarrollar contaraacuten con una variacioacuten de uno a dos carbonos en
la cadena carbonada para determinar la longitud oacuteptima para la actividad
4 AMINA CENTRAL
El grupo amino es constante en todas las familias tomadas como referencia
Del mismo modo las aminoquinolinas tienen como similitud estructural entre
otras un grupo amino unido a la cadena alifaacutetica En este trabajo se plantea el
uso de piperazina homopiperazina (S)-aminopirrolidina aminopiperidina e
tetrahidropiridina para evaluar el efecto del cambio y determinar queacute tipo de
estructuras resulta maacutes conveniente
5 GRUPO AR2
En los compuestos tomados como referencia estructural de partida se observa
la presencia de las cadenas alifaacuteticas en el extremo amino Los nuevos
derivados combinan la amina ciacuteclica con un anillo aromaacutetico sustituido por
grupos electroatrayentes como CF3 (presentes en metanolquinolinas y
Plan de Trabajo
63
arilaminoalcoholes y de efecto positivo deducible para la actividad) el grupo
NO2 o el aacutetomo de F
Figura 29 Disentildeo de nuevas series de derivados de arilaminoalcoholes como nuevos agentes antimalaacutericos
V2 Siacutentesis de los compuestos disentildeados
Una vez disentildeados los compuestos y antes de empezar el trabajo de siacutentesis
se debe dejar claro cuaacutel va a ser el proceso elegido De forma general se puede
definir la siacutentesis de todos los derivados como siacutentesis lineal
La reaccioacuten de Mannnich que se usa para condensar metilcetonas con aminas
y las reacciones de condensacioacuten por sustitucioacuten nucleoacutefila alifaacutetica son
reacciones lineales La posterior reduccioacuten a hidroxilos u oximas se realiza en
un solo paso de reaccioacuten De esta forma nos aseguramos el menor nuacutemero de
pasos de reaccioacuten simplificacioacuten de la siacutentesis disminucioacuten del tiempo
invertido en el mismo y reduccioacuten del coste
V3 Caracterizacioacuten de los compuestos
Todas las reacciones seraacuten seguidas y controladas por cromatografiacutea en capa
fina Una vez obtenidos los compuestos se identificaraacuten por cromatografiacutea en
capa fina espectroscopia infrarroja resonancia magneacutetica nuclear de protoacuten
anaacutelisis elemental y punto de fusioacuten
Plan de Trabajo
64
V4 Evaluacioacuten bioloacutegica ldquoin vitrordquo
Los compuestos finales obtenidos seraacuten enviados a la Universidad de
Antioquiacutea (Medelliacuten Colombia) para la evaluacioacuten in vitro de su actividad
antimalaacuterica Los ensayos de toxicidad de los mismos se realizaraacuten en el
Laboratorio de Farmacologiacutea para el Desarrollo (IRD) de la Universidad Paul
Sabatier en Toulouse (Francia)
V5 Evaluacioacuten bioloacutegica ldquoin vivordquo
Aquellos compuestos que sean seleccionados por sus caracteriacutesticas de
estructura actividad in vitro y toxicidad seraacuten enviados a la Universidad Paul
Sabatier de Toulouse (Francia) para su evaluacioacuten in vivo
V6 Estudios computacionales
Todos los compuestos se someteraacuten a estudios computacionales sobre sus
propiedades fisicoquiacutemicas para obtener datos aproximados de su
comportamiento en solucioacuten (Log P) lipofilia o caraacutecter polar-apolar (presencia
de grupos polares y capacidad de formar enlaces donadores o aceptores) que
aporten datos teoacutericos sobre su absorcioacuten en el organismo A partir de los datos
conformacionales teoacutericos se plantea la unioacuten con una diana Los estudios
computacionales se realizaraacuten en la Unidad de I+D de Medicamentos de la
Universidad de Navarra
MATERIAL Y
MEacuteTODOS
VVII QQUUIacuteIacuteMMIICCAA TTEEOacuteOacuteRRIICCAA
VI1 Esquema general de siacutentesis
Figura 30 Reactivos y condiciones Viacutea 1 Carbonato potaacutesico en tetrahidrofurano a reflujo
Viacutea 2 Dioxolano con aacutecido clorhiacutedrico a reflujo 130-140ordmC
Quiacutemica Teoacuterica
70
VI2 Siacutentesis de precursores
VI21 Siacutentesis de (benzo[b]tiofen-3-il)-3-cloropropan-1-ona
Figura 31 Esquema general de siacutentesis de (benzo[b]tiofen-3-il)-3-cloropropan-1-ona
La siacutentesis de este derivado se lleva a cabo usando tricloruro de aluminio a
temperatura ambiente durante 48 horas (Peacuterez-Silanes S et alts 2001) En vez
de emplear cloroformo como disolvente tal y como describen los autores se
empleoacute diclorometano ya que es menos toacutexico y resulta igualmente efectivo
VI22 Siacutentesis de arilaminas
VI221 Siacutentesis de arilaminas protegidas
Los compuestos sintetizados se ajustan a la estructura general que se muestra
en la figura 32
Figura 32 Estructura general de las arilaminas intermedias sintetizadas
Las arilaminas sintetizadas tienen un extremo amino protegido con un grupo
tert-butiloxicarbonilo (BOC) voluminoso que evita que estas diaminas
reaccionen por ambos extremos con el fluoruro de arilo
Figura 33 Esquema general para la siacutentesis de arilaminas
Este tipo de reacciones raramente transcurren por un mecanismo de
sustitucioacuten nucleofiacutelica aromaacutetica (SNA) Normalmente la SNA dan bajos
rendimientos debido a que el enlace C (sp2)-X es maacutes corto y fuerte que el de un
carbono con hibridacioacuten sp3 La SN2 estaacute impedida por dificultades esteacutericas del
anillo para que se aproxime el nucleoacutefilo y la SN1 estaacute impedida por la
inestabilidad del catioacuten fenilo intermedio
Tras revisar la bibliografiacutea se propone que este tipo de SNA transcurren
seguacuten un mecanismo llamado Sustitucioacuten nucleofiacutelica aromaacutetica viacutea complejos
Quiacutemica teoacuterica
71
de meisenheimer (Figura 34) consistente en una adicioacuten-eliminacioacuten (Bruckner
et alts 2002)
En la primera fase la adicioacuten el nucleoacutefilo ataca al compuesto aromaacutetico en la
que es la etapa lenta de la reaccioacuten Se produce un carbanioacuten que es llamado
Complejo de Meisenheimer La carga negativa queda deslocalizada sobre los
cinco carbonos aromaacuteticos con hibridacioacuten sp2 del anillo pero no lo hace
uniformemente sino que se distribuye tal y como se indica en la figura 34
Figura 34 Primera Etapa Etapa lenta del mecanismo de reaccioacuten de sustitucioacuten nucleofiacutelica viacutea complejos de
Meisenheimer
El aacutetomo unido al nucleoacutefilo tiene hibridacioacuten sp3 ya que tambieacuten se
encuentra unido al sustituyente X que se elimina en una segunda etapa la fase
raacutepida de la reaccioacuten (Figura 35)
Figura 35 Segunda Etapa Etapa raacutepida del mecanismo de reaccioacuten de sustitucioacuten nucleofiacutelica viacutea complejos de
Meisenheimer
Independientemente del haloacutegeno X y del sustituyente R empleados en la
posicioacuten para respecto del aacutetomo de carbono al que ataca el nucleoacutefilo aparece
una carga parcial de -030 del mismo modo en las posiciones orto esta carga
parcial es de -025 y en la posiciones meta la carga es de -010 Como
consecuencia de esto uno de los requisitos maacutes importantes para que se de la
reaccioacuten es que alguacuten grupo electroatrayente estabilice el complejo La mayor
densidad de carga negativa se encuentra en para por lo que los grupos
electroatrayentes en esta posicioacuten estabilizan mucho el compuesto formado Por
esta razoacuten se han empleado grupos nitro o fluacuteor en dicha posicioacuten
El empleo de fluoruros de arilo para la formacioacuten de los intermedios de
aminas protegidas tambieacuten se explica por esta razoacuten El fluacuteor tiene un fuerte
efecto inductivo lo que estabiliza el complejo formado
Quiacutemica Teoacuterica
72
Tras una revisioacuten bibliograacutefica se observoacute que esta reaccioacuten esta favorecida
llevaacutendose a cabo en un medio de acetonitrilo (CH3CN) a reflujo en lugar del
dimetilsulfoacutexido (DMSO) anteriormente descrito usando carbonato potaacutesico
(K2CO3) (Blizzard et alts 2005) lo que facilita el trabajo por el bajo punto de
ebullicioacuten del medio y simplificando la extraccioacuten de los compuestos en este
medio
VI222 Desproteccioacuten de aminas
Las arilaminas sintetizadas tienen un extremo amino protegido con un grupo
BOC asiacute una vez formados los intermedios protegidos el paso siguiente para
continuar con la siacutentesis de los compuestos deseados consiste en eliminar este
grupo protector
Figura 36 Generacioacuten del carbocatioacuten t-butilo y del aacutecido carbaacutemico
La reaccioacuten de las aminas protegidas con aacutecidos acuosos como aacutecido
clorhiacutedrico y aacutecido aceacutetico (HCl y HAc) en condiciones de temperatura
ambiente rinde la consiguiente amina desprotegida en forma de hidrocloruro
Para esta reaccioacuten la amina protegida se disuelve en una disolucioacuten (11) de
HClHAc a temperatura ambiente generaacutendose un aacutecido carbaacutemico (Figura 36)
que es inestable y se descarboxila in situ (Figura 37) dando lugar a la amina
desprotegida en forma de hidrocloruro debido la presencia de HCl en el medio
Figura 37 Descarboxilacioacuten espontaacutenea del aacutecido carbaacutemico
Los hidrocloruros son compuestos poco solubles en muchos de los
disolventes orgaacutenicos y en ocasiones impiden los siguientes pasos de siacutentesis
Asiacute los intermedios se convierten a su forma de base libre por medio de su
disolucioacuten en agua y posterior adicioacuten de una disolucioacuten de hidroacutexido soacutedico
Quiacutemica teoacuterica
73
(NaOH) 2M de forma gradual hasta pH baacutesico para asegurar una completa
eliminacioacuten de HCl de la moleacutecula La disolucioacuten baacutesica se deja en agitacioacuten
durante dos horas aproximadamente Normalmente se observa como al antildeadir
la base se obtiene un precipitado debido a la insolubilidad de la amina en forma
de base libre en el medio acuoso mientras que en forma de hidrocloruro
resultaba soluble
Como uacuteltimo paso de reaccioacuten se procede a la extraccioacuten de la amina con un
disolvente orgaacutenico que suele ser diclorometano En general las aminas
precipitan faacutecilmente en hexano friacuteo como soacutelido Si fuese necesario purificar el
aceite impuro se realiza una cromatografiacutea en columna no flash con
diclorometano basificado con unas gotas de amoniacuteaco
VI3 Siacutentesis de derivados carboniacutelicos (Serie 0)
VI31 Condensacioacuten de 1-(benzo[b]tiofen-3-il)-3-cloropropan-1-ona y
de 2-bromo-2acute-acetonaftona con la amina (Viacutea 1)
En este caso los productos finales se obtienen a traveacutes de una reaccioacuten de
sustitucioacuten nucleofiacutelica alifaacutetica (Figura 38) a partir del 1-(benzo[b]tiofen-3-il)-3-
cloropropan-1-ona o del 2-bromo-2acute-acetonaftona y la correspondiente amina
Al tratarse de un cloruro de alquilo primario el mecanismo maacutes probable de
reaccioacuten es el de una sustitucioacuten nucleofiacutelica de segundo orden (SN2)
Figura 38 Esquema de siacutentesis de cetonas
La mayoriacutea de las veces los reactivos de partida no se llegan a consumir
completamente y se obtienen productos secundarios que no se eliminan con
facilidad Ha sido especialmente costosa la purificacioacuten de algunos compuestos
los que han requerido la purificacioacuten por medio dos columnas cromatograacuteficas
tradicionales consdecutivas columna tradicional seguida de una preparativa o
purificarlos dos veces consecutivas en el equipo de cromatografiacutea flash Todos
estos intentos de purificacioacuten ldquoparcialrdquo hacen disminuiacuter notablemente el
rendimiento de la reaccioacuten Otras veces los compuestos se precipitan como
hidrocloruro consiguiendo al mismo tiempo ser purificados
Quiacutemica Teoacuterica
74
VI32 Reaccioacuten de Mannich Condensacioacuten de metilcetonas con aminas
en medio aacutecido (Viacutea 2)
La reaccioacuten de Mannich consiste en la condensacioacuten de un compuesto que
posea aacutetomos de hidroacutegeno activos (sustrato) con formaldehiacutedo y una amina
para formar una moleacutecula conocida como ldquoBase de Mannichrdquo
En la mayor parte de las reacciones se usoacute el 13-dioxolano que es una amina
secundaria como compuesto generador de formaldehido El sustrato son
arilmetilcetonas donde el anillo aromaacutetico es fluorobenzo[b]tiofeno naftaleno
4-fluoronaftaleno o bencenos para-sustituidos El 13-dioxolano es ademaacutes el
disolvente y como catalizador el aacutecido clorhiacutedrico aporta al medio los protones
necesarios para la reaccioacuten
Las arilmetilcetonas utilizadas presentan hidroacutegenos aacutecidos en posiciones α
con respecto al grupo carboniacutelico (Figura 40) En medio aacutecido la acidez de estos
se debe a la estabilizacioacuten de la base conjugada (forma enoacutelica) por resonancia
La presencia del anillo en α con respecto al carbonilo provoca una situacioacuten de
deslocalizacioacuten electroacutenica π del sistema en su forma enoacutelica que se ve
favorecida por los sustituyentes electroatrayentes unidos al anillo La
reactividad aumenta debido a la retirada de carga del sistema π por estos
sustituyenes que acidifican asiacute los hidrogenos α
El mecanismo de reaccioacuten propuesto transcurre en dos etapas
En una primera etapa la amina reacciona con el formaldehiacutedo generando el
catioacuten iminio El 13 dioxolano es un acetal que en medio aacutecido genera
formaldehiacutedo ldquoin siturdquo para producirse entonces una adicioacuten nucleoacutefila de
la amina al carbonilo del compuesto no enolizable como es el recieacuten
generado formaldehiacutedo (Figura 39) (Tramontini et alts 1973)
Figura 39 Primera etapa del mecanismo de reaccioacuten propuesto para la formacioacuten de la base de Mannich
En la segunda etapa de reaccioacuten la metilcetona en medio aacutecido se protona
dando lugar a un equilibrio ceto-enoacutelico desplazado hacia la forma enoacutelica
(Figura 40)
Quiacutemica teoacuterica
75
Figura 40 Equilibrio ceto-enoacutelico en medio aacutecido
El ion iminio formado en la primera etapa es un buen electroacutefilo que
reacciona con la forma enolica nucleoacutefila obtenieacutendose como resultado la sal del
compuesto final (Figura 41) Asiacute el uacuteltimo paso de reaccioacuten es la basificacioacuten del
medio con una disolucioacuten acuosa de NaOH para la obtencioacuten de la sal
inorgaacutenica y compuesto orgaacutenico libre
Figura 41 Segunda etapa del mecanismo de reaccioacuten de Mannich
Se ha determinado experimentalmente que en la obtencioacuten de la base se
produce la misma reaccioacuten usando como generador de formaldehido el
paraformaldehido Para ella ha de usarse como medio de reaccioacuten un medio
proacutetico como el alcohol etiacutelico y HCl Despueacutes de varios experimentos y
optimizacioacuten de la temperatura necesaria para la reaccioacuten se comproboacute que la
viacutea oacuteptima por rapidez y rendimiento era la del 13 dioxolano
VI4 Siacutentesis de derivados hidroxiacutelicos (Series 1-7)
Los derivados hidroxiacutelicos se sintetizan a traveacutes de la reduccioacuten de las
correspondientes intermedios carboniacutelicos con borohidruro soacutedico (BH4Na) en
metanol a 0ordmC
Figura 42 Esquema general para la siacutentesis de alcoholes desde cetonas
En todas las reducciones que se han realizado se utiliza como agente
reductor el BH4Na que es probablemente el agente reductor maacutes usado en este
tipo de siacutentesis Se trata de un hidruro de reactividad media que presenta alta
quimioselectividad y un manejo sencillo en comparacioacuten con otros hidruros
El disolvente empleado es metanol con el que se logra una buena solubilidad
del BH4Na La temperatura de reaccioacuten se ha de mantener en torno a 0ordmC por
Quiacutemica Teoacuterica
76
tres motivos primero para evitar que la reaccioacuten se deacute demasiado raacutepida lo que
conlleva la aparicioacuten de productos secundarios en segundo lugar para evitar
que sea demasiado lenta lo que favorece la reaccioacuten secundaria entre el
borohidruro y el metanol El tercer motivo es impedir que tenga lugar la
reaccioacuten inversa a la reaccioacuten de Mannich
En general la reaccioacuten entre el BH4Na y el compuesto se da por completo
durante la primera hora de reaccioacuten antes de que tenga lugar la reaccioacuten
inversa de descomposicioacuten del compuesto cetoacutenico El mecanismo de reaccioacuten
no se ha descrito de forma totalmente definitiva aunque siacute que parece seguro el
hecho de que la estequiometriacutea de la reaccioacuten es de cuatro moleacuteculas de cetona
por una de BH4Na
La reaccioacuten transcurre siguiendo una transferencia secuencial de hidruros
desde la moleacutecula de BH4Na hasta cada una de las cuatro cetonas a traveacutes de
sendos ataques nucleofiacutelicos a los carbonos carboniacutelicos que tras estas
transferencias forman la sal soacutedica del tetraborato Este complejo sufre con
posterioridad una hidroacutelisis dando lugar finalmente a la formacioacuten del alcohol
(Figura 43)
Figura 43 Mecanismo de reaccioacuten propuesto para la siacutentesis de los alcoholes
Quiacutemica teoacuterica
77
El disolvente utilizado es el metanol que al ser un disolvente proacutetico cumple
la misioacuten de reducir la energiacutea de activacioacuten que es demasiado grande para que
la reaccioacuten se produzca de forma espontaacutenea a pesar de que el proceso neto es
exoteacutermico Esta cataacutelisis de la reaccioacuten se debe a la estabilizacioacuten que el
disolvente aporta al estado de transicioacuten ademaacutes de estabilizar el borano y el
anioacuten alcoacutexido cuando eacutestos no se hayan unido
Todos los derivados hidroxiacutelicos se han purificado por cromatografiacutea en capa
fina cromatografiacutea de columna cromatografiacutea preparativa o cromatografiacutea
flash Algunos se han precipitado en forma de hidrocloruro mediante la
adicioacuten de eacuteter saturado de aacutecido clorhiacutedrico
Estereoquiacutemica de la reaccioacuten
Las cetonas asimeacutetricas empleadas en estas reacciones son productos
proquirales por lo que dan lugar a las dos configuraciones posibles del
derivado hidroxiacutelico R y S La reaccioacuten rinde una mezcla raceacutemica ya que el
borohidruro soacutedico no es agente estereoselectivo y el grupo carbonilo es plano
con lo que el ion hidruro puede atacar por ambos lados del grupo con igual
probabilidad Ademaacutes estas moleacuteculas no poseen grupos voluminosos que
favorezcan la aparicioacuten de un mayor porcentaje de uno de los enantioacutemeros
Dado que es muy costoso el aislamiento de los isoacutemeros por separado se
replanteariacutea este trabajo en caso de encontrar una moleacutecula especialmente
activa
Reacciones secundarias
Una de las reacciones secundarias maacutes frecuentes es la rotura de la base de
Mannich formada a traveacutes de una desaminacioacuten o de una desaminometilacioacuten
que recibe el nombre de ldquoretro-Mannichrdquo (Tramontini y Angiolono 1990) La
reaccioacuten tiene como productos los reactivos de partida de la condensacioacuten
carboniacutelica
Todaviacutea no queda claro el porqueacute de estas reacciones pero podriacutea deberse a
un aumento de la temperatura del medio provocada por una adicioacuten
demasiado raacutepida de BH4Na o por una excesiva basificacioacuten del medio
ocasionada por un exceso del agente reductor
Quiacutemica Teoacuterica
78
VI5 Siacutentesis de oximas (Serie 8)
La siacutentesis de estos derivados se abordoacute a partir de los derivados carboniacutelicos
mediante una condensacioacuten de estos con hidroxilamina usando etanol (EtOH)
como disolvente (Figura 44)
Figura 44 Esquema general de reduccioacuten de carbonilo a oxima
El mecanismo de la reaccioacuten transcurre en dos etapas a traveacutes de un
intermedio cuya existencia ha sido verificada mediante el uso de teacutecnicas de
espectroscopia de IR (Martinez J 1999)
La primera etapa consiste en la formacioacuten del intermedio de reaccioacuten para lo
cual es necesaria la presencia de hidroxilamina en su forma libre (la forma
protonada no posee caraacutecter nucleofiacutelico) por lo que esta etapa de la reaccioacuten se
veraacute favorecida a pH baacutesico
Figura 45 Mecanismo de reaccioacuten propuesto para la formacioacuten del intermedio de reaccioacuten en la formacioacuten de oximas
La segunda etapa consiste en la deshidratacioacuten del intermedio que estaraacute
favorecida por un pH aacutecido La velocidad de la reaccioacuten dependeraacute del pH de la
misma y asiacute mientras que en un pH baacutesico la adicioacuten de hidroxilamina es un
proceso raacutepido y es la segunda etapa la que controla la velocidad de reaccioacuten lo
contrario ocurre a pH aacutecido siendo entonces la primera etapa la que controla la
velocidad de reaccioacuten
Figura 46 Mecanismo propuesto para la formacioacuten de la oxima por deshidratacioacuten del intermedio de reaccioacuten en media aacutecido
Quiacutemica teoacuterica
79
Estereoquiacutemica de la reaccioacuten
La formacioacuten de oximas puede producir dos isoacutemeros posibles el Z o cis y el
E o trans
Figura 47 Isomeriacutea cis-trans de los derivados oxima31
Se observoacute que seguacuten el derivado carboxiacutelico del que se partiacutea se obteniacutea
mayoritariamente un isoacutemero u otro pero aunque no se ha encontrado
explicacioacuten a esta selectividad
31 El estudio espectroscoacutepico de ambos isoacutemeros se encuentra desarrollado en la tesis del Dr J Martinez Esparza (1999)
VVIIII QQUUIacuteIacuteMMIICCAA EEXXPPEERRIIMMEENNTTAALL
Quiacutemica experimental
83
VII1 Instrumental y reactivos
Los reactivos quiacutemicos utilizados en siacutentesis fueron adquiridos en E Merck
(Darmstadt Alemania) Scharlau (FEROSA Barcelona Espantildea) Panreac
Quiacutemica SA (Montcada i Reixac Barcelona Espantildea) Sigma-Aldrich Quiacutemica
SA (Alcobendas Madrid) Acros Organics (Janssen Pharmaceuticalaan 3a
2440 Geel Beacutelgica) Maybridge (Cornwall Reino Unido) Lancaster (Bischheim-
Strasbourg Francia) y Prolabo (Leuven Belgica)
Las cromatografiacuteas de capa Fina se desarrollan sobre gel de siacutelice de 02 mm de
espesor (Alugram SIL GUV254 [ref 818133] Macherey-Nagel Alemania) Las
placas se desarrollan en diclorometanometanol en diferentes proporciones y
se revelan bajo una laacutempara ultravioleta a longitud de onda 254 y 365 nm
La cromatografiacutea en columna se desarrolla en columnas de vidrio
empaquetadas con siacutelica gel 60 (0040-0063 mm y 0063-0200 mm de tamantildeo
de partiacutecula Merck) con fases moacuteviles diclorometanometanol o
hexanoacetato en diferentes proporciones
La cromatografiacutea preparativa se desarrolla en placas de vidrio rectangulares
sobre las cuales se preparan laacuteminas de siacutelica gel (Siacutelica Gel 60 PF254
cromatografiacutea en capa fina (ref 1077472500) Merck KGaA Darmstadt
Alemania) de 1 mm de grosor La fase moacutevil utilizada en esta metodologiacutea es
diclorometanometanol 973
La cromatografiacutea flash se realiza en un equipo de cromatografiacutea Combiflashreg
Rf 200 (Teledyne Isco Lincoln USA) Se desarrolla en columnas flash de fase
normal de 12 gramos RediSepreg Rf Columns (Teledyne Isco USA) con un
gradiente binario hasta 991 diclorometanometanol (pureza de siacutentesis SDS-
Carlo Erba Reactifs Francia)
Formacioacuten de hidrocloruro algunos de los compuestos fueron purificados o
precipitados en forma de sales Para ellos se utilizoacute eacuteter saturado de HCl
preparado en el laboratorio
VII2 Meacutetodos de elucidacioacuten estructural
Todos los compuestos sintetizados han sido caracterizados quiacutemicamente por
cromatografiacutea en capa fina (CCF) punto de fusioacuten espectroscopia infrarroja
(IR) resonancia magneacutetica nuclear (RMN) anaacutelisis elemental de carbono
Ensayos Bioloacutegicos
84
hidroacutegeno y nitroacutegeno (CHN) y cromatografiacutea liacutequida de alta resolucioacuten
(HPLC)
Los puntos de fusioacuten han sido determinados en un equipo Mettler FP82 +
FP80 (Greifense Suiza) y no han sido corregidos La temperatura de fusioacuten se
muestra en grados centiacutegrados (0C)
Los espectros de IR han sido registrados en un equipo Thermo Nicolet FTIR
Nexus Euro (Madison USA) con el programa informaacutetico OMNIC 60
empleando pastillas de bromuro potaacutesico Las frecuencias se expresan en cm-1 y
las intensidades de sentildeal se representan como md (media deacutebil) d (deacutebil) m
(media) f (fuerte) y mf (muy fuerte)
Los espectros de RMN-1H han sido registrados en un equipo Brucker 400
UltrasieldTM (Brucker BioSpin GmbH Rheinstelten Alemania) utilizando como
referencia interna tetrametilsilano en una concentracioacuten aproximada de 01
gmL de TMS y dimetilsulfoacutexido-d6 (DMSO-d6) o cloroformo deuterado
(CDCl3) como disolventes La concentracioacuten de las muestras ha sido
aproximadamente 20 mgmL Para la deteccioacuten de los protones laacutebiles se
emplean unas gotas de agua deuterada Los desplazamientos quiacutemicos (δ) han
sido expresadas en ppm relativas a tetrametilsilano y las multiplicidades de
sentildeal se han representado como se indican en las siguientes abreviaturas sa
(sentildeal ancha) s (singlete) d (doblete) t (triplete) c (cuadruplete) m
(multiplete) dd (doble doblete) y ddd (doble doblete desdoblado) Las
constantes de acoplamiento J han sido expresadas en Hz Los experimentos
HMBC (espectros en 2D para determinar los acoplamientos de protones a larga
distancia) HMQC (espectros en 2D para observar los acoplamientos C-H en la
moleacutecula) DEPT-135 (espectros en 1D donde los CH y CH3 salen positivos y
los CH2 negativos) DEPT-90 (espectros en 1D donde solo aparecen los grupos
CH) RMN-13C y COSY (espectro 2D para determinar los acoplamientos de los
protones con los protones vecinos) se han registrado en el mismo equipo
empleado para la resonancia de protoacuten utilizando los mismos disolventes
deuterados
Los CHN han sido obtenidos en un microanalizador LECO CHN-900(Tres
cantos Espantildea) a partir de muestras previamente secadas con pentoacutexido de
foacutesforo durante 24-48 horas a vaciacuteo (3-4 mm Hg) y temperatura ambienteEl
intervalo de error admitido para cada producto es de plusmn04 para cada tipo de
aacutetomo determinado
Quiacutemica experimental
85
Los tiempos de retencioacuten y longitudes maacuteximas de absorcioacuten para la
determinacioacuten de pureza y caracterizacioacuten han sido obtenidos en un equipo de
HPLC Los experimentos fueron realizados en un cromatoacutegrafo Ultimate 3000
(DIONEX) controlado por el software Cromeleon versioacuten 68 Las medidas se
obtuvieron con una columna RP18 (LICHROSPHER 100 RP18 EC 5 microm
10x046 TEKNOKROMA) como fase estacionaria y un flujo de 1 mL minuto
con metanolagua (8020) como fase moacutevil Los tiempos de retencioacuten (tR) se
expresan en minutos y las longitudes de onda maacuteximas en nm
VII3 Denominaciones de compuestos
El criterio elegido para la asignacioacuten de las referencias ha sido el siguiente En
primer lugar se dividen los compuestos obtenidos en carbonilos hidroxilos y
oximas Los derivados carboniacutelicos son considerados como intermedios en la
reaccioacuten global asiacute que se les asigna el nombre de Serie 0 Los compuestos
hidroxiacutelicos son los que corresponden estructuralmente con los
arilaminoalcoholes antimalaacutericos objeto central de este trabajo que se divide en
subgrupos En el caso de las oximas se ha denominado al grupo de compuestos
como Serie 8
La primera divisioacuten se realiza seguacuten la naturaleza del Ar1 y de la longitud de la
cadena alifaacutetica
Figura 48 Estructura general de los derivados hidroxiacutelicos sintetizados
Serie 1 2 3 4 5 6 7
Ar1
n 2 2 2 1 2 2 2
Tabla 1 Distribucioacuten de compuestos en series por Ar1
Ademaacutes de la serie numeacuterica una letra diferenciaraacute cada compuesto seguacuten la
amina y los sustituyentes Ra y Rb del benceno de Ar2 que conforman cada
derivado De esta forma
Ensayos Bioloacutegicos
86
a b c d e f g
Amina
RaRb CF3N
O2 NO2CF3 HCF3 CF3NO2 CF3NO2 CF3NO2 HF
Tabla 2 Denominacioacuten de compuestos
Siguiendo este orden alfabeacutetico los derivados que forman la Serie 0 son
numerados seguacuten el mismo criterio
Ejemplo un compuesto hidroxiacutelico que presenta un aacutetomo de fluacuteor en Ar1
unido a un grupo naftaleno con una piperidina central y grupo fenil con Ra
trifluorometil y Rb nitro se denomina como compuesto 5f
Referencia Serie 5f
Ar1= FNFT
(CH2) n n=2
Amina= PIPR
Ar2 Ra=CF3 ndash Rb= NO2
VII4 Descripcioacuten general de meacutetodos de siacutentesis
VII41 Meacutetodo A procedimiento general para la obtencioacuten de las
arilaminas protegidas
En 30 mL de acetonitrilo (CH3CN) se disuelven 1 equivalente de la amina
comercial protegida y 12 equivalentes del halogenuro de arilo correspondiente
seguacuten la arilamina que se desee sintetizar en cada caso Se antildeaden tambieacuten 15
equivalentes de carbonato potaacutesico (K2CO3) para neutralizar el medio de
reaccioacuten Se hace reaccionar a reflujo un maacuteximo de 24 horas tras lo cual se
elimina el CH3CN en el rotavapor El residuo obtenido se disuelve en
diclorometano y se extrae tres veces con agua La fase orgaacutenica obtenida se seca
con sulfato soacutedico anhidro se filtra y se elimina el disolvente a sequedad en el
rotavapor obtenieacutendose la correspondiente BOC-arilamina
Quiacutemica experimental
87
VII42 Meacutetodo B procedimiento general para la desproteccioacuten de
aminas
Se disuelve la amina protegida en 40 mL de disolucioacuten HClAcH (11)
observaacutendose ligera efervescencia por el desprendimiento de H2 Se deja
agitando 2 horas a temperatura ambiente Transcurrido el tiempo se elimina el
disolvente en el rotavapor El clorhidrato obtenido se disuelve en agua y se
antildeade NaOH 2M hasta conseguir pH baacutesico Se agita 2 horas y la mezcla de
reaccioacuten se extrae con DCM La fase orgaacutenica se seca con sulfato soacutedico anhidro
se filtra y se elimina el disolvente a sequedad en el rotavapor obtenieacutendose la
correspondiente arilamina desprotegida
VII43 Meacutetodo C procedimiento general para condensacioacuten de aminas
(Viacutea 1)
Se disuelven en 40 mL de tetrahidrofurano (THF) las cantidades indicadas en
cada caso de 1-(benzo[b]tiofen-3-il)-3-cloropropan-1-ona o 2-bromo-2acute-
acetonaftona y la amina deseada en proporciones 11 Se antildeade la cantidad
equimolecular de carbonato potaacutesico Se deja agitando un maacuteximo de 24 horas a
temperatura ambiente y en el transcurso de ese tiempo se sigue el desarrollo de
la reaccioacuten por CCF Se elimina el THF en el rotavapor a presioacuten reducida y el
residuo obtenido se disuelve en diclorometano para lavarlo tres veces con agua
La fase orgaacutenica se seca con sulfato soacutedico se filtra y se elimina el disolvente en
el rotavapor El residuo obtenido se purifica por el meacutetodo descrito en cada
caso
Esta viacutea se siacutentesis se aplica a la obtencioacuten de los derivados de la Serie 0 1 2
3 14 y 15 que son los intermedios para la obtencioacuten las Series 1 y 4
VII44 Meacutetodo D procedimiento de condensacioacuten de aminas (Viacutea 2)
En un matraz se ponen las cantidades indicadas de 1-(5-fluorobenzo[b]tiofen-
3-il)etanona 2-acetonaftona 4-fluoro-1acute-acetonaftona 4-fluoroacetofenona o 4-
(trifluorometil)acetofenona y la amina deseada en proporciones
equimoleculares Se antildeade 13 dioxolano en una proporcioacuten 14 molar y se
antildeaden varias gotas HCl concentrado Se lleva a reflujo a una temperatura de
bantildeo de 130-140 ordmC siguiendo la reaccioacuten por CCF Finalizada la reaccioacuten se
enfriacutea a temperatura ambiente y se antildeade agua y NaOH 2M hasta pH baacutesico en
agitacioacuten El compuesto se extrae con diclorometano y se seca la fase orgaacutenica
con sulfato soacutedico anhidro Se filtra y elimina el disolvente en el rotavapor a
Ensayos Bioloacutegicos
88
sequedad El residuo obtenido puede precipitar puro o necesitar posterior
purificacioacuten por los meacutetodos descritos en cada caso
Esta viacutea de siacutentesis se aplica para la obtencioacuten de la mayor parte de los
compuestos de la Serie 0 intermedios para la obtencioacuten de las Series 2 35 6 7
y 8
VII45 Meacutetodo E procedimiento general para la reduccioacuten de cetonas
En un bantildeo de hielo a 0 ordmC se pone un matraz con 10 mL de metanol a
enfriar Una vez friacuteo se antildeade el compuesto carboniacutelico al matraz y se deja en
agitacioacuten Se le antildeade a la disolucioacuten enfriada aproximadamente 200 mg de
BH4Na observaacutendose efervescencia Se deja en agitacioacuten un maacuteximo de una
hora manteniendo la temperatura del bantildeo siguiendo la evolucioacuten por CCF
Transcurrido el tiempo se antildeaden 5 mL de agua que inactivan el BH4Na y se
elimina a vaciacuteo el disolvente Se extrae con DCM y la fase orgaacutenica se seca con
sulfato soacutedico anhidro Se filtra y se elimina el disolvente a vaciacuteo El residuo
puede precipitar puro o necesitar purificacioacuten por cromatografiacutea en columna
flash o mediante formacioacuten del correspondiente hidrocloruro
Se obtienen por este meacutetodo los compuestos de las Series 1 a 7
VII46 Meacutetodo F procedimiento general para siacutentesis de oximas desde
carbonilos
En un matraz se pone la cantidad de carbonilo obtenido deseada y se antildeade
el clorhidrato de hidroxilamina en proporcioacuten 1 55 molar respectivamente Por
uacuteltimo se antildeaden 15 mL de EtOH y se lleva a reflujo durante 90 minutos
Pasado el tiempo se retira el reflujo y se deja enfriar unos minutos A
continuacioacuten se antildeaden 30 mL de una disolucioacuten previamente preparada de
NaOH 2M en EtOH hasta que el pH es baacutesico y se lleva media hora maacutes a
reflujo Se deja enfriar la reaccioacuten se antildeade un poco de agua al matraz y se hace
una extraccioacuten acetato de etiloagua Se seca y se elimina el disolvente en el
rotavapor obteniendo un soacutelido impuro que se purifica solubilizando las
impurezas en diclorometano puesto que la oxima no es soluble en ese
disolvente El soacutelido que se obtiene se lava con eacuteter etiacutelico para su purificacioacuten
Se obtienen por este meacutetodo los compuestos de la Serie 8
Quiacutemica experimental
89
VII5 Purificacioacuten por cromatografiacutea flash
La cromatografiacutea manual en columna de vidrio tradicional ha sido uno de los
meacutetodos de purificacioacuten maacutes usados en quiacutemica orgaacutenica por ser un meacutetodo
praacutectico de bajo coste y controlado por el operario Por otro lado lleva asociado
algunos inconvenientes como la baja resolucioacuten y reproducibilidad teacutecnica
costosa en tiempo opciones de tipo de elucioacuten limitadas baja utilidad en
separacioacuten de muestras complejas y baja estandarizacioacuten del sistema por la falta
de automatizacioacuten La evolucioacuten para mejorar todos estos puntos deacutebiles pasa
por la automatizacioacuten del sistema que va desde la inyeccioacuten de la muestra hasta
la coleccioacuten automaacutetica que permite la realizacioacuten de otros trabajos durante la
separacioacuten de los compuestos Ademaacutes aumenta la reproducibilidad y la
productividad Seguacuten la muestra que purificar y sus caracteriacutesticas
fisicoquiacutemicas se ha de seleccionar las condiciones de trabajo del equipo de
cromatografiacutea flash
Fase estacionaria Existen disponibles comercialmente una gran variabilidad
de columnas con distintas fases estacionarias La maacutes usual que es tambieacuten la
empleada en este trabajo es la columna de siacutelica de fase normal Pero tambieacuten
se dispone de columnas C18 fase reversa columnas de aminas aluacutemina baacutesica
aluacutemina neutra ciano diol de intercambio anioacutenico y de intercambio catioacutenico
Las columnas de siacutelica de fase normal estaacuten formadas por un poliacutemero de oacutexido
de silicio entrecruzado tetraeacutedricamente En medio acuoso las valencias libres
de los aacutetomos de silicio adsorben grupos hidroxilos formando grupos silanol
polares en la superficie
Claacutesicamente para cada gramo de compuesto que va a ser purificado se pone
100 g de siacutelica gel (1 de carga) pero en el nuevo sistema las columnas estaacuten
preparadas para el 10 de carga En este trabajo se ha usado columnas de siacutelica
de 12 g de tamantildeo (tamantildeo de partiacutecula 35-70 microm y tamantildeo de poro 60 Aring con
una capacidad de muestra de 12 a 1200 mg con flujo oacuteptimo 25-40 mLmin y
volumen 168 mL
Fase moacutevil Al igual que la fase estacionaria la eleccioacuten de la fase moacutevil
depende de la muestra a purificar Existen diferentes gradientes de elucioacuten
siendo el gradiente binario el maacutes utilizado en la separacioacuten de compuestos
Controlando el gradiente se pueden obtener tiempos de elucioacuten menores
menor dependencia de los factores oacuteptimos de separacioacuten y mayor eficacia
repetitividad y pureza El gradiente elegido en este caso para la purificacioacuten de
compuestos es el isocraacutetico lineal donde se alternan periodos donde las
Ensayos Bioloacutegicos
90
proporciones de mezcla de solventes permanecen constantes en el tiempo con
otros periodos donde aumenta la proporcioacuten del solvente maacutes polar
Para la eleccioacuten del solvente adecuado se realiza un estudio previo del
desarrollo de los componentes en CCF ya que esto da una aproximacioacuten del
comportamiento de los componentes de la muestra en la columna durante la
purificacioacuten Se ha seleccionado la mezcla DCMmetanol en todos los casos de
purificacioacuten de compuestos por la buena separacioacuten de componentes que ha
mostrado No es posible la utilizacioacuten de metanol al 100 ya que se podriacutean
producir dantildeos en las columnas de fases estacionarias Ademaacutes la estabilidad
de las bombas tambieacuten podriacutea verse afectada por tanto ha de utilizarse como
fase moacutevil polar una mezcla DCMmetanol 8020
Longitud de onda de deteccioacuten La longitud de onda de deteccioacuten oacuteptima ha
de ser elegida seguacuten la estructura quiacutemica de la muestra En el caso de
arilaminoalcoholes se ha seleccionado como longitud de onda de deteccioacuten 254
nm que es la oacuteptima para aromaacuteticos En el caso de los derivados de las Series
3 4 y 5 (naftalenos) como el equipo ofrece la posibilidad de detectar dos
longitudes de onda se seleccionoacute la deteccioacuten a 365 nm como complementaria
Teacutecnicas de carga de muestra Las muestras son cargadas en el sistema en
estado soacutelido o en disolucioacuten dependiendo de la solubilidad que presenten a la
fase menos polar con la que se inicia la purificacioacuten En el caso de muestras
solubles al diclorometano se realiza una disolucioacuten con la miacutenima cantidad de
solvente posible y se inyectan en el equipo Si la muestra no es soluble al
diclorometano se realiza una disolucioacuten soacutelida en siacutelica gel 60 (0040-0063 nm
de tamantildeo de poro) Para ello se disuelve la muestra en un solvente adecuado y
se antildeade siacutelica Se elimina el disolvente a sequedad a vaciacuteo y se pone la muestra
en un cartucho vaciacuteo especial para este tipo de muestras desde donde el equipo
inyectaraacute automaacuteticamente la muestra
VVIIIIII EENNSSAAYYOOSS BBIIOOLLOacuteOacuteGGIICCOOSS
Ensayos bioloacutegicos
93
VIII1 Ensayos in vitro
Los compuestos descritos han sido ensayados por el Grupo Malaria de la
Universidad de Antioquiacutea en Medelliacuten (Colombia)
Los ensayos in vitro han sido realizaron en cepas sensibles a la CQ NF-54 y
Colombian FCR-3 de Plasmodium falciparum resistentes a la CQ Los cultivos se
desarrollaron a 37ordmC en una atmoacutesfera de CO2 al 5 y en un medio de glucosa
enriquecida RPMI 1640 con gentamicina a una concentracioacuten de 01 mgmL y
suero humano al 10 inactivado por calor como se describe en la bibliografiacutea
(Trager y Jensen 1976) Los compuestos se disuelven en dimetilsulfoacutexido
(DMSO) hasta completar un rango de concentraciones entre 200 y 01 microM La
concentracioacuten final de DMSO nunca es superior al 01
La actividad antimalaacuterica in vitro se mide utilizando el ensayo de
incorporacioacuten de hipoxantina tritiada (MP Biomedicals USA) seguacuten el meacutetodo
de Desjardins (Desjardins et alts 1979) El meacutetodo consiste en una medicioacuten
indirecta de la actividad metaboacutelica del paraacutesito por medio de la incorporacioacuten
de un precursor de aacutecidos nucleicos marcado radiactivamente El Plasmodium es
incapaz de sintetizar las purinas que necesita para su replicacioacuten obtenieacutendolas
de una fuente externa La utilizacioacuten del precursor de purinas marcadas
permitiraacute determinar la incorporacioacuten del material geneacutetico del paraacutesito y por
tanto se comportaraacute como marcador de la regeneracioacuten del mismo
Los ensayos se realizan por triplicado y los resultados se obtienen por
interpolacioacuten lineal (Huber y Koella 1993) Finalmente se expresan como CI50
(concentracioacuten que produce una inhibicioacuten del 50 del crecimiento plusmn la
desviacioacuten estaacutendar) siendo
Log (IC50) = log (X1) + (50-Y1)(Y2-Y1) [log (X2) ndash log (X1)]
Siendo X1 Concentracioacuten del compuesto que da un de inhibicioacuten de la
parasitemia Y1gt50 X2 Concentracioacuten de compuesto que da un de
inhibicioacuten de la parasitemia Y2lt50
El porcentaje de incorporacioacuten de hipoxantina unida al paraacutesito se calcula con la siguiente ecuacioacuten
hipoxantina incorporada = 100 ndash (PTx100)
Siendo P cuentas por minuto (cpm) para cada concentracioacuten T control
negativo (eritrocitos sin tratar)
Ensayos bioloacutegicos
94
VIII2 Ensayos toxicoloacutegicos
Los ensayos de citotoxicidad de los compuestos se realizaron en dos etapas
Inicialmente se llevaron a cabo en la Universidad Cayetano Heredia (UPCH) en
Lima Peruacute y posteriormente en la Universidad Paul Sabatier (Toulouse III) en
Toulouse Francia
La toxicidad de todos los compuestos se evaluaron en ceacutelulas epiteliales de
rintildeoacuten de mono African (Vero) Estas ceacutelulas fueron cultivadas con medio
DMEN F-12 (Cat Nordm BE12-719F) suplementado con 10 de suero fetal bovino
inactivado por calor NEAA piruvato de Na y mantenidas en una incubadora a
37 ordmC con una atmoacutesfera de 5 de CO2 La evaluacioacuten toxicoloacutegica se realiza en
placas de 96 pocillos de fondo plano adicionando 100 microL de cultivo de ceacutelulas
Vero a cada pocillo a una concentracioacuten de 10x105 ceacutelulaspocillo Los
compuestos se antildeadieron a diferentes concentraciones 100 microgmL 10 microgmL 1
microgmL y 01 microgmL y el efecto se evaluacutea 48 horas despueacutes de haber adicionado
el compuesto
El efecto se determinoacute usando el ensayo de viabilidad celular del MTT que
consiste en adicionar 10 microL de MTT a una concentracioacuten de 10 microgmL en las
placas que son colocadas nuevamente en la incubadora cubiertas con papel
aluminio durante el periodo de incubacioacuten Cuatro horas despueacutes de finalizado
el periodo de incubacioacuten se antildeade 100 microL de una solucioacuten de lisis que contiene
50 de isopropanol 10 de SDS y se deja reposar las placas a temperatura
ambiente en un orbital a 150 rpm durante 30 minutos
Finalmente se lee la densidad oacuteptica con un escaacutener de 96 pocillos a 590 nm
en un equipo Bio-Rad Todos los experimentos se realizan por triplicado
El dato de inhibicioacuten de crecimiento GI50 se determina por anaacutelisis de
regresioacuten linear definido como la concentracioacuten de compuesto que produce el
50 de reduccioacuten de absorbancia comparaacutendola con los controles
VIII3 Ensayos in vivo
Los procedimientos se desarrollaron siguiendo el manual de Teacutecnicas de
laboratorio para la seleccioacuten de sustancias antimalaacutericas (Deharo et alts 2000)
en el Laboratorio de Farmacologiacutea para el Desarrollo perteneciente al Instituto
para el Desarrollo (IRD) de la Universidad Paul Sabatier (Toulouse III) de
Toulouse (Francia)
Ensayos bioloacutegicos
95
VIII31 Instrumental y reactivos
Los estudios in vivo se llevaron a cabo seguacuten la legislacioacuten francesa sobre
cuidado y uso de animales de laboratorio vigente (Ndeg 008430) Se utilizaron
ratones macho IOPF Swiss de 4-6 semanas de vida con un peso de 20 2 g con
certificado negativo para Encephalitozoom cuniculi (Janvier Saint Berthevin
Francia) El animalario-bioterio de la Facultad de Farmacia de la Universidad
Paul Sabatier se encargoacute del cuidado de animales mantenimiento condiciones
ambientales de las instalaciones y eliminacioacuten del material bioloacutegico
Las cepas usadas tanto para los ensayos de virulencia como para los estudios
provienen de la reserva de material bioloacutegico del IRD De ahiacute se descongelaron
una cepa Plasmodium berghei NK65 y otra Plasmodium petteri que se encontraban
bien identificadas dentro de tanques de nitroacutegeno liacutequido en caacutemaras
refrigeradas del IRD
Los materiales empleados en el manejo animal fueron agujas Neolus de 05
mm y jeringas de 1 mL U100 Insulin de Tarumo Europe NV (Beacutelgica) Ademaacutes
se usoacute heparina Sigma H6263 (Alemania) suero fisioloacutegico esteacuteril Baxter
(Francia) y viales de plaacutestico con tapoacuten no esteacuteriles Para los frotis se usaron
laacuteminas portaobjetos de vidrio (Tarumo Europe NV Belgica) y metanol de
calidad HPLC Fisher Chemicals (Leicestershine Reino Unido) Para la
coloracioacuten se usoacute el reactivo Giemsa en polvo con glicerol de Sigma Ultra
(Steinheim Alemania) disolucioacuten tampoacuten de fosfato soacutedico dibaacutesico
heptahidratado y fosfato potaacutesico monobaacutesico anhidro de Sigma Aldrich
(Steinheim Alemania) en agua miliQ
Para la lectura de los frotis y conteo de hematiacutees se ha usado un microscopio
Leica DME (USA)
VIII32 Metodologiacutea
VIII321 Preparacioacuten de disolucioacuten Giemsa
La Giemsa es un colorante neutro compuesto de un colorante aacutecido (azul de
eosinato) y otro baacutesico (azul de metileno) que precipita con agua Lo que se
obtiene es un colorante neutro que no es soluble al agua pero si al alcohol
metiacutelico De forma inversa no es activo en solucioacuten metiacutelica pero siacute en
disolucioacuten acuosa Las ceacutelulas protozoarias disocian el colorante neutro el ADN
se tintildee de rojo y el citoplasma de azul Por las caracteriacutesticas comentadas ha de
Ensayos bioloacutegicos
96
ser utilizado con un tampoacuten para evitar que el pH de los medios de trabajo lo
precipite o inactive y con agua destilada calidad miliQ
Se pesan 076 g de polvo de Giemsa en un erlenmeyer y se pone suavemente
en agitacioacuten con 50 mL de glicerina y se deja hasta completa disolucioacuten a 60 ordmC
Una vez disuelto se deja enfriar y se le antildeaden 50 mL de metanol dejando la
disolucioacuten en agitacioacuten 12 horas Transcurrido el tiempo se deja reposar
protegido de la luz 7 diacuteas para finalizar con una filtracioacuten eliminando asiacute los
restos no disueltos Mientras se prepara una disolucioacuten tampoacuten fosfato con 02 g
de fosfato potaacutesico monobaacutesico anhidro y 05 g de fosfato soacutedico dibaacutesico
heptahidratado en un litro de agua MiliQ ajustaacutendose el pH a 74
Estas dos disoluciones no se mezclaraacuten hasta el momento de ser utilizadas
manteniendo la de Giemsa protegida de la luz Para su utilizacioacuten en un tubo
coacutenico de 50 mL se colocan 45 mL de la disolucioacuten tampoacuten de tampoacuten fosfato
y 5 mL de Giemsa y se homogenizan cuidadosamente dos veces por inversioacuten
Se cubre la muestra con el preparado y lo sobrante se desecha
Las disoluciones preparadas de Giemsa tienen un tiempo de vida corto ya
que con el paso del tiempo van precipitando y formaacutendose cristales que dantildean
la tincioacuten Debido a esto se recomienda preparar perioacutedicamente un nuevo
stock de colorante y nunca mezclar dos tipos diferentes puesto que cada
preparado tiene caracteriacutesticas propias que afectan el resultado en la coloracioacuten
VIII322 Tincioacuten con Panoacuteptico Raacutepido
Esta es una teacutecnica de tincioacuten por inmersioacuten a diferencia de la tincioacuten por
Giemsa que es por cobertura La ventaja es que es maacutes raacutepida y faacutecil de trabajar
cuando no se cuenta con un gran nuacutemero de laacuteminas para colorear El meacutetodo
consiste en la inmersioacuten sucesiva de la laacutemina que tentildeir en tres colorantes
consecutivamente En una primera cubeta Wertheim se pone una solucioacuten
alcohoacutelica de triarilmetano en la segunda cubeta se pone una solucioacuten
tamponada de xanteno y en la tercera una tamponada de tiazina
Las laacuteminas con las muestras fijadas se sumergen verticalmente y en el mismo
sentido que se ha extendido la muestra en la primera cubeta realizando
movimientos regulares verticales durante unos segundos Se sacan de la cubeta
y se espera que escurran el colorante sobrante Este procedimiento se repite en
las tres cubetas teniendo especial cuidado en la uacuteltima donde se debe asegurar
la homogeneidad de la tincioacuten sin exceso de coloracioacuten Finalmente se lava con
agua se dejan secar al aire para ser analizadas al microscopio
Ensayos bioloacutegicos
97
VIII323 Realizacioacuten de un frotis
Se denomina frotis a la extensioacuten de una muestra o cultivo que se realiza
sobre un portaobjetos con objeto de separar lo maacutes posible los microorganismos
o componentes sanguiacuteneos y para obtener de ellos una imagen clara y niacutetida al
microscopio
La muestra ha de ser fijada al vidrio del portaobjetos sin que la muestra sea
arrastrada en los lavados para poder aplicar despueacutes sobre eacutel meacutetodos de
tincioacuten que permiten la observacioacuten al microscopio de las ceacutelulas En la
actualidad los portaobjetos utilizados se comercializan limpios y esterilizados
para su uso inmediato
En primer lugar se toma un portaobjetos nuevo y se rotula adecuadamente
Con unas tijeras esterilizadas se hace un pequentildeo corte en la punta de la cola
del ratoacuten y se presiona para conseguir una gota de sangre que es recogida en el
centro de un extremo del portaobjetos Raacutepidamente con el filo de otro
portaobjetos se extiende la gota arrastraacutendola suavemente por la superficie del
primer portaobjetos para conseguir una peliacutecula lo maacutes homogeacutenea posible
tratando de cubrir toda la superficie de la laacutemina Posteriormente se pone el
portaobjetos horizontal y se cubre con metanol se deja secar con cuidado al aire
y se guarda la muestra hasta la tincioacuten el tiempo que sea necesario
Asiacute tentildeida la muestra se puede proceder a su lectura para calcular el
porcentaje de parasitemia ( parasitemia paraacutemetro que indica el nivel de
infeccioacuten de la sangre de un ratoacuten) mediante el conteo manual de los hematiacutees
sanos y los parasitados Se hace un conteo de veinte campos elegidos de forma
que los hematiacutees no se solapen y aproximadamente contengan la misma
cantidad de unidades El tanto por ciento de parasitemia se calcula aplicando la
siguiente foacutermula
Siendo H infectados hematiacutees infectados H sanos hematiacutees sanos
Ensayos bioloacutegicos
98
iquestQueacute se puede ver en un frotis al microscopio
En un frotis de ratoacuten sano se pueden ver
Trozos de cristales de colorante si el vidrio no ha sido lavado lo
suficiente
Hematiacutees o gloacutebulos rojos o eritrocitos
Leucocitos o gloacutebulos blancos Estos se colorean con la tincioacuten
porque tiene carga geneacutetica y los hematiacutees no En ocasiones puede
confundirse un hematiacutee joven y un leucocito porque los hematiacutees
joacutevenes conservan restos de nuacutecleo pero se diferencian en nuacutemero
y tamantildeo Los leucocitos son menos numerosos y de mayor
tamantildeo ademaacutes en la tincioacuten quedan anteriormente tentildeidos de
morado con una aureola azul
En un ratoacuten infectado se puede observar
Hematiacutees sanos
Hematiacutee joven
Esquizonte joven que puede confundirse con un hematiacutee joven
Esquizonte desarrollado
Esquizonte agotado Es el momento previo a la ruptura del
espacio y la liberacioacuten de trofozoiacutetos libres que continuaran con la
infeccioacuten
Trofozoiacutetos libres que pueden confundirse con plaquetas
Hematiacutees en invasioacuten
Figura 49 Vista al microscopio de un frotis de sangre infectada por Plasmodium32
32 Disponible en httpwwwelrincondelamedicinainternacom2011_05_16_archivehtml
Ensayos bioloacutegicos
99
VIII324 Preparacioacuten y lectura en la caacutemara Malassez
La caacutemara se usa para hacer el conteo de hematiacutees totales Se cubre la
cuadriacutecula de la caacutemara con la muestra de sangre heparinizada con la ayuda de
una micropipeta y por capilaridad se llena la cuadriacutecula de conteo Como la
disolucioacuten tiene caraacutecter tridimensional y en el microscopio las lecturas son
bidimensionales se pone la ceacutelula en una caacutemara huacutemeda durante diez minutos
para que la muestra sedimente y no se deshidrate durante el proceso Pasado el
tiempo se pone la caacutemara de Malassez al microscopio y con cuarenta aumentos
y se hace el recuento manual de hematiacutees por mm3 de sangre Con el valor
promedio y teniendo en cuenta la dilucioacuten y el volumen de la caacutemara es posible
calcular la densidad de gloacutebulos rojos (GR) en la sangre de un ratoacuten sano
mediante la siguiente ecuacioacuten
GRmm3= GR promedio x dilucioacuten muestra x volumen celda
Siendo GR promedio promedio de hematiacutees dilucioacuten muestra valor fijo de
200 (10 microL en 2 mL) volumen volumen de la celda valor fijo 100 mm3
EL valor medio de hematiacutees de un ratoacuten sano es 5 millones de hematiacutees por
mm3
Una caracteriacutestica de la enfermedad es la anemia asiacute un ratoacuten infectado que
ha desarrollado la enfermedad presenta una disminucioacuten aproximada de un 75
en el nuacutemero de hematiacutees con respecto al ratoacuten sano por conteo en caacutemara
Malassez
VIII325 Ensayos de virulencia
Para este estudio es necesario tener al paraacutesito y al hueacutesped En este caso se
utilizaraacuten dos especies diferentes de paraacutesito que producen la enfermedad de la
malaria como son Plasmodium berghei NK65 y Plasmodium vinckei petteri
provenientes de la reserva del IRD Estas dos especies son capaces de infectar
roedores por lo que el hueacutesped seraacute un grupo de veinte ratones machos IOPF
Swiss
Descongelacioacuten de cepas y activacioacuten de paraacutesitos
Cuando se descongela una cepa no tiene mucha capacidad de infeccioacuten
(virulencia) sino que esta va en aumento con el paso de los diacuteas Por otro lado
es probable que los ratones inoculados no lleguen a desarrollar la enfermedad
porque la muestra haya sido mal conservada o se haya degradado demasiado
Ensayos bioloacutegicos
100
en el friacuteo que es lo que ocurrioacute experimentalmente con la cepa de P vinckei
petteri En este caso se esperan 10 diacuteas despueacutes de la inoculacioacuten y se
monitoriza al ratoacuten para observar si hay progresioacuten de la infeccioacuten de no ser
asiacute debe realizarse una revisioacuten de los tanques de almacenamiento para
descartar las muestras anteriores a la fecha de congelacioacuten de la muestras que
presentaron problemas ya que pueden estar en igual o en peores condiciones
El estudio comienza con la descongelacioacuten de una cepa de Plasmodium berghei
NK65 a temperatura ambiente mientras se extraen 10-20 microL (45 gotas) de sangre
de cola de ratoacuten sano Este volumen se mezcla inmediatamente con una gota de
heparina con el fin de evitar la coagulacioacuten de la sangre extraiacuteda La sangre
heparinizada se diluye 1200 en un vial esteacuteril con tapoacuten con 4 mL de suero
fisioloacutegico para devolver las ceacutelulas sanguiacuteneas a un medio parecido al normal
y que no se produzcan procesos de oacutesmosis que destruyan la muestra Cerrar el
vial y guardar la muestra
Cuando este descongelado el vial con la cepa se toma con una jeringa el
volumen contenido en el vial y se divide en dos para ser inyectado viacutea
intraperitoneal en dos ratones separados previamente del grupo Estos ratones
se separan del grupo en una celda identificada con la fecha de infeccioacuten la cepa
y la especie que contiene para observar la progresioacuten de la infeccioacuten La sangre
heparinizada se usa para un primer conteo del nuacutemero de hematiacutees en
ejemplares sanos cuyo recuento se realiza con cuadriacutecula doble en la ceacutelula o
caacutemara de Malassez A los tres diacuteas de la inoculacioacuten se hace un control del
estado de los dos ratones infectados tanto visual como sanguiacuteneo Los siacutentomas
externos de la enfermedad son peacuterdida de coloracioacuten en los ojos y orejas pelo
erizado ademaacutes de peacuterdida de peso y aglomeracioacuten entre ellos por causa de la
fiebre Tambieacuten se realiza un frotis para calcular la parasitemia
Cuando los ratones infectados desarrollen la enfermedad se infecta con su
sangre a otros dos ratones sanos de forma que ademaacutes de conocer coacutemo se
desarrolla el paraacutesito se garantice que tendraacuten la fuerza suficiente para
comenzar los ensayos de actividad De esta forma no es necesario conocer la
parasitemia basta con saber que la cepa estaacute viva Asiacute se realiza un frotis
control positivo con sangre de la cola del ratoacuten y del mismo sitio se obtendraacuten
20 microL de sangre que se hepariniza y disuelve en 1 mL de suero Se puede
conocer el buen estado de esta disolucioacuten visualmente si se observa un color
rojo muy claro ya que indica que no se ha producido hemoacutelisis Este nuevo
grupo de ratones infectados son los ratones fuente
Ensayos bioloacutegicos
101
El volumen de la disolucioacuten anterior se pone en una jeringa para ser
inyectado en dos ratones sanos que tambieacuten se aiacuteslan para controlar coacutemo
evoluciona la infeccioacuten
Diariamente se realiza un frotis control a los diferentes grupos de ratones
infectados para registrar la evolucioacuten de la parasitemia ya que algunos
evolucionaraacuten muy raacutepido y moriraacuten mientras que otros no mostraraacuten la
enfermedad
Ensayos de virulencia
El quinto diacutea desde la inoculacioacuten del paraacutesito vivo en los ratones fuente se
procede a calcular la parasitemia En este momento se infecta a un nuevo grupo
de 5 ratones En esta ocasioacuten la infeccioacuten seraacute controlada y se procederaacute a una
infeccioacuten con un nuacutemero de paraacutesitos determinado Para estos ensayos
normalmente se inoculan 107 paraacutesitos por ratoacuten por tal motivo es necesario
conocer previamente el nuacutemero de paraacutesitos en la sangre del ratoacuten fuente
sabiendo esto se puede calcular la cantidad de paraacutesitos necesarios para
inocular a todos los grupos de ratones experimentales seguacuten la siguiente
ecuacioacuten
Para preparar las cantidades necesarias de sangre infectada heparina y suero
fisioloacutegico necesarias para desarrollar el ensayo de virulencia se deben tener en
cuenta los cinco ratones disponibles a los que se antildeade un sexto ratoacuten hipoteacutetico
con el que se tienen en cuenta las peacuterdidas de disoluciones durante los
procedimientos experimentales Seraacuten necesarios 10 microL de sangre del ratoacuten
fuente para inyectar a cada ratoacuten del ensayo El procedimiento de extraccioacuten de
sangre e infeccioacuten del grupo es el mismo
Durante todo este proceso es preciso llevar un seguimiento diario de la
parasitemia para observar el grado de virulencia del paraacutesito Los resultados
del comportamiento del paraacutesito son aproximados debido al aumento de la
parasitemia en los sucesivos ensayos
Por queacute un seguimiento previo del desarrollo de la infeccioacuten
El desarrollo de los paraacutesitos en individuos infectados no se produce siempre
de igual forma por lo que si se parte de cepas congeladas es necesaria una
primera activacioacuten del paraacutesito (primera infeccioacuten) y una posterior reactivacioacuten
del paraacutesito (infecciones sucesivas) a partir de la primera infeccioacuten
Ensayos bioloacutegicos
102
Las diferencias de desarrollo se deben a tres factores principalmente
1- Viacutea intraperitoneal Es una viacutea menos precisa que la viacutea intravenosa
porque no hay una localizacioacuten exacta de la inyeccioacuten de la sangre
infectada Todos los ratones tienen la misma capacidad de respuesta pero
no se puede controlar la respuesta del ratoacuten por esta viacutea de inoculacioacuten
Por viacutea intravenosa se asegurariacutea su introduccioacuten en el hiacutegado pero por
las por las caracteriacutesticas aproximativas de los ensayos y queda
descartada
2- Raza Swiss Este tipo de ratoacuten no es monoclonal por tanto todos los
individuos son diferentes entre siacute De ahiacute se deduce que la respuesta seraacute
distinta en cada uno de ellos El objetivo de los ensayos realizados es
encontrar un nuevo compuesto que revierta cualquier tipo de
parasitemia como hace la CQ de manera que la variabilidad del sistema
no sea influyente
3- Enzephalitozoom Cuniculli Es un paraacutesito de roedor que puede interferir
cruzadamente con el Plasmodium lo que hace que los ensayos no sean
fiables En la actualidad este factor no se tiene en cuenta ya que todos los
lotes de ratones adquiridos traen consigo el certificado de anaacutelisis de la
empresa que los suministra
Una vez conocido coacutemo se desarrolla el paraacutesito de la cepa elegida se
comienza con la infeccioacuten de otro grupo de ratones Esta infeccioacuten se realiza con
el objetivo de tener ratones fuente disponibles el diacutea que se ha de comenzar el
ensayo Del mismo modo la sangre de los ratones infectados es usada para la
congelacioacuten de nuevas cepas
VIII326 Ensayos de actividad Test de Peters
El test claacutesico de supresioacuten de 4 diacuteas (Peters y Robinson 1999) da comienzo
una vez que se conoce coacutemo se va a desarrollar previsiblemente la cepa elegida
En este ensayo dicha cepa es Plasmodium berghei NK65 inoculada en 100 ratones
macho tipo Swiss con un peso de 20 2 g Se distribuyen en 10 grupos de 10
individuos identificados de la siguiente manera
-Grupo Negativo 10 ratones que seraacuten tratados con el medio de dilucioacuten de
los compuestos que ensayar En esta ocasioacuten el medio de dilucioacuten es DMSO
utilizado a una dosis maacutexima de 100 microL por ratoacuten y diacutea
Ensayos bioloacutegicos
103
-Grupo Positivo 10 ratones que seraacuten tratados con 40 microg de CQ en 100 microL
DMSO (2 mg por kg)
-Grupos de A1 al A4 Cuatro grupos de 10 ratones que seraacuten tratados con uno
de los compuestos que ensayar a dosis de 40 20 10 y 5 mgkg respectivamente
-Grupos del B1 al B4 Cuatro grupos de 10 ratones que seraacuten tratados con el
otro compuesto que ensayar a dosis 40 20 10 y 5 mgkg respectivamente
El ensayo parte de la determinacioacuten de la parasitemia y de un conteo de
hematiacutees por ceacutelula Malassez de ratones fuente para conocer queacute cantidad de
sangre se necesita para realizar una infeccioacuten controlada y simultaacutenea de los
cien ratones con ceacutelulas parasitadas con 107 ceacutelulas parasitadasratoacuten en una
solucioacuten salina al 09 por viacutea intraperitoneal
La extraccioacuten se realiza por puncioacuten seno retro-orbital ya que el volumen de
sangre que se necesita es superior al que se puede obtener por puncioacuten de la
vena de la cola La muestra se trata de la misma forma que lo explicado
anteriormente y se procede a la infeccioacuten de la totalidad de los individuos
Trascurridas dos horas se comienza con la administracioacuten del tratamiento
especiacutefico de cada grupo en lo que se denomina Diacutea 0 En dicho momento se
realiza la administracioacuten del tratamiento todos los diacuteas siguientes a la misma
hora y con el mismo procedimiento El tratamiento se aplica viacutea subcutaacutenea en
la parte interna de las patas traseras Con esto evitamos que se produzca
toxicidad o necropsia de alguacuten oacutergano del peritoneo Tambieacuten se alterna la pata
donde se inyecta el tratamiento para asegurarse de que no se produzca una
necrosis por toxicidad debida a la acumulacioacuten del producto por una mala
difusioacuten Si un producto no es toacutexico podriacutea acumularse pero no necrosar y
esto tambieacuten podriacutea observarse como un bulto debajo de la piel
Durante el transcurso del test se ha de llevar a cabo un seguimiento visual de
la posible respuesta externa de los ratones a la administracioacuten de los
compuestos anotando cambios en el comportamiento de los ratones
irritaciones deacutermicas en diferentes zonas prestando especial atencioacuten a la zona
donde se produce la inyeccioacuten del tratamiento falta de movilidad y cambios
morfoloacutegicos como disminucioacuten de la temperatura peacuterdida de peso o pelo
cambios en la pigmentacioacuten de la piel
Pasados cinco diacuteas o Diacutea 4 se realiza un frotis a todos los ratones
supervivientes para calcular la parasitemia en sangre perifeacuterica Se comprueba
la inhibicioacuten de la parasitemia para calcular la dosis letal (DL50) determinada
Ensayos bioloacutegicos
104
por anaacutelisis de regresioacuten lineal de miacutenimos cuadrados Una vez pasado el
tiempo del Test de Peters los ratones supervivientes seguiraacuten siendo
observados en los siguientes diacuteas lo que se denomina Test Rane Esto sirve para
la determinacioacuten de la actividad esquizonticida en vivo comparando de la
mortalidad de los ratones del grupo negativo con el resto de grupos
Durante la realizacioacuten de los ensayos los ratones que mueren son desechados
seguacuten los protocolos normalizados del animalario (bioterio) en el que se
realizan todos los procedimientos experimentales
IIXX EESSTTUUDDIIOOSS CCOOMMPPUUTTAACCIIOONNAALLEESS
Estudios Computacionales
107
IX1 Propiedades fisicoquiacutemicas de los compuestos
Para los caacutelculos de las propiedades fisicoquiacutemicas de los compuestos se
utilizoacute el Laboratorio de Quiacutemica Computacional Virtual33 (Tetko et alts 2005)
y la herramienta de caacutelculo de propiedades online Molinspiration34 (Ertl et alts
2000)
Los datos obtenidos fueron utilizados para establecer una aproximacioacuten
teoacuterica del comportamiento de los compuestos en tratamientos orales Los
estudios se centraron en la obtencioacuten de las caracteriacutesticas de absorcioacuten de cada
compuesto que depende de otros factores como liposolubilidad fuerzas polares
moleculares y caracteriacutesticas propias de la estructura molecular
El coeficiente de particioacuten octanolagua estaacute asociado a la solubilidad y se
calculoacute desde MLog P miLogP AlogP KOWLogP y ABlogP Las
caracteriacutesticas estructurales de la moleacutecula como tamantildeo y posibilidad de giro
de enlaces tambieacuten influyen en la absorcioacuten Las caracteriacutesticas polares son
importantes para la absorcioacuten porque intervienen en la lipofilia de los
compuestos asiacute se desprende del estudio de los enlaces aceptores y receptores
de enlaces polares y del TPSA Se puede obtener asiacute una aproximacioacuten al
porcentaje de absorcioacuten (Zhao et alts 2002) de los compuestos en la membranas
celulares
Los compuestos que a su vez cumplen las Reglas de Lipinski (Lipinski et alts
1997) son buenos candidatos para ofrecer buenas cualidades en la
administracioacuten oral
IX2 Optimizacioacuten geomeacutetrica
Los estudios computacionales de Modelizacioacuten y Docking35 se llevaron a
cabo para compuestos liacutederes en los Laboratorios de Investigacioacuten y Desarrollo
de la Facultad de Ciencias y Filosofiacutea de la Universidad Peruana Cayetano
Heredia (UPCH) Lima (Peruacute)
33 httpwwwvcclaborg 34 httpwwwmolinspirationcomservicespropertieshtml 35 Docking (del ingleacutes anclarse) En el campo del Modelado molecular este es un meacutetodo que predice la conformacioacuten preferida de un moleacutecula al estar unida a otra con el fin de formar un complejo estable1 El conocimiento de la orientacioacuten preferida a su vez puede ser usada para predecir la fuerza de la asociacioacuten o la afinidad de enlace entre dos moleacuteculas usando por ejemplo las funciones de puntuacioacuten (o funciones de scoring)
Estudios Computacionales
108
El compuesto maacutes activo se sometioacute a estudios de modelizacioacuten para
optimizar la geometriacutea y determinar los potenciales electrostaacuteticos de la
moleacutecula Para esto se usoacute el caacutelculo mecaacutenico Quantum en concreto el
programa Gaussian36 de quiacutemica cuaacutentica y el set baacutesico HF3-21G El Potencial
molecular electrostaacutetico (MEP) fue computerizado por la densidad electroacutenica
y fue calculado a partir de datos del software Molekel37 (Fluumlckigel et alts 2008)
IX3 Estudios de Acoplamiento Molecular (Docking)
El programa ICM38 de modelizacioacuten se usoacute para determinar el potencial
modo de unioacuten entre los compuestos maacutes activos y la enzima diana
previamente estudiada en estudios anteriores la plasmepsina II del Plasmodium
Ensayos anteriores mostraban la cristalizacioacuten de la enzima plasmepsina II con
un compuesto denominado EH58 (N-(3-[(2-benzo[13]dioxol-5-yl-ethyl)[3-(1-
methyl-3-oxo-13-dihydro-isoindol-2-yl)-propionyl]-amino]-1-benzyl-2-
(hydroxypropyl)-4-benzyloxy-35-dimethoxy-benzamide Figura 50) (Asojo et
alts 2003)
Figura 50 Imagen de la interaccioacuten del compuesto EH-58 y la plasmepsina II39
Seguacuten datos publicados posteriormente se demostroacute que la enzima presenta
un hueco activo donde pueden introducirse diferentes moleacuteculas y establecer
interacciones que inhiben su actividad En el caso de los derivados estudiados
se planteoacute la posible unioacuten de estos al resto polar del aminoaacutecido aspartato
(ASP) de las posiciones 214 y 34 de sitio activo de la enzima (Bjelic et alts
36 Gaussian Inc Pittsburg PA 2003 37 httpwwwcscschmolekel 38 versioacuten3 4-8 La Jolla CA Molsoft LLC 2006 39 Disponible en Asojo et alts 2003
Estudios Computacionales
109
2007) En primer lugar para validar la metodologiacutea y comprobar la capacidad
del programa ICM para estudiar los modos de enlace de los inhibidores en el
sitio de unioacuten de la enzima el complejo EH50-plasmepsina II40 fue reacoplado
mediante caacutelculos computacionales De acuerdo con la bibliografiacutea (Cunico et
alts 2009a b y Mendoza et alts 2011) en los estudios de acoplamiento se
considera como vaacutelidos los valores de desviacioacuten de la media cuadraacutetica
(RMSD) entre 30 a 40 Aring
Las estructuras se prepararon siguiendo la metodologiacutea ICM (Abagyan et
alts 1994) y se dibujaron con el editor molecular del software41 Asiacute las
estructuras de los compuestos y la proteiacutena fueron convertidas a objetos ICM
Durante este proceso de conversioacuten de la proteiacutena se antildeadieron hidroacutegenos
para proceder despueacutes con una optimizacioacuten geomeacutetrica Ademaacutes las
representaciones en dos dimensiones fueron convertidas a tres dimensiones
asignando cargas parciales y asignando enlaces rotatorios
De acuerdo con estudios previos (Mendoza et al 2011 y Cunico et al 2009b)
los aminoaacutecidos que conforman el sitio activo son la ASP 34 y la ASP 214
El programa buscador de cavidades del sistema ICM42 se usoacute para identificar
el sitio activo con un valor de tolerancia de 46 Aring La posicioacuten y orientacioacuten
inicial del ligando y el tamantildeo y posicioacuten del hueco fueron escogidos de
acuerdo con los valores sugeridos por el sistema
Los modos de unioacuten calculados con al menos un enlace por puentes de
hidroacutegeno con alguno de los aspartatos que conforman el sitio cataliacutetico se
consideraron como los maacutes representativos y tomados en cuenta para su
anaacutelisis (Kasam et alts 2007 y Aringqvist et alts 1994) El acoplamiento planteado
para cada ligando fue analizado estudiaacutendose su energiacutea total relativa La
conformacioacuten maacutes favorable energeacuteticamente se seleccionoacute como mejor
posicioacuten espacial
40 Protein Data Bank PDB code 1LF3 wwwrcsborg 41 Molecular Editor versioacuten 25 La jolla CA Molsoft LLC 2006 42 ICM Pocket Finder An et alts 2005
RESULTADOS Y
DISCUSIOacuteN
XX DDEESSCCRRIIPPCCIIOacuteOacuteNN DDEE CCOOMMPPUUEESSTTOOSS
Descripcioacuten de Compuestos
115
X1 Siacutentesis de precursores
(Benzo[b]tiofen-3-il)-3-cloropropan-1-ona
Procedimiento experimental
Sobre 205 g de AlCl3 (015 mmol) disueltos en 150 mL de diclorometano seco y
en atmoacutesfera de N2 se antildeade gota a gota una disolucioacuten de 1878 g de
benzo[b]tiofeno (140 mmol) y 159 mL de cloruro de 3-cloropropionilo (140
mmol) disueltos en 50 mL de diclorometano seco A continuacioacuten se antildeaden
tambieacuten gota a gota 95 mL de aacutecido sulfuacuterico en 150 mL de agua Se realiza
extracciones con diclorometano La fase orgaacutenica se seca con trazas de sulfato
soacutedico anhidro y se elimina el disolvente a presioacuten reducida Se obtiene un
aceite que se purifica por cromatografiacutea en columna empleando una mezcla de
hexanoacetato de etilo como fase moacutevil en gradiente hasta (955) El producto
se precipita con hexano friacuteo
Punto de fusioacuten 55-57ordmC
IR (cm-1) 1655 (mf CO)
RMN-1H (CDCl3 400 MHz) δ (ppm) 343 (m 2H CH2-CO) 386 (c 2H CH2-
Cl) 732-748 (m 2H H5 + H6) 780 (d 1H H4 J45= 76 Hz) 824 (s 1H H2 ) 847
(d 1H H7 J76= 73 Hz)
Anaacutelisis elemental (CHN)
Calculado Hallado
C 5879 5845
H 400 396
N 000 000
FM C11H9 ClOS PM 2245 APARIENCIA Soacutelido blanco RENDIMIENTO 86
Descripcioacuten de Compuestos
116
Tert-butil 4-(4-nitro-2-trifluorometilfenil)piperazin-1-carboxilato
Procedimiento experimental
Seguacuten el meacutetodo A a partir de 2 g de 2-fluacuteor-5-nitro-1-(trifluorometil)benceno
(956 mmol) y 25 g de tert-butil piperacin-1-carboxilato (1342 mmol) se obtiene
un residuo que se lava con hexano y se usa en la reaccioacuten siguiente sin maacutes
purificaciones
Punto de fusioacuten 136ndash138 ordmC
IR (cm-1) 2982-2751 (m C-H alifaacuteticos) 1685 (mf CO) 1530 y 1350 (m NO2)
1280 y 1155 (mf CF3)
RMN-1H (CDCl3 400 MHz) δ (ppm) 150 (s 9H C(CH3)3) 308 (dd 4H H3+H5
PIPZ) 362 (dd 4H H2+H6 PIPZ) 732 (d 1H H6 FENIL J65= 90 Hz) 837 (dd
1H H5 FENIL J56= 90 Hz J53= 28 Hz) 855 (d 1H H3 FENIL J35= 27 Hz)
(4-nitro-2-trifluorometilfenil)piperazina
Procedimiento experimental
Seguacuten el meacutetodo B usando amina protegida se obtiene un aceite que precipita
con hexano en friacuteo obtenieacutendose un polvo amarillo intenso
Punto de fusioacuten 97-99ordmC
IR (cm-1) 3380 (f NH) 2982-2751 (m C-H alifaacuteticos) 1685 (mf CO) 1530 y 1350
(m NO2) 1280 y 1155 (mf CF3)
RMN-1H (CDCl3 400 MHz) δ (ppm) 212 (s 1H NH) 306-308 (m 4H H2+H6
PIPZ) 313-315 (m 4H H3+H5 PIPZ) 730 (d 1H H6 FENIL J65= 90 Hz) 835
(dd 1H H5 FENIL J56= 90 Hz J53= 26 Hz) 853 (d 1H H3 FENIL J35= 26 Hz)
FM C16H20N3F3O4
PM 3751 Apariencia Soacutelido amarillo Rendimiento 75
FM C11H12N3F3O2
PM 2751 Apariencia Soacutelido amarillo Rendimiento 75
Descripcioacuten de Compuestos
117
Tert-butil 4-(4-nitro-2-trifluorometilfenil)-14-diazepan-1-carboxilato
Procedimiento experimental
Seguacuten el meacutetodo A a partir de 2 g de tert-butil 14-diazepan-1-carboxilato (999
mmol) y 108 g de 1-fluacuteor-2-nitro-4-(trifluorometil)benceno (516 mmol) se
obtiene un residuo que se lava con eacuteter etiacutelico y se usa en la reaccioacuten siguiente
sin maacutes purificacioacuten
Punto de fusioacuten 197ndash198 ordmC
IR (cm-1) 2982-2751 (m C-H alifaacuteticos) 1694 (mf CO) 1524 y 1346 (m NO2)
1283 y 1154 (mf CF3)
RMN-1H (DMSO-d6 400 MHz) δ (ppm) 208-211 (q 2H H6 DZP) 324 (sa
2H H2 DZP) 330 (sa 2H H7 DZP) 344 (t 2H H5 DZP) 363 (t 2H H3 DZP)
756 (d 1H H6 FENIL J65= 99Hz) 839-845 (m 2H H3+H5 FENIL)
(4-nitro-2-trifluorometil)fenil)-14-diazepan
Procedimiento experimental
Seguacuten el meacutetodo B usando amina protegida se obtiene un aceite que precipita
con eacuteter etiacutelico en friacuteo
Punto de fusioacuten 121ndash123 ordmC
IR (cm-1) 3352 (m NH) 2938-2850 (m C-H alifaacuteticos) 1581 y 1331 (mf CF3)
RMN-1H (CDCl3 400 MHz) δ (ppm) 174 (sa 1H NH) 192-197 (m 2H H6
DZP) 303-309 (m 4H H3+H5 DZP) 350-357 (m 4H H2+H7 DZP) 721 (d 1H
H6 FENIL J65= 93 Hz) 825 (dd 1H H5 FENIL J56= 92 Hz J53= 28 Hz) 853
(d 1H H3 FENIL J35= 28 Hz)
FM C17H22N3F3O4
PM 3893 Apariencia Soacutelido amarillo Rendimiento 77
FM C12H14N3F3O2
PM 2893 Apariencia Soacutelido amarillo Rendimiento 75
Descripcioacuten de Compuestos
118
Tert-butil 1-(4-nitro-2-trifluorometilfenil)-(S)-pirrolodin-3-ilcarbamato
Procedimiento experimental
Seguacuten el meacutetodo A a partir de 127 g (686 mmol) de tert-butil-(S)-pirrolidin-3-ilcarbamato y
072 g (343 mmol) de 2-fluor-5-nitro-1-(trifluorometil) benceno El residuo obtenido se precipita
y se lava con hexano
Punto de fusioacuten 115 ndash 117 ordmC
IR (cm-1) 3349 (f NH) 2981-2880 (d C-H alifaacuteticos) 1680 (mf CO) 1507 y 1326 (m NO2) 1273 y
1120 (f CF3)
RMN-1H (CDCl3 400 MHz) δ (ppm) 148 (s 9H C(CH3)3) 199-207 (m 1H H4ec PIRR) 226-
235 (m 1H H4ax PIRR) 342(c 1H H2ec PIRR) 359-365 (m 1H H5ax PIRR) 368-374 (m 1H
H5ec PIRR) 384 (c 1H H2ax PIRR) 438 (sa 1H NH) 470 (sa 2H H3 PIRR) 683 (d 1H H6
FENIL J65 = 95 Hz) 820 (dd 1H H5 FENIL J56 = 94 Hz J53 = 27Hz) 856 (d 1H H3 FENIL
J35= 27 Hz)
1-(4-nitro-2-trifluorometilfenil)-(S)-pirrolidin-3-il amina
Procedimiento experimental
Seguacuten el meacutetodo B usando la amina protegida se obtiene un aceite que precipita
con hexano en friacuteo Se identifica y se usa sin maacutes purificaciones en la siguiente
reaccioacuten
Punto de fusioacuten 64ndash66 ordmC
IR (cm-1) 3359 (d NH) 2943-2851 (d C-H alifaacuteticos) 1505 y 1317 (mf NO2) 1105 (mf CF3)
RMN-1H (CDCl3 400 MHz) δ (ppm) 149 (sa 2H NH2) 183-191 (m 1H H4ec
PIRR) 219-226 (m 1H H4ax PIRR) 327-330 (m 1H H2ec PIRR) 358-363 (m
1H H5ax PIRR) 375-381 (m 4H H2ax+H3+H5ec PIRR) 683 (d 1H H6 FENIL
J65= 95 Hz) 819 (dd 1H H5 FENIL J56= 95 Hz J53= 27 Hz) 856 (d 1H H3
FENIL J35= 27 Hz)
FM C16H20N3F3O4
PM 37521 Apariencia Soacutelido amarillo Rendimiento 71
FM C11H12N3F3O2
PM 2751 Apariencia Soacutelido marroacuten claro Rendimiento 83
Descripcioacuten de Compuestos
119
Tert-butil 1-(4-nitro-2-trifluorometilfenil)piperidin-4-ilcarbamato
Procedimiento experimental
Seguacuten el meacutetodo A a partir de 241 g de tert-butil piperidin-4-ilcarbamato (1203 mmol) y 214 g
de 1-fluacuteor-4-nitro-2-(trifluorometil)benceno (1023 mmol) El residuo obtenido se lava con
hexano
Punto de fusioacuten 120ndash122 ordmC
IR (cm-1) 3431 (m NH) 2979-2798 (m C-H alifaacuteticos) 1707 (mf CO) 1500 y 1341 (mf NO2)
1118 (f CF3)
RMN-1H (CDCl3 400 MHz) δ (ppm) 147 (s 9H C(CH3)3) 162 (dd 2H H3ax+H5ax PIPR J3ax3ec
= J5ax5ec = 113 Hz J3ax2ax = J5ax6ax = 35 Hz) 209 (d 2H H3ec+H5ec PIPR J3ec3ax = J5aec5ax = 121 Hz)
296 (td 2H H2ax+H6ax PIPR J2ax2ec = J6ax6ec = J2ax3ax = J6ax5ax = 125 Hz J2ax3ec = J6ax5ec = 19 Hz) 335
(d 2H H2ec+H6ec PIPR J2ec2ax = J6ex6ac =125 Hz) 366 (sa 1H H4 PIPR) 456 (sa 1H HN) 728 (d
1H H6 PIPR J65= 90 Hz) 832 (dd 1H H5 FENIL J56= 90 Hz J53 = 27 Hz) 851 (d 1H H3
FENIL J35 = 27 Hz)
1-(4-nitro-2-trifluorometilfenil)piperidin-4-il amina
Procedimiento experimental
Seguacuten el meacutetodo B usando la amina protegida se obtiene un aceite que precipita con
hexano en friacuteo Se identifica y se usa sin maacutes purificaciones en la siguiente reaccioacuten
Punto de fusioacuten 24-25 ordmC
IR (cm-1) 2938-2847 (m C-H alifaacuteticos) 1499 y 1334 (mf NO2) 1119 (mf CF3)
RMN-1H (CDCl3 400 MHz) δ (ppm) 152 (sa 1H NH2) 151-162 (m 2H H3ax+H5ax
PIPR) 195 (d 2H H3ec+H5ec PIPR J3ax3ec = J5ax5ec = 126 Hz) 287-296 (m 3H
H2ax+H6ax+H4 PIPR) 339 (d 2H H2ec+H6ec PIPR J2ec2ax = J6ec6ax = 127 Hz) 725 (d 1H
H6 FENIL J65= 91 Hz) 830 (dd 2H H5 FENIL J56= 90 Hz J53= 25 Hz) 851 (d 1H H3
FENIL J35= 26 Hz)
FM C17H22N3F3O4
PM 3892 Apariencia Soacutelido amarillo Rendimiento 93
FM C12H14N3O2F3
PM 2891 Apariencia Soacutelido amarillo Rendimiento 88
Descripcioacuten de Compuestos
120
X2 Siacutentesis de derivados carboniacutelicos (Serie 0)
1-(benzo[b]tiofen-3-il)-3-[4-(4-nitro-2-trifluorometilfenil)piperazin-1-
il]propan-1-ona
Procedimiento experimental
Seguacuten el meacutetodo general C a partir de 104 g (378 mmol) de (4-nitro-2-
trifluorometilfenil)piperazina y 085 g (370 mmol) de 1-(benzo[b]tiofen-3-il)-3-
cloropropan-1-ona Se elimina el disolvente a presioacuten reducida y se precipita el
soacutelido con hexanoeacuteter en friacuteo El soacutelido obtenido se purifica en columna
cromatograacutefica usando como fase moacutevil diclorometanometanol (991) Se
elimina el disolvente de las fracciones adecuadas a presioacuten reducida
obtenieacutendose el compuesto de forma soacutelida
Punto de fusioacuten 153-154ordmC
IR (cm-1) 2952-2815 (m C-H alifaacuteticos) 1673 (mf CO) 1457 y 1332 (mf NO2)
1281 y 1131 (m CF3)
RMN-1H (CDCl3 400 MHz) δ (ppm) 276-277 (m 4H H3+H5 PIPZ) 298-312
(m 2H CO-CH2-CH2) 319-321 (t 4H H2+H6 PIPZ) 327-330 (m 2H CO-CH2-
CH2) 729 (dd 1H H5rsquo FENIL J5acute6acute= 94 Hz J5acute3acute= 25 Hz) 746 (t 1H H6 BZT
J65= 80 Hz) 752 (t 1H H5 BZT J56= J54= 81 Hz) 790 (d 1H H4 BZT J45= 80
Hz) 833-836 (m 2H H6rsquo FENIL+ H7 BZT) 853 (s 1H H2 BZT) 878 (d 1H H3rsquo
FENIL J3acute5acute= 26 Hz)
Anaacutelisis elemental (CHN)
HPLC (RP-18 1 mLmin metanol-agua (8020)) tr 713 min ʎmax 2196 nm
Calculado Hallado
C 5720 5677
H 432 457
N 916 908
FM C22H20N3F3O3S PM 4635 Apariencia Soacutelido amarillo
Rendimiento 13
01
Descripcioacuten de Compuestos
121
Hidrocloruro de 1-(benzo[b]tiofen-3-il)-3-[4-(2-nitro-4-
trifluorometilfenil)piperazin-1-il]propan-1-ona
Procedimiento experimental
Seguacuten el meacutetodo general C a partir de 147 g (534 mmol) de 4-(2-nitro-4-
trifluorometilfenil) piperazina comercial y 104 g (445 mmol) de 1-
(benzo[b]tiofen-3-il)-3-cloropropan-1-ona Se elimina el disolvente a presioacuten
reducida y precipita con hexano El soacutelido obtenido no es del todo puro por lo
que se purifica por columna cromatograacutefica usando como fase moacutevil
diclorometanometanol (991) Se elimina el disolvente de las fracciones
adecuadas a presioacuten reducida obteniendo un aceite claro que se precipita como
hidrocloruro
Punto de fusioacuten 207-209 ordmC
IR (cm-1) 2970-2930 (d C-H alifaacuteticos) 1657 (mf CO) 1447 y 1332 (mf NO2)
1253 y 1120 (m CF3)
RMN-1H (DMSO 400 MHz) δ (ppm) 326 (d 2H CO-CH2-CH2 JCHCH= 98
Hz) 351 (d 2H H3ax + H5ax PIPZ Jaxec= 128 Hz) 355 (d 4H
H3ec+H5ec+H2ax+H6ax PIPZ Jaxec= 129 Hz) 367 (d 2H H2ec+H6ec PIPZ Jecec=
122 Hz) 377 (t 2H CO-CH2 JCHCH= 100 Hz) 749 (ddd 1H H5 BZT J54= 84
Hz J56= 68 Hz) 754 (ddd 1H H6 BZT J67= 82 Hz J65= 70 Hz) 758 (d 1H
H6rsquo FENIL J6acute5acute= 88 Hz) 797 (dd 1H H5rsquo FENIL J5acute6acute= 89 Hz J5acute3acute= 21 Hz)
812 (d 1H H4 BZT J45= 79 Hz) 830 (sa 1H H3rsquo FENIL) 862 (d 1H H7 BZT
J76= 78 Hz) 909 (sa 1H H2 BTZ) 1145 (sa 1H HCl)
Anaacutelisis elemental (CHN)
HPLC (RP-18 1 mLmin metanol-agua (8020)) tr 523 min ʎmax 2181 nm
Calculado Hallado
C 5285 5301
H 400 416
N 841 831
FMC22H20N3F3O3SHCl PM 4999 Apariencia Soacutelido beige Rendimiento 60
02
Descripcioacuten de Compuestos
122
1-(benzo[b]tiofen-3-il)-3-[4-(4-fluorofenil)-36-dihidropiridin-
1(2H)-il]propan-1-ona
Procedimiento experimental
Seguacuten el meacutetodo general C a partir de 1 g (567 mmol) de 4-(4-fluorofenil)-
1236-tetrahidropiridina y 12 g (534 mmol) de 1-(benzo[b]tiofen-3-il)-3-
cloropropan-1-ona Se elimina el disolvente a presioacuten reducida y se precipita el
soacutelido con eacuteter El soacutelido obtenido se purifica por cromatografiacutea flash usando
como fase moacutevil diclorometanometanol (991) Se elimina el disolvente de las
fracciones adecuadas a presioacuten reducida obtenieacutendose el compuesto de forma
soacutelida
Punto de fusioacuten 79-80 ordmC
IR (cm-1) 2780-2775 (d C-H alifaacuteticos) 1664 (mf CO)
RMN-1H (CDCl3 400 MHz) δ (ppm) 261 (sa 2H H6 PIRD) 285 (t 2H H2
PIRD J2ec3ec= J2ax3ax= 57 Hz) 306 (t 2H CO-CH2-CH2 JCHCH= 74 Hz) 330 (sa
2H H5 PIRD) 335 (t 2H CO-CH2 JCHCH= 73 Hz) 603 (t 1H H3 PIRD J56ec=
J56ax= 40 Hz) 702 (dd 2H H3rsquo+ H5rsquo FENIL J3acute2acute= J5acute6acute= 87 Hz) 736 (dd 2H
H2rsquo+ H6rsquo FENIL J3acute2acute= J6acute5acute= 86 Hz) 745 (t 1H H6 BZT J65= J67= 76 Hz) 752 (t
1H H5 BZT J56= J54= 77 Hz) 790 (d 1H H4 BZT J45 = 73 Hz) 839 (s H2 BZT)
879 (d 1H H7 BZT J76= 75 Hz)
Anaacutelisis elemental (CHN)
HPLC (RP-18 1 mLmin metanol-agua (8020)) tr 561 min ʎmax 2196 nm
Calculado Hallado
C 7232 7214
H 548 549
N 383 369
FM C22H20NFOS PM 3655 Apariencia Soacutelido amarillo Rendimiento 15
03
Descripcioacuten de Compuestos
123
1-(5-fluorobenzo[b]tiofen-3-il)-3[4-(4-nitro-2-
(trifluorometilfenil)piperazin-1-il]propan-1-ona
Procedimiento experimental
Seguacuten el meacutetodo general D a partir de 048 g (174 mmol) de 4-(4-nitro-2-
trifluorometilfenil) piperazina y 035 g (179 mmol) de 1-(5-fluorobenzo[b]tiofen-
3-il) etanona se elimina el disolvente a presioacuten reducida y se precipita el soacutelido
con hexanoeacuteter en friacuteo
IR (cm-1) 2976-2832 (d C-H alifaacuteticos) 1671 (mf CO) 1330 (f NO2) 1281 y 1127
(m CF3)
RMN-1H (CDCl3 400 MHz) δ (ppm) 296 (sa 4H H3+H5 PIPZ) 320 (sa 2H
CO-CH2-CH2) 331 (sa 4H H2+H6 PIPZ) 346 (sa 2H CO-CH2) 723 (dt 1H
H6 FBZT J65= J67= 86 Hz J64= 25 Hz) 739 (d 1H H6acute FENIL J6acute5acute= 88 Hz)
783 (dd 1H H7 FBZT J76= 88 Hz J75= 48 Hz) 837 (dd 1H H5acute FENIL J5acute6acute=
89 Hz J5acute3acute= 26 Hz) 848 (dd 1H H4 FBZT J4F= 104 Hz J46= 25 Hz) 853 (s
1H H2 FBZT) 854 (d 1H H3rsquo FENIL)
Anaacutelisis elemental (CHN)
HPLC (RP-18 1 mLmin metanol-agua (8020)) tr 703 min ʎmax 2159 nm
Calculado Hallado
C 5101 5055
H 387 390
N 811 786
FM C22H19N3F4O3S PM 4815 Apariencia Soacutelido amarillo Rendimiento 35
04
Descripcioacuten de Compuestos
124
1-(5-fluorobenzo[b]tiofen-3-il)-3-[4-(2-nitro-4-
(trifluorometilfenil)piperazin-1-il]propan-1-ona
Procedimiento experimental
Seguacuten el meacutetodo general D a partir de 058 g (209 mmol) de 4-(2-nitro-4-
trifluorometilfenil) piperazina y 043 g (222 mmol) de 1-(5-fluorobenzo[b]tiofen-
3-il) etanona Se elimina el disolvente a presioacuten reducida y el residuo se
precipita con eacuteter en friacuteo
RMN-1H (CDCl3 400 MHz) δ (ppm) 280 (sa 4H H3+H5 PIPZ) 303 (t 2H
CO-CH2-CH2 JCHCH= JCHCH= 74 Hz) 323 (sa 4H H2+H6 PIPZ) 328 (t 2H
CO-CH2 JCHCH= JCHCH = 73 Hz) 719 (d 1H H6rsquo FENIL J6acute5acute= 84 Hz) 722-725
(m 1H H6 FBZT) 769 (dd 1H H5acute FENIL J5acute6acute= 87 Hz J5acute3acute= 20 Hz) 782 (dd
1H H7 FBZT J76= 89 Hz J7F= 49 Hz) 843 (s 1H H2 FBZT) 808 (d 1HH3acute
FENIL J3acute5acute= 16 Hz) 850 (dd 1H H4 FBZT J4F= 104 Hz J46= 26 Hz)
Anaacutelisis elemental (CHN)
HPLC (RP-18 1 mLmin metanol-agua (8020)) tr 542 min ʎmax 2196 nm
Calculado Hallado
C 5101 5102
H 386 384
N 811 798
FM C22H19N3F4O3S PM 4815 Apariencia Soacutelido naranja Rendimiento 51
05
Descripcioacuten de Compuestos
125
1-(5-fluorobenzo[b]tiofen-3-il)-3-[4-(4-(trifluorometilfenil)
piperazin-1-il]propan-1-ona
Procedimiento experimental
Seguacuten el meacutetodo general D a partir de 036 g (130 mmol) de 4-(4-
trifluorometilfenil) piperazina y 033 g (170 mmol) de 1-(5-fluorobenzo[b]tiofen-
3-il)etanona Se elimina el disolvente a presioacuten reducida y se precipita el soacutelido
con hexanoeacuteter El soacutelido obtenido no es del todo puro por lo que se purifica
por cromatografiacutea flash usando como fase moacutevil diclorometanometanol (991)
Se elimina el disolvente de las fracciones adecuadas a presioacuten reducida
obtenieacutendose un aceite claro
Debido al bajo rendimiento de la reaccioacuten el aceite puro obtenido se identifica
por CCF y se usa en su totalidad para la siacutentesis del derivado hidroxiacutelico 2c
FM C22H20N2F4OS PM 4815 Apariencia Aceite incoloro Rendimiento 15
06
Descripcioacuten de Compuestos
126
Hidrocloruro de 1-(5-fluorobenzo[b]tiofen-3-il)-3-[4-(4-nitro-2-
(trifluorometilfenil)-14-diazepan-1-il]propan-1-ona
Procedimiento experimental
Seguacuten el meacutetodo general D a partir de 051 g (177 mmol) de 4-(2-nitro-4-
trifluorometilfenil) piperazina comercial y 035 g (179 mmol) de 1-(5-
fluorobenzo[b]tiofen-3-il)etanona se elimina el disolvente a presioacuten reducida y
se precipita con hexanoeacuteter etiacutelico
IR (cm-1) 2938 (d C-H alifaacuteticos) 1663 (m CO) 1449 y 1332 (mf NO2) 1281 y
1120 (m CF3)
RMN-1H (DMSO-d6 400 MHz) δ (ppm) 290-297 (m 6H H3+H5+H6 DZP)
310 (t 2H CO-CH2-CH2 JCHCH= 69 Hz) 322 (t 2H CO-CH2 JCHCH= 71 Hz)
353 (d 2H H7 DZP J76= 78 Hz) 356 (d 2H H2 DZP J23= 81 Hz) 712 (d 1H
H6acute FENIL J6acute5acute= 90 Hz) 722 (dd 1H H6 FBZT J67= 83 Hz J64= 23 Hz) 781
(dd 1H H5acute FENIL J5acute6acute= 93 Hz J5acute3acute= 28 Hz ) 820 (d 1H H7rsquo FBZT J76= 80
Hz) 841 (sa 1H H2 FBZT) 848 (d 1H H3acute FENIL J3acute5acute= 26 Hz) 850 (d 1H H4
FBTF J4F= 102 Hz)
Anaacutelisis elemental (CHN)
HPLC (RP-18 1 mLmin metanol-agua (8020)) tr 239 min ʎmax 2235 nm
Calculado Hallado
C 519lt3 5094
H 414 413
N 790 760
FM C23H21N3F4O3SHCl PM 5320 Apariencia Soacutelido amarillo
Rendimiento 80
07
Descripcioacuten de Compuestos
127
1-(5-fluorobenzo[b]tiofen-3-il)-3-[1-(4-nitro-2-
(trifluorometilfenil)piperidin-4-ilamino]propan-1-ona
Procedimiento experimental
Seguacuten el meacutetodo general D a partir de 030 g (155 mmol) de 1-(4-nitro-2-
trifluorometilfenil) piperidin-4-il amina y 033 g (172 mmol) de 1-(5-
fluorobenzo[b]tiofen-3-il) etanona se elimina el disolvente a presioacuten reducida y
se purifica el aceite impuro por cromatografiacutea flash usando como fase moacutevil
diclorometanometanol (991) Se elimina el disolvente de las fracciones
adecuadas a presioacuten reducida obtenieacutendose un aceite claro aacutembar intenso
Debido al bajo rendimiento de la reaccioacuten el intermedio obtenido se identifica
por CCF y se usa en su totalidad para la siacutentesis del derivado hidroxiacutelico 2f
FM C23H21N3F4O3S PM 4955 Apariencia Aceite aacutembar Rendimiento 20
08
Descripcioacuten de Compuestos
128
Hidrocloruro de 1-(2-naftil)-3-[4-(4-nitro-2-trifluorometilfenil)
piperazin-1-il] propan-1-ona
Procedimiento experimental
Seguacuten el meacutetodo general D partiendo de 031 g (181 mmol) de 2-acetonaftona
comercial y 050 g (181 mmol) de 4-(4-nitro-2-trifluorometilfenil) piperazina
Despueacutes de la extraccioacuten y eliminacioacuten a presioacuten reducida del disolvente se
obtiene un aceite impuro El compuesto se purifica y precipita con eacuteter saturado
de clorhiacutedrico para la obtencioacuten del hidrocloruro
Punto de fusioacuten 181-183ordmC
IR (cm-1) 2922-2844 (d C-H alifaacuteticos) 1680 (mf CO) 1521 y 1347 (mf NO2)
1279 y 1151 (m CF3)
RMN-1H (DMSO-d6 400 MHz) δ (ppm) 321 (d 2H H3ax+H5ax PIPZ) 327 (d
2H H3ec+H5ec PIPZ) 364 (sa 2H H2ax+H6ax PIPZ) 367 (sa 2H H2ec+H6ec PIPZ)
390 (t 2H CO-CH2-CH2 JCH-CH= 118 Hz) 403 (t 2H CO-CH2 JCH-CH= 64 Hz)
765-759 (m 3H H6+H7 NFT+H6acute FENIL) 792 (d 1H H4 NFT J43= 79 Hz)
795 (d 1H H5 NFT J56= 87 Hz) 804 (d 1H H8 NFT J87= 83 Hz) 806 (d 1H
H3 NFT J34= 79 Hz) 846 (dd 1H H5acute FENIL J5acute6acute= 88 Hz J5acute3acute= 25 Hz) 858
(d 1H H3acute FENIL J3acute5acute= 25 Hz) 862 (sa 1H H1 NFT)
Anaacutelisis elemental (CHN)
HPLC (RP-18 1 mLmin metanol-agua (8020)) tr 252 min ʎmax 2134 nm
Calculado Hallado
C 5434 5410
H 434 455
N 790 765
FM C24H22N3F3O3HCl PM 4940 Apariencia Soacutelido beige Rendimiento 17
09
Descripcioacuten de Compuestos
129
Hidrocloruro de 1-(2-naftil)-3-[4-(2-nitro-4-
trifluorometilfenil)piperazin-1-il]propan-1-ona
Procedimiento experimental
Seguacuten el meacutetodo general D partiendo de 062 g (363 mmol) de 2-acetonaftona
comercial y 100 g (363 mmol) de 4-(2-nitro-4-trifluorometilfenil) piperazina
Despueacutes de extraer y eliminar a presioacuten reducida el disolvente se obtiene un
aceite impuro El compuesto se purifica y precipita con eacuteter saturado de
clorhiacutedrico para la obtencioacuten del hidrocloruro
Punto de fusioacuten 152ndash153 ordmC
IR (cm-1) 2953-2838 (md C-H alifaacuteticos) 1672 (mf CO) 1535 y 1329 (mf NO2)
1278 y 1169 (m CF3)
RMN-1H (DMSO-d6 400 MHz) δ (ppm) 324ndash331 (m 2H CO-CH2-CH2)
345ndash361(m 6H H3+H5+H2ax+H2ax PIPZ) 371 (d 2H H2ec+H6ec PIPZ Jec-ax=
1148 Hz) 387 (t 2H CO-CH2 JCH-CH= 111 Hz) 756 (d 1H H6acute FENIL J6acute5acute=
87 Hz) 767 (ddd 1H H6 NFT J65= 82 Hz J67= 68 Hz J68= 13 Hz) 771 (ddd
1H H7 NFT J78= 83 Hz J76= 71 Hz J75= 13 Hz) 797 (dd 1H H5acute FENIL J5acute6acute=
89 Hz) 803 (d 1H H4 NFT J43= 84 Hz) 804 (d 1H H5 NFT J56= 85 Hz) 808
(d 1H H8 NFT J87= 85 Hz) 815 (d 1H H3 NFT J34= 80 Hz) 828 (d 1H H3acute
FENIL J3acute5acute= 13 Hz) 877 (sa 1H H1 NFT) 1135 (sa 1H HCl)
Anaacutelisis elemental (CHN)
HPLC (RP-18 1 mLmin metanol-agua (8020)) tr 528 min ʎmax 2475 nm
Calculado Hallado
C 5836 5842
H 466 471
N 850 843
FM C24H22N3F3O3HCl PM 4940 Apariencia Soacutelido amarillo Rendimiento 41
010
Descripcioacuten de Compuestos
130
Hidrocloruro de 1-(2-naftil)-3-[1-(4-nitro-2-
trifluorometilfenil)pirrolidin-3-ilamino]propan-1-ona
Procedimiento experimental
Seguacuten el meacutetodo general D partiendo de 067 g (394 mmol) de 2-acetonaftona y
095 g de 1-(4-nitro-2-(trifluorometilfenil)-(S)-pirrolidin-3-amina Despueacutes de
extraer con acetato de etilo y eliminar a presioacuten reducida el disolvente se
obtiene un soacutelido fino que se lava con eacuteter
Punto de fusioacuten 170-171ordmC
IR (cm-1) 2942-2716 (m C-H alifaacuteticos) 1681 (m CO) 1504 y 1324 (mf NO2)
1285 y 1121 (m CF3)
RMN-1H (DMSO-d6 400 MHz) δ (ppm) 238 (dd 1H H4ec PIRR) 245 (dd 1H
H4ax PIRR) 342 (d 2H CO-CH2-CH2) 364 (dd 1H H2ec PIRR) 375 (t 2H CO-
CH2) 381- 386 (m 2H H5ec+ H2ax PIRR) 394 (dd 1H H5ax PIRR) 408 (s 1H
H3 PIRR) 712 (d 1H H6acute FENIL J6acute5acute= 96 Hz) 765 (dd 1H H6 NFT J67= 78
Hz J65= 68 Hz) 769 (dd 1H H7 NFT J78= 83 Hz J76= 78 Hz) 800 (d 1H H4
NFT J43= 65 Hz) 802 (d 1H H3 NFT J34= 65 Hz) 806 (d 1H H5acute FENIL
J5acute6acute= 86 Hz) 816 (d 1H H5 NFT J56= 68 Hz) 825 (d 1H H8 NFT J87= 84
Hz) 839 (sa 1H H3acute FENIL) 869 (sa 1H H1 NFT) 980 (sa 2H NH+ HCl)
Anaacutelisis elemental (CHN)
HPLC (RP-18 1 mLmin metanol-agua (8020)) 25 min ʎmax= 2141 nm
Calculado Hallado
C 5836 5794
H 466 475
N 851 837
FM C24H22N3F3O3HCl PM 4935 Apariencia Soacutelido anaranjado
Rendimiento 38
011
Descripcioacuten de Compuestos
131
3-[4-(4-fluorofenil)-36-dihidropiridin-1(2H)-il]-1-(naftalen-2-
il)propan-1-ona
Procedimiento experimental
Seguacuten el meacutetodo general D a partir de 082 g (463 mmol) de 4-(4-fluorofenil)-
1236-tetrahidropiridina y 070 g (411 mmol) de 2-acetonaftona Se elimina el
disolvente a presioacuten reducida y se precipita el soacutelido con eacuteter El soacutelido
obtenido se purifica por cromatografiacutea flash usando como fase moacutevil
diclorometanometanol (991) Se elimina el disolvente de las fracciones
adecuadas a presioacuten reducida obtenieacutendose un soacutelido
Punto de fusioacuten 172ndash175 ordmC
IR (cm-1) 2780-2775 (d C-H alifaacuteticos) 1677 (f CO) 1510 (f C=C)
RMN-1H (CDCl3 400 MHz) δ (ppm) 161 (sa 2H H6 PIRD) 214 (sa 2H H2
PIRD) 272 (sa 2H CO-CH2-CH2) 292-299 (m 2H H5 PIRD) 345 (d 2H CO-
CH2) 602 (sa 1H H3 PIRD) 705 (t 2H H3rsquo+ H5rsquo FENIL J3acute2acute= J5acute6acute= 86 Hz)
735 (d 1H H6acute FENIL J6acute5acute= 86 Hz) 739 (sa 1H H2acute FENIL) 748-751 (m 3H
H5+H6+H7 NFT) 784-786 (m 3H H3+H4+H8 NFT) 791 (s 1H H1 NFT)
Anaacutelisis elemental (CHN)
HPLC (RP-18 1 mLmin metanol-agua (8020)) tr 557 min ʎmax 2455 nm
Calculado Hallado
C 7182 7125
H 581 573
N 354 350
FM C24H22NFO PM 3595 Apariencia Soacutelido beige Rendimiento 24
012
Descripcioacuten de Compuestos
132
3-[4-(4-fluorofenil)-36-dihidropiridin-1(2H)-il]-1-(4-
trifluorometilfenil)propan-1-ona
Procedimiento experimental
Seguacuten el meacutetodo general D a partir de 054 g (293 mmol) de 4-(4-fluorofenil)-
1236-tetrahidropiridina y 052 g (276 mmol) de 1-(4-trifluorometilfenil)
etanona se elimina el disolvente a presioacuten reducida y el aceite se purifica por
cromatografiacutea flash usando como fase moacutevil diclorometanometanol (991) Se
elimina el disolvente de las fracciones adecuadas a presioacuten reducida obteniendo
el compuesto puro
RMN-1H (DMSO-d6 400 MHz) δ (ppm) 284 (sa 2H H6 PIRD) 355 (t 2H H2
PIRD) 382 (t 4H CO-CH2 +CO-CH2-CH2) 406 (sa 2H H5 PIRD) 621 (sa 1H
H3 PIRD) 723 (t 2H H2+ H6 TFBZN J23= J65= 88 Hz) 756 (dd 2H H3acute+ H5acute
FENIL J3acute2acute= J5acute6acute= 87 Hz J3acute5acute= J5acute3acute= 54 Hz) 797 (d 2H H2acute+ H6acute FENIL J2acute3acute=
J6acute5acute= 83 Hz) 823 (d 2H H3+H5 TFBZN J32= J56= 86 Hz)
FM C21H19NF4O
PM 3774 Apariencia Aceite beige Rendimiento 13
013
Descripcioacuten de Compuestos
133
1-(2-naftil)-2-[4-(4-nitro-2-trifluorometilfenil)piperazin-1-il]etan-1-
ona
Procedimiento experimental
Seguacuten el meacutetodo general C a partir de 070 g (254 mmol) de 4-(4-nitro-2-
trifluorometilfenil) piperazina y 053 g (211 mmol) de 2-bromo-2acute-acetonaftona
Se elimina el disolvente a presioacuten reducida obteniendo un aceite que se purifica
por columna cromatograacutefica usando como fase moacutevil diclorometanometanol
(973) Se elimina el disolvente de las fracciones adecuadas a presioacuten reducida
obteniendo compuesto puro en forma soacutelida
Punto de fusioacuten 167-168ordmC
IR (cm-1) 2925-2873 (d C-H alifaacuteticos) 1669 (mf CO) 1499 y 1334 (mf NO2)
1281 y 1124 (m CF3)
RMN-1H (DMSO-d6 400 MHz) δ (ppm) 309 (sa 4H H2+H6 PIPZ) 336 (sa
4H H3+H5 PIPZ) 428 (sa 2H COCH2) 739 (d 1H H6acute FENIL J6acute5acute= 88 Hz)
760-765 (m 1H H6 NFT) 766-771 (m 1H H7 NFT) 792 (d 1H H3 NFT J34=
81 Hz) 794 (d 1H H5acute FENIL J5acute6acute= 89 Hz) 800 (d 1H H4 NFT J43= 81 Hz)
805 (dd 1H H5 NFT J56= 85 Hz J57= 12 Hz) 837 (dd 1H H8 NFT J87= 90
Hz J86= 19 Hz) 856 (sa 2H H2 NFT+ H3acute FENIL)
Anaacutelisis elemental (CHN)
HPLC (RP-18 1 mLmin metanol-agua (8020)) tr 69 min ʎmax 2477 nm
Calculado Hallado
C 6225 602
H 451 421
N 948 925
FM C23H20N3F3O3 PM 4434 Apariencia Soacutelido beige Rendimiento 13
014
Descripcioacuten de Compuestos
134
1-(2-naftil)-2-[4-(2-nitro-4-trifluorometilfenil)piperazin-1-il]etan-1-
ona
Procedimiento experimental
Seguacuten el meacutetodo general C a partir de 135 g (481 mmol) de 4-(2-nitro-4-
trifluorometilfenil) piperazina y 104 g (417 mmol) de 2-bromo-2acute-acetonaftona
Se elimina el disolvente a presioacuten reducida obteniendo un aceite que se
precipita con una mezcla de hexanoeacuteter etiacutelico en frio
Punto de Fusioacuten 105-106ordmC
IR (cm-1) 2943-2854 (d alifaacuteticos) 1686 (f CO) 1532 y 1329 (m NO2) 1295 y
1118 (m CF3)
RMN-1H (CDCl3 400 MHz) δ (ppm) 290 (t 4H H3+H5 PIPZ) 331 (t 4H
H2+H6 PIPZ) 410 (sa 2H CO-CH2) 721 (d 1H H6acute FENIL J6acute5acute= 86 Hz) 760
(dd 1H H7 NFT J78= 85 Hz J75= 84 Hz) 764 (dd 1H H4 NFT J43= 81 Hz
J45= 14 Hz) 769 (ddd 1H H6 NFT J65= 95 Hz J67= 84 Hz J68= 16 Hz) 791
(d 1H H5 NFT J56= 95 Hz) 794 (d 1H H8 NFT J87= 84 Hz) 800 (d 1H H3
NFT J34= 81 Hz) 806 (dd 1H H5acute FENIL J5acute6acute= 86 Hz J5acute3acute= 16 Hz) 809 (d
1H H3acute FENIL J3acute5acute= 16 Hz) 856 (sa 1H H1 NFT)
Anaacutelisis elemental (CHN)
Calculado Hallado
C 6230 6173
H 451 481
N 948 933
FM C23H20N3F3O3 PM 44340 Apariencia Soacutelido naranja Rendimiento 60
015
Descripcioacuten de Compuestos
135
1-(4-fluoronaftil)-3-[4-(4-nitro-2-trifluorometilfenil)piperazin-1-
il]propan-1-ona
Procedimiento experimental
Seguacuten el meacutetodo general D a partir de 063 g (229 mmol) de 4-(4-nitro-2-
trifluorometilfenil) piperazina y 056 g (299 mmol) de 4acute-fluoro-1acute-acetonaftona
comercial se elimina el disolvente a presioacuten reducida obteniendo un aceite que
se purifica por cromatografiacutea flash usando como fase moacutevil
diclorometanometanol (955) Se elimina el disolvente de las fracciones
adecuadas a presioacuten reducida obtenieacutendose el compuesto en forma de aceite
que se usa en su totalidad despueacutes de su identificacioacuten por CCF para la siacutentesis
del derivado hidroxiacutelico 5a
FM C24H21N3F4O3 PM 4754 Apariencia Aceite amarillo Rendimiento 53
016
Descripcioacuten de Compuestos
136
1-(4-fluoronaftil)-3-[4-(2-nitro-4-trifluorometilfenil) piperazin-1-il]
propan-1-ona
Procedimiento experimental
Seguacuten el meacutetodo general D partiendo de 144 g (523 mmol) de 4-(2-nitro-4-
trifluorometilfenil) piperazina y 098 g (522 mmol) de 4acute-fluoro-1acute-acetonaftona
comercial Despueacutes de extraer y eliminar a presioacuten reducida el disolvente se
obtiene un aceite que al antildeadir hexano friacuteo precipita el compuesto puro como
soacutelido fino
Punto de fusioacuten 106ndash107 ordmC
IR (cm-1) 2924-2854 (f C-H alifaacuteticos) 1675 (mf CO) 1531 y 1326 (m NO2)
1278 y 1123 (m CF3)
RMN-1H (DMSO 400 MHz) δ (ppm) 270 (sa 4H H3+H5 PIPZ) 304 (sa 2H
CO-CH2-CH2) 319 (sa 4H H2+H6 PIPZ) 335 (sa 2H CO-CH2) 717 (d 1H H6acute
FENIL J6acute5acute= 88 Hz) 720 (dd 1H H7 FNFT J78= 90 Hz J76= 80 Hz) 763 (ddd
1H H6 FNFT) 768 (dd 1H H5acute FENIL J5acute6acute= 88 Hz J5acute3acute= 16 Hz) 769 (dd 1H
H5 FNFT J56= 73 Hz J5F= 27 Hz) 794 (dd 1H H3 FNFT J32= 79 Hz J3F= 54
Hz) 807 (d 1H H3acute FENIL J3acute5acute= 15 Hz) 819 (d 1H H2 FNFT J23= 79 Hz)
873 (d 1H H8 FNFT J87= 90 Hz)
Anaacutelisis elemental (CHN)
HPLC (RP-18 1 mLmin metanol-agua (8020)) 243 min ʎmax= 2200 nm
Calculado Hallado
C 6063 6100
H 442 459
N 884 867
FM C24H21N3F4O3 PM 4754 Apariencia Soacutelido anaranjado Rendimiento 73
017
Descripcioacuten de Compuestos
137
1-(4-fluoronaft-1-il)-3-[4-(4-trifluorometilfenil)piperazin-1-
il]propan-1-ona
Procedimiento experimental
Seguacuten el meacutetodo general D a partir de 037 g (187 mmol) de 4-(4-
trifluorometilfenil) piperazina y 032 g (169 mmol) de 4acute-fluoro-1acute-acetonaftona
se elimina el disolvente a presioacuten reducida y precipita un soacutelido impuro con
hexanoeacuteter Se purifica por cromatografiacutea flash usando como fase moacutevil
diclorometanometanol (991) y se elimina el disolvente de las fracciones
adecuadas a presioacuten reducida obtenieacutendose el compuesto en forma de aceite
que despueacutes de su identificacioacuten por CCF se usa en su totalidad para la siacutentesis
del derivado hidroxiacutelico 5c
FM C24H22N2F4O PM 4305 Apariencia Aceite beige Rendimiento 23
018
Descripcioacuten de Compuestos
138
1-(4-fluoronaft-1-il)-3-[1-(4-nitro-2-trifluorometilfenil)piperidin-4-
ilamino]propan-1-ona
Procedimiento experimental
Seguacuten el meacutetodo general D a partir de 085 g (293 mmol) de 1-(4-nitro-2-
trifluorometilfenil)piperidin-4-il amina y 100 g (531 mmol) de 4acute-fluoro-1acute-
acetonaftona Se elimina el disolvente a presioacuten reducida y se purifica el aceite
impuro por cromatografiacutea flash usando como fase moacutevil
diclorometanometanol (991) Se elimina el disolvente de las fracciones
adecuadas a presioacuten reducida obtenieacutendose un soacutelido amarillo
IR (cm-1) 2950-2732 (d C-H alifaacuteticos) 1673 (mf CO) 1508 y 1334 (m NO2)
1284 y 1119 (m CF3)
RMN-1H (DMSO 400 MHz) δ (ppm) 180 (d 2H H3ax+ H5ax PIPR J3ax5ax=
J5ax3ax= 116 Hz) 224 (d 2H H3ec+H5ec PIPR J3ec5ec= J5ec3ec= 116 Hz) 300 (t 2H
CO-CH2-CH2 JCHCH= 118 Hz) 336-343 (m 5H H2+H4+H6 PIPR) 366 (t 2H
CO-CH2 JCHCH= 62 Hz) 753 (ddd 1H H3 FNFT J3F= 106 Hz J32= 85 Hz J35=
157 Hz) 760 (d 1H H6acute FENIL J6acute5acute= 89 Hz) 774 (ddd 1H H6 FNFT J65= 79
Hz J67= 69 Hz J68= 12 Hz) 779 (ddd 1H H7 FNFT J78= 85 Hz J76= 70 Hz
J75= 14 Hz) 818 (d 1H H2 FNFT J23= 81 Hz) 826 (dd 1H H5 FNFT J56= 74
Hz J5F= 56 Hz J57= 14 Hz) 840 (d 1H H3acute FENIL J3acute5acute= 24 Hz ) 844 (dd 1H
H5acute FENIL J5acute6acute= 87 Hz J5acute3acute= 26 Hz) 880 (d 1H H8 FNFT J87= 83 Hz)
FM C25H23N3F4O3 PM 4895 Apariencia Soacutelido amarillo Rendimiento 52
019
Descripcioacuten de Compuestos
139
1-(4-fluoronaft-1-il)-3-[4-(4-fluorofenil)-36-dihidropiridin-1(2H)-
il]propan-1-ona
Procedimiento experimental
Seguacuten el meacutetodo general D a partir de 143 g (669 mmol) de 4-(4-fluorofenil)-
1236-tetrahidropiridina y 097 g (518 mmol) de 4acute-fluoro-1acute-acetonaftona Se
elimina el disolvente a presioacuten reducida y el aceite se purifica por cromatografiacutea
flash usando como fase moacutevil diclorometanometanol (955) Se elimina el
disolvente de las fracciones adecuadas a presioacuten reducida obteniendo un soacutelido
puro
Punto de fusioacuten 127-128ordmC
IR (cm-1) 2536 (d C-H alifaacuteticos) 1672 (f CO)
RMN-1H (DMSO-d6 400 MHz) δ (ppm) 263 (s 2H H5 PIRD) 314-335 (m
6H H2+ H6 PIRD+ CO-CH2-CH2) 361 (s 2H CO-CH2) 616 (s 1H H3 PIRD)
719 (t 2H H3acute+ H5acute FENIL J3acute2acute= J6acute5acute= 89 Hz) 749 (d 1H H3 FNFT J32= 80
Hz) 751 (d 2H H2acute+H6acute FENIL J2acute3acute= J6acute5acute= 87 Hz) 773 (t 2H H6+H7 FNFT
J67= J76= 71 Hz) 815 (d 1H H5 FNFT J56= 75 Hz) 828 (dd 1H H2 FNFT J23=
78 Hz J2F= 43 Hz) 868 (d 1H H8 FNFT J87= 81 Hz)
FM C24H21NF2O
PM 3775 Apariencia Soacutelido blanco Rendimiento 44
020
Descripcioacuten de Compuestos
140
1-(4-fluorofenil)-3-[4-(4-nitro-2-trifluorometilfenil) piperazin-1-il]
propan-1-ona
Procedimiento experimental
Seguacuten el meacutetodo general D a partir de 026 g (093 mmol) de 4-(4-nitro-2-
trifluorometilfenil) piperazina y 025 g (180 mmol) de 1-(4-fluorofenil) etanona
se elimina el disolvente a presioacuten reducida obtenieacutendose un aceite que se
purifica por cromatografiacutea flash usando como fase moacutevil
diclorometanometanol (991) Se elimina el disolvente de las fracciones
adecuadas a presioacuten reducida obteniendo el compuesto en forma de aceite que
se usa en su totalidad despueacutes de su identificacioacuten por CCF para la siacutentesis del
derivado hidroxiacutelico 6a
FM C20H19N3F4O3 PM 4254 Apariencia Aceite amarillo Rendimiento 63
021
Descripcioacuten de Compuestos
141
1-(4-fluorofenil)-3-[1-(4-nitro-2-trifluorometilfenil)piperidin-4-il-
amino]propan-1-ona
Procedimiento experimental
Seguacuten el meacutetodo general D a partir de 025 g (853 mmol) de 1-(4-nitro-2-
trifluorometilfenil) piperidin-4-il amina y 022 g (160 mmol) de 1-(4-
fluorofenil)etanona Se elimina el disolvente a presioacuten reducida y se purifica el
aceite impuro por cromatografiacutea flash usando como fase moacutevil
diclorometanometanol (991) Se elimina el disolvente de las fracciones
adecuadas a presioacuten reducida obtenieacutendose un aceite
RMN-1H (DMSO-d6 400 MHz) δ (ppm) 250 (sa 1H H4 PIPR) 263-256 (m
4H H3+ H5 PIPR) 275 (t 2H CO-CH2-CH2) 314-309 (m 4H H2 +H6 PIPR)
324 (t 2H CO-CH2) 736 (t 2H H2 +H6 FBZN J23= J65=80 Hz) 754 (d 1H H6acute
FENIL J6acute5acute= 79 Hz) 808 (d 1H H5 FBZN J56= 79 Hz) 810 (d 1H H3 FBZN
J32= 76 Hz) 838 (s 1H H3acute FENIL) 839 (sa 1H H5acute FENIL)
FM C21H21N3F4O3 PM 4394 Apariencia Aceite amarillo Rendimiento 12
022
Descripcioacuten de Compuestos
142
1-(4-fluorofenil)-3-[4-(4-fluorofenil)-36-dihidropiridin-1(2H)-il]
propan-1-ona
Procedimiento experimental
Seguacuten el meacutetodo general D a partir de 050 g (288 mmol) de 4-(4-fluorofenil)-
1236-tetrahidropiridina y 034 g (245 mmol) de 1-(4-fluorofenil)etanona Se
elimina el disolvente a presioacuten reducida y el aceite se purifica por cromatografiacutea
flash usando como fase moacutevil diclorometanometanol (991) Se elimina el
disolvente de las fracciones adecuadas a presioacuten reducida obteniendo un aceite
amarillo
Despueacutes de identificar el compuesto por CCF debido al bajo rendimiento se usa
todo el aceite obtenido para la siacutentesis del derivado hidroxiacutelico 6g
FM C20H19NF2O
PM 32740 Apariencia Aceite amarillo Rendimiento 10
023
Descripcioacuten de Compuestos
143
X3 Siacutentesis de derivados hidroxiacutelicos
1-(benzo[b]tiofen-3-il)-3-[4-(4-nitro-2-
trifluorometilfenil)piperazin-1-il] propan-1-ol
Procedimiento experimental
Seguacuten el meacutetodo general E partiendo de 050 g (107 mmol) de 1-
(benzo[b]tiofen-3-il)-3-[4-(4-nitro-2-trifluorometilfenil)piperazin-1-il]propan-1-
ona se obtiene tras la eliminacioacuten del disolvente un soacutelido que se purifica por
columna cromatograacutefica de fase moacutevil diclorometanometanol (991) y se
obtiene el compuesto puro
Punto de fusioacuten 157ndash158 ordmC
IR (cm-1) 3365 (m OH) 2998-2830 (m C-H alifaacuteticos) 1524 y 1349 (mf NO2)
1282 y 1128 (f CF3)
RMN-1H (CDCl3 400 MHz) δ (ppm) 214-216 (m 2H CHOH-CH2) 277-287
(m 6H CHOH-CH2-CH2+H3+H5 PIPZ) 320-329 (m 4H H2 +H6 PIPZ) 538
(dd 1H CHOH) 733-742 (m 3H H6rsquo FENIL +H6+H5 BZT) 745 (s 1H H2
BZT) 782 (d 1H H4 BZT J45 = 84 Hz) 788 (d 1H H7 BZT J76= 80 Hz) 837
(dd 1H H5rsquo FENIL J5rsquo6rsquo = 92 Hz J5rsquo3rsquo = 28 Hz) 855 (d 1H H3rsquo FENIL)
Anaacutelisis elemental (CHN)
HPLC (RP-18 1 mLmin metanol-agua (8020)) 54 min ʎmax= 2281 nm
Calculado Hallado
C 5677 5701
H 473 485
N 903 853
FM C22H22N3F3O3S PM 4655 Apariencia Soacutelido amarillo Rendimiento 13
1a
Descripcioacuten de Compuestos
144
Hidrocloruro de 1-(benzo[b]tiofen-3-il)-3-[4-(2-nitro-4-
trifluorometilfenil)piperazin-1-il]propan-1-ol
Procedimiento experimental
Seguacuten el meacutetodo general E se parte de 041 g (082 mmol) de 1-(benzo[b]tiofen-
3-il)-3-[4-(2-nitro-4-trifluorometilfenil)piperazin-1-il]propan-1-ona Tras la
eliminacioacuten del disolvente se obtiene un aceite impuro que se purifica por
cromatografiacutea flash con diclorometanometanol (991) El aceite puro precipita
con eacuteter clorhiacutedrico como hidrocloruro
Punto de fusioacuten 176-178ordmC
IR (cm-1) 3185 (d OH) 2924-2851 (f C-H alifaacuteticos) 1509 y 1346 (mf NO2) 1279
y 1119 (f CF3)
RMN-1H (DMSO-d6 400 MHz) δ (ppm) 223ndash232 (m 2H CHOH-CH2) 317
(sa 2H CHOH-CH2-CH2) 335 (sa 2H H3ax+H5ax PIPZ) 349 (sa 4H
H2ax+H6ax+ H3ec+H5ec PIPZ) 359 (d 2H H2ec+H6ec PIPZ) 501 (m 1H CH-OH)
743ndash736 (m 2H H5+H6 BZT) 754 (d 1H H6acute FENIL J6acute5acute = 80 Hz) 764 (sa
1H H2 BZT) 794 (dd 1H H5acute FENIL J5acute6acute = 81 Hz J5acute3acute = 16 Hz) 798-801 (m
2H H7+ H4 BZT) 825 (sa 1H H3acute FENIL) 1111 (sa 1H HCl)
Anaacutelisis elemental (CHN)
HPLC (RP-18 1 mLmin metanol-agua (8020)) 433 min ʎmax= 2290 nm
Calculado Hallado
C 5264 5253
H 439 428
N 838 826
FM C22H22N3F3O3SHCl PM 502 Apariencia Soacutelido camel Rendimiento 16
1b
Descripcioacuten de Compuestos
145
Hidrocloruro de 1-(benzo[b]tiofen-3-il)-3-[4-(4-fluorofenil)-36-
dihidropiridin-1(2H)-il)propan-1-ol
Procedimiento experimental
Seguacuten el meacutetodo general E partiendo de 015 g (041 mmol) de 1-
(benzo[b]tiofen-3-il)-3-[4-(4-fluorofenil)-36-dihidropiridin-1(2H)-il] propan-1-
ona Despueacutes se elimina el disolvente y se obtiene un soacutelido impuro que se
purifica precipitando el hidrocloruro con eacuteter clorhiacutedrico
Punto fusioacuten 204-206ordmC
IR (cm-1) 3385 (d OH) 2924-2851 (f C-H alifaacuteticos)
RMN-1H (DMSO 400 MHz) δ (ppm) 229-30 (m 2H CHOH-CH2) 274- 281
(m 2H CHOH-CH2-CH2) 337-340 (m 2H H6 PIRD) 366-377 (m 3H
H2+H5ax PIRD) 40 (d 1H H5ec PIRD) 509 (sa 1H CHOH) 620 (s 1H H3
PIRD) 723 (d 2H H3rsquo+ H5rsquo FENIL J3acute2acute= J5acute6acute= 90 Hz) 738-74 (m 2H H2rsquo+ H6rsquo
FENIL) 750 (dd 2H H6+H5 BTF J65= J56= 80 Hz J54= J67= 71 Hz) 760 (s 1H
H2 BTF) 800 (dd 2H H4 +H7 BTF J45= J76= 70 Hz J6= J75= 18 Hz) 105 (sa
1H HCl)
Anaacutelisis elemental (CHN)
HPLC (RP-18 1 mLmin metanol-agua (8020)) tr 426 min ʎmax 2282 nm
Calculado Hallado
C 640 6389
H 551 575
N 339 325
FM C22H22NFOSHCl PM 4405 Apariencia Soacutelido blanco
Rendimiento 65
1g
Descripcioacuten de Compuestos
146
1-(5-fluorobenzo[b]tiofen-3-il)-3-[4-(4-nitro-2-
trifluorometilfenil)piperazin-1-il]propan-1-ol
Procedimiento experimental
Seguacuten el meacutetodo general E partiendo de 040 g (092 mmol) de 1-(5-
fluorobenzo[b]tiofen-3-il)-3-[4-(4-nitro-2-trifluorometilfenil)piperazin-1-
il]propan-1-ona Despueacutes de eliminar el disolvente se obtiene un soacutelido marroacuten
impuro que purificamos por cromatografiacutea flash en diclorometanometanol
(991)
Punto fusioacuten 140-142ordmC
IR (cm-1) 3426 (d OH) 2826 (d C-H alifaacuteticos) 1507 y 1329 (mf NO2) 1283 (mf
F-BZT)1240 y 1122 (f CF3)
RMN-1H (CDCl3 400 MHz) δ (ppm) 206-215 (m 2H CHOH-CH2) 274-283
(sa 3H H3ax+H5ax PIPZ+ CHOH-CH2-CH2) 292-386 (m 3H H3ec+H5ec PIPZ+
CHOH-CH2-CH2) 324 (t 4H H2+H6 PIPZ) 530 (dd 1H CHOH JCH-OH = 74
Hz JCH-CH = 39 Hz) 713 (dt 1H H6 FBZT J67 = 87 Hz J6F = 83 Hz J64 = 25
Hz) 735 (d 1H H6acute FENIL J6acute5acute= 90 Hz) 752 (dd 1H H4 FBZT J4F = 95 Hz J46
= 28 Hz) 751 (s 1H H2 FBZT) 780 (dd 1H H7 FBZT J76 = 88 Hz J7F = 49
Hz) 838 (dd 1H H5rsquo FENIL J5acute6acute = 89 Hz J5acute3acute = 27 Hz) 855 (d 1H H3rsquo FENIL
J3acute5acute = 27 Hz)
Anaacutelisis elemental (CHN)
HPLC (RP-18 1 mLmin metanol-agua (8020)) 554 min ʎmax= 2283 nm
Calculado Hallado
C 5446 5483
H 434 444
N 869 920
FM C22H21N3F4O3S PM 4835 Apariencia Soacutelido amarillo Rendimiento 21
2a
Descripcioacuten de Compuestos
147
Hidrocloruro de 1-(5-fluorobenzo[b]tiofen-3-il)-3-[4-(2-nitro-4-
trifluorometilfenil)piperazin-1-il]propan-1-ol
Procedimiento experimental
Seguacuten el meacutetodo general E partiendo de 031 g (086 mmol) de 1-(5-
fluorobenzo[b]tiofen-3-il)-3-[4-(2-nitro-4-trifluorometilfenil)piperazin-1-
il]propan-1-ona se obtiene tras la eliminacioacuten del disolvente un aceite impuro
que se purifica por cromatografiacutea flash con diclorometanometanol (991) El
aceite puro precipita como hidrocloruro con eacuteter clorhiacutedrico
Punto de fusioacuten 196-198ordmC
IR (cm-1) 3408 (d OH) 2968-2814 (d C-H alifaacuteticos) 1533 y 1329 (mf NO2)
1230 y 1112 (f CF3)
RMN-1H (DMSO-d6 400 MHz) δ (ppm) 206 (sa 2H CHOH-CH2) 292 (sa
4H H2+H6 PIPZ) 324 (sa 4H H3+H5 PIPZ) 37 (sa 2H CHOH-CH2-CH2) 50
(sa 1H CHOH) 726 (dt 1H H6 FBZT J6F = 91 Hz J67 = 88 Hz J64 = 22 Hz)
749 (d 1H H6acute FENIL J6acute5acute= 85 Hz) 772 (s 1H H2 FBZT) 777 (d 1H H4
FBZT J4F = 102 Hz) 790 (d 1H H5acute FENIL J5acute6acute = 84 Hz) 802 (dd 1H H7
FBZT J76 = 89 Hz J7F = 51 Hz ) 820 (s 1H H3acute FENIL)
Anaacutelisis elemental (CHN)
HPLC (RP-18 1 mLmin metanol-agua (8020)) 445 min ʎmax=2308 nm
Calculado Hallado
C 5081 5121
H 423 375
N 808 811
FM C22H21N3F4O3S HCl PM 5195 Apariencia Soacutelido amarillo Rendimiento 20
2b
Descripcioacuten de Compuestos
148
1-(5-fluorobenzo[b]tiofen-3-il)-3-[4-(4-
trifluorometilfenil)piperazin-1-il]propan-1-ol
Procedimiento experimental
Seguacuten el meacutetodo general E partiendo de 053 g de 1-(5-fluorobenzo[b]tiofen-3-
il)-3-[4-(4-trifluorometilfenil)piperazin-1-il]propan-1-ona se obtiene en la
eliminacioacuten del disolvente un aceite impuro que se purifica por cromatografiacutea
flash con diclorometanometanol (991)
Punto de fusioacuten 158-160ordmC
IR (cm-1) 2961-2831 (d C-H alifaacuteticos) 1248 y 1115 (f CF3)
RMN-1H (CDCl3 400 MHz) δ (ppm) 221 (sa 2H CHOH-CH2) 282 (sa 3H
H3ax+H5ax PIPZ +CHOH-CH2-CH2) 293-294 (m 3H H3ec+H5ec PIPZ + CHOH-
CH2-CH2) 345 (sa 4H H2+H6 PIPZ) 532 (dd 1H CHOH JCH-OH = 41 Hz JCH-
CH = 67 Hz) 696 (d 2H H6+H7 FBZT J67 = J76 = 84 Hz) 710-715 (m 1H H4
FBZT) 750-754 (m 4H H2acute+H3acute+H5acute+H6acute FENIL) 780 (sa 1H H2 FBZT)
Anaacutelisis elemental (CHN)
HPLC (RP-18 1 mLmin metanol-agua (8020)) tr 466 min ʎmax 2005 nm
Calculado Hallado
C 6027 5930
H 502 495
N 639 624
FM C22H22N2F4OS
PM 4385 Apariencia Soacutelido blanco Rendimiento 15
2c
Descripcioacuten de Compuestos
149
1-(5-fluorobenzo[b]tiofen-3-il)-3-[4-(4-nitro-2-trifluorometilfenil)-
14-diazepan-1-il]propan-1-ol
Procedimiento experimental
Seguacuten el meacutetodo general E partiendo de 039 g (080 mmol) de 1-(5-
fluorobenzo[b]tiofen-3-il)-3-[4-(4-nitro-2-trifluorometilfenil)-14-diazepan-1-
il]propan-1-ona se obtiene tras la eliminacioacuten del disolvente un aceite impuro
que se purifica por cromatografiacutea flash en diclorometanometanol (991)
Punto de fusioacuten 110-111ordmC
IR (cm-1) 3425 (m OH) 1500 y 1338 (mf NO2) 1280 (mf F-BZT)1257 y 1106 (f
CF3)
RMN-1H (CDCl3 400 MHz) δ (ppm) 208 (sa 4H CHOH-CH2+H6 DZP) 287-
293 (m 4H H2+H7 DZP) 298-299 (m 2H CHOH-CH2-CH2) 354 (sa 2H H5
DZP) 562 (sa 2H H3 DZP) 530 (t 1H CHOH JCH-OH = JCH-CH = 57 Hz) 712
(dd 1H H7 BZT J76= 88 Hz J7F= 24 Hz) 722 (d 1H H6acute FENIL J65acuteacute= 92 Hz)
750 (s 1H H2 FBZT) 751 (dd 1H H4 FBZT J4F= 98 Hz J46= 15 Hz) 780 (dd
1H H6 FBZT J67= 88 Hz J6F= 50 Hz) 828 (dd 1H H5acute FENIL J5acute6acute= 92 Hz
J5acute3acute= 27 Hz) 854 (s 1H H3acute FENIL)
Anaacutelisis elemental (CHN)
HPLC (RP-18 1 mLmin metanol-agua (8020)) 557 min ʎmax= 2308 nm
Calculado Hallado
C 5548 5515
H 462 464
N 844 826
FM C23H23N3O3F4S PM 4975 Apariencia Soacutelido amarillo Rendimiento 25
2d
Descripcioacuten de Compuestos
150
1-(5-fluorobenzo[b]tiofen-3-il)-3-[1-(4-nitro-2-
trifluorometilfenil)piperidin-4-il]amino propan-1-ol
Procedimiento experimental
Seguacuten el meacutetodo general E partiendo de 017 g (034 mmol) de 1-(5-
fluorobenzo[b]tiofen-3-il)-3-[1-(4-nitro-2-trifluorometilfenil)piperidin-4-
il]aminopropan-1-ona se obtiene tras la eliminacioacuten del disolvente un aceite
impuro que se purifica por cromatografiacutea flash en diclorometanometanol
(991)
Punto de fusioacuten 140-142ordmC
IR (cm-1) 3425 (m OH) 1498 y 1334 (mf NO2) 1283 (mf F-BTF)1283 y 1106 (f
CF3)
RMN-1H (CDCl3 400 MHz) δ (ppm) 156-171 (m 2H H3ax+H5ax PIPR) 195-
197 (m 2H CHOH-CH2) 211 (sa 2H H3ec+H5ec PIPR) 275 (sa 1H H4 PIPR)
295 (t 2H H2ax+H6ax PIPR J2ax2ec= J6ax6ec= 97 Hz) 313 (sa 2H CHOH-CH2-
CH2) 342 (d 2H H2ec+H6ec PIPR J2ec2ax= J6ec6ax= 90 Hz) 530 (d 1H CHOH JCH-
OH = 77 Hz) 712 (t 1H H6 FBZT J6F = J67 = 77 Hz) 729 (d 1H H6acute FENIL J6acute5acute=
86 Hz) 750 (dd 1H H4 FBZT J4F = 85 Hz J46 = 49 Hz) 752 (s 1H H2 FBZT)
779 (dd 1H H7 FBZT J76 = 82 Hz J7F = 31 Hz) 833 (dd 1H H5rsquo FENIL J5acute6acute =
85 Hz J5acute3acute = 18 Hz) 853 (sa 1H H3rsquo FENIL)
Anaacutelisis elemental (CHN)
HPLC (RP-18 1 mLmin metanol-agua (8020)) 443 min ʎmax= 2299 nm
Calculado Hallado
C 5548 5555
H 481 462
N 826 844
FM C23H23N3O3F4S PM 49751 Apariencia Soacutelido amarillo Rendimiento 37
2f
Descripcioacuten de Compuestos
151
Hidrocloruro de 1-(2-naftil)-3-[4-(4-nitro-2-
trifluorometilfenil)piperazin-1-il]propan-1-ol
Procedimiento experimental
Seguacuten el meacutetodo general E partiendo de 033 g (066 mmol) de 1-(2-naftil)-3-[4-
(4-nitro-2-trifluorometilfenil)piperazin-1-il]propan-1-ona tras la eliminacioacuten del
disolvente se obtiene un aceite que precipita en forma de hidrocloruro con eacuteter
saturado de HCl
Punto de fusioacuten 183-185ordmC
IR (cm-1) 3185 (d OH) 2924-2851 (f C-H alifaacuteticos) 1509 y 1346 (mf NO2) 1279
y 1119 (f CF3)
RMN-1H (DMSO-d6 400 MHz) δ (ppm) 214 (sa 2H CHOH-CH2) 317 (sa
2H CHOH-CH2-CH2) 329-335 (m 6H H3ax+ H5ax+ H2+H6 PIPZ) 360 (sa 2H
H3ec+ H5ec PIPZ) 483-485 (m 1H CHOH) 749-752 (m 3H H6rsquo FENIL + H6+H7
NFT) 764 (d 1H H3 NFT J34 = 91 Hz) 786 (sa 1H H1 NFT) 788-792 (m 3H
H4+H5+H8 NFT ) 841 (d 1H H3acute FENIL J3acute5acute = 21 Hz) 846 (dd 1H H5rsquo FENIL
J5rsquo6rsquo = 92 Hz J5rsquo3rsquo = 19 Hz)
Anaacutelisis elemental (CHN)
HPLC (RP-18 1 mLmin metanol-agua (8020)) 762 min ʎmax= 2236 nm
Calculado Hallado
C 5812 5770
H 484 520
N 847 801
FM C24H24N3F3O3HCl PM 5325 Apariencia Soacutelido amarillo Rendimiento 50
3a
Descripcioacuten de Compuestos
152
Hidrocloruro de 1-(2-naftil)-3-[4-(2-nitro-4-trifluorometilfenil)
piperazin-1-il] propan-1-ol
Procedimiento experimental
Seguacuten el meacutetodo general E partiendo de 036 g (083 mmol) de 1-(2-naftil)-3-[4-
(2-nitro-4-trifluorometilfenil)piperazin-1-il]propan-1-ona tras la eliminacioacuten del
disolvente se obtiene un aceite que precipita en forma de hidrocloruro con eacuteter
saturado de HCl
Punto de fusioacuten 165ndash166 ordmC
IR (cm-1) 3250 (m OH) 2927-2873 (d C-H alifaacuteticos) 1534 y 1327 (mf NO2)
1280 y 1123 (f CF3)
RMN-1H (DMSO-d6 400 MHz) δ (ppm) 219-222 (m 2H CHOH-CH2) 316
(sa 4H H3+H5 PIPZ) 348 (sa 4H H2+H6 PIPZ) 358 (d 2H CHOH-CH2-CH2)
484-487 (m 1H CHOH) 574 (sa 1H OH) 747-752 (m 2H H6acuteFENIL+H3
NFT) 754 (sa 1H H7 NFT) 756 (sa 1H H6 NFT) 788-795 (m 5H
H1+H4+H5+H8 NFT+H5acute FENIL) 825 (sa 1H H3acute FENIL) 1110 (sa 1H HCl)
Anaacutelisis elemental (CHN)
HPLC (RP-18 1 mLmin metanol-agua (8020)) 457 min ʎmax= 2220 nm
Calculado Hallado
C 5663 5682
H 469 458
N 821 813
FM C24H24N3F3O3HCl PM 4960 Apariencia Soacutelido camel Rendimiento 63
3b
Descripcioacuten de Compuestos
153
Hidrocloruro de 1-(2-naftil)-3-[3-(4-nitro-2-trifluorometilfenil)-
pirrolidin-3-ilamino]propan-1-ol
Procedimiento experimental
Seguacuten el meacutetodo general E partiendo de 025 g (0546 mmol) de 1-(2-naftil)-3-[3-
(4-nitro-2-trifluorometilfenil)pirrolidin-3-ilamino]propan-1-ona tras la
eliminacioacuten del disolvente se obtiene un aceite que se precipita en forma de
hidrocloruro con eacuteter saturado de HCl
Punto de fusioacuten 180-182ordmC
IR (cm-1) 3422 (m OH) 2951-2793 (d C-H alifaacuteticos) 1580 y 1327 (mf NO2)
1286 y 1122 (f CF3)
RMN-1H (DMSO-d6 400 MHz) δ (ppm) 207-214 (m 2H CHOH-CH2) 229-
231 (m 1H H4ax PIRR) 236-241 (m 1H H4ec PIRR) 311 (sa 2H CHOH-CH2-
CH2) 357-364 (m 1H H2ax PIRR) 375-379 (m 2H H5ax+ H2ec PIRR) 385-389
(m 1H H5ec PIRR) 397 (sa 1H H3 PIRR) 590 (sa 1H CHOH) 576 (s 1H
OH) 710 (d 1H H6rsquo FENIL J6rsquo5rsquo = 87 Hz) 747-755 (m 3H H3 + H6+ H7 NFT)
786 (sa 1H H1 NFT) 790-792 (m 3H H4+ H5+ H8 NFT) 824-890 (d 1H H5rsquo
FENIL J5rsquo6rsquo = 89 Hz) 840 (sa 1H H3rsquo FENIL) 949 (sa 1H NH)
Anaacutelisis elemental (CHN)
HPLC (RP-18 1 mLmin metanol-agua (8020)) 115 min ʎmax= 2238 nm
Calculado Hallado
C 5631 5650
H 492 523
N 821 821
FM C24H24N3F3O3HCl PM 4961 Apariencia Soacutelido anaranjado
Rendimiento 38
3e
Descripcioacuten de Compuestos
154
3-[4-(4-fluorofenil)-36-dihidropiridin-1(2H)-il]-1-(naftalen-2-
il)propan-1-ol
Procedimiento experimental
Seguir el meacutetodo general E partiendo de 030 g (084 mmol) de 3-[4-(4-
fluorofenil)-36-dihidropiridin-1(2H)-il)]-1-(naftalen-2-il)propan-1-ona se
obtiene tras la eliminacioacuten del disolvente un aceite impuro que puede
purificarse por cromatografiacutea flash en diclorometano-metanol (991)
Punto de fusioacuten 127-129ordmC
IR (cm-1) 3510 (d OH) 2833 (m C-H alifaacuteticos)
RMN-1H (CDCl3 400 MHz) δ (ppm) 199-212 (m 2H CHOH-CH2) 264 (s
2H H6 PIRD) 272-296 (m 4H H2+H5 PIRD) 331 (d 2H CHOH-CH2-CH2 JCH-
CH= 167 Hz) 517 (sa 1H CH-OH) 602 (s 1H H3 PIRD) 704 (t 2H H3acute+ H5acute
FENIL J3acute2acute= J5acute6acute= 87 Hz) 737 (dd 2H H2acute+ H6acute FENIL J2acute3acute= J6acute5acute= 87 Hz
J2acuteF= J6acuteF= 54 Hz) 745-750 (m 2H H6 + H7 NFT) 751 (dd 1H H8 NFT J87= 74
Hz J86=16 Hz) 785 (d 2H H3+ H4 NFT J34acute= J43acute=83 Hz) 787 (dd 1H H5
NFT J56= 78 Hz J57=23 Hz) 791 (s 1H H1 NFT)
Anaacutelisis elemental (CHN)
HPLC (RP-18 1 mLmin metanol-agua (8020)) tr 468 min ʎmax 2196 nm
Calculado Hallado
C 7783 7787
H 662 682
N 378 330
FM C24H24NFO PM 3615 Apariencia Soacutelido blanco Rendimiento 23
3g
Descripcioacuten de Compuestos
155
1-(2-naftil)-2-[4-(2-nitro-4-trifluorometilfenil)piperazin-1-il]etan-1-
ol
Procedimiento experimental
Seguacuten el meacutetodo general E partiendo de 038 g (086 mmol) de 1-(2-naftil)-2-[4-
(2-nitro-4-trifluorometilfenil)piperazin-1-il]propan-1-ona se obtiene tras la
eliminacioacuten del disolvente un aceite impuro que se puede purificar
precipitando el compuesto con hexano
Punto de fusioacuten 134ndash135 ordmC
IR (cm-1) 3408 (d OH) 2968-2814 (d C-H alifaacuteticos) 1533 y 1329 (mf NO2)
1230 y 1112 (f CF3)
RMN-1H (DMSO-d6 400 MHz) δ (ppm) 275-281 (m 4H H3+H5 PIPZ) 303
(sa 2H CHOH-CH2) 326-331 (m 2H H2+H6 PIPZ) 504 (dd 1H CHOH) 721
(d 1H H6acute FENIL J6acute5acute = 87 Hz) 749-752 (m 3H H3+H6+H7 NFT) 771 (dd
1H H5acute FENIL J5acute6acute = 87 Hz J5acute3acute = 19 Hz) 786 (sa 1H H1 NFT) 787 (dd 1H
H8 NFT J87 = 79 Hz J86 = 15 Hz) 788 (d 1H H4 NFT J43 = 55 Hz) 790 (sa
1H H5 NFT) 811 (d 1H H3acute FENIL J3acute5acute = 19 Hz)
Anaacutelisis elemental (CHN)
HPLC (RP-18 1 mLmin metanol-agua (8020)) 566 min ʎmax= 2228 nm
Calculado Hallado
C 6202 6226
H 494 512
N 944 914
FM C23H22N3F3O3 PM 4454 Apariencia Soacutelido amarillo Rendimiento 78
4b
Descripcioacuten de Compuestos
156
1-(4-fluoronaftil)-3-[4-(4-nitro-2-trifluorometilfenil)piperazin-1-
il]propan-1-ol
Procedimiento experimental
Seguacuten el meacutetodo general E partiendo de 053 g (107 mmol) de 1-(4-
fluoronaftil)-3-[4-(4-nitro-2-trifluorometilfenil)piperazin-1-il]propan-1-ona se
obtiene tras la eliminacioacuten del disolvente un aceite impuro que se purifica por
cromatografiacutea flash usando como fase moacutevil diclorometanometanol (991)
Punto de fusioacuten 183-184ordmC
IR (cm-1) 3447 (d OH) 2931-2836 (d C-H alifaacuteticos) 1513 y 1338 (f NO2) 1283
y 1119 (f CF3)
RMN-1H (CDCl3 400 MHz) δ (ppm) 206-214 (m 2H CHOH-CH2) 274-280
(m 3H H5 PIPZ+ CHOH-CH2-CH2) 288-294 (m 3H H3 PIPZ+ CHOH-CH2-
CH2) 327 (t 4H H2+H6 PIPZ J23= J65= 467 Hz) 571 (dd 1H CHOH JCH-CH =
81 Hz JCH-CH = 27 Hz) 718 (dd 1H H3 FNFT J3F = 102 Hz J32= 80 Hz) 735
(d 1H H6acute FENIL J6acute5acute = 89 Hz) 767-771 (m 2H H6+H7 FNFT) 769 (dd 1H
H2 FNFT J23 = 79 Hz J2F= 56 Hz) 804 (d 1H H8 FNFT J87 = 80 Hz) 817 (dd
1H H5 FNFT J56 = 76 Hz J5F = 21 Hz) 838 (dd 1H H5acute FENIL J5acute6acute = 89 Hz
J5acute3acute = 27 Hz) 855 (d 1H H3acute FENIL J3acute5acute = 27 Hz)
Anaacutelisis elemental (CHN)
HPLC (RP-18 1 mLmin metanol-agua (8020)) 703 min ʎmax= 2217 nm
Calculado Hallado
C 6038 6015
H 482 486
N 880 878
FM C24H23N3F4O3 PM 4775 Apariencia Cristales amarillos Rendimiento 51
5a
Descripcioacuten de Compuestos
157
1-(4-fluoronaftil)-3-[4-(2-nitro-4-trifluorometilfenil)piperazin-1-
il]propan-1-ol
Procedimiento experimental
Seguacuten el meacutetodo general E partiendo de 049 g (102 mmol) de 1-(4-
fluoronaftil)-3-[4-(2-nitro-4-trifluorometilfenil)piperazin-1-il]propan-1-ona se
obtiene tras la eliminacioacuten del disolvente un aceite impuro que se purifica al
lavarlo con hexano
Punto de fusioacuten 147ndash148 ordmC
IR (cm-1) 3430 (m OH) 2957-2835 (d C-H alifaacuteticos) 1533 y 1330 (mf NO2)
1278 y 1125 (f CF3)
RMN-1H (DMSO-d6 400 MHz) δ (ppm) 208-218 (m 2H CHOH-CH2) 283
(sa 3H H5 PIPZ+ CHOH-CH2-CH2) 295 (sa 3H H3 PIPZ+ CHOH-CH2-CH2)
332 (sa 4H H2+H6 PIPZ) 571 (dd 1H CHOH) 718 (dd 1H H3 FNFT J3F =
102 Hz J32 = 81 Hz) 723 (d 1H H6acute FENIL J6acute5acute = 87 Hz) 754-762 (m 2H
H6+H7 FNFT) 768 (dd 1H H2 FNFT J23 = 80 Hz J2F = 56 Hz) 774 (dd 1H
H5acute FENIL J5acute6acute = 87 Hz J5acute3acute = 19 Hz) 805 (dd 1H H5 FNFT J56 = 82 Hz J5F =
17 Hz) 811 (d 1H H3acute FENIL J3acute5acute = 19 Hz) 817 (dd 1H H8 FNFT J87 = 86
Hz J86 = 29 Hz)
Anaacutelisis elemental (CHN)
HPLC (RP-18 1 mLmin metanol-agua (8020)) 556 min ʎmax= 2222 nm
Calculado Hallado
C 6038 6012
H 482 505
N 881 862
FM C24H23N3F4O3 PM 4775 Apariencia Soacutelido amarillo Rendimiento 90
5b
Descripcioacuten de Compuestos
158
Hidrocloruro de 1-(4-fluoronaft-1-il)-3-[4-(4-trifluorometilfenil)
piperidin-1-il] propan-1-ol
Procedimiento experimental
Seguacuten el meacutetodo general E partiendo de 010 g de 1-(4-fluoronaftalen-1-il)-3-[1-
(4-trifluorometilfenilpiperidin-4-il)amino]propan-1-ona se obtiene tras la
eliminacioacuten del disolvente un aceite impuro que se purifica por cromatografiacutea
flash en diclorometanometanol (991) y se precipita como hidrocloruro con
eacuteter saturado de HCl
Punto de fusioacuten 174-175ordmC
IR (cm-1) 3436 (m OH) 2983 (d C-H alifaacuteticos) 2396 (d HCl) 1333 (f N-C)
1118 (mf CF3)
RMN-1H (DMSO-d6 400 MHz) δ (ppm) 221 (d 2H CHOH-CH2) 320-360
(m 6H CHOH-CH2-CH2+ H3+H5 PIPZ) 355 (sa 2H H2ax+H6ax PIPZ) 397 (sa
2H H2ec+H6ec PIPZ) 541 (d 1H CH-OH JCH-CH=75 Hz) 590 (sa 1H OH) 713
(d 2H H6acute+H2acute FENIL J6acute5acute= J2acute3acuteacute= 81 Hz) 736 (dd 1H H3 FNFT J32= 82 Hz
J3F= 97 Hz) 756 (d 2H H6+H7 FNFT J67= J76acute= 84 Hz) 767 (sa 3H H2
FNFT+H3acute+H5acute FENIL) 810 (d 1H H5 FNFT J56 = 66 Hz) 829 (d 1H H8
FNFT J87= 88 Hz) 1112 (sa 1H HCl)
Anaacutelisis elemental (CHN)
HPLC (RP-18 1 mLmin metanol-agua (8020)) 850 min ʎmax= 2266 nm
Calculado Hallado
C 6147 6135
H 539 482
N 598 596
FM C24H24N2F4OHCl PM 4690 Apariencia Soacutelido blanco Rendimiento 45
5c
Descripcioacuten de Compuestos
159
1-(4-fluoronaft-1-il)-3-[1-(4-nitro-2-trifluorometilfenilpiperidin-4-
il)amino]propan-1-ol
Procedimiento experimental
Seguacuten el meacutetodo general E partiendo de 04106 g (084 mmol) de 1-(4-
fluoronaft-1-il)-3-[1-(4-nitro-2-trifluorometilfenilpiperidin-4-il)amino] propan-1-
ona se obtiene tras la eliminacioacuten del disolvente un aceite impuro que se
purifica por cromatografiacutea flash en diclorometanometanol (991)
Punto de fusioacuten 93-95ordmC
IR (cm-1) 3352 (m OH) 1524 y 1318 (mf NO2) 1280 y 1171 (f CF3)
RMN-1H (CDCl3 400 MHz) δ (ppm) 168-183 (m 2H H3ax+ H5ax PIPR) 186-
201 (m 2H CHOH-CH2) 215-223 (m 2H H3ec+H5ec PIPR) 212 (d 1H CH-
OH JCH-CH= 127 Hz) 275-284 (m 1H H4 PIPR) 298 (t 2H H2ax+ H6ax PIPR
J2ax2ec = J6ax6ec = 115 Hz) 300-303 (m 1H CHOH-CH2-CH2) 308-315 (m 1H
CHOH-CH2-CH2) 342 (d 2H H2ec+H6ec PIPR) 571 (dd 1H CHOH JCHCH =
82 Hz JCH-CH2 = 23 Hz) 717 (dd 1H H3 FNFT J3F = 102 Hz J32 = 81 Hz)
727-730 (m 1H H6acute FENIL) 753-761 (m 2H H6+H7 FNFT) 767-772 (m 1H
H2 FNFT) 804 (d 1H H8 FNFT J87 = 78 Hz) 816 (dd 1H H5 FNFT J56 =72 Hz
J5F = 33 Hz ) 833 (dd 1H H5acute FENIL J5acute6acute = 90 Hz J5acute3acute = 27 Hz ) 853 (d 1H
H3acute FENIL J3acute5acute = 27 Hz)
Anaacutelisis elemental (CHN)
HPLC (RP-18 1 mLmin metanol-agua (8020)) tr 464 min ʎmax 2230 nm
Calculado Hallado
C 6111 6077
H 543 543
N 855 830
FM C25H25N3O3F4 PM 4910 Apariencia Soacutelido amarillo Rendimiento 90
5f
Descripcioacuten de Compuestos
160
1-(4-fluoronaftalen-1-il)-3-[4-(4-fluorofenil)-36-dihidropiridin-
1(2H)-il]propan-1-ol
Procedimiento experimental
Seguacuten el meacutetodo general E partiendo de 043 g (114 mmol) de 1-(4-
fluoronaftalen-1-il)-3-[4-(4-fluorofenil)-36-dihidropiridin-1(2H)-il]propan-1-
ona se obtiene tras la eliminacioacuten del disolvente un soacutelido blanco que precipita
con hexanoeacuteter
Punto de fusioacuten 162-163ordmC
IR (cm-1) 2828 (d C-H alifaacuteticos) 1509 (f F-BZN) 1227 (mf F-NFT)
RMN-1H (DMSO-d6 400 MHz) δ (ppm) 214-220 (m 2H CHOH-CH2) 273
(sa 2H H6 PIRD) 284-312 (m 4H CHOH-CH2-CH2+H5 PIRD) 341 (d 1H
H2ax PIRD J2ax 2ec=164 Hz) 347 (d 1H H2ec PIRD J2ec2ax=161 Hz) 574 (sa 1H
CHOH) 600-605 (m 1H H3 PIRD) 700-708 (m 2H H2acute+H6acute FENIL) 718 (dd
1H H3 FNFT J3F= 102 Hz J32 = 81 Hz) 735-740 (m 2H H6+H7 FNFT) 754-
761 (m 2H H5acute+H3acute FENIL) 770 (dd 1H H2 FNFT J23= 80 Hz J2F = 56 Hz)
807 (d 1H H5 FNFT J56 = 82 Hz) 82 (dd 1H H8 FNFT J87= 70 Hz J86 = 25
Hz)
Anaacutelisis elemental (CHN)
Calculado Hallado
C 7595 7525
H 606 645
N 369 350
FM C24H23NF2O PM 3792 Apariencia Soacutelido blanco Rendimiento 82
5g
Descripcioacuten de Compuestos
161
Hidrocloruro de 1-(4-fluorofenil)-3-[4-(4-nitro-2-
trifluorometilfenilpiperazin-1-il]propan-1-ol
Procedimiento experimental
Seguacuten el meacutetodo general E partiendo de 036 g (107 mmol) de 1-(4-fluorofenil)-
3-[4-(4-nitro-2-trifluorometilfenil)piperazin-1-il]propan-1-ona se obtiene tras la
eliminacioacuten del disolvente un aceite impuro que se precipita con hexanoeacuteter
El soacutelido que se obtiene se lava con eacuteter saturado de HCl
Punto de fusioacuten 163-165ordmC
IR (cm-1) 3348 (m OH) 2928-2848 (d C-H alifaacuteticos) 1519 y 1352 (f NO2) 1284
y 1120 (f CF3)
RMN-1H (DMSO-d6 400 MHz) δ (ppm) 209 (sa 2H CHOH-CH2) 315-320
(m 4H H3+H5 PIPZ) 335-344 (m 4H H2+H6 PIPZ) 360 (sa 2H CHOH-CH2-
CH2) 469 (s 1H CHOH) 565 (s 1H OH) 718 (t 2H H3+H5 FBZN J32 = J56=
81 Hz) 742 (dd 2H H2+H6 FBZN J23 = J65= 80 Hz J2Facute= J6F= 66 Hz) 764 (d
1H H6acute FENIL J6acute5acute = 90 Hz) 842 (s 1H H3acute FENIL) 847 (d 1H H5acute FENIL
J5acute6acute = 88 Hz) 1120 (sa 1H HCl)
Anaacutelisis elemental (CHN)
HPLC (RP-18 1 mLmin metanol-agua (8020)) tr 206 min ʎmax 2011 nm
Calculado Hallado
C 4984 4950
H 477 476
N 872 863
FM C20H21N3F4O3HCl PM 4659 Apariencia Soacutelido amarillo Rendimiento 20
6a
Descripcioacuten de Compuestos
162
Hidrocloruro de 1-(4-fluorofenil)-3-[1-(4-nitro-2-
trifluorometilfenil)piperidin-4-il)amino]propan-1-ol
Procedimiento experimental
Seguacuten el meacutetodo general E partiendo de 010 g (021 mmol) de 1-(4-fluorofenil)-
3-[1-(4-nitro-2-trifluorometilfenilpiperidin-4-il)amino]propan-1-ona se obtiene
en la eliminacioacuten del disolvente un aceite impuro que se purifica como
hidrocloruro lavando con eacuteter saturado de HCl
Punto de fusioacuten 185-187ordmC
IR (cm-1) 3425 1498 y 1334 (mf NO2) 1283 (mf F BZN)1283 y 1106 (f CF3)
RMN-1H (DMSO-d6 400 MHz) δ (ppm) 138 (sa 2H H3ax+ H5ax PIPR) 170
(sa 2H H3ec+H5ec PIPD) 190 (d 2H CHOH-CH2 JCH-CH= 110 Hz) 258 (sa 1H
H4 PIPR) 263-264 (m 2H H2ax+ H6ax PIPR) 295 (t 2H H2ec+H6ec PIPR J2ec2ax =
J6ec6ax = 121 Hz) 320-330 (m 2H CHOH-CH2-CH2) 469 (t 1H CHOH JCHOH-
CHCH = 90 Hz) 713 (t 2H H3+H5 FBZN J32 = J56= 81 Hz) 736 (sa 2H H2+H6
FBZN) 750 (d 1H H6acute FENIL J6acute5acute = 80 Hz) 837 (sa 2H H3acute+H5acute FENIL)
Anaacutelisis elemental (CHN)
HPLC (RP-18 1 mLmin metanol-agua (8020)) tr 1977 min ʎmax 2011 nm
Calculado Hallado
C 5251 5213
H 503 491
N 880 849
FM C21H23N3F4O3HCl PM 4799 Apariencia Soacutelido amarillo Rendimiento 11
6f
Descripcioacuten de Compuestos
163
1-(4-fluorofenil)-3-[4-(4-fluorofenil)-36-dihidropiridin-1(2H)-
il]propan-1-ol
Procedimiento experimental
Seguir el meacutetodo general E partiendo de 090 g (027 mmol) de 1-(4-fluorofenil)-
3-(4-(4-fluorofenil)-56-dihidropiridin-1(2H)-il)propan-1-ona y se obtiene tras la
eliminacioacuten del disolvente un aceite impuro que se purifica por cromatografiacutea
flash en diclorometanometanol (991) El soacutelido obtenido se recristaliza de
hexano para su total purificacioacuten
Punto de fusioacuten 199-201ordmC
RMN-1H (DMSO-d6 400 MHz) δ (ppm) 176-180 (m 2H CHOH-CH2) 245
(sa 4H CHOH-CH2-CH2+H5 PIRD) 257-262 (m 2H H6 PIRD) 306 (sa 2H
H2 PIRD) 466 (t 1H CHOH JCH-OH=63 Hz) 549 (sa 1H OH) 612 (sa 1H H3
PIRD) 714 (dd 4H H3acute+H5acute FENIL+ H3+H5 FBZN J3acuteF= J5acuteF= J3F= J5F = 126 Hz
J3acute2acute= J5acute6acute= J32= J56 = 80 Hz) 737 (dd 2H H2+H6 FBZN J23= J65= 79 Hz J2F=
J6F= 60 Hz) 746 (dd 2H H2acute+H6acute FENIL J2acute3acute= J6acute5acute= 77 Hz J2acuteF= J6acuteF= 55 Hz)
Anaacutelisis elemental (CHN)
Calculado Hallado
C 7242 7196
H 634 633
N 422 403
FM C20H21NF2O PM 3314 Apariencia Soacutelido blanco Rendimiento 2
6g
Descripcioacuten de Compuestos
164
3-[4-(4-fluorofenil)-36-dihidropiridin-1(2H)-il]-1-(4-
trifluorometilfenil)propan-1-ol
Procedimiento experimental
Seguacuten el meacutetodo general E partiendo de 013 g (034 mmol) de 1-(4-
fluoronaftalen-1-il)-3-[1-(4-nitro-2-trifluorometilfenilpiperidin-4-
il)amino]propan-1-ona se obtiene tras la eliminacioacuten del disolvente se obtiene
un soacutelido blanco que se lava con hexano eacuteter y se recristaliza de hexano
Punto de fusioacuten 116-117ordmC
IR (cm-1) 2912- 2761 (C-H alifaacuteticos) 1511 (f F) 1328 y 1127 (f CF3)
RMN-1H (DMSO-d6 400 MHz) δ (ppm) 181 (dd 2H CHOH-CH2 JCH-CH=
137 Hz JCH-CHOH= 73 HZ) 245-250 (m 4H CHOH-CH2-CH2+H5 PIRD) 262 (t
2H H6 PIRD JCH-CH= JCH-CH=55 Hz) 308 (s 2H H2 PIRD) 475-480 (m 1H
CHOH) 570 (sa 1H OH) 612 (s 1H H3 PIRD) 715 (t 2H H5acute+H3acute FENIL
J5acuteF=J3acuteF= 88 Hz J5acute6acute= J3acute2acute =88 Hz) 747 (dd 2H H6acute+H2acute FENIL J6acute5acute=J2acute3acute= 84
Hz J6acuteF= J2acuteF =56 Hz) 757 (d 2H H2+H6 TFBZN J23acute=J65= 79 Hz) 768 (d 2H
H3+H5 TFBZN J32acute=J56= 81 Hz)
Anaacutelisis elemental (CHN)
HPLC (RP-18 1 mLmin metanol-agua (8020)) tr 1027 min ʎmax 2418 nm
Calculado Hallado
C 6649 6601
H 554 567
N 370 381
FM C21H21NF4O
PM 379 Apariencia Agujas blancas Rendimiento 40
7g
Descripcioacuten de Compuestos
165
X4 Siacutentesis de Oximas (Serie 8)
1-(naftalen-2-il)-3-[4-(2-nitro-4-trifluorometilfenil)piperazin-1-
il]propan-1-oxima
Procedimiento experimental
Seguacuten el meacutetodo general F partiendo de 023 g (050 mmol) de 1-(2-naftil)-3-[4-
(2-nitro-4-trifluorometilfenil)piperazin-1-il]propan-1-ona se obtiene tras la
eliminacioacuten del disolvente un aceite impuro que se purifica por columna
cromatograacutefica con diclorometanometanol (973)
Punto de fusioacuten 185-187 ordmC
IR (cm-1) 1560 y 1328 (mf NO2) 1283 y 1120 (f CF3)
RMN-1H (DMSO-d6 400 MHz) δ (ppm) 254-264 (m 6H CNOH-CH2-
CH2+H3+H5 PIPZ) 303-309 (m 2H CNOH-CH2) 311-317 (m 4H H2+H6
PIPZ) 743 (d 1H H6acuteFENIL J6acute5acute= 88 Hz) 751-756 (m 2H H6+H7 NFT) 784
(dd 1H H5acute FENIL J5acute6acuteacute= 88 Hz J5acute3acuteacute= 17 Hz) 788-793 (m 3H H4+H5+H8
NFT) 798-802 (m 1H H3 NFT) 814 (sa 2H H1 NFT+H3acute FENIL) 1140 (sa
1H OH)
Anaacutelisis elemental (CHN)
HPLC (RP-18 1 mLmin metanol-agua (8020)) tr 464 min ʎmax 2391 nm
Calculado Hallado
C 6102 6114
H 487 521
N 1186 1163
FM C24H23N4F3O3 PM 4720 Apariencia Soacutelido camel Rendimiento 54
81
Descripcioacuten de Compuestos
166
1-(2-naftil)-3-[3-(4-nitro-2-trifluorometilfenil)pirrolidin-3-
ilamino]propan-1-oxima
Procedimiento experimental
Seguir el meacutetodo general F partiendo de 0350 g (0769 mmol) de 1-(2-naftil)-3-
[3-(4-nitro-2-trifluorometilfenil)pirrolidin-3-ilamino]propan-1-ona se obtiene
tras la eliminacioacuten del disolvente un soacutelido anaranjado que se lava con
diclorometano y eacuteter etiacutelico obtenieacutendose el compuesto puro
Punto de fusioacuten 129 - 130ordfC
IR (cm-1) 3441 (d OH) 2951-2834 (d C-H alifaacuteticos) 1503 y 1323 (mf NO2)
1285 y 1112 (f CF3)
RMN-1H (DMSO-d6 400 MHz) δ (ppm) 178-185 (m 1H H4ax PIRR) 202-209
(m 1H H4ec PIRR) 221 (sa 1H -NH-) 270-282 (m 2H CNOH-CH2-CH2) 300
(t 2H CNOH-CH2) 325 (dd 1H H3 PIRR) 343-351 (m 2H H2ax+ H2ec PIRR)
358-361 (m 2H H5 PIRR) 697 (d 1H H6acute FENIL J6acute5acute = 96 Hz) 751 (d 1H
H5 NFT J56 = 61 Hz) 752 (d 1H H8 NFT J87 = 61 Hz) 786 (sa 2H H3+H4
NFT) 788-794 (m 2H H6+H7 NFT) 813 (sa 1H H1 NFT) 815 (dd 1H H5acute
FENIL J5acute6acute = 94 Hz J5acute3acute = 27 Hz) 835 (d 1H H3acute FENIL J3acute5acute = 27 Hz)
Anaacutelisis elemental (CHN)
HPLC (RP-18 1 mLmin metanol-agua (8020)) 365 min ʎmax= 2360 nm
Calculado Hallado
C 5987 5954
H 502 474
N 1164 1157
FM C24H23N4O3F3 PM 472 Apariencia Soacutelido amarillo Rendimiento 45
82
Descripcioacuten de Compuestos
167
X5 Purificacioacuten de compuestos por cromatografiacutea flash
La cromatografiacutea flash ha sido utilizada como meacutetodo de purificacioacuten de
muchos de los compuestos de este trabajo Las condiciones elegidas para la
purificacioacuten han sido
- Fase Estacionaria Columnas de Siacutelica gel Rf RediSepreg de tamantildeo de
partiacutecula entre 35 y 70 micras y tamantildeo de poro 60 Aring
- Fase Moacutevil Diclorometanometanol de flujo isocraacutetico linear (Figuras 51 y
52) con un volumen de equilibrado de 20 mL
- Longitud de onda de deteccioacuten 254 nm en todas las muestras y 365 nm en
los compuestos que contienen el grupo naftaleno
- Tipo de muestra Liacutequidas cuando no
son muy complejas y soacutelidas cuando se
trata de purificacioacuten de mezclas
complejas e hidrocloruros
Figura 51 Informe graacutefico de la purificacioacuten compuesto 023
Figura 52 Informe graacutefico de la purificacioacuten compuesto 5f
De los 47 compuestos sintetizados 23 han sido purificados mediante
cromatografiacutea flash Este meacutetodo ha supuesto una mejora y simplificacioacuten del
proceso de siacutentesis asiacute como un ahorro de costes por la reduccioacuten de tiempos
solventes y residuos La purificacioacuten del resto ha sido realizada por
precipitacioacuten como hidrocloruros lavado del compuesto con hexanoeacuteter o
recristalizacioacuten con hexano
Tabla 3
Condiciones de trabajo empleadas en la figuras 51 y 52
Tiempo (min)
Metanol (B)
Teacutecnica de flujo
Compuesto 023
10 00 Isocraacutetico
1 25 Linear
15 25 Isocratico
1 5 Linear
30 5 isocraacutetico
Compuesto 5f
5 0 Isocraacutetico
1 25 Linear
15 25 Isocratico
1 5 Linear
30 5 isocraacutetico
Descripcioacuten de Compuestos
168
X6 Elucidacioacuten estructural de compuestos por RMN
Todos los compuestos sintetizados han sido identificados a traveacutes de teacutecnicas
de CCF IR y RMN-1H Los compuestos finales han sido caracterizados ademaacutes
mediante anaacutelisis elemental de CHN De este modo se ha podido determinar
inequiacutevocamente las estructuras orgaacutenicas de las moleacuteculas obtenidas y formar
un ldquoficha de identidadrdquo de cada compuesto
X61 Elucidacioacuten estructural para los derivados de piperazina
En el caso de que las teacutecnicas anteriores fueran insuficientes para la
caracterizacioacuten exacta de la moleacutecula se han empleado teacutecnicas
complementarias de RMN como RMN-13C 2D 1H-1H COSY y 2D HMQC Este
ha sido el caso del compuesto 5a (figura 53)
Figura 53 Estructura molecular del compuesto 5a ejemplo escogido para un anaacutelisis maacutes exhaustivo mediante experimentos de RMN
La espectroscopia de RMN revela el nuacutemero de hidroacutegenos o carbonos de la
moleacutecula y su posible posicioacuten A traveacutes de los distintos experimentos esta
teacutecnica permite identificar y asignar los distintos protones y carbonos presentes
en la moleacutecula mediante el anaacutelisis de los desplazamientos y multiplicidades
que muestra cada uno de ellos
Figura 54 RMN-1H del compuesto 5a
Descripcioacuten de Compuestos
169
Zona alifaacutetica
En la zona de hidroacutegenos alifaacuteticos se observan cuatro sentildeales
Figura 55 Regioacuten alifaacutetica de la RMN-1H
Los hidroacutegenos alifaacuteticos aparecen a desplazamientos bajos porque estaacuten
muy apantallados
El C1 es un carbono terciario y por tanto tiene un hidroacutegeno muy
desapantallado por el efecto del grupo OH dando una sentildeal a altos ppm como
queda sentildealada en naranja en la figura 55 Esta asignacioacuten facilita el poder
asociar los picos sentildealados en morado (Figura 55) con el metileno vecino C2 ya
que aparece a bajos ppm debido a su aumentado caraacutecter alifaacutetico El multiplete
obtenido integrado por dos hidroacutegenos aparece a 210 ppm Mediante el
espectro COSY (Figura 56) se puede comprobar siguiendo el trazado naranja
coacutemo siendo la sentildeal de CHOH la de 571 ppm se acopla con ella uacutenicamente la
de su vecino CHOH-CH2
Los hidroacutegenos pertenecientes al ciclo de piperazina se diferencian entre siacute por
el desplazamiento de las sentildeales seguacuten esteacuten maacutes o menos cercanos al grupo
fenilo Asiacute los protones H3p y H5p son los que aparecen a menores ppm A 277
ppm y a 291 ppm aparecen dos multipletes (sentildealados con azul en la figura 55)
que integran a tres hidroacutegenos cada uno lo cual resulta extrantildeo ya que en la
moleacutecula no hay ninguacuten CH3 Esto se debe a la diastereotopiacutea del carbono
hidroxiacutelico que hace que los 4 hidroacutegenos salgan divididos en dos sentildeales que
integran a dos hidroacutegenos cada una y a ambas se les suma uno de los
hidroacutegenos del C3 alifaacutetico Esto hace que aparezcan dos sentildeales que integran a
tres hidroacutegenos correspondientes a 2H3p 2H5p y los dos hidroacutegenos alifaacuteticos
Descripcioacuten de Compuestos
170
de C3 Si se siguen ahora las
liacuteneas moradas de la figura
55 se corrobora la
informacioacuten de que los
protones del C3 salen unidos
a las sentildeales de los protones
de H3 y H5 porque hay un
acoplamiento entre el C2 y
esas sentildeales
Figura 56 Espectro COSY Acoplamientos entre metilenos
Por uacuteltimo a 327 ppm se encuentra la sentildeal marcada con verde (figura 55)
correspondiente a 2H2 y 2H6 que integra por cuatro hidroacutegenos y aparece como
triplete debido a los acoplamientos con 2H3 y 2H5
Zona aromaacutetica
En esta moleacutecula se encuentran 9 hidroacutegenos aromaacuteticos no equivalentes lo
que dificulta la asignacioacuten de las sentildeales Como en el apartado anterior se
recurriraacute para estudiar los acoplamientos protoacuten-protoacuten y protoacuten-carbono a la
resonancia magneacutetica nuclear en dos dimensiones con el fin de asignar
inequiacutevocamente cada sentildeal
Figura 57 Resonancia magneacutetica nuclear de protoacuten de la zona aromaacutetica de la moleacutecula 5a
La dificultad de la asignacioacuten en esta moleacutecula se ve aumentada por la
presencia de un aacutetomo de fluacuteor en la parte del naftaleno En el espectro de
Descripcioacuten de Compuestos
171
RMN-1H el aacutetomo de fluacuteor no produce sentildeal pero siacute acoplamientos con los
hidroacutegenos vecinos obtenieacutendose constantes de acoplamiento (J) bastantes altas
y sentildeales desdobladas no esperadas en protones de su entorno
En la figura 57 lo primero que se observa son los altos desplazamientos de los
hidroacutegenos aromaacuteticos debido al menor apantallamiento de estos por su
naturaleza aromaacutetica
Teoacutericamente el espectro deberiacutea tener un singlete claro perteneciente a H3acute
pero no se encuentra ninguno en la figura 57 Asiacute que se puede pensar en un
desdoblamiento de la sentildeal por acoplamiento deacutebil a larga distancia con el H5acute
lo que mostrariacutea un doblete con acoplamiento muy bajo
En el espectro se encuentran tres dobletes sencillos Con las constantes de
acoplamiento a 850 ppm se ve este doblete que integra por uno y que tiene
una J = 27 Hz El otro doblete se encuentra a 804 ppm con una J = 80 Hz y el
maacutes bajo estaacute en 735 ppm con una J = 89 Hz Por el razonamiento inicial la
sentildeal a 850 ppm es la que deberiacutea asociarse con un acoplamiento a larga
distancia y por tanto con H3acute Esta informacioacuten puede ser contrastada con el
COSY
En el espectro bidimensional COSY se ha marcado en rojo el uacutenico
acoplamiento de H3acute que solo
pueda asociarse con la sentildeal
de H5acute Por tanto el doble
doblete a 838 ppm sentildealado
en la figura 56 de azul se
corresponde con H5acute
(informacioacuten verificada por
su constante de acoplamiento
menor J = 27Hz igual a la de
H3acute)
Figura 58 Espectro COSY de la zona aromaacutetica de la moleacutecula
Si ahora se sigue la liacutenea azul de la figura 58 donde se sentildealan los
acoplamientos de H5acute se puede ver un acoplamiento mayor con su uacutenico
hidroacutegeno vecino H6acute Asiacute tambieacuten queda asignada la sentildeal de este uacuteltimo que
se puede comprobar por comparacioacuten de las constantes de acoplamiento
(J5acute6acute=89 Hz y J6acute5acute=90 Hz)
Descripcioacuten de Compuestos
172
Para asignar los hidroacutegenos del naftaleno se debe tener en cuenta la presencia
del aacutetomo de fluacuteor De esta forma para los hidroacutegenos H2 H3 y H5 se puede
establecer teoacutericamente
que no se veraacuten como
dobletes sino dobles
dobletes en el espectro
de protoacuten En el COSY
(Figura 58) para una
primera aproximacioacuten
se seleccionan los tres
dobles dobletes de
protoacuten que solo tengan
un acoplamiento
Figura 59 Espectro COSY Zona aromaacutetica de la moleacutecula
Seguacuten la posicioacuten de H2 y H3 con por efecto del fluacuteor de la moleacutecula ademaacutes de
ser dobles dobletes el espectro COSY (Figura 58) debe mostrar dos sentildeales que
se acoplan entre ellas Por lo que se deduce que estos protones seraacuten los
sentildealados en azul y morado (figura 57) Si se recurre ahora a los valores de
acoplamiento se justifica la asignacioacuten ya que la sentildeal morada a 770 ppm
tiene una J = 79 Hz que se corresponde con la J = 81 Hz de la sentildeal azul a 720
ppm Ademaacutes estas sentildeales por la proximidad del fluacuteor tienen un segundo
valor de acoplamiento que en el caso de H3 seraacute muy alto y en H2 menor De
este modo se concluye que la sentildeal a 770 ppm corresponde a H2 y la sentildeal a
720 ppm a H3
La continuacioacuten de la asignacioacuten se centra en H6 y H7 Estos dos protones
teoacutericamente produciraacuten sentildeales como miacutenimo con multiplicidad de triplete ya
que son los uacutenicos que presentan tres protones diferentes en su entorno Como
no hay ninguacuten triplete en el espectro podemos pensar que sus sentildeales pudieran
aparecer juntas en el multiplete que se observa sentildealado en verde en la figura
57 a 750 ppm
Por otro lado queda por asociar las sentildeales a 817 ppm y a 804 ppm (Figura
57) correspondientes a un doble doblete y un doblete respectivamente Los
protones que quedan por asignar son H5 y H8 Se podriacutea pensar que H8 seriacutea un
doblete y H5 un doble doblete por efecto del fluacuteor como el caso de H2 Si se
estudian las J se verifica esta informacioacuten ya que la sentildeal a 817 ppm tiene una
constante de acoplamiento de 21 Hz muy pequentildea para pertenecer a un
Descripcioacuten de Compuestos
173
acoplamiento protoacutenndashprotoacuten aromaacutetico Por tanto se asigna a un acoplamiento a
larga distancia del H5 con
el fluacuteor sustituido en
posicioacuten 4 del NFT
Recurriendo al espectro
COSY (Figura 60) se
puede visualizar y
verificar estas cuatro
asignaciones ya que en
caso de ser correctas
deben acoplarse las
sentildeales doblete con el
uacutenico multiplete
Figura 60 Espectro COSY para la asignacioacuten de los H del naftaleno
Identificados todos los hidroacutegenos de la moleacutecula si se recurre ahora al
espectro HMQC (Figura 61) se pueden asignar directamente los carbonos no
cuaternarios presentes en la estructura esto se debe a que este experimento
bidimensional muestra el acoplamiento entre cada carbono y los protones
directamente unidos al mismo
Lo anterior se realiza siguiendo las liacuteneas de unioacuten entre el eje horizontal
espectro de RMN- 1H y el vertical que es el espectro de RMN-13C
Figura 61 Espectro HMQC Acoplamientos protoacuten-carbono
Descripcioacuten de Compuestos
174
Las asignaciones quedan de la siguiente forma
Zona aromaacutetica
C2
FNFT
C3
FNFT
C5
FNFT
C6
FNFT
C7
FNFT
C8
FNFT
C3
FENIL
C5
FENIL
C6
FENIL
RMN-
13C
(ppm)
12320 10912 12840 12725 12611 12311 12180 12491 12332
RMN-
1H
(ppm)
770 720 817 750 750 804 805 838 735
Zona alifaacutetica
C1
alifaacutetico
C2
alifaacutetico
C3
alifaacutetico C2 PIPZ C3 PIPZ C5 PIPZ C6 PIPZ
RMN-13C
(ppm) 7232 3295 5743 5350 5310 5310 5350
RMN-1H
(ppm) 571 210
Ha 290
Hb 278 291 327 327 270
De esta forma queda correctamente determinada la estructura de la moleacutecula
Con el anaacutelisis elemental (CHN) en uacuteltimo lugar se verifica el compuesto y se
determina la pureza del mismo
Descripcioacuten de Compuestos
175
X62 Elucidacioacuten estructural para los derivados de piperidina
El compuesto que se ha tomado como referencia en este caso es el 5f Se trata
de un derivado de FNFT que tiene como amina central una amino piperidina
En la figura 62 se muestra la estructura plana de la moleacutecula con los carbonos
alifaacuteticos diferenciados
Figura 62 Estructura del compuesto 5f con los diferentes carbonos alifaacuteticos coloreados
El espectro de protoacuten del compuesto se muestra en la figura 62
Figura 63 Resonancia de protoacuten del compuesto 5f
Por pertenencia al mismo grupo estructural el derivado 5f y el 5a tienen en
comuacuten los grupos aromaacuteticos de la estructura en consecuencia la zona
aromaacutetica de la moleacutecula ya ha quedado elucidada en el apartado anterior En
este apartado los estudios se centran en la descripcioacuten y asignacioacuten de sentildeales
de la regioacuten alifaacutetica que corresponden a la aminopiperidina En la figura 64 se
han destacado en distintos colores las diferentes sentildeales correspondientes a los
carbonos alifaacuteticos de la moleacutecula 5f
Descripcioacuten de Compuestos
176
Figura 64 Ampliacioacuten zona alifaacutetica de la resonancia de protoacuten del compuesto 5f
Para comenzar con la explicacioacuten de la asignacioacuten se revisa en primer lugar el
espectro DEPT-135 (Figura 65) de resonancia de la zona alifaacutetica donde quedan
diferenciados los carbonos terciarios que dan lugar a sentildeales positivas de los
secundarios que dan lugar a sentildeales negativas
Figura 65 DEPT 135 de la regioacuten aromaacutetica del compuesto 5f Coloreados los carbonos terciarios
En el espectro quedan sentildealados los carbonos terciarios que corresponden al
C1 y a C4p Los
desplazamientos se
mantienen en el espectro de
RMN-13C simple por lo que
en el espectro de HMQC se
puede obtener a queacute
hidroacutegenos van asociadas
las sentildeales de esos carbonos
(Figura 66)
Figura 66 HMQC alifaacutetica asignacioacuten de los carbonos terciarios
Descripcioacuten de Compuestos
177
Al trazar las liacuteneas de unioacuten se observa que la sentildeal de carbono a mayores ppm
corresponde con la de un H que integra a uno y que corresponde a la sentildeal que
aparece a mayores ppm Los H de C1 estaacuten muy desapantallados por el efecto
del OH asiacute la sentildeal a 571 ppm del espectro de protoacuten (Figura 64) corresponde al
CHOH De esta forma la otra sentildeal del C terciario corresponde con el H4 asiacute
trazando una liacutenea amarilla en el HMQC se puede asignar con seguridad la
sentildeal de ese H
Seguacuten el DEPT-135 (Figura 65) en torno a 30 ppm se pueden ver dos singletes
muy proacuteximos que corresponden a dos C secundarios y en torno a 50 ppm
aparece un singlete que integra dos sentildeales Seguacuten la estructura del compuesto
hay cuatro carbonos equivalentes dos a dos los CH2 y CH2 de la piperidina
que aparecen como singletes muy proacuteximos
Los carbonos C2p y C6p (H2+H6) aparecen a desplazamientos mayores como
C4p En el espectro de carbono el desplazamiento a 5230 ppm cumple estas
especificaciones y por tanto puede ser asignado a los CH2 En el HMQC
(Figura 67) al trazar una liacutenea verde desde RMN-13C al RMN-1H para unir las
sentildeales de acoplamiento C-H se comprueba que hay dos acoplamientos de
protoacuten con el mismo carbono Esta situacioacuten se produce porque los hidroacutegenos
de los metilenos no son equivalentes ya que espacialmente se disponen en
planos axiales y ecuatoriales seguacuten se representa en la figura 67
Figura 67 HMQC del compuesto 5f asignacioacuten H piperidina
Descripcioacuten de Compuestos
178
En la disposicioacuten espacial de miacutenima energiacutea en el vaciacuteo (Figura 68) los
hidroacutegenos de los carbonos de piperazina se disponen en diferentes planos Los
H axiales se encuentran
perpendiculares al plano del ciclo de
amina y los H ecuatoriales se
disponen en el mismo plano lo que
produce cambios en el entorno
quiacutemico que quedan reflejados en el
espectro de protoacuten (Figura 64)
Figura 68 Imagen 3D del compuesto 5f obtenida con Chemdraw 3D
La disposicioacuten adoptada hace que los H axiales esteacuten maacutes cerca entre siacute y se
produzcan acoplamientos fuertes con los H axiales vecinos y deacutebiles con los H
ecuatoriales del carbono al que pertenecen En el caso de los H ecuatoriales los
acoplamientos que se generan son deacutebiles con el H en axial del carbono propio
y en ocasiones acoplan muy deacutebilmente con los H ecuatoriales de carbonos
vecinos ya que se encuentran maacutes alejados Por esto en el espectro de esta
moleacutecula no se obtiene una uacutenica sentildeal que integra por cuatro hidroacutegenos sino
que se obtienen dos sentildeales que integran a dos H y que tienen distintas
multiplicidades
En el espectro de protoacuten en HMQC (Figura 67) siguiendo la liacutenea verde que
muestra el acoplamiento de C2p y C6p con los H se ven dos sentildeales a 342 ppm
y 291 ppm La sentildeal a 342 ppm es un doblete ancho con una J =121Hz que
seguacuten lo explicado corresponde a los CH2 (H2+H6) ecuatoriales El H2ec (y por
analogiacutea H6ec) se acopla solo con H2ax la amplitud de la sentildeal podriacutea explicarse
por el acoplamiento deacutebil con H3ec La sentildeal a 291 ppm es un triplete que se
asocia a H2 Y H6 axial ya que H2ax de acoplamientos fuertes con H3ax y H2ec
Las sentildeales de carbonos en 3274 ppm y 3303 ppm corresponden a los CH2 (H3
y H5) Por el razonamiento seguido para los metilenos 2 y 6 las sentildeales a 210
ppm y 160 ppm en el espectro de protoacuten corresponden a los H ecuatoriales y
axiales respectivamente
Los carbonos de la cadena alifaacutetica quedan asignados tambieacuten en base a los
desplazamientos del RMN-13C El C2 estaacute maacutes apantallado por el caraacutecter
alifaacutetico del entorno por lo que de las dos sentildeales que quedan por asignar la
que se obtiene a 3676 ppm corresponde al CHOH-CH2
Descripcioacuten de Compuestos
179
En el espectro HMQC (Figura 69) se obtiene para esta sentildeal CHOH-CH2
varios acoplamientos
correspondientes a
diferentes sentildeales
muacuteltiples a 200 ppm
y 212 ppm en el
espectro de protoacuten
Esto se debe tambieacuten
a la disposicioacuten
espacial de ambos H
como ocurre en el
caso de los H de la
amina
Figura 69 HMQC Asignacioacuten de los carbonos del puente de metilenos
Las sentildeales que quedan sin asignar pertenecen a C3 (sentildealado en rosa en la
figura CH2) a 4575 ppm que seguacuten el HMQC corresponde a los dos protones
que dan sentildeales como multipletes a 310 ppm y 300 ppm
La asignacioacuten de las sentildeales queda de la siguiente manera
Zona aromaacutetica
C2
FNFT
C3
FNFT
C5
FNFT
C6
FNFT
C7
FNFT
C8
FNFT
C3
FENIL
C5
FENIL
C6
FENIL
RMN-13C
(ppm) 12320 10912 12840 12725 12611 12311 12180 12491 12332
RMN-1H
(ppm) 770 720 817 750 750 804 805 838 735
Zona alifaacutetica
C1
alifaacutetico
C2
alifaacutetico
C3
alifaacutetico C2 PIPR C3 PIPR
C4
PIPR C5 PIPR C6 PIPR
RMN-13C
(ppm) 7259 3676 4575 5230 3303 5456 3274 5230
RMN-1H
(ppm) 571
Ha 212
Hb 200
Ha 319
Hb 300
Ha 342
Hb 298
Ha 210
Hb 160 280
Ha 210
Hb 160
Ha 342
Hb 298
De esta forma queda correctamente identificada la estructura del compuesto
5f
Descripcioacuten de Compuestos
180
X63 Elucidacioacuten estructural para los derivados de tetrahidropiridina
En este apartado se describen los compuestos 6g y 7g derivados de benceno
que tienen como amina central una tetrahidropiridina y como resto Ar2 un
benceno para-fluacuteor-sustituido En estos derivados la diferencia estructural que
cabe destacar estaacute en el resto Ar1 donde el 6g presenta un p-fluorobenceno
sustituido y el 7g un p-trifluorometileno (Figura 70)
Figura 70 Estructuras del compuesto 7g y 6g
Para la determinacioacuten estructural de estos compuestos se toma como punto
de partida la RMN-1H asignando las posibles sentildeales con sus correspondientes
protones El espectro de protoacuten de los compuestos se muestra en la figura 71
pudieacutendose comprobar su similitud
Figura 71 Espectro de RMN 1H del compuesto 6g y 7g respectivamente
Descripcioacuten de Compuestos
181
Zona Alifaacutetica
La regioacuten alifaacutetica de estas dos moleacuteculas son ideacutenticas por tanto las sentildeales
estaacuten a desplazamientos similares Estas moleacuteculas cuentan con cinco metilenos
de caraacutecter alifaacutetico y dos carbonos terciarios de los cuales C1 y C3p estaacuten muy
desapantallados por efecto tanto del OH
como por la pertenencia a una insaturacioacuten
como es el doble enlace de la
tetrahidropiridina Por las descripciones de
las zonas alifaacuteticas anteriores se puede
aproximar que el H perteneciente al C1
tendraacute un desplazamiento en torno a 500
ppm En la figura 72 queda sentildealada en
amarillo esta sentildeal a 470 ppm la otra sentildeal
de H sentildealada en naranja a un
desplazamiento 61 ppm corresponde al
protoacuten H3 de la tetrahidropiridina
Figura 72 Ampliacioacuten de RMN- 1H
La sentildeal pequentildea y ancha de entre ambas
sentildeales desaparece con agua deuterada por lo
que se identifica con el protoacuten del OH
El resto de sentildeales corresponden a la
tetrahidropiridina y el puente alifaacutetico En la
figura 73 se muestra ampliada la zona alifaacutetica
del espectro El estudio del espectro COSY
(Figura 74) ayudaraacute en la asignacioacuten de las
sentildeales
Figura 73 Ampliacioacuten RMN- 1H zona alifaacutetica
Habiendo asociado las sentildeales de C1 y C3p seguacuten los acoplamientos
mostrados se puede asignar las sentildeales de los carbonos contiguos con los que se
acopla De esta manera en la figura 74 puede observarse seguacuten los
acoplamientos cuaacuteles son los H contiguos al grupo hidroxilo que son los
pertenecientes a C2
Descripcioacuten de Compuestos
182
Figura 74 Asignacioacuten de las sentildeales de la cadena alifaacutetica
Se asigna la sentildeal que se observa a
180 ppm a C2 (CH2) puesto que es de
los dos el de mayor caraacutecter alifaacutetico
Integrado en el multiplete de 250 ppm
queda la sentildeal del otro CH2
correspondiente a C3 Si se traslada
esta asignacioacuten al HMQC (Figura 75) se
pueden asignar por las sentildeales a queacute C
pertenecen
Figura 75 Espectro HMQC- 1H-13C alifaacuteticos
Tomando como referencia el CH
de C3p (Figura 76) seguacuten los
acoplamientos mostrados en el
espectro COSY se determina
claramente cuaacutel es la sentildeal del CH2
de C2p
Figura 76 Ampliacioacuten zona alifaacutetica del espectro COSY
Si se continuacutea analizando los acoplamientos desde la sentildeal de H2 sentildealados
en morado se corresponde con el multiplete de 260 ppm de la RMN de protoacuten
Descripcioacuten de Compuestos
183
Como se ha explicado en el apartado anterior la posicioacuten espacial de la
moleacutecula genera acoplamientos deacutebiles de los H entre carbonos que no estaacuten
contiguos pero si espacialmente proacuteximos Por ello el multiplete genera
acoplamiento deacutebil con el hidroacutegeno del doble enlace y con los H2 y con una
tercera sentildeal que
pertenece a los H que
quedan por describir
Si se recurre al
espectro HMQC
(Figura 77) de esa
parte de la moleacutecula se
puede asignar las
sentildeales con seguridad
teniendo en cuenta los
desplazamientos
quiacutemicos de los
carbonos
Figura 77 Ampliacioacuten del espectro HMQC en la parte de la piridina
Habieacutendose asignado el H2 de C2p se puede ver el acoplamiento con el
carbono correspondiente Los dos carbonos que quedan por asignar
corresponden a las posiciones C5p y C6p El C5p teoacutericamente deberaacute aparecer a
desplazamientos menores pero la presencia del doble enlace hace que aparezca
a mayores desplazamientos Por tanto trazando las liacuteneas de unioacuten con la RMN
de protoacuten quedan justificadas todas las asignaciones realizadas al comienzo
sobre la resonancia de protoacuten
Zona aromaacutetica
Los protones aromaacuteticos de los compuestos 6g y 7g muestran diferentes
desplazamientos en la RMN- 1H (Figura 78)
Figura 78 Zona aromaacutetica de las RMN- 1H de los compuestos 6g y 7g respectivamente
Descripcioacuten de Compuestos
184
Sin embargo en una primera aproximacioacuten se puede comprobar que hay
sentildeales que se mantienen de una moleacutecula a otra La diferencia estructural entre
los dos compuestos estaacute en el sustituyente Ar1 donde se intercambian un fluacuteor y
un trifluorometil Por tanto las sentildeales que se conservan con desplazamientos a
710 ppm y 740 ppm pertenecen al benceno para sustituido de Ar2 (unido a la
amina) comuacuten en las dos estructuras Se recurre a los espectros bidimensionales
para la asignacioacuten de las sentildeales
En el espectro COSY del compuesto 7g (Figura 79) se puede determinar queacute
hidroacutegenos pertenecen a carbonos del mismo ciclo por sus acoplamientos
vecinales En la RMN- 1H del compuesto 7g a 710 ppm hay un triplete que
integra por dos hidroacutegenos Teoacutericamente la sentildeal obtenida deberiacutea ser un
doblete ya que los hidroacutegenos del los anillos solo se ven afectados por un
hidroacutegeno vecino La explicacioacuten de esta multiplicidad es la presencia del
aacutetomo de fluacuteor que no genera sentildeal pero si influencia en los hidroacutegenos vecinos
De esta forma se asigna esa sentildeal a 710 ppm a los hidroacutegenos 3acute y 5acute del anillo
de Ar2 Con el espectro COSY quedan descritos los correspondientes vecinos
H2acute y H6acute a 740 ppm
Figura 79 Espectro COSY del compuesto 6g
De esta manera queda claro que las otras dos sentildeales pertenecen a Ar1 Si se
recurre de nuevo a la RMN- 1H del compuesto 6g se puede observar una sentildeal
intensa que integra cuatro protones a 710 ppm Conociendo que dos
hidroacutegenos son H3acute y H5acute que pertenecen a Ar2 los otros dos seraacuten H3 y H5
pertenecientes al benceno unido al hidroxilo Ar1 que en este compuesto
tambieacuten tienen un aacutetomo de fluacuteor contiguo
Descripcioacuten de Compuestos
185
En el espectro COSY del compuesto 7g la sentildeal a 750 ppm se ha asignado a
H2acute y H6acute de Ar2 El compuesto 6g tiene los mismos protones H2acute y H6acute de Ar2 a
igual desplazamiento por lo que la sentildeal a 740 ppm perteneceraacute a los protones
H2 y H6 que faltaban por designar en el compuesto 6g Los uacutenicos protones que
no comparten 6g y 7g son H3 y H5 Por RMN- 1H del compuesto 6g se ha deduce
que estos hidroacutegenos dan una sentildeal a 71 ppm En el espectro del compuesto 7g
a 770 ppm hay una sentildeal que por lo explicado se asigna a estos hidroacutegenos
vecinos del grupo trifluorometil de Ar1
Las asignaciones son
Zona aromaacutetica
6g C2
FBZN
C3
FBZN
C5
FBZN
C6
FBZN
C2
FENIL
C3
FENIL
C5
FENIL
C6
FENIL
RMN-13C
(ppm) 12730 11580 11580 12730 12730 11580 11580 12730
RMN-1H
(ppm) 740 710 710 740 750 710 710 750
7g C2
TBZN
C3
TBZN
C5
TBZN
C6
TBZN
C2
FENIL
C3
FENIL
C5
FENIL
C6
FENIL
RMN-13C
(ppm) 12730 12570 12570 12730 12730 11580 11580 12730
RMN-1H
(ppm) 750 770 770 750 740 710 710 740
Zona alifaacutetica comuacuten
C1
alifaacutetico
C2
alifaacutetico
C3
alifaacutetico
C2
PIRD
C3
PIRD
C5
PIRD
C6
PIRD
RMN-13C
(ppm) 7149 3696 2836 5360 12280 5531 5074
RMN-1H
(ppm) 470 180 250 306 610 245 260
XXII EENNSSAAYYOOSS BBIIOOLLOacuteOacuteGGIICCOOSS
Ensayos Bioloacutegicos
189
XI1Ensayos de actividad antiplasmoacutedica in vitro
Se determinoacute como se describe en el apartado de material y meacutetodos la
actividad antimalaacuterica in vitro y la citotoxicidad de la mayor parte de los
compuestos obtenidos y los resultados se muestran en las siguiente tablas
(Tabla 4 5 y 6)
Compuesto Ar1 n Amina RaRb CI50
NF54 microM
CI50 FCR3 microM
DT50
Vero microM
IS VeroFCR3
1
2 PIPZ CF3NO2 1250 10310 3610 035
2 2 PIPZ NO2CF3 ND 090 490 544
9
2 PIPZ CF3NO2 830 4205 1890 045
11 2 PIRR CF3NO2 390 4605 7040 150
14
1 PIPZ CF3NO2 23260 19020 gt100 065
15 1 PIPZ NO2CF3 10320 18615 gt100 053
17
2 PIPZ NO2CF3 1700 7300 949 013
Referencia QC 004 013 gt50 gt350
Tabla 4 Tabla de resultados de actividad y citotoxicidad de los compuestos de la Serie 0 derivados carboniacutelicos CQ Cloroquina CI50 valores medios del ensayo realizado por triplicado expresados en microM de la inhibicioacuten del 50 del
crecimiento celular de cepas FCR-3 de Plasmodium falciparum DT50 concentracioacuten citotoacutexica media de los compuestos en ceacutelulas Vero IS Iacutendice de Selectividad de los compuestos obtenido del cociente de DT50 de ceacutelulas Vero y la CI50 en
cepas FCR3 ND No determinado
Ensayos Bioloacutegicos
190
Series Ar1 Comp n Amina RaRb CI50
NF54 microM
CI50
FCR3 microM
DT50 Vero microM
IS VeroFCR3
Serie 1
1a 2 PIPZ CF3NO2 230 400 2420 605
1b 2 PIPZ NO2CF3 420 645 gt100 gt100
1g 2 PIRD HF ND 1689 1790 106
Serie 2
2a 2 PIPZ CF3NO2 ND 130 gt200 gt100
2b 2 PIPZ NO2CF3 ND 223 gt150 8598
2c 2 PIPZ HCF3 ND 105 gt250 gt100
2d 2 DZP CF3NO2 ND 075 133 1770
2f 2 PIPR CF3NO2 ND 070 660 670
Serie 3
3b 2 PIPZ NO2CF3 1670 3615 gt100 380
3e 2 PIRR CF3NO2 610 1050 2970 190
3g 2 PIRD HF ND 1403 2460 175
Serie 4
4b 1 PIPZ NO2CF3 2170 10225 7460 070
Serie 5
5a 2 PIPZ CF3NO2 130 050 2090 4180
5b 2 PIPZ NO2CF3 170 490 7570 1540
5c 2 PIPZ HCF3 ND 093 gt200 gt100
5f 2 PIPR CF3NO2 ND 015 550 5500
5g 2 PIRD HF ND 040 3430 8590
Serie 6
6a 2 PIPZ CF3NO2 ND 036 8798 gt100
6f 2 PIPR CF3NO2 ND 048 3000 gt100
6g 2 PIRD HF ND 066 gt1000 gt1000
Serie 7
7g 2 PIRD HF ND 560 gt300 gt100
Referencia CQ 004 013 gt50 gt300
Tabla 5 Tabla de resultados de actividad y citotoxicidad de los compuestos hidroxiacutelicos CQ Cloroquina CI50 valores medios del ensayo realizado por triplicado expresados en microM de la inhibicioacuten del 50 del crecimiento celular de cepas FCR-3 de Plasmodium falciparum DT50 concentracioacuten citotoacutexica media de los compuestos en ceacutelulas Vero IS Iacutendice de
Selectividad de los compuestos obtenido del cociente de DT50 de ceacutelulas Vero y la CI50 en cepas FCR3 ND No determinado
Ensayos Bioloacutegicos
191
Serie 8
Ar1 Amina RaRb IC50
NF54 microM
IC50
FCR3 microM
DT50 Vero
microM
DT50 MCF7
microM
IS VeroFCR3
1
PIPZ NO2CF3 ND SA 150 471 ND
2 PIRR CF3NO2 214 465 101 ND 022
Referencia CQ 004 013 gt50 ND gt400
Tabla 6 Tabla de resultados de actividad y citotoxicidad de los compuestos de la Serie 8 derivados oxima CQ Cloroquina CI50 valores medios del ensayo realizado por triplicado expresados en microM de la inhibicioacuten del 50 del
crecimiento celular de cepas FCR-3 de Plasmodium falciparum DT50 concentracioacuten citotoacutexica media de los compuestos en ceacutelulas Vero IS Iacutendice de Selectividad de los compuestos obtenido del cociente de DT50 de ceacutelulas Vero y la CI50 en
cepas FCR3 ND No determinado SA sin actividad
XI2 Ensayos de actividad antiplasmoacutedica in vivo
Los ensayos in vivo comenzaron con los ensayos de virulencia para obtener
una aproximacioacuten del comportamiento de la cepa elegida Fueron desarrollados
como se muestra en la figura 80
Figura 80 Desarrollo del ensayo de virulencia previo al ensayo de actividad in vivo de los compuestos
En ratones parasitados al 50 hay 24x106 hematiacutees infectados por microL y son
necesarios 107 hematiacutees totales por ratoacuten Para el test de Peters se dispuso de
Ensayos Bioloacutegicos
192
100 ratones pero en los caacutelculos teniendo en cuenta las posibles peacuterdidas se
contoacute con 110 ratones en total Asiacute fueron necesarios 110x107 paraacutesitos para
comenzar la experimentacioacuten El volumen maacuteximo que inyectar es 100 microL de
solucioacuten lo que supone preparar 11 mL de solucioacuten de sangre parasitada al
comienzo del ensayo
Teniendo en cuenta estos tres datos fueron necesarios 458 microL de sangre
infectada al 50 en un volumen de 11 mL de suero fisioloacutegico Con la
inoculacioacuten de los ratones da comienzo el Test de Peters
Los resultados a lo largo del test se ofrecen en la Tabla 7
Test de Peters (respuesta visual externa) P Supervivencia
Grupo Diacutea 0 Diacutea 1 Diacutea 2 Diacutea 3 Diacutea 4 Diacutea 5 Diacutea 7 Diacutea 9 Diacutea 11 Diacutea 12
Control negativo - - + AC + AC + AC 23 910 35 13 11 1
Control positivo - - + AC + AC + AC 19 1010 68 44 44 2
Grupo 2a1 - - + AC + AC + AC 24 710 34 12 - -
Grupo 2a2 - - + AC + AC + AC 32 810 22 22 - -
Grupo 2a3 - - + AC + AC + AC 14 1010 66 55 13 1
Grupo 2a4 - - + AC + AC + AC 31 910 45 22 12 1
Grupo 5f1 - +AC +AC
ID
+AC
BMBO
+AC
BMBO 6 510 35 33 23 2
Grupo 5f2 - +AC + AC +AC
BMBO
+AC
BMBO 15 1010 67 45 23 -
Grupo 5f3 - +AC + AC + AC + AC 32 910 44 23 - -
Grupo 5f4 - +AC + AC + AC + AC 18 1010 67 44 - -
Tabla 7 Resultados de los ensayos in vivo para los compuestos 2a y 5f P porcentaje de parasitemia (-) sin respuesta visual externa (+) respuesta externa AC alteracioacuten momentaacutenea del comportamiento en el momento de la inyeccioacuten del tratamiento BM baja movilidad BO baja oxigenacioacuten principios de cianosis parasitemia medida al cuarto diacutea
Supervivencia expresada en ratones supervivientes con respecto al grupo el diacutea determinado
XI3 Discusioacuten de ensayos bioloacutegicos
Los resultados bioloacutegicos obtenidos ofrecen datos de estructura-actividad
suficientemente consistentes como para proseguir con un refinamiento
estructural de los compuestos El estudio del comportamiento de los
compuestos de las diferentes series en el ensayo de actividad antiplasmoacutedica in
vitro en la cepa FCR3 ha sido suficiente para comprobar que (Series 1-7) son
mucho maacutes activos en todos los casos los derivados hidroxiacutelicos (CHOH) que
un reducido nuacutemero de derivados carboniacutelicos (Serie 0) Por esto no fueron
ensayados el resto de compuestos de la Serie 0
Ensayos Bioloacutegicos
193
Los mismos resultados se obtuvieron para las dos oximas de la Serie 8 por lo
que se paroacute su siacutentesis Sin embargo esto no es extensible a los datos de
toxicidad que se ve influenciada por otros sustituyentes en la moleacutecula Por esto
se centraraacute el estudio en los resultados de las modificaciones estructurales de
los derivados hidroxiacutelicos pertenecientes a las Series 1 a 7
En referencia al sustituyente en la posicioacuten Ar1 comparando series como 1 vs
2 y 3 vs 5 se puede destacar que las series con un grupo fluacuteor en Ar1 aumentan
significativamente su actividad sin ser extensible este dato a la toxicidad (veacutease
compuestos 1a vs 2a 1b vs 2b 3b vs 5b y 3g vs 5g) La siguiente comparativa se
basa en la naturaleza de los anillos condensados (benzo[b]tiofeno y naftaleno)
respecto del benceno sustituido que forman el nuacutecleo del sustituyente Ar1 En
una primera aproximacioacuten se puede ver que la actividad desciende en orden
derivados de FNFTgtderivados de FBZNgtderivados de FBTF Comparando
ahora la actividad de los compuestos 1a vs 2a vs 3a vs 5a vs 6a puede verse que
el compuesto 5f (derivado de FNFT) tiene el mejor dato de CI50 pero el
compuesto 6a (derivado de FBZN) es el que mejor actividad in vitro ha
mostrado siendo soacutelo 3 veces menos activo que la CQ usada como referencia Si
se comparan los derivados de FBTF (Serie 2) y FNFT (Serie 5) en general los
compuestos de la Serie 5 son maacutes activos que sus homoacutelogos de la Serie 2
excepto en el caso de los compuestos 2b vs 5b
En cuanto a toxicidad aunque de forma menos marcada se observa un
aumento en los derivados de FNFT respecto de sus homoacutelogos de FBTF
Centrando el estudio en la variacioacuten de la longitud de la cadena alifaacutetica se
comparan los compuestos 3b y 4b La mayor parte de los compuestos
sintetizados contienen dos carbonos en la cadena alifaacutetica La disminucioacuten en
un aacutetomo de carbono en esta cadena (Compuestos de la Serie 0 14 y 015 y Serie
4) supone una peacuterdida muy considerable de la actividad de los compuestos
Este dato de menor actividad condujo a cerrar esta serie
La naturaleza de la amina central ademaacutes de influir claramente en la
actividad tiene gran influencia en la toxicidad in vitro de los derivados De
forma que se puede ver como la mayoriacutea de derivados de piperazina muestran
una toxicidad bastante baja en comparacioacuten con compuestos derivados de otras
aminas Por el contrario exceptuando el compuesto 6a estos derivados tienen
menor actividad que sus anaacutelogos con otras aminas como homopiperazinas
(compuestos 2a vs 2d) o piperidinas (compuestos 2a vs 2f o 5a vs 5f)
Ensayos Bioloacutegicos
194
Se puede plantear como hipoacutetesis que la presencia de un grupo NH libre en la
estructura aumenta considerablemente la toxicidad de los compuestos Este
caso se observa en los derivados de la Serie 2 y Serie 3 donde los compuestos
con piperazina no son toacutexicos pero al introducir una amina con un NH libre
aumenta su toxicidad a la vez que lo hace la actividad Esto no es de aplicacioacuten
en los anaacutelogos de la Serie 5 (ya que el compuesto 5a contiene el anillo de
piperazina y muestra toxicidad) por lo que se podriacutea deducir que el grupo FNFT
confiere por si mismo cierta toxicidad Con respecto a los derivados de
tetrahidropiridina no se tienen suficientes datos como para extraer conclusiones
claras en la relacioacuten estructura-actividad
Por uacuteltimo se estudia la variacioacuten de la actividad y citotoxicidad en relacioacuten a
los sustituyentes en Ar2 Si se comparan los compuestos a y b de las diferentes
series se deduce que es conveniente para la actividad que el grupo CF3 esteacute en
posicioacuten orto con respecto a la amina (compuestos ldquoardquo de las diferentes series)
Los compuestos con CF3 en para (compuestos ldquobrdquo) son menos activos pero
tambieacuten menos toacutexicos Los anaacutelogos que carecen de grupo NO2 (compuestos 2c
y 5c) aumentan la actividad y cabe destacar el descenso en la toxicidad por lo
que se deduce que el grupo NO2 confiere toxicidad no ligada a la actividad
como el caso de los grupos NH libres Los datos obtenidos permiten una
aproximacioacuten al comportamiento de los compuestos in vivo Para estos ensayos
de los compuestos disponibles se seleccionaron dos el 5f el maacutes activo
(proacuteximo al compuesto de referencia) y 2a el de mejor perfil de toxicidad
En la Tabla 4 se muestran los datos experimentales obtenidos durante la
realizacioacuten del Test de Peters El compuesto 5f disminuye en gran medida la
parasitemia a altas concentraciones pero por acumulacioacuten en el tratamiento
diario provoca diferentes muestras de toxicidad como mala oxigenacioacuten o
alteraciones de conducta de los ratones A concentraciones menores los
resultados desafortunadamente no son tan relevantes como cabiacutea esperar ni en
cuanto a parasitemias ni a supervivencia
El compuesto 2a si bien no muestra indicios de toxicidad no mejora los
resultados con respecto a la CQ en datos de parasitemia ni de supervivencia
XXIIII EENNSSAAYYOOSS CCOOMMPPUUTTAACCIIOONNAALLEESS
Ensayos Computacionales
197
XII1 Propiedades fisicoquiacutemicas de los compuestos
Todos los valores obtenidos en relacioacuten a las propiedades fisicoquiacutemicas de
los compuestos sintetizados se exponen en la tabla siguiente (Tabla 8)
ABS TPSA (Ǻ2)
n-ROTB
PM miLogP KOWLogP ALogPS
21 MLogP
n-OHNH n-ON aceptores
Lipinskis violations ID donadores
rule
gt500 lt5 lt5 lt5 lt415 lt5 lt10 le1
01 8506 6940 7 46350 503 486 480 414 0 6 1
02 8507 6937 7 gt500 503 486 476 414 0 6 1
03 10000 2031 5 36450 481 548 52 442 0 2 0
04 8507 6937 7 48151 419 506 476 424 0 6 0
05 8507 6937 7 48151 419 506 476 424 0 6 0
06 10000 2355 6 43651 431 525 502 451 0 3 0
07 8703 6368 7 49554 401 543 504 485 0 5 0
08 8203 7816 8 49554 448 576 463 445 1 6 0
09 8506 6940 7 4940 532 504 479 448 0 6 1
010 8507 6937 8 gt500 489 504 520 448 0 6 0
011 8202 7820 8 4940 533 525 435 448 1 6 1
012 10000 2031 5 35947 510 566 507 477 0 2 1
013 10000 2031 6 37741 481 544 461 487 0 2 0
014 8506 6940 6 44340 505 531 458 427 0 6 1
015 8506 6940 6 44340 505 531 461 427 0 6 1
016 8507 6937 7 47548 541 524 457 458 0 6 1
017 8506 6940 7 47540 541 524 458 458 0 6 1
018 10000 2355 6 43048 552 543 504 485 0 3 1
019 8203 7816 8 48951 463 594 461 478 1 6 0
020 10000 2031 5 37746 519 580 490 514 0 2 1
021 8507 6937 7 42542 430 407 372 390 0 6 0
022 8203 7816 8 43945 458 477 373 411 1 6 0
023 10000 2031 5 32740 408 468 422 411 0 2 0
81 7971 8489 7 47247 538 468 463 395 1 7 1
82 7668 9368 8 47247 469 458 463 395 1 6 0
CQ 9930 2820 8 31990 501 450 528 352 1 3 1
Tabla 8 Datos computacionales de las propiedades fisicoquiacutemicas de los derivados de la Serie 0 y Serie 8 ABS porcentaje de absorcioacuten calculado como 109 ndash (0345 x TPSA) siendo TPSA el Aacuterea Superficial Polar Topoloacutegica n-
ROTB es el nuacutemero de enlaces de giro permitido Log P es el coeficiente de particioacuten del compuesto en octanol-agua n-OHNH es nuacutemero de enlaces de hidrogeno donadores n-ON es el nuacutemero de enlaces de hidroacutegeno aceptores CQ
cloroquina
ID ABS TPSA (Ǻ2) n-ROTB PM miLogP KOWLogP ALogPS 21 MLogP n-OHNH n-ON
aceptores Lipinskis violations donadores
rule
gt500 lt5 lt5 lt5 lt415 lt5 lt10 le1
1a 8398 7253 7 46550 469 468 463 395 1 6 0
1b 8398 7253 7 gt500 469 458 463 395 1 6 0
1g 10000 2347 5 40399 447 530 461 423 1 2 0
2a 8398 7253 7 48349 407 488 499 432 1 6 0
2b 8398 7253 7 gt500 478 488 499 432 1 6 0
2c 9979 2670 6 43849 397 507 509 432 1 3 0
2d 8398 7253 7 49751 413 538 505 453 1 6 0
2f 8095 8132 8 49751 414 558 461 453 2 6 0
3b 8398 7253 7 49600 498 486 483 429 1 6 0
3e 8095 8132 8 49607 499 506 439 429 1 6 0
3g 10000 2347 5 36146 476 548 466 457 1 2 0
4b 8399 7250 6 44540 471 415 477 408 1 6 0
5a 8399 7250 7 47750 507 506 503 466 1 6 1
5b 8399 7250 7 47750 507 424 384 546 1 6 1
5c 9979 2670 6 46896 519 525 514 466 1 3 1
5f 8095 8132 8 49147 536 576 465 486 2 6 1
5g 10000 2347 5 37945 485 568 488 495 1 2 0
6a 8398 7253 7 46591 337 389 413 398 1 6 0
6f 8095 8132 8 47994 424 459 374 419 2 6 0
6g 10000 2347 5 329 39 374 450 395 425 1 2 0
7g 10000 2347 6 37974 447 526 469 468 1 2 0
CQ 9930 2820 8 31990 501 450 528 352 1 3 1
Tabla 9 Datos computacionales de las propiedades fisicoquiacutemicas de los derivados hidroxiacutelicos ABS porcentaje de absorcioacuten calculado como 109 ndash (0345 x TPSA) siendo TPSA el Aacuterea Superficial Polar Topoloacutegica n- ROTB es el nuacutemero de enlaces de giro permitido Log P es el coeficiente de particioacuten del compuesto en octanol-agua n-OHNH es nuacutemero de enlaces de hidrogeno donadores n-
ON es el nuacutemero de enlaces de hidroacutegeno aceptores CQ cloroquina
Ensayos Computacionales
199
XII2 Discusioacuten de propiedades fisicoquiacutemicas
Los estudios teoacutericos de los paraacutemetros fiacutesico-quiacutemicos muestran que los
compuestos cumplen las Reglas de Lipinski ya que tienen un peso molecular
menor de 500 Daltons los coeficientes de particioacuten octanolagua estaacuten dentro
de los liacutemites admitidos (entre -04 y 56) lejos de los cinco enlaces donadores
de hidroacutegeno (suma de los OH y NH) y de los 10 aceptores (suma de O y N)
Las caracteriacutesticas estructurales han de ser tenidas en cuenta para predecir la
solubilidad de los compuestos
El tamantildeo de las estructuras influye de manera directa en la absorcioacuten de un
compuesto puesto que los de bajo peso molecular difunden mejor pasivamente
Todos los compuestos de este trabajo presentan bajos pesos moleculares
La polaridad de las estructuras tambieacuten juega un papel importante en las
caracteriacutesticas farmacocineacuteticas Las moleacuteculas apolares difunden con mayor
facilidad que las polares ya que son maacutes lipoacutefilas Los coeficientes de reparto
octanolagua determinan esta caracteriacutestica de la moleacutecula teniendo en cuenta
el medio Es decir los compuestos con altos coeficientes de particioacuten son maacutes
hidroacutefobos y por tanto tendraacuten buena difusioacuten Los valores obtenidos para los
distintos compuestos en las diferentes aplicaciones utilizadas no muestran una
tendencia clara que permita distinguir entre estructuras Lo que siacute cabe destacar
es que todos cuentan con valores altos proacuteximos a 5 que les confiere buena
difusioacuten
Los aacutetomos que conforman las moleacuteculas estaacuten cargados y confieren
polaridad a la estructura Esta caracteriacutestica estaacute distribuida en el espacio de
diferente forma seguacuten los aacutetomos de O N y F que posea la moleacutecula dando
lugar al TPSA (suma de superficie de todos los aacutetomos polares) La bibliografiacutea
(Palm et alts 1997) demuestra que la liposolubilidad estaacute relacionada con los
valores de TPSA Los valores de TPSA entre 63 y 139 Aring2 predicen una buena
absorcioacuten de los compuestos La mayoriacutea de las estructuras del trabajo estaacuten
dentro de esos paraacutemetros incluso hay estructuras que como la CQ tienen
TPSA menores de 63 Aring2 que indican que el porcentaje de absorcioacuten de los
compuestos seraacute oacuteptimo
Todos los paraacutemetros fisicoquiacutemicos proponen unas buenas cualidades de
absorcioacuten de los compuestos de este trabajo
Ensayos computacionales
200
XII3 Estudios de Modelizacioacuten y Acoplamiento Molecular
Se realiza una primera aproximacioacuten para la validacioacuten de la diana propuesta
usando el programa Autodock donde se analizan los modos de unioacuten maacutes
representativos de las diez conformaciones calculadas del compuesto EH58 y del
5a con al menos un enlace de hidroacutegeno con uno de los aspartatos del sitio
cataliacutetico Las energiacuteas de unioacuten y los valores de RMSD de EH58 y las energiacuteas de
unioacuten del compuesto 5a para esas diez conformaciones se muestran en la
siguiente tabla
EH58 5a
Confa Energiacutea
b RMSD
c Energiacutea
b
1 -406 453 -616
2 -250 361 -607
3 -245 559 -585
4 -230 393 -584
5 -232 299 -570
6 -232 632 -556
7 -209 551 -556
8 -197 557 -545
9 -162 556 -525
10 -121 733 -478
Tabla 10 Datos de energiacutea de las distintas conformaciones de los compuestos EH58 y 5a a Mejores conformaciones obtenidas por docking ordenadas seguacuten la energiacutea b energiacutea de unioacuten en in Kcalmol calculadas con el programa
Autodock c Valores RMSD en Aring
Los resultados de los ensayos computacionales realizados al compuesto 5a
producen representaciones graacuteficas tridimensionales del MEP (Figura 81) de la
conformacioacuten de miacutenima energiacutea obtenida seguacuten los datos mostrados en la
anterior Tabla 10
En el MEP se observa una red de potencial electronegativo alrededor del fluacuteor
los grupos OH y los NO2 Asiacute se puede deducir que los compuestos maacutes activos
los derivados hidroxiacutelicos tendraacuten un potencial electronegativo y un modo de
accioacuten similar
Ensayos Computacionales
201
Figura 81 MEP de la mejor conformacioacuten del compuesto 5g
Los estudios de docking se orientaron a la unioacuten entre el compuesto liacuteder y la
plasmepsina II como se ha explicado anteriormente Se llegoacute a la conclusioacuten que
se forma un puente de hidroacutegeno con el sitio activo de la aspartato cataliacutetica de
la enzima (ASP 214 y ASP 34) Esta interaccioacuten se da sobre el uacutenico grupo
hidroxilo de la moleacutecula y el residuo ASP 214
Todo esto nos aporta representaciones graacuteficas como la obtenida para la mejor
conformacioacuten encontrada para el compuesto 5a dentro del sitio activo de la
plasmepsina II (figura 82)
Figura 82 Representacioacuten de la unioacuten del compuesto 5a y la Plasmepsina Sentildealado con raya discontinua amarilla la unioacuten del OH y la ASP 214 Tambieacuten se puede ver dibujadas en rama otras terminaciones de la enzima
En base al resultado obtenido en la primera aproximacioacuten con el programa
Autodock que valida como diana la plasmepsina se realiza una segunda
aproximacioacuten con el programa ICM que emplea menos tiempo para sus caacutelculos
una vez conocidos los paraacutemetros de buacutesqueda base
Ensayos computacionales
202
Para este segundo estudio se emplearon las estructuras de los derivados 5a 5c
5g 6a 6g y 6f Una de las hipoacutetesis base del estudio es que partiendo de que
habiacutea comprobado que el compuesto 5a encaja en el sitio activo los demaacutes
derivados deberaacuten encajar tambieacuten Esto se confirma en la figura 83 donde se
muestra como los diferentes derivados solapan estructuralmente en el hueco del
sitio activo de la moleacutecula
Figura 83 Imagen de la plasmepsina donde se muestra el solapamiento de las diferentes estructuras estudiadas
El programa ICM realizoacute caacutelculos para obtener las energiacuteas de las mejores
conformaciones de las moleacuteculas propuestas (Tabla 11)
Compuesto Energiacutea
(Kcalmol) Actividad
uM
5f -917627 015
5a -867278 05
6f -815261 048
6a -764088 036
5c -751448 093
6g -681119 066
Tabla 11 Energiacutea de las conformaciones oacuteptimas de los diferentes compuestos estudiados
Teniendo en cuenta los datos de energiacutea y las configuraciones espaciales maacutes
estables para el sitio de unioacuten de las moleacuteculas se obtuvo la representacioacuten de las
interacciones que realiza cada moleacutecula en el sitio activo de la enzima
plasmepsina (Figuras 84 a 89)
En la figura 84 se puede ver la representacioacuten de las interacciones del
compuesto 5a en el sitio activo En amarillo quedan sentildealadas las interacciones
hidrofoacutebicas (interacciones de Van der Waals) entre restos apolares de la
Ensayos Computacionales
203
moleacutecula y de los restos de la enzima
En verde se sentildeala el puente de
hidroacutegeno entre el grupo OH y la
ASP 214 En este compuesto el
programa plantea otra posible unioacuten
con el resto THR 217 En azul se
resalta la regioacuten ionizable la amina
Los restos libres que podriacutean
interaccionar con las moleacuteculas
propuestas se plantean en recuadros
alrededor de ella
Figura 84 Representacioacuten de las interacciones de 5a
En la figura 85 se puede estudiar la
variacioacuten en las interacciones con el
cambio de posicioacuten del grupo CF3 y la
desaparicioacuten del grupo NO2 del
compuesto 5c Ahora el programa
plantea la posibilidad de la interaccioacuten
del OH con ASP 34 ademaacutes de la
interaccioacuten con ASP 214
Figura 85 Representacioacuten de las interacciones de 5c
En la figura 86 se muestra el compuesto 5f y se aprecia el cambio los aacutengulos de
conformacioacuten de la estructura
cuando la amina PIPZ central se
cambia por PIPR Se observa como
se establecen muchas maacutes
interacciones apolares del grupo
FNFT y del CF3 en orto pero
disminuyen las del ciclo de la amina
con respecto a la piperazina
Ademaacutes se plantea una nueva unioacuten
por puente de hidroacutegeno entre el
NH libre y la ASP 34
Figura 86 Representacioacuten de las interacciones de 5f
Ensayos computacionales
204
En la figura 87 el compuesto 6f se
diferencia del anterior en que en lugar de
un FNFT se tiene un FBZN que plantea
una unioacuten con el resto TYR 192 Se ve a
simple vista la disminucioacuten en la cantidad
de interacciones apolares que hay en la
moleacutecula
Figura87 Representacioacuten de las interacciones de 6f
En la figura 88 se representa el
compuesto 6a Se puede ver como de
nuevo el anillo de PIPZ vuelve a dar
interacciones apolares y aporta
regiones ionizables aunque se pierde
el puente de hidroacutegeno con ASP 34
Figura 88 Representacioacuten de las interacciones de 6a
En esta uacuteltima figura 89 se
representa el compuesto 6g que se
diferencia del anterior en que la
amina central es la PIRD Este ciclo
posibilita una interaccioacuten con TYR 77
y VAL 78 La distribucioacuten de
interacciones apolares se asemeja a la
de la moleacutecula 5c ya que el
sustituyente tambieacuten de caraacutecter
electro-atrayente se encuentra en
posicioacuten para del anillo
Figura 89 Representacioacuten de las interacciones de 6g
En este estudio se incluyoacute una seacuteptima moleacutecula el derivado 4b Este
compuesto se diferencia del resto de los sintetizados en que su cadena alifaacutetica
cuenta con dos aacutetomos de carbono lo que significa que la separacioacuten entre el OH
y la amina es de un uacutenico carbono Los caacutelculos sobre energiacuteas y configuraciones
espaciales de maacutexima estabilidad para una correcta interaccioacuten con la diana
Ensayos Computacionales
205
propuesta mostraron que el compuesto 4b puede adoptar una conformacioacuten que
le permitiriacutea acceder al hueco activo de la plasmepsina pero no se produciriacutea la
interaccioacuten caracteriacutestica del grupo OH y la ASP 214
Estos datos ofrecen la posibilidad de un farmacoacuteforo que se muestra en la
figura 90
Figura 90 Farmacoacuteforo propuesto para los derivados de arilaminoalcoholes con actividad antimalaacuterica que tienen como diana propuesta la plasmepsina II
En la imagen del farmacoacuteforo quedan destacadas en amarillo las zonas
apolares que establecen interacciones hidrofoacutebicas con los aminoaacutecidos del sitio
activo de la plasmepsina y que se corresponden con la zona aromaacutetica Ar1 Las
flechas granate sentildealan las posibles interacciones que establece el aacutetomo de fluacuteor
Las flechas verdes sentildealan las interacciones polares entre los grupos polares y la
ASP 214 Asiacute de la zona azul correspondiente a las interacciones de la amina se
destaca una segunda interaccioacuten de los NH libres con la enzima en el resto ASP
34 El resto del ciclo de amina establece interacciones apolares
En la imagen la parte de Ar2 por su naturaleza aromaacutetica tambieacuten plantea
interacciones apolares con la enzima propuesta
Con los datos obtenidos y tomando como diana la enzima plasmepsina se puede
proponer un nuevo esquema para seguir con el refinamiento estructural
Ensayos computacionales
206
Figura 91 Estructura general planteada para el refinamiento estructural
Las nuevas estructuras deberaacuten contar con un grupo hidroxilo separado por un
espaciador alifaacutetico de una longitud miacutenima de dos carbonos con una amina A
ambos lados de la moleacutecula se dispondraacuten las zonas de interaccioacuten apolar
formadas por sistemas aromaacuteticos sencillos o conjugados sutituidos por grupos
de caraacutecter electroatrayente como haloacutegenos metoxi o trifluorometoxi
Ensayos Computacionales
207
XII4 Discusioacuten de resultados de modelizacioacuten
Los estudios computacionales proponen como diana de los compuestos
desarrollados en este trabajo la plasmepsina II Seguacuten los datos obtenidos para
las diferentes estructuras estudiadas se pueden establecer relaciones
estructura-actividad Estos resultados se ven confirmados por las distintas
interacciones de los compuestos en su conformacioacuten maacutes estable dentro de
hueco activo de la enzima
Al estudiar los resultados de las diferentes interacciones por zonas de las
moleacuteculas en las figuras 84 a 89 se podriacutea dar una explicacioacuten de la diferente
actividad mostrada por los compuestos ensayados
Queda evidenciado desde la primera aproximacioacuten computacional que el
puente de hidroacutegeno entre el grupo OH y la ASP 214 es el punto clave en la
validacioacuten de la plasmepsina II como diana de los compuestos Esta interaccioacuten
confirma que es requisito indispensable para la actividad de los derivados la
presencia de un grupo OH en la estructura
Los sistemas aromaacuteticos conjugados o anillo aromaacutetico que conforman Ar1
son sistemas completamente apolares que ejercen interacciones hidrofoacutebicas
con los restos apolares del bolsillo activo de la enzima como isoleucina (ILE)
fenilalanina (PHE) o leucina (LEU) Cuanto mayor es la nube de electrones π del
sistema Ar1 mayores son las interacciones con los sistemas π de los
aminoaacutecidos que explica porqueacute los derivados de la Serie 5 tienen maacutes
actividad que los de la Serie 6 Varias representaciones plantean una posible
unioacuten polar del aacutetomo de fluacuteor con tirosina (TYR) que aumentariacutea la interaccioacuten
global de la moleacutecula y aclara el porqueacute los derivados fluorados son maacutes afines
que los no fluorados
La longitud de la cadena alifaacutetica tambieacuten juega un papel importante en la
actividad de los derivados la disminucioacuten de tres aacutetomos de carbono a dos de
la cadena alifaacutetica ha supuesto una disminucioacuten draacutestica de la actividad (veacuteanse
los compuestos 3b y 4b) Los estudios realizados al compuesto 4b podriacutean
explicar esta disminucioacuten Los carbonos de la cadena alifaacutetica tienen capacidad
de rotar lo que confiere a la estructura mayor capacidad para adoptar
diferentes conformaciones que le permiten llegar a la disposicioacuten de miacutenima
energiacutea Los derivados ensayados con un carbono alifaacutetico menos seguacuten las
previsiones teoacutericas adoptan una conformacioacuten que les permite acceder al
Ensayos computacionales
208
hueco activo de la plasmepsina II pero no permite la unioacuten del grupo OH con
el resto ASP 214 que se predice como esencial para la actividad de los
compuestos presentados en este trabajo Se puede predecir que teoacutericamente la
plasmepsina II no es la diana adecuada para los derivados de la Serie 0 14 y 15
y 4b
La naturaleza de la amina central juega un papel muy importante en este tipo
de estudios Puede verse en las representaciones que seguacuten sea la amina
piperazina o amino-piperidina las interacciones con el entorno son muy
diferentes Centrando la atencioacuten en los derivados de PIPZ se observa que el
ciclo por completo da lugar a una regioacuten ionizable por el efecto del N y las
interacciones electrostaacuteticas del ciclo debidas al plegamiento espacial que
confiere estabilidad Si ahora se estudian las PIPR lo que se puede ver es que el
ciclo pierde interaccioacuten apolar con el medio ya que se plantea un nuevo puente
de hidroacutegeno del grupo NH libre con el resto ASP 34 Esta segunda unioacuten polar
hace que la moleacutecula adquiera menos energiacutea y maacutes estabilidad dentro del
hueco activo que justifica por queacute los derivados de amino-piperidina muestran
maacutes actividad (compuestos 2a y 2f 5a y 5f 6a y 6f)
Los grupos CF3 y NO2 presentes en Ar2 y OH seguacuten el mapa MEP de
potenciales electrostaacuteticos son restos que aportan polaridad a las moleacuteculas La
posibilidad de establecer nuevas interacciones polares maacutes fuertes con sitios del
hueco de la plasmepsina podriacutea explicar por queacute son maacutes activos los
compuestos con estos restos
Con los datos obtenidos en los estudios computacionales se puede proponer
un posible farmacoacuteforo para la plasmepsina II En la figura 89 se ve como las
interacciones maacutes importantes son las descritas teoacutericamente para los enlaces
polares del OH con la ASP214 NH libre con ASP 34 y la posible interaccioacuten del
aacutetomo de fluacuteor de Ar1 con otros restos como tirosina lo que justifica los datos de
actividad de los derivados El resto de interacciones con el sitio activo son
producidas por los restos apolares de la estructura lo que sugiere que es
necesaria la presencia de zonas aromaacuteticas terminales como son los NFT o BZN
en Ar1 y Ar2 Los datos disponibles no permiten establecer una hipoacutetesis sobre
la influencia del tamantildeo de las zonas aromaacuteticas ni de los sustituyentes
presentes en la zona aromaacutetica de Ar2
CONCLUSIONES
Conclusiones
211
El objetivo de este trabajo ha sido la obtencioacuten de nuevos arilaminoalcoholes
como agentes antimalaacutericos para el tratamiento de la malaria resistente al
tratamiento con cloroquina
En las paacuteginas de esta memoria se han presentado los antecedentes del tema
los objetivos fijados y el plan de trabajo para su desarrollo Se ha realizado la
parte experimental correspondiente y ha sido descrito el trabajo realizado en la
preparacioacuten de los compuestos asiacute como en los ensayos bioloacutegicos y
computacionales Finalmente se ha realizado la discusioacuten de los diferentes
resultados obtenidos para obtener unas conclusiones estructura actividad de los
compuestos que se presentan
Desde el punto de vista quiacutemico las aportaciones son las siguientes
1 Se ha sintetizado cuarenta y siete nuevos compuestos derivados de
arilaminas identificados mediante teacutecnicas claacutesicas de elucidacioacuten
estructural como cromatografiacutea de capa fina espectroscopia infrarroja
resonancia magneacutetica nuclear de protoacuten anaacutelisis elemental y punto de
fusioacuten
2 Se ha logrado optimizar rutas sinteacuteticas anteriormente utilizadas para
obtener derivados con mejores rendimientos En el caso de la siacutentesis de
aminas sustituidas se ha comprobado que una relacioacuten molar de amina
protegida-halogenuro de arilo 151 mejora considerablemente los tiempos
de reaccioacuten El uso de esta proporcioacuten de reactivos de partida favorece que
la reaccioacuten finalice en una hora En la obtencioacuten de los derivados
carboniacutelicos por siacutentesis de Mannich la reaccioacuten se optimiza cuando la
temperatura de reflujo se mantiene entre 130 y 140 ordmC De esta forma el
tiempo necesario para completar la reaccioacuten se reduce a un maacuteximo de tres
horas
3 La aplicacioacuten de la cromatografiacutea en columna flash para la purificacioacuten de
23 de los 47 compuestos ha supuesto un notable avance en la obtencioacuten de
los derivados Las condiciones de trabajo se han adaptado a las necesidades
de cada reaccioacuten reducieacutendose asiacute los tiempos globales de siacutentesis
aumentando los rendimientos y disminuyendo los costes
Desde el punto de vista bioloacutegico las aportaciones son las siguientes
1 Diez de los treinta compuestos evaluados in vitro frente a cepas de
Plasmodium falciparum FCR-3 cloroquino resistentes presentan un valor de
CI50 inferior a 1 microM Quince derivados muestran un nivel de citotoxicidad
en ceacutelulas VERO menor de 50 microM Estos resultados permiten confirmar que
la hipoacutetesis de trabajo planteada fue bien dirigida hacia los objetivos
establecidos
2 Los compuestos 2a y 5f fueron seleccionados para desarrollar ensayos in
vivo Los resultados obtenidos no superan los datos de parasitemia y
supervivencia obtenidos en el tratamiento con CQ
3 Los datos obtenidos en los estudios realizados a la totalidad de los
compuestos presentados en este trabajo indican buenas propiedades
fisicoquiacutemicas de solubilidad y distribucioacuten de cargas electrostaacuteticas Con
estos datos teoacutericos se predice un buen perfil de absorcioacuten en el caso de
tratamientos por viacutea oral
4 Los estudios computacionales proponen como diana de los compuestos
desarrollados en este trabajo la enzima Plasmepsina II que interviene en
los procesos de degradacioacuten de la Hb Quedando pendiente su validacioacuten
experimental
5 Siete de los veintiuacuten derivados hidroxiacutelicos que mostraron buenas
actividades in vitro fueron seleccionados para los estudios de acoplamiento
(docking) con la enzima diana plasmepsina II Se obtuvieron buenos
resultados de acoplamiento de los derivados seleccionados en el sitio activo
de la enzima debido a la unioacuten por puente de hidroacutegeno del grupo
hidroxilo con el resto ASP 214 reforzado por el resto de interacciones
electrostaacuteticas de las zonas apolares de la moleacutecula y restos apolares del
hueco activo de la plasmepsina II
De los resultados bioloacutegicos obtenidos se puede establecer la siguiente
relacioacuten estructura-actividad
1 El estudio de la actividad antimalaacuterica ha demostrado que es esencial la
presencia de un grupo hidroxilo en la estructura Queda demostrado que
los compuestos de las Series 1 a 7 muestran actividad significativa frente al
Plasmodium falciparum resistente a la CQ Los derivados cetona (Serie 0) y
oxima (Serie 8) carecen de intereacutes seguacuten los datos de actividad
Conclusiones
213
2 Entre los derivados hidroxiacutelicos los compuestos de las Series 2 5 y 6 son
los que muestran mejores actividades debido a la presencia de un aacutetomo de
fluacuteor en la posicioacuten 5 del benzo[b]tiofeno en la posicioacuten 4 del naftaleno y
para del benceno respectivamente A su vez son los derivados de las Series
5 y 6 (naftalenos y bencenos) los que han mostrado mejores potenciales
antimalaacuterico
3 La longitud miacutenima de la cadena alifaacutetica debe ser tres unidades que
permitan la libre rotacioacuten estructural Los estudios computacionales
plantean que la disminucioacuten de un aacutetomo de carbono de la cadena alifaacutetica
imposibilita la unioacuten esencial de la estructura a la diana propuesta
4 La amina central juega un papel importante en la actividad-toxicidad de las
estructuras Los resultados obtenidos apuntan a que las piperazinas y
tetrahidropiridinas (compuestos 5a 5b 5c 5g 6a y 6g) son las aminas maacutes
adecuadas para formar parte de los compuestos antimalaacutericos por su buena
relacioacuten toxicidad y actividad in vitro Las piperidinas han resultado maacutes
activas (5f y 6f) pero a su vez mas toacutexicas
5 Los sustituyentes o-trifluorometil y p-nitro benceno (compuestos 5a 5f 6a y
6f) confieren en general buena actividad a los derivados estudiados Los
derivados de aril-tetrahidropiridinas sustituidos con un fluacuteor en para
(compuestos 5g y 6g) tambieacuten demuestran buena actividad antimalaacuterica
Con los datos obtenidos del estudio de los derivados sintetizados se ha
establecido un farmacoacuteforo que permite continuar con el refinamiento
estructural de estos nuevos arilaminoalcoholes Queda abierta la viacutea a la
optimizacioacuten de las estructuras la profundizacioacuten en ensayos bioloacutegicos y en el
mecanismo de accioacuten propuesto para la validacioacuten de la diana plasmepsina II
Conclusions
215
CONCLUSIONS
The objective of this work was to obtain new arylamino alcohols as
antimalarial agents for treating chloroquine-resistant malaria
This thesis presents general background information the proposed objectives
and the plan established for developing the work The experimental part was
carried out and a description of the work involved in preparing the
compounds and in performing biological assays and computational analysis
has also been provided Finally this thesis includes a discussion of the all
results obtained and the structure-activity conclusions reached regarding the
compounds presented here
From a chemical standpoint the work carried out made the following
contributions
1 Forty-seven new arylamino-derived compounds (identified by classical
structural elucidation techniques such as thin layer chromatography
infrared spectroscopy proton nuclear magnetic resonance elemental
analysis and melting point) were synthesized
2 Previously used synthetic routes were optimized so as to obtain derivatives
with better yields In the case of the synthesis of substituted amines a molar
ratio of protected amine to aryl halide 151 improves the reaction times
considerably The use of this proportion of starting reagents helps the
reaction to finish in just one hour In obtaining the carbonyl derivatives by
Mannich reaction the reaction is optimized when the reflux temperature is
maintained between 130 and 140 ordmC Therefore time needed to complete the
reaction is reduced to a maximum of three hours
3 Applying flash column chromatography for the purification of 23 out of the
47 compounds has made a notable advance in obtaining the derivatives
The work conditions have been adapted to the specific needs of each
reaction thereby reducing the time needed for syntheses increasing the
yields and bringing down the costs involved
From a biological point of view contributions from this work included the
following
4 Ten out of the thirty compounds evaluated in vitro against chloroquine-
resistant Plasmodium falciparum strain FCR-3 presented an IC50 value less
Conclusions
216
than 1 microM Fifteen derivatives showed a toxicity level in VERO cells that is
less than 50 microM These results show that the established work hypothesis
was a good approach for attaining the proposed objectives
5 Compounds 2a and 5f were selected for developing in vivo assays The
results obtained do not improve the parasitemia and survival data obtained
in treatment with CQ
6 The data obtained from the assays that were performed on all the
compounds presented in this work indicate good physicocochemical
properties of solubility and good electrostatic charge distribution With this
theoretical data a good absorption profile is predicted in the case of orally
administered treatments
7 The computational studies propose the enzyme plasmepsin II as the target
of the compounds that were developed in this study this enzyme is
involved in the degradation processes of Hb although experimental
validation is still pending
8 Seven out of the twenty-one hydroxyl derivatives which showed good in
vitro activity were chosen for docking studies with the target enzyme
plasmepsin II Good docking results were obtained from the selected
derivatives in the active site of the enzyme due to the bonding of the
hydroxyl group with the ASP 214 by means of a hydrogen bridge
reinforced by the rest of the electrostatic interactions from the nonpolar
areas of the molecule and nonpolar rests from the active gap of plasmepsin
II
The following structure-activity relationship has been established from the
biological results that were obtained in the study
9 The antimalarial activity study has demonstrated that the presence of a
hydroxyl group is essential in the study It has been demonstrated that the
compounds from Series 1 to 7 show significant activity against CQ-resistant
Plasmodium falciparum Based on their activity data the ketone (Series 0)
and oxime (Series 8) derivatives are not of interest
10 From among the hydroxyl derivatives compounds from the Series 2 5 and
6 show the best activity due to the presence of a fluorine atom in position 5
of the benzo[b]thiophene in position 4 of the naphthalene and in para
position of the benzene respectively In addition derivatives from the
Conclusions
217
Series 5 and 6 (naphthalenes and benzenes) have shown better antimalarial
potential
11 The minimum length of the aliphatic chain should be three units that
permit free rotation The computational studies suggest that a decrease of
one carbon atom from the aliphatic chain impedes the essential linking of
the structure to the proposed target
12 The central amine plays an important roll in the toxicity-activity of the
structures The obtained results appear to indicate that the piperazines and
tetrahydropyridines (compounds 5a 5b 5c 5g 6a and 6g) are the most
adequate amines for forming part of the antimalarial compounds due to
their good activity-toxicity relationships in vitro The piperidines were more
active (5f and 6f) but they were also more toxic
13 In general the o-trifluoromethyl y p-nitro benzene substituents (compounds
5a 5f 6a and 6f) give good activity to the derivatives that were studied The
aryl-tetrahydropyridine derivatives that are substituted with fluorine in
para position (compounds 5g and 6g) also show good antimalarial activity
With the data obtained from the study carried out on the synthesized
derivatives a pharmacophore has been established which permits continuing
with the structural refinement of these new arylamino alcohols The road for
optimizing structures and advancing in biological testing and in the mechanism
of action proposed for validating the target plasmepsin II remains wide open
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40- Sitio web del PDB httpwwwrcsborgpdbhomehomedo
41- Editor molecular httpwwwmolsoftcomicm_browser_prohtml
42- Buscador de cavidades ICM
httpwwwncbinlmnihgovpubmedterm=Pocketome20via20com
prehensive20identification20and20classification20of20ligand2
0binding20envelopes
ANEXOS
ldquoPuede que los ideales que albergamos
nuestros suentildeos maacutes anhelados y nuestras maacutes fervientes esperanzas
no lleguen a cumplirse mientras vivimos
Pero eso no importa
Saber que en tu diacutea cumpliste con tu deber y
estuviste a la altura de las expectativas de tus congeacuteneres
es por siacute misma una experiencia gratificante y un logro magniacuteficordquo
Nelson Mandela
Agradecimientos
La realizacioacuten de esta tesis doctoral no hubiese podido llevarse a cabo sin la ayuda y
el apoyo de las personas que han compartido conmigo estos uacuteltimos antildeos A todos
ellos que han hecho posible hoy la presentacioacuten de este trabajo deseo expresar mi maacutes
sincero agradecimiento
Mi agradecimiento especial al Dr Antonio Monge la persona de referencia durante
el desarrollo de todo este trabajo Por apostar por miacute y mi trabajo en momentos en que
todo pareciacutea que no llegariacutea a teacutermino Por ensentildearme que todo el trabajo merece la
pena que la contribucioacuten de todos es igual de vaacutelida que somos una familia Gracias
por su apoyo en los buenos y malos momentos personales
Mi gratitud a la Dra Silvia Peacuterez Silanes por estar siempre dispuesta a ayudarme en
todo lo que fuese necesario en todos los planos de la vida durante estos antildeos por su
gran implicacioacuten en este proyecto por transmitirme tesoacuten orden correccioacuten y sobre
todo optimismo durante todo este tiempo que he tenido el honor de trabajar a su lado
Gracias al Dr Ignacio Aldana la persona que me ofrecioacute la oportunidad de
introducirme en el mundo de la investigacioacuten por ayudarme y apoyarme en todo
momento y transmitirme que en investigacioacuten tambieacuten es importante la tranquilidad
I wish to express my gratitude to Dr Valerie Jullian for being such a splendid host
during my first few days in Toulouse and for considering my small contribution to his
magnificent work to be of importance
I would also like to thank Dr Michel Sauvain for introducing me into the world of in
vivo biological research He accepted the challenge of introducing a chemist into his
specialized area of experimentation with live rodents showing a great amount of
patience with me
I want to give a special thanks to Dr Eric Deharo who had faith in this work and
whose collaboration was immensely helpful He provided the necessary contacts of
other researchers outside the University of Navarras RampD department and
coordinated the project contributing to the success of this work
I would also like to give a special mention to Adriana Pabon from Colombia and to
German Gonzalez Giovanni Garavito and Miguel Quiliano from Peru for their active
participation in this project
A todos los compantildeeros de laboratorio con los que he trabajado estos antildeos
A mi familia por animarme a seguir siempre adelante al hacerme sentir en todo
momento que todo este trabajo es algo de gran importancia y valor humano
ABREVIATURAS
ABS Porcentaje de absorcioacuten
ADN Aacutecido desoxirribonucleico
AMREF African Medical and Reserch Foundation
ARN Aacutecido ribonucleico
ASP 214 Aspartato 214
ASP 34 Asptartato 34
ATP Adenosin trifosfato
BZN Benceno
BZT Benzotiofeno
CCF Cromatografiacutea en capa fina
CDCl3 Triclorometano deuterado
CI50 Concentracioacuten Inhibitoria al 50
COSY Correlated Espectroscopy H-H
CQ Cloroquina
CSP Proteina circumsporozito
DDT Dicloro-difenil-Tricloroetano
DEET NN-dimetil-meta-toluamida
DEPT 90 Distorsionless Enhancement by Polarization Transfer (CH)
DEPT-135 Distorsionless Enhancement by Polarization Transfer
DMEN F-12 Medio de cultivo con mezcla de nutrientes
DMSO Dimetilsulfoacutexido
DOXP Enzima 1-desoxi-D-xilulosa-5-fosfato
DT50 Dosis Toacutexica al 50
ECDC European Centre for Disease Prevention and Control
EMP-1 Proteiacutena de la membrana epitelial
FM Foacutermula Molecular
FAS II Siacutentesis de aacutecidos grasos II
FBZT Fluoro-benzotiofeno
FCR-3 Cepas Plasmodium Falciparum Cloroquino-resistente
FNFT Fluoro-naftaleno
FRP Asociacioacuten de la lucha contra el Paludismo
Hb Hemoglobina
HMBC Heteronuclear Multiple Bond Correlation
HMQC Heteronuclear Multiple Quantum Correlation
HPLC High Performance Liquid Chromatography
HRP-2 Proteiacutena Rica en Histidina
IC50 Concentracioacuten Inhibitoria del 50
IR Espectroscopia Infrarroja
IS Iacutendice de Selectividad
J Constante de Acoplamiento
K Lisina (coacutedigo de una letra)
LDH Lactato Deshidrogenasa
MSP-1 Proteiacutena de superficie del merozoiacuteto
MTT Bromuro de 3-(45- dimetiltiazol-2-ilo)-25-difeniltetrazol
NaOH Hidroacutexido de sodio
NEAA Nonessential amino-acids
NFT Naftalenos
OMS Organizacioacuten Mundial de la Salud (en ingleacutes WHO)
PM Peso Molecular
PENUD Programa de Naciones Unidas para el Desarrollo
PfCRT Proteiacutena Transportadora del Plasmodium falciparum causante
de la resistencia a la Cloroquina
PIPR Piperidina
PIPZ Piperazina
PIRD Tertrahidropiridina
PIRR Pirrolidina
R Arginina (coacutedigo de una letra)
RMN Resonancia Magneacutetica Nuclear
RMSD (Root-mean-square derivation) Desviacioacuten de la media
cuadraacutetica
S Serina (coacutedigo de una letra)
S163R Mutacioacuten arginina-serina en posicioacuten 163 que invierte la
resistencia a la Cloroquina
T Treonina (simplificacioacuten para codificacioacuten en aminoaacutecidos)
TCA Terapias Combinadas de Artemisina
THR Treonina
TNFα Factor de Necrosis tumoral
TPSA Aacuterea superficial Topoloacutegica
TYR Tirosina
UNICEF Fondo de Naciones Unidas para la Infancia
Iacutendice
INTRODUCCIOacuteN 1
I MALARIA 3
I1 Definicioacuten 5
I2 Historia de la enfermedad 5
I3 Epidemiologiacutea 7
I31 Situacioacuten global de la enfermedad 7
I32 Factores epidemioloacutegicos 11
I33 Tipologiacutea de aacutereas endeacutemicas 11
I34 Zonas endeacutemicas e inmunidad 12
II MALARIA Y PLASMODIUM 13
II1 El Plasmodium 15
II11 Caracteriacutesticas morfoloacutegicas 15
II12 Mecanismo de movilidad 16
II13 Mecanismo de invasioacuten celular 16
II14 Metabolismo para el crecimiento 17
II2 Ciclo de la malaria 18
II21 Ciclo de vida del paraacutesito 18
II22 Desarrollo de los esquizontes 20
II3 Especies de Plasmodium 22
II4 Sintomatologiacutea 25
II5 Deteccioacuten y diagnoacutestico 26
III PREVENCIOacuteN Y TRATAMIENTO 29
III1 Medidas preventivas 31
III2 Tratamiento 32
III21 Historia del tratamiento 32
III22 Clasificacioacuten de los compuestos antimalaacutericos 33
III23 Aparicioacuten de resistencias 38
III24 Tratamientos actuales 40
III3 Estrategias mundiales en la lucha contra la malaria 43
III4 Liacuteneas de investigacioacuten actual 44
III41 Buacutesqueda de nuevas dianas 44
III42 Productos naturales 46
III43 Desarrollo de vacunas 47
ANTECEDENTES 49
OBJETIVOS Y PLAN DE TRABAJO 53
IV OBJETIVOS 55
V PLAN DE TRABAJO 59
V1 Disentildeo de nuevos arilaminoalcoholes 61
V2 Siacutentesis de los compuestos disentildeados 63
V3 Caracterizacioacuten de los compuestos 63
Iacutendice
V4 Evaluacioacuten bioloacutegica ldquoin vitrordquo 64
V5 Evaluacioacuten bioloacutegica ldquoin vivordquo 64
V6 Estudios computacionales 64
MATERIAL Y MEacuteTODOS 65
VI QUIacuteMICA TEOacuteRICA 67
VI1 Esquema general de siacutentesis 69
VI2 Siacutentesis de precursores 70
VI21 Siacutentesis de (benzo[b]tiofen-3-il)-3-cloropropan-1-ona 70
VI22 Siacutentesis de arilaminas 70
VI3 Siacutentesis de derivados carboniacutelicos (Serie 0) 73
VI31 Condensacioacuten de 1-(benzo[b]tiofen-3-il)-3-cloropropan-1-ona y de 2-bromo-2acute-acetonaftona
con la amina (Viacutea 1) 73
VI32 Reaccioacuten de Mannich Condensacioacuten de metilcetonas con aminas en medio aacutecido (Viacutea 2) 74
VI4 Siacutentesis de derivados hidroxiacutelicos (Series 1-7) 75
VI5 Siacutentesis de oximas (Serie 8) 78
VII QUIacuteMICA EXPERIMENTAL 81
VII1 Instrumental y reactivos 83
VII2 Meacutetodos de elucidacioacuten estructural 83
VII3 Denominaciones de compuestos 85
VII4 Descripcioacuten general de meacutetodos de siacutentesis 86
VII41 Meacutetodo A procedimiento general para la obtencioacuten de las arilaminas protegidas 86
VII42 Meacutetodo B procedimiento general para la desproteccioacuten de aminas 87
VII43 Meacutetodo C procedimiento general para condensacioacuten de aminas (Viacutea 1) 87
VII44 Meacutetodo D procedimiento de condensacioacuten de aminas (Viacutea 2) 87
VII45 Meacutetodo E procedimiento general para la reduccioacuten de cetonas 88
VII46 Meacutetodo F procedimiento general para siacutentesis de oximas desde carbonilos 88
VII5 Purificacioacuten por cromatografiacutea flash 89
VIII ENSAYOS BIOLOacuteGICOS 91
VIII1 Ensayos in vitro 93
VIII2 Ensayos toxicoloacutegicos 94
VIII3 Ensayos in vivo 94
VIII31 Instrumental y reactivos 95
VIII32 Metodologiacutea 95
IX ESTUDIOS COMPUTACIONALES 105
IX1 Propiedades fisicoquiacutemicas de los compuestos 107
IX2 Optimizacioacuten geomeacutetrica 107
IX3 Estudios de Acoplamiento Molecular (Docking) 108
RESULTADOS Y DISCUSIOacuteN 111
X DESCRIPCIOacuteN DE COMPUESTOS 113
Iacutendice
X1 Siacutentesis de precursores 115
X2 Siacutentesis de derivados carboniacutelicos (Serie 0) 120
X3 Siacutentesis de derivados hidroxiacutelicos 143
X4 Siacutentesis de Oximas (Serie 8) 165
X5 Purificacioacuten de compuestos por cromatografiacutea flash 167
X6 Elucidacioacuten estructural de compuestos por RMN 168
X61 Elucidacioacuten estructural para los derivados de piperazina 168
X62 Elucidacioacuten estructural para los derivados de piperidina 175
X63 Elucidacioacuten estructural para los derivados de tetrahidropiridina 180
XI ENSAYOS BIOLOacuteGICOS 187
XI1 Ensayos de actividad antiplasmoacutedica in vitro 189
XI2 Ensayos de actividad antiplasmoacutedica in vivo 191
XI3 Discusioacuten de ensayos bioloacutegicos 192
XII ENSAYOS COMPUTACIONALES 195
XII1 Propiedades fisicoquiacutemicas de los compuestos 197
XII2 Discusioacuten de propiedades fisicoquiacutemicas 199
XII3 Estudios de Modelizacioacuten y Acoplamiento Molecular 200
XII4 Discusioacuten de resultados de modelizacioacuten 207
CONCLUSIONES 209
BIBLIOGRAFIacuteA 219
ANEXOS 231
INTRODUCCIOacuteN
II MMAALLAARRIIAA
Malaria
5
I1 Definicioacuten
La malaria fiebre paluacutedica o tambieacuten llamada paludismo es una enfermedad
infecciosa causada por el paraacutesito protozoario del filo Apicomplexa clase
Aconoidasida orden Haemosporididae de la familia Plasmodiidae del geacutenero
Plasmodium1 y es transmitido por la hembra del mosquito del geacutenero Anopheles
La malaria es una de las enfermedades tropicales maacutes importante del mundo
que provoca la muerte de miles personas Estaacute estrechamente ligada a la
pobreza y a la evolucioacuten y el desarrollo del hombre
Los mayores problemas en la lucha contra la enfermedad ademaacutes de la crisis
actual que reduce los fondos destinados a los paiacuteses en viacuteas de desarrollo (que
son los maacutes afectados) son la constante aparicioacuten de resistencias por el uso de
monoterapias en tratamientos y debido a los insecticidas utilizados
I2 Historia de la enfermedad
La historia de la malaria es tan antigua como la historia de la civilizacioacuten ya
que se tiene constancia de la presencia de la enfermedad en manuscritos
originarios de China la India o el Antiguo Egipto
Teniendo en cuenta esto se puede entender de donde proviene el nombre de
la enfermedad La palabra malaria proviene de las palabras ldquomal ndashairerdquo que
fueron empleadas en Italia para describir las fiebres intermitentes asociadas a la
exposicioacuten al ambiente de las marismas o cieacutenagas El otro nombre por el que
nos referimos a la enfermedad proviene del latiacuten ldquopalusrdquo que significa pantano
cieacutenaga de ahiacute la denominacioacuten de fiebres paluacutedicas o paludismo
Aunque su nombre tiene su origen en Europa se cree que los paraacutesitos se
desarrollaron en el oeste y centro oeste de Aacutefrica y en el sudeste asiaacutetico Es
importante tener en cuenta su estrecha relacioacuten con la historia natural Ha sido
la evolucioacuten del hombre la que ha expandido la enfermedad de ahiacute que hay
que ser muy conscientes de que durante la historia de la humanidad ha habido
picos de enfermedad ocasionados por la accioacuten del hombre y su desarrollo No
es de extrantildear dicha variacioacuten en la incidencia cuando en China hace maacutes de
5000 antildeos que se conoce la enfermedad2 y los textos egipcios dejan constancia
1httpwwwncbinlmnihgovTaxonomy 2 httpwwwmalariasitecommalariahistory_literaturehtm
Malaria
6
de ella desde hace ya 4000 antildeos Se puede saber por textos antiguos que la
enfermedad se extiendioacute por el mar Mediterraacuteneo hace 2000 antildeos y que al Norte
de Europa llegoacute hace aproximadamente 1000 antildeos Podemos darnos cuenta de
que la malaria ha avanzado unida a la historia del hombre si se tiene en cuenta
que cada vez es mayor la intercomunicacioacuten de sociedades alejadas
geograacuteficamente las continuas guerras e invasiones las rutas comerciales el
comercio de esclavos la profundizacioacuten y especializacioacuten de cultivos propensos
a la criacutea del paraacutesito como arrozales (humedales) el desarrollo de los medios de
transporte que permiten viajar a grandes distancias el aumento y la lejaniacutea de
las migraciones la democratizacioacuten de las vacaciones el comercio-intercambio
de grandes cantidades de alimentos el cada vez mayor trasiego de animales
vivos
Alrededor de 400 aC en la antigua Roma Hipoacutecrates fue el primero en
describir las manifestaciones tiacutepicas de la malaria que la diferenciaba de otras
enfermedades estudioacute la eacutepoca del antildeo donde aumentaba la enfermedad y el
lugar de vida de los enfermos Con ello establecioacute una relacioacuten enfermedad-
agua estancada que dio lugar a los primeros programas de drenaje de agua en
Roma y a la primera intervencioacuten contra la malaria
La escuela hipocraacutetica sosteniacutea que la enfermedad era el resultado de un
desequilibrio en el cuerpo de los cuatro humores unos fluidos que en las
personas sanas se encontraban naturalmente en una proporcioacuten semejante
Cuando los cuatro humores (sangre bilis negra bilis amarilla y flema) se
desequilibraban (laquodyscrasiaraquo mala mezcla) el individuo enfermaba y
permaneciacutea enfermo hasta que se recuperaba el equilibrio La terapia
hipocraacutetica se concentraba en restaurar este equilibrio El tratamiento maacutes
administrado era la purga de la sangre
No seriacutea hasta el antildeo 100 dC cuando se pensoacute que la enfermedad se
transmitiacutea por inhalacioacuten de vapores de la enfermedad el ldquomal airardquo italiano
No era tan errado el diagnoacutestico ya que por el aire vuelan los responsables de
transmitir los paraacutesitos que ocasionan la enfermedad Del otro sinoacutenimo de
malaria se deriva una confusioacuten semejante que llega tambieacuten indirectamente
del aire el paludismo rdquopalusrdquo en latiacuten designa a los pantanos que se creiacutean
responsables de la dolencia pero en realidad era donde proliferaban los
mosquitos Habraacute que esperar hasta 1898 en que se demostroacute que la malaria era
Malaria
7
transmitida por estos cuando ya se relacionaba la enfermedad con larvas del
moquito y microorganismos involucrados en la infeccioacuten
El nacimiento y desarrollo de la microbiologiacutea supuso un salto importante en
el conocimiento de las ciencias y como no podiacutea ser menos impulsoacute el
conocimiento de la enfermedad Asiacute en el antildeo 1880 el cirujano franceacutes Charles
Louis Alphonse Laveran (disciacutepulo de Pasteur) observoacute en Argelia los paraacutesitos
dentro de los gloacutebulos rojos de personas infectadas Planteoacute entonces que la
enfermedad era causada por protozoos siendo esta la primera vez que se
asociaba un protozoo con una enfermedad humana Posteriormente sus
estudios sobre protozoos le reportaron el Nobel de Medicina en 1907 aunque
fueron los cientiacuteficos italianos Ettore Marchiafava y Angelo Celli los que
bautizaron a estos protozoos con el nombre de ldquoPlasmodiumrdquo Carlos Finlay
meacutedico cubano sugirioacute por sus conocimientos sobre la fiebre amarilla que la
malaria podiacutea ser transmitida tambieacuten por mosquitos Hipoacutetesis confirmada en
el antildeo 1898 por Sir Ronald Ross en la India por lo que le fue concedido el
premio Nobel de medicina en 1902 Desde ese momento los estudios
protozoarios fueron avanzando y al poco tiempo en el antildeo 1899 Grassi
Bignami y Basianelli descubrieron el ciclo completo de la enfermedad el ciclo
celular protozoario y su transmisioacuten3
Desde entonces hasta la actualidad se han desarrollado diferentes
conocimientos y modos de prevencioacuten y tratamiento Un caso muy interesante
y uacutetil de estos avances fue el hecho de que los trabajos realizados por Finlay y
Ross sirvieron para crear las primeras guiacuteas de salud muy uacutetiles en eventos tan
importantes para el mundo como la construccioacuten del Canal de Panamaacute
I3 Epidemiologiacutea
I31 Situacioacuten global de la enfermedad
Seguacuten el informe de 2011 de la OMS4 sobre malaria son 106 paiacuteses los que
incluyen esta enfermedad como endeacutemica Se estima en 216 millones los casos
registrados a nivel mundial de los que se han producido 266 mil muertes Los
esfuerzos en la lucha contra la enfermedad de los diferentes organismos
3 httpwwwmedicinamcom 4httpwwwwhointmalariaes
Malaria
8
internacionales han dado como resultado un descenso de un 25 de las tasas de
mortalidad por malaria en la uacuteltima deacutecada5
Figura 1 Distribucioacuten mundial de la malaria paiacuteses libres endeacutemicos y en tratamiento6
En la figura 1 se observa coacutemo la malaria es una enfermedad asociada a la
pobreza y a los climas tropicales El 81 de los casos detectados provienen de
Aacutefrica subsahariana aunque a nivel mundial el 86 de las viacutectimas de la
malaria son nintildeos menores de cinco antildeos
De los 3300 millones de personas en riesgo de contraer la malaria 2100
millones se encuentran en situacioacuten de alto riego de los que el 47 pertenecen
al continente africano y el 37 al asiaacutetico De los 1200 millones restantes que
estaacuten en bajo riesgo de contraer malaria el 94 no son africanos En Aacutefrica
seguacuten los datos del informe de la Fundacioacuten para la investigacioacuten y la medicina
africana (AMREF) de 20117 se concentra la mayor poblacioacuten en riesgo donde el
apoyo externo es mayor y donde por el contrario se invierte el menor gasto
puacuteblico El 90 de los casos de malaria los produce el plasmodio maacutes agresivo
el P falciparum Seguacuten la OMS muchos paiacuteses de la regioacuten africana han
registrado desde el antildeo 2000 hasta 2010 un descenso mayor del 50 de casos
confirmados ingresos y muertes Esto se debe a los cada vez maacutes eficaces
sistemas de vigilancia Del 25 de la disminucioacuten mundial de las muertes
causadas por la malaria un 33 corresponde a Aacutefrica8 En el continente
americano la malaria se centra en la zona amazoacutenica y de Centroameacuterica En
5 Centro de prensa de la OMS (dic 2011) 6 Disponible en httpwwwwhointmalariaworld_malaria_report_2009 7httpwwwamrefesuploadsdocumento 8 Diez datos sobre el paludismo (OMS abril 2012)
Malaria
9
estas zonas se dan menos casos de malaria que en la regioacuten africana pero la
inversioacuten del gasto puacuteblico para erradicarla es mucho mayor La mayoriacutea de los
casos son producidos por el P vivax aunque tambieacuten se dan casos de P
falciparum Del 25 de la disminucioacuten mundial el 55 corresponde a este
continente
En Asia la situacioacuten es maacutes complicada de definir porque depende mucho de
la zona geograacutefica En la zona del sudeste asiaacutetico la situacioacuten es maacutes grave
maacutes parecida a Aacutefrica donde predominan los casos de P falciparum En el resto
de Asia predomina sin embargo el P vivax como en centro y Sudameacuterica En
Oceaniacutea la situacioacuten es muy parecida a la zona de Asia donde la malaria no es
tan grave La disminucioacuten de las muertes supone un 42 de la disminucioacuten de
mortalidad por malaria en este continente
El continente europeo se consideraba libre de malaria desde hace unos antildeos
pero en la actualidad se han registrado nuevos datos El 80 de los casos de la
Europa Occidental se registran en Francia Inglaterra Italia y Alemania Son
zonas donde la malaria se produce de forma ocasional estacional o por razones
de migraciones humanas (ECDC 20119) La zona de Oriente medio concentran
el mayor nuacutemero de casos ocasionados por P vivax La tasa de mortalidad por
malaria en Europa ha disminuido hasta el 1 de los casos
I311 La malaria en Espantildea
La lucha antipaluacutedica fue la primera intervencioacuten sanitaria espantildeola que se
basoacute en criterios epidemioloacutegicos es decir se planificoacute en base a datos de
prevalencia de la enfermedad En 1920 se realizoacute una organizacioacuten de Lucha
Antiplasmoacutedica que consiguioacute con la creacioacuten de dispensarios antipaluacutedicos el
estudio del vector con la participacioacuten y asesoramiento de entomoacutelogos
especialistas en saneamiento ambiental dieron como resultado en los antildeos 30
una disminucioacuten de los datos endeacutemicos en Espantildea En la guerra civil espantildeola
por el debilitamiento socioeconoacutemico y las circunstancias propias de una guerra
se produjo un recrudecimiento de la malaria
9 ECDC European Centre for Disease Prevention and Control Centro de la Unioacuten Europea creado en 2005 para el control de las enfermedades infecciosas con sede en Suecia
Malaria
10
Figura 2 Distribucioacuten de la malaria en Espantildea en el antildeo 193310
En el antildeo 1943 ante la evidente gravedad sanitaria del paiacutes se produce una
reactivacioacuten del Dispensario y un uso masivo de insecticidas A esto se le suma
la firma del convenio con la OMS para potenciar la erradicacioacuten de la malaria
en Espantildea
En 1943 se da por finalizada la campantildea entrando en fase de mantenimiento
que da paso en 1964 a la declaracioacuten de paiacutes libre de malaria por la OMS
siempre teniendo en cuenta que se han de mantener los sistemas de vigilancia
de la enfermedad
En 1961 se registra el uacuteltimo caso de malaria autoacutectona en Espantildea aunque desde
la declaracioacuten de zona libre se han descrito por parte de la Red nacional de
vigilancia epidemioloacutegica varios casos de malaria En el antildeo 2001 se registraron
466 casos diagnosticados en Espantildea asociados a inmigrantes y turistas ademaacutes
se debe tener en cuenta la posibilidad de producirse casos por transfusiones
sanguiacuteneas trasiego de jeringuillas de pacientes drogadictos o malaria de
aeropuerto (Bueno Mari R y Jimenez Peydro R 2008)
El uacuteltimo caso de malaria en Espantildea se diagnosticoacute en una mujer en Aragoacuten en
2009 Por esto se incrementaron las alertas pero no han quedado registrados
maacutes casos (Santa Olalla et alts 201011)
10 Disponible en httpscieloisciiiesscielophppid=s1135-57272008000500003ampscript=sci_arttext 11 httpwwweurosurveillanceorgViewArticleASPxArticleId=19684
Malaria
11
I32 Factores epidemioloacutegicos
La epidemiologiacutea de esta enfermedad depende principalmente de dos
factores
- Primarios
o Hueacutesped o fuente de infeccioacuten hombre portador
o Vector hembras de ciertas especies de mosquito Anopheles
o Susceptibilidad humana este es el factor maacutes variable ya que
depende de factores de inmunidad natural o adquirida factores
geneacuteticos edad (los nintildeos estaacuten maacutes expuestos) migraciones
ocupacioacuten y caracteriacutesticas socioeconoacutemicas
- Secundarios son los que ayudan a la transmisioacuten de la enfermedad como
los factores geograacuteficos (altura sobre el nivel del mar) o climatoloacutegicos
(temperatura humedad atmosfeacuterica o lluvias)
I33 Tipologiacutea de aacutereas endeacutemicas
Seguacuten la proporcioacuten de poblacioacuten que se encuentre afectada las aacutereas donde
la enfermedad estaacute considerada como endeacutemica se dividen en cuatro12
- Aacutereas hipo-endeacutemicas son aquellas donde la malaria afecta a menos del
10 de la poblacioacuten
- Aacutereas meso-endeacutemicas aquellas donde la poblacioacuten afectada estaacute entre el
11 y el 50
- Aacutereas hiper-endeacutemicas son las aacutereas donde el porcentaje de poblacioacuten
afectada estaacute entre el 51 y el 75
- Aacutereas holo-endeacutemicas aquellas donde maacutes del 75 de la poblacioacuten es
portadora de la enfermedad Estas aacutereas estaacuten asociadas a malaria latente
Las hiper y holo-endeacutemicas se caracterizan por alta mortalidad infantil y
juvenil pero los adultos suelen ser asintomaacuteticos por la inmunidad especiacutefica
que generan algunos humanos al sufrir maacutes de una picadura por mosquito
infectado al diacutea
12httpwwwmonografiascomtrabajos77paludismo-enfermedad-tercer-mundopaludismo-enfermedad-tercer-mundo2shtml
Malaria
12
I34 Zonas endeacutemicas e inmunidad
El ciclo de vida del paraacutesito es complejo e involucra distintos medios lo que
demuestra su capacidad para entrar y salir de diferentes ceacutelulas tanto del
hueacutesped como del vector Para ello el paraacutesito debe cambiar su forma la
constitucioacuten y el modo de presentacioacuten de sus proteiacutenas y receptores asiacute se
pone de manifiesto que su respuesta inmune a los tratamientos es muy
compleja A su vez la respuesta inmune del hueacutesped debe generar respuestas
especiacuteficas para las diferentes formas del paraacutesito lo que se denomina
Inmunidad adaptada
Los tipos de inmunidad consideradas para la enfermedad son tres
- Natural ciertos grupos de poblacioacuten poseen alguacuten grado de resistencia
conferida por factores geneacuteticos como la deficiencia de la G6PDH que
confiere resistencia al paraacutesito o la mutacioacuten Hemoglobina E (Hb E la
mutacioacuten del gen que codifica la cadena β-globina que compone la Hb
tambieacuten conocido como talasemia) Hb S (anemia drepanociacutetica) o Hb
fetal
- Adquirida con este tipo de infeccioacuten se produce premunicioacuten13 Se da en
personas de exposicioacuten prolongada como los habitantes de zonas holo-
endeacutemicas El problema estaacute en que la inmunidad adquirida es una
inmunidad parcial y relativa y no garantiza la inmunidad esterilizante
Es una inmunidad especiacutefica a un lugar determinado que en muchos
casos se pierde tras el cambio de haacutebitat a zonas donde la malaria no es
endeacutemica Esto conlleva que el individuo sea vulnerable si vuelve
posteriormente a zonas endeacutemicas
- Pasiva es la que suele relacionarse con el embarazo La conferida por la
madre al feto en muchos lugares donde la enfermedad es endeacutemica
13 (Edm Sergent L Parrot y A Donatien 1924) (Del latiacuten prae antes y munire fortificar) Sinoacutenimo inmunidad de infeccioacuten o de sobreinfeccioacuten (R Debreacute y Bonnet 1927) inmunidad no esterilizante inmunidad relativa (Pasteur 1881 Plehn 1901 von Wasielewski 1901-1908) inmunidad parcial (J Bordet 1920) inmunidad- tolerancia premunidad (Ch Nicolle) laquoEstado de resistencia a toda sobreinfeccioacuten de un organismo ya infectado La premunicioacuten que es simultaacutenea a la infeccioacuten y cesa con ella es conferida por diversas enfermedades infecciosas croacutenicas (paludismo piroplasmosis tuberculosis siacutefilis brucelosis etc) Se opone a la inmunidad verdadera que caracteriza la resistencia del organismo curado a toda reinfeccioacuten es generalmente durable y consecutiva a ciertas infecciones agudas (sarampioacuten escarlatina viruela carbunco fiebre tifoidea etc)raquo (Edm Sergent)
IIII MMAALLAARRIIAA YY PPLLAASSMMOODDIIUUMM
Malaria y Plasmodium
15
II1 El Plasmodium
El Plasmodium es un protozoo eucariota unicelular esporozoario que se
caracteriza por un estilo de vida intracelular obligado con orgaacutenulos
especializados en las diferentes funciones vitales La proliferacioacuten se produce
por invasioacuten celular crecimiento y divisioacuten celular hasta que las reacuteplicas
destruyen la ceacutelula hueacutesped Ademaacutes es el miembro maacutes importante de los
Apicomplexa grupo de clasificacioacuten al que pertenecen tambieacuten otros paraacutesitos
como el toxoplasma o el criptosporium De las 175 especies de Plasmodium son 4
especies las que pueden infectar a humanos P vivax P ovale P falciparum y P
malariae Las tres primeras son las que afectan en mayor grado al hombre
siendo el P falciparum el maacutes violento y resistente Existe una quinta P
knowlesi que afecta maacutes a los grandes simios pero desde hace pocos antildeos se ha
registrado alguacuten caso de infeccioacuten humana por este tipo de paraacutesitos (Figtree et
alts 2010)
El paludismo es causado por paraacutesitos del geacutenero Plasmodium que se
transmiten al ser humano por la picadura de mosquitos infectados de las 20
especies del geacutenero Anopheles los llamados vectores del paludismo que pican
sobre todo entre el anochecer y el amanecer en zonas con climas tropicales
II11 Caracteriacutesticas morfoloacutegicas
El Plasmodium es un protozoo con orgaacutenulos especializados suspendidos en el
citoplasma que se encargan de sus diferentes necesidades como movimiento
invasioacuten celular penetracioacuten de membranas celulares expulsioacuten enzimas
eliminacioacuten de metabolitos o nutricioacuten por fagocitosis
Los trofozoiacutetos son las formas vegetativas moacuteviles que constan de membrana
citoplasma y nuacutecleo La membrana limita el contorno celular protege y permite
el intercambio de sustancias Aquiacute se produce el metabolismo de fosfoliacutepidos y
el mecanismo de transporte de protones y sodio El citoplasma es un sistema
coloidal que representa el cuerpo donde se desarrollan funciones como siacutentesis
de folatos y glicoacutelisis ademaacutes de biosiacutentesis de nucleoacutetidos necesarios para la
reproduccioacuten El nuacutecleo eucarionte contiene el ARN y ADN del paraacutesito
Malaria y Plasmodium
16
II12 Mecanismo de movilidad
Una de las principales caracteriacutesticas del paraacutesito es que no tiene sistema de
locomocioacuten (cilios ni flagelos) su movilidad se produce por deslizamiento Se
ha estudiado (Casanova Morales 2010) que la membrana del paraacutesito tiene dos
dimensiones citoesqueleto y submembrana El movimiento se produce gracias
al citoesqueleto en concreto al sistema actina-miosina que actuacutea como motor
molecular La miosina se transporta a lo largo de los filamentos de la actina con
la energiacutea obtenida de la hidroacutelisis de ATP e interacciona con las adhesinas
transmembrana de la superficie de la ceacutelula hueacutesped Por medio de una
trayectoria helicoidal generada con estas interacciones se produce el
desplazamiento
II13 Mecanismo de invasioacuten celular
Uno de los organelos funcionales maacutes caracteriacutesticos es el orgaacutenulo o
complejo apical que se localiza en un extremo del paraacutesito y estaacute involucrado en
la interaccioacuten hueacutesped paraacutesito durante la invasioacuten celular Su funcioacuten se
relaciona con la adherencia y perforacioacuten de membrana eritrociacutetica ya que
excreta una sustancia que facilita la penetracioacuten celular imprescindible para la
supervivencia del paraacutesito Este orgaacutenulo estaacute presente en las formas
esporozoiacuteto merozoiacuteto y ookinete
La invasioacuten de un eritrocito induce un proceso controlado y transitorio de
rotura de la membrana y reorganizacioacuten de la ceacutelula Es un proceso complicado
(Gratzer y Dluzewski 1993) que conlleva un contacto inicial reorientacioacuten y
deformacioacuten del eritrocito unioacuten de formacioacuten y entrada del paraacutesito Las
interacciones con el eritrocito se piensa que son al azar y que son interacciones
reversibles entre proteiacutenas de superficie del paraacutesito y del gloacutebulo rojo
Son muchas las proteiacutenas implicadas en estos procesos como la proteiacutena de
superficie del merozoiacuteto 1 (MSP-1) que participa directamente en el paso de
invasioacuten y es una de las dianas terapeacuteuticas planteadas actualmente Otra
proteiacutena diana es la proteiacutena circumsporozoiacuteto (CSP) que estaacute implicada en los
procesos de reorientacioacuten del complejo apical En la invasioacuten se producen
cambios en la composicioacuten lipiacutedica de la membrana El paraacutesito una vez
realizada la invasioacuten exporta proteiacutenas como la proteiacutena de membrana epitelial
(EMP) a la membrana eritrociacutetrica que evita que se produzca la depuracioacuten de
los eritrocitos infectados en el bazo Durante la invasioacuten de la membrana
Malaria y Plasmodium
17
diferentes orgaacutenulos del paraacutesito van introducieacutendose en el eritrocito y
producen la unioacuten con la ceacutelula hueacutesped
II14 Metabolismo para el crecimiento
La caracteriacutestica principal del paraacutesito es la dependencia total del hueacutesped
para la supervivencia Como consecuencia de la invasioacuten aumenta la tasa
metaboacutelica de los eritrocitos infectados con cambios en la permeabilidad de
membrana que permiten por fagocitosis el ingreso de solutos necesarios para el
desarrollo del Plasmodium Este cambio de permeabilidad da preferencia al paso
de aniones y solutos como monosacaacuteridos aminoaacutecidos nucleoacutesidos lactato
acido pantoteacutenico y amonio cuaternario La composicioacuten ioacutenica del paraacutesito
depende del proceso de transporte a traveacutes de tres membranas la membrana
plasmaacutetica del eritrocito la vacuola digestiva y la membrana digestiva del
paraacutesito
Las alteraciones proteicas de la membrana intervienen en el transporte de
nutrientes y productos de desecho ademaacutes de evitar la accioacuten del sistema
inmune del hueacutesped Mediante endocitosis el Plasmodium retiene porciones del
citoplasma del eritrocito dentro de vesiacuteculas que se fusionan con la vacuola
digestiva El paraacutesito tiene mitocondria pero carece de ciclo de aacutecido ciacutetrico
funcional por lo que se piensa que es totalmente dependiente de la glucoacutelisis
para su abastecimiento energeacutetico (Dario Mendez 2010) Durante el periodo de
maduracioacuten del paraacutesito se produce un aumento en el uso de glucosa y la
produccioacuten de aacutecido laacutectico en la ceacutelula hueacutesped en detrimento de la capacidad
de la ceacutelula de sintetizar macromoleacuteculas Para su crecimiento y replicacioacuten en
el eritrocito requiere purinas y pirimidinas Las purinas provenientes del
eritrocito son recicladas por el propio paraacutesito para su uso En cambio las
pirimidinas han de ser sintetizadas a partir de sustancias como carbonatos o
adenosiacuten trifosfato (ATP) y mediante la accioacuten de enzimas como dihidrofolato
reductasa o dihidrooroato dihidrogenasa (DHOD) que se convierten asiacute en
dianas terapeacuteuticas La atovaquona es un ejemplo de inhibidor de la DHOD
En la vacuola digestiva del paraacutesito se producen enzimas digestivas y
residuos que se eliminan a traveacutes de la membrana celular Dentro de los
gloacutebulos rojos los paraacutesitos se alimentan de la Hb En primer lugar se produce
la endocitosis de la moleacutecula hasta la vacuola digestiva donde las
endopeptidasas cisteiacutenicas y aspaacuterticas continuacutean con la degradacioacuten de la Hb
Malaria y Plasmodium
18
hasta pequentildeos aminoaacutecidos que el paraacutesito requiere para sus muacuteltiples
funciones de desarrollo En la ruptura celular se produce la liberacioacuten de los
residuos generados durante los diferentes procesos del metabolismo de
nutrientes Algunos siacutentomas de la enfermedad se ocasionan por esta liberacioacuten
En todos estos procesos de cambio de permeabilidad celular necesarios para
la supervivencia del paraacutesito el pH juega un papel fundamental El Plasmodium
desarrolla diferentes sistemas de control y autorregulacioacuten que estaacuten siendo
estudiados y propuestos como diana terapeacuteutica (Loacutepez y Segura 2008)
II2 Ciclo de la malaria
II21 Ciclo de vida del paraacutesito
Para referirnos al ciclo de la enfermedad hablaremos en todo momento del
ciclo de vida del paraacutesito (Figura 5) El Plasmodium falciparum es un organismo
eucariota que cuenta con 14 cromosomas y es transmitido como hemos
comentado al comienzo por los mosquitos Anopheles hembra Pero no son los
mosquitos los que tienen el paraacutesito inicialmente ya que en la picadura a un ser
humano infectado adquieren los paraacutesitos presentes en las sangre (en forma de
gametocitos) dando comienzo la fase Esporogoacutenica (fase sexual) del ciclo de
vida del paraacutesito en el mosquito
En esta sangre infectada hay microgametocitos (macho) y macrogametocitos
(hembra) Los gametocitos macho fertilizan a los hembra formando un cigoto
que recibe el nombre de ookinete el cual penetra en la pared celular de los
mosquitos para desarrollarse hasta formar un oocito Los oocitos desarrollados
se almacenan en sus glaacutendulas salivares Es ahiacute donde estaacuten listos para infectar
a otro humano con su picadura liberando esporozoiacutetos a traveacutes de la saliva
Esta fase esporogoacutenica se da a gran velocidad y se completa en dos semanas si
las condiciones son las idoacuteneas Queda claro de esta forma que el mosquito es el
vector que transporta la enfermedad y los humanos son los hueacutespedes
En este punto la enfermedad se desarrolla en el hombre por medio de dos
viacuteas Exo-eritrociacutetica (hepaacutetica) y Endo-eritrociacutetica La viacutea exo-eritrociacutetica es la
fase del ciclo de vida del paraacutesito que comienza en el momento que el mosquito
infectado pica a un humano y transfiere en la saliva ademaacutes de los esporozoiacutetos
del paraacutesito otros compuestos anti hemostaacuteticos y vasodilatadores al torrente
sanguiacuteneo humano
Malaria y Plasmodium
19
Los esporozoiacutetos son formas alargadas que miden
11 microm de ancho por 1 microm de largo con extremidades
afiladas (Figura 3) Se mueven por deslizamiento y
poseen una gruesa membrana cuya extremidad
anterior se transforma en una caacutepsula apical provista
de anillos polares y de un conoide que favorece la
penetracioacuten celular
Figura 3 Imagen de un esporozoiacuteto14
En treinta minutos los esporozoiacutetos llegan al hiacutegado humano e infectan los
hepatocitos Asiacute durante un periodo de 6 a 15 diacuteas se van a multiplicar
asexualmente (en este periodo de latencia de la enfermedad se llaman
hipnozoiacutetos) Estos daraacuten lugar a miles de merozoiacutetos que rompen las ceacutelulas
hepaacuteticas e para invadir el torrente sanguiacuteneo
En la viacutea endo-eritrociacutetrica los merozoiacutetos del torrente sanguiacuteneo invaden
los eritrocitos (gloacutebulos rojos o hematiacutees) para convertirse en trofozoiacutetos
(formas paraeritrociacuteticas Figura 4) Esta forma madura
y se multiplica asexualmente para formar los
esquizontes Estos a su vez se rompen liberando de
nuevo merozoiacutetos (en su forma endo-eritrociacutetica) que
repetiraacuten el ciclo de los hematiacutees Es la formacioacuten de
los esquizontes la que causaraacute la aparicioacuten de los
siacutentomas cliacutenicos A la vez que esto ocurre unos pocos
merozoiacutetos sufren gametocitogeacutenesis dando lugar a los
gametocitos que infectaraacuten nuevos mosquitos
Figura 4 Imagen de trofozoiacutetos15
En el caso de Plasmodium vivax y ovale se producen hipnozoiacutetos en la fase exo-
eritrociacutetica que permanecen en estado latente y durante un periodo de hasta
tres antildeos sin manifestarse siacutentomas En liacuteneas generales la duracioacuten del ciclo
eritrociacutetico del P ovale es de 50 horas el de P malarie de 72 horas y el de P vivax
y falciparum de 48 horas
14 Disponible en wwwfabaorg 15 Disponible en wwwdfarmaciacom
Malaria y Plasmodium
20
Figura 5 Ciclo de vida completo del plasmodio El mosquito Anopheles infectado en su picadura transmite los
esporocitos del parasito Plasmodio Esporocitos infectan ceacutelulas hepaacuteticas que maduran hasta esquizontes y
que liberaran despueacutes merozoitos Fase exo-eritrociacutetica y fase endo-eritrociacutetica Los merozoitos infectan los
hematiacutees Los trofozoiacutetos maduros daraacuten esquizontes que se rompen para dar maacutes merozoitos Algunos
merozoitos pasan a ser nuevos gametocitos Los gametocitos sexuados son ingeridos por el mosquito La Fase
esporogoacutenica Microgametos y macrogametos forman cigotos que evolucionan hasta ookinete Estos a su vez se
desarrollan hasta Los oocitos se rompen dando esporocitos que se almacenan en las glaacutendulas salivares del mosquito
esperando a ser inoculadas a otro humano 16
II22 Desarrollo de los esquizontes
Los merozoiacutetos provenientes de las ceacutelulas hepaacuteticas viajan al torrente
sanguiacuteneo para infectar a los eritrocitos que contienen la Hb En concreto es la
degradacioacuten de la Hb el factor fundamental para el desarrollo de los
esquizontes ya que este proceso conlleva la obtencioacuten de ldquonutrientesrdquo como
aminoaacutecidos esenciales para el desarrollo de las nuevas formas del paraacutesito En
el citoplasma de los eritrocitos se encuentra la Hb que es ingerida por
endocitosis al citostoma del paraacutesito y comprimida en vesiacuteculas transportadoras
que la conducen hasta las vacuolas digestivas del merozoiacuteto (Figura 6)
16 Citado de wwwdpdcdcgovdpdxHTMLMalariahtm
Malaria y Plasmodium
21
Figura 6 Transporte de membrana de la Hb a la vacuola del merozoiacuteto
Una vez dentro de la vacuola comienza su digestioacuten o degradacioacuten en un
proceso en el que intervienen varias proteasas y peptidasas que generan
diferentes subproductos Del conocimiento de estas enzimas surgen las
muacuteltiples dianas terapeacuteuticas para combatir este proceso y por tanto la
enfermedad ya que el proceso es clave para la supervivencia del paraacutesito Una
vez que la moleacutecula de Hb es introducida en la vacuola digestiva se produce la
ruptura de la estructura (Figura 7) en porcioacuten proteica la globina y en el
producto de degradacioacuten el grupo hemo La globina a su vez se degrada por
medio de peptidasas especiacuteficas (cisteiacutenas y aspartatos) que generan peacuteptidos
maacutes pequentildeos que seraacuten transportados en forma de aminoaacutecidos (los α-Aa) al
citoplasma del paraacutesito (citosol del merozoiacuteto)
Figura 7 Proceso de digestioacuten de la Hb en la vacuola digestiva del paraacutesito
Otro producto de dicha reaccioacuten de degradacioacuten es el grupo hemo libre que
se oxida hasta formar hematina (Figura 8) compuesto muy toacutexico debido a que
puede generar especies reactivas de oxiacutegeno como peroacutexido de hidroacutegeno
(H2O2) radicales superoacutexido y radicales hidroxilo Estos radicales son
mediadores directos de ciertos procesos bioquiacutemicos que ocasionan la ruptura
Malaria y Plasmodium
22
celular y en uacuteltima instancia la muerte del paraacutesito De este modo la siguiente
reaccioacuten es el proceso de detoxificacioacuten de dicho compuesto Esta reaccioacuten
consiste en una biomineralizacioacuten o biocristalizacioacuten donde la hematina
cristaliza como diacutemero cristalino llamado β-hematina (la unioacuten por puentes de
hidroacutegeno de los cristales recibe el nombre de hemozoiacutena) que no es toacutexica para
el paraacutesito
Figura 8 Compuestos obtenidos en la degradacioacuten de la Hb
Para el final del estado trofozoiacutetico del ciclo han sido consumidas muchas
unidades de Hb
II3 Especies de Plasmodium
Son muchas las variables de las que depende el desarrollo de la enfermedad
comenzando por la especie de paraacutesito que infecta
Plasmodium vivax esta especie estaacute presente en casi todas las zonas donde el
paludismo es endeacutemico y su aacuterea de distribucioacuten se extiende
principalmente en Ameacuterica Central y la India La duracioacuten de su ciclo exo-
eritrociacutetico variacutea seguacuten la cepa desde 20 diacuteas a 9 meses Los paraacutesitos
pueden permanecer en el hiacutegado en estado latente maacutes de 2 antildeos y ser
responsable de recaiacuteda La parasitemia raramente excede de 2 paraacutesitos en
100 gloacutebulos rojos y el proceso de formacioacuten de esquizontes dura 48 horas
P vivax parasita sobre todo los hematiacutees joacutevenes (reticulocitos) el hematiacutee
parasitado es maacutes grande que los hematiacutees normales y contiene numerosos
graacutenulos de Schuumlffner que resultan de la degradacioacuten de la Hb y le dan un
aspecto punteado Las formas endo-eritrociacuteticas son grandes (llegan a
ocupar hasta 23 partes del eritrocito) y estaacuten provistas de movimientos
ameboides vivaces (de ahiacute el nombre vivax) los esquizontes presentan
Malaria y Plasmodium
23
hasta 16 merozoiacutetos los gametocitos son redondos frecuentemente
exceacutentricos y con pigmento abundante
Figura 9 Formas endo-eritrociacuteticas del P vivax17
Plasmodium ovale es muy proacuteximo a P vivax con el cual fue confundido por
mucho tiempo Su incubacioacuten variacutea de 15 diacuteas a varios meses P ovale
parasita los hematiacutees joacutevenes el
hematiacutee parasitado es de talla grande
ovalado (es el porqueacute del nombre
ovale) sus bordes estaacuten recortados y
contiene tempranamente numerosos
graacutenulos de Schuumlffner El poli-
parasitismo es posible Los trofozoiacutetos
son ovalados los esquizontes son
irregulares y tienen de 8 hasta 16
merozoiacutetos
Figura 10 Formas endo-eritrociacuteticas del P ovale
Plasmodium malariae es menos frecuente que P vivax o P falciparum y se
encuentra principalmente en zonas como Aacutefrica subsahariana o sudeste
asiaacutetico Su incubacioacuten dura alrededor de 3 a 4 semanas Puede permanecer
en estado latente hasta 20 antildeos El ciclo de maduracioacuten eritrociacutetica dura 72
horas Parasita los hematiacutees viejos (1 a 2) los que son de tamantildeo normal o
retractado y monocromaacutetico Morfoloacutegicamente P malariae estaacute
caracterizado por la disposicioacuten en banda cuadrilaacutetera o ecuatorial de los
17 Imaacutegenes extraiacuteda de wwwgefor4tcom
Malaria y Plasmodium
24
trofozoiacutetos con esquizontes que presentan 8 merozoiacutetos y con gametocitos
semejantes a los de P vivax pero maacutes pequentildeos
Figura 11 Formas endo-eritrociacuteticas del P malariae
Plasmodium falciparum es la especie maacutes temible y mortal Se encuentra en
las regiones tropicales y subtropicales de Aacutefrica en Nueva Guinea y Haitiacute
El desarrollo de su ciclo en el mosquito necesita una temperatura superior a
los 18 degC a esto se debe su ausencia en las montantildeas tropicales y en las
regiones templadas Su ciclo exo-eritrociacutetico es el periodo maacutes corto dura
solamente de 7 a 15 diacuteas de promedio La longevidad del paraacutesito no pasa
habitualmente de 2 meses aunque puede llegar a un antildeo P falciparum
parasita todos los hematiacutees por esto maacutes del 10 de los gloacutebulos rojos
pueden ser parasitados En el frotis de sangre se observa la presencia
uniforme de trofozoiacutetos anulares (los esquizontes se encuentran en
capilares profundos y presentan hasta 16 merozoiacutetos) el poliparasitismo de
un gloacutebulo rojo es frecuente Los gametocitos tienen la forma de banana o
pequentildea hoz (del latino falx falcis) a esto se debe el nombre de esta especie
Figura 12 Formas endo-eritrociacuteticas del P falciparum
Malaria y Plasmodium
25
II4 Sintomatologiacutea
La infeccioacuten por malaria se puede confundir faacutecilmente con un catarro o gripe
comuacuten ya que como se describe en apartados anteriores es el desarrollo de los
esquizontes y la posterior ruptura de los hematiacutees (Figura 13) para seguir
infectando hematiacutees sanos lo que causa la aparicioacuten de sintomatologiacutea cliacutenica
Aunque en la liberacioacuten de nuevos merozoiacutetos tambieacuten se produce la liberacioacuten
de otras sustancias que producen la
sintomatologiacutea caracteriacutestica como los dolores
musculares dolor de cabeza naacuteuseas y voacutemitos
fiebres sudoraciones secuenciales y escalofriacuteos
La sintomatologiacutea observada en la infeccioacuten por
Plasmodium variacutea seguacuten el tipo de malaria que
desarrolla el enfermo
Figura 13 Ruptura de los Eritrocitos infectados18
En Malaria no complicada los siacutentomas caracteriacutesticos son acceso malaacuterico
anemia19 esplenomegalia20 (por la funcioacuten de limpieza de la sangre de
geacutermenes e impurezas por fagocitosis y la produccioacuten de linfocitos la funcioacuten
inmune produce este marcador interno de la infeccioacuten) y en ocasiones
ictericia21 Los picos de fiebre se correlacionan con altos niveles seacutericos de TNF-
α por la liberacioacuten de proteiacutenas del paraacutesito en la ruptura de los eritrocitos que
crea la anemia Ademaacutes de esto se asocia una creacioacuten de anticuerpos contra los
hematiacutees diseritropoyesis22 y secuestro espleacutenico23
18 Imagen extraida de wwwimmuninforu 19 Patologiacutea general Empobrecimiento de la sangre por disminucioacuten de su cantidad total o cantidad de hemoglobina [a(n)- ἀ-ἀν- gr no + -haimiacuteā -αιμία gr sangre] httpDicciomedeusales 20 Patolgiacutea general Aumento de volumen o hipertrofia del bazo[ splēn(o)- σπλή-ν-νός gr bazo + -megalia μεγαλ-ία gr cient tamantildeo excesivo] httpDicciomedeusales 21 Patologiacutea digestiva y hepatoloacutegica Enfermedad producida por acumulacioacuten de pigmentos biliares en la sangre cuya sentildeal exterior maacutes visibles es la amarillez de la piel y las conjuntivas [ikter(o)- ἴκτερος gr ictericia (amarillo) + -ik-os-ik-ē gr + -ia(m) lat cualidad] httpDicciomedeusales 22 (Del griego an- privacioacuten y haima sangre) Sinoacutenimo OLIGOHEMIA ESPANEMIA Empobrecimiento de la sangre caracterizado por la disminucioacuten de uno de varios o de todos sus elementos (anemia total anemias parciales) Esta palabra se aplica generalmente cuando se emplea sin epiacuteteto a una anemia parcial caracterizada por la disminucioacuten del nuacutemero de gloacutebulos rojos o maacutes exactamente por la disminucioacuten de la cantidad de hemoglobina contenida en la unidad de volumen de sangre no estando aumentado el volumen plasmaacutetico (Jean Bernard) Se emplea tambieacuten para designar el estado del organismo privado de sangre y desde este punto de vista la anemia puede ser general o local Se dice que la anemia es hemotiacutesica cuando obedece a la destruccioacuten exagerada de los hematiacutees y mielotiacutesica cuando resulta de la detencioacuten de su formacioacuten por insuficiencia del tejido mieloide (Pappenheim) wwwportalesmedicoscom
Malaria y Plasmodium
26
En Malaria croacutenica se produce esplenomegalia y hepatomegalia24 asiacute como
accesos febriles irregulares y de baja intensidad La piel se torna amarillo-
terrosa se producen palpitaciones somnolencia y fatiga Una caracteriacutestica muy
comuacuten es la baja parasitemia que presentan los pacientes
En el embarazo la malaria produce alta mortalidad materna por anemia
partos prematuros por insuficiencia cardiacuteaca palpitaciones mareos y disnea25
Esto repercute en el bebeacute de forma que producen muertes neonatales y dantildeos
cerebrales
La Malaria severa es producida por Plasmodium falciparum que ocasiona
disfuncioacuten de oacuterganos vitales altas parasitemias imposibilidad de tratamiento
por viacutea oral y hemoacutelisis intravascular
Los casos maacutes graves son los de Malaria cerebral Los nintildeos son el grupo maacutes
susceptible de contraer este tipo de malaria Los hematiacutees infectados se tornan
maacutes adhesivos y se pegan a las paredes de los vasos capilares entre otros a los
del cerebro Se produce anemia grave fallos renales y pulmonares agudos
convulsiones trastornos de movilidad y neuroloacutegicos El paciente entra en
coma pudiendo fallecer en 24 horas Si se logra un retorno del coma los dantildeos
cerebrales residuales son permanentes
II5 Deteccioacuten y diagnoacutestico
Es relativamente sencillo diagnosticar malaria pero lo realmente complicado
y uacutetil es el diagnostico concreto del tipo de malaria Ejemplo de ello es que una
caracteriacutestica de la infeccioacuten por P falciparum es la alta parasitemia donde
hasta 3 trofozoiacutetos se encuentran invadiendo un eritrocito o la aparicioacuten de
gametocitos con forma alargada que no se da en otros tipos de plasmodio
El diagnoacutestico de la malaria se realiza basaacutendose en una serie de criterios
cliacutenicos epidemioloacutegicos y de laboratorio que con una adecuada anamnesis y
examen fiacutesico pueden orientar con alto grado de certeza sobre el tipo de malaria
23 Un gran nuacutemero de ceacutelulas falciformes quedan atrapadas en el bazo y producen su agrandamiento repentino Los siacutentomas pueden incluir debilidad repentina palidez en los labios respiracioacuten raacutepida sed extrema dolor abdominal (del estoacutemago) o en el costado izquierdo del cuerpo y palpitaciones raacutepidas wwwcdcgov 24 Patologiacutea digestiva y hepatoloacutegica Aumento de volumen o hipertrofia del hiacutegado [hēpat(o)- ἧπα-ρ-τος
gr hiacutegado + -megalia μεγαλ-ία gr cient tamantildeo excesivo] httpDicciomedeusales 25 Patologiacutea neumoloacutegica dificultad para respirar [dys- δυσ- gr dificultad + -pnoi(a) -πνοια gr respiracioacuten] httpDicciomedeusales
Malaria y Plasmodium
27
contraiacuteda Las pruebas maacutes concluyentes son la visualizacioacuten del paraacutesito o
deteccioacuten de antiacutegenos en pruebas raacutepidas
Criterios cliacutenicos Se tendraacuten en cuenta tanto episodios malaacutericos anteriores
del paciente como fiebres actuales o recientes (en menos de un mes) escalofriacuteos
intensos sudoracioacuten profusa naacuteuseas y voacutemitos mialgias siacutentomas
gastrointestinales anemia o esplenomegalia
Criterios epidemioloacutegicos El estudio de antecedentes aporta mucha
informacioacuten para el diagnoacutestico Antecedentes como los de exposicioacuten en los
uacuteltimos quince diacuteas en aacutereas de transmisioacuten activas antecedentes hospitalarios
transfusioacuten sanguiacutenea de medicacioacuten antimalaacuterica o relacioacuten con personas que
hayan sufrido malaria
Criterios de laboratorio La forma maacutes sencilla de detectar la enfermedad
incluyendo casos donde todaviacutea estaacute en estado latente es el Meacutetodo de la Gota
gruesa La toma de muestra se realiza mediante la puncioacuten con una lanceta
esteacuteril normalmente en la yema del dedo Se recogen 3 oacute 4 gotas sobre un
portaobjetos y con la esquina de otro se unen en movimientos raacutepidos
extendieacutendose hasta formar una capa gruesa y uniforme Se usa para la
determinacioacuten de la parasitemia y tiene una sensibilidad del 80 y 100 de
especificidad
Se mide mediante la ecuacioacuten
(Nordm paraacutesitos x 8000) Parasitemia (paraacutesitosμL) =
200 eritrocitos (hematiacutees)
La gota gruesa permite analizar una mayor cantidad
de sangre facilitando la deteccioacuten de parasitemias
bajas menores del 1 (Figura 14) y un ahorro de
tiempo en el examen aunque al romperse los
eritrocitos resulta difiacutecil la identificacioacuten de especie
Figura 14 Vista al microscopio de los eritrocitos26
26 Disponible en
httpdpdcdcgovdpdxhtmlFramesMRMalariaovalebody_malariadfovaringhtm
Malaria y Plasmodium
28
Es una prueba sencilla y poco costosa que muestra los casos positivos En
zonas de alta trasmisioacuten esta prueba no es determinante ya que la deteccioacuten de
paraacutesitos en sangre no significa que la posible fiebre que presente una persona
sea por malaria
Como se ha indicado antes es importante la determinacioacuten de la especie de
Plasmodium y se consigue tambieacuten de una manera sencilla con el Meacutetodo de
frotis donde la muestra se colecta de la misma forma que la gota gruesa pero en
este caso se recoge una gota de sangre en un portaobjetos y con otro se realiza
la extensioacuten en capa fina de la misma El inconveniente para realizar estas dos
teacutecnicas sencillas es que se necesita un laboratorio y personal cualificado no
disponible en muchas de las zonas endeacutemicas
Hay otras teacutecnicas de deteccioacuten maacutes desarrolladas como el sistema QBC
(Quantitative Buffy Coat test) que es un meacutetodo de screening para la deteccioacuten
raacutepida de paraacutesitos en sangre centrifugada en un microcapilar Es un meacutetodo
gravimeacutetrico que usa la fluorescencia para la determinacioacuten Aunque es un
meacutetodo raacutepido son necesarias infraestructuras y es difiacutecil distinguir la especie
Existen tambieacuten otros meacutetodos basados en teacutecnicas inmunocromatograacuteficas
en la deteccioacuten de antiacutegenos parasitarios La HRP-2 y la LDH son proteiacutenas
secretadas por el paraacutesito y por tanto indicadoras de su presencia Son pruebas
raacutepidas y no precisan microscopio Tambieacuten son faacuteciles de interpretar ya que
son test en tiras o tarjetas donde se pone una muestra de sangre y se revelan
Son usados como examen de autodiagnoacutestico y en lugares donde no hay
laboratorios como examen preliminar El problema es que dan falsos negativos
y no es un meacutetodo cuantitativo del grado de infeccioacuten
Por uacuteltimo las teacutecnicas de biologiacutea molecular usadas en casos de baja
parasitemia infecciones mixtas o mutaciones entre otras Aunque presentan
muchas ventajas son teacutecnicas laboriosas caras y poco accesibles ya que se
necesitan medios y personal muy cualificado
Es por tanto la combinacioacuten de los criterios explicados la forma maacutes
concluyente de diagnosticar que tipo de malaria estaacute afectando a un enfermo
IIIIII PPRREEVVEENNCCIIOacuteOacuteNN YY TTRRAATTAAMMIIEENNTTOO
Prevencioacuten y Tratamiento
31
III1 Medidas preventivas
La malaria es una enfermedad que puede prevenirse desde sus dos frentes
principales el vector mosquito y el hospedador humano Las medidas de
prevencioacuten se centran en objetivos distintos como evitar el desarrollo de la
enfermedad con proteccioacuten individual en aacutereas endeacutemicas erradicacioacuten del
mosquito prevencioacuten de la picadura o desarrollo de medicamentos
profilaacutecticos
En lo que a la lucha antivectorial se refiere el uso de mosquiteras en las
camas ha reducido mucho el caso de nuevos contagios de la enfermedad Es
una medida que a simple vista parece muy sencilla pero que en realidad no lo
es El problema estaacute en que en muchos de los paiacuteses endeacutemicos la pobreza es
elevada y por tanto el coste de las mosquiteras no es asumible por las personas
En otras ocasiones no es el coste de dichas mosquiteras lo que impide la
prevencioacuten sino que las redes son usadas con otros fines prioritarios como la
pesca En la actualidad la OMS recomienda el uso de insecticidas como
piretroides para impregnar las mosquiteras
Otra forma eficaz de reducir raacutepidamente la transmisioacuten del paludismo es la
fumigacioacuten de interiores con insecticidas de accioacuten residual Los mejores
resultados se consiguen cuando se fumiga al menos el 80 de las viviendas de
la zona en cuestioacuten La fumigacioacuten de interiores es eficaz de tres a seis meses
dependiendo del insecticida utilizado y del tipo de superficie sobre la que se
aplica En algunos casos el DDT puede ser eficaz de nueve a doce meses
Actualmente se estaacuten desarrollando insecticidas con accioacuten residual maacutes
prolongada para la fumigacioacuten de interiores Se ha comprobado la eficacia de
insecticidas como el DDT que aunque fue prohibido su uso por su alto grado de
toxicidad en plantas y su efecto acumulativo sigue siendo ampliamente
utilizado en la lucha contra la malaria Tambieacuten se cuenta con la ayuda de los
repelentes para la piel (DEET) o tiras insecticidas Finalmente no se deberiacutea
olvidar como arma vaacutelida y primaria para la lucha la educacioacuten en prevencioacuten
y gestioacuten del medio ambiente
En lo que al factor humano se refiere el uso de medicamentos especiacuteficos en
bajas dosis durante largo tiempo es la forma actual de profilaxis En esta liacutenea
se estaacuten desarrollando vacunas y tratamientos actualmente en el campo de la
genoacutemica
Prevencioacuten y Tratamiento
32
III2 Tratamiento
III21 Historia del tratamiento
La malaria es una de las enfermedades mejor estudiadas de la medicina
occidental hasta mediados del siglo XX a pesar de
que no se haya encontrado solucioacuten para su
erradicacioacuten A principios del siglo XVIII el
primer tratamiento conocido se basoacute en el uso de
la corteza de un aacuterbol originario de Sudameacuterica
la Cinchona (Figura 15) En 1820 se consiguioacute
aislar e identificar la quinina como compuesto
activo
Figura 15 Aacuterbol de la Cinchona pubescens
En 1891 el azul de metileno se usoacute para tratar a dos pacientes enfermos de
malaria Asiacute se convierte este compuesto en el primer ldquomedicamento sinteacuteticordquo
Actualmente se conoce que su mecanismo de accioacuten implica la inhibicioacuten de la
glutatioacuten reductasa y posteriormente la interrupcioacuten de la homeostasis redox
del paraacutesito
En 1925 se desarrolloacute la mepraquina para combatir estadios del P falciparum
en sangre Es un compuesto que pertenece al grupo de derivados de acridina
usados en el sudeste asiaacutetico durante la II Guerra Mundial Ya en 1934 se
sintetizoacute la cloroquina (CQ) aunque no es hasta el antildeo 1946 cuando comienza
su uso porque se consideraba demasiado toacutexica Con esta estructura comienza a
desarrollarse el grupo de las 4-aminoquinolinas Desde entonces ha sido el
antimalaacuterico maacutes utilizado En 1969 la guerra del Vietnam conlleva el uso de la
mefloquina y halofantrina que son aminoalcoholes derivados de la quinina
Sin embargo el antimalaacuterico maacutes antiguo puede ser la artemisina descubierta
en el antildeo 1596 a partir de un compuesto de origen natural de China La
Artemisina Annua es una planta originaria oriental que constaba ya siglos atraacutes
en los manuales de procedimientos para el tratamiento de fiebres Aunque no
fue hasta el antildeo 1972 cuando se consiguioacute aislar e identificar Este compuesto es
utilizado en la actualidad y resulta eficaz y poco toacutexico
Prevencioacuten y Tratamiento
33
III22 Clasificacioacuten de los compuestos antimalaacutericos
A lo largo de la historia se han usado diferentes tratamientos derivados del
desarrollo de nuevas estructuras y del mejor conocimiento de la enfermedad y
del paraacutesito
De este modo las estructuras pueden clasificarse por
Actividad antimalaacuterica
o Hombre
Estados pre-eritrociacuteticos profilaxis eventual pero poco praacutecticos
Hipnoticidas para P vivax y P ovale actuacutean a nivel hepaacutetico
Esquizonticidas en sangre para estados eritrociacuteticos asexuales
o Mosquito
Gametocidas destruccioacuten de las formas eritrociacuteticas de la fase
sexual del mosquito Prevencioacuten de la transmisioacuten
Esporonticidas previene el crecimiento de los oocitos en el
mosquito tambieacuten se usa para prevenir transmisioacuten
Mecanismo de accioacuten
o Accioacuten sobre la vacuola digestiva del Plasmodium accioacuten sobre la
degradacioacuten de la Hb detoxificacioacuten de la hematina (por ejemplo la
CQ)
o Enzimas involucradas en la siacutentesis y metabolismo de
macromoleacuteculas
o Accioacuten sobre procesos de membrana
o Siacutentesis de purinas y pirimidinas
o Glucoacutelisis y siacutentesis de ATP mitocondrial
Forman familias de compuestos con actividades diferentes en muacuteltiples aacutereas
y niveles
Metanolquinolinas y arilaminoalcoholes
La metanolquinolinas y arilaminoalcoholes forman una familia de
compuestos de gran importancia Este grupo engloba desde
estructuras con gran relevancia histoacuterica como la quinina hasta
compuestos como la lumefantrina que se usa en terapias combinadas
en la actualidad
Prevencioacuten y Tratamiento
34
Estas dos familias de compuestos estaacuten relacionadas entre siacute Como
primera correspondencia destacar su gran efectividad como
esquizonticidas sanguiacuteneos Intervienen en la digestioacuten de la Hb en
concreto en la detoxificacioacuten especiacutefica de la hemozoiacutena
Pertenecientes a la familia de metanolquinolinas son la quinina y
quinidina (que son isoacutemeros L y D) y mefloquina (Figura 16)
Figura 16 Estructura de metanolquinolinas
El problema de la quinina y la quinidina es sus efectos adversos sin
embargo siguen siendo ampliamente usados debido a su faacutecil acceso
La mefloquina es muy uacutetil en malarias resistentes pero tiene efectos
neurosiquiaacutetricos adversos
Los arilaminoalcoholes como halofantrina y lumefantrina (Figura
17) son estructuras de gran capacidad esquizonticida siendo el
mecanismo de accioacuten en la mayor parte de ellos la intervencioacuten en los
procesos de degradacioacuten de la Hb
Figura 17 Estructura de arilaminoalcoholes
Estas estructuras actuacutean en los paraacutesitos maacutes maduros pero no tienen
capacidad hipnoticida Se desarrollaron tras la aparicioacuten de
resistencias a la quinina y CQ
Prevencioacuten y Tratamiento
35
Aminoquinolinas
En este grupo se engloban compuestos como la familia de las 4-
aminoquinolinas y las 8-aminoquinolinas Las 4ndashaminoquinolinas
actuacutean en las fases endo-eritrociacuteticas del paraacutesito La gran ventaja de
esta familia es que los compuestos son faacuteciles de sintetizar
econoacutemicos y bien tolerados A este grupo pertenecen compuestos tan
relevantes como la cloroquina efectiva en profilaxis pero que en la
actualidad presenta problemas de resistencias o la amodiaquina que
es mejor que la CQ para eliminar parasitemias aunque es
hepatotoacutexica (Figura 18)
Figura 18 Estructura quiacutemica de la cloroquina y la amodiaquina
Al grupo de las 8-aminoquinolinas pertenecen la pamaquina la
primaquina y la tafenoquina (Figura 19) que son el uacutenico grupo de
gametocidas y tambieacuten son usadas como profilaxis El gran problema
de estos compuestos es su alta toxicidad
Figura 19 Estructuras de 8-aminoquinolinas
Prevencioacuten y Tratamiento
36
Derivados de acridina
Son compuestos de relevancia histoacuterica como la mepraquina
compuesto sucesor y de origen muy similar a la CQ que fue el primer
compuesto sinteacutetico usado cliacutenicamente como esquizonticida La
pironaridina que tambieacuten pertenece a esta familia (estructuralmente
relacionado con la amodiaquina) se usa en casos de malaria por P
falciparum resistente pero tiene baja biodisponibilidad oral y su precio
es elevado (Figura 18)
Figura 18 Estructura de derivados de acridina
Antifolatos e inhibidores de la siacutentesis de folatos
El aacutecido foacutelico obtenido mediante la dieta es convertido por el
paraacutesito en aacutecido tetrahidrofoacutelico necesario para su superviviencia
Los antifolatos inhiben el metabolismo del aacutecido foacutelico actuando como
coenzimas de la siacutentesis de ADN y pirimidinas Estos compuestos
actuacutean sobre los estados de crecimiento del paraacutesito en el hiacutegado y
detienen la reinfeccioacuten del mosquito
Pertenecen a esta familia sulfonamidas como sulfadoxina o sulfonas
como dapsona y compuestos como proguanil y pirimetamina (Figura
19)
Figura 19 Estructura de antifolatos
Prevencioacuten y Tratamiento
37
Antibioacuteticos
Son familias de compuestos que actuacutean a nivel celular y de
genoma Una de sus dianas es la inhibicioacuten de la siacutentesis de
proteiacutenas con funciones metaboacutelicas importantes para la
supervivencia del paraacutesito Este es el caso de la inhibicioacuten de la
funcioacuten del apicoplasto que interviene en la siacutentesis del grupo
hemo o liacutepidos Para ello estaacuten los antibioacuteticos del grupo de
tetraciclinas como la doxiciclina (Vibramycinreg) (Figura 20)
Figura 20 Estructura de la doxiciclina
Artemisinas y terapias combinadas de artemisinas (TCA)
Esta familia proviene del compuesto aislado del la planta Artemisia
Annua La artemisina (Figura 21) se obtiene solo por viacutea natural y el
resto de derivados son semisinteacuteticos El mecanismo de accioacuten es el
mismo que el de las 4-Aminoquinolinas solo que en esta ocasioacuten viacutea
radicales libres
Son compuestos muy activos en malaria y aunque sus tiempos de vida
son cortos ofrecen actividad aguda El punto negativo es que en su
tiempo de accioacuten no son capaces de eliminar toda la parasitemia y son
necesarias terapias combinadas con otros compuestos En la
actualidad se ha detectado la aparicioacuten de resistencias debido al uso
de monoterapias
Figura 21 Estructura de la artemisina
Prevencioacuten y Tratamiento
38
III23 Aparicioacuten de resistencias
La OMS ha definido resistencia como la capacidad de una cepa parasitaria de
sobrevivir yo multiplicarse a pesar de la administracioacuten y absorcioacuten de un
medicamento dada a dosis iguales o mayores que aquellas usualmente
recomendadas pero dentro de los liacutemites de tolerancia del sujeto La resistencia
a los antimalaacutericos es un serio problema desde hace antildeos En 1973 la CQ fue
reemplazada por la combinacioacuten de sulfadoxina + pirimetamina (Fansidarreg)
Pero en 1985 eacutesta tambieacuten se volvioacute inefectiva en algunas cepas de P falciparum
Estaacute demostrado que la resistencia a algunos antimalaacutericos se desarrolla cierto
tiempo despueacutes de la introduccioacuten de los mismos como tratamiento uacutenico
Seguacuten la OMS se describen tres grados de resistencia in vivo a las drogas
antimalaacutericas
- Grado I (bajo grado) recurrencia a los 7 y 28 diacuteas del tratamiento completo
siguiendo a una inicial solucioacuten de los siacutentomas y reduccioacuten de la
parasitemia
- Grado II (grado intermedio) reduccioacuten de la parasitemia asexuada en maacutes
de un 75 dentro de las 48 h del tratamiento pero con aumento a los siete
diacuteas
- Grado III (alto grado) el nivel de la parasitemia asexuada no cae en maacutes del
75 dentro de las 48 h despueacutes del tratamiento
En la actualidad uno de los compuestos maacutes utilizados es la quinina que a
pesar de los efectos adversos que tiene es uno de los compuestos maacutes accesibles
en los paiacuteses pobres lo que facilita su uso actual Tambieacuten la artemisina y sus
derivados son ampliamente utilizados ya que estudios recientes demuestran la
gran capacidad antiplasmoacutedica Pero en su contra estaacute la baja vida del
compuesto la parasitemia residual y la aparicioacuten de resistencias Ademaacutes de
estos puntos negativos se une el hecho de que la uacutenica viacutea de obtencioacuten de este
compuesto es por medio natural no es viable su obtencioacuten por siacutentesis quiacutemica
lo que conlleva encarecimiento del producto por su limitada accesibilidad
Estudios actuales han conseguido explicar el origen de alguna de estas
resistencias La CQ es un compuesto que accede a la vacuola digestiva del
paraacutesito para interferir en la detoxificacioacuten de la hemozoiacutena El pH de la
vacuola estaacute en torno a 5 lo que produce una protonacioacuten de la CQ hasta su
forma diproacutetica (CQH2+2) En esta forma protonada la QC queda atrapada
Prevencioacuten y Tratamiento
39
dentro de la vacuola porque no se puede difundir y es asiacute como produce su
accioacuten
El Plasmodium falciparum que ha desarrollado resistencia a la CQ se caracteriza
por la proteiacutena PfCRT (Plasmodium Falciparum Chloroquine Resistance
Transporter) modificada Esta proteiacutena adopta la funcioacuten de unirse a la CQ para
realizar su transporte fuera de la vacuola evitando asiacute la acumulacioacuten y la
realizacioacuten de la funcioacuten del faacutermaco Los primeros estudios realizados en este
tema (Fidock DA et alts 2000) mostraron los primeros datos sobre la relacioacuten
entre las mutaciones el pH de la vacuola digestiva y las concentraciones del
faacutermaco dentro de la vacuola digestiva En un principio se pensoacute que las
mutaciones en los genes del Plasmodium provocaban la acidificacioacuten del medio
interior de la vacuola digestiva alterando la concentracioacuten del faacutermaco o
reduciendo la fijacioacuten a la hematina
Estudios posteriores (Martin R et alts 2009) han llegado a concretar el
mecanismo por el cual se producen resistencias a la CQ La mutacioacuten que le
confiere resistencia a la CQ es el cambio de una lisina (K) por una treonina (T)
en la posicioacuten 76 de la serie de aminoaacutecidos Esta mutacioacuten K76T se da en la
regioacuten de la proteiacutena que se cree involucrada en la unioacuten con la moleacutecula Estaacute
siendo objeto de estudio la creacioacuten de nuevos derivados que favorezcan la
inversioacuten de las mutaciones asiacute como favorecer de nuevo la formacioacuten de la
conformacioacuten T76K Ocurre lo mismo con el intercambio de posicioacuten arginina-
serina (R163S confiere resistencia a la CQ y el cambio a S163R la vuelve
sensible) Este cambio confiere carga positiva al sitio de unioacuten e imposibilita por
repulsioacuten de cargas la unioacuten de la PfCRT con la CQ lo que confiere
sensibilidad a la cepa resistente
La aparicioacuten de resistencias a la artemisina queda registrada en el sudeste
asiaacutetico durante estos uacuteltimos antildeos Se han descrito evidencias cliacutenicas que
concluyen que existen en la actualidad casos de resistencias a la artemisina y a
los TCA promovida principalmente por el extendido uso de las monoterapias
de artemisina pero todaviacutea estaacute en estudio el mecanismo por el que se producen
estas resistencias (OMS Informe 2011) En la actualidad la posibilidad de
estudiar el genoma de los paraacutesitos y los mecanismos de accioacuten de los
diferentes tratamientos da como resultado el conocimiento de las resistencias y
la oportunidad de mejorar los tratamientos existentes
Prevencioacuten y Tratamiento
40
Dentro de las medidas de lucha contra la malaria estaacuten como se ha
comentado las referentes al control de vectores La uacutenica clase de insecticidas
empleados en las mosquiteras actualmente recomendadas incluidos los de
accioacuten prolongada actualmente recomendados son los piretroides En este
aacutembito tambieacuten se han desarrollado resistencias en la actualidad Se carece por
ahora de insecticidas alternativos que sean seguros y con una aceptable relacioacuten
costo-eficacia El desarrollo de nuevos insecticidas alternativos es una tarea de
alta prioridad pero tambieacuten larga y costosa Mientras la deteccioacuten de las
resistencias debe ser un componente esencial de todos los esfuerzos por
controlar el paludismo (OMS 2012)27
III24 Tratamientos actuales
Los regiacutemenes terapeacuteuticos en malaria son muy diversos ya que ademaacutes de
las caracteriacutesticas del paciente dependen del tipo de Plasmodium que infecta y la
zona donde se contrae la enfermedad
Cloroquina
Se usa a dosis maacutexima de 25 mgkg viacutea oral en P ovale y P malariae y cepas
sensibles de P vivax y P falciparum Actuacutea en la vacuola digestiva del
paraacutesito interfiriendo en la detoxificacioacuten de la hematina La alternativa
terapeacuteutica es gluconato de quinidina o quinina
Los efectos adversos que se producen son nauseas irritacioacuten con picor o
desoacuterdenes neuropsiquiaacutetricos La sobredosis se ha de tratar con diazepam
En caso de cepas P vivax resistentes se usa mefloquina halofantrina o
sulfato de quinina combinado con tetraciclinas o sulfonamidas Para tratar
recaiacutedas por hipnozoiacutetos se usa el fosfato de primaquina Para tratar
infeccioacuten por P falciparum resistente se usa sulfato de quinina 250 mgkg
combinado con pirimetamina-sulfadoxina o combiando con doxiclina Para
el tratamiento de nintildeos y embarazadas la quinina se combina con
clindamicina
Quinina
Es usada para el tratamiento de P falciparum resistente a la CQ Actuacutea como
esquizonticida sanguiacuteneo Como alternativa se usa el gluconato de
quinidina que es maacutes potente Las alternativas terapeacuteuticas son mefloquina
27 httpwwwwhointmalariadiagnosis_treatment
Prevencioacuten y Tratamiento
41
halofantrina atovaquona artemisinina y pirimetamina-sulfadoxina Para P
falciparum resistente se usa la artemisina IV combinada con tetraclicina o
mefloquina
Los efectos adversos son sabor metaacutelico tinnitus28 y peacuterdida de audicioacuten
reversible
Pirimetamina-sulfadoxina (Fansidarreg)
Es inhibidor de la siacutentesis de aacutecido foacutelico del ciclo vital del paraacutesito Se
utiliza en paiacuteses en desarrollo por su bajo coste sin embargo el incremento
de la resistencia a los antifolatos lo colocan como agente de segunda liacutenea
Mefloquina (Lariamreg)
Puede administrarse a dosis uacutenica de 25 mg baseKg y actuacutea como
esquizonticida sanguiacuteneo No debe administrarse en nintildeos con menos de 15
Kg de peso ni en pacientes que reciban quimioprofilaxis ni halofantrina
para evitar la resistencia cruzada Puede combinarse con doxiciclina
quinina y derivados de la artemisinina
Los efectos adversos son voacutemitos y toxicidad neuroloacutegica manifiestada en
forma de mareos delirio ataxia29 y convulsiones
Halofantrina
Se administra en dosis de 24 mgKg para intervenir en la degradacioacuten de la
Hb El faacutermaco tiene absorcioacuten oral variable y estaacute contraindicado en
enfermos con afecciones cardiacuteacas embarazadas y durante la lactancia Los
efectos adversos se han asociado con toxicidad cardiacuteaca y arritmias30
Atovaquona ndashproguanil (Malaronereg)
La dosis empleada es de 250 mg atovaquona100 mg proguanil Interviene
en la siacutentesis de aacutecido foacutelico del paraacutesito y en la cadena de transporte
electroacutenico mitocondrial (principal accioacuten de la atovaquona) El faacutermaco se
usa generalmente en profilaxis pero tambieacuten en el tratamiento de malaria
28 Patologia Otorrinolaringologa Estomatologa Percepcioacuten de golpeos o pitidos en el oiacutedo que no proceden de ninguna fuente [ claacutes tinnītus es tintineo] httpdicciomedeusales 29 Patologiacutea Neuroloacutegica Perdida de la capacidad de ejecutar movimientos de manera voluntaria ordenada y suavemente Puede afectar a tronco extremidades faringe laringe etc Se debe a la afectacioacuten de algunas estructuras del sistema nervioso [gr ataxiacuteā ἀταξία [a(n)- ἀ-ἀν- gr no + tag- τάξις gr orden formacioacuten + -siacuteā gr] httpdicciomedeusales 30 Patologiacutea cardiovascular Irregularidad y desigualdad en las contracciones del corazoacuten [gr arrythmiacuteā ἀρρυθμία [a(n)- ἀ-ἀν- gr no + rhythm(o)- ῥυθμός gr cadencia ritmo + -iacuteā gr cualidad] wwwdicciomedeusales
Prevencioacuten y Tratamiento
42
por P falciparum resistente a otros medicamentos No presenta efectos
adversos destacables
Derivados de la artemisina o TCA
La dosis de administracioacuten es de 12 mgKg pero es conveniente que se
combinen preferiblemente con mefloquina tetraciclina o clindamicina
Son el tratamiento de eleccioacuten para P falciparum resistente a quinina ya que
estos eliminan la parasitemia maacutes raacutepidamente que la quinina No se ha
descrito toxicidad severa en humanos aunque algunos estudios
demuestran neurotoxicidad en animales Auacuten no se ha determinado la
seguridad del uso de estos compuestos durante el embarazo
Artemeter-lumefantrina (Coartemreg y Riametreg)
Es una combinacioacuten fija de artemeter (20 mg) y lumefantrina (120 mg) con
accioacuten esquizonticida sanguiacutenea La combinacioacuten es eficaz contra las cepas
de P falciparum resistentes a otros tratamientos sin artemisina
Prevencioacuten y Tratamiento
43
III3 Estrategias mundiales en la lucha contra la malaria
En el antildeo 2008 se formoacute un grupo de estudio y control sobre la malaria
mundial integrado por la OMS Fondo de Naciones Unidas para la infancia
(UNICEF) el Programa de Naciones Unidas para el desarrollo (PNUD) el
Banco Mundial y la Asociacioacuten de la lucha contra el paludismo (FRP) Se crean
una serie de frentes de lucha para combatir y reducir la malaria mundial en un
plazo de 7 antildeos incluiacutedo en los Objetivos de Desarrollo del Milenio propuestos
por la ONU
La estrategia mundial tiene cuatro elementos baacutesicos
o Asegurar el diagnoacutestico precoz y el tratamiento inmediato
o Planificar y aplicar las medidas selectivas y sostenibles de prevencioacuten
incluiacuteda la lucha antivectorial
o Detectar a tiempo contener o prevenir las epidemias
o Reforzar la capacidad local en materia de investigacioacuten baacutesica y aplicada
a fin de permitir y promover la evaluacioacuten regular de la situacioacuten del
paludismo en el paiacutes en particular los factores ecoloacutegicos sociales y
econoacutemicos que influyen en la enfermedad
En el antildeo 2010 se realizoacute una revisioacuten del estado del plan y se propusieron
una serie de adaptaciones para mejorar los buenos resultados obtenidos
teniendo en cuenta la situacioacuten actual de aparicioacuten de resistencias
- Cobertura universal de los programas de prevencioacuten y tratamiento
- En prevencioacuten se proponen
mayores esfuerzos en proporcionar mosquiteras y principalmente un
haacutebito en su uso ya que se habiacutean obtenidos datos concluyentes que
relacionan directamente la disminucioacuten de muertes sobre todo
infantiles con el uso de mosquiteras
mantenimiento del rociado de exteriores con insecticidas de accioacuten
residual aprobadas por la OMS
administracioacuten de tratamiento preventivo intermitente a embarazadas
en zonas endeacutemicas
- En tratamientos se propone
priorizar las confirmaciones parasitoacutelogas de la enfermedad en
pacientes Es decir en la medida de lo posible no administrar
Prevencioacuten y Tratamiento
44
tratamientos sin confirmacioacuten de la enfermedad al microscopio o con
pruebas de diagnostico raacutepido
priorizar al uso de las TCA proponieacutendose la retirada de las
monoterapias orales de artemisina (OMS 2011)
III4 Liacuteneas de investigacioacuten actual
III41 Buacutesqueda de nuevas dianas
En la actualidad la aparicioacuten de resistencias por las mutaciones en el ADN del
paraacutesito obliga a un esfuerzo mayor por encontrar compuestos o asociaciones
de compuestos que sigan siendo efectivos contra el Plasmodium ademaacutes de a la
buacutesqueda de nuevos medicamentos Gracias a los avances de las ciencias
quiacutemicas y tecnologiacuteas actuales y el desarrollo de la Bioquiacutemica y la Genoacutemica
en la lucha contra la malaria posibilitan la determinacioacuten de nuevas dianas Ya
desde hace tiempo se conoce la viacutea de accioacuten de la detoxificacioacuten de la Hb pero
el continuo avance de la ciencia ha llevado al conocimiento del ADN y de las
macromoleacuteculas necesarias para la vida del paraacutesito conocimiento de las
mutaciones que llevan a las resistencias enzimas y otras moleacuteculas que
participan en el desarrollo del paraacutesito
Actualmente diferentes proyectos se encuentran en la fase de identificacioacuten de
cabezas de serie con actividad antimalaacuterica o en periodo de optimizacioacuten con el
fin de generar compuestos con propiedades terapeacuteuticas adecuadas como
inhibidores de proteasas de aacutecidos grasos inhibidores de la ruta de siacutentesis de
isoprenoides o del transporte y metabolismo de fosfoliacutepidos del metabolismo
mitocrondial o pirimidiacutenico
En lo que a inhibidores de proteasas se refiere las hemo-polimerasas como
cistein-proteasas (falcipainas) o aspartil-proteasas (plasmepsinas) son objetivos
primordiales de estudio Es el caso del conocimiento de las proteasas aspaacuterticas
del Plasmodium en los procesos de degradacioacuten de la hemoglobina de los
eritrocitos infectados Se ha determinado bioloacutegicamente que participan 4 tipos
de proteasas en concreto las plasmepsinas I II y IV y la histoaspaacutertica
(Ersmark K et alts 2006)
El mecanismo de accioacuten propuesto es la ruptura inicial de las cadenas α de la
Hb en el enlace peptiacutedico entre Phe-33 y Leu-34 Por meacutetodos computacionales
Prevencioacuten y Tratamiento
45
se genera la estructura tridimensional detallada de las enzimas y se estudia si
los compuestos pueden interaccionar inhibiendo su actividad
En relacioacuten con la siacutentesis de aacutecidos grasos hay que destacar las peculiares
caracteriacutesticas que reviste este proceso en bacterias y en cloroplastos Contienen
un sistema denominado tipo II (FASII) en el que cada reaccioacuten en el proceso de
biosiacutentesis estaacute catalizada por una proteiacutena independiente monofuncional al
contrario que en las ceacutelulas de mamiacutefero donde la siacutentesis estaacute mediada por una
proteiacutena multifuncional conocida como la aacutecido graso sintetasa de tipo I Los
inhibidores de enzimas de la ruta son el triclosan y la tiolactomicina un
metabolito secundario de hongos y estaacuten en desarrollo nuevos compuestos con
potencial terapeacuteutico
En faacutermacos dirigidos a la ruta de biosiacutentesis de isoprenoides vale la pena
destacar que el P falciparum depende de la viacutea 2C-metil-D-eritrol 4-fosfato
(MEP) para la siacutentesis de sus isoprenoides La fosmidomicina un antibioacutetico
natural producido por Streptomyces lavendulae ha demostrado ser un buen
tratamiento en el control de la malaria resistente porque inhibe de manera
especiacutefica la actividad de la enzima DOXP reductoisomerasa y porque controla
el segundo paso de la viacutea MEP
Otro proceso que tiene lugar durante las fases endo-eritrociacuteticas del paraacutesito
es la siacutentesis activa de estructuras de membrana Uno de los componentes
principales de las membranas del paraacutesito es el fosfoliacutepido fosfatidil-colina cuya
siacutentesis a su vez depende de la incorporacioacuten de colina exoacutegena a partir de la
sangre Distintos anaacutelogos de la colina exhiben una potente actividad
antimalaacuterica y se asume que inhiben el transporte de colina que tiene lugar a
traveacutes de un transportador especiacutefico localizado en la membrana del paraacutesito
(Vial HJ et alts 2004)
Existen un conjunto de compuestos que interfieren con la actividad
mitocondrial del paraacutesito Las fases endo-eritrociacuteticas tienen un metabolismo
mitocondrial activo estando presentes todas las enzimas implicadas en el ciclo
de los aacutecidos tricarboxiacutelicos y determinados componentes de la cadena de
transporte electroacutenico Asiacute la cadena respiratoria del paraacutesito constituye un
blanco de accioacuten para los faacutermacos Un ejemplo de desarrollo de faacutermacos por
esta viacutea es el Malaronereg donde la atovaquona se une al sitio de oxidacioacuten del
coenzima Q en el citocromo B del complejo III La accioacuten estaacute complementada
por la combinacioacuten con Proguanilo 45 (antifolato)
Prevencioacuten y Tratamiento
46
III42 Productos naturales
Los productos naturales han sido y son de gran intereacutes en el tratamiento de la
malaria La sociedad apuesta por lo natural y se plantean buacutesquedas de
compuestos activos en diferentes plantas de diferentes regiones africanas
(Magadula JJ y Erasto P 2009) o americanas (Mariath IR et alts 2009) ya
consideradas anteriormente como medicinales
La artemisina y sus derivados es el ejemplo a conseguir con estos
compuestos pero evitando en este caso el inconveniente de que solo puede
obtenerse por viacutea natural o semisinteacutetica
En esta liacutenea se siguen desarrollando derivados de artemisina y peroacutexidos que
tienen el mismo mecanismo de accioacuten que la artemisina viacutea radicales libres
(Muraleedharan KM and Mitchell A 2009) Uno de los muchos resultados de
esta variacioacuten de la estructura base son los compuestos hiacutebridos artemisinas-
quinolinas actualmente en desarrollo que dan lugar a los TCA recomendados
por la OMS Las benzo[c]fenantridinas son un grupo de compuestos
provenientes de extractos de plantas que pueden ser sintetizados y
modificados en un laboratorio (Rivaud M et alts 2012) Su mecanismo de
accioacuten estaacute todaviacutea por confirmar pero se cree que tienen actividad sobre la
inhibicioacuten de la ADN topoisomerasa que participa en la degradacioacuten de la Hb
Siguiendo con la liacutenea de productos naturales un objetivo que no se puede
pasar por alto son los compuestos marinos provenientes de esponjas algas
coraleshellip que contienen compuestos con estudiada actividad antimalaacuterica
(Gademann K y Kobyliska J 2009) Un ejemplo son las esponjas que
contienen diferentes familias de compuestos antimalaacutericos como las
pirroloquinolinas o las manzaminas A (Figura 23) de funcioacuten similar a la CQ y
mejor que la artemisina a igual dosis
Figura 23 Estructuras de compuestos naturales de origen marino
Prevencioacuten y Tratamiento
47
III43 Desarrollo de vacunas
Atendiendo a las observaciones sobre inmunidades que llegan a expresar las
personas que habitan zonas con altas tasas de malaria se van desarrollando las
vacunas Se ha comprobado que los esporozoiacutetos inactivos son muy eficaces
como inductores de la inmunidad en el ser humano Desafortunadamente no es
posible producir esporozoiacutetos inactivos en las enormes cantidades requeridas
para utilizarlos como meacutetodo viable de vacunacioacuten Por otro lado los avances
en materia de genoacutemica permiten identificar prometedoras moleacuteculas
inmunogeacutenicas con una rapidez mucho mayor y eso ampliacutea considerablemente
el nuacutemero de vacunas potenciales (Rojas Rivero L et alts 2005)
Las vacunas experimentales estaacuten basadas en diversos antiacutegenos derivados
de las diferentes formas que adopta el paraacutesito durante su ciclo de desarrollo
Los tipos de vacunas actualmente se clasifican en
Vacunas pre-eritrociacuteticas impiden que los esporozoiacutetos penetren o se
desarrollen en las ceacutelulas hepaacuteticas Estas vacunas prevendriacutean las
consecuencias graves y potencialmente mortales del paludismo en las
personas no inmunizadas Hasta la fecha se han ultimado unos 20 ensayos
cliacutenicos en el hombre con diversas proto-vacunas pre-eritrociacuteticas de
Plasmodium falciparum Una proto-vacuna muy prometedora es la RTS S
que promueve la activacioacuten del sistema inmunitario para que actuacutee contra
el P falciparum (Aponte JJ et alts 2007)
Vacunas contra las formas hemaacuteticas asexuadas son aquellas que impiden
que los merozoiacutetos penetren o se desarrollen en el interior de los hematiacutees
Se han desarrollado varios candidatos Sin embargo la mayoriacutea de esos
preparados se encuentra en estudios precliacutenicos y muy pocos han llegado a
estudios cliacutenicos de fase I debido en parte a la gran variabilidad que
manifiestan estas moleacuteculas en diferentes cepas
Vacunas bloqueadoras de la transmisioacuten son aquellas que estimulan la
produccioacuten de anticuerpos contra antiacutegenos de la fase sexuada del paraacutesito
que puedan impedir el desarrollo de esporozoiacutetos infecciosos en las
glaacutendulas salivales del mosquito Anopheles Teoacutericamente estas vacunas
podriacutean interrumpir el ciclo de transmisioacuten del paraacutesito al paso de este por
el vector y seriacutean de gran utilidad para reducir la diseminacioacuten de paraacutesitos
de cepas resistentes a otros tipos de vacunas El problema es que seriacutea
Prevencioacuten y Tratamiento
48
necesaria una vacunacioacuten masiva durante un largo periodo de tiempo
Actualmente hay algunas en estudios cliacutenicos de fase I
A pesar de todas las prometedoras vacunas que estaacuten en desarrollo
actualmente hay que tener en cuenta que los paraacutesitos desarrollan ingeniosos y
complejos mecanismos para soslayar la respuesta inmunitaria del hueacutesped Por
ejemplo son capaces de expresar diferentes antiacutegenos en cada una de las fases
de su ciclo de vida y a menudo modificar esos antiacutegenos cuando el hueacutesped
activa contra ellos su sistema inmunitario Ademaacutes se ha de vigilar la
complejidad inherente a la realizacioacuten de los propios ensayos cliacutenicos sobre el
terreno por cuanto no es faacutecil para los investigadores determinar la reduccioacuten
de la morbilidad y la mortalidad atribuible a la vacuna experimental
ANTECEDENTES
Antecedentes
51
La Unidad de I+D de Medicamentos de la Universidad de Navarra ha estado
trabajando durante varios antildeos en la siacutentesis de nuevos compuestos duales con
afinidad por los receptores 5-HT1A que fuesen a su vez inhibidores de la
recaptacioacuten de 5-HT para el tratamiento de la depresioacuten (Martinez- Esparza J
et alts 2001 Oruacutes L et alts 2002a Oruacutes L et alts 2002c Perez-Silanes S et
alts 2004)
Se llevaron a cabo estudios de modelizacioacuten molecular (Oruacutes L et alts
2002b) que definieron como farmacoacuteforo la estructura de la figura 24
Figura 24 Elementos farmacofoacutericos para la afinidad por los receptores 5-HT1 e inhibicioacuten del transportador de 5-HT
Los compuestos sintetizados podriacutean definirse como arilaminopropanoles
estructuralmente proacuteximos a las metanolquinolinas y arilaminoalcoholes
usados desde hace antildeos como antimalaacutericos Tal y como se como se ha tratado
en el apartado de introduccioacuten quinina y CQ (metanolquinolinas y
arilaminoalcoholes respectivamente) y halofantrina y lumefantina
(arilaminoalcoholes desarrollados tras la aparicioacuten de resistencias a las
anteriores) son compuestos de gran capacidad esquizonticida
Desde el punto de vista estructural la quinina y cloroquina pueden
considerarse farmacoacuteforos polivalentes ya que a partir de sus estructuras se han
desarrollado muchos de los compuestos que se usan como tratamiento de la
malaria en la actualidad La relacioacuten estructura-actividad de estos farmacoacuteforos
con base de quinolina se puede estudiar en la figura 25 (Konznetsov VV et
alts 2008)
Figura 25 Relacioacuten estructura actividad de la CQ
Antecedentes
52
Viendo la similitud estructural de los compuestos con estas estrucutras y los
aminoalcoholes utilizados en el tratamiento actual se decidioacute ensayar la posible
actividad antiplasmoacutedica de los mismos con buenos resultados en cepas
sensibles a la CQ (Perez-Silanes S et alts 2009)
Figura 26 Estructuras de los arilaminoalcoholes sintetizados como antidepresivos con mejor actividad antimalaacuterica Valores de CI50 en microM La CQ tiene un valor de 008 microM en cepas 3D7 sensibles a la CQ
Surgen asiacute las estructuras a desarrollar en este proyecto enfocado a la siacutentesis
de nuevos derivados de arilamino alcoholes para el tratamiento de la malaria
resistente a la CQ
OBJETIVOS Y
PLAN DE TRABAJO
IIVV OOBBJJEETTIIVVOOSS
Objetivos
57
El presente trabajo tiene como objetivo la buacutesqueda de nuevos derivados para
el tratamiento de la malaria resistente Teniendo en cuenta la estructura de los
aminoalcoholes derivados de la quinina y tomando como referencia la CQ se
propone la siacutentesis de nuevos derivados de arilaminoalcoholes con actividad
antimalaacuterica
El objetivo para llevar a cabo este proyecto estaacute basado en el trabajo detallado
a continuacioacuten
Revisioacuten bibliograacutefica de los faacutermacos con actividad antimalaacuterica
publicada hasta la fecha y planteamiento de un farmacoacuteforo
Disentildeo y siacutentesis de nuevos compuestos derivados de
arilaminoalcoholes con potencial actividad antimalaacuterica
Caracterizacioacuten estructural y evaluacioacuten bioloacutegica y computacional de
cada uno de los nuevos compuestos obtenidos
Estudio de la posible relacioacuten estructura-actividad de los compuestos
sintetizados que permita identificar liacutederes y una optimizacioacuten en el
disentildeo de nuevos derivados
Refinamiento estructural de nuevos compuestos con afinidad mejorada
por las dianas del plasmodio en base a los resultados obtenidos
VV PPLLAANN DDEE TTRRAABBAAJJOO
Plan de Trabajo
61
V1 Disentildeo de nuevos arilaminoalcoholes
Tal y como se ha comentado anteriormente se puede observar en la figura 27
que muchos de los compuestos antimalaacutericos de las diferentes subfamilias
tienen su base de desarrollo en la quinolina De ella surgen los dos compuestos
antimalaacutericos por excelencia
Figura 27 Esquema general del proceso de disentildeo de las moleacuteculas a desarrollar
Teniendo en cuenta todo esto se propone como estructura general de este
proyecto la mostrada en la figura 28
Figura 28 Esquema general de las nuevas estructuras
El proceso de disentildeo estructural de las nuevas moleacuteculas fue el siguiente
1 GRUPO AR1
En muchos de los compuestos antimalaricos mas relevantes como quinina o
cloroquina una constante en la estructura es la presencia del anillo de
quinolina aunque ya en los derivados de la familia de arilaminoalcoholes este
grupo es variable como en la halofantrina donde el grupo quinolina es
Plan de Trabajo
62
sustituido por el grupo fenantreno o el Benflumetol (lumefantrina) que cuenta
con un fluoreno sustituido
De este modo se plantea la posibilidad de la sustitucioacuten de la quinoleiacutena por el
benzo[b]tiofeno (basanda en estudios previos) el naftaleno (bioisoacutemero de la
quinoleiacutena) e incluso se plantea la simplificacioacuten a benceno (por motivos de
reduccioacuten estructurural) Se ha tenido en cuenta tambieacuten que en la familia de las
4-aminoquinolinas asociado a esa quinolina se presenta un grupo
electroatrayente (CF3) Asiacute se propone la introduccioacuten de un aacutetomo de fluacuteor
que es maacutes electronegativo y de menor tamantildeo
2 GRUPO Y
Si bien en la bibliografiacutea el grupo alcohol se considera esencial para la
actividad antimalaacuterica se quiso probar si en nuestros compuestos seguiacutea siendo
grupo esencial en la actividad Se estudioacute la actividad de los carbonilos
precursores de siacutentesis sustituyeacutendolos por un grupo oxima en posicioacuten 1 de la
cadena alifaacutetica en los nuevos derivados
3 CADENA ALIFAacuteTICA (CH2)n
En la familia de las aminoquinolinas y dentro del grupo de
arilaminoalcoholes se observa la presencia de una cadena alifaacutetica como puente
de unioacuten entre el grupo Ar1 y el resto de la moleacutecula De este modo los nuevos
derivados que desarrollar contaraacuten con una variacioacuten de uno a dos carbonos en
la cadena carbonada para determinar la longitud oacuteptima para la actividad
4 AMINA CENTRAL
El grupo amino es constante en todas las familias tomadas como referencia
Del mismo modo las aminoquinolinas tienen como similitud estructural entre
otras un grupo amino unido a la cadena alifaacutetica En este trabajo se plantea el
uso de piperazina homopiperazina (S)-aminopirrolidina aminopiperidina e
tetrahidropiridina para evaluar el efecto del cambio y determinar queacute tipo de
estructuras resulta maacutes conveniente
5 GRUPO AR2
En los compuestos tomados como referencia estructural de partida se observa
la presencia de las cadenas alifaacuteticas en el extremo amino Los nuevos
derivados combinan la amina ciacuteclica con un anillo aromaacutetico sustituido por
grupos electroatrayentes como CF3 (presentes en metanolquinolinas y
Plan de Trabajo
63
arilaminoalcoholes y de efecto positivo deducible para la actividad) el grupo
NO2 o el aacutetomo de F
Figura 29 Disentildeo de nuevas series de derivados de arilaminoalcoholes como nuevos agentes antimalaacutericos
V2 Siacutentesis de los compuestos disentildeados
Una vez disentildeados los compuestos y antes de empezar el trabajo de siacutentesis
se debe dejar claro cuaacutel va a ser el proceso elegido De forma general se puede
definir la siacutentesis de todos los derivados como siacutentesis lineal
La reaccioacuten de Mannnich que se usa para condensar metilcetonas con aminas
y las reacciones de condensacioacuten por sustitucioacuten nucleoacutefila alifaacutetica son
reacciones lineales La posterior reduccioacuten a hidroxilos u oximas se realiza en
un solo paso de reaccioacuten De esta forma nos aseguramos el menor nuacutemero de
pasos de reaccioacuten simplificacioacuten de la siacutentesis disminucioacuten del tiempo
invertido en el mismo y reduccioacuten del coste
V3 Caracterizacioacuten de los compuestos
Todas las reacciones seraacuten seguidas y controladas por cromatografiacutea en capa
fina Una vez obtenidos los compuestos se identificaraacuten por cromatografiacutea en
capa fina espectroscopia infrarroja resonancia magneacutetica nuclear de protoacuten
anaacutelisis elemental y punto de fusioacuten
Plan de Trabajo
64
V4 Evaluacioacuten bioloacutegica ldquoin vitrordquo
Los compuestos finales obtenidos seraacuten enviados a la Universidad de
Antioquiacutea (Medelliacuten Colombia) para la evaluacioacuten in vitro de su actividad
antimalaacuterica Los ensayos de toxicidad de los mismos se realizaraacuten en el
Laboratorio de Farmacologiacutea para el Desarrollo (IRD) de la Universidad Paul
Sabatier en Toulouse (Francia)
V5 Evaluacioacuten bioloacutegica ldquoin vivordquo
Aquellos compuestos que sean seleccionados por sus caracteriacutesticas de
estructura actividad in vitro y toxicidad seraacuten enviados a la Universidad Paul
Sabatier de Toulouse (Francia) para su evaluacioacuten in vivo
V6 Estudios computacionales
Todos los compuestos se someteraacuten a estudios computacionales sobre sus
propiedades fisicoquiacutemicas para obtener datos aproximados de su
comportamiento en solucioacuten (Log P) lipofilia o caraacutecter polar-apolar (presencia
de grupos polares y capacidad de formar enlaces donadores o aceptores) que
aporten datos teoacutericos sobre su absorcioacuten en el organismo A partir de los datos
conformacionales teoacutericos se plantea la unioacuten con una diana Los estudios
computacionales se realizaraacuten en la Unidad de I+D de Medicamentos de la
Universidad de Navarra
MATERIAL Y
MEacuteTODOS
VVII QQUUIacuteIacuteMMIICCAA TTEEOacuteOacuteRRIICCAA
VI1 Esquema general de siacutentesis
Figura 30 Reactivos y condiciones Viacutea 1 Carbonato potaacutesico en tetrahidrofurano a reflujo
Viacutea 2 Dioxolano con aacutecido clorhiacutedrico a reflujo 130-140ordmC
Quiacutemica Teoacuterica
70
VI2 Siacutentesis de precursores
VI21 Siacutentesis de (benzo[b]tiofen-3-il)-3-cloropropan-1-ona
Figura 31 Esquema general de siacutentesis de (benzo[b]tiofen-3-il)-3-cloropropan-1-ona
La siacutentesis de este derivado se lleva a cabo usando tricloruro de aluminio a
temperatura ambiente durante 48 horas (Peacuterez-Silanes S et alts 2001) En vez
de emplear cloroformo como disolvente tal y como describen los autores se
empleoacute diclorometano ya que es menos toacutexico y resulta igualmente efectivo
VI22 Siacutentesis de arilaminas
VI221 Siacutentesis de arilaminas protegidas
Los compuestos sintetizados se ajustan a la estructura general que se muestra
en la figura 32
Figura 32 Estructura general de las arilaminas intermedias sintetizadas
Las arilaminas sintetizadas tienen un extremo amino protegido con un grupo
tert-butiloxicarbonilo (BOC) voluminoso que evita que estas diaminas
reaccionen por ambos extremos con el fluoruro de arilo
Figura 33 Esquema general para la siacutentesis de arilaminas
Este tipo de reacciones raramente transcurren por un mecanismo de
sustitucioacuten nucleofiacutelica aromaacutetica (SNA) Normalmente la SNA dan bajos
rendimientos debido a que el enlace C (sp2)-X es maacutes corto y fuerte que el de un
carbono con hibridacioacuten sp3 La SN2 estaacute impedida por dificultades esteacutericas del
anillo para que se aproxime el nucleoacutefilo y la SN1 estaacute impedida por la
inestabilidad del catioacuten fenilo intermedio
Tras revisar la bibliografiacutea se propone que este tipo de SNA transcurren
seguacuten un mecanismo llamado Sustitucioacuten nucleofiacutelica aromaacutetica viacutea complejos
Quiacutemica teoacuterica
71
de meisenheimer (Figura 34) consistente en una adicioacuten-eliminacioacuten (Bruckner
et alts 2002)
En la primera fase la adicioacuten el nucleoacutefilo ataca al compuesto aromaacutetico en la
que es la etapa lenta de la reaccioacuten Se produce un carbanioacuten que es llamado
Complejo de Meisenheimer La carga negativa queda deslocalizada sobre los
cinco carbonos aromaacuteticos con hibridacioacuten sp2 del anillo pero no lo hace
uniformemente sino que se distribuye tal y como se indica en la figura 34
Figura 34 Primera Etapa Etapa lenta del mecanismo de reaccioacuten de sustitucioacuten nucleofiacutelica viacutea complejos de
Meisenheimer
El aacutetomo unido al nucleoacutefilo tiene hibridacioacuten sp3 ya que tambieacuten se
encuentra unido al sustituyente X que se elimina en una segunda etapa la fase
raacutepida de la reaccioacuten (Figura 35)
Figura 35 Segunda Etapa Etapa raacutepida del mecanismo de reaccioacuten de sustitucioacuten nucleofiacutelica viacutea complejos de
Meisenheimer
Independientemente del haloacutegeno X y del sustituyente R empleados en la
posicioacuten para respecto del aacutetomo de carbono al que ataca el nucleoacutefilo aparece
una carga parcial de -030 del mismo modo en las posiciones orto esta carga
parcial es de -025 y en la posiciones meta la carga es de -010 Como
consecuencia de esto uno de los requisitos maacutes importantes para que se de la
reaccioacuten es que alguacuten grupo electroatrayente estabilice el complejo La mayor
densidad de carga negativa se encuentra en para por lo que los grupos
electroatrayentes en esta posicioacuten estabilizan mucho el compuesto formado Por
esta razoacuten se han empleado grupos nitro o fluacuteor en dicha posicioacuten
El empleo de fluoruros de arilo para la formacioacuten de los intermedios de
aminas protegidas tambieacuten se explica por esta razoacuten El fluacuteor tiene un fuerte
efecto inductivo lo que estabiliza el complejo formado
Quiacutemica Teoacuterica
72
Tras una revisioacuten bibliograacutefica se observoacute que esta reaccioacuten esta favorecida
llevaacutendose a cabo en un medio de acetonitrilo (CH3CN) a reflujo en lugar del
dimetilsulfoacutexido (DMSO) anteriormente descrito usando carbonato potaacutesico
(K2CO3) (Blizzard et alts 2005) lo que facilita el trabajo por el bajo punto de
ebullicioacuten del medio y simplificando la extraccioacuten de los compuestos en este
medio
VI222 Desproteccioacuten de aminas
Las arilaminas sintetizadas tienen un extremo amino protegido con un grupo
BOC asiacute una vez formados los intermedios protegidos el paso siguiente para
continuar con la siacutentesis de los compuestos deseados consiste en eliminar este
grupo protector
Figura 36 Generacioacuten del carbocatioacuten t-butilo y del aacutecido carbaacutemico
La reaccioacuten de las aminas protegidas con aacutecidos acuosos como aacutecido
clorhiacutedrico y aacutecido aceacutetico (HCl y HAc) en condiciones de temperatura
ambiente rinde la consiguiente amina desprotegida en forma de hidrocloruro
Para esta reaccioacuten la amina protegida se disuelve en una disolucioacuten (11) de
HClHAc a temperatura ambiente generaacutendose un aacutecido carbaacutemico (Figura 36)
que es inestable y se descarboxila in situ (Figura 37) dando lugar a la amina
desprotegida en forma de hidrocloruro debido la presencia de HCl en el medio
Figura 37 Descarboxilacioacuten espontaacutenea del aacutecido carbaacutemico
Los hidrocloruros son compuestos poco solubles en muchos de los
disolventes orgaacutenicos y en ocasiones impiden los siguientes pasos de siacutentesis
Asiacute los intermedios se convierten a su forma de base libre por medio de su
disolucioacuten en agua y posterior adicioacuten de una disolucioacuten de hidroacutexido soacutedico
Quiacutemica teoacuterica
73
(NaOH) 2M de forma gradual hasta pH baacutesico para asegurar una completa
eliminacioacuten de HCl de la moleacutecula La disolucioacuten baacutesica se deja en agitacioacuten
durante dos horas aproximadamente Normalmente se observa como al antildeadir
la base se obtiene un precipitado debido a la insolubilidad de la amina en forma
de base libre en el medio acuoso mientras que en forma de hidrocloruro
resultaba soluble
Como uacuteltimo paso de reaccioacuten se procede a la extraccioacuten de la amina con un
disolvente orgaacutenico que suele ser diclorometano En general las aminas
precipitan faacutecilmente en hexano friacuteo como soacutelido Si fuese necesario purificar el
aceite impuro se realiza una cromatografiacutea en columna no flash con
diclorometano basificado con unas gotas de amoniacuteaco
VI3 Siacutentesis de derivados carboniacutelicos (Serie 0)
VI31 Condensacioacuten de 1-(benzo[b]tiofen-3-il)-3-cloropropan-1-ona y
de 2-bromo-2acute-acetonaftona con la amina (Viacutea 1)
En este caso los productos finales se obtienen a traveacutes de una reaccioacuten de
sustitucioacuten nucleofiacutelica alifaacutetica (Figura 38) a partir del 1-(benzo[b]tiofen-3-il)-3-
cloropropan-1-ona o del 2-bromo-2acute-acetonaftona y la correspondiente amina
Al tratarse de un cloruro de alquilo primario el mecanismo maacutes probable de
reaccioacuten es el de una sustitucioacuten nucleofiacutelica de segundo orden (SN2)
Figura 38 Esquema de siacutentesis de cetonas
La mayoriacutea de las veces los reactivos de partida no se llegan a consumir
completamente y se obtienen productos secundarios que no se eliminan con
facilidad Ha sido especialmente costosa la purificacioacuten de algunos compuestos
los que han requerido la purificacioacuten por medio dos columnas cromatograacuteficas
tradicionales consdecutivas columna tradicional seguida de una preparativa o
purificarlos dos veces consecutivas en el equipo de cromatografiacutea flash Todos
estos intentos de purificacioacuten ldquoparcialrdquo hacen disminuiacuter notablemente el
rendimiento de la reaccioacuten Otras veces los compuestos se precipitan como
hidrocloruro consiguiendo al mismo tiempo ser purificados
Quiacutemica Teoacuterica
74
VI32 Reaccioacuten de Mannich Condensacioacuten de metilcetonas con aminas
en medio aacutecido (Viacutea 2)
La reaccioacuten de Mannich consiste en la condensacioacuten de un compuesto que
posea aacutetomos de hidroacutegeno activos (sustrato) con formaldehiacutedo y una amina
para formar una moleacutecula conocida como ldquoBase de Mannichrdquo
En la mayor parte de las reacciones se usoacute el 13-dioxolano que es una amina
secundaria como compuesto generador de formaldehido El sustrato son
arilmetilcetonas donde el anillo aromaacutetico es fluorobenzo[b]tiofeno naftaleno
4-fluoronaftaleno o bencenos para-sustituidos El 13-dioxolano es ademaacutes el
disolvente y como catalizador el aacutecido clorhiacutedrico aporta al medio los protones
necesarios para la reaccioacuten
Las arilmetilcetonas utilizadas presentan hidroacutegenos aacutecidos en posiciones α
con respecto al grupo carboniacutelico (Figura 40) En medio aacutecido la acidez de estos
se debe a la estabilizacioacuten de la base conjugada (forma enoacutelica) por resonancia
La presencia del anillo en α con respecto al carbonilo provoca una situacioacuten de
deslocalizacioacuten electroacutenica π del sistema en su forma enoacutelica que se ve
favorecida por los sustituyentes electroatrayentes unidos al anillo La
reactividad aumenta debido a la retirada de carga del sistema π por estos
sustituyenes que acidifican asiacute los hidrogenos α
El mecanismo de reaccioacuten propuesto transcurre en dos etapas
En una primera etapa la amina reacciona con el formaldehiacutedo generando el
catioacuten iminio El 13 dioxolano es un acetal que en medio aacutecido genera
formaldehiacutedo ldquoin siturdquo para producirse entonces una adicioacuten nucleoacutefila de
la amina al carbonilo del compuesto no enolizable como es el recieacuten
generado formaldehiacutedo (Figura 39) (Tramontini et alts 1973)
Figura 39 Primera etapa del mecanismo de reaccioacuten propuesto para la formacioacuten de la base de Mannich
En la segunda etapa de reaccioacuten la metilcetona en medio aacutecido se protona
dando lugar a un equilibrio ceto-enoacutelico desplazado hacia la forma enoacutelica
(Figura 40)
Quiacutemica teoacuterica
75
Figura 40 Equilibrio ceto-enoacutelico en medio aacutecido
El ion iminio formado en la primera etapa es un buen electroacutefilo que
reacciona con la forma enolica nucleoacutefila obtenieacutendose como resultado la sal del
compuesto final (Figura 41) Asiacute el uacuteltimo paso de reaccioacuten es la basificacioacuten del
medio con una disolucioacuten acuosa de NaOH para la obtencioacuten de la sal
inorgaacutenica y compuesto orgaacutenico libre
Figura 41 Segunda etapa del mecanismo de reaccioacuten de Mannich
Se ha determinado experimentalmente que en la obtencioacuten de la base se
produce la misma reaccioacuten usando como generador de formaldehido el
paraformaldehido Para ella ha de usarse como medio de reaccioacuten un medio
proacutetico como el alcohol etiacutelico y HCl Despueacutes de varios experimentos y
optimizacioacuten de la temperatura necesaria para la reaccioacuten se comproboacute que la
viacutea oacuteptima por rapidez y rendimiento era la del 13 dioxolano
VI4 Siacutentesis de derivados hidroxiacutelicos (Series 1-7)
Los derivados hidroxiacutelicos se sintetizan a traveacutes de la reduccioacuten de las
correspondientes intermedios carboniacutelicos con borohidruro soacutedico (BH4Na) en
metanol a 0ordmC
Figura 42 Esquema general para la siacutentesis de alcoholes desde cetonas
En todas las reducciones que se han realizado se utiliza como agente
reductor el BH4Na que es probablemente el agente reductor maacutes usado en este
tipo de siacutentesis Se trata de un hidruro de reactividad media que presenta alta
quimioselectividad y un manejo sencillo en comparacioacuten con otros hidruros
El disolvente empleado es metanol con el que se logra una buena solubilidad
del BH4Na La temperatura de reaccioacuten se ha de mantener en torno a 0ordmC por
Quiacutemica Teoacuterica
76
tres motivos primero para evitar que la reaccioacuten se deacute demasiado raacutepida lo que
conlleva la aparicioacuten de productos secundarios en segundo lugar para evitar
que sea demasiado lenta lo que favorece la reaccioacuten secundaria entre el
borohidruro y el metanol El tercer motivo es impedir que tenga lugar la
reaccioacuten inversa a la reaccioacuten de Mannich
En general la reaccioacuten entre el BH4Na y el compuesto se da por completo
durante la primera hora de reaccioacuten antes de que tenga lugar la reaccioacuten
inversa de descomposicioacuten del compuesto cetoacutenico El mecanismo de reaccioacuten
no se ha descrito de forma totalmente definitiva aunque siacute que parece seguro el
hecho de que la estequiometriacutea de la reaccioacuten es de cuatro moleacuteculas de cetona
por una de BH4Na
La reaccioacuten transcurre siguiendo una transferencia secuencial de hidruros
desde la moleacutecula de BH4Na hasta cada una de las cuatro cetonas a traveacutes de
sendos ataques nucleofiacutelicos a los carbonos carboniacutelicos que tras estas
transferencias forman la sal soacutedica del tetraborato Este complejo sufre con
posterioridad una hidroacutelisis dando lugar finalmente a la formacioacuten del alcohol
(Figura 43)
Figura 43 Mecanismo de reaccioacuten propuesto para la siacutentesis de los alcoholes
Quiacutemica teoacuterica
77
El disolvente utilizado es el metanol que al ser un disolvente proacutetico cumple
la misioacuten de reducir la energiacutea de activacioacuten que es demasiado grande para que
la reaccioacuten se produzca de forma espontaacutenea a pesar de que el proceso neto es
exoteacutermico Esta cataacutelisis de la reaccioacuten se debe a la estabilizacioacuten que el
disolvente aporta al estado de transicioacuten ademaacutes de estabilizar el borano y el
anioacuten alcoacutexido cuando eacutestos no se hayan unido
Todos los derivados hidroxiacutelicos se han purificado por cromatografiacutea en capa
fina cromatografiacutea de columna cromatografiacutea preparativa o cromatografiacutea
flash Algunos se han precipitado en forma de hidrocloruro mediante la
adicioacuten de eacuteter saturado de aacutecido clorhiacutedrico
Estereoquiacutemica de la reaccioacuten
Las cetonas asimeacutetricas empleadas en estas reacciones son productos
proquirales por lo que dan lugar a las dos configuraciones posibles del
derivado hidroxiacutelico R y S La reaccioacuten rinde una mezcla raceacutemica ya que el
borohidruro soacutedico no es agente estereoselectivo y el grupo carbonilo es plano
con lo que el ion hidruro puede atacar por ambos lados del grupo con igual
probabilidad Ademaacutes estas moleacuteculas no poseen grupos voluminosos que
favorezcan la aparicioacuten de un mayor porcentaje de uno de los enantioacutemeros
Dado que es muy costoso el aislamiento de los isoacutemeros por separado se
replanteariacutea este trabajo en caso de encontrar una moleacutecula especialmente
activa
Reacciones secundarias
Una de las reacciones secundarias maacutes frecuentes es la rotura de la base de
Mannich formada a traveacutes de una desaminacioacuten o de una desaminometilacioacuten
que recibe el nombre de ldquoretro-Mannichrdquo (Tramontini y Angiolono 1990) La
reaccioacuten tiene como productos los reactivos de partida de la condensacioacuten
carboniacutelica
Todaviacutea no queda claro el porqueacute de estas reacciones pero podriacutea deberse a
un aumento de la temperatura del medio provocada por una adicioacuten
demasiado raacutepida de BH4Na o por una excesiva basificacioacuten del medio
ocasionada por un exceso del agente reductor
Quiacutemica Teoacuterica
78
VI5 Siacutentesis de oximas (Serie 8)
La siacutentesis de estos derivados se abordoacute a partir de los derivados carboniacutelicos
mediante una condensacioacuten de estos con hidroxilamina usando etanol (EtOH)
como disolvente (Figura 44)
Figura 44 Esquema general de reduccioacuten de carbonilo a oxima
El mecanismo de la reaccioacuten transcurre en dos etapas a traveacutes de un
intermedio cuya existencia ha sido verificada mediante el uso de teacutecnicas de
espectroscopia de IR (Martinez J 1999)
La primera etapa consiste en la formacioacuten del intermedio de reaccioacuten para lo
cual es necesaria la presencia de hidroxilamina en su forma libre (la forma
protonada no posee caraacutecter nucleofiacutelico) por lo que esta etapa de la reaccioacuten se
veraacute favorecida a pH baacutesico
Figura 45 Mecanismo de reaccioacuten propuesto para la formacioacuten del intermedio de reaccioacuten en la formacioacuten de oximas
La segunda etapa consiste en la deshidratacioacuten del intermedio que estaraacute
favorecida por un pH aacutecido La velocidad de la reaccioacuten dependeraacute del pH de la
misma y asiacute mientras que en un pH baacutesico la adicioacuten de hidroxilamina es un
proceso raacutepido y es la segunda etapa la que controla la velocidad de reaccioacuten lo
contrario ocurre a pH aacutecido siendo entonces la primera etapa la que controla la
velocidad de reaccioacuten
Figura 46 Mecanismo propuesto para la formacioacuten de la oxima por deshidratacioacuten del intermedio de reaccioacuten en media aacutecido
Quiacutemica teoacuterica
79
Estereoquiacutemica de la reaccioacuten
La formacioacuten de oximas puede producir dos isoacutemeros posibles el Z o cis y el
E o trans
Figura 47 Isomeriacutea cis-trans de los derivados oxima31
Se observoacute que seguacuten el derivado carboxiacutelico del que se partiacutea se obteniacutea
mayoritariamente un isoacutemero u otro pero aunque no se ha encontrado
explicacioacuten a esta selectividad
31 El estudio espectroscoacutepico de ambos isoacutemeros se encuentra desarrollado en la tesis del Dr J Martinez Esparza (1999)
VVIIII QQUUIacuteIacuteMMIICCAA EEXXPPEERRIIMMEENNTTAALL
Quiacutemica experimental
83
VII1 Instrumental y reactivos
Los reactivos quiacutemicos utilizados en siacutentesis fueron adquiridos en E Merck
(Darmstadt Alemania) Scharlau (FEROSA Barcelona Espantildea) Panreac
Quiacutemica SA (Montcada i Reixac Barcelona Espantildea) Sigma-Aldrich Quiacutemica
SA (Alcobendas Madrid) Acros Organics (Janssen Pharmaceuticalaan 3a
2440 Geel Beacutelgica) Maybridge (Cornwall Reino Unido) Lancaster (Bischheim-
Strasbourg Francia) y Prolabo (Leuven Belgica)
Las cromatografiacuteas de capa Fina se desarrollan sobre gel de siacutelice de 02 mm de
espesor (Alugram SIL GUV254 [ref 818133] Macherey-Nagel Alemania) Las
placas se desarrollan en diclorometanometanol en diferentes proporciones y
se revelan bajo una laacutempara ultravioleta a longitud de onda 254 y 365 nm
La cromatografiacutea en columna se desarrolla en columnas de vidrio
empaquetadas con siacutelica gel 60 (0040-0063 mm y 0063-0200 mm de tamantildeo
de partiacutecula Merck) con fases moacuteviles diclorometanometanol o
hexanoacetato en diferentes proporciones
La cromatografiacutea preparativa se desarrolla en placas de vidrio rectangulares
sobre las cuales se preparan laacuteminas de siacutelica gel (Siacutelica Gel 60 PF254
cromatografiacutea en capa fina (ref 1077472500) Merck KGaA Darmstadt
Alemania) de 1 mm de grosor La fase moacutevil utilizada en esta metodologiacutea es
diclorometanometanol 973
La cromatografiacutea flash se realiza en un equipo de cromatografiacutea Combiflashreg
Rf 200 (Teledyne Isco Lincoln USA) Se desarrolla en columnas flash de fase
normal de 12 gramos RediSepreg Rf Columns (Teledyne Isco USA) con un
gradiente binario hasta 991 diclorometanometanol (pureza de siacutentesis SDS-
Carlo Erba Reactifs Francia)
Formacioacuten de hidrocloruro algunos de los compuestos fueron purificados o
precipitados en forma de sales Para ellos se utilizoacute eacuteter saturado de HCl
preparado en el laboratorio
VII2 Meacutetodos de elucidacioacuten estructural
Todos los compuestos sintetizados han sido caracterizados quiacutemicamente por
cromatografiacutea en capa fina (CCF) punto de fusioacuten espectroscopia infrarroja
(IR) resonancia magneacutetica nuclear (RMN) anaacutelisis elemental de carbono
Ensayos Bioloacutegicos
84
hidroacutegeno y nitroacutegeno (CHN) y cromatografiacutea liacutequida de alta resolucioacuten
(HPLC)
Los puntos de fusioacuten han sido determinados en un equipo Mettler FP82 +
FP80 (Greifense Suiza) y no han sido corregidos La temperatura de fusioacuten se
muestra en grados centiacutegrados (0C)
Los espectros de IR han sido registrados en un equipo Thermo Nicolet FTIR
Nexus Euro (Madison USA) con el programa informaacutetico OMNIC 60
empleando pastillas de bromuro potaacutesico Las frecuencias se expresan en cm-1 y
las intensidades de sentildeal se representan como md (media deacutebil) d (deacutebil) m
(media) f (fuerte) y mf (muy fuerte)
Los espectros de RMN-1H han sido registrados en un equipo Brucker 400
UltrasieldTM (Brucker BioSpin GmbH Rheinstelten Alemania) utilizando como
referencia interna tetrametilsilano en una concentracioacuten aproximada de 01
gmL de TMS y dimetilsulfoacutexido-d6 (DMSO-d6) o cloroformo deuterado
(CDCl3) como disolventes La concentracioacuten de las muestras ha sido
aproximadamente 20 mgmL Para la deteccioacuten de los protones laacutebiles se
emplean unas gotas de agua deuterada Los desplazamientos quiacutemicos (δ) han
sido expresadas en ppm relativas a tetrametilsilano y las multiplicidades de
sentildeal se han representado como se indican en las siguientes abreviaturas sa
(sentildeal ancha) s (singlete) d (doblete) t (triplete) c (cuadruplete) m
(multiplete) dd (doble doblete) y ddd (doble doblete desdoblado) Las
constantes de acoplamiento J han sido expresadas en Hz Los experimentos
HMBC (espectros en 2D para determinar los acoplamientos de protones a larga
distancia) HMQC (espectros en 2D para observar los acoplamientos C-H en la
moleacutecula) DEPT-135 (espectros en 1D donde los CH y CH3 salen positivos y
los CH2 negativos) DEPT-90 (espectros en 1D donde solo aparecen los grupos
CH) RMN-13C y COSY (espectro 2D para determinar los acoplamientos de los
protones con los protones vecinos) se han registrado en el mismo equipo
empleado para la resonancia de protoacuten utilizando los mismos disolventes
deuterados
Los CHN han sido obtenidos en un microanalizador LECO CHN-900(Tres
cantos Espantildea) a partir de muestras previamente secadas con pentoacutexido de
foacutesforo durante 24-48 horas a vaciacuteo (3-4 mm Hg) y temperatura ambienteEl
intervalo de error admitido para cada producto es de plusmn04 para cada tipo de
aacutetomo determinado
Quiacutemica experimental
85
Los tiempos de retencioacuten y longitudes maacuteximas de absorcioacuten para la
determinacioacuten de pureza y caracterizacioacuten han sido obtenidos en un equipo de
HPLC Los experimentos fueron realizados en un cromatoacutegrafo Ultimate 3000
(DIONEX) controlado por el software Cromeleon versioacuten 68 Las medidas se
obtuvieron con una columna RP18 (LICHROSPHER 100 RP18 EC 5 microm
10x046 TEKNOKROMA) como fase estacionaria y un flujo de 1 mL minuto
con metanolagua (8020) como fase moacutevil Los tiempos de retencioacuten (tR) se
expresan en minutos y las longitudes de onda maacuteximas en nm
VII3 Denominaciones de compuestos
El criterio elegido para la asignacioacuten de las referencias ha sido el siguiente En
primer lugar se dividen los compuestos obtenidos en carbonilos hidroxilos y
oximas Los derivados carboniacutelicos son considerados como intermedios en la
reaccioacuten global asiacute que se les asigna el nombre de Serie 0 Los compuestos
hidroxiacutelicos son los que corresponden estructuralmente con los
arilaminoalcoholes antimalaacutericos objeto central de este trabajo que se divide en
subgrupos En el caso de las oximas se ha denominado al grupo de compuestos
como Serie 8
La primera divisioacuten se realiza seguacuten la naturaleza del Ar1 y de la longitud de la
cadena alifaacutetica
Figura 48 Estructura general de los derivados hidroxiacutelicos sintetizados
Serie 1 2 3 4 5 6 7
Ar1
n 2 2 2 1 2 2 2
Tabla 1 Distribucioacuten de compuestos en series por Ar1
Ademaacutes de la serie numeacuterica una letra diferenciaraacute cada compuesto seguacuten la
amina y los sustituyentes Ra y Rb del benceno de Ar2 que conforman cada
derivado De esta forma
Ensayos Bioloacutegicos
86
a b c d e f g
Amina
RaRb CF3N
O2 NO2CF3 HCF3 CF3NO2 CF3NO2 CF3NO2 HF
Tabla 2 Denominacioacuten de compuestos
Siguiendo este orden alfabeacutetico los derivados que forman la Serie 0 son
numerados seguacuten el mismo criterio
Ejemplo un compuesto hidroxiacutelico que presenta un aacutetomo de fluacuteor en Ar1
unido a un grupo naftaleno con una piperidina central y grupo fenil con Ra
trifluorometil y Rb nitro se denomina como compuesto 5f
Referencia Serie 5f
Ar1= FNFT
(CH2) n n=2
Amina= PIPR
Ar2 Ra=CF3 ndash Rb= NO2
VII4 Descripcioacuten general de meacutetodos de siacutentesis
VII41 Meacutetodo A procedimiento general para la obtencioacuten de las
arilaminas protegidas
En 30 mL de acetonitrilo (CH3CN) se disuelven 1 equivalente de la amina
comercial protegida y 12 equivalentes del halogenuro de arilo correspondiente
seguacuten la arilamina que se desee sintetizar en cada caso Se antildeaden tambieacuten 15
equivalentes de carbonato potaacutesico (K2CO3) para neutralizar el medio de
reaccioacuten Se hace reaccionar a reflujo un maacuteximo de 24 horas tras lo cual se
elimina el CH3CN en el rotavapor El residuo obtenido se disuelve en
diclorometano y se extrae tres veces con agua La fase orgaacutenica obtenida se seca
con sulfato soacutedico anhidro se filtra y se elimina el disolvente a sequedad en el
rotavapor obtenieacutendose la correspondiente BOC-arilamina
Quiacutemica experimental
87
VII42 Meacutetodo B procedimiento general para la desproteccioacuten de
aminas
Se disuelve la amina protegida en 40 mL de disolucioacuten HClAcH (11)
observaacutendose ligera efervescencia por el desprendimiento de H2 Se deja
agitando 2 horas a temperatura ambiente Transcurrido el tiempo se elimina el
disolvente en el rotavapor El clorhidrato obtenido se disuelve en agua y se
antildeade NaOH 2M hasta conseguir pH baacutesico Se agita 2 horas y la mezcla de
reaccioacuten se extrae con DCM La fase orgaacutenica se seca con sulfato soacutedico anhidro
se filtra y se elimina el disolvente a sequedad en el rotavapor obtenieacutendose la
correspondiente arilamina desprotegida
VII43 Meacutetodo C procedimiento general para condensacioacuten de aminas
(Viacutea 1)
Se disuelven en 40 mL de tetrahidrofurano (THF) las cantidades indicadas en
cada caso de 1-(benzo[b]tiofen-3-il)-3-cloropropan-1-ona o 2-bromo-2acute-
acetonaftona y la amina deseada en proporciones 11 Se antildeade la cantidad
equimolecular de carbonato potaacutesico Se deja agitando un maacuteximo de 24 horas a
temperatura ambiente y en el transcurso de ese tiempo se sigue el desarrollo de
la reaccioacuten por CCF Se elimina el THF en el rotavapor a presioacuten reducida y el
residuo obtenido se disuelve en diclorometano para lavarlo tres veces con agua
La fase orgaacutenica se seca con sulfato soacutedico se filtra y se elimina el disolvente en
el rotavapor El residuo obtenido se purifica por el meacutetodo descrito en cada
caso
Esta viacutea se siacutentesis se aplica a la obtencioacuten de los derivados de la Serie 0 1 2
3 14 y 15 que son los intermedios para la obtencioacuten las Series 1 y 4
VII44 Meacutetodo D procedimiento de condensacioacuten de aminas (Viacutea 2)
En un matraz se ponen las cantidades indicadas de 1-(5-fluorobenzo[b]tiofen-
3-il)etanona 2-acetonaftona 4-fluoro-1acute-acetonaftona 4-fluoroacetofenona o 4-
(trifluorometil)acetofenona y la amina deseada en proporciones
equimoleculares Se antildeade 13 dioxolano en una proporcioacuten 14 molar y se
antildeaden varias gotas HCl concentrado Se lleva a reflujo a una temperatura de
bantildeo de 130-140 ordmC siguiendo la reaccioacuten por CCF Finalizada la reaccioacuten se
enfriacutea a temperatura ambiente y se antildeade agua y NaOH 2M hasta pH baacutesico en
agitacioacuten El compuesto se extrae con diclorometano y se seca la fase orgaacutenica
con sulfato soacutedico anhidro Se filtra y elimina el disolvente en el rotavapor a
Ensayos Bioloacutegicos
88
sequedad El residuo obtenido puede precipitar puro o necesitar posterior
purificacioacuten por los meacutetodos descritos en cada caso
Esta viacutea de siacutentesis se aplica para la obtencioacuten de la mayor parte de los
compuestos de la Serie 0 intermedios para la obtencioacuten de las Series 2 35 6 7
y 8
VII45 Meacutetodo E procedimiento general para la reduccioacuten de cetonas
En un bantildeo de hielo a 0 ordmC se pone un matraz con 10 mL de metanol a
enfriar Una vez friacuteo se antildeade el compuesto carboniacutelico al matraz y se deja en
agitacioacuten Se le antildeade a la disolucioacuten enfriada aproximadamente 200 mg de
BH4Na observaacutendose efervescencia Se deja en agitacioacuten un maacuteximo de una
hora manteniendo la temperatura del bantildeo siguiendo la evolucioacuten por CCF
Transcurrido el tiempo se antildeaden 5 mL de agua que inactivan el BH4Na y se
elimina a vaciacuteo el disolvente Se extrae con DCM y la fase orgaacutenica se seca con
sulfato soacutedico anhidro Se filtra y se elimina el disolvente a vaciacuteo El residuo
puede precipitar puro o necesitar purificacioacuten por cromatografiacutea en columna
flash o mediante formacioacuten del correspondiente hidrocloruro
Se obtienen por este meacutetodo los compuestos de las Series 1 a 7
VII46 Meacutetodo F procedimiento general para siacutentesis de oximas desde
carbonilos
En un matraz se pone la cantidad de carbonilo obtenido deseada y se antildeade
el clorhidrato de hidroxilamina en proporcioacuten 1 55 molar respectivamente Por
uacuteltimo se antildeaden 15 mL de EtOH y se lleva a reflujo durante 90 minutos
Pasado el tiempo se retira el reflujo y se deja enfriar unos minutos A
continuacioacuten se antildeaden 30 mL de una disolucioacuten previamente preparada de
NaOH 2M en EtOH hasta que el pH es baacutesico y se lleva media hora maacutes a
reflujo Se deja enfriar la reaccioacuten se antildeade un poco de agua al matraz y se hace
una extraccioacuten acetato de etiloagua Se seca y se elimina el disolvente en el
rotavapor obteniendo un soacutelido impuro que se purifica solubilizando las
impurezas en diclorometano puesto que la oxima no es soluble en ese
disolvente El soacutelido que se obtiene se lava con eacuteter etiacutelico para su purificacioacuten
Se obtienen por este meacutetodo los compuestos de la Serie 8
Quiacutemica experimental
89
VII5 Purificacioacuten por cromatografiacutea flash
La cromatografiacutea manual en columna de vidrio tradicional ha sido uno de los
meacutetodos de purificacioacuten maacutes usados en quiacutemica orgaacutenica por ser un meacutetodo
praacutectico de bajo coste y controlado por el operario Por otro lado lleva asociado
algunos inconvenientes como la baja resolucioacuten y reproducibilidad teacutecnica
costosa en tiempo opciones de tipo de elucioacuten limitadas baja utilidad en
separacioacuten de muestras complejas y baja estandarizacioacuten del sistema por la falta
de automatizacioacuten La evolucioacuten para mejorar todos estos puntos deacutebiles pasa
por la automatizacioacuten del sistema que va desde la inyeccioacuten de la muestra hasta
la coleccioacuten automaacutetica que permite la realizacioacuten de otros trabajos durante la
separacioacuten de los compuestos Ademaacutes aumenta la reproducibilidad y la
productividad Seguacuten la muestra que purificar y sus caracteriacutesticas
fisicoquiacutemicas se ha de seleccionar las condiciones de trabajo del equipo de
cromatografiacutea flash
Fase estacionaria Existen disponibles comercialmente una gran variabilidad
de columnas con distintas fases estacionarias La maacutes usual que es tambieacuten la
empleada en este trabajo es la columna de siacutelica de fase normal Pero tambieacuten
se dispone de columnas C18 fase reversa columnas de aminas aluacutemina baacutesica
aluacutemina neutra ciano diol de intercambio anioacutenico y de intercambio catioacutenico
Las columnas de siacutelica de fase normal estaacuten formadas por un poliacutemero de oacutexido
de silicio entrecruzado tetraeacutedricamente En medio acuoso las valencias libres
de los aacutetomos de silicio adsorben grupos hidroxilos formando grupos silanol
polares en la superficie
Claacutesicamente para cada gramo de compuesto que va a ser purificado se pone
100 g de siacutelica gel (1 de carga) pero en el nuevo sistema las columnas estaacuten
preparadas para el 10 de carga En este trabajo se ha usado columnas de siacutelica
de 12 g de tamantildeo (tamantildeo de partiacutecula 35-70 microm y tamantildeo de poro 60 Aring con
una capacidad de muestra de 12 a 1200 mg con flujo oacuteptimo 25-40 mLmin y
volumen 168 mL
Fase moacutevil Al igual que la fase estacionaria la eleccioacuten de la fase moacutevil
depende de la muestra a purificar Existen diferentes gradientes de elucioacuten
siendo el gradiente binario el maacutes utilizado en la separacioacuten de compuestos
Controlando el gradiente se pueden obtener tiempos de elucioacuten menores
menor dependencia de los factores oacuteptimos de separacioacuten y mayor eficacia
repetitividad y pureza El gradiente elegido en este caso para la purificacioacuten de
compuestos es el isocraacutetico lineal donde se alternan periodos donde las
Ensayos Bioloacutegicos
90
proporciones de mezcla de solventes permanecen constantes en el tiempo con
otros periodos donde aumenta la proporcioacuten del solvente maacutes polar
Para la eleccioacuten del solvente adecuado se realiza un estudio previo del
desarrollo de los componentes en CCF ya que esto da una aproximacioacuten del
comportamiento de los componentes de la muestra en la columna durante la
purificacioacuten Se ha seleccionado la mezcla DCMmetanol en todos los casos de
purificacioacuten de compuestos por la buena separacioacuten de componentes que ha
mostrado No es posible la utilizacioacuten de metanol al 100 ya que se podriacutean
producir dantildeos en las columnas de fases estacionarias Ademaacutes la estabilidad
de las bombas tambieacuten podriacutea verse afectada por tanto ha de utilizarse como
fase moacutevil polar una mezcla DCMmetanol 8020
Longitud de onda de deteccioacuten La longitud de onda de deteccioacuten oacuteptima ha
de ser elegida seguacuten la estructura quiacutemica de la muestra En el caso de
arilaminoalcoholes se ha seleccionado como longitud de onda de deteccioacuten 254
nm que es la oacuteptima para aromaacuteticos En el caso de los derivados de las Series
3 4 y 5 (naftalenos) como el equipo ofrece la posibilidad de detectar dos
longitudes de onda se seleccionoacute la deteccioacuten a 365 nm como complementaria
Teacutecnicas de carga de muestra Las muestras son cargadas en el sistema en
estado soacutelido o en disolucioacuten dependiendo de la solubilidad que presenten a la
fase menos polar con la que se inicia la purificacioacuten En el caso de muestras
solubles al diclorometano se realiza una disolucioacuten con la miacutenima cantidad de
solvente posible y se inyectan en el equipo Si la muestra no es soluble al
diclorometano se realiza una disolucioacuten soacutelida en siacutelica gel 60 (0040-0063 nm
de tamantildeo de poro) Para ello se disuelve la muestra en un solvente adecuado y
se antildeade siacutelica Se elimina el disolvente a sequedad a vaciacuteo y se pone la muestra
en un cartucho vaciacuteo especial para este tipo de muestras desde donde el equipo
inyectaraacute automaacuteticamente la muestra
VVIIIIII EENNSSAAYYOOSS BBIIOOLLOacuteOacuteGGIICCOOSS
Ensayos bioloacutegicos
93
VIII1 Ensayos in vitro
Los compuestos descritos han sido ensayados por el Grupo Malaria de la
Universidad de Antioquiacutea en Medelliacuten (Colombia)
Los ensayos in vitro han sido realizaron en cepas sensibles a la CQ NF-54 y
Colombian FCR-3 de Plasmodium falciparum resistentes a la CQ Los cultivos se
desarrollaron a 37ordmC en una atmoacutesfera de CO2 al 5 y en un medio de glucosa
enriquecida RPMI 1640 con gentamicina a una concentracioacuten de 01 mgmL y
suero humano al 10 inactivado por calor como se describe en la bibliografiacutea
(Trager y Jensen 1976) Los compuestos se disuelven en dimetilsulfoacutexido
(DMSO) hasta completar un rango de concentraciones entre 200 y 01 microM La
concentracioacuten final de DMSO nunca es superior al 01
La actividad antimalaacuterica in vitro se mide utilizando el ensayo de
incorporacioacuten de hipoxantina tritiada (MP Biomedicals USA) seguacuten el meacutetodo
de Desjardins (Desjardins et alts 1979) El meacutetodo consiste en una medicioacuten
indirecta de la actividad metaboacutelica del paraacutesito por medio de la incorporacioacuten
de un precursor de aacutecidos nucleicos marcado radiactivamente El Plasmodium es
incapaz de sintetizar las purinas que necesita para su replicacioacuten obtenieacutendolas
de una fuente externa La utilizacioacuten del precursor de purinas marcadas
permitiraacute determinar la incorporacioacuten del material geneacutetico del paraacutesito y por
tanto se comportaraacute como marcador de la regeneracioacuten del mismo
Los ensayos se realizan por triplicado y los resultados se obtienen por
interpolacioacuten lineal (Huber y Koella 1993) Finalmente se expresan como CI50
(concentracioacuten que produce una inhibicioacuten del 50 del crecimiento plusmn la
desviacioacuten estaacutendar) siendo
Log (IC50) = log (X1) + (50-Y1)(Y2-Y1) [log (X2) ndash log (X1)]
Siendo X1 Concentracioacuten del compuesto que da un de inhibicioacuten de la
parasitemia Y1gt50 X2 Concentracioacuten de compuesto que da un de
inhibicioacuten de la parasitemia Y2lt50
El porcentaje de incorporacioacuten de hipoxantina unida al paraacutesito se calcula con la siguiente ecuacioacuten
hipoxantina incorporada = 100 ndash (PTx100)
Siendo P cuentas por minuto (cpm) para cada concentracioacuten T control
negativo (eritrocitos sin tratar)
Ensayos bioloacutegicos
94
VIII2 Ensayos toxicoloacutegicos
Los ensayos de citotoxicidad de los compuestos se realizaron en dos etapas
Inicialmente se llevaron a cabo en la Universidad Cayetano Heredia (UPCH) en
Lima Peruacute y posteriormente en la Universidad Paul Sabatier (Toulouse III) en
Toulouse Francia
La toxicidad de todos los compuestos se evaluaron en ceacutelulas epiteliales de
rintildeoacuten de mono African (Vero) Estas ceacutelulas fueron cultivadas con medio
DMEN F-12 (Cat Nordm BE12-719F) suplementado con 10 de suero fetal bovino
inactivado por calor NEAA piruvato de Na y mantenidas en una incubadora a
37 ordmC con una atmoacutesfera de 5 de CO2 La evaluacioacuten toxicoloacutegica se realiza en
placas de 96 pocillos de fondo plano adicionando 100 microL de cultivo de ceacutelulas
Vero a cada pocillo a una concentracioacuten de 10x105 ceacutelulaspocillo Los
compuestos se antildeadieron a diferentes concentraciones 100 microgmL 10 microgmL 1
microgmL y 01 microgmL y el efecto se evaluacutea 48 horas despueacutes de haber adicionado
el compuesto
El efecto se determinoacute usando el ensayo de viabilidad celular del MTT que
consiste en adicionar 10 microL de MTT a una concentracioacuten de 10 microgmL en las
placas que son colocadas nuevamente en la incubadora cubiertas con papel
aluminio durante el periodo de incubacioacuten Cuatro horas despueacutes de finalizado
el periodo de incubacioacuten se antildeade 100 microL de una solucioacuten de lisis que contiene
50 de isopropanol 10 de SDS y se deja reposar las placas a temperatura
ambiente en un orbital a 150 rpm durante 30 minutos
Finalmente se lee la densidad oacuteptica con un escaacutener de 96 pocillos a 590 nm
en un equipo Bio-Rad Todos los experimentos se realizan por triplicado
El dato de inhibicioacuten de crecimiento GI50 se determina por anaacutelisis de
regresioacuten linear definido como la concentracioacuten de compuesto que produce el
50 de reduccioacuten de absorbancia comparaacutendola con los controles
VIII3 Ensayos in vivo
Los procedimientos se desarrollaron siguiendo el manual de Teacutecnicas de
laboratorio para la seleccioacuten de sustancias antimalaacutericas (Deharo et alts 2000)
en el Laboratorio de Farmacologiacutea para el Desarrollo perteneciente al Instituto
para el Desarrollo (IRD) de la Universidad Paul Sabatier (Toulouse III) de
Toulouse (Francia)
Ensayos bioloacutegicos
95
VIII31 Instrumental y reactivos
Los estudios in vivo se llevaron a cabo seguacuten la legislacioacuten francesa sobre
cuidado y uso de animales de laboratorio vigente (Ndeg 008430) Se utilizaron
ratones macho IOPF Swiss de 4-6 semanas de vida con un peso de 20 2 g con
certificado negativo para Encephalitozoom cuniculi (Janvier Saint Berthevin
Francia) El animalario-bioterio de la Facultad de Farmacia de la Universidad
Paul Sabatier se encargoacute del cuidado de animales mantenimiento condiciones
ambientales de las instalaciones y eliminacioacuten del material bioloacutegico
Las cepas usadas tanto para los ensayos de virulencia como para los estudios
provienen de la reserva de material bioloacutegico del IRD De ahiacute se descongelaron
una cepa Plasmodium berghei NK65 y otra Plasmodium petteri que se encontraban
bien identificadas dentro de tanques de nitroacutegeno liacutequido en caacutemaras
refrigeradas del IRD
Los materiales empleados en el manejo animal fueron agujas Neolus de 05
mm y jeringas de 1 mL U100 Insulin de Tarumo Europe NV (Beacutelgica) Ademaacutes
se usoacute heparina Sigma H6263 (Alemania) suero fisioloacutegico esteacuteril Baxter
(Francia) y viales de plaacutestico con tapoacuten no esteacuteriles Para los frotis se usaron
laacuteminas portaobjetos de vidrio (Tarumo Europe NV Belgica) y metanol de
calidad HPLC Fisher Chemicals (Leicestershine Reino Unido) Para la
coloracioacuten se usoacute el reactivo Giemsa en polvo con glicerol de Sigma Ultra
(Steinheim Alemania) disolucioacuten tampoacuten de fosfato soacutedico dibaacutesico
heptahidratado y fosfato potaacutesico monobaacutesico anhidro de Sigma Aldrich
(Steinheim Alemania) en agua miliQ
Para la lectura de los frotis y conteo de hematiacutees se ha usado un microscopio
Leica DME (USA)
VIII32 Metodologiacutea
VIII321 Preparacioacuten de disolucioacuten Giemsa
La Giemsa es un colorante neutro compuesto de un colorante aacutecido (azul de
eosinato) y otro baacutesico (azul de metileno) que precipita con agua Lo que se
obtiene es un colorante neutro que no es soluble al agua pero si al alcohol
metiacutelico De forma inversa no es activo en solucioacuten metiacutelica pero siacute en
disolucioacuten acuosa Las ceacutelulas protozoarias disocian el colorante neutro el ADN
se tintildee de rojo y el citoplasma de azul Por las caracteriacutesticas comentadas ha de
Ensayos bioloacutegicos
96
ser utilizado con un tampoacuten para evitar que el pH de los medios de trabajo lo
precipite o inactive y con agua destilada calidad miliQ
Se pesan 076 g de polvo de Giemsa en un erlenmeyer y se pone suavemente
en agitacioacuten con 50 mL de glicerina y se deja hasta completa disolucioacuten a 60 ordmC
Una vez disuelto se deja enfriar y se le antildeaden 50 mL de metanol dejando la
disolucioacuten en agitacioacuten 12 horas Transcurrido el tiempo se deja reposar
protegido de la luz 7 diacuteas para finalizar con una filtracioacuten eliminando asiacute los
restos no disueltos Mientras se prepara una disolucioacuten tampoacuten fosfato con 02 g
de fosfato potaacutesico monobaacutesico anhidro y 05 g de fosfato soacutedico dibaacutesico
heptahidratado en un litro de agua MiliQ ajustaacutendose el pH a 74
Estas dos disoluciones no se mezclaraacuten hasta el momento de ser utilizadas
manteniendo la de Giemsa protegida de la luz Para su utilizacioacuten en un tubo
coacutenico de 50 mL se colocan 45 mL de la disolucioacuten tampoacuten de tampoacuten fosfato
y 5 mL de Giemsa y se homogenizan cuidadosamente dos veces por inversioacuten
Se cubre la muestra con el preparado y lo sobrante se desecha
Las disoluciones preparadas de Giemsa tienen un tiempo de vida corto ya
que con el paso del tiempo van precipitando y formaacutendose cristales que dantildean
la tincioacuten Debido a esto se recomienda preparar perioacutedicamente un nuevo
stock de colorante y nunca mezclar dos tipos diferentes puesto que cada
preparado tiene caracteriacutesticas propias que afectan el resultado en la coloracioacuten
VIII322 Tincioacuten con Panoacuteptico Raacutepido
Esta es una teacutecnica de tincioacuten por inmersioacuten a diferencia de la tincioacuten por
Giemsa que es por cobertura La ventaja es que es maacutes raacutepida y faacutecil de trabajar
cuando no se cuenta con un gran nuacutemero de laacuteminas para colorear El meacutetodo
consiste en la inmersioacuten sucesiva de la laacutemina que tentildeir en tres colorantes
consecutivamente En una primera cubeta Wertheim se pone una solucioacuten
alcohoacutelica de triarilmetano en la segunda cubeta se pone una solucioacuten
tamponada de xanteno y en la tercera una tamponada de tiazina
Las laacuteminas con las muestras fijadas se sumergen verticalmente y en el mismo
sentido que se ha extendido la muestra en la primera cubeta realizando
movimientos regulares verticales durante unos segundos Se sacan de la cubeta
y se espera que escurran el colorante sobrante Este procedimiento se repite en
las tres cubetas teniendo especial cuidado en la uacuteltima donde se debe asegurar
la homogeneidad de la tincioacuten sin exceso de coloracioacuten Finalmente se lava con
agua se dejan secar al aire para ser analizadas al microscopio
Ensayos bioloacutegicos
97
VIII323 Realizacioacuten de un frotis
Se denomina frotis a la extensioacuten de una muestra o cultivo que se realiza
sobre un portaobjetos con objeto de separar lo maacutes posible los microorganismos
o componentes sanguiacuteneos y para obtener de ellos una imagen clara y niacutetida al
microscopio
La muestra ha de ser fijada al vidrio del portaobjetos sin que la muestra sea
arrastrada en los lavados para poder aplicar despueacutes sobre eacutel meacutetodos de
tincioacuten que permiten la observacioacuten al microscopio de las ceacutelulas En la
actualidad los portaobjetos utilizados se comercializan limpios y esterilizados
para su uso inmediato
En primer lugar se toma un portaobjetos nuevo y se rotula adecuadamente
Con unas tijeras esterilizadas se hace un pequentildeo corte en la punta de la cola
del ratoacuten y se presiona para conseguir una gota de sangre que es recogida en el
centro de un extremo del portaobjetos Raacutepidamente con el filo de otro
portaobjetos se extiende la gota arrastraacutendola suavemente por la superficie del
primer portaobjetos para conseguir una peliacutecula lo maacutes homogeacutenea posible
tratando de cubrir toda la superficie de la laacutemina Posteriormente se pone el
portaobjetos horizontal y se cubre con metanol se deja secar con cuidado al aire
y se guarda la muestra hasta la tincioacuten el tiempo que sea necesario
Asiacute tentildeida la muestra se puede proceder a su lectura para calcular el
porcentaje de parasitemia ( parasitemia paraacutemetro que indica el nivel de
infeccioacuten de la sangre de un ratoacuten) mediante el conteo manual de los hematiacutees
sanos y los parasitados Se hace un conteo de veinte campos elegidos de forma
que los hematiacutees no se solapen y aproximadamente contengan la misma
cantidad de unidades El tanto por ciento de parasitemia se calcula aplicando la
siguiente foacutermula
Siendo H infectados hematiacutees infectados H sanos hematiacutees sanos
Ensayos bioloacutegicos
98
iquestQueacute se puede ver en un frotis al microscopio
En un frotis de ratoacuten sano se pueden ver
Trozos de cristales de colorante si el vidrio no ha sido lavado lo
suficiente
Hematiacutees o gloacutebulos rojos o eritrocitos
Leucocitos o gloacutebulos blancos Estos se colorean con la tincioacuten
porque tiene carga geneacutetica y los hematiacutees no En ocasiones puede
confundirse un hematiacutee joven y un leucocito porque los hematiacutees
joacutevenes conservan restos de nuacutecleo pero se diferencian en nuacutemero
y tamantildeo Los leucocitos son menos numerosos y de mayor
tamantildeo ademaacutes en la tincioacuten quedan anteriormente tentildeidos de
morado con una aureola azul
En un ratoacuten infectado se puede observar
Hematiacutees sanos
Hematiacutee joven
Esquizonte joven que puede confundirse con un hematiacutee joven
Esquizonte desarrollado
Esquizonte agotado Es el momento previo a la ruptura del
espacio y la liberacioacuten de trofozoiacutetos libres que continuaran con la
infeccioacuten
Trofozoiacutetos libres que pueden confundirse con plaquetas
Hematiacutees en invasioacuten
Figura 49 Vista al microscopio de un frotis de sangre infectada por Plasmodium32
32 Disponible en httpwwwelrincondelamedicinainternacom2011_05_16_archivehtml
Ensayos bioloacutegicos
99
VIII324 Preparacioacuten y lectura en la caacutemara Malassez
La caacutemara se usa para hacer el conteo de hematiacutees totales Se cubre la
cuadriacutecula de la caacutemara con la muestra de sangre heparinizada con la ayuda de
una micropipeta y por capilaridad se llena la cuadriacutecula de conteo Como la
disolucioacuten tiene caraacutecter tridimensional y en el microscopio las lecturas son
bidimensionales se pone la ceacutelula en una caacutemara huacutemeda durante diez minutos
para que la muestra sedimente y no se deshidrate durante el proceso Pasado el
tiempo se pone la caacutemara de Malassez al microscopio y con cuarenta aumentos
y se hace el recuento manual de hematiacutees por mm3 de sangre Con el valor
promedio y teniendo en cuenta la dilucioacuten y el volumen de la caacutemara es posible
calcular la densidad de gloacutebulos rojos (GR) en la sangre de un ratoacuten sano
mediante la siguiente ecuacioacuten
GRmm3= GR promedio x dilucioacuten muestra x volumen celda
Siendo GR promedio promedio de hematiacutees dilucioacuten muestra valor fijo de
200 (10 microL en 2 mL) volumen volumen de la celda valor fijo 100 mm3
EL valor medio de hematiacutees de un ratoacuten sano es 5 millones de hematiacutees por
mm3
Una caracteriacutestica de la enfermedad es la anemia asiacute un ratoacuten infectado que
ha desarrollado la enfermedad presenta una disminucioacuten aproximada de un 75
en el nuacutemero de hematiacutees con respecto al ratoacuten sano por conteo en caacutemara
Malassez
VIII325 Ensayos de virulencia
Para este estudio es necesario tener al paraacutesito y al hueacutesped En este caso se
utilizaraacuten dos especies diferentes de paraacutesito que producen la enfermedad de la
malaria como son Plasmodium berghei NK65 y Plasmodium vinckei petteri
provenientes de la reserva del IRD Estas dos especies son capaces de infectar
roedores por lo que el hueacutesped seraacute un grupo de veinte ratones machos IOPF
Swiss
Descongelacioacuten de cepas y activacioacuten de paraacutesitos
Cuando se descongela una cepa no tiene mucha capacidad de infeccioacuten
(virulencia) sino que esta va en aumento con el paso de los diacuteas Por otro lado
es probable que los ratones inoculados no lleguen a desarrollar la enfermedad
porque la muestra haya sido mal conservada o se haya degradado demasiado
Ensayos bioloacutegicos
100
en el friacuteo que es lo que ocurrioacute experimentalmente con la cepa de P vinckei
petteri En este caso se esperan 10 diacuteas despueacutes de la inoculacioacuten y se
monitoriza al ratoacuten para observar si hay progresioacuten de la infeccioacuten de no ser
asiacute debe realizarse una revisioacuten de los tanques de almacenamiento para
descartar las muestras anteriores a la fecha de congelacioacuten de la muestras que
presentaron problemas ya que pueden estar en igual o en peores condiciones
El estudio comienza con la descongelacioacuten de una cepa de Plasmodium berghei
NK65 a temperatura ambiente mientras se extraen 10-20 microL (45 gotas) de sangre
de cola de ratoacuten sano Este volumen se mezcla inmediatamente con una gota de
heparina con el fin de evitar la coagulacioacuten de la sangre extraiacuteda La sangre
heparinizada se diluye 1200 en un vial esteacuteril con tapoacuten con 4 mL de suero
fisioloacutegico para devolver las ceacutelulas sanguiacuteneas a un medio parecido al normal
y que no se produzcan procesos de oacutesmosis que destruyan la muestra Cerrar el
vial y guardar la muestra
Cuando este descongelado el vial con la cepa se toma con una jeringa el
volumen contenido en el vial y se divide en dos para ser inyectado viacutea
intraperitoneal en dos ratones separados previamente del grupo Estos ratones
se separan del grupo en una celda identificada con la fecha de infeccioacuten la cepa
y la especie que contiene para observar la progresioacuten de la infeccioacuten La sangre
heparinizada se usa para un primer conteo del nuacutemero de hematiacutees en
ejemplares sanos cuyo recuento se realiza con cuadriacutecula doble en la ceacutelula o
caacutemara de Malassez A los tres diacuteas de la inoculacioacuten se hace un control del
estado de los dos ratones infectados tanto visual como sanguiacuteneo Los siacutentomas
externos de la enfermedad son peacuterdida de coloracioacuten en los ojos y orejas pelo
erizado ademaacutes de peacuterdida de peso y aglomeracioacuten entre ellos por causa de la
fiebre Tambieacuten se realiza un frotis para calcular la parasitemia
Cuando los ratones infectados desarrollen la enfermedad se infecta con su
sangre a otros dos ratones sanos de forma que ademaacutes de conocer coacutemo se
desarrolla el paraacutesito se garantice que tendraacuten la fuerza suficiente para
comenzar los ensayos de actividad De esta forma no es necesario conocer la
parasitemia basta con saber que la cepa estaacute viva Asiacute se realiza un frotis
control positivo con sangre de la cola del ratoacuten y del mismo sitio se obtendraacuten
20 microL de sangre que se hepariniza y disuelve en 1 mL de suero Se puede
conocer el buen estado de esta disolucioacuten visualmente si se observa un color
rojo muy claro ya que indica que no se ha producido hemoacutelisis Este nuevo
grupo de ratones infectados son los ratones fuente
Ensayos bioloacutegicos
101
El volumen de la disolucioacuten anterior se pone en una jeringa para ser
inyectado en dos ratones sanos que tambieacuten se aiacuteslan para controlar coacutemo
evoluciona la infeccioacuten
Diariamente se realiza un frotis control a los diferentes grupos de ratones
infectados para registrar la evolucioacuten de la parasitemia ya que algunos
evolucionaraacuten muy raacutepido y moriraacuten mientras que otros no mostraraacuten la
enfermedad
Ensayos de virulencia
El quinto diacutea desde la inoculacioacuten del paraacutesito vivo en los ratones fuente se
procede a calcular la parasitemia En este momento se infecta a un nuevo grupo
de 5 ratones En esta ocasioacuten la infeccioacuten seraacute controlada y se procederaacute a una
infeccioacuten con un nuacutemero de paraacutesitos determinado Para estos ensayos
normalmente se inoculan 107 paraacutesitos por ratoacuten por tal motivo es necesario
conocer previamente el nuacutemero de paraacutesitos en la sangre del ratoacuten fuente
sabiendo esto se puede calcular la cantidad de paraacutesitos necesarios para
inocular a todos los grupos de ratones experimentales seguacuten la siguiente
ecuacioacuten
Para preparar las cantidades necesarias de sangre infectada heparina y suero
fisioloacutegico necesarias para desarrollar el ensayo de virulencia se deben tener en
cuenta los cinco ratones disponibles a los que se antildeade un sexto ratoacuten hipoteacutetico
con el que se tienen en cuenta las peacuterdidas de disoluciones durante los
procedimientos experimentales Seraacuten necesarios 10 microL de sangre del ratoacuten
fuente para inyectar a cada ratoacuten del ensayo El procedimiento de extraccioacuten de
sangre e infeccioacuten del grupo es el mismo
Durante todo este proceso es preciso llevar un seguimiento diario de la
parasitemia para observar el grado de virulencia del paraacutesito Los resultados
del comportamiento del paraacutesito son aproximados debido al aumento de la
parasitemia en los sucesivos ensayos
Por queacute un seguimiento previo del desarrollo de la infeccioacuten
El desarrollo de los paraacutesitos en individuos infectados no se produce siempre
de igual forma por lo que si se parte de cepas congeladas es necesaria una
primera activacioacuten del paraacutesito (primera infeccioacuten) y una posterior reactivacioacuten
del paraacutesito (infecciones sucesivas) a partir de la primera infeccioacuten
Ensayos bioloacutegicos
102
Las diferencias de desarrollo se deben a tres factores principalmente
1- Viacutea intraperitoneal Es una viacutea menos precisa que la viacutea intravenosa
porque no hay una localizacioacuten exacta de la inyeccioacuten de la sangre
infectada Todos los ratones tienen la misma capacidad de respuesta pero
no se puede controlar la respuesta del ratoacuten por esta viacutea de inoculacioacuten
Por viacutea intravenosa se asegurariacutea su introduccioacuten en el hiacutegado pero por
las por las caracteriacutesticas aproximativas de los ensayos y queda
descartada
2- Raza Swiss Este tipo de ratoacuten no es monoclonal por tanto todos los
individuos son diferentes entre siacute De ahiacute se deduce que la respuesta seraacute
distinta en cada uno de ellos El objetivo de los ensayos realizados es
encontrar un nuevo compuesto que revierta cualquier tipo de
parasitemia como hace la CQ de manera que la variabilidad del sistema
no sea influyente
3- Enzephalitozoom Cuniculli Es un paraacutesito de roedor que puede interferir
cruzadamente con el Plasmodium lo que hace que los ensayos no sean
fiables En la actualidad este factor no se tiene en cuenta ya que todos los
lotes de ratones adquiridos traen consigo el certificado de anaacutelisis de la
empresa que los suministra
Una vez conocido coacutemo se desarrolla el paraacutesito de la cepa elegida se
comienza con la infeccioacuten de otro grupo de ratones Esta infeccioacuten se realiza con
el objetivo de tener ratones fuente disponibles el diacutea que se ha de comenzar el
ensayo Del mismo modo la sangre de los ratones infectados es usada para la
congelacioacuten de nuevas cepas
VIII326 Ensayos de actividad Test de Peters
El test claacutesico de supresioacuten de 4 diacuteas (Peters y Robinson 1999) da comienzo
una vez que se conoce coacutemo se va a desarrollar previsiblemente la cepa elegida
En este ensayo dicha cepa es Plasmodium berghei NK65 inoculada en 100 ratones
macho tipo Swiss con un peso de 20 2 g Se distribuyen en 10 grupos de 10
individuos identificados de la siguiente manera
-Grupo Negativo 10 ratones que seraacuten tratados con el medio de dilucioacuten de
los compuestos que ensayar En esta ocasioacuten el medio de dilucioacuten es DMSO
utilizado a una dosis maacutexima de 100 microL por ratoacuten y diacutea
Ensayos bioloacutegicos
103
-Grupo Positivo 10 ratones que seraacuten tratados con 40 microg de CQ en 100 microL
DMSO (2 mg por kg)
-Grupos de A1 al A4 Cuatro grupos de 10 ratones que seraacuten tratados con uno
de los compuestos que ensayar a dosis de 40 20 10 y 5 mgkg respectivamente
-Grupos del B1 al B4 Cuatro grupos de 10 ratones que seraacuten tratados con el
otro compuesto que ensayar a dosis 40 20 10 y 5 mgkg respectivamente
El ensayo parte de la determinacioacuten de la parasitemia y de un conteo de
hematiacutees por ceacutelula Malassez de ratones fuente para conocer queacute cantidad de
sangre se necesita para realizar una infeccioacuten controlada y simultaacutenea de los
cien ratones con ceacutelulas parasitadas con 107 ceacutelulas parasitadasratoacuten en una
solucioacuten salina al 09 por viacutea intraperitoneal
La extraccioacuten se realiza por puncioacuten seno retro-orbital ya que el volumen de
sangre que se necesita es superior al que se puede obtener por puncioacuten de la
vena de la cola La muestra se trata de la misma forma que lo explicado
anteriormente y se procede a la infeccioacuten de la totalidad de los individuos
Trascurridas dos horas se comienza con la administracioacuten del tratamiento
especiacutefico de cada grupo en lo que se denomina Diacutea 0 En dicho momento se
realiza la administracioacuten del tratamiento todos los diacuteas siguientes a la misma
hora y con el mismo procedimiento El tratamiento se aplica viacutea subcutaacutenea en
la parte interna de las patas traseras Con esto evitamos que se produzca
toxicidad o necropsia de alguacuten oacutergano del peritoneo Tambieacuten se alterna la pata
donde se inyecta el tratamiento para asegurarse de que no se produzca una
necrosis por toxicidad debida a la acumulacioacuten del producto por una mala
difusioacuten Si un producto no es toacutexico podriacutea acumularse pero no necrosar y
esto tambieacuten podriacutea observarse como un bulto debajo de la piel
Durante el transcurso del test se ha de llevar a cabo un seguimiento visual de
la posible respuesta externa de los ratones a la administracioacuten de los
compuestos anotando cambios en el comportamiento de los ratones
irritaciones deacutermicas en diferentes zonas prestando especial atencioacuten a la zona
donde se produce la inyeccioacuten del tratamiento falta de movilidad y cambios
morfoloacutegicos como disminucioacuten de la temperatura peacuterdida de peso o pelo
cambios en la pigmentacioacuten de la piel
Pasados cinco diacuteas o Diacutea 4 se realiza un frotis a todos los ratones
supervivientes para calcular la parasitemia en sangre perifeacuterica Se comprueba
la inhibicioacuten de la parasitemia para calcular la dosis letal (DL50) determinada
Ensayos bioloacutegicos
104
por anaacutelisis de regresioacuten lineal de miacutenimos cuadrados Una vez pasado el
tiempo del Test de Peters los ratones supervivientes seguiraacuten siendo
observados en los siguientes diacuteas lo que se denomina Test Rane Esto sirve para
la determinacioacuten de la actividad esquizonticida en vivo comparando de la
mortalidad de los ratones del grupo negativo con el resto de grupos
Durante la realizacioacuten de los ensayos los ratones que mueren son desechados
seguacuten los protocolos normalizados del animalario (bioterio) en el que se
realizan todos los procedimientos experimentales
IIXX EESSTTUUDDIIOOSS CCOOMMPPUUTTAACCIIOONNAALLEESS
Estudios Computacionales
107
IX1 Propiedades fisicoquiacutemicas de los compuestos
Para los caacutelculos de las propiedades fisicoquiacutemicas de los compuestos se
utilizoacute el Laboratorio de Quiacutemica Computacional Virtual33 (Tetko et alts 2005)
y la herramienta de caacutelculo de propiedades online Molinspiration34 (Ertl et alts
2000)
Los datos obtenidos fueron utilizados para establecer una aproximacioacuten
teoacuterica del comportamiento de los compuestos en tratamientos orales Los
estudios se centraron en la obtencioacuten de las caracteriacutesticas de absorcioacuten de cada
compuesto que depende de otros factores como liposolubilidad fuerzas polares
moleculares y caracteriacutesticas propias de la estructura molecular
El coeficiente de particioacuten octanolagua estaacute asociado a la solubilidad y se
calculoacute desde MLog P miLogP AlogP KOWLogP y ABlogP Las
caracteriacutesticas estructurales de la moleacutecula como tamantildeo y posibilidad de giro
de enlaces tambieacuten influyen en la absorcioacuten Las caracteriacutesticas polares son
importantes para la absorcioacuten porque intervienen en la lipofilia de los
compuestos asiacute se desprende del estudio de los enlaces aceptores y receptores
de enlaces polares y del TPSA Se puede obtener asiacute una aproximacioacuten al
porcentaje de absorcioacuten (Zhao et alts 2002) de los compuestos en la membranas
celulares
Los compuestos que a su vez cumplen las Reglas de Lipinski (Lipinski et alts
1997) son buenos candidatos para ofrecer buenas cualidades en la
administracioacuten oral
IX2 Optimizacioacuten geomeacutetrica
Los estudios computacionales de Modelizacioacuten y Docking35 se llevaron a
cabo para compuestos liacutederes en los Laboratorios de Investigacioacuten y Desarrollo
de la Facultad de Ciencias y Filosofiacutea de la Universidad Peruana Cayetano
Heredia (UPCH) Lima (Peruacute)
33 httpwwwvcclaborg 34 httpwwwmolinspirationcomservicespropertieshtml 35 Docking (del ingleacutes anclarse) En el campo del Modelado molecular este es un meacutetodo que predice la conformacioacuten preferida de un moleacutecula al estar unida a otra con el fin de formar un complejo estable1 El conocimiento de la orientacioacuten preferida a su vez puede ser usada para predecir la fuerza de la asociacioacuten o la afinidad de enlace entre dos moleacuteculas usando por ejemplo las funciones de puntuacioacuten (o funciones de scoring)
Estudios Computacionales
108
El compuesto maacutes activo se sometioacute a estudios de modelizacioacuten para
optimizar la geometriacutea y determinar los potenciales electrostaacuteticos de la
moleacutecula Para esto se usoacute el caacutelculo mecaacutenico Quantum en concreto el
programa Gaussian36 de quiacutemica cuaacutentica y el set baacutesico HF3-21G El Potencial
molecular electrostaacutetico (MEP) fue computerizado por la densidad electroacutenica
y fue calculado a partir de datos del software Molekel37 (Fluumlckigel et alts 2008)
IX3 Estudios de Acoplamiento Molecular (Docking)
El programa ICM38 de modelizacioacuten se usoacute para determinar el potencial
modo de unioacuten entre los compuestos maacutes activos y la enzima diana
previamente estudiada en estudios anteriores la plasmepsina II del Plasmodium
Ensayos anteriores mostraban la cristalizacioacuten de la enzima plasmepsina II con
un compuesto denominado EH58 (N-(3-[(2-benzo[13]dioxol-5-yl-ethyl)[3-(1-
methyl-3-oxo-13-dihydro-isoindol-2-yl)-propionyl]-amino]-1-benzyl-2-
(hydroxypropyl)-4-benzyloxy-35-dimethoxy-benzamide Figura 50) (Asojo et
alts 2003)
Figura 50 Imagen de la interaccioacuten del compuesto EH-58 y la plasmepsina II39
Seguacuten datos publicados posteriormente se demostroacute que la enzima presenta
un hueco activo donde pueden introducirse diferentes moleacuteculas y establecer
interacciones que inhiben su actividad En el caso de los derivados estudiados
se planteoacute la posible unioacuten de estos al resto polar del aminoaacutecido aspartato
(ASP) de las posiciones 214 y 34 de sitio activo de la enzima (Bjelic et alts
36 Gaussian Inc Pittsburg PA 2003 37 httpwwwcscschmolekel 38 versioacuten3 4-8 La Jolla CA Molsoft LLC 2006 39 Disponible en Asojo et alts 2003
Estudios Computacionales
109
2007) En primer lugar para validar la metodologiacutea y comprobar la capacidad
del programa ICM para estudiar los modos de enlace de los inhibidores en el
sitio de unioacuten de la enzima el complejo EH50-plasmepsina II40 fue reacoplado
mediante caacutelculos computacionales De acuerdo con la bibliografiacutea (Cunico et
alts 2009a b y Mendoza et alts 2011) en los estudios de acoplamiento se
considera como vaacutelidos los valores de desviacioacuten de la media cuadraacutetica
(RMSD) entre 30 a 40 Aring
Las estructuras se prepararon siguiendo la metodologiacutea ICM (Abagyan et
alts 1994) y se dibujaron con el editor molecular del software41 Asiacute las
estructuras de los compuestos y la proteiacutena fueron convertidas a objetos ICM
Durante este proceso de conversioacuten de la proteiacutena se antildeadieron hidroacutegenos
para proceder despueacutes con una optimizacioacuten geomeacutetrica Ademaacutes las
representaciones en dos dimensiones fueron convertidas a tres dimensiones
asignando cargas parciales y asignando enlaces rotatorios
De acuerdo con estudios previos (Mendoza et al 2011 y Cunico et al 2009b)
los aminoaacutecidos que conforman el sitio activo son la ASP 34 y la ASP 214
El programa buscador de cavidades del sistema ICM42 se usoacute para identificar
el sitio activo con un valor de tolerancia de 46 Aring La posicioacuten y orientacioacuten
inicial del ligando y el tamantildeo y posicioacuten del hueco fueron escogidos de
acuerdo con los valores sugeridos por el sistema
Los modos de unioacuten calculados con al menos un enlace por puentes de
hidroacutegeno con alguno de los aspartatos que conforman el sitio cataliacutetico se
consideraron como los maacutes representativos y tomados en cuenta para su
anaacutelisis (Kasam et alts 2007 y Aringqvist et alts 1994) El acoplamiento planteado
para cada ligando fue analizado estudiaacutendose su energiacutea total relativa La
conformacioacuten maacutes favorable energeacuteticamente se seleccionoacute como mejor
posicioacuten espacial
40 Protein Data Bank PDB code 1LF3 wwwrcsborg 41 Molecular Editor versioacuten 25 La jolla CA Molsoft LLC 2006 42 ICM Pocket Finder An et alts 2005
RESULTADOS Y
DISCUSIOacuteN
XX DDEESSCCRRIIPPCCIIOacuteOacuteNN DDEE CCOOMMPPUUEESSTTOOSS
Descripcioacuten de Compuestos
115
X1 Siacutentesis de precursores
(Benzo[b]tiofen-3-il)-3-cloropropan-1-ona
Procedimiento experimental
Sobre 205 g de AlCl3 (015 mmol) disueltos en 150 mL de diclorometano seco y
en atmoacutesfera de N2 se antildeade gota a gota una disolucioacuten de 1878 g de
benzo[b]tiofeno (140 mmol) y 159 mL de cloruro de 3-cloropropionilo (140
mmol) disueltos en 50 mL de diclorometano seco A continuacioacuten se antildeaden
tambieacuten gota a gota 95 mL de aacutecido sulfuacuterico en 150 mL de agua Se realiza
extracciones con diclorometano La fase orgaacutenica se seca con trazas de sulfato
soacutedico anhidro y se elimina el disolvente a presioacuten reducida Se obtiene un
aceite que se purifica por cromatografiacutea en columna empleando una mezcla de
hexanoacetato de etilo como fase moacutevil en gradiente hasta (955) El producto
se precipita con hexano friacuteo
Punto de fusioacuten 55-57ordmC
IR (cm-1) 1655 (mf CO)
RMN-1H (CDCl3 400 MHz) δ (ppm) 343 (m 2H CH2-CO) 386 (c 2H CH2-
Cl) 732-748 (m 2H H5 + H6) 780 (d 1H H4 J45= 76 Hz) 824 (s 1H H2 ) 847
(d 1H H7 J76= 73 Hz)
Anaacutelisis elemental (CHN)
Calculado Hallado
C 5879 5845
H 400 396
N 000 000
FM C11H9 ClOS PM 2245 APARIENCIA Soacutelido blanco RENDIMIENTO 86
Descripcioacuten de Compuestos
116
Tert-butil 4-(4-nitro-2-trifluorometilfenil)piperazin-1-carboxilato
Procedimiento experimental
Seguacuten el meacutetodo A a partir de 2 g de 2-fluacuteor-5-nitro-1-(trifluorometil)benceno
(956 mmol) y 25 g de tert-butil piperacin-1-carboxilato (1342 mmol) se obtiene
un residuo que se lava con hexano y se usa en la reaccioacuten siguiente sin maacutes
purificaciones
Punto de fusioacuten 136ndash138 ordmC
IR (cm-1) 2982-2751 (m C-H alifaacuteticos) 1685 (mf CO) 1530 y 1350 (m NO2)
1280 y 1155 (mf CF3)
RMN-1H (CDCl3 400 MHz) δ (ppm) 150 (s 9H C(CH3)3) 308 (dd 4H H3+H5
PIPZ) 362 (dd 4H H2+H6 PIPZ) 732 (d 1H H6 FENIL J65= 90 Hz) 837 (dd
1H H5 FENIL J56= 90 Hz J53= 28 Hz) 855 (d 1H H3 FENIL J35= 27 Hz)
(4-nitro-2-trifluorometilfenil)piperazina
Procedimiento experimental
Seguacuten el meacutetodo B usando amina protegida se obtiene un aceite que precipita
con hexano en friacuteo obtenieacutendose un polvo amarillo intenso
Punto de fusioacuten 97-99ordmC
IR (cm-1) 3380 (f NH) 2982-2751 (m C-H alifaacuteticos) 1685 (mf CO) 1530 y 1350
(m NO2) 1280 y 1155 (mf CF3)
RMN-1H (CDCl3 400 MHz) δ (ppm) 212 (s 1H NH) 306-308 (m 4H H2+H6
PIPZ) 313-315 (m 4H H3+H5 PIPZ) 730 (d 1H H6 FENIL J65= 90 Hz) 835
(dd 1H H5 FENIL J56= 90 Hz J53= 26 Hz) 853 (d 1H H3 FENIL J35= 26 Hz)
FM C16H20N3F3O4
PM 3751 Apariencia Soacutelido amarillo Rendimiento 75
FM C11H12N3F3O2
PM 2751 Apariencia Soacutelido amarillo Rendimiento 75
Descripcioacuten de Compuestos
117
Tert-butil 4-(4-nitro-2-trifluorometilfenil)-14-diazepan-1-carboxilato
Procedimiento experimental
Seguacuten el meacutetodo A a partir de 2 g de tert-butil 14-diazepan-1-carboxilato (999
mmol) y 108 g de 1-fluacuteor-2-nitro-4-(trifluorometil)benceno (516 mmol) se
obtiene un residuo que se lava con eacuteter etiacutelico y se usa en la reaccioacuten siguiente
sin maacutes purificacioacuten
Punto de fusioacuten 197ndash198 ordmC
IR (cm-1) 2982-2751 (m C-H alifaacuteticos) 1694 (mf CO) 1524 y 1346 (m NO2)
1283 y 1154 (mf CF3)
RMN-1H (DMSO-d6 400 MHz) δ (ppm) 208-211 (q 2H H6 DZP) 324 (sa
2H H2 DZP) 330 (sa 2H H7 DZP) 344 (t 2H H5 DZP) 363 (t 2H H3 DZP)
756 (d 1H H6 FENIL J65= 99Hz) 839-845 (m 2H H3+H5 FENIL)
(4-nitro-2-trifluorometil)fenil)-14-diazepan
Procedimiento experimental
Seguacuten el meacutetodo B usando amina protegida se obtiene un aceite que precipita
con eacuteter etiacutelico en friacuteo
Punto de fusioacuten 121ndash123 ordmC
IR (cm-1) 3352 (m NH) 2938-2850 (m C-H alifaacuteticos) 1581 y 1331 (mf CF3)
RMN-1H (CDCl3 400 MHz) δ (ppm) 174 (sa 1H NH) 192-197 (m 2H H6
DZP) 303-309 (m 4H H3+H5 DZP) 350-357 (m 4H H2+H7 DZP) 721 (d 1H
H6 FENIL J65= 93 Hz) 825 (dd 1H H5 FENIL J56= 92 Hz J53= 28 Hz) 853
(d 1H H3 FENIL J35= 28 Hz)
FM C17H22N3F3O4
PM 3893 Apariencia Soacutelido amarillo Rendimiento 77
FM C12H14N3F3O2
PM 2893 Apariencia Soacutelido amarillo Rendimiento 75
Descripcioacuten de Compuestos
118
Tert-butil 1-(4-nitro-2-trifluorometilfenil)-(S)-pirrolodin-3-ilcarbamato
Procedimiento experimental
Seguacuten el meacutetodo A a partir de 127 g (686 mmol) de tert-butil-(S)-pirrolidin-3-ilcarbamato y
072 g (343 mmol) de 2-fluor-5-nitro-1-(trifluorometil) benceno El residuo obtenido se precipita
y se lava con hexano
Punto de fusioacuten 115 ndash 117 ordmC
IR (cm-1) 3349 (f NH) 2981-2880 (d C-H alifaacuteticos) 1680 (mf CO) 1507 y 1326 (m NO2) 1273 y
1120 (f CF3)
RMN-1H (CDCl3 400 MHz) δ (ppm) 148 (s 9H C(CH3)3) 199-207 (m 1H H4ec PIRR) 226-
235 (m 1H H4ax PIRR) 342(c 1H H2ec PIRR) 359-365 (m 1H H5ax PIRR) 368-374 (m 1H
H5ec PIRR) 384 (c 1H H2ax PIRR) 438 (sa 1H NH) 470 (sa 2H H3 PIRR) 683 (d 1H H6
FENIL J65 = 95 Hz) 820 (dd 1H H5 FENIL J56 = 94 Hz J53 = 27Hz) 856 (d 1H H3 FENIL
J35= 27 Hz)
1-(4-nitro-2-trifluorometilfenil)-(S)-pirrolidin-3-il amina
Procedimiento experimental
Seguacuten el meacutetodo B usando la amina protegida se obtiene un aceite que precipita
con hexano en friacuteo Se identifica y se usa sin maacutes purificaciones en la siguiente
reaccioacuten
Punto de fusioacuten 64ndash66 ordmC
IR (cm-1) 3359 (d NH) 2943-2851 (d C-H alifaacuteticos) 1505 y 1317 (mf NO2) 1105 (mf CF3)
RMN-1H (CDCl3 400 MHz) δ (ppm) 149 (sa 2H NH2) 183-191 (m 1H H4ec
PIRR) 219-226 (m 1H H4ax PIRR) 327-330 (m 1H H2ec PIRR) 358-363 (m
1H H5ax PIRR) 375-381 (m 4H H2ax+H3+H5ec PIRR) 683 (d 1H H6 FENIL
J65= 95 Hz) 819 (dd 1H H5 FENIL J56= 95 Hz J53= 27 Hz) 856 (d 1H H3
FENIL J35= 27 Hz)
FM C16H20N3F3O4
PM 37521 Apariencia Soacutelido amarillo Rendimiento 71
FM C11H12N3F3O2
PM 2751 Apariencia Soacutelido marroacuten claro Rendimiento 83
Descripcioacuten de Compuestos
119
Tert-butil 1-(4-nitro-2-trifluorometilfenil)piperidin-4-ilcarbamato
Procedimiento experimental
Seguacuten el meacutetodo A a partir de 241 g de tert-butil piperidin-4-ilcarbamato (1203 mmol) y 214 g
de 1-fluacuteor-4-nitro-2-(trifluorometil)benceno (1023 mmol) El residuo obtenido se lava con
hexano
Punto de fusioacuten 120ndash122 ordmC
IR (cm-1) 3431 (m NH) 2979-2798 (m C-H alifaacuteticos) 1707 (mf CO) 1500 y 1341 (mf NO2)
1118 (f CF3)
RMN-1H (CDCl3 400 MHz) δ (ppm) 147 (s 9H C(CH3)3) 162 (dd 2H H3ax+H5ax PIPR J3ax3ec
= J5ax5ec = 113 Hz J3ax2ax = J5ax6ax = 35 Hz) 209 (d 2H H3ec+H5ec PIPR J3ec3ax = J5aec5ax = 121 Hz)
296 (td 2H H2ax+H6ax PIPR J2ax2ec = J6ax6ec = J2ax3ax = J6ax5ax = 125 Hz J2ax3ec = J6ax5ec = 19 Hz) 335
(d 2H H2ec+H6ec PIPR J2ec2ax = J6ex6ac =125 Hz) 366 (sa 1H H4 PIPR) 456 (sa 1H HN) 728 (d
1H H6 PIPR J65= 90 Hz) 832 (dd 1H H5 FENIL J56= 90 Hz J53 = 27 Hz) 851 (d 1H H3
FENIL J35 = 27 Hz)
1-(4-nitro-2-trifluorometilfenil)piperidin-4-il amina
Procedimiento experimental
Seguacuten el meacutetodo B usando la amina protegida se obtiene un aceite que precipita con
hexano en friacuteo Se identifica y se usa sin maacutes purificaciones en la siguiente reaccioacuten
Punto de fusioacuten 24-25 ordmC
IR (cm-1) 2938-2847 (m C-H alifaacuteticos) 1499 y 1334 (mf NO2) 1119 (mf CF3)
RMN-1H (CDCl3 400 MHz) δ (ppm) 152 (sa 1H NH2) 151-162 (m 2H H3ax+H5ax
PIPR) 195 (d 2H H3ec+H5ec PIPR J3ax3ec = J5ax5ec = 126 Hz) 287-296 (m 3H
H2ax+H6ax+H4 PIPR) 339 (d 2H H2ec+H6ec PIPR J2ec2ax = J6ec6ax = 127 Hz) 725 (d 1H
H6 FENIL J65= 91 Hz) 830 (dd 2H H5 FENIL J56= 90 Hz J53= 25 Hz) 851 (d 1H H3
FENIL J35= 26 Hz)
FM C17H22N3F3O4
PM 3892 Apariencia Soacutelido amarillo Rendimiento 93
FM C12H14N3O2F3
PM 2891 Apariencia Soacutelido amarillo Rendimiento 88
Descripcioacuten de Compuestos
120
X2 Siacutentesis de derivados carboniacutelicos (Serie 0)
1-(benzo[b]tiofen-3-il)-3-[4-(4-nitro-2-trifluorometilfenil)piperazin-1-
il]propan-1-ona
Procedimiento experimental
Seguacuten el meacutetodo general C a partir de 104 g (378 mmol) de (4-nitro-2-
trifluorometilfenil)piperazina y 085 g (370 mmol) de 1-(benzo[b]tiofen-3-il)-3-
cloropropan-1-ona Se elimina el disolvente a presioacuten reducida y se precipita el
soacutelido con hexanoeacuteter en friacuteo El soacutelido obtenido se purifica en columna
cromatograacutefica usando como fase moacutevil diclorometanometanol (991) Se
elimina el disolvente de las fracciones adecuadas a presioacuten reducida
obtenieacutendose el compuesto de forma soacutelida
Punto de fusioacuten 153-154ordmC
IR (cm-1) 2952-2815 (m C-H alifaacuteticos) 1673 (mf CO) 1457 y 1332 (mf NO2)
1281 y 1131 (m CF3)
RMN-1H (CDCl3 400 MHz) δ (ppm) 276-277 (m 4H H3+H5 PIPZ) 298-312
(m 2H CO-CH2-CH2) 319-321 (t 4H H2+H6 PIPZ) 327-330 (m 2H CO-CH2-
CH2) 729 (dd 1H H5rsquo FENIL J5acute6acute= 94 Hz J5acute3acute= 25 Hz) 746 (t 1H H6 BZT
J65= 80 Hz) 752 (t 1H H5 BZT J56= J54= 81 Hz) 790 (d 1H H4 BZT J45= 80
Hz) 833-836 (m 2H H6rsquo FENIL+ H7 BZT) 853 (s 1H H2 BZT) 878 (d 1H H3rsquo
FENIL J3acute5acute= 26 Hz)
Anaacutelisis elemental (CHN)
HPLC (RP-18 1 mLmin metanol-agua (8020)) tr 713 min ʎmax 2196 nm
Calculado Hallado
C 5720 5677
H 432 457
N 916 908
FM C22H20N3F3O3S PM 4635 Apariencia Soacutelido amarillo
Rendimiento 13
01
Descripcioacuten de Compuestos
121
Hidrocloruro de 1-(benzo[b]tiofen-3-il)-3-[4-(2-nitro-4-
trifluorometilfenil)piperazin-1-il]propan-1-ona
Procedimiento experimental
Seguacuten el meacutetodo general C a partir de 147 g (534 mmol) de 4-(2-nitro-4-
trifluorometilfenil) piperazina comercial y 104 g (445 mmol) de 1-
(benzo[b]tiofen-3-il)-3-cloropropan-1-ona Se elimina el disolvente a presioacuten
reducida y precipita con hexano El soacutelido obtenido no es del todo puro por lo
que se purifica por columna cromatograacutefica usando como fase moacutevil
diclorometanometanol (991) Se elimina el disolvente de las fracciones
adecuadas a presioacuten reducida obteniendo un aceite claro que se precipita como
hidrocloruro
Punto de fusioacuten 207-209 ordmC
IR (cm-1) 2970-2930 (d C-H alifaacuteticos) 1657 (mf CO) 1447 y 1332 (mf NO2)
1253 y 1120 (m CF3)
RMN-1H (DMSO 400 MHz) δ (ppm) 326 (d 2H CO-CH2-CH2 JCHCH= 98
Hz) 351 (d 2H H3ax + H5ax PIPZ Jaxec= 128 Hz) 355 (d 4H
H3ec+H5ec+H2ax+H6ax PIPZ Jaxec= 129 Hz) 367 (d 2H H2ec+H6ec PIPZ Jecec=
122 Hz) 377 (t 2H CO-CH2 JCHCH= 100 Hz) 749 (ddd 1H H5 BZT J54= 84
Hz J56= 68 Hz) 754 (ddd 1H H6 BZT J67= 82 Hz J65= 70 Hz) 758 (d 1H
H6rsquo FENIL J6acute5acute= 88 Hz) 797 (dd 1H H5rsquo FENIL J5acute6acute= 89 Hz J5acute3acute= 21 Hz)
812 (d 1H H4 BZT J45= 79 Hz) 830 (sa 1H H3rsquo FENIL) 862 (d 1H H7 BZT
J76= 78 Hz) 909 (sa 1H H2 BTZ) 1145 (sa 1H HCl)
Anaacutelisis elemental (CHN)
HPLC (RP-18 1 mLmin metanol-agua (8020)) tr 523 min ʎmax 2181 nm
Calculado Hallado
C 5285 5301
H 400 416
N 841 831
FMC22H20N3F3O3SHCl PM 4999 Apariencia Soacutelido beige Rendimiento 60
02
Descripcioacuten de Compuestos
122
1-(benzo[b]tiofen-3-il)-3-[4-(4-fluorofenil)-36-dihidropiridin-
1(2H)-il]propan-1-ona
Procedimiento experimental
Seguacuten el meacutetodo general C a partir de 1 g (567 mmol) de 4-(4-fluorofenil)-
1236-tetrahidropiridina y 12 g (534 mmol) de 1-(benzo[b]tiofen-3-il)-3-
cloropropan-1-ona Se elimina el disolvente a presioacuten reducida y se precipita el
soacutelido con eacuteter El soacutelido obtenido se purifica por cromatografiacutea flash usando
como fase moacutevil diclorometanometanol (991) Se elimina el disolvente de las
fracciones adecuadas a presioacuten reducida obtenieacutendose el compuesto de forma
soacutelida
Punto de fusioacuten 79-80 ordmC
IR (cm-1) 2780-2775 (d C-H alifaacuteticos) 1664 (mf CO)
RMN-1H (CDCl3 400 MHz) δ (ppm) 261 (sa 2H H6 PIRD) 285 (t 2H H2
PIRD J2ec3ec= J2ax3ax= 57 Hz) 306 (t 2H CO-CH2-CH2 JCHCH= 74 Hz) 330 (sa
2H H5 PIRD) 335 (t 2H CO-CH2 JCHCH= 73 Hz) 603 (t 1H H3 PIRD J56ec=
J56ax= 40 Hz) 702 (dd 2H H3rsquo+ H5rsquo FENIL J3acute2acute= J5acute6acute= 87 Hz) 736 (dd 2H
H2rsquo+ H6rsquo FENIL J3acute2acute= J6acute5acute= 86 Hz) 745 (t 1H H6 BZT J65= J67= 76 Hz) 752 (t
1H H5 BZT J56= J54= 77 Hz) 790 (d 1H H4 BZT J45 = 73 Hz) 839 (s H2 BZT)
879 (d 1H H7 BZT J76= 75 Hz)
Anaacutelisis elemental (CHN)
HPLC (RP-18 1 mLmin metanol-agua (8020)) tr 561 min ʎmax 2196 nm
Calculado Hallado
C 7232 7214
H 548 549
N 383 369
FM C22H20NFOS PM 3655 Apariencia Soacutelido amarillo Rendimiento 15
03
Descripcioacuten de Compuestos
123
1-(5-fluorobenzo[b]tiofen-3-il)-3[4-(4-nitro-2-
(trifluorometilfenil)piperazin-1-il]propan-1-ona
Procedimiento experimental
Seguacuten el meacutetodo general D a partir de 048 g (174 mmol) de 4-(4-nitro-2-
trifluorometilfenil) piperazina y 035 g (179 mmol) de 1-(5-fluorobenzo[b]tiofen-
3-il) etanona se elimina el disolvente a presioacuten reducida y se precipita el soacutelido
con hexanoeacuteter en friacuteo
IR (cm-1) 2976-2832 (d C-H alifaacuteticos) 1671 (mf CO) 1330 (f NO2) 1281 y 1127
(m CF3)
RMN-1H (CDCl3 400 MHz) δ (ppm) 296 (sa 4H H3+H5 PIPZ) 320 (sa 2H
CO-CH2-CH2) 331 (sa 4H H2+H6 PIPZ) 346 (sa 2H CO-CH2) 723 (dt 1H
H6 FBZT J65= J67= 86 Hz J64= 25 Hz) 739 (d 1H H6acute FENIL J6acute5acute= 88 Hz)
783 (dd 1H H7 FBZT J76= 88 Hz J75= 48 Hz) 837 (dd 1H H5acute FENIL J5acute6acute=
89 Hz J5acute3acute= 26 Hz) 848 (dd 1H H4 FBZT J4F= 104 Hz J46= 25 Hz) 853 (s
1H H2 FBZT) 854 (d 1H H3rsquo FENIL)
Anaacutelisis elemental (CHN)
HPLC (RP-18 1 mLmin metanol-agua (8020)) tr 703 min ʎmax 2159 nm
Calculado Hallado
C 5101 5055
H 387 390
N 811 786
FM C22H19N3F4O3S PM 4815 Apariencia Soacutelido amarillo Rendimiento 35
04
Descripcioacuten de Compuestos
124
1-(5-fluorobenzo[b]tiofen-3-il)-3-[4-(2-nitro-4-
(trifluorometilfenil)piperazin-1-il]propan-1-ona
Procedimiento experimental
Seguacuten el meacutetodo general D a partir de 058 g (209 mmol) de 4-(2-nitro-4-
trifluorometilfenil) piperazina y 043 g (222 mmol) de 1-(5-fluorobenzo[b]tiofen-
3-il) etanona Se elimina el disolvente a presioacuten reducida y el residuo se
precipita con eacuteter en friacuteo
RMN-1H (CDCl3 400 MHz) δ (ppm) 280 (sa 4H H3+H5 PIPZ) 303 (t 2H
CO-CH2-CH2 JCHCH= JCHCH= 74 Hz) 323 (sa 4H H2+H6 PIPZ) 328 (t 2H
CO-CH2 JCHCH= JCHCH = 73 Hz) 719 (d 1H H6rsquo FENIL J6acute5acute= 84 Hz) 722-725
(m 1H H6 FBZT) 769 (dd 1H H5acute FENIL J5acute6acute= 87 Hz J5acute3acute= 20 Hz) 782 (dd
1H H7 FBZT J76= 89 Hz J7F= 49 Hz) 843 (s 1H H2 FBZT) 808 (d 1HH3acute
FENIL J3acute5acute= 16 Hz) 850 (dd 1H H4 FBZT J4F= 104 Hz J46= 26 Hz)
Anaacutelisis elemental (CHN)
HPLC (RP-18 1 mLmin metanol-agua (8020)) tr 542 min ʎmax 2196 nm
Calculado Hallado
C 5101 5102
H 386 384
N 811 798
FM C22H19N3F4O3S PM 4815 Apariencia Soacutelido naranja Rendimiento 51
05
Descripcioacuten de Compuestos
125
1-(5-fluorobenzo[b]tiofen-3-il)-3-[4-(4-(trifluorometilfenil)
piperazin-1-il]propan-1-ona
Procedimiento experimental
Seguacuten el meacutetodo general D a partir de 036 g (130 mmol) de 4-(4-
trifluorometilfenil) piperazina y 033 g (170 mmol) de 1-(5-fluorobenzo[b]tiofen-
3-il)etanona Se elimina el disolvente a presioacuten reducida y se precipita el soacutelido
con hexanoeacuteter El soacutelido obtenido no es del todo puro por lo que se purifica
por cromatografiacutea flash usando como fase moacutevil diclorometanometanol (991)
Se elimina el disolvente de las fracciones adecuadas a presioacuten reducida
obtenieacutendose un aceite claro
Debido al bajo rendimiento de la reaccioacuten el aceite puro obtenido se identifica
por CCF y se usa en su totalidad para la siacutentesis del derivado hidroxiacutelico 2c
FM C22H20N2F4OS PM 4815 Apariencia Aceite incoloro Rendimiento 15
06
Descripcioacuten de Compuestos
126
Hidrocloruro de 1-(5-fluorobenzo[b]tiofen-3-il)-3-[4-(4-nitro-2-
(trifluorometilfenil)-14-diazepan-1-il]propan-1-ona
Procedimiento experimental
Seguacuten el meacutetodo general D a partir de 051 g (177 mmol) de 4-(2-nitro-4-
trifluorometilfenil) piperazina comercial y 035 g (179 mmol) de 1-(5-
fluorobenzo[b]tiofen-3-il)etanona se elimina el disolvente a presioacuten reducida y
se precipita con hexanoeacuteter etiacutelico
IR (cm-1) 2938 (d C-H alifaacuteticos) 1663 (m CO) 1449 y 1332 (mf NO2) 1281 y
1120 (m CF3)
RMN-1H (DMSO-d6 400 MHz) δ (ppm) 290-297 (m 6H H3+H5+H6 DZP)
310 (t 2H CO-CH2-CH2 JCHCH= 69 Hz) 322 (t 2H CO-CH2 JCHCH= 71 Hz)
353 (d 2H H7 DZP J76= 78 Hz) 356 (d 2H H2 DZP J23= 81 Hz) 712 (d 1H
H6acute FENIL J6acute5acute= 90 Hz) 722 (dd 1H H6 FBZT J67= 83 Hz J64= 23 Hz) 781
(dd 1H H5acute FENIL J5acute6acute= 93 Hz J5acute3acute= 28 Hz ) 820 (d 1H H7rsquo FBZT J76= 80
Hz) 841 (sa 1H H2 FBZT) 848 (d 1H H3acute FENIL J3acute5acute= 26 Hz) 850 (d 1H H4
FBTF J4F= 102 Hz)
Anaacutelisis elemental (CHN)
HPLC (RP-18 1 mLmin metanol-agua (8020)) tr 239 min ʎmax 2235 nm
Calculado Hallado
C 519lt3 5094
H 414 413
N 790 760
FM C23H21N3F4O3SHCl PM 5320 Apariencia Soacutelido amarillo
Rendimiento 80
07
Descripcioacuten de Compuestos
127
1-(5-fluorobenzo[b]tiofen-3-il)-3-[1-(4-nitro-2-
(trifluorometilfenil)piperidin-4-ilamino]propan-1-ona
Procedimiento experimental
Seguacuten el meacutetodo general D a partir de 030 g (155 mmol) de 1-(4-nitro-2-
trifluorometilfenil) piperidin-4-il amina y 033 g (172 mmol) de 1-(5-
fluorobenzo[b]tiofen-3-il) etanona se elimina el disolvente a presioacuten reducida y
se purifica el aceite impuro por cromatografiacutea flash usando como fase moacutevil
diclorometanometanol (991) Se elimina el disolvente de las fracciones
adecuadas a presioacuten reducida obtenieacutendose un aceite claro aacutembar intenso
Debido al bajo rendimiento de la reaccioacuten el intermedio obtenido se identifica
por CCF y se usa en su totalidad para la siacutentesis del derivado hidroxiacutelico 2f
FM C23H21N3F4O3S PM 4955 Apariencia Aceite aacutembar Rendimiento 20
08
Descripcioacuten de Compuestos
128
Hidrocloruro de 1-(2-naftil)-3-[4-(4-nitro-2-trifluorometilfenil)
piperazin-1-il] propan-1-ona
Procedimiento experimental
Seguacuten el meacutetodo general D partiendo de 031 g (181 mmol) de 2-acetonaftona
comercial y 050 g (181 mmol) de 4-(4-nitro-2-trifluorometilfenil) piperazina
Despueacutes de la extraccioacuten y eliminacioacuten a presioacuten reducida del disolvente se
obtiene un aceite impuro El compuesto se purifica y precipita con eacuteter saturado
de clorhiacutedrico para la obtencioacuten del hidrocloruro
Punto de fusioacuten 181-183ordmC
IR (cm-1) 2922-2844 (d C-H alifaacuteticos) 1680 (mf CO) 1521 y 1347 (mf NO2)
1279 y 1151 (m CF3)
RMN-1H (DMSO-d6 400 MHz) δ (ppm) 321 (d 2H H3ax+H5ax PIPZ) 327 (d
2H H3ec+H5ec PIPZ) 364 (sa 2H H2ax+H6ax PIPZ) 367 (sa 2H H2ec+H6ec PIPZ)
390 (t 2H CO-CH2-CH2 JCH-CH= 118 Hz) 403 (t 2H CO-CH2 JCH-CH= 64 Hz)
765-759 (m 3H H6+H7 NFT+H6acute FENIL) 792 (d 1H H4 NFT J43= 79 Hz)
795 (d 1H H5 NFT J56= 87 Hz) 804 (d 1H H8 NFT J87= 83 Hz) 806 (d 1H
H3 NFT J34= 79 Hz) 846 (dd 1H H5acute FENIL J5acute6acute= 88 Hz J5acute3acute= 25 Hz) 858
(d 1H H3acute FENIL J3acute5acute= 25 Hz) 862 (sa 1H H1 NFT)
Anaacutelisis elemental (CHN)
HPLC (RP-18 1 mLmin metanol-agua (8020)) tr 252 min ʎmax 2134 nm
Calculado Hallado
C 5434 5410
H 434 455
N 790 765
FM C24H22N3F3O3HCl PM 4940 Apariencia Soacutelido beige Rendimiento 17
09
Descripcioacuten de Compuestos
129
Hidrocloruro de 1-(2-naftil)-3-[4-(2-nitro-4-
trifluorometilfenil)piperazin-1-il]propan-1-ona
Procedimiento experimental
Seguacuten el meacutetodo general D partiendo de 062 g (363 mmol) de 2-acetonaftona
comercial y 100 g (363 mmol) de 4-(2-nitro-4-trifluorometilfenil) piperazina
Despueacutes de extraer y eliminar a presioacuten reducida el disolvente se obtiene un
aceite impuro El compuesto se purifica y precipita con eacuteter saturado de
clorhiacutedrico para la obtencioacuten del hidrocloruro
Punto de fusioacuten 152ndash153 ordmC
IR (cm-1) 2953-2838 (md C-H alifaacuteticos) 1672 (mf CO) 1535 y 1329 (mf NO2)
1278 y 1169 (m CF3)
RMN-1H (DMSO-d6 400 MHz) δ (ppm) 324ndash331 (m 2H CO-CH2-CH2)
345ndash361(m 6H H3+H5+H2ax+H2ax PIPZ) 371 (d 2H H2ec+H6ec PIPZ Jec-ax=
1148 Hz) 387 (t 2H CO-CH2 JCH-CH= 111 Hz) 756 (d 1H H6acute FENIL J6acute5acute=
87 Hz) 767 (ddd 1H H6 NFT J65= 82 Hz J67= 68 Hz J68= 13 Hz) 771 (ddd
1H H7 NFT J78= 83 Hz J76= 71 Hz J75= 13 Hz) 797 (dd 1H H5acute FENIL J5acute6acute=
89 Hz) 803 (d 1H H4 NFT J43= 84 Hz) 804 (d 1H H5 NFT J56= 85 Hz) 808
(d 1H H8 NFT J87= 85 Hz) 815 (d 1H H3 NFT J34= 80 Hz) 828 (d 1H H3acute
FENIL J3acute5acute= 13 Hz) 877 (sa 1H H1 NFT) 1135 (sa 1H HCl)
Anaacutelisis elemental (CHN)
HPLC (RP-18 1 mLmin metanol-agua (8020)) tr 528 min ʎmax 2475 nm
Calculado Hallado
C 5836 5842
H 466 471
N 850 843
FM C24H22N3F3O3HCl PM 4940 Apariencia Soacutelido amarillo Rendimiento 41
010
Descripcioacuten de Compuestos
130
Hidrocloruro de 1-(2-naftil)-3-[1-(4-nitro-2-
trifluorometilfenil)pirrolidin-3-ilamino]propan-1-ona
Procedimiento experimental
Seguacuten el meacutetodo general D partiendo de 067 g (394 mmol) de 2-acetonaftona y
095 g de 1-(4-nitro-2-(trifluorometilfenil)-(S)-pirrolidin-3-amina Despueacutes de
extraer con acetato de etilo y eliminar a presioacuten reducida el disolvente se
obtiene un soacutelido fino que se lava con eacuteter
Punto de fusioacuten 170-171ordmC
IR (cm-1) 2942-2716 (m C-H alifaacuteticos) 1681 (m CO) 1504 y 1324 (mf NO2)
1285 y 1121 (m CF3)
RMN-1H (DMSO-d6 400 MHz) δ (ppm) 238 (dd 1H H4ec PIRR) 245 (dd 1H
H4ax PIRR) 342 (d 2H CO-CH2-CH2) 364 (dd 1H H2ec PIRR) 375 (t 2H CO-
CH2) 381- 386 (m 2H H5ec+ H2ax PIRR) 394 (dd 1H H5ax PIRR) 408 (s 1H
H3 PIRR) 712 (d 1H H6acute FENIL J6acute5acute= 96 Hz) 765 (dd 1H H6 NFT J67= 78
Hz J65= 68 Hz) 769 (dd 1H H7 NFT J78= 83 Hz J76= 78 Hz) 800 (d 1H H4
NFT J43= 65 Hz) 802 (d 1H H3 NFT J34= 65 Hz) 806 (d 1H H5acute FENIL
J5acute6acute= 86 Hz) 816 (d 1H H5 NFT J56= 68 Hz) 825 (d 1H H8 NFT J87= 84
Hz) 839 (sa 1H H3acute FENIL) 869 (sa 1H H1 NFT) 980 (sa 2H NH+ HCl)
Anaacutelisis elemental (CHN)
HPLC (RP-18 1 mLmin metanol-agua (8020)) 25 min ʎmax= 2141 nm
Calculado Hallado
C 5836 5794
H 466 475
N 851 837
FM C24H22N3F3O3HCl PM 4935 Apariencia Soacutelido anaranjado
Rendimiento 38
011
Descripcioacuten de Compuestos
131
3-[4-(4-fluorofenil)-36-dihidropiridin-1(2H)-il]-1-(naftalen-2-
il)propan-1-ona
Procedimiento experimental
Seguacuten el meacutetodo general D a partir de 082 g (463 mmol) de 4-(4-fluorofenil)-
1236-tetrahidropiridina y 070 g (411 mmol) de 2-acetonaftona Se elimina el
disolvente a presioacuten reducida y se precipita el soacutelido con eacuteter El soacutelido
obtenido se purifica por cromatografiacutea flash usando como fase moacutevil
diclorometanometanol (991) Se elimina el disolvente de las fracciones
adecuadas a presioacuten reducida obtenieacutendose un soacutelido
Punto de fusioacuten 172ndash175 ordmC
IR (cm-1) 2780-2775 (d C-H alifaacuteticos) 1677 (f CO) 1510 (f C=C)
RMN-1H (CDCl3 400 MHz) δ (ppm) 161 (sa 2H H6 PIRD) 214 (sa 2H H2
PIRD) 272 (sa 2H CO-CH2-CH2) 292-299 (m 2H H5 PIRD) 345 (d 2H CO-
CH2) 602 (sa 1H H3 PIRD) 705 (t 2H H3rsquo+ H5rsquo FENIL J3acute2acute= J5acute6acute= 86 Hz)
735 (d 1H H6acute FENIL J6acute5acute= 86 Hz) 739 (sa 1H H2acute FENIL) 748-751 (m 3H
H5+H6+H7 NFT) 784-786 (m 3H H3+H4+H8 NFT) 791 (s 1H H1 NFT)
Anaacutelisis elemental (CHN)
HPLC (RP-18 1 mLmin metanol-agua (8020)) tr 557 min ʎmax 2455 nm
Calculado Hallado
C 7182 7125
H 581 573
N 354 350
FM C24H22NFO PM 3595 Apariencia Soacutelido beige Rendimiento 24
012
Descripcioacuten de Compuestos
132
3-[4-(4-fluorofenil)-36-dihidropiridin-1(2H)-il]-1-(4-
trifluorometilfenil)propan-1-ona
Procedimiento experimental
Seguacuten el meacutetodo general D a partir de 054 g (293 mmol) de 4-(4-fluorofenil)-
1236-tetrahidropiridina y 052 g (276 mmol) de 1-(4-trifluorometilfenil)
etanona se elimina el disolvente a presioacuten reducida y el aceite se purifica por
cromatografiacutea flash usando como fase moacutevil diclorometanometanol (991) Se
elimina el disolvente de las fracciones adecuadas a presioacuten reducida obteniendo
el compuesto puro
RMN-1H (DMSO-d6 400 MHz) δ (ppm) 284 (sa 2H H6 PIRD) 355 (t 2H H2
PIRD) 382 (t 4H CO-CH2 +CO-CH2-CH2) 406 (sa 2H H5 PIRD) 621 (sa 1H
H3 PIRD) 723 (t 2H H2+ H6 TFBZN J23= J65= 88 Hz) 756 (dd 2H H3acute+ H5acute
FENIL J3acute2acute= J5acute6acute= 87 Hz J3acute5acute= J5acute3acute= 54 Hz) 797 (d 2H H2acute+ H6acute FENIL J2acute3acute=
J6acute5acute= 83 Hz) 823 (d 2H H3+H5 TFBZN J32= J56= 86 Hz)
FM C21H19NF4O
PM 3774 Apariencia Aceite beige Rendimiento 13
013
Descripcioacuten de Compuestos
133
1-(2-naftil)-2-[4-(4-nitro-2-trifluorometilfenil)piperazin-1-il]etan-1-
ona
Procedimiento experimental
Seguacuten el meacutetodo general C a partir de 070 g (254 mmol) de 4-(4-nitro-2-
trifluorometilfenil) piperazina y 053 g (211 mmol) de 2-bromo-2acute-acetonaftona
Se elimina el disolvente a presioacuten reducida obteniendo un aceite que se purifica
por columna cromatograacutefica usando como fase moacutevil diclorometanometanol
(973) Se elimina el disolvente de las fracciones adecuadas a presioacuten reducida
obteniendo compuesto puro en forma soacutelida
Punto de fusioacuten 167-168ordmC
IR (cm-1) 2925-2873 (d C-H alifaacuteticos) 1669 (mf CO) 1499 y 1334 (mf NO2)
1281 y 1124 (m CF3)
RMN-1H (DMSO-d6 400 MHz) δ (ppm) 309 (sa 4H H2+H6 PIPZ) 336 (sa
4H H3+H5 PIPZ) 428 (sa 2H COCH2) 739 (d 1H H6acute FENIL J6acute5acute= 88 Hz)
760-765 (m 1H H6 NFT) 766-771 (m 1H H7 NFT) 792 (d 1H H3 NFT J34=
81 Hz) 794 (d 1H H5acute FENIL J5acute6acute= 89 Hz) 800 (d 1H H4 NFT J43= 81 Hz)
805 (dd 1H H5 NFT J56= 85 Hz J57= 12 Hz) 837 (dd 1H H8 NFT J87= 90
Hz J86= 19 Hz) 856 (sa 2H H2 NFT+ H3acute FENIL)
Anaacutelisis elemental (CHN)
HPLC (RP-18 1 mLmin metanol-agua (8020)) tr 69 min ʎmax 2477 nm
Calculado Hallado
C 6225 602
H 451 421
N 948 925
FM C23H20N3F3O3 PM 4434 Apariencia Soacutelido beige Rendimiento 13
014
Descripcioacuten de Compuestos
134
1-(2-naftil)-2-[4-(2-nitro-4-trifluorometilfenil)piperazin-1-il]etan-1-
ona
Procedimiento experimental
Seguacuten el meacutetodo general C a partir de 135 g (481 mmol) de 4-(2-nitro-4-
trifluorometilfenil) piperazina y 104 g (417 mmol) de 2-bromo-2acute-acetonaftona
Se elimina el disolvente a presioacuten reducida obteniendo un aceite que se
precipita con una mezcla de hexanoeacuteter etiacutelico en frio
Punto de Fusioacuten 105-106ordmC
IR (cm-1) 2943-2854 (d alifaacuteticos) 1686 (f CO) 1532 y 1329 (m NO2) 1295 y
1118 (m CF3)
RMN-1H (CDCl3 400 MHz) δ (ppm) 290 (t 4H H3+H5 PIPZ) 331 (t 4H
H2+H6 PIPZ) 410 (sa 2H CO-CH2) 721 (d 1H H6acute FENIL J6acute5acute= 86 Hz) 760
(dd 1H H7 NFT J78= 85 Hz J75= 84 Hz) 764 (dd 1H H4 NFT J43= 81 Hz
J45= 14 Hz) 769 (ddd 1H H6 NFT J65= 95 Hz J67= 84 Hz J68= 16 Hz) 791
(d 1H H5 NFT J56= 95 Hz) 794 (d 1H H8 NFT J87= 84 Hz) 800 (d 1H H3
NFT J34= 81 Hz) 806 (dd 1H H5acute FENIL J5acute6acute= 86 Hz J5acute3acute= 16 Hz) 809 (d
1H H3acute FENIL J3acute5acute= 16 Hz) 856 (sa 1H H1 NFT)
Anaacutelisis elemental (CHN)
Calculado Hallado
C 6230 6173
H 451 481
N 948 933
FM C23H20N3F3O3 PM 44340 Apariencia Soacutelido naranja Rendimiento 60
015
Descripcioacuten de Compuestos
135
1-(4-fluoronaftil)-3-[4-(4-nitro-2-trifluorometilfenil)piperazin-1-
il]propan-1-ona
Procedimiento experimental
Seguacuten el meacutetodo general D a partir de 063 g (229 mmol) de 4-(4-nitro-2-
trifluorometilfenil) piperazina y 056 g (299 mmol) de 4acute-fluoro-1acute-acetonaftona
comercial se elimina el disolvente a presioacuten reducida obteniendo un aceite que
se purifica por cromatografiacutea flash usando como fase moacutevil
diclorometanometanol (955) Se elimina el disolvente de las fracciones
adecuadas a presioacuten reducida obtenieacutendose el compuesto en forma de aceite
que se usa en su totalidad despueacutes de su identificacioacuten por CCF para la siacutentesis
del derivado hidroxiacutelico 5a
FM C24H21N3F4O3 PM 4754 Apariencia Aceite amarillo Rendimiento 53
016
Descripcioacuten de Compuestos
136
1-(4-fluoronaftil)-3-[4-(2-nitro-4-trifluorometilfenil) piperazin-1-il]
propan-1-ona
Procedimiento experimental
Seguacuten el meacutetodo general D partiendo de 144 g (523 mmol) de 4-(2-nitro-4-
trifluorometilfenil) piperazina y 098 g (522 mmol) de 4acute-fluoro-1acute-acetonaftona
comercial Despueacutes de extraer y eliminar a presioacuten reducida el disolvente se
obtiene un aceite que al antildeadir hexano friacuteo precipita el compuesto puro como
soacutelido fino
Punto de fusioacuten 106ndash107 ordmC
IR (cm-1) 2924-2854 (f C-H alifaacuteticos) 1675 (mf CO) 1531 y 1326 (m NO2)
1278 y 1123 (m CF3)
RMN-1H (DMSO 400 MHz) δ (ppm) 270 (sa 4H H3+H5 PIPZ) 304 (sa 2H
CO-CH2-CH2) 319 (sa 4H H2+H6 PIPZ) 335 (sa 2H CO-CH2) 717 (d 1H H6acute
FENIL J6acute5acute= 88 Hz) 720 (dd 1H H7 FNFT J78= 90 Hz J76= 80 Hz) 763 (ddd
1H H6 FNFT) 768 (dd 1H H5acute FENIL J5acute6acute= 88 Hz J5acute3acute= 16 Hz) 769 (dd 1H
H5 FNFT J56= 73 Hz J5F= 27 Hz) 794 (dd 1H H3 FNFT J32= 79 Hz J3F= 54
Hz) 807 (d 1H H3acute FENIL J3acute5acute= 15 Hz) 819 (d 1H H2 FNFT J23= 79 Hz)
873 (d 1H H8 FNFT J87= 90 Hz)
Anaacutelisis elemental (CHN)
HPLC (RP-18 1 mLmin metanol-agua (8020)) 243 min ʎmax= 2200 nm
Calculado Hallado
C 6063 6100
H 442 459
N 884 867
FM C24H21N3F4O3 PM 4754 Apariencia Soacutelido anaranjado Rendimiento 73
017
Descripcioacuten de Compuestos
137
1-(4-fluoronaft-1-il)-3-[4-(4-trifluorometilfenil)piperazin-1-
il]propan-1-ona
Procedimiento experimental
Seguacuten el meacutetodo general D a partir de 037 g (187 mmol) de 4-(4-
trifluorometilfenil) piperazina y 032 g (169 mmol) de 4acute-fluoro-1acute-acetonaftona
se elimina el disolvente a presioacuten reducida y precipita un soacutelido impuro con
hexanoeacuteter Se purifica por cromatografiacutea flash usando como fase moacutevil
diclorometanometanol (991) y se elimina el disolvente de las fracciones
adecuadas a presioacuten reducida obtenieacutendose el compuesto en forma de aceite
que despueacutes de su identificacioacuten por CCF se usa en su totalidad para la siacutentesis
del derivado hidroxiacutelico 5c
FM C24H22N2F4O PM 4305 Apariencia Aceite beige Rendimiento 23
018
Descripcioacuten de Compuestos
138
1-(4-fluoronaft-1-il)-3-[1-(4-nitro-2-trifluorometilfenil)piperidin-4-
ilamino]propan-1-ona
Procedimiento experimental
Seguacuten el meacutetodo general D a partir de 085 g (293 mmol) de 1-(4-nitro-2-
trifluorometilfenil)piperidin-4-il amina y 100 g (531 mmol) de 4acute-fluoro-1acute-
acetonaftona Se elimina el disolvente a presioacuten reducida y se purifica el aceite
impuro por cromatografiacutea flash usando como fase moacutevil
diclorometanometanol (991) Se elimina el disolvente de las fracciones
adecuadas a presioacuten reducida obtenieacutendose un soacutelido amarillo
IR (cm-1) 2950-2732 (d C-H alifaacuteticos) 1673 (mf CO) 1508 y 1334 (m NO2)
1284 y 1119 (m CF3)
RMN-1H (DMSO 400 MHz) δ (ppm) 180 (d 2H H3ax+ H5ax PIPR J3ax5ax=
J5ax3ax= 116 Hz) 224 (d 2H H3ec+H5ec PIPR J3ec5ec= J5ec3ec= 116 Hz) 300 (t 2H
CO-CH2-CH2 JCHCH= 118 Hz) 336-343 (m 5H H2+H4+H6 PIPR) 366 (t 2H
CO-CH2 JCHCH= 62 Hz) 753 (ddd 1H H3 FNFT J3F= 106 Hz J32= 85 Hz J35=
157 Hz) 760 (d 1H H6acute FENIL J6acute5acute= 89 Hz) 774 (ddd 1H H6 FNFT J65= 79
Hz J67= 69 Hz J68= 12 Hz) 779 (ddd 1H H7 FNFT J78= 85 Hz J76= 70 Hz
J75= 14 Hz) 818 (d 1H H2 FNFT J23= 81 Hz) 826 (dd 1H H5 FNFT J56= 74
Hz J5F= 56 Hz J57= 14 Hz) 840 (d 1H H3acute FENIL J3acute5acute= 24 Hz ) 844 (dd 1H
H5acute FENIL J5acute6acute= 87 Hz J5acute3acute= 26 Hz) 880 (d 1H H8 FNFT J87= 83 Hz)
FM C25H23N3F4O3 PM 4895 Apariencia Soacutelido amarillo Rendimiento 52
019
Descripcioacuten de Compuestos
139
1-(4-fluoronaft-1-il)-3-[4-(4-fluorofenil)-36-dihidropiridin-1(2H)-
il]propan-1-ona
Procedimiento experimental
Seguacuten el meacutetodo general D a partir de 143 g (669 mmol) de 4-(4-fluorofenil)-
1236-tetrahidropiridina y 097 g (518 mmol) de 4acute-fluoro-1acute-acetonaftona Se
elimina el disolvente a presioacuten reducida y el aceite se purifica por cromatografiacutea
flash usando como fase moacutevil diclorometanometanol (955) Se elimina el
disolvente de las fracciones adecuadas a presioacuten reducida obteniendo un soacutelido
puro
Punto de fusioacuten 127-128ordmC
IR (cm-1) 2536 (d C-H alifaacuteticos) 1672 (f CO)
RMN-1H (DMSO-d6 400 MHz) δ (ppm) 263 (s 2H H5 PIRD) 314-335 (m
6H H2+ H6 PIRD+ CO-CH2-CH2) 361 (s 2H CO-CH2) 616 (s 1H H3 PIRD)
719 (t 2H H3acute+ H5acute FENIL J3acute2acute= J6acute5acute= 89 Hz) 749 (d 1H H3 FNFT J32= 80
Hz) 751 (d 2H H2acute+H6acute FENIL J2acute3acute= J6acute5acute= 87 Hz) 773 (t 2H H6+H7 FNFT
J67= J76= 71 Hz) 815 (d 1H H5 FNFT J56= 75 Hz) 828 (dd 1H H2 FNFT J23=
78 Hz J2F= 43 Hz) 868 (d 1H H8 FNFT J87= 81 Hz)
FM C24H21NF2O
PM 3775 Apariencia Soacutelido blanco Rendimiento 44
020
Descripcioacuten de Compuestos
140
1-(4-fluorofenil)-3-[4-(4-nitro-2-trifluorometilfenil) piperazin-1-il]
propan-1-ona
Procedimiento experimental
Seguacuten el meacutetodo general D a partir de 026 g (093 mmol) de 4-(4-nitro-2-
trifluorometilfenil) piperazina y 025 g (180 mmol) de 1-(4-fluorofenil) etanona
se elimina el disolvente a presioacuten reducida obtenieacutendose un aceite que se
purifica por cromatografiacutea flash usando como fase moacutevil
diclorometanometanol (991) Se elimina el disolvente de las fracciones
adecuadas a presioacuten reducida obteniendo el compuesto en forma de aceite que
se usa en su totalidad despueacutes de su identificacioacuten por CCF para la siacutentesis del
derivado hidroxiacutelico 6a
FM C20H19N3F4O3 PM 4254 Apariencia Aceite amarillo Rendimiento 63
021
Descripcioacuten de Compuestos
141
1-(4-fluorofenil)-3-[1-(4-nitro-2-trifluorometilfenil)piperidin-4-il-
amino]propan-1-ona
Procedimiento experimental
Seguacuten el meacutetodo general D a partir de 025 g (853 mmol) de 1-(4-nitro-2-
trifluorometilfenil) piperidin-4-il amina y 022 g (160 mmol) de 1-(4-
fluorofenil)etanona Se elimina el disolvente a presioacuten reducida y se purifica el
aceite impuro por cromatografiacutea flash usando como fase moacutevil
diclorometanometanol (991) Se elimina el disolvente de las fracciones
adecuadas a presioacuten reducida obtenieacutendose un aceite
RMN-1H (DMSO-d6 400 MHz) δ (ppm) 250 (sa 1H H4 PIPR) 263-256 (m
4H H3+ H5 PIPR) 275 (t 2H CO-CH2-CH2) 314-309 (m 4H H2 +H6 PIPR)
324 (t 2H CO-CH2) 736 (t 2H H2 +H6 FBZN J23= J65=80 Hz) 754 (d 1H H6acute
FENIL J6acute5acute= 79 Hz) 808 (d 1H H5 FBZN J56= 79 Hz) 810 (d 1H H3 FBZN
J32= 76 Hz) 838 (s 1H H3acute FENIL) 839 (sa 1H H5acute FENIL)
FM C21H21N3F4O3 PM 4394 Apariencia Aceite amarillo Rendimiento 12
022
Descripcioacuten de Compuestos
142
1-(4-fluorofenil)-3-[4-(4-fluorofenil)-36-dihidropiridin-1(2H)-il]
propan-1-ona
Procedimiento experimental
Seguacuten el meacutetodo general D a partir de 050 g (288 mmol) de 4-(4-fluorofenil)-
1236-tetrahidropiridina y 034 g (245 mmol) de 1-(4-fluorofenil)etanona Se
elimina el disolvente a presioacuten reducida y el aceite se purifica por cromatografiacutea
flash usando como fase moacutevil diclorometanometanol (991) Se elimina el
disolvente de las fracciones adecuadas a presioacuten reducida obteniendo un aceite
amarillo
Despueacutes de identificar el compuesto por CCF debido al bajo rendimiento se usa
todo el aceite obtenido para la siacutentesis del derivado hidroxiacutelico 6g
FM C20H19NF2O
PM 32740 Apariencia Aceite amarillo Rendimiento 10
023
Descripcioacuten de Compuestos
143
X3 Siacutentesis de derivados hidroxiacutelicos
1-(benzo[b]tiofen-3-il)-3-[4-(4-nitro-2-
trifluorometilfenil)piperazin-1-il] propan-1-ol
Procedimiento experimental
Seguacuten el meacutetodo general E partiendo de 050 g (107 mmol) de 1-
(benzo[b]tiofen-3-il)-3-[4-(4-nitro-2-trifluorometilfenil)piperazin-1-il]propan-1-
ona se obtiene tras la eliminacioacuten del disolvente un soacutelido que se purifica por
columna cromatograacutefica de fase moacutevil diclorometanometanol (991) y se
obtiene el compuesto puro
Punto de fusioacuten 157ndash158 ordmC
IR (cm-1) 3365 (m OH) 2998-2830 (m C-H alifaacuteticos) 1524 y 1349 (mf NO2)
1282 y 1128 (f CF3)
RMN-1H (CDCl3 400 MHz) δ (ppm) 214-216 (m 2H CHOH-CH2) 277-287
(m 6H CHOH-CH2-CH2+H3+H5 PIPZ) 320-329 (m 4H H2 +H6 PIPZ) 538
(dd 1H CHOH) 733-742 (m 3H H6rsquo FENIL +H6+H5 BZT) 745 (s 1H H2
BZT) 782 (d 1H H4 BZT J45 = 84 Hz) 788 (d 1H H7 BZT J76= 80 Hz) 837
(dd 1H H5rsquo FENIL J5rsquo6rsquo = 92 Hz J5rsquo3rsquo = 28 Hz) 855 (d 1H H3rsquo FENIL)
Anaacutelisis elemental (CHN)
HPLC (RP-18 1 mLmin metanol-agua (8020)) 54 min ʎmax= 2281 nm
Calculado Hallado
C 5677 5701
H 473 485
N 903 853
FM C22H22N3F3O3S PM 4655 Apariencia Soacutelido amarillo Rendimiento 13
1a
Descripcioacuten de Compuestos
144
Hidrocloruro de 1-(benzo[b]tiofen-3-il)-3-[4-(2-nitro-4-
trifluorometilfenil)piperazin-1-il]propan-1-ol
Procedimiento experimental
Seguacuten el meacutetodo general E se parte de 041 g (082 mmol) de 1-(benzo[b]tiofen-
3-il)-3-[4-(2-nitro-4-trifluorometilfenil)piperazin-1-il]propan-1-ona Tras la
eliminacioacuten del disolvente se obtiene un aceite impuro que se purifica por
cromatografiacutea flash con diclorometanometanol (991) El aceite puro precipita
con eacuteter clorhiacutedrico como hidrocloruro
Punto de fusioacuten 176-178ordmC
IR (cm-1) 3185 (d OH) 2924-2851 (f C-H alifaacuteticos) 1509 y 1346 (mf NO2) 1279
y 1119 (f CF3)
RMN-1H (DMSO-d6 400 MHz) δ (ppm) 223ndash232 (m 2H CHOH-CH2) 317
(sa 2H CHOH-CH2-CH2) 335 (sa 2H H3ax+H5ax PIPZ) 349 (sa 4H
H2ax+H6ax+ H3ec+H5ec PIPZ) 359 (d 2H H2ec+H6ec PIPZ) 501 (m 1H CH-OH)
743ndash736 (m 2H H5+H6 BZT) 754 (d 1H H6acute FENIL J6acute5acute = 80 Hz) 764 (sa
1H H2 BZT) 794 (dd 1H H5acute FENIL J5acute6acute = 81 Hz J5acute3acute = 16 Hz) 798-801 (m
2H H7+ H4 BZT) 825 (sa 1H H3acute FENIL) 1111 (sa 1H HCl)
Anaacutelisis elemental (CHN)
HPLC (RP-18 1 mLmin metanol-agua (8020)) 433 min ʎmax= 2290 nm
Calculado Hallado
C 5264 5253
H 439 428
N 838 826
FM C22H22N3F3O3SHCl PM 502 Apariencia Soacutelido camel Rendimiento 16
1b
Descripcioacuten de Compuestos
145
Hidrocloruro de 1-(benzo[b]tiofen-3-il)-3-[4-(4-fluorofenil)-36-
dihidropiridin-1(2H)-il)propan-1-ol
Procedimiento experimental
Seguacuten el meacutetodo general E partiendo de 015 g (041 mmol) de 1-
(benzo[b]tiofen-3-il)-3-[4-(4-fluorofenil)-36-dihidropiridin-1(2H)-il] propan-1-
ona Despueacutes se elimina el disolvente y se obtiene un soacutelido impuro que se
purifica precipitando el hidrocloruro con eacuteter clorhiacutedrico
Punto fusioacuten 204-206ordmC
IR (cm-1) 3385 (d OH) 2924-2851 (f C-H alifaacuteticos)
RMN-1H (DMSO 400 MHz) δ (ppm) 229-30 (m 2H CHOH-CH2) 274- 281
(m 2H CHOH-CH2-CH2) 337-340 (m 2H H6 PIRD) 366-377 (m 3H
H2+H5ax PIRD) 40 (d 1H H5ec PIRD) 509 (sa 1H CHOH) 620 (s 1H H3
PIRD) 723 (d 2H H3rsquo+ H5rsquo FENIL J3acute2acute= J5acute6acute= 90 Hz) 738-74 (m 2H H2rsquo+ H6rsquo
FENIL) 750 (dd 2H H6+H5 BTF J65= J56= 80 Hz J54= J67= 71 Hz) 760 (s 1H
H2 BTF) 800 (dd 2H H4 +H7 BTF J45= J76= 70 Hz J6= J75= 18 Hz) 105 (sa
1H HCl)
Anaacutelisis elemental (CHN)
HPLC (RP-18 1 mLmin metanol-agua (8020)) tr 426 min ʎmax 2282 nm
Calculado Hallado
C 640 6389
H 551 575
N 339 325
FM C22H22NFOSHCl PM 4405 Apariencia Soacutelido blanco
Rendimiento 65
1g
Descripcioacuten de Compuestos
146
1-(5-fluorobenzo[b]tiofen-3-il)-3-[4-(4-nitro-2-
trifluorometilfenil)piperazin-1-il]propan-1-ol
Procedimiento experimental
Seguacuten el meacutetodo general E partiendo de 040 g (092 mmol) de 1-(5-
fluorobenzo[b]tiofen-3-il)-3-[4-(4-nitro-2-trifluorometilfenil)piperazin-1-
il]propan-1-ona Despueacutes de eliminar el disolvente se obtiene un soacutelido marroacuten
impuro que purificamos por cromatografiacutea flash en diclorometanometanol
(991)
Punto fusioacuten 140-142ordmC
IR (cm-1) 3426 (d OH) 2826 (d C-H alifaacuteticos) 1507 y 1329 (mf NO2) 1283 (mf
F-BZT)1240 y 1122 (f CF3)
RMN-1H (CDCl3 400 MHz) δ (ppm) 206-215 (m 2H CHOH-CH2) 274-283
(sa 3H H3ax+H5ax PIPZ+ CHOH-CH2-CH2) 292-386 (m 3H H3ec+H5ec PIPZ+
CHOH-CH2-CH2) 324 (t 4H H2+H6 PIPZ) 530 (dd 1H CHOH JCH-OH = 74
Hz JCH-CH = 39 Hz) 713 (dt 1H H6 FBZT J67 = 87 Hz J6F = 83 Hz J64 = 25
Hz) 735 (d 1H H6acute FENIL J6acute5acute= 90 Hz) 752 (dd 1H H4 FBZT J4F = 95 Hz J46
= 28 Hz) 751 (s 1H H2 FBZT) 780 (dd 1H H7 FBZT J76 = 88 Hz J7F = 49
Hz) 838 (dd 1H H5rsquo FENIL J5acute6acute = 89 Hz J5acute3acute = 27 Hz) 855 (d 1H H3rsquo FENIL
J3acute5acute = 27 Hz)
Anaacutelisis elemental (CHN)
HPLC (RP-18 1 mLmin metanol-agua (8020)) 554 min ʎmax= 2283 nm
Calculado Hallado
C 5446 5483
H 434 444
N 869 920
FM C22H21N3F4O3S PM 4835 Apariencia Soacutelido amarillo Rendimiento 21
2a
Descripcioacuten de Compuestos
147
Hidrocloruro de 1-(5-fluorobenzo[b]tiofen-3-il)-3-[4-(2-nitro-4-
trifluorometilfenil)piperazin-1-il]propan-1-ol
Procedimiento experimental
Seguacuten el meacutetodo general E partiendo de 031 g (086 mmol) de 1-(5-
fluorobenzo[b]tiofen-3-il)-3-[4-(2-nitro-4-trifluorometilfenil)piperazin-1-
il]propan-1-ona se obtiene tras la eliminacioacuten del disolvente un aceite impuro
que se purifica por cromatografiacutea flash con diclorometanometanol (991) El
aceite puro precipita como hidrocloruro con eacuteter clorhiacutedrico
Punto de fusioacuten 196-198ordmC
IR (cm-1) 3408 (d OH) 2968-2814 (d C-H alifaacuteticos) 1533 y 1329 (mf NO2)
1230 y 1112 (f CF3)
RMN-1H (DMSO-d6 400 MHz) δ (ppm) 206 (sa 2H CHOH-CH2) 292 (sa
4H H2+H6 PIPZ) 324 (sa 4H H3+H5 PIPZ) 37 (sa 2H CHOH-CH2-CH2) 50
(sa 1H CHOH) 726 (dt 1H H6 FBZT J6F = 91 Hz J67 = 88 Hz J64 = 22 Hz)
749 (d 1H H6acute FENIL J6acute5acute= 85 Hz) 772 (s 1H H2 FBZT) 777 (d 1H H4
FBZT J4F = 102 Hz) 790 (d 1H H5acute FENIL J5acute6acute = 84 Hz) 802 (dd 1H H7
FBZT J76 = 89 Hz J7F = 51 Hz ) 820 (s 1H H3acute FENIL)
Anaacutelisis elemental (CHN)
HPLC (RP-18 1 mLmin metanol-agua (8020)) 445 min ʎmax=2308 nm
Calculado Hallado
C 5081 5121
H 423 375
N 808 811
FM C22H21N3F4O3S HCl PM 5195 Apariencia Soacutelido amarillo Rendimiento 20
2b
Descripcioacuten de Compuestos
148
1-(5-fluorobenzo[b]tiofen-3-il)-3-[4-(4-
trifluorometilfenil)piperazin-1-il]propan-1-ol
Procedimiento experimental
Seguacuten el meacutetodo general E partiendo de 053 g de 1-(5-fluorobenzo[b]tiofen-3-
il)-3-[4-(4-trifluorometilfenil)piperazin-1-il]propan-1-ona se obtiene en la
eliminacioacuten del disolvente un aceite impuro que se purifica por cromatografiacutea
flash con diclorometanometanol (991)
Punto de fusioacuten 158-160ordmC
IR (cm-1) 2961-2831 (d C-H alifaacuteticos) 1248 y 1115 (f CF3)
RMN-1H (CDCl3 400 MHz) δ (ppm) 221 (sa 2H CHOH-CH2) 282 (sa 3H
H3ax+H5ax PIPZ +CHOH-CH2-CH2) 293-294 (m 3H H3ec+H5ec PIPZ + CHOH-
CH2-CH2) 345 (sa 4H H2+H6 PIPZ) 532 (dd 1H CHOH JCH-OH = 41 Hz JCH-
CH = 67 Hz) 696 (d 2H H6+H7 FBZT J67 = J76 = 84 Hz) 710-715 (m 1H H4
FBZT) 750-754 (m 4H H2acute+H3acute+H5acute+H6acute FENIL) 780 (sa 1H H2 FBZT)
Anaacutelisis elemental (CHN)
HPLC (RP-18 1 mLmin metanol-agua (8020)) tr 466 min ʎmax 2005 nm
Calculado Hallado
C 6027 5930
H 502 495
N 639 624
FM C22H22N2F4OS
PM 4385 Apariencia Soacutelido blanco Rendimiento 15
2c
Descripcioacuten de Compuestos
149
1-(5-fluorobenzo[b]tiofen-3-il)-3-[4-(4-nitro-2-trifluorometilfenil)-
14-diazepan-1-il]propan-1-ol
Procedimiento experimental
Seguacuten el meacutetodo general E partiendo de 039 g (080 mmol) de 1-(5-
fluorobenzo[b]tiofen-3-il)-3-[4-(4-nitro-2-trifluorometilfenil)-14-diazepan-1-
il]propan-1-ona se obtiene tras la eliminacioacuten del disolvente un aceite impuro
que se purifica por cromatografiacutea flash en diclorometanometanol (991)
Punto de fusioacuten 110-111ordmC
IR (cm-1) 3425 (m OH) 1500 y 1338 (mf NO2) 1280 (mf F-BZT)1257 y 1106 (f
CF3)
RMN-1H (CDCl3 400 MHz) δ (ppm) 208 (sa 4H CHOH-CH2+H6 DZP) 287-
293 (m 4H H2+H7 DZP) 298-299 (m 2H CHOH-CH2-CH2) 354 (sa 2H H5
DZP) 562 (sa 2H H3 DZP) 530 (t 1H CHOH JCH-OH = JCH-CH = 57 Hz) 712
(dd 1H H7 BZT J76= 88 Hz J7F= 24 Hz) 722 (d 1H H6acute FENIL J65acuteacute= 92 Hz)
750 (s 1H H2 FBZT) 751 (dd 1H H4 FBZT J4F= 98 Hz J46= 15 Hz) 780 (dd
1H H6 FBZT J67= 88 Hz J6F= 50 Hz) 828 (dd 1H H5acute FENIL J5acute6acute= 92 Hz
J5acute3acute= 27 Hz) 854 (s 1H H3acute FENIL)
Anaacutelisis elemental (CHN)
HPLC (RP-18 1 mLmin metanol-agua (8020)) 557 min ʎmax= 2308 nm
Calculado Hallado
C 5548 5515
H 462 464
N 844 826
FM C23H23N3O3F4S PM 4975 Apariencia Soacutelido amarillo Rendimiento 25
2d
Descripcioacuten de Compuestos
150
1-(5-fluorobenzo[b]tiofen-3-il)-3-[1-(4-nitro-2-
trifluorometilfenil)piperidin-4-il]amino propan-1-ol
Procedimiento experimental
Seguacuten el meacutetodo general E partiendo de 017 g (034 mmol) de 1-(5-
fluorobenzo[b]tiofen-3-il)-3-[1-(4-nitro-2-trifluorometilfenil)piperidin-4-
il]aminopropan-1-ona se obtiene tras la eliminacioacuten del disolvente un aceite
impuro que se purifica por cromatografiacutea flash en diclorometanometanol
(991)
Punto de fusioacuten 140-142ordmC
IR (cm-1) 3425 (m OH) 1498 y 1334 (mf NO2) 1283 (mf F-BTF)1283 y 1106 (f
CF3)
RMN-1H (CDCl3 400 MHz) δ (ppm) 156-171 (m 2H H3ax+H5ax PIPR) 195-
197 (m 2H CHOH-CH2) 211 (sa 2H H3ec+H5ec PIPR) 275 (sa 1H H4 PIPR)
295 (t 2H H2ax+H6ax PIPR J2ax2ec= J6ax6ec= 97 Hz) 313 (sa 2H CHOH-CH2-
CH2) 342 (d 2H H2ec+H6ec PIPR J2ec2ax= J6ec6ax= 90 Hz) 530 (d 1H CHOH JCH-
OH = 77 Hz) 712 (t 1H H6 FBZT J6F = J67 = 77 Hz) 729 (d 1H H6acute FENIL J6acute5acute=
86 Hz) 750 (dd 1H H4 FBZT J4F = 85 Hz J46 = 49 Hz) 752 (s 1H H2 FBZT)
779 (dd 1H H7 FBZT J76 = 82 Hz J7F = 31 Hz) 833 (dd 1H H5rsquo FENIL J5acute6acute =
85 Hz J5acute3acute = 18 Hz) 853 (sa 1H H3rsquo FENIL)
Anaacutelisis elemental (CHN)
HPLC (RP-18 1 mLmin metanol-agua (8020)) 443 min ʎmax= 2299 nm
Calculado Hallado
C 5548 5555
H 481 462
N 826 844
FM C23H23N3O3F4S PM 49751 Apariencia Soacutelido amarillo Rendimiento 37
2f
Descripcioacuten de Compuestos
151
Hidrocloruro de 1-(2-naftil)-3-[4-(4-nitro-2-
trifluorometilfenil)piperazin-1-il]propan-1-ol
Procedimiento experimental
Seguacuten el meacutetodo general E partiendo de 033 g (066 mmol) de 1-(2-naftil)-3-[4-
(4-nitro-2-trifluorometilfenil)piperazin-1-il]propan-1-ona tras la eliminacioacuten del
disolvente se obtiene un aceite que precipita en forma de hidrocloruro con eacuteter
saturado de HCl
Punto de fusioacuten 183-185ordmC
IR (cm-1) 3185 (d OH) 2924-2851 (f C-H alifaacuteticos) 1509 y 1346 (mf NO2) 1279
y 1119 (f CF3)
RMN-1H (DMSO-d6 400 MHz) δ (ppm) 214 (sa 2H CHOH-CH2) 317 (sa
2H CHOH-CH2-CH2) 329-335 (m 6H H3ax+ H5ax+ H2+H6 PIPZ) 360 (sa 2H
H3ec+ H5ec PIPZ) 483-485 (m 1H CHOH) 749-752 (m 3H H6rsquo FENIL + H6+H7
NFT) 764 (d 1H H3 NFT J34 = 91 Hz) 786 (sa 1H H1 NFT) 788-792 (m 3H
H4+H5+H8 NFT ) 841 (d 1H H3acute FENIL J3acute5acute = 21 Hz) 846 (dd 1H H5rsquo FENIL
J5rsquo6rsquo = 92 Hz J5rsquo3rsquo = 19 Hz)
Anaacutelisis elemental (CHN)
HPLC (RP-18 1 mLmin metanol-agua (8020)) 762 min ʎmax= 2236 nm
Calculado Hallado
C 5812 5770
H 484 520
N 847 801
FM C24H24N3F3O3HCl PM 5325 Apariencia Soacutelido amarillo Rendimiento 50
3a
Descripcioacuten de Compuestos
152
Hidrocloruro de 1-(2-naftil)-3-[4-(2-nitro-4-trifluorometilfenil)
piperazin-1-il] propan-1-ol
Procedimiento experimental
Seguacuten el meacutetodo general E partiendo de 036 g (083 mmol) de 1-(2-naftil)-3-[4-
(2-nitro-4-trifluorometilfenil)piperazin-1-il]propan-1-ona tras la eliminacioacuten del
disolvente se obtiene un aceite que precipita en forma de hidrocloruro con eacuteter
saturado de HCl
Punto de fusioacuten 165ndash166 ordmC
IR (cm-1) 3250 (m OH) 2927-2873 (d C-H alifaacuteticos) 1534 y 1327 (mf NO2)
1280 y 1123 (f CF3)
RMN-1H (DMSO-d6 400 MHz) δ (ppm) 219-222 (m 2H CHOH-CH2) 316
(sa 4H H3+H5 PIPZ) 348 (sa 4H H2+H6 PIPZ) 358 (d 2H CHOH-CH2-CH2)
484-487 (m 1H CHOH) 574 (sa 1H OH) 747-752 (m 2H H6acuteFENIL+H3
NFT) 754 (sa 1H H7 NFT) 756 (sa 1H H6 NFT) 788-795 (m 5H
H1+H4+H5+H8 NFT+H5acute FENIL) 825 (sa 1H H3acute FENIL) 1110 (sa 1H HCl)
Anaacutelisis elemental (CHN)
HPLC (RP-18 1 mLmin metanol-agua (8020)) 457 min ʎmax= 2220 nm
Calculado Hallado
C 5663 5682
H 469 458
N 821 813
FM C24H24N3F3O3HCl PM 4960 Apariencia Soacutelido camel Rendimiento 63
3b
Descripcioacuten de Compuestos
153
Hidrocloruro de 1-(2-naftil)-3-[3-(4-nitro-2-trifluorometilfenil)-
pirrolidin-3-ilamino]propan-1-ol
Procedimiento experimental
Seguacuten el meacutetodo general E partiendo de 025 g (0546 mmol) de 1-(2-naftil)-3-[3-
(4-nitro-2-trifluorometilfenil)pirrolidin-3-ilamino]propan-1-ona tras la
eliminacioacuten del disolvente se obtiene un aceite que se precipita en forma de
hidrocloruro con eacuteter saturado de HCl
Punto de fusioacuten 180-182ordmC
IR (cm-1) 3422 (m OH) 2951-2793 (d C-H alifaacuteticos) 1580 y 1327 (mf NO2)
1286 y 1122 (f CF3)
RMN-1H (DMSO-d6 400 MHz) δ (ppm) 207-214 (m 2H CHOH-CH2) 229-
231 (m 1H H4ax PIRR) 236-241 (m 1H H4ec PIRR) 311 (sa 2H CHOH-CH2-
CH2) 357-364 (m 1H H2ax PIRR) 375-379 (m 2H H5ax+ H2ec PIRR) 385-389
(m 1H H5ec PIRR) 397 (sa 1H H3 PIRR) 590 (sa 1H CHOH) 576 (s 1H
OH) 710 (d 1H H6rsquo FENIL J6rsquo5rsquo = 87 Hz) 747-755 (m 3H H3 + H6+ H7 NFT)
786 (sa 1H H1 NFT) 790-792 (m 3H H4+ H5+ H8 NFT) 824-890 (d 1H H5rsquo
FENIL J5rsquo6rsquo = 89 Hz) 840 (sa 1H H3rsquo FENIL) 949 (sa 1H NH)
Anaacutelisis elemental (CHN)
HPLC (RP-18 1 mLmin metanol-agua (8020)) 115 min ʎmax= 2238 nm
Calculado Hallado
C 5631 5650
H 492 523
N 821 821
FM C24H24N3F3O3HCl PM 4961 Apariencia Soacutelido anaranjado
Rendimiento 38
3e
Descripcioacuten de Compuestos
154
3-[4-(4-fluorofenil)-36-dihidropiridin-1(2H)-il]-1-(naftalen-2-
il)propan-1-ol
Procedimiento experimental
Seguir el meacutetodo general E partiendo de 030 g (084 mmol) de 3-[4-(4-
fluorofenil)-36-dihidropiridin-1(2H)-il)]-1-(naftalen-2-il)propan-1-ona se
obtiene tras la eliminacioacuten del disolvente un aceite impuro que puede
purificarse por cromatografiacutea flash en diclorometano-metanol (991)
Punto de fusioacuten 127-129ordmC
IR (cm-1) 3510 (d OH) 2833 (m C-H alifaacuteticos)
RMN-1H (CDCl3 400 MHz) δ (ppm) 199-212 (m 2H CHOH-CH2) 264 (s
2H H6 PIRD) 272-296 (m 4H H2+H5 PIRD) 331 (d 2H CHOH-CH2-CH2 JCH-
CH= 167 Hz) 517 (sa 1H CH-OH) 602 (s 1H H3 PIRD) 704 (t 2H H3acute+ H5acute
FENIL J3acute2acute= J5acute6acute= 87 Hz) 737 (dd 2H H2acute+ H6acute FENIL J2acute3acute= J6acute5acute= 87 Hz
J2acuteF= J6acuteF= 54 Hz) 745-750 (m 2H H6 + H7 NFT) 751 (dd 1H H8 NFT J87= 74
Hz J86=16 Hz) 785 (d 2H H3+ H4 NFT J34acute= J43acute=83 Hz) 787 (dd 1H H5
NFT J56= 78 Hz J57=23 Hz) 791 (s 1H H1 NFT)
Anaacutelisis elemental (CHN)
HPLC (RP-18 1 mLmin metanol-agua (8020)) tr 468 min ʎmax 2196 nm
Calculado Hallado
C 7783 7787
H 662 682
N 378 330
FM C24H24NFO PM 3615 Apariencia Soacutelido blanco Rendimiento 23
3g
Descripcioacuten de Compuestos
155
1-(2-naftil)-2-[4-(2-nitro-4-trifluorometilfenil)piperazin-1-il]etan-1-
ol
Procedimiento experimental
Seguacuten el meacutetodo general E partiendo de 038 g (086 mmol) de 1-(2-naftil)-2-[4-
(2-nitro-4-trifluorometilfenil)piperazin-1-il]propan-1-ona se obtiene tras la
eliminacioacuten del disolvente un aceite impuro que se puede purificar
precipitando el compuesto con hexano
Punto de fusioacuten 134ndash135 ordmC
IR (cm-1) 3408 (d OH) 2968-2814 (d C-H alifaacuteticos) 1533 y 1329 (mf NO2)
1230 y 1112 (f CF3)
RMN-1H (DMSO-d6 400 MHz) δ (ppm) 275-281 (m 4H H3+H5 PIPZ) 303
(sa 2H CHOH-CH2) 326-331 (m 2H H2+H6 PIPZ) 504 (dd 1H CHOH) 721
(d 1H H6acute FENIL J6acute5acute = 87 Hz) 749-752 (m 3H H3+H6+H7 NFT) 771 (dd
1H H5acute FENIL J5acute6acute = 87 Hz J5acute3acute = 19 Hz) 786 (sa 1H H1 NFT) 787 (dd 1H
H8 NFT J87 = 79 Hz J86 = 15 Hz) 788 (d 1H H4 NFT J43 = 55 Hz) 790 (sa
1H H5 NFT) 811 (d 1H H3acute FENIL J3acute5acute = 19 Hz)
Anaacutelisis elemental (CHN)
HPLC (RP-18 1 mLmin metanol-agua (8020)) 566 min ʎmax= 2228 nm
Calculado Hallado
C 6202 6226
H 494 512
N 944 914
FM C23H22N3F3O3 PM 4454 Apariencia Soacutelido amarillo Rendimiento 78
4b
Descripcioacuten de Compuestos
156
1-(4-fluoronaftil)-3-[4-(4-nitro-2-trifluorometilfenil)piperazin-1-
il]propan-1-ol
Procedimiento experimental
Seguacuten el meacutetodo general E partiendo de 053 g (107 mmol) de 1-(4-
fluoronaftil)-3-[4-(4-nitro-2-trifluorometilfenil)piperazin-1-il]propan-1-ona se
obtiene tras la eliminacioacuten del disolvente un aceite impuro que se purifica por
cromatografiacutea flash usando como fase moacutevil diclorometanometanol (991)
Punto de fusioacuten 183-184ordmC
IR (cm-1) 3447 (d OH) 2931-2836 (d C-H alifaacuteticos) 1513 y 1338 (f NO2) 1283
y 1119 (f CF3)
RMN-1H (CDCl3 400 MHz) δ (ppm) 206-214 (m 2H CHOH-CH2) 274-280
(m 3H H5 PIPZ+ CHOH-CH2-CH2) 288-294 (m 3H H3 PIPZ+ CHOH-CH2-
CH2) 327 (t 4H H2+H6 PIPZ J23= J65= 467 Hz) 571 (dd 1H CHOH JCH-CH =
81 Hz JCH-CH = 27 Hz) 718 (dd 1H H3 FNFT J3F = 102 Hz J32= 80 Hz) 735
(d 1H H6acute FENIL J6acute5acute = 89 Hz) 767-771 (m 2H H6+H7 FNFT) 769 (dd 1H
H2 FNFT J23 = 79 Hz J2F= 56 Hz) 804 (d 1H H8 FNFT J87 = 80 Hz) 817 (dd
1H H5 FNFT J56 = 76 Hz J5F = 21 Hz) 838 (dd 1H H5acute FENIL J5acute6acute = 89 Hz
J5acute3acute = 27 Hz) 855 (d 1H H3acute FENIL J3acute5acute = 27 Hz)
Anaacutelisis elemental (CHN)
HPLC (RP-18 1 mLmin metanol-agua (8020)) 703 min ʎmax= 2217 nm
Calculado Hallado
C 6038 6015
H 482 486
N 880 878
FM C24H23N3F4O3 PM 4775 Apariencia Cristales amarillos Rendimiento 51
5a
Descripcioacuten de Compuestos
157
1-(4-fluoronaftil)-3-[4-(2-nitro-4-trifluorometilfenil)piperazin-1-
il]propan-1-ol
Procedimiento experimental
Seguacuten el meacutetodo general E partiendo de 049 g (102 mmol) de 1-(4-
fluoronaftil)-3-[4-(2-nitro-4-trifluorometilfenil)piperazin-1-il]propan-1-ona se
obtiene tras la eliminacioacuten del disolvente un aceite impuro que se purifica al
lavarlo con hexano
Punto de fusioacuten 147ndash148 ordmC
IR (cm-1) 3430 (m OH) 2957-2835 (d C-H alifaacuteticos) 1533 y 1330 (mf NO2)
1278 y 1125 (f CF3)
RMN-1H (DMSO-d6 400 MHz) δ (ppm) 208-218 (m 2H CHOH-CH2) 283
(sa 3H H5 PIPZ+ CHOH-CH2-CH2) 295 (sa 3H H3 PIPZ+ CHOH-CH2-CH2)
332 (sa 4H H2+H6 PIPZ) 571 (dd 1H CHOH) 718 (dd 1H H3 FNFT J3F =
102 Hz J32 = 81 Hz) 723 (d 1H H6acute FENIL J6acute5acute = 87 Hz) 754-762 (m 2H
H6+H7 FNFT) 768 (dd 1H H2 FNFT J23 = 80 Hz J2F = 56 Hz) 774 (dd 1H
H5acute FENIL J5acute6acute = 87 Hz J5acute3acute = 19 Hz) 805 (dd 1H H5 FNFT J56 = 82 Hz J5F =
17 Hz) 811 (d 1H H3acute FENIL J3acute5acute = 19 Hz) 817 (dd 1H H8 FNFT J87 = 86
Hz J86 = 29 Hz)
Anaacutelisis elemental (CHN)
HPLC (RP-18 1 mLmin metanol-agua (8020)) 556 min ʎmax= 2222 nm
Calculado Hallado
C 6038 6012
H 482 505
N 881 862
FM C24H23N3F4O3 PM 4775 Apariencia Soacutelido amarillo Rendimiento 90
5b
Descripcioacuten de Compuestos
158
Hidrocloruro de 1-(4-fluoronaft-1-il)-3-[4-(4-trifluorometilfenil)
piperidin-1-il] propan-1-ol
Procedimiento experimental
Seguacuten el meacutetodo general E partiendo de 010 g de 1-(4-fluoronaftalen-1-il)-3-[1-
(4-trifluorometilfenilpiperidin-4-il)amino]propan-1-ona se obtiene tras la
eliminacioacuten del disolvente un aceite impuro que se purifica por cromatografiacutea
flash en diclorometanometanol (991) y se precipita como hidrocloruro con
eacuteter saturado de HCl
Punto de fusioacuten 174-175ordmC
IR (cm-1) 3436 (m OH) 2983 (d C-H alifaacuteticos) 2396 (d HCl) 1333 (f N-C)
1118 (mf CF3)
RMN-1H (DMSO-d6 400 MHz) δ (ppm) 221 (d 2H CHOH-CH2) 320-360
(m 6H CHOH-CH2-CH2+ H3+H5 PIPZ) 355 (sa 2H H2ax+H6ax PIPZ) 397 (sa
2H H2ec+H6ec PIPZ) 541 (d 1H CH-OH JCH-CH=75 Hz) 590 (sa 1H OH) 713
(d 2H H6acute+H2acute FENIL J6acute5acute= J2acute3acuteacute= 81 Hz) 736 (dd 1H H3 FNFT J32= 82 Hz
J3F= 97 Hz) 756 (d 2H H6+H7 FNFT J67= J76acute= 84 Hz) 767 (sa 3H H2
FNFT+H3acute+H5acute FENIL) 810 (d 1H H5 FNFT J56 = 66 Hz) 829 (d 1H H8
FNFT J87= 88 Hz) 1112 (sa 1H HCl)
Anaacutelisis elemental (CHN)
HPLC (RP-18 1 mLmin metanol-agua (8020)) 850 min ʎmax= 2266 nm
Calculado Hallado
C 6147 6135
H 539 482
N 598 596
FM C24H24N2F4OHCl PM 4690 Apariencia Soacutelido blanco Rendimiento 45
5c
Descripcioacuten de Compuestos
159
1-(4-fluoronaft-1-il)-3-[1-(4-nitro-2-trifluorometilfenilpiperidin-4-
il)amino]propan-1-ol
Procedimiento experimental
Seguacuten el meacutetodo general E partiendo de 04106 g (084 mmol) de 1-(4-
fluoronaft-1-il)-3-[1-(4-nitro-2-trifluorometilfenilpiperidin-4-il)amino] propan-1-
ona se obtiene tras la eliminacioacuten del disolvente un aceite impuro que se
purifica por cromatografiacutea flash en diclorometanometanol (991)
Punto de fusioacuten 93-95ordmC
IR (cm-1) 3352 (m OH) 1524 y 1318 (mf NO2) 1280 y 1171 (f CF3)
RMN-1H (CDCl3 400 MHz) δ (ppm) 168-183 (m 2H H3ax+ H5ax PIPR) 186-
201 (m 2H CHOH-CH2) 215-223 (m 2H H3ec+H5ec PIPR) 212 (d 1H CH-
OH JCH-CH= 127 Hz) 275-284 (m 1H H4 PIPR) 298 (t 2H H2ax+ H6ax PIPR
J2ax2ec = J6ax6ec = 115 Hz) 300-303 (m 1H CHOH-CH2-CH2) 308-315 (m 1H
CHOH-CH2-CH2) 342 (d 2H H2ec+H6ec PIPR) 571 (dd 1H CHOH JCHCH =
82 Hz JCH-CH2 = 23 Hz) 717 (dd 1H H3 FNFT J3F = 102 Hz J32 = 81 Hz)
727-730 (m 1H H6acute FENIL) 753-761 (m 2H H6+H7 FNFT) 767-772 (m 1H
H2 FNFT) 804 (d 1H H8 FNFT J87 = 78 Hz) 816 (dd 1H H5 FNFT J56 =72 Hz
J5F = 33 Hz ) 833 (dd 1H H5acute FENIL J5acute6acute = 90 Hz J5acute3acute = 27 Hz ) 853 (d 1H
H3acute FENIL J3acute5acute = 27 Hz)
Anaacutelisis elemental (CHN)
HPLC (RP-18 1 mLmin metanol-agua (8020)) tr 464 min ʎmax 2230 nm
Calculado Hallado
C 6111 6077
H 543 543
N 855 830
FM C25H25N3O3F4 PM 4910 Apariencia Soacutelido amarillo Rendimiento 90
5f
Descripcioacuten de Compuestos
160
1-(4-fluoronaftalen-1-il)-3-[4-(4-fluorofenil)-36-dihidropiridin-
1(2H)-il]propan-1-ol
Procedimiento experimental
Seguacuten el meacutetodo general E partiendo de 043 g (114 mmol) de 1-(4-
fluoronaftalen-1-il)-3-[4-(4-fluorofenil)-36-dihidropiridin-1(2H)-il]propan-1-
ona se obtiene tras la eliminacioacuten del disolvente un soacutelido blanco que precipita
con hexanoeacuteter
Punto de fusioacuten 162-163ordmC
IR (cm-1) 2828 (d C-H alifaacuteticos) 1509 (f F-BZN) 1227 (mf F-NFT)
RMN-1H (DMSO-d6 400 MHz) δ (ppm) 214-220 (m 2H CHOH-CH2) 273
(sa 2H H6 PIRD) 284-312 (m 4H CHOH-CH2-CH2+H5 PIRD) 341 (d 1H
H2ax PIRD J2ax 2ec=164 Hz) 347 (d 1H H2ec PIRD J2ec2ax=161 Hz) 574 (sa 1H
CHOH) 600-605 (m 1H H3 PIRD) 700-708 (m 2H H2acute+H6acute FENIL) 718 (dd
1H H3 FNFT J3F= 102 Hz J32 = 81 Hz) 735-740 (m 2H H6+H7 FNFT) 754-
761 (m 2H H5acute+H3acute FENIL) 770 (dd 1H H2 FNFT J23= 80 Hz J2F = 56 Hz)
807 (d 1H H5 FNFT J56 = 82 Hz) 82 (dd 1H H8 FNFT J87= 70 Hz J86 = 25
Hz)
Anaacutelisis elemental (CHN)
Calculado Hallado
C 7595 7525
H 606 645
N 369 350
FM C24H23NF2O PM 3792 Apariencia Soacutelido blanco Rendimiento 82
5g
Descripcioacuten de Compuestos
161
Hidrocloruro de 1-(4-fluorofenil)-3-[4-(4-nitro-2-
trifluorometilfenilpiperazin-1-il]propan-1-ol
Procedimiento experimental
Seguacuten el meacutetodo general E partiendo de 036 g (107 mmol) de 1-(4-fluorofenil)-
3-[4-(4-nitro-2-trifluorometilfenil)piperazin-1-il]propan-1-ona se obtiene tras la
eliminacioacuten del disolvente un aceite impuro que se precipita con hexanoeacuteter
El soacutelido que se obtiene se lava con eacuteter saturado de HCl
Punto de fusioacuten 163-165ordmC
IR (cm-1) 3348 (m OH) 2928-2848 (d C-H alifaacuteticos) 1519 y 1352 (f NO2) 1284
y 1120 (f CF3)
RMN-1H (DMSO-d6 400 MHz) δ (ppm) 209 (sa 2H CHOH-CH2) 315-320
(m 4H H3+H5 PIPZ) 335-344 (m 4H H2+H6 PIPZ) 360 (sa 2H CHOH-CH2-
CH2) 469 (s 1H CHOH) 565 (s 1H OH) 718 (t 2H H3+H5 FBZN J32 = J56=
81 Hz) 742 (dd 2H H2+H6 FBZN J23 = J65= 80 Hz J2Facute= J6F= 66 Hz) 764 (d
1H H6acute FENIL J6acute5acute = 90 Hz) 842 (s 1H H3acute FENIL) 847 (d 1H H5acute FENIL
J5acute6acute = 88 Hz) 1120 (sa 1H HCl)
Anaacutelisis elemental (CHN)
HPLC (RP-18 1 mLmin metanol-agua (8020)) tr 206 min ʎmax 2011 nm
Calculado Hallado
C 4984 4950
H 477 476
N 872 863
FM C20H21N3F4O3HCl PM 4659 Apariencia Soacutelido amarillo Rendimiento 20
6a
Descripcioacuten de Compuestos
162
Hidrocloruro de 1-(4-fluorofenil)-3-[1-(4-nitro-2-
trifluorometilfenil)piperidin-4-il)amino]propan-1-ol
Procedimiento experimental
Seguacuten el meacutetodo general E partiendo de 010 g (021 mmol) de 1-(4-fluorofenil)-
3-[1-(4-nitro-2-trifluorometilfenilpiperidin-4-il)amino]propan-1-ona se obtiene
en la eliminacioacuten del disolvente un aceite impuro que se purifica como
hidrocloruro lavando con eacuteter saturado de HCl
Punto de fusioacuten 185-187ordmC
IR (cm-1) 3425 1498 y 1334 (mf NO2) 1283 (mf F BZN)1283 y 1106 (f CF3)
RMN-1H (DMSO-d6 400 MHz) δ (ppm) 138 (sa 2H H3ax+ H5ax PIPR) 170
(sa 2H H3ec+H5ec PIPD) 190 (d 2H CHOH-CH2 JCH-CH= 110 Hz) 258 (sa 1H
H4 PIPR) 263-264 (m 2H H2ax+ H6ax PIPR) 295 (t 2H H2ec+H6ec PIPR J2ec2ax =
J6ec6ax = 121 Hz) 320-330 (m 2H CHOH-CH2-CH2) 469 (t 1H CHOH JCHOH-
CHCH = 90 Hz) 713 (t 2H H3+H5 FBZN J32 = J56= 81 Hz) 736 (sa 2H H2+H6
FBZN) 750 (d 1H H6acute FENIL J6acute5acute = 80 Hz) 837 (sa 2H H3acute+H5acute FENIL)
Anaacutelisis elemental (CHN)
HPLC (RP-18 1 mLmin metanol-agua (8020)) tr 1977 min ʎmax 2011 nm
Calculado Hallado
C 5251 5213
H 503 491
N 880 849
FM C21H23N3F4O3HCl PM 4799 Apariencia Soacutelido amarillo Rendimiento 11
6f
Descripcioacuten de Compuestos
163
1-(4-fluorofenil)-3-[4-(4-fluorofenil)-36-dihidropiridin-1(2H)-
il]propan-1-ol
Procedimiento experimental
Seguir el meacutetodo general E partiendo de 090 g (027 mmol) de 1-(4-fluorofenil)-
3-(4-(4-fluorofenil)-56-dihidropiridin-1(2H)-il)propan-1-ona y se obtiene tras la
eliminacioacuten del disolvente un aceite impuro que se purifica por cromatografiacutea
flash en diclorometanometanol (991) El soacutelido obtenido se recristaliza de
hexano para su total purificacioacuten
Punto de fusioacuten 199-201ordmC
RMN-1H (DMSO-d6 400 MHz) δ (ppm) 176-180 (m 2H CHOH-CH2) 245
(sa 4H CHOH-CH2-CH2+H5 PIRD) 257-262 (m 2H H6 PIRD) 306 (sa 2H
H2 PIRD) 466 (t 1H CHOH JCH-OH=63 Hz) 549 (sa 1H OH) 612 (sa 1H H3
PIRD) 714 (dd 4H H3acute+H5acute FENIL+ H3+H5 FBZN J3acuteF= J5acuteF= J3F= J5F = 126 Hz
J3acute2acute= J5acute6acute= J32= J56 = 80 Hz) 737 (dd 2H H2+H6 FBZN J23= J65= 79 Hz J2F=
J6F= 60 Hz) 746 (dd 2H H2acute+H6acute FENIL J2acute3acute= J6acute5acute= 77 Hz J2acuteF= J6acuteF= 55 Hz)
Anaacutelisis elemental (CHN)
Calculado Hallado
C 7242 7196
H 634 633
N 422 403
FM C20H21NF2O PM 3314 Apariencia Soacutelido blanco Rendimiento 2
6g
Descripcioacuten de Compuestos
164
3-[4-(4-fluorofenil)-36-dihidropiridin-1(2H)-il]-1-(4-
trifluorometilfenil)propan-1-ol
Procedimiento experimental
Seguacuten el meacutetodo general E partiendo de 013 g (034 mmol) de 1-(4-
fluoronaftalen-1-il)-3-[1-(4-nitro-2-trifluorometilfenilpiperidin-4-
il)amino]propan-1-ona se obtiene tras la eliminacioacuten del disolvente se obtiene
un soacutelido blanco que se lava con hexano eacuteter y se recristaliza de hexano
Punto de fusioacuten 116-117ordmC
IR (cm-1) 2912- 2761 (C-H alifaacuteticos) 1511 (f F) 1328 y 1127 (f CF3)
RMN-1H (DMSO-d6 400 MHz) δ (ppm) 181 (dd 2H CHOH-CH2 JCH-CH=
137 Hz JCH-CHOH= 73 HZ) 245-250 (m 4H CHOH-CH2-CH2+H5 PIRD) 262 (t
2H H6 PIRD JCH-CH= JCH-CH=55 Hz) 308 (s 2H H2 PIRD) 475-480 (m 1H
CHOH) 570 (sa 1H OH) 612 (s 1H H3 PIRD) 715 (t 2H H5acute+H3acute FENIL
J5acuteF=J3acuteF= 88 Hz J5acute6acute= J3acute2acute =88 Hz) 747 (dd 2H H6acute+H2acute FENIL J6acute5acute=J2acute3acute= 84
Hz J6acuteF= J2acuteF =56 Hz) 757 (d 2H H2+H6 TFBZN J23acute=J65= 79 Hz) 768 (d 2H
H3+H5 TFBZN J32acute=J56= 81 Hz)
Anaacutelisis elemental (CHN)
HPLC (RP-18 1 mLmin metanol-agua (8020)) tr 1027 min ʎmax 2418 nm
Calculado Hallado
C 6649 6601
H 554 567
N 370 381
FM C21H21NF4O
PM 379 Apariencia Agujas blancas Rendimiento 40
7g
Descripcioacuten de Compuestos
165
X4 Siacutentesis de Oximas (Serie 8)
1-(naftalen-2-il)-3-[4-(2-nitro-4-trifluorometilfenil)piperazin-1-
il]propan-1-oxima
Procedimiento experimental
Seguacuten el meacutetodo general F partiendo de 023 g (050 mmol) de 1-(2-naftil)-3-[4-
(2-nitro-4-trifluorometilfenil)piperazin-1-il]propan-1-ona se obtiene tras la
eliminacioacuten del disolvente un aceite impuro que se purifica por columna
cromatograacutefica con diclorometanometanol (973)
Punto de fusioacuten 185-187 ordmC
IR (cm-1) 1560 y 1328 (mf NO2) 1283 y 1120 (f CF3)
RMN-1H (DMSO-d6 400 MHz) δ (ppm) 254-264 (m 6H CNOH-CH2-
CH2+H3+H5 PIPZ) 303-309 (m 2H CNOH-CH2) 311-317 (m 4H H2+H6
PIPZ) 743 (d 1H H6acuteFENIL J6acute5acute= 88 Hz) 751-756 (m 2H H6+H7 NFT) 784
(dd 1H H5acute FENIL J5acute6acuteacute= 88 Hz J5acute3acuteacute= 17 Hz) 788-793 (m 3H H4+H5+H8
NFT) 798-802 (m 1H H3 NFT) 814 (sa 2H H1 NFT+H3acute FENIL) 1140 (sa
1H OH)
Anaacutelisis elemental (CHN)
HPLC (RP-18 1 mLmin metanol-agua (8020)) tr 464 min ʎmax 2391 nm
Calculado Hallado
C 6102 6114
H 487 521
N 1186 1163
FM C24H23N4F3O3 PM 4720 Apariencia Soacutelido camel Rendimiento 54
81
Descripcioacuten de Compuestos
166
1-(2-naftil)-3-[3-(4-nitro-2-trifluorometilfenil)pirrolidin-3-
ilamino]propan-1-oxima
Procedimiento experimental
Seguir el meacutetodo general F partiendo de 0350 g (0769 mmol) de 1-(2-naftil)-3-
[3-(4-nitro-2-trifluorometilfenil)pirrolidin-3-ilamino]propan-1-ona se obtiene
tras la eliminacioacuten del disolvente un soacutelido anaranjado que se lava con
diclorometano y eacuteter etiacutelico obtenieacutendose el compuesto puro
Punto de fusioacuten 129 - 130ordfC
IR (cm-1) 3441 (d OH) 2951-2834 (d C-H alifaacuteticos) 1503 y 1323 (mf NO2)
1285 y 1112 (f CF3)
RMN-1H (DMSO-d6 400 MHz) δ (ppm) 178-185 (m 1H H4ax PIRR) 202-209
(m 1H H4ec PIRR) 221 (sa 1H -NH-) 270-282 (m 2H CNOH-CH2-CH2) 300
(t 2H CNOH-CH2) 325 (dd 1H H3 PIRR) 343-351 (m 2H H2ax+ H2ec PIRR)
358-361 (m 2H H5 PIRR) 697 (d 1H H6acute FENIL J6acute5acute = 96 Hz) 751 (d 1H
H5 NFT J56 = 61 Hz) 752 (d 1H H8 NFT J87 = 61 Hz) 786 (sa 2H H3+H4
NFT) 788-794 (m 2H H6+H7 NFT) 813 (sa 1H H1 NFT) 815 (dd 1H H5acute
FENIL J5acute6acute = 94 Hz J5acute3acute = 27 Hz) 835 (d 1H H3acute FENIL J3acute5acute = 27 Hz)
Anaacutelisis elemental (CHN)
HPLC (RP-18 1 mLmin metanol-agua (8020)) 365 min ʎmax= 2360 nm
Calculado Hallado
C 5987 5954
H 502 474
N 1164 1157
FM C24H23N4O3F3 PM 472 Apariencia Soacutelido amarillo Rendimiento 45
82
Descripcioacuten de Compuestos
167
X5 Purificacioacuten de compuestos por cromatografiacutea flash
La cromatografiacutea flash ha sido utilizada como meacutetodo de purificacioacuten de
muchos de los compuestos de este trabajo Las condiciones elegidas para la
purificacioacuten han sido
- Fase Estacionaria Columnas de Siacutelica gel Rf RediSepreg de tamantildeo de
partiacutecula entre 35 y 70 micras y tamantildeo de poro 60 Aring
- Fase Moacutevil Diclorometanometanol de flujo isocraacutetico linear (Figuras 51 y
52) con un volumen de equilibrado de 20 mL
- Longitud de onda de deteccioacuten 254 nm en todas las muestras y 365 nm en
los compuestos que contienen el grupo naftaleno
- Tipo de muestra Liacutequidas cuando no
son muy complejas y soacutelidas cuando se
trata de purificacioacuten de mezclas
complejas e hidrocloruros
Figura 51 Informe graacutefico de la purificacioacuten compuesto 023
Figura 52 Informe graacutefico de la purificacioacuten compuesto 5f
De los 47 compuestos sintetizados 23 han sido purificados mediante
cromatografiacutea flash Este meacutetodo ha supuesto una mejora y simplificacioacuten del
proceso de siacutentesis asiacute como un ahorro de costes por la reduccioacuten de tiempos
solventes y residuos La purificacioacuten del resto ha sido realizada por
precipitacioacuten como hidrocloruros lavado del compuesto con hexanoeacuteter o
recristalizacioacuten con hexano
Tabla 3
Condiciones de trabajo empleadas en la figuras 51 y 52
Tiempo (min)
Metanol (B)
Teacutecnica de flujo
Compuesto 023
10 00 Isocraacutetico
1 25 Linear
15 25 Isocratico
1 5 Linear
30 5 isocraacutetico
Compuesto 5f
5 0 Isocraacutetico
1 25 Linear
15 25 Isocratico
1 5 Linear
30 5 isocraacutetico
Descripcioacuten de Compuestos
168
X6 Elucidacioacuten estructural de compuestos por RMN
Todos los compuestos sintetizados han sido identificados a traveacutes de teacutecnicas
de CCF IR y RMN-1H Los compuestos finales han sido caracterizados ademaacutes
mediante anaacutelisis elemental de CHN De este modo se ha podido determinar
inequiacutevocamente las estructuras orgaacutenicas de las moleacuteculas obtenidas y formar
un ldquoficha de identidadrdquo de cada compuesto
X61 Elucidacioacuten estructural para los derivados de piperazina
En el caso de que las teacutecnicas anteriores fueran insuficientes para la
caracterizacioacuten exacta de la moleacutecula se han empleado teacutecnicas
complementarias de RMN como RMN-13C 2D 1H-1H COSY y 2D HMQC Este
ha sido el caso del compuesto 5a (figura 53)
Figura 53 Estructura molecular del compuesto 5a ejemplo escogido para un anaacutelisis maacutes exhaustivo mediante experimentos de RMN
La espectroscopia de RMN revela el nuacutemero de hidroacutegenos o carbonos de la
moleacutecula y su posible posicioacuten A traveacutes de los distintos experimentos esta
teacutecnica permite identificar y asignar los distintos protones y carbonos presentes
en la moleacutecula mediante el anaacutelisis de los desplazamientos y multiplicidades
que muestra cada uno de ellos
Figura 54 RMN-1H del compuesto 5a
Descripcioacuten de Compuestos
169
Zona alifaacutetica
En la zona de hidroacutegenos alifaacuteticos se observan cuatro sentildeales
Figura 55 Regioacuten alifaacutetica de la RMN-1H
Los hidroacutegenos alifaacuteticos aparecen a desplazamientos bajos porque estaacuten
muy apantallados
El C1 es un carbono terciario y por tanto tiene un hidroacutegeno muy
desapantallado por el efecto del grupo OH dando una sentildeal a altos ppm como
queda sentildealada en naranja en la figura 55 Esta asignacioacuten facilita el poder
asociar los picos sentildealados en morado (Figura 55) con el metileno vecino C2 ya
que aparece a bajos ppm debido a su aumentado caraacutecter alifaacutetico El multiplete
obtenido integrado por dos hidroacutegenos aparece a 210 ppm Mediante el
espectro COSY (Figura 56) se puede comprobar siguiendo el trazado naranja
coacutemo siendo la sentildeal de CHOH la de 571 ppm se acopla con ella uacutenicamente la
de su vecino CHOH-CH2
Los hidroacutegenos pertenecientes al ciclo de piperazina se diferencian entre siacute por
el desplazamiento de las sentildeales seguacuten esteacuten maacutes o menos cercanos al grupo
fenilo Asiacute los protones H3p y H5p son los que aparecen a menores ppm A 277
ppm y a 291 ppm aparecen dos multipletes (sentildealados con azul en la figura 55)
que integran a tres hidroacutegenos cada uno lo cual resulta extrantildeo ya que en la
moleacutecula no hay ninguacuten CH3 Esto se debe a la diastereotopiacutea del carbono
hidroxiacutelico que hace que los 4 hidroacutegenos salgan divididos en dos sentildeales que
integran a dos hidroacutegenos cada una y a ambas se les suma uno de los
hidroacutegenos del C3 alifaacutetico Esto hace que aparezcan dos sentildeales que integran a
tres hidroacutegenos correspondientes a 2H3p 2H5p y los dos hidroacutegenos alifaacuteticos
Descripcioacuten de Compuestos
170
de C3 Si se siguen ahora las
liacuteneas moradas de la figura
55 se corrobora la
informacioacuten de que los
protones del C3 salen unidos
a las sentildeales de los protones
de H3 y H5 porque hay un
acoplamiento entre el C2 y
esas sentildeales
Figura 56 Espectro COSY Acoplamientos entre metilenos
Por uacuteltimo a 327 ppm se encuentra la sentildeal marcada con verde (figura 55)
correspondiente a 2H2 y 2H6 que integra por cuatro hidroacutegenos y aparece como
triplete debido a los acoplamientos con 2H3 y 2H5
Zona aromaacutetica
En esta moleacutecula se encuentran 9 hidroacutegenos aromaacuteticos no equivalentes lo
que dificulta la asignacioacuten de las sentildeales Como en el apartado anterior se
recurriraacute para estudiar los acoplamientos protoacuten-protoacuten y protoacuten-carbono a la
resonancia magneacutetica nuclear en dos dimensiones con el fin de asignar
inequiacutevocamente cada sentildeal
Figura 57 Resonancia magneacutetica nuclear de protoacuten de la zona aromaacutetica de la moleacutecula 5a
La dificultad de la asignacioacuten en esta moleacutecula se ve aumentada por la
presencia de un aacutetomo de fluacuteor en la parte del naftaleno En el espectro de
Descripcioacuten de Compuestos
171
RMN-1H el aacutetomo de fluacuteor no produce sentildeal pero siacute acoplamientos con los
hidroacutegenos vecinos obtenieacutendose constantes de acoplamiento (J) bastantes altas
y sentildeales desdobladas no esperadas en protones de su entorno
En la figura 57 lo primero que se observa son los altos desplazamientos de los
hidroacutegenos aromaacuteticos debido al menor apantallamiento de estos por su
naturaleza aromaacutetica
Teoacutericamente el espectro deberiacutea tener un singlete claro perteneciente a H3acute
pero no se encuentra ninguno en la figura 57 Asiacute que se puede pensar en un
desdoblamiento de la sentildeal por acoplamiento deacutebil a larga distancia con el H5acute
lo que mostrariacutea un doblete con acoplamiento muy bajo
En el espectro se encuentran tres dobletes sencillos Con las constantes de
acoplamiento a 850 ppm se ve este doblete que integra por uno y que tiene
una J = 27 Hz El otro doblete se encuentra a 804 ppm con una J = 80 Hz y el
maacutes bajo estaacute en 735 ppm con una J = 89 Hz Por el razonamiento inicial la
sentildeal a 850 ppm es la que deberiacutea asociarse con un acoplamiento a larga
distancia y por tanto con H3acute Esta informacioacuten puede ser contrastada con el
COSY
En el espectro bidimensional COSY se ha marcado en rojo el uacutenico
acoplamiento de H3acute que solo
pueda asociarse con la sentildeal
de H5acute Por tanto el doble
doblete a 838 ppm sentildealado
en la figura 56 de azul se
corresponde con H5acute
(informacioacuten verificada por
su constante de acoplamiento
menor J = 27Hz igual a la de
H3acute)
Figura 58 Espectro COSY de la zona aromaacutetica de la moleacutecula
Si ahora se sigue la liacutenea azul de la figura 58 donde se sentildealan los
acoplamientos de H5acute se puede ver un acoplamiento mayor con su uacutenico
hidroacutegeno vecino H6acute Asiacute tambieacuten queda asignada la sentildeal de este uacuteltimo que
se puede comprobar por comparacioacuten de las constantes de acoplamiento
(J5acute6acute=89 Hz y J6acute5acute=90 Hz)
Descripcioacuten de Compuestos
172
Para asignar los hidroacutegenos del naftaleno se debe tener en cuenta la presencia
del aacutetomo de fluacuteor De esta forma para los hidroacutegenos H2 H3 y H5 se puede
establecer teoacutericamente
que no se veraacuten como
dobletes sino dobles
dobletes en el espectro
de protoacuten En el COSY
(Figura 58) para una
primera aproximacioacuten
se seleccionan los tres
dobles dobletes de
protoacuten que solo tengan
un acoplamiento
Figura 59 Espectro COSY Zona aromaacutetica de la moleacutecula
Seguacuten la posicioacuten de H2 y H3 con por efecto del fluacuteor de la moleacutecula ademaacutes de
ser dobles dobletes el espectro COSY (Figura 58) debe mostrar dos sentildeales que
se acoplan entre ellas Por lo que se deduce que estos protones seraacuten los
sentildealados en azul y morado (figura 57) Si se recurre ahora a los valores de
acoplamiento se justifica la asignacioacuten ya que la sentildeal morada a 770 ppm
tiene una J = 79 Hz que se corresponde con la J = 81 Hz de la sentildeal azul a 720
ppm Ademaacutes estas sentildeales por la proximidad del fluacuteor tienen un segundo
valor de acoplamiento que en el caso de H3 seraacute muy alto y en H2 menor De
este modo se concluye que la sentildeal a 770 ppm corresponde a H2 y la sentildeal a
720 ppm a H3
La continuacioacuten de la asignacioacuten se centra en H6 y H7 Estos dos protones
teoacutericamente produciraacuten sentildeales como miacutenimo con multiplicidad de triplete ya
que son los uacutenicos que presentan tres protones diferentes en su entorno Como
no hay ninguacuten triplete en el espectro podemos pensar que sus sentildeales pudieran
aparecer juntas en el multiplete que se observa sentildealado en verde en la figura
57 a 750 ppm
Por otro lado queda por asociar las sentildeales a 817 ppm y a 804 ppm (Figura
57) correspondientes a un doble doblete y un doblete respectivamente Los
protones que quedan por asignar son H5 y H8 Se podriacutea pensar que H8 seriacutea un
doblete y H5 un doble doblete por efecto del fluacuteor como el caso de H2 Si se
estudian las J se verifica esta informacioacuten ya que la sentildeal a 817 ppm tiene una
constante de acoplamiento de 21 Hz muy pequentildea para pertenecer a un
Descripcioacuten de Compuestos
173
acoplamiento protoacutenndashprotoacuten aromaacutetico Por tanto se asigna a un acoplamiento a
larga distancia del H5 con
el fluacuteor sustituido en
posicioacuten 4 del NFT
Recurriendo al espectro
COSY (Figura 60) se
puede visualizar y
verificar estas cuatro
asignaciones ya que en
caso de ser correctas
deben acoplarse las
sentildeales doblete con el
uacutenico multiplete
Figura 60 Espectro COSY para la asignacioacuten de los H del naftaleno
Identificados todos los hidroacutegenos de la moleacutecula si se recurre ahora al
espectro HMQC (Figura 61) se pueden asignar directamente los carbonos no
cuaternarios presentes en la estructura esto se debe a que este experimento
bidimensional muestra el acoplamiento entre cada carbono y los protones
directamente unidos al mismo
Lo anterior se realiza siguiendo las liacuteneas de unioacuten entre el eje horizontal
espectro de RMN- 1H y el vertical que es el espectro de RMN-13C
Figura 61 Espectro HMQC Acoplamientos protoacuten-carbono
Descripcioacuten de Compuestos
174
Las asignaciones quedan de la siguiente forma
Zona aromaacutetica
C2
FNFT
C3
FNFT
C5
FNFT
C6
FNFT
C7
FNFT
C8
FNFT
C3
FENIL
C5
FENIL
C6
FENIL
RMN-
13C
(ppm)
12320 10912 12840 12725 12611 12311 12180 12491 12332
RMN-
1H
(ppm)
770 720 817 750 750 804 805 838 735
Zona alifaacutetica
C1
alifaacutetico
C2
alifaacutetico
C3
alifaacutetico C2 PIPZ C3 PIPZ C5 PIPZ C6 PIPZ
RMN-13C
(ppm) 7232 3295 5743 5350 5310 5310 5350
RMN-1H
(ppm) 571 210
Ha 290
Hb 278 291 327 327 270
De esta forma queda correctamente determinada la estructura de la moleacutecula
Con el anaacutelisis elemental (CHN) en uacuteltimo lugar se verifica el compuesto y se
determina la pureza del mismo
Descripcioacuten de Compuestos
175
X62 Elucidacioacuten estructural para los derivados de piperidina
El compuesto que se ha tomado como referencia en este caso es el 5f Se trata
de un derivado de FNFT que tiene como amina central una amino piperidina
En la figura 62 se muestra la estructura plana de la moleacutecula con los carbonos
alifaacuteticos diferenciados
Figura 62 Estructura del compuesto 5f con los diferentes carbonos alifaacuteticos coloreados
El espectro de protoacuten del compuesto se muestra en la figura 62
Figura 63 Resonancia de protoacuten del compuesto 5f
Por pertenencia al mismo grupo estructural el derivado 5f y el 5a tienen en
comuacuten los grupos aromaacuteticos de la estructura en consecuencia la zona
aromaacutetica de la moleacutecula ya ha quedado elucidada en el apartado anterior En
este apartado los estudios se centran en la descripcioacuten y asignacioacuten de sentildeales
de la regioacuten alifaacutetica que corresponden a la aminopiperidina En la figura 64 se
han destacado en distintos colores las diferentes sentildeales correspondientes a los
carbonos alifaacuteticos de la moleacutecula 5f
Descripcioacuten de Compuestos
176
Figura 64 Ampliacioacuten zona alifaacutetica de la resonancia de protoacuten del compuesto 5f
Para comenzar con la explicacioacuten de la asignacioacuten se revisa en primer lugar el
espectro DEPT-135 (Figura 65) de resonancia de la zona alifaacutetica donde quedan
diferenciados los carbonos terciarios que dan lugar a sentildeales positivas de los
secundarios que dan lugar a sentildeales negativas
Figura 65 DEPT 135 de la regioacuten aromaacutetica del compuesto 5f Coloreados los carbonos terciarios
En el espectro quedan sentildealados los carbonos terciarios que corresponden al
C1 y a C4p Los
desplazamientos se
mantienen en el espectro de
RMN-13C simple por lo que
en el espectro de HMQC se
puede obtener a queacute
hidroacutegenos van asociadas
las sentildeales de esos carbonos
(Figura 66)
Figura 66 HMQC alifaacutetica asignacioacuten de los carbonos terciarios
Descripcioacuten de Compuestos
177
Al trazar las liacuteneas de unioacuten se observa que la sentildeal de carbono a mayores ppm
corresponde con la de un H que integra a uno y que corresponde a la sentildeal que
aparece a mayores ppm Los H de C1 estaacuten muy desapantallados por el efecto
del OH asiacute la sentildeal a 571 ppm del espectro de protoacuten (Figura 64) corresponde al
CHOH De esta forma la otra sentildeal del C terciario corresponde con el H4 asiacute
trazando una liacutenea amarilla en el HMQC se puede asignar con seguridad la
sentildeal de ese H
Seguacuten el DEPT-135 (Figura 65) en torno a 30 ppm se pueden ver dos singletes
muy proacuteximos que corresponden a dos C secundarios y en torno a 50 ppm
aparece un singlete que integra dos sentildeales Seguacuten la estructura del compuesto
hay cuatro carbonos equivalentes dos a dos los CH2 y CH2 de la piperidina
que aparecen como singletes muy proacuteximos
Los carbonos C2p y C6p (H2+H6) aparecen a desplazamientos mayores como
C4p En el espectro de carbono el desplazamiento a 5230 ppm cumple estas
especificaciones y por tanto puede ser asignado a los CH2 En el HMQC
(Figura 67) al trazar una liacutenea verde desde RMN-13C al RMN-1H para unir las
sentildeales de acoplamiento C-H se comprueba que hay dos acoplamientos de
protoacuten con el mismo carbono Esta situacioacuten se produce porque los hidroacutegenos
de los metilenos no son equivalentes ya que espacialmente se disponen en
planos axiales y ecuatoriales seguacuten se representa en la figura 67
Figura 67 HMQC del compuesto 5f asignacioacuten H piperidina
Descripcioacuten de Compuestos
178
En la disposicioacuten espacial de miacutenima energiacutea en el vaciacuteo (Figura 68) los
hidroacutegenos de los carbonos de piperazina se disponen en diferentes planos Los
H axiales se encuentran
perpendiculares al plano del ciclo de
amina y los H ecuatoriales se
disponen en el mismo plano lo que
produce cambios en el entorno
quiacutemico que quedan reflejados en el
espectro de protoacuten (Figura 64)
Figura 68 Imagen 3D del compuesto 5f obtenida con Chemdraw 3D
La disposicioacuten adoptada hace que los H axiales esteacuten maacutes cerca entre siacute y se
produzcan acoplamientos fuertes con los H axiales vecinos y deacutebiles con los H
ecuatoriales del carbono al que pertenecen En el caso de los H ecuatoriales los
acoplamientos que se generan son deacutebiles con el H en axial del carbono propio
y en ocasiones acoplan muy deacutebilmente con los H ecuatoriales de carbonos
vecinos ya que se encuentran maacutes alejados Por esto en el espectro de esta
moleacutecula no se obtiene una uacutenica sentildeal que integra por cuatro hidroacutegenos sino
que se obtienen dos sentildeales que integran a dos H y que tienen distintas
multiplicidades
En el espectro de protoacuten en HMQC (Figura 67) siguiendo la liacutenea verde que
muestra el acoplamiento de C2p y C6p con los H se ven dos sentildeales a 342 ppm
y 291 ppm La sentildeal a 342 ppm es un doblete ancho con una J =121Hz que
seguacuten lo explicado corresponde a los CH2 (H2+H6) ecuatoriales El H2ec (y por
analogiacutea H6ec) se acopla solo con H2ax la amplitud de la sentildeal podriacutea explicarse
por el acoplamiento deacutebil con H3ec La sentildeal a 291 ppm es un triplete que se
asocia a H2 Y H6 axial ya que H2ax de acoplamientos fuertes con H3ax y H2ec
Las sentildeales de carbonos en 3274 ppm y 3303 ppm corresponden a los CH2 (H3
y H5) Por el razonamiento seguido para los metilenos 2 y 6 las sentildeales a 210
ppm y 160 ppm en el espectro de protoacuten corresponden a los H ecuatoriales y
axiales respectivamente
Los carbonos de la cadena alifaacutetica quedan asignados tambieacuten en base a los
desplazamientos del RMN-13C El C2 estaacute maacutes apantallado por el caraacutecter
alifaacutetico del entorno por lo que de las dos sentildeales que quedan por asignar la
que se obtiene a 3676 ppm corresponde al CHOH-CH2
Descripcioacuten de Compuestos
179
En el espectro HMQC (Figura 69) se obtiene para esta sentildeal CHOH-CH2
varios acoplamientos
correspondientes a
diferentes sentildeales
muacuteltiples a 200 ppm
y 212 ppm en el
espectro de protoacuten
Esto se debe tambieacuten
a la disposicioacuten
espacial de ambos H
como ocurre en el
caso de los H de la
amina
Figura 69 HMQC Asignacioacuten de los carbonos del puente de metilenos
Las sentildeales que quedan sin asignar pertenecen a C3 (sentildealado en rosa en la
figura CH2) a 4575 ppm que seguacuten el HMQC corresponde a los dos protones
que dan sentildeales como multipletes a 310 ppm y 300 ppm
La asignacioacuten de las sentildeales queda de la siguiente manera
Zona aromaacutetica
C2
FNFT
C3
FNFT
C5
FNFT
C6
FNFT
C7
FNFT
C8
FNFT
C3
FENIL
C5
FENIL
C6
FENIL
RMN-13C
(ppm) 12320 10912 12840 12725 12611 12311 12180 12491 12332
RMN-1H
(ppm) 770 720 817 750 750 804 805 838 735
Zona alifaacutetica
C1
alifaacutetico
C2
alifaacutetico
C3
alifaacutetico C2 PIPR C3 PIPR
C4
PIPR C5 PIPR C6 PIPR
RMN-13C
(ppm) 7259 3676 4575 5230 3303 5456 3274 5230
RMN-1H
(ppm) 571
Ha 212
Hb 200
Ha 319
Hb 300
Ha 342
Hb 298
Ha 210
Hb 160 280
Ha 210
Hb 160
Ha 342
Hb 298
De esta forma queda correctamente identificada la estructura del compuesto
5f
Descripcioacuten de Compuestos
180
X63 Elucidacioacuten estructural para los derivados de tetrahidropiridina
En este apartado se describen los compuestos 6g y 7g derivados de benceno
que tienen como amina central una tetrahidropiridina y como resto Ar2 un
benceno para-fluacuteor-sustituido En estos derivados la diferencia estructural que
cabe destacar estaacute en el resto Ar1 donde el 6g presenta un p-fluorobenceno
sustituido y el 7g un p-trifluorometileno (Figura 70)
Figura 70 Estructuras del compuesto 7g y 6g
Para la determinacioacuten estructural de estos compuestos se toma como punto
de partida la RMN-1H asignando las posibles sentildeales con sus correspondientes
protones El espectro de protoacuten de los compuestos se muestra en la figura 71
pudieacutendose comprobar su similitud
Figura 71 Espectro de RMN 1H del compuesto 6g y 7g respectivamente
Descripcioacuten de Compuestos
181
Zona Alifaacutetica
La regioacuten alifaacutetica de estas dos moleacuteculas son ideacutenticas por tanto las sentildeales
estaacuten a desplazamientos similares Estas moleacuteculas cuentan con cinco metilenos
de caraacutecter alifaacutetico y dos carbonos terciarios de los cuales C1 y C3p estaacuten muy
desapantallados por efecto tanto del OH
como por la pertenencia a una insaturacioacuten
como es el doble enlace de la
tetrahidropiridina Por las descripciones de
las zonas alifaacuteticas anteriores se puede
aproximar que el H perteneciente al C1
tendraacute un desplazamiento en torno a 500
ppm En la figura 72 queda sentildealada en
amarillo esta sentildeal a 470 ppm la otra sentildeal
de H sentildealada en naranja a un
desplazamiento 61 ppm corresponde al
protoacuten H3 de la tetrahidropiridina
Figura 72 Ampliacioacuten de RMN- 1H
La sentildeal pequentildea y ancha de entre ambas
sentildeales desaparece con agua deuterada por lo
que se identifica con el protoacuten del OH
El resto de sentildeales corresponden a la
tetrahidropiridina y el puente alifaacutetico En la
figura 73 se muestra ampliada la zona alifaacutetica
del espectro El estudio del espectro COSY
(Figura 74) ayudaraacute en la asignacioacuten de las
sentildeales
Figura 73 Ampliacioacuten RMN- 1H zona alifaacutetica
Habiendo asociado las sentildeales de C1 y C3p seguacuten los acoplamientos
mostrados se puede asignar las sentildeales de los carbonos contiguos con los que se
acopla De esta manera en la figura 74 puede observarse seguacuten los
acoplamientos cuaacuteles son los H contiguos al grupo hidroxilo que son los
pertenecientes a C2
Descripcioacuten de Compuestos
182
Figura 74 Asignacioacuten de las sentildeales de la cadena alifaacutetica
Se asigna la sentildeal que se observa a
180 ppm a C2 (CH2) puesto que es de
los dos el de mayor caraacutecter alifaacutetico
Integrado en el multiplete de 250 ppm
queda la sentildeal del otro CH2
correspondiente a C3 Si se traslada
esta asignacioacuten al HMQC (Figura 75) se
pueden asignar por las sentildeales a queacute C
pertenecen
Figura 75 Espectro HMQC- 1H-13C alifaacuteticos
Tomando como referencia el CH
de C3p (Figura 76) seguacuten los
acoplamientos mostrados en el
espectro COSY se determina
claramente cuaacutel es la sentildeal del CH2
de C2p
Figura 76 Ampliacioacuten zona alifaacutetica del espectro COSY
Si se continuacutea analizando los acoplamientos desde la sentildeal de H2 sentildealados
en morado se corresponde con el multiplete de 260 ppm de la RMN de protoacuten
Descripcioacuten de Compuestos
183
Como se ha explicado en el apartado anterior la posicioacuten espacial de la
moleacutecula genera acoplamientos deacutebiles de los H entre carbonos que no estaacuten
contiguos pero si espacialmente proacuteximos Por ello el multiplete genera
acoplamiento deacutebil con el hidroacutegeno del doble enlace y con los H2 y con una
tercera sentildeal que
pertenece a los H que
quedan por describir
Si se recurre al
espectro HMQC
(Figura 77) de esa
parte de la moleacutecula se
puede asignar las
sentildeales con seguridad
teniendo en cuenta los
desplazamientos
quiacutemicos de los
carbonos
Figura 77 Ampliacioacuten del espectro HMQC en la parte de la piridina
Habieacutendose asignado el H2 de C2p se puede ver el acoplamiento con el
carbono correspondiente Los dos carbonos que quedan por asignar
corresponden a las posiciones C5p y C6p El C5p teoacutericamente deberaacute aparecer a
desplazamientos menores pero la presencia del doble enlace hace que aparezca
a mayores desplazamientos Por tanto trazando las liacuteneas de unioacuten con la RMN
de protoacuten quedan justificadas todas las asignaciones realizadas al comienzo
sobre la resonancia de protoacuten
Zona aromaacutetica
Los protones aromaacuteticos de los compuestos 6g y 7g muestran diferentes
desplazamientos en la RMN- 1H (Figura 78)
Figura 78 Zona aromaacutetica de las RMN- 1H de los compuestos 6g y 7g respectivamente
Descripcioacuten de Compuestos
184
Sin embargo en una primera aproximacioacuten se puede comprobar que hay
sentildeales que se mantienen de una moleacutecula a otra La diferencia estructural entre
los dos compuestos estaacute en el sustituyente Ar1 donde se intercambian un fluacuteor y
un trifluorometil Por tanto las sentildeales que se conservan con desplazamientos a
710 ppm y 740 ppm pertenecen al benceno para sustituido de Ar2 (unido a la
amina) comuacuten en las dos estructuras Se recurre a los espectros bidimensionales
para la asignacioacuten de las sentildeales
En el espectro COSY del compuesto 7g (Figura 79) se puede determinar queacute
hidroacutegenos pertenecen a carbonos del mismo ciclo por sus acoplamientos
vecinales En la RMN- 1H del compuesto 7g a 710 ppm hay un triplete que
integra por dos hidroacutegenos Teoacutericamente la sentildeal obtenida deberiacutea ser un
doblete ya que los hidroacutegenos del los anillos solo se ven afectados por un
hidroacutegeno vecino La explicacioacuten de esta multiplicidad es la presencia del
aacutetomo de fluacuteor que no genera sentildeal pero si influencia en los hidroacutegenos vecinos
De esta forma se asigna esa sentildeal a 710 ppm a los hidroacutegenos 3acute y 5acute del anillo
de Ar2 Con el espectro COSY quedan descritos los correspondientes vecinos
H2acute y H6acute a 740 ppm
Figura 79 Espectro COSY del compuesto 6g
De esta manera queda claro que las otras dos sentildeales pertenecen a Ar1 Si se
recurre de nuevo a la RMN- 1H del compuesto 6g se puede observar una sentildeal
intensa que integra cuatro protones a 710 ppm Conociendo que dos
hidroacutegenos son H3acute y H5acute que pertenecen a Ar2 los otros dos seraacuten H3 y H5
pertenecientes al benceno unido al hidroxilo Ar1 que en este compuesto
tambieacuten tienen un aacutetomo de fluacuteor contiguo
Descripcioacuten de Compuestos
185
En el espectro COSY del compuesto 7g la sentildeal a 750 ppm se ha asignado a
H2acute y H6acute de Ar2 El compuesto 6g tiene los mismos protones H2acute y H6acute de Ar2 a
igual desplazamiento por lo que la sentildeal a 740 ppm perteneceraacute a los protones
H2 y H6 que faltaban por designar en el compuesto 6g Los uacutenicos protones que
no comparten 6g y 7g son H3 y H5 Por RMN- 1H del compuesto 6g se ha deduce
que estos hidroacutegenos dan una sentildeal a 71 ppm En el espectro del compuesto 7g
a 770 ppm hay una sentildeal que por lo explicado se asigna a estos hidroacutegenos
vecinos del grupo trifluorometil de Ar1
Las asignaciones son
Zona aromaacutetica
6g C2
FBZN
C3
FBZN
C5
FBZN
C6
FBZN
C2
FENIL
C3
FENIL
C5
FENIL
C6
FENIL
RMN-13C
(ppm) 12730 11580 11580 12730 12730 11580 11580 12730
RMN-1H
(ppm) 740 710 710 740 750 710 710 750
7g C2
TBZN
C3
TBZN
C5
TBZN
C6
TBZN
C2
FENIL
C3
FENIL
C5
FENIL
C6
FENIL
RMN-13C
(ppm) 12730 12570 12570 12730 12730 11580 11580 12730
RMN-1H
(ppm) 750 770 770 750 740 710 710 740
Zona alifaacutetica comuacuten
C1
alifaacutetico
C2
alifaacutetico
C3
alifaacutetico
C2
PIRD
C3
PIRD
C5
PIRD
C6
PIRD
RMN-13C
(ppm) 7149 3696 2836 5360 12280 5531 5074
RMN-1H
(ppm) 470 180 250 306 610 245 260
XXII EENNSSAAYYOOSS BBIIOOLLOacuteOacuteGGIICCOOSS
Ensayos Bioloacutegicos
189
XI1Ensayos de actividad antiplasmoacutedica in vitro
Se determinoacute como se describe en el apartado de material y meacutetodos la
actividad antimalaacuterica in vitro y la citotoxicidad de la mayor parte de los
compuestos obtenidos y los resultados se muestran en las siguiente tablas
(Tabla 4 5 y 6)
Compuesto Ar1 n Amina RaRb CI50
NF54 microM
CI50 FCR3 microM
DT50
Vero microM
IS VeroFCR3
1
2 PIPZ CF3NO2 1250 10310 3610 035
2 2 PIPZ NO2CF3 ND 090 490 544
9
2 PIPZ CF3NO2 830 4205 1890 045
11 2 PIRR CF3NO2 390 4605 7040 150
14
1 PIPZ CF3NO2 23260 19020 gt100 065
15 1 PIPZ NO2CF3 10320 18615 gt100 053
17
2 PIPZ NO2CF3 1700 7300 949 013
Referencia QC 004 013 gt50 gt350
Tabla 4 Tabla de resultados de actividad y citotoxicidad de los compuestos de la Serie 0 derivados carboniacutelicos CQ Cloroquina CI50 valores medios del ensayo realizado por triplicado expresados en microM de la inhibicioacuten del 50 del
crecimiento celular de cepas FCR-3 de Plasmodium falciparum DT50 concentracioacuten citotoacutexica media de los compuestos en ceacutelulas Vero IS Iacutendice de Selectividad de los compuestos obtenido del cociente de DT50 de ceacutelulas Vero y la CI50 en
cepas FCR3 ND No determinado
Ensayos Bioloacutegicos
190
Series Ar1 Comp n Amina RaRb CI50
NF54 microM
CI50
FCR3 microM
DT50 Vero microM
IS VeroFCR3
Serie 1
1a 2 PIPZ CF3NO2 230 400 2420 605
1b 2 PIPZ NO2CF3 420 645 gt100 gt100
1g 2 PIRD HF ND 1689 1790 106
Serie 2
2a 2 PIPZ CF3NO2 ND 130 gt200 gt100
2b 2 PIPZ NO2CF3 ND 223 gt150 8598
2c 2 PIPZ HCF3 ND 105 gt250 gt100
2d 2 DZP CF3NO2 ND 075 133 1770
2f 2 PIPR CF3NO2 ND 070 660 670
Serie 3
3b 2 PIPZ NO2CF3 1670 3615 gt100 380
3e 2 PIRR CF3NO2 610 1050 2970 190
3g 2 PIRD HF ND 1403 2460 175
Serie 4
4b 1 PIPZ NO2CF3 2170 10225 7460 070
Serie 5
5a 2 PIPZ CF3NO2 130 050 2090 4180
5b 2 PIPZ NO2CF3 170 490 7570 1540
5c 2 PIPZ HCF3 ND 093 gt200 gt100
5f 2 PIPR CF3NO2 ND 015 550 5500
5g 2 PIRD HF ND 040 3430 8590
Serie 6
6a 2 PIPZ CF3NO2 ND 036 8798 gt100
6f 2 PIPR CF3NO2 ND 048 3000 gt100
6g 2 PIRD HF ND 066 gt1000 gt1000
Serie 7
7g 2 PIRD HF ND 560 gt300 gt100
Referencia CQ 004 013 gt50 gt300
Tabla 5 Tabla de resultados de actividad y citotoxicidad de los compuestos hidroxiacutelicos CQ Cloroquina CI50 valores medios del ensayo realizado por triplicado expresados en microM de la inhibicioacuten del 50 del crecimiento celular de cepas FCR-3 de Plasmodium falciparum DT50 concentracioacuten citotoacutexica media de los compuestos en ceacutelulas Vero IS Iacutendice de
Selectividad de los compuestos obtenido del cociente de DT50 de ceacutelulas Vero y la CI50 en cepas FCR3 ND No determinado
Ensayos Bioloacutegicos
191
Serie 8
Ar1 Amina RaRb IC50
NF54 microM
IC50
FCR3 microM
DT50 Vero
microM
DT50 MCF7
microM
IS VeroFCR3
1
PIPZ NO2CF3 ND SA 150 471 ND
2 PIRR CF3NO2 214 465 101 ND 022
Referencia CQ 004 013 gt50 ND gt400
Tabla 6 Tabla de resultados de actividad y citotoxicidad de los compuestos de la Serie 8 derivados oxima CQ Cloroquina CI50 valores medios del ensayo realizado por triplicado expresados en microM de la inhibicioacuten del 50 del
crecimiento celular de cepas FCR-3 de Plasmodium falciparum DT50 concentracioacuten citotoacutexica media de los compuestos en ceacutelulas Vero IS Iacutendice de Selectividad de los compuestos obtenido del cociente de DT50 de ceacutelulas Vero y la CI50 en
cepas FCR3 ND No determinado SA sin actividad
XI2 Ensayos de actividad antiplasmoacutedica in vivo
Los ensayos in vivo comenzaron con los ensayos de virulencia para obtener
una aproximacioacuten del comportamiento de la cepa elegida Fueron desarrollados
como se muestra en la figura 80
Figura 80 Desarrollo del ensayo de virulencia previo al ensayo de actividad in vivo de los compuestos
En ratones parasitados al 50 hay 24x106 hematiacutees infectados por microL y son
necesarios 107 hematiacutees totales por ratoacuten Para el test de Peters se dispuso de
Ensayos Bioloacutegicos
192
100 ratones pero en los caacutelculos teniendo en cuenta las posibles peacuterdidas se
contoacute con 110 ratones en total Asiacute fueron necesarios 110x107 paraacutesitos para
comenzar la experimentacioacuten El volumen maacuteximo que inyectar es 100 microL de
solucioacuten lo que supone preparar 11 mL de solucioacuten de sangre parasitada al
comienzo del ensayo
Teniendo en cuenta estos tres datos fueron necesarios 458 microL de sangre
infectada al 50 en un volumen de 11 mL de suero fisioloacutegico Con la
inoculacioacuten de los ratones da comienzo el Test de Peters
Los resultados a lo largo del test se ofrecen en la Tabla 7
Test de Peters (respuesta visual externa) P Supervivencia
Grupo Diacutea 0 Diacutea 1 Diacutea 2 Diacutea 3 Diacutea 4 Diacutea 5 Diacutea 7 Diacutea 9 Diacutea 11 Diacutea 12
Control negativo - - + AC + AC + AC 23 910 35 13 11 1
Control positivo - - + AC + AC + AC 19 1010 68 44 44 2
Grupo 2a1 - - + AC + AC + AC 24 710 34 12 - -
Grupo 2a2 - - + AC + AC + AC 32 810 22 22 - -
Grupo 2a3 - - + AC + AC + AC 14 1010 66 55 13 1
Grupo 2a4 - - + AC + AC + AC 31 910 45 22 12 1
Grupo 5f1 - +AC +AC
ID
+AC
BMBO
+AC
BMBO 6 510 35 33 23 2
Grupo 5f2 - +AC + AC +AC
BMBO
+AC
BMBO 15 1010 67 45 23 -
Grupo 5f3 - +AC + AC + AC + AC 32 910 44 23 - -
Grupo 5f4 - +AC + AC + AC + AC 18 1010 67 44 - -
Tabla 7 Resultados de los ensayos in vivo para los compuestos 2a y 5f P porcentaje de parasitemia (-) sin respuesta visual externa (+) respuesta externa AC alteracioacuten momentaacutenea del comportamiento en el momento de la inyeccioacuten del tratamiento BM baja movilidad BO baja oxigenacioacuten principios de cianosis parasitemia medida al cuarto diacutea
Supervivencia expresada en ratones supervivientes con respecto al grupo el diacutea determinado
XI3 Discusioacuten de ensayos bioloacutegicos
Los resultados bioloacutegicos obtenidos ofrecen datos de estructura-actividad
suficientemente consistentes como para proseguir con un refinamiento
estructural de los compuestos El estudio del comportamiento de los
compuestos de las diferentes series en el ensayo de actividad antiplasmoacutedica in
vitro en la cepa FCR3 ha sido suficiente para comprobar que (Series 1-7) son
mucho maacutes activos en todos los casos los derivados hidroxiacutelicos (CHOH) que
un reducido nuacutemero de derivados carboniacutelicos (Serie 0) Por esto no fueron
ensayados el resto de compuestos de la Serie 0
Ensayos Bioloacutegicos
193
Los mismos resultados se obtuvieron para las dos oximas de la Serie 8 por lo
que se paroacute su siacutentesis Sin embargo esto no es extensible a los datos de
toxicidad que se ve influenciada por otros sustituyentes en la moleacutecula Por esto
se centraraacute el estudio en los resultados de las modificaciones estructurales de
los derivados hidroxiacutelicos pertenecientes a las Series 1 a 7
En referencia al sustituyente en la posicioacuten Ar1 comparando series como 1 vs
2 y 3 vs 5 se puede destacar que las series con un grupo fluacuteor en Ar1 aumentan
significativamente su actividad sin ser extensible este dato a la toxicidad (veacutease
compuestos 1a vs 2a 1b vs 2b 3b vs 5b y 3g vs 5g) La siguiente comparativa se
basa en la naturaleza de los anillos condensados (benzo[b]tiofeno y naftaleno)
respecto del benceno sustituido que forman el nuacutecleo del sustituyente Ar1 En
una primera aproximacioacuten se puede ver que la actividad desciende en orden
derivados de FNFTgtderivados de FBZNgtderivados de FBTF Comparando
ahora la actividad de los compuestos 1a vs 2a vs 3a vs 5a vs 6a puede verse que
el compuesto 5f (derivado de FNFT) tiene el mejor dato de CI50 pero el
compuesto 6a (derivado de FBZN) es el que mejor actividad in vitro ha
mostrado siendo soacutelo 3 veces menos activo que la CQ usada como referencia Si
se comparan los derivados de FBTF (Serie 2) y FNFT (Serie 5) en general los
compuestos de la Serie 5 son maacutes activos que sus homoacutelogos de la Serie 2
excepto en el caso de los compuestos 2b vs 5b
En cuanto a toxicidad aunque de forma menos marcada se observa un
aumento en los derivados de FNFT respecto de sus homoacutelogos de FBTF
Centrando el estudio en la variacioacuten de la longitud de la cadena alifaacutetica se
comparan los compuestos 3b y 4b La mayor parte de los compuestos
sintetizados contienen dos carbonos en la cadena alifaacutetica La disminucioacuten en
un aacutetomo de carbono en esta cadena (Compuestos de la Serie 0 14 y 015 y Serie
4) supone una peacuterdida muy considerable de la actividad de los compuestos
Este dato de menor actividad condujo a cerrar esta serie
La naturaleza de la amina central ademaacutes de influir claramente en la
actividad tiene gran influencia en la toxicidad in vitro de los derivados De
forma que se puede ver como la mayoriacutea de derivados de piperazina muestran
una toxicidad bastante baja en comparacioacuten con compuestos derivados de otras
aminas Por el contrario exceptuando el compuesto 6a estos derivados tienen
menor actividad que sus anaacutelogos con otras aminas como homopiperazinas
(compuestos 2a vs 2d) o piperidinas (compuestos 2a vs 2f o 5a vs 5f)
Ensayos Bioloacutegicos
194
Se puede plantear como hipoacutetesis que la presencia de un grupo NH libre en la
estructura aumenta considerablemente la toxicidad de los compuestos Este
caso se observa en los derivados de la Serie 2 y Serie 3 donde los compuestos
con piperazina no son toacutexicos pero al introducir una amina con un NH libre
aumenta su toxicidad a la vez que lo hace la actividad Esto no es de aplicacioacuten
en los anaacutelogos de la Serie 5 (ya que el compuesto 5a contiene el anillo de
piperazina y muestra toxicidad) por lo que se podriacutea deducir que el grupo FNFT
confiere por si mismo cierta toxicidad Con respecto a los derivados de
tetrahidropiridina no se tienen suficientes datos como para extraer conclusiones
claras en la relacioacuten estructura-actividad
Por uacuteltimo se estudia la variacioacuten de la actividad y citotoxicidad en relacioacuten a
los sustituyentes en Ar2 Si se comparan los compuestos a y b de las diferentes
series se deduce que es conveniente para la actividad que el grupo CF3 esteacute en
posicioacuten orto con respecto a la amina (compuestos ldquoardquo de las diferentes series)
Los compuestos con CF3 en para (compuestos ldquobrdquo) son menos activos pero
tambieacuten menos toacutexicos Los anaacutelogos que carecen de grupo NO2 (compuestos 2c
y 5c) aumentan la actividad y cabe destacar el descenso en la toxicidad por lo
que se deduce que el grupo NO2 confiere toxicidad no ligada a la actividad
como el caso de los grupos NH libres Los datos obtenidos permiten una
aproximacioacuten al comportamiento de los compuestos in vivo Para estos ensayos
de los compuestos disponibles se seleccionaron dos el 5f el maacutes activo
(proacuteximo al compuesto de referencia) y 2a el de mejor perfil de toxicidad
En la Tabla 4 se muestran los datos experimentales obtenidos durante la
realizacioacuten del Test de Peters El compuesto 5f disminuye en gran medida la
parasitemia a altas concentraciones pero por acumulacioacuten en el tratamiento
diario provoca diferentes muestras de toxicidad como mala oxigenacioacuten o
alteraciones de conducta de los ratones A concentraciones menores los
resultados desafortunadamente no son tan relevantes como cabiacutea esperar ni en
cuanto a parasitemias ni a supervivencia
El compuesto 2a si bien no muestra indicios de toxicidad no mejora los
resultados con respecto a la CQ en datos de parasitemia ni de supervivencia
XXIIII EENNSSAAYYOOSS CCOOMMPPUUTTAACCIIOONNAALLEESS
Ensayos Computacionales
197
XII1 Propiedades fisicoquiacutemicas de los compuestos
Todos los valores obtenidos en relacioacuten a las propiedades fisicoquiacutemicas de
los compuestos sintetizados se exponen en la tabla siguiente (Tabla 8)
ABS TPSA (Ǻ2)
n-ROTB
PM miLogP KOWLogP ALogPS
21 MLogP
n-OHNH n-ON aceptores
Lipinskis violations ID donadores
rule
gt500 lt5 lt5 lt5 lt415 lt5 lt10 le1
01 8506 6940 7 46350 503 486 480 414 0 6 1
02 8507 6937 7 gt500 503 486 476 414 0 6 1
03 10000 2031 5 36450 481 548 52 442 0 2 0
04 8507 6937 7 48151 419 506 476 424 0 6 0
05 8507 6937 7 48151 419 506 476 424 0 6 0
06 10000 2355 6 43651 431 525 502 451 0 3 0
07 8703 6368 7 49554 401 543 504 485 0 5 0
08 8203 7816 8 49554 448 576 463 445 1 6 0
09 8506 6940 7 4940 532 504 479 448 0 6 1
010 8507 6937 8 gt500 489 504 520 448 0 6 0
011 8202 7820 8 4940 533 525 435 448 1 6 1
012 10000 2031 5 35947 510 566 507 477 0 2 1
013 10000 2031 6 37741 481 544 461 487 0 2 0
014 8506 6940 6 44340 505 531 458 427 0 6 1
015 8506 6940 6 44340 505 531 461 427 0 6 1
016 8507 6937 7 47548 541 524 457 458 0 6 1
017 8506 6940 7 47540 541 524 458 458 0 6 1
018 10000 2355 6 43048 552 543 504 485 0 3 1
019 8203 7816 8 48951 463 594 461 478 1 6 0
020 10000 2031 5 37746 519 580 490 514 0 2 1
021 8507 6937 7 42542 430 407 372 390 0 6 0
022 8203 7816 8 43945 458 477 373 411 1 6 0
023 10000 2031 5 32740 408 468 422 411 0 2 0
81 7971 8489 7 47247 538 468 463 395 1 7 1
82 7668 9368 8 47247 469 458 463 395 1 6 0
CQ 9930 2820 8 31990 501 450 528 352 1 3 1
Tabla 8 Datos computacionales de las propiedades fisicoquiacutemicas de los derivados de la Serie 0 y Serie 8 ABS porcentaje de absorcioacuten calculado como 109 ndash (0345 x TPSA) siendo TPSA el Aacuterea Superficial Polar Topoloacutegica n-
ROTB es el nuacutemero de enlaces de giro permitido Log P es el coeficiente de particioacuten del compuesto en octanol-agua n-OHNH es nuacutemero de enlaces de hidrogeno donadores n-ON es el nuacutemero de enlaces de hidroacutegeno aceptores CQ
cloroquina
ID ABS TPSA (Ǻ2) n-ROTB PM miLogP KOWLogP ALogPS 21 MLogP n-OHNH n-ON
aceptores Lipinskis violations donadores
rule
gt500 lt5 lt5 lt5 lt415 lt5 lt10 le1
1a 8398 7253 7 46550 469 468 463 395 1 6 0
1b 8398 7253 7 gt500 469 458 463 395 1 6 0
1g 10000 2347 5 40399 447 530 461 423 1 2 0
2a 8398 7253 7 48349 407 488 499 432 1 6 0
2b 8398 7253 7 gt500 478 488 499 432 1 6 0
2c 9979 2670 6 43849 397 507 509 432 1 3 0
2d 8398 7253 7 49751 413 538 505 453 1 6 0
2f 8095 8132 8 49751 414 558 461 453 2 6 0
3b 8398 7253 7 49600 498 486 483 429 1 6 0
3e 8095 8132 8 49607 499 506 439 429 1 6 0
3g 10000 2347 5 36146 476 548 466 457 1 2 0
4b 8399 7250 6 44540 471 415 477 408 1 6 0
5a 8399 7250 7 47750 507 506 503 466 1 6 1
5b 8399 7250 7 47750 507 424 384 546 1 6 1
5c 9979 2670 6 46896 519 525 514 466 1 3 1
5f 8095 8132 8 49147 536 576 465 486 2 6 1
5g 10000 2347 5 37945 485 568 488 495 1 2 0
6a 8398 7253 7 46591 337 389 413 398 1 6 0
6f 8095 8132 8 47994 424 459 374 419 2 6 0
6g 10000 2347 5 329 39 374 450 395 425 1 2 0
7g 10000 2347 6 37974 447 526 469 468 1 2 0
CQ 9930 2820 8 31990 501 450 528 352 1 3 1
Tabla 9 Datos computacionales de las propiedades fisicoquiacutemicas de los derivados hidroxiacutelicos ABS porcentaje de absorcioacuten calculado como 109 ndash (0345 x TPSA) siendo TPSA el Aacuterea Superficial Polar Topoloacutegica n- ROTB es el nuacutemero de enlaces de giro permitido Log P es el coeficiente de particioacuten del compuesto en octanol-agua n-OHNH es nuacutemero de enlaces de hidrogeno donadores n-
ON es el nuacutemero de enlaces de hidroacutegeno aceptores CQ cloroquina
Ensayos Computacionales
199
XII2 Discusioacuten de propiedades fisicoquiacutemicas
Los estudios teoacutericos de los paraacutemetros fiacutesico-quiacutemicos muestran que los
compuestos cumplen las Reglas de Lipinski ya que tienen un peso molecular
menor de 500 Daltons los coeficientes de particioacuten octanolagua estaacuten dentro
de los liacutemites admitidos (entre -04 y 56) lejos de los cinco enlaces donadores
de hidroacutegeno (suma de los OH y NH) y de los 10 aceptores (suma de O y N)
Las caracteriacutesticas estructurales han de ser tenidas en cuenta para predecir la
solubilidad de los compuestos
El tamantildeo de las estructuras influye de manera directa en la absorcioacuten de un
compuesto puesto que los de bajo peso molecular difunden mejor pasivamente
Todos los compuestos de este trabajo presentan bajos pesos moleculares
La polaridad de las estructuras tambieacuten juega un papel importante en las
caracteriacutesticas farmacocineacuteticas Las moleacuteculas apolares difunden con mayor
facilidad que las polares ya que son maacutes lipoacutefilas Los coeficientes de reparto
octanolagua determinan esta caracteriacutestica de la moleacutecula teniendo en cuenta
el medio Es decir los compuestos con altos coeficientes de particioacuten son maacutes
hidroacutefobos y por tanto tendraacuten buena difusioacuten Los valores obtenidos para los
distintos compuestos en las diferentes aplicaciones utilizadas no muestran una
tendencia clara que permita distinguir entre estructuras Lo que siacute cabe destacar
es que todos cuentan con valores altos proacuteximos a 5 que les confiere buena
difusioacuten
Los aacutetomos que conforman las moleacuteculas estaacuten cargados y confieren
polaridad a la estructura Esta caracteriacutestica estaacute distribuida en el espacio de
diferente forma seguacuten los aacutetomos de O N y F que posea la moleacutecula dando
lugar al TPSA (suma de superficie de todos los aacutetomos polares) La bibliografiacutea
(Palm et alts 1997) demuestra que la liposolubilidad estaacute relacionada con los
valores de TPSA Los valores de TPSA entre 63 y 139 Aring2 predicen una buena
absorcioacuten de los compuestos La mayoriacutea de las estructuras del trabajo estaacuten
dentro de esos paraacutemetros incluso hay estructuras que como la CQ tienen
TPSA menores de 63 Aring2 que indican que el porcentaje de absorcioacuten de los
compuestos seraacute oacuteptimo
Todos los paraacutemetros fisicoquiacutemicos proponen unas buenas cualidades de
absorcioacuten de los compuestos de este trabajo
Ensayos computacionales
200
XII3 Estudios de Modelizacioacuten y Acoplamiento Molecular
Se realiza una primera aproximacioacuten para la validacioacuten de la diana propuesta
usando el programa Autodock donde se analizan los modos de unioacuten maacutes
representativos de las diez conformaciones calculadas del compuesto EH58 y del
5a con al menos un enlace de hidroacutegeno con uno de los aspartatos del sitio
cataliacutetico Las energiacuteas de unioacuten y los valores de RMSD de EH58 y las energiacuteas de
unioacuten del compuesto 5a para esas diez conformaciones se muestran en la
siguiente tabla
EH58 5a
Confa Energiacutea
b RMSD
c Energiacutea
b
1 -406 453 -616
2 -250 361 -607
3 -245 559 -585
4 -230 393 -584
5 -232 299 -570
6 -232 632 -556
7 -209 551 -556
8 -197 557 -545
9 -162 556 -525
10 -121 733 -478
Tabla 10 Datos de energiacutea de las distintas conformaciones de los compuestos EH58 y 5a a Mejores conformaciones obtenidas por docking ordenadas seguacuten la energiacutea b energiacutea de unioacuten en in Kcalmol calculadas con el programa
Autodock c Valores RMSD en Aring
Los resultados de los ensayos computacionales realizados al compuesto 5a
producen representaciones graacuteficas tridimensionales del MEP (Figura 81) de la
conformacioacuten de miacutenima energiacutea obtenida seguacuten los datos mostrados en la
anterior Tabla 10
En el MEP se observa una red de potencial electronegativo alrededor del fluacuteor
los grupos OH y los NO2 Asiacute se puede deducir que los compuestos maacutes activos
los derivados hidroxiacutelicos tendraacuten un potencial electronegativo y un modo de
accioacuten similar
Ensayos Computacionales
201
Figura 81 MEP de la mejor conformacioacuten del compuesto 5g
Los estudios de docking se orientaron a la unioacuten entre el compuesto liacuteder y la
plasmepsina II como se ha explicado anteriormente Se llegoacute a la conclusioacuten que
se forma un puente de hidroacutegeno con el sitio activo de la aspartato cataliacutetica de
la enzima (ASP 214 y ASP 34) Esta interaccioacuten se da sobre el uacutenico grupo
hidroxilo de la moleacutecula y el residuo ASP 214
Todo esto nos aporta representaciones graacuteficas como la obtenida para la mejor
conformacioacuten encontrada para el compuesto 5a dentro del sitio activo de la
plasmepsina II (figura 82)
Figura 82 Representacioacuten de la unioacuten del compuesto 5a y la Plasmepsina Sentildealado con raya discontinua amarilla la unioacuten del OH y la ASP 214 Tambieacuten se puede ver dibujadas en rama otras terminaciones de la enzima
En base al resultado obtenido en la primera aproximacioacuten con el programa
Autodock que valida como diana la plasmepsina se realiza una segunda
aproximacioacuten con el programa ICM que emplea menos tiempo para sus caacutelculos
una vez conocidos los paraacutemetros de buacutesqueda base
Ensayos computacionales
202
Para este segundo estudio se emplearon las estructuras de los derivados 5a 5c
5g 6a 6g y 6f Una de las hipoacutetesis base del estudio es que partiendo de que
habiacutea comprobado que el compuesto 5a encaja en el sitio activo los demaacutes
derivados deberaacuten encajar tambieacuten Esto se confirma en la figura 83 donde se
muestra como los diferentes derivados solapan estructuralmente en el hueco del
sitio activo de la moleacutecula
Figura 83 Imagen de la plasmepsina donde se muestra el solapamiento de las diferentes estructuras estudiadas
El programa ICM realizoacute caacutelculos para obtener las energiacuteas de las mejores
conformaciones de las moleacuteculas propuestas (Tabla 11)
Compuesto Energiacutea
(Kcalmol) Actividad
uM
5f -917627 015
5a -867278 05
6f -815261 048
6a -764088 036
5c -751448 093
6g -681119 066
Tabla 11 Energiacutea de las conformaciones oacuteptimas de los diferentes compuestos estudiados
Teniendo en cuenta los datos de energiacutea y las configuraciones espaciales maacutes
estables para el sitio de unioacuten de las moleacuteculas se obtuvo la representacioacuten de las
interacciones que realiza cada moleacutecula en el sitio activo de la enzima
plasmepsina (Figuras 84 a 89)
En la figura 84 se puede ver la representacioacuten de las interacciones del
compuesto 5a en el sitio activo En amarillo quedan sentildealadas las interacciones
hidrofoacutebicas (interacciones de Van der Waals) entre restos apolares de la
Ensayos Computacionales
203
moleacutecula y de los restos de la enzima
En verde se sentildeala el puente de
hidroacutegeno entre el grupo OH y la
ASP 214 En este compuesto el
programa plantea otra posible unioacuten
con el resto THR 217 En azul se
resalta la regioacuten ionizable la amina
Los restos libres que podriacutean
interaccionar con las moleacuteculas
propuestas se plantean en recuadros
alrededor de ella
Figura 84 Representacioacuten de las interacciones de 5a
En la figura 85 se puede estudiar la
variacioacuten en las interacciones con el
cambio de posicioacuten del grupo CF3 y la
desaparicioacuten del grupo NO2 del
compuesto 5c Ahora el programa
plantea la posibilidad de la interaccioacuten
del OH con ASP 34 ademaacutes de la
interaccioacuten con ASP 214
Figura 85 Representacioacuten de las interacciones de 5c
En la figura 86 se muestra el compuesto 5f y se aprecia el cambio los aacutengulos de
conformacioacuten de la estructura
cuando la amina PIPZ central se
cambia por PIPR Se observa como
se establecen muchas maacutes
interacciones apolares del grupo
FNFT y del CF3 en orto pero
disminuyen las del ciclo de la amina
con respecto a la piperazina
Ademaacutes se plantea una nueva unioacuten
por puente de hidroacutegeno entre el
NH libre y la ASP 34
Figura 86 Representacioacuten de las interacciones de 5f
Ensayos computacionales
204
En la figura 87 el compuesto 6f se
diferencia del anterior en que en lugar de
un FNFT se tiene un FBZN que plantea
una unioacuten con el resto TYR 192 Se ve a
simple vista la disminucioacuten en la cantidad
de interacciones apolares que hay en la
moleacutecula
Figura87 Representacioacuten de las interacciones de 6f
En la figura 88 se representa el
compuesto 6a Se puede ver como de
nuevo el anillo de PIPZ vuelve a dar
interacciones apolares y aporta
regiones ionizables aunque se pierde
el puente de hidroacutegeno con ASP 34
Figura 88 Representacioacuten de las interacciones de 6a
En esta uacuteltima figura 89 se
representa el compuesto 6g que se
diferencia del anterior en que la
amina central es la PIRD Este ciclo
posibilita una interaccioacuten con TYR 77
y VAL 78 La distribucioacuten de
interacciones apolares se asemeja a la
de la moleacutecula 5c ya que el
sustituyente tambieacuten de caraacutecter
electro-atrayente se encuentra en
posicioacuten para del anillo
Figura 89 Representacioacuten de las interacciones de 6g
En este estudio se incluyoacute una seacuteptima moleacutecula el derivado 4b Este
compuesto se diferencia del resto de los sintetizados en que su cadena alifaacutetica
cuenta con dos aacutetomos de carbono lo que significa que la separacioacuten entre el OH
y la amina es de un uacutenico carbono Los caacutelculos sobre energiacuteas y configuraciones
espaciales de maacutexima estabilidad para una correcta interaccioacuten con la diana
Ensayos Computacionales
205
propuesta mostraron que el compuesto 4b puede adoptar una conformacioacuten que
le permitiriacutea acceder al hueco activo de la plasmepsina pero no se produciriacutea la
interaccioacuten caracteriacutestica del grupo OH y la ASP 214
Estos datos ofrecen la posibilidad de un farmacoacuteforo que se muestra en la
figura 90
Figura 90 Farmacoacuteforo propuesto para los derivados de arilaminoalcoholes con actividad antimalaacuterica que tienen como diana propuesta la plasmepsina II
En la imagen del farmacoacuteforo quedan destacadas en amarillo las zonas
apolares que establecen interacciones hidrofoacutebicas con los aminoaacutecidos del sitio
activo de la plasmepsina y que se corresponden con la zona aromaacutetica Ar1 Las
flechas granate sentildealan las posibles interacciones que establece el aacutetomo de fluacuteor
Las flechas verdes sentildealan las interacciones polares entre los grupos polares y la
ASP 214 Asiacute de la zona azul correspondiente a las interacciones de la amina se
destaca una segunda interaccioacuten de los NH libres con la enzima en el resto ASP
34 El resto del ciclo de amina establece interacciones apolares
En la imagen la parte de Ar2 por su naturaleza aromaacutetica tambieacuten plantea
interacciones apolares con la enzima propuesta
Con los datos obtenidos y tomando como diana la enzima plasmepsina se puede
proponer un nuevo esquema para seguir con el refinamiento estructural
Ensayos computacionales
206
Figura 91 Estructura general planteada para el refinamiento estructural
Las nuevas estructuras deberaacuten contar con un grupo hidroxilo separado por un
espaciador alifaacutetico de una longitud miacutenima de dos carbonos con una amina A
ambos lados de la moleacutecula se dispondraacuten las zonas de interaccioacuten apolar
formadas por sistemas aromaacuteticos sencillos o conjugados sutituidos por grupos
de caraacutecter electroatrayente como haloacutegenos metoxi o trifluorometoxi
Ensayos Computacionales
207
XII4 Discusioacuten de resultados de modelizacioacuten
Los estudios computacionales proponen como diana de los compuestos
desarrollados en este trabajo la plasmepsina II Seguacuten los datos obtenidos para
las diferentes estructuras estudiadas se pueden establecer relaciones
estructura-actividad Estos resultados se ven confirmados por las distintas
interacciones de los compuestos en su conformacioacuten maacutes estable dentro de
hueco activo de la enzima
Al estudiar los resultados de las diferentes interacciones por zonas de las
moleacuteculas en las figuras 84 a 89 se podriacutea dar una explicacioacuten de la diferente
actividad mostrada por los compuestos ensayados
Queda evidenciado desde la primera aproximacioacuten computacional que el
puente de hidroacutegeno entre el grupo OH y la ASP 214 es el punto clave en la
validacioacuten de la plasmepsina II como diana de los compuestos Esta interaccioacuten
confirma que es requisito indispensable para la actividad de los derivados la
presencia de un grupo OH en la estructura
Los sistemas aromaacuteticos conjugados o anillo aromaacutetico que conforman Ar1
son sistemas completamente apolares que ejercen interacciones hidrofoacutebicas
con los restos apolares del bolsillo activo de la enzima como isoleucina (ILE)
fenilalanina (PHE) o leucina (LEU) Cuanto mayor es la nube de electrones π del
sistema Ar1 mayores son las interacciones con los sistemas π de los
aminoaacutecidos que explica porqueacute los derivados de la Serie 5 tienen maacutes
actividad que los de la Serie 6 Varias representaciones plantean una posible
unioacuten polar del aacutetomo de fluacuteor con tirosina (TYR) que aumentariacutea la interaccioacuten
global de la moleacutecula y aclara el porqueacute los derivados fluorados son maacutes afines
que los no fluorados
La longitud de la cadena alifaacutetica tambieacuten juega un papel importante en la
actividad de los derivados la disminucioacuten de tres aacutetomos de carbono a dos de
la cadena alifaacutetica ha supuesto una disminucioacuten draacutestica de la actividad (veacuteanse
los compuestos 3b y 4b) Los estudios realizados al compuesto 4b podriacutean
explicar esta disminucioacuten Los carbonos de la cadena alifaacutetica tienen capacidad
de rotar lo que confiere a la estructura mayor capacidad para adoptar
diferentes conformaciones que le permiten llegar a la disposicioacuten de miacutenima
energiacutea Los derivados ensayados con un carbono alifaacutetico menos seguacuten las
previsiones teoacutericas adoptan una conformacioacuten que les permite acceder al
Ensayos computacionales
208
hueco activo de la plasmepsina II pero no permite la unioacuten del grupo OH con
el resto ASP 214 que se predice como esencial para la actividad de los
compuestos presentados en este trabajo Se puede predecir que teoacutericamente la
plasmepsina II no es la diana adecuada para los derivados de la Serie 0 14 y 15
y 4b
La naturaleza de la amina central juega un papel muy importante en este tipo
de estudios Puede verse en las representaciones que seguacuten sea la amina
piperazina o amino-piperidina las interacciones con el entorno son muy
diferentes Centrando la atencioacuten en los derivados de PIPZ se observa que el
ciclo por completo da lugar a una regioacuten ionizable por el efecto del N y las
interacciones electrostaacuteticas del ciclo debidas al plegamiento espacial que
confiere estabilidad Si ahora se estudian las PIPR lo que se puede ver es que el
ciclo pierde interaccioacuten apolar con el medio ya que se plantea un nuevo puente
de hidroacutegeno del grupo NH libre con el resto ASP 34 Esta segunda unioacuten polar
hace que la moleacutecula adquiera menos energiacutea y maacutes estabilidad dentro del
hueco activo que justifica por queacute los derivados de amino-piperidina muestran
maacutes actividad (compuestos 2a y 2f 5a y 5f 6a y 6f)
Los grupos CF3 y NO2 presentes en Ar2 y OH seguacuten el mapa MEP de
potenciales electrostaacuteticos son restos que aportan polaridad a las moleacuteculas La
posibilidad de establecer nuevas interacciones polares maacutes fuertes con sitios del
hueco de la plasmepsina podriacutea explicar por queacute son maacutes activos los
compuestos con estos restos
Con los datos obtenidos en los estudios computacionales se puede proponer
un posible farmacoacuteforo para la plasmepsina II En la figura 89 se ve como las
interacciones maacutes importantes son las descritas teoacutericamente para los enlaces
polares del OH con la ASP214 NH libre con ASP 34 y la posible interaccioacuten del
aacutetomo de fluacuteor de Ar1 con otros restos como tirosina lo que justifica los datos de
actividad de los derivados El resto de interacciones con el sitio activo son
producidas por los restos apolares de la estructura lo que sugiere que es
necesaria la presencia de zonas aromaacuteticas terminales como son los NFT o BZN
en Ar1 y Ar2 Los datos disponibles no permiten establecer una hipoacutetesis sobre
la influencia del tamantildeo de las zonas aromaacuteticas ni de los sustituyentes
presentes en la zona aromaacutetica de Ar2
CONCLUSIONES
Conclusiones
211
El objetivo de este trabajo ha sido la obtencioacuten de nuevos arilaminoalcoholes
como agentes antimalaacutericos para el tratamiento de la malaria resistente al
tratamiento con cloroquina
En las paacuteginas de esta memoria se han presentado los antecedentes del tema
los objetivos fijados y el plan de trabajo para su desarrollo Se ha realizado la
parte experimental correspondiente y ha sido descrito el trabajo realizado en la
preparacioacuten de los compuestos asiacute como en los ensayos bioloacutegicos y
computacionales Finalmente se ha realizado la discusioacuten de los diferentes
resultados obtenidos para obtener unas conclusiones estructura actividad de los
compuestos que se presentan
Desde el punto de vista quiacutemico las aportaciones son las siguientes
1 Se ha sintetizado cuarenta y siete nuevos compuestos derivados de
arilaminas identificados mediante teacutecnicas claacutesicas de elucidacioacuten
estructural como cromatografiacutea de capa fina espectroscopia infrarroja
resonancia magneacutetica nuclear de protoacuten anaacutelisis elemental y punto de
fusioacuten
2 Se ha logrado optimizar rutas sinteacuteticas anteriormente utilizadas para
obtener derivados con mejores rendimientos En el caso de la siacutentesis de
aminas sustituidas se ha comprobado que una relacioacuten molar de amina
protegida-halogenuro de arilo 151 mejora considerablemente los tiempos
de reaccioacuten El uso de esta proporcioacuten de reactivos de partida favorece que
la reaccioacuten finalice en una hora En la obtencioacuten de los derivados
carboniacutelicos por siacutentesis de Mannich la reaccioacuten se optimiza cuando la
temperatura de reflujo se mantiene entre 130 y 140 ordmC De esta forma el
tiempo necesario para completar la reaccioacuten se reduce a un maacuteximo de tres
horas
3 La aplicacioacuten de la cromatografiacutea en columna flash para la purificacioacuten de
23 de los 47 compuestos ha supuesto un notable avance en la obtencioacuten de
los derivados Las condiciones de trabajo se han adaptado a las necesidades
de cada reaccioacuten reducieacutendose asiacute los tiempos globales de siacutentesis
aumentando los rendimientos y disminuyendo los costes
Desde el punto de vista bioloacutegico las aportaciones son las siguientes
1 Diez de los treinta compuestos evaluados in vitro frente a cepas de
Plasmodium falciparum FCR-3 cloroquino resistentes presentan un valor de
CI50 inferior a 1 microM Quince derivados muestran un nivel de citotoxicidad
en ceacutelulas VERO menor de 50 microM Estos resultados permiten confirmar que
la hipoacutetesis de trabajo planteada fue bien dirigida hacia los objetivos
establecidos
2 Los compuestos 2a y 5f fueron seleccionados para desarrollar ensayos in
vivo Los resultados obtenidos no superan los datos de parasitemia y
supervivencia obtenidos en el tratamiento con CQ
3 Los datos obtenidos en los estudios realizados a la totalidad de los
compuestos presentados en este trabajo indican buenas propiedades
fisicoquiacutemicas de solubilidad y distribucioacuten de cargas electrostaacuteticas Con
estos datos teoacutericos se predice un buen perfil de absorcioacuten en el caso de
tratamientos por viacutea oral
4 Los estudios computacionales proponen como diana de los compuestos
desarrollados en este trabajo la enzima Plasmepsina II que interviene en
los procesos de degradacioacuten de la Hb Quedando pendiente su validacioacuten
experimental
5 Siete de los veintiuacuten derivados hidroxiacutelicos que mostraron buenas
actividades in vitro fueron seleccionados para los estudios de acoplamiento
(docking) con la enzima diana plasmepsina II Se obtuvieron buenos
resultados de acoplamiento de los derivados seleccionados en el sitio activo
de la enzima debido a la unioacuten por puente de hidroacutegeno del grupo
hidroxilo con el resto ASP 214 reforzado por el resto de interacciones
electrostaacuteticas de las zonas apolares de la moleacutecula y restos apolares del
hueco activo de la plasmepsina II
De los resultados bioloacutegicos obtenidos se puede establecer la siguiente
relacioacuten estructura-actividad
1 El estudio de la actividad antimalaacuterica ha demostrado que es esencial la
presencia de un grupo hidroxilo en la estructura Queda demostrado que
los compuestos de las Series 1 a 7 muestran actividad significativa frente al
Plasmodium falciparum resistente a la CQ Los derivados cetona (Serie 0) y
oxima (Serie 8) carecen de intereacutes seguacuten los datos de actividad
Conclusiones
213
2 Entre los derivados hidroxiacutelicos los compuestos de las Series 2 5 y 6 son
los que muestran mejores actividades debido a la presencia de un aacutetomo de
fluacuteor en la posicioacuten 5 del benzo[b]tiofeno en la posicioacuten 4 del naftaleno y
para del benceno respectivamente A su vez son los derivados de las Series
5 y 6 (naftalenos y bencenos) los que han mostrado mejores potenciales
antimalaacuterico
3 La longitud miacutenima de la cadena alifaacutetica debe ser tres unidades que
permitan la libre rotacioacuten estructural Los estudios computacionales
plantean que la disminucioacuten de un aacutetomo de carbono de la cadena alifaacutetica
imposibilita la unioacuten esencial de la estructura a la diana propuesta
4 La amina central juega un papel importante en la actividad-toxicidad de las
estructuras Los resultados obtenidos apuntan a que las piperazinas y
tetrahidropiridinas (compuestos 5a 5b 5c 5g 6a y 6g) son las aminas maacutes
adecuadas para formar parte de los compuestos antimalaacutericos por su buena
relacioacuten toxicidad y actividad in vitro Las piperidinas han resultado maacutes
activas (5f y 6f) pero a su vez mas toacutexicas
5 Los sustituyentes o-trifluorometil y p-nitro benceno (compuestos 5a 5f 6a y
6f) confieren en general buena actividad a los derivados estudiados Los
derivados de aril-tetrahidropiridinas sustituidos con un fluacuteor en para
(compuestos 5g y 6g) tambieacuten demuestran buena actividad antimalaacuterica
Con los datos obtenidos del estudio de los derivados sintetizados se ha
establecido un farmacoacuteforo que permite continuar con el refinamiento
estructural de estos nuevos arilaminoalcoholes Queda abierta la viacutea a la
optimizacioacuten de las estructuras la profundizacioacuten en ensayos bioloacutegicos y en el
mecanismo de accioacuten propuesto para la validacioacuten de la diana plasmepsina II
Conclusions
215
CONCLUSIONS
The objective of this work was to obtain new arylamino alcohols as
antimalarial agents for treating chloroquine-resistant malaria
This thesis presents general background information the proposed objectives
and the plan established for developing the work The experimental part was
carried out and a description of the work involved in preparing the
compounds and in performing biological assays and computational analysis
has also been provided Finally this thesis includes a discussion of the all
results obtained and the structure-activity conclusions reached regarding the
compounds presented here
From a chemical standpoint the work carried out made the following
contributions
1 Forty-seven new arylamino-derived compounds (identified by classical
structural elucidation techniques such as thin layer chromatography
infrared spectroscopy proton nuclear magnetic resonance elemental
analysis and melting point) were synthesized
2 Previously used synthetic routes were optimized so as to obtain derivatives
with better yields In the case of the synthesis of substituted amines a molar
ratio of protected amine to aryl halide 151 improves the reaction times
considerably The use of this proportion of starting reagents helps the
reaction to finish in just one hour In obtaining the carbonyl derivatives by
Mannich reaction the reaction is optimized when the reflux temperature is
maintained between 130 and 140 ordmC Therefore time needed to complete the
reaction is reduced to a maximum of three hours
3 Applying flash column chromatography for the purification of 23 out of the
47 compounds has made a notable advance in obtaining the derivatives
The work conditions have been adapted to the specific needs of each
reaction thereby reducing the time needed for syntheses increasing the
yields and bringing down the costs involved
From a biological point of view contributions from this work included the
following
4 Ten out of the thirty compounds evaluated in vitro against chloroquine-
resistant Plasmodium falciparum strain FCR-3 presented an IC50 value less
Conclusions
216
than 1 microM Fifteen derivatives showed a toxicity level in VERO cells that is
less than 50 microM These results show that the established work hypothesis
was a good approach for attaining the proposed objectives
5 Compounds 2a and 5f were selected for developing in vivo assays The
results obtained do not improve the parasitemia and survival data obtained
in treatment with CQ
6 The data obtained from the assays that were performed on all the
compounds presented in this work indicate good physicocochemical
properties of solubility and good electrostatic charge distribution With this
theoretical data a good absorption profile is predicted in the case of orally
administered treatments
7 The computational studies propose the enzyme plasmepsin II as the target
of the compounds that were developed in this study this enzyme is
involved in the degradation processes of Hb although experimental
validation is still pending
8 Seven out of the twenty-one hydroxyl derivatives which showed good in
vitro activity were chosen for docking studies with the target enzyme
plasmepsin II Good docking results were obtained from the selected
derivatives in the active site of the enzyme due to the bonding of the
hydroxyl group with the ASP 214 by means of a hydrogen bridge
reinforced by the rest of the electrostatic interactions from the nonpolar
areas of the molecule and nonpolar rests from the active gap of plasmepsin
II
The following structure-activity relationship has been established from the
biological results that were obtained in the study
9 The antimalarial activity study has demonstrated that the presence of a
hydroxyl group is essential in the study It has been demonstrated that the
compounds from Series 1 to 7 show significant activity against CQ-resistant
Plasmodium falciparum Based on their activity data the ketone (Series 0)
and oxime (Series 8) derivatives are not of interest
10 From among the hydroxyl derivatives compounds from the Series 2 5 and
6 show the best activity due to the presence of a fluorine atom in position 5
of the benzo[b]thiophene in position 4 of the naphthalene and in para
position of the benzene respectively In addition derivatives from the
Conclusions
217
Series 5 and 6 (naphthalenes and benzenes) have shown better antimalarial
potential
11 The minimum length of the aliphatic chain should be three units that
permit free rotation The computational studies suggest that a decrease of
one carbon atom from the aliphatic chain impedes the essential linking of
the structure to the proposed target
12 The central amine plays an important roll in the toxicity-activity of the
structures The obtained results appear to indicate that the piperazines and
tetrahydropyridines (compounds 5a 5b 5c 5g 6a and 6g) are the most
adequate amines for forming part of the antimalarial compounds due to
their good activity-toxicity relationships in vitro The piperidines were more
active (5f and 6f) but they were also more toxic
13 In general the o-trifluoromethyl y p-nitro benzene substituents (compounds
5a 5f 6a and 6f) give good activity to the derivatives that were studied The
aryl-tetrahydropyridine derivatives that are substituted with fluorine in
para position (compounds 5g and 6g) also show good antimalarial activity
With the data obtained from the study carried out on the synthesized
derivatives a pharmacophore has been established which permits continuing
with the structural refinement of these new arylamino alcohols The road for
optimizing structures and advancing in biological testing and in the mechanism
of action proposed for validating the target plasmepsin II remains wide open
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