UNIVERSIDAD ALAS PERUANAS FACULTAD DE MEDICINA HUMANA Y CIENCIAS DE LA SALUD

ESCUELA ACADÉMICO PROFESIONAL DE ESTOMATOLOGÍA

MICROBIOLOGÍA Y PARASITOLOGÍA

GENERAL Y ESTOMATOLÓGICA

GUIA DE PRÁCTICA 2012

AUTOR: Mg CD ELOY GAMBOA ALVARADO

DOCENTES COLABORADORES:

Mg Blgo. Nelson O. Rivera Fernández (Coordinador del Curso).

Mg Blgo. Marco Antonio Mesia Guevara

Mg Blga. Carmen Lesly Castillo Pampas

RECOMENDACIONES GENERALES

1. El estudiante deberá asistir a las clases prácticas correctamente uniformado de blanco y

llevando consigo mandil blanco, gorro, mascarilla y guantes descartables. Además plumón

indeleble para escritura en vidrio y lápices de colores.

2. El alumno que incumpla el ítem anterior no podrá ingresar a sala de prácticas.

3. Está prohibido comer, beber y fumar en sala de prácticas.

4. Sobre la mesa de trabajo sólo colocará materiales, guía práctica y libreta de apuntes.

5. Antes y después de cada práctica el estudiante desinfectará la mesa de trabajo, para lo

cual deberá contar siempre con un frasco de alcohol yodado, algodón y gasa.

6. Finalizada la práctica el estudiante eliminará los materiales de desecho al depósito

correspondiente.

7. Las láminas preparadas deberán ser colocadas en una caja para su archivo.

8. Todas las placas y tubos con medios de cultivo ya usados serán colocadas en las canastillas

para su autoclavado y desecho.

9. Las láminas coloreadas a desecharse deberán ser colocadas en recipientes con boca ancha

conteniendo desinfectante.

10. Los cultivos a incubarse deberán rotularse con los siguientes datos:

a. Nombre o iniciales del estudiante.

b. Nombre del microrganismo, número de mesa, sección y fecha.

c. Las placas se colocarán en forma invertida, salvo indicación contraria del docente.

d. Los tubos deberán estar bien tapados y colocados en gradillas.

e. Los alumnos son responsables de colocar los cultivos en las estufas a temperatura

y tiempo adecuados.

f. Los alumnos son responsables de la observación macroscópica tras la incubación.

11. Al finalizar la práctica, el estudiante se responsabiliza de:

a. Limpiar los objetivos y platina del microscopio con algodón y alcohol isopropílico.

b. Ubicar el objetivo de menor aumento frente al condensador y verificar que no

queden láminas sobre la platina.

c. Desinfectar la mesa de trabajo.

d. Cerrar la válvula de gas.

e. Lavarse las manos con jabón carbólico.

12. El protocolo será controlado por el docente al final de cada práctica.

PRÁCTICA N° 01

EQUIPOS, INSTRUMENTOS Y MATERIALES DEL LABORATORIO DE MICROBIOLOGÍA

OBJETIVOS:

Identificar y reconocer los principales equipos, instrumentos y materiales

utilizados en el Laboratorio de Microbiología.

Familiarizar al estudiante con el manejo y uso adecuado de los equipos,

instrumentos y materiales usados en las diversas prácticas de microbiología.

I. EQUIPOS:

MICROSCOPIO

Aparato óptico formado por un juego de lentes que permiten la observación de la imagen

de un objeto amplificado. Existen varios tipos, siendo los más usados el óptico de campo

claro (hasta 2000x) y el electrónico (hasta 100000x), además existen otros con fines

específicos como los microscopios ópticos de inmunofluorescencia, el de campo oscuro y

el de contraste de fases. Es usado para reconocer características morfológicas, tintoriales y

detectar las diferentes estructuras que poseen los microrganismos.

Partes.

Mecánica.

Óptica.

Sistema de Iluminación.

A. Mecánica:

a) Pie.

b) Platina (Circular o rectangular fija o móvil, el vernier y el sistema de movimiento o tren)

c) Tubo óptico, Revólver.

d) Sistema de Enfoque: Tornillos Micrométricos y Macrométricos (Cremallera)

B. Sistema Óptico:

a) Oculares: 05 – 10 – 20x

b) Objetivos: 05 – 10 – 40 – 100x

Objetivos de observación en seco y en inmersión.

C. Sistema de Iluminación:

a) Espejo: Plano y Cóncavo

b) Condensador.

c) Diafragma filtros.

d) Fuentes de iluminación natural y artificial.

Para determinar el aumento del microscopio se multiplica la cifra del ocular con la del

objetivo; ambas representan el aumento proporcionado por cada lente.

Para la observación microscópica proceda según el siguiente orden:

La elección de la iluminación depende de la fuente de luz, aumentos empleados y

otros factores.

Enfoque de preferencia con el objetivo de menor aumento, que por lo común

tiene un tope inferior que impide la ruptura de las láminas a observar.

Una vez enfocado el objeto, haga rotar el revólver y utilice el objetivo deseado. Al

usar el de inmersión, coloque previamente una gota de aceite de cedro sobre la

preparación. Al colocarse el objetivo en posición debe existir una continuidad

entre ellas. Para el enfoque preciso, use tornillo micrométrico.

Mantener los ojos abiertos, aunque el microscopio sea monocular.

Al terminar la observación limpie le objetivo con papel especial para lente,

algodón o un lienzo fino, embebido con alcohol isopropílico o xilol en pequeña

cantidad y secar. Las láminas ya observadas, se depositarán en un recipiente de

boca ancha con solución sulfocrómica.

AUTOCLAVE

Destinado para la esterilización con calor húmedo y presión (121°C x 15’ a 15 Lbs/pulg2 ).

Permite la esterilización demateriales de desecho, medios de cultivo, ropa quirúrgica, agua

destilada, etc.

HORNO (Horno Pasteur o Poupinel)

Destinado para la esterilización a calor seco. La temperatura usual es 160 – 180°C por 1 – 2

horas. Se esteriliza material de vidrio, de laboratorio e instrumentos metálicos.

ESTUFA O INCUBADORA

Permite obtener temperaturas fijas permanentes gracias a un termostato. La temperatura

se elige según el requerimiento del microrganismo a cultivar. Generalmente es de 37°C.

REFRIGERADOR O NEVERA

Permite obtener temperaturas bajas y se utiliza con fines de conservación de

microorganismos, medios de cultivo, muestras, reactivos, etc. Por lo general se usa a

temperatura de 0 a 4°C.

CENTRIFUGA

Equipo de diversas capacidades y que permite separar una sustancia sólida en suspensión

del líquido respectivo. Se puede centrifugar orina o sangre para obtener el “sedimento

urinario” o “suero” respectivamente.

BALANZA

Se usa en bacteriología para pesar colorantes, medios de cultivo, reactivos, etc. Existen de

diferentes tipos según su aplicación y sensibilidad.

BAÑO MARIA

Permite la transmisión indirecta y atenuada de calor, de un líquido sobre una sustancia a

través de un recipiente contenedor. Evita el calor directo. Se usa entre otras cosas para

licuar medios de cultivo y para inactivar sueros. Existen diversos modelos según aplicación.

AGITADOR MECÁNICO

Equipo de diseño diverso y con frecuencia variable por el número de veces que oscilan por

minuto. Se utilizan para agitar tubos, frascos, pipetas y láminas excavadas.

POTENCIOMETRO

Equipo destinado a determinar la concentración de iones H (pH en una solución).

BOMBA DE VACIO

Produce presión negativa y se utiliza de preferencia para filtrar muestras de agua potable,

a través de una membrana filtrante donde se retienen las bacterias contaminantes.

CONTADOR DE COLONIAS

Utilizado para el recuento de colonias en una placa de cultivo, de manera más exacta y con

mayor facilidad.

II. MATERIALES DE VIDRIO

Materiales que deben ser de buena calidad, resistir acciones mecánicas y cambios bruscos

de temperatura, tener bajo coeficiente de dilatación y una mínima cantidad de álcali libre.

PLACA PETRI

Formado por dos cristalizadores, haciendo de tapa el más grande y de base el más

pequeño. Existen en medidas de 10x60 y 15x100, encontrándose en el mercado incluso

con divisiones internas.

PLACAS BREWER

Son más gruesas y pesadas que las anteriores. La tapa encaja perfectamente sobre la base,

dejando espacio sólo el necesario para colocar el medio de cultivo. Es usado generalmente

para el aislamiento y cultivo de microrganismos anaerobios.

TUBOS DE PRUEBA (Tubos de ensayo).

Presentes en tamaños variados y cuyas medidas se dan en mm del diámetro de la boca y el

largo del tubo. Los más frecuentes son de 13x100 mm, 16x150 mm y 18x150 mm. Una

variante de ellos posee tapa de bakelita y se emplea para realizar pruebas bioquímicas,

cepario, estudios de fermentación, reacciones diversas, etc. Los tubos para centrífuga son

de paredes gruesas y de fondo cónico, pueden tener graduación y sirve para reunir el

sedimento de los líquidos.

MATRACES Y BALONES

Recipientes de base esférica con fondo plano y forma cónica o de globo, con cuello de

boca ancha que termina en reborde. Existen con medidas volumétricas desde 50 ml hasta

5000ml, y son empleados para la preparación de medios de cultivo, colorantes, soluciones,

reactivos diversos, etc.

PIPETAS

De forma tubular y abierta en ambos extremos, graduado en su extremo proximal y son

usados para medir soluciones en cantidades pequeñas y exactas. Son de diversas clases:

Pipetas con bulbo, llamadas así por el abultamiento que presentan en su parte intermedia;

Pipetas de sangre, que poseen un pequeño bulbo y graduaciones que permiten relaizar

diluciones en citometría hemática; también están las Pipetas Pasteur que no poseen

marcas ni graduaciones y son utilizadas para medir volúmenes pequeños.

Las pipetas poseen las siguientes abreviaturas: TC (Tocontainer), las que contiene un

determinado volumen , pero al vaciar no suministra la totalidad del líquido; y TD

(Todeliver), al vaciar la pipeta suministrará la totalidad del volumen especificado.

PROBETA

De paredes gruesas y graduadas, con base para estabilidad. Existen de diferentes

capacidades, de 10 a 1000ml, y son usadas para medir soluciones o sustancias líquidas.

FIOLAS

Matraces volumétricos con cuello largo y base globosa, poseen una línea de aforo y son

usados para la preparación de reactivos valorados.

MATRAZ DE PRECIPITADO

Recipientes cilíndricos de boca ancha y con pico en el borde. Generalmente se usa para

preparar soluciones diversas.

LAMINAS PORTA Y CUBREOBJETOS

Láminas de vidrio rectangulares o cuadrangulares con diferentes dimensiones, las más

comunes son de 65x35 mm y 22x22mm. Son usadas para hacer extensiones y coloraciones

de muestras biológicas y observaciones en fresco.

En otros materiales de vidrio pueden considerarse embudos, jeringas hipodérmicas,

frascos, goteros, baguetas, perlas de vidrio, etc.

III. OTROS MATERIALES

MANGOS DE KOLLE

Vástagos de metal con cubierta de ebonita (aislante de calor), en cuyo extremo distal

presenta una tuerca para insertar el alambre de platino o micrón que formará el asa de

siembra. Usado en la toma de muestras de microrganismos y en la siembra de los mismos.

ESPÁTULAS DE METAL

Usado para pesar medios de cultivo y reactivos. Los de níquel no se oxidan.

TRIPODE

Soporte de tres pies generalmente de metal, empleados para soportar recipientes durante

el calentamiento.

Entre otros materiales también se consideran: soportes universales, agujas hipodérmicas,

gradillas para tubos de ensayo, rejillas de asbesto, tapones de jebe, mangueras de jebe,

papel indicador de pH, etc.

CUESTIONARIO

1. Dibuje los diferentes equipos y materiales de laboratorio estudiados.

2. Describa y esquematice el modo de usar una pipeta y una placa Petri.

3. Qué material de laboratorio utilizaría para medir volúmenes pequeños y exactos?.

4. Qué equipo de laboratorio utilizaría para esterilizar medios de cultivo?.

PRÁCTICA N°02

COLORANTES Y COLORACIONES BACTERIANAS

OBJETIVOS

Identificar y reconocer los colorantes y las principales técnicas de coloración utilizadas en

Bacteriología.

Identificar y reconocer la estructura y morfología bacterianas.

INTRODUCCION

COLORANTE: Sustancia química de origen natural o sintético que otorga color.

Por su naturaleza, se clasifican en colorantes naturales y artificiales.

Naturales: Son de origen animal y vegetal. Ejemplo: El Carmín es obtenido de la cochinilla,

la hematoxilina y el tornasol que son obtenidas de las plantas.

Artificiales o Sintéticos: Obtenidos como derivados del carbón de piedra o hulla. Son

conocidos como anilinas. Ejemplo: azul de etileno, safranina, violeta de genciana, atc.

Por su afinidad tintorial, es decir de acuerdo al comportamiento químico del colorante, se clasifica

en:

a) Colorantes Ácidos

b) Colorantes Básicos.

c) Colorantes Neutros.

a) Colorantes Ácidos: Se dice que un colorante es ácido o aniónico, cuando la parte básica o

catiónica es incolora y la parte ácida o aniónica es coloreada, teniendo afinidad poe le

citoplasma. Ejemplo: Ácido pícrico, Eosina, Fucsina ácida, etc.

b) Colorantes Básicos: Son los colorantes que tienen la parte básica o catiónica coloreada y la

parte ácida o aniónica incolora. Tienen afinidad por el núcleo. Ejemplo: Violeta de

genciana, Fucsina básica, Tionina, etc.

c) Colorantes Neutros: Son los colorantes que tienen la parte ácido y básica coloreada y

tiñen al núcleo de un color y al citoplasma de otro. Ejemplo: Leishman, Giemsa, Wright,

Eosinato azul de metileno, etc.

COLORACIÓN O TINCIÓN

Proceso en el que se produce un intercambio de iones entre los colorantes y los sitios activos de la

superficie o del interior de la célula.

Las coloraciones según el número de colorantes pueden ser:

A) Simples

B) Diferenciales

C) Especiales

A) COLORACIONES SIMPLES.

Son aquellas coloraciones que utilizan un solo colorante para la observación de la

morfología de los microrganismos. Ejemplos: Coloración de azul de metileno, Tinta china y

la de azul de lactofenol.

B) COLORACIONES DIFERENCIALES.

Son aquellas coloraciones que utilizan más de un colorante. Generalmente al primer

colorante se le denomina Colorante Primario, mientras que al segundo se le denomina

Colorante Secundario o de Contraste. Permiten observar diferencias entre células

bacterianas o partes de la estructura bacterianas. Ejemplos: Coloración Gram y Coloración

de ZiehlNeelsen (también llamada ácido alcohol resistente).

C) COLORACIONES ESPECIALES.

Cuando se utilizan colorantes que permiten reconocer ciertas estructuras celulares.

Ejemplo: Giemsa, Wrigth, Leishman, Vago, etc.

PASOS GENERALES DE UNA COLORACIÓN:

a) Extensión: Consiste en colocar la muestra sobre una lámina portaobjetos, extendiéndola

uniformemente.

b) Fijación: Fijar la muestra sobre la lámina portaobjeto utilizando alcohol, éter o flameado

suavemente sobre el mechero o simplemente dejarlo al medio ambiente.

c) Tinción: Se utiliza el colorante requerido cubriendo la muestra en su totalidad por un

tiempo determinado.

d) Lavado: Enjuagar usando un chorro suave de agua.

e) Secado: Dejar secar la lámina al calor del mechero.

f) Observación: Observar con el objetivo de inmersión usando el aceite de cedro.

COLORACION DE AZUL DE METILENO

1. Prepara un frotis con la muestra bacteriana y fijar al calor.

2. Cubrir el frotis con 3 gotas del colorante azul de metileno y dejar actuar por 3 – 5 minutos.

3. Lavar con chorro tenue de agua y dejar secar.

4. Observar al microscopio con objetivo de inmersión y aceite de cedro.

RESULTADO: Los microrganismos se observan de color azul intenso.

PROTOCOLO

COLORACION SIMPLE

MORFOLOGÍA DEL MICROORGANISMO

ESQUEMA DE LA OBSERVACIÓN

AZUL DE METILENO

COLORACIÓN GRAM

1. Dividir la lámina en 3 partes: 1/3 para rotular y 2/3 para la preparación del frotis.

2. Con el asa bacteriológica previamente esterilizada, tomar la muestra y realizar un frotis en

el centro de la lámina portaobjeto, extendiéndola en espiral del centro a la periferia, para

obtener una preparación en capa fina.

3. Fijar la muestra, mediante el secado completo del frotis por flameado con la ayuda del

mechero.

4. Colocar la lámina sobre la varilla o puente de coloración.

5. Cubrir el frotis con 03 gotas de Cristal Violeta (colorante primario), dejar actuar por 2

minutos.

6. Lavar con agua corriente (evitar la caída directa del chorro sobre el frotis).

7. Cubrir con Lugol durante 1 – 2 minutos.

8. Lavar con agua.

9. Decolorar el frotis con la solución de Alcohol Acetona (inclinar la lámina y decolorar hasta

que no arrastre colorante), máximo por 30 segundos.

10. Lavar con agua.

11. Cubrir con 03 gotas del colorante de contraste Safranina durante 2 minutos.

12. Lavar con agua.

13. Secar a temperatura ambiente o con la ayuda de la llama del mechero.

14. Observar al microscopio con el objetivo de inmersión.

RESULTADO: Las Bacterias Grampositivas se colorean de violeta y las Bacterias Gramnegativas

de color rojo grosella o rosado.

PROTOCOLO

CATEGORÍA BACTERIANA

MORFOLOGÍA BACTERIANA ESQUEMA DE LA OBSERVACIÓN

GRAMPOSITIVAS

GRAMNEGATIVAS

COLORACIÓN DE ZIEHL NEELSEN

1. Cubrir el frotis con 05 gotas de Fucsina Fenicada y calentar la preparación con el mechero

de alcohol hasta apreciar el desprendimiento de vapores, repetir este procedimiento por

03 veces, evitando que hierva el colorante.

2. Lavar con agua corriente.

3. Decolorar con Alcohol Ácido hasta que se aprecie una coloración rosada, máximo hasta 01

minuto.

4. Lavar con agua corriente.

5. Cubrir con el colorante de contraste, Azul de Metileno, 03 gotas, durante 01 minuto.

6. Lavar con agua corriente.

7. Secar y observar con objetivo de inmersión.

RESULTADO: Las bacterias ácido alcohol resistentes se tiñen de color rojo y las no ácido

alcohol resistente se tiñen de color azul.

PROTOCOLO

LÁMINA

MORFOLOGÍA DEL MICROORGANISMO

ESQUEMA DE LA OBSERVACIÓN

COLORACIÓN DE ZIEHL NEELSEN

CUESTIONARIO

1. ¿Qué tipo de colorantes son el azul de metileno, tinta china y el azul de lactofenol?

2. ¿Cuáles son los componentes del azul de metileno?

3. ¿Qué estructura de la bacteria se colorea con el azul de metileno?

4. ¿A qué se debe que las bacterias Gramnegativas no retengan el complejo cristal violeta-

yodo?

5. ¿A qué se debe que los colorantes básicos tiñan el núcleo de la célula?

6. ¿Con qué clase de colorante teñiría el protoplasma de la célula?

7. ¿Para qué clase de microrganismos es recomendable la coloración ácido alcohol

resistente?

8. ¿Cuál es la función de la fucsina fenicada?

9. ¿A qué se denomina colorante primario y colorante de contraste?

PRÁCTICA N° 03

MEDIOS DE CULTIVO

OBJETIVOS

Identificar y reconocer los medios de cultivo de uso frecuente en microbiología.

Conocer y describir los requerimientos nutricios necesarios para el crecimiento de

microrganismos.

Preparar y autoclavar medios de cultivo.

INTRODUCCIÓN

MEDIOS DE CULTIVO

El término Cultivo hace referencia al crecimiento de microrganismos, por lo que los medios de

cultivo son sustancias nutritivas líquidas o solidas, que sirven en laboratorio para proporcionar

sustrato nutritivo para el crecimiento y multiplicación de los microorgansimos. Sus componentes

básicos deben satisfacer las exigencias nutricionales para el crecimiento microbiano y varian según

el tipo de bacteria.

Las condiciones que deben tomarse en cuenta para el crecimiento en medio de cultivo son:

Temperatura.

Grado de humedad.

Presión de oxígeno.

pH.

Los medios de cultivo permiten:

Crecimiento y desarrollo de microrganismos.

Aislamiento e identificación de los microrganismos.

Clasificación de los microrganismos.

Obtención de productos microbianos.

Obtención de cepas microbianas para la fabricación de vacunas.

Obtención de toxinas para la síntesis de antitoxinas

Para su crecimiento los microrganismos deben tomar del ambiente que lo rodea, todas las

sustancias que requiere para la síntesis de sus materiales celulares y energía. A estas sustancias se

les denomina nutrientes y un medio de cultivo debe tener la concentración adecuada de los

mismos acorde a los requerimientos específicos de los microrganismospara los que han sido

preparados. Y siendo los microrganismos extraordinariamente diversos, los medios de cultivo son

también muy diversos en cuanto a número y características nutricias.

AGUA

Para la preparación de medios de cultivo y reactivos diversos, sólo debe utilizarse agua destilada o

agua desmineralizada, libres de metales disueltos y compuestos bactericidas o bacteriostáticos.

EXTRACTO DE CARNE

Se puede usar cualquier marca de extracto de carne siempre y cuando produzca resultados

positivos, lo que no se debe usar es la infusión de carne.

PEPTONA

Es una proteína degradada para su fácil asimilación por los microrganismos. Se puede utilizar

cualquier peptona que previas pruebas conduzcan a resultados satisfactorios en el crecimiento de

microrganismos.

AZUCARES

Todos los azúcares usados para la preparación de medios de cultivo deben ser químicamente

puros y adecuados para propósitos bacteriológicos.

AGAR

Agente gelatinoso obtenido de algas marinas y que se emplea de forma granular o fragmentado

para la preparación de medios de cultivo.

REACTIVOS GENERALES

Todos los reactivos generales utilizados como ingredientes en los medios de cultivo deben ser de

grado ACS o de calidad analítica.

COLORANTES

Para la preparación de los medios de cultivo sólo deben emplearse colorantes certificados.

A partir de estos ingredientes es posible preparar un medio de cultivo capaz de permitir el

crecimiento y desarrollo de diversos microrganismos heterótrofos.

TIPOS DE MEDIO DE CULTIVO

A los medios de cultivo se les puede clasificar de las siguientes maneras:

I. SEGÚN SU ESTADO FÍSICO

1. MEDIOS LIQUIDOS: Son los que se presentan en este estado. Se les denomina

Caldos.

2. MEDIO SÓLIDOS: Se preparan a partir de los medios líquidos , a los cuales se les

adiciona un agente gelificante, el Agar agar. Se les denomina Agares. 3. MEDIOS SEMISÓLIDOS: Se les prepara a partir de los medios líquidos y a los que

se les adiciona un agente gelificante pero en menor proporción que para los

sólidos. II. SEGÚN LA FUNCIÓN QUE CUMPLEN:

1. MEDIOS COMUNES: Son aquellos que poseen los componentes esenciales

mínimos para permitir el crecimiento de bacterias que no necesiten

requerimientos especiales. Ejemplos: Agua peptonada, Agar Nutritivo, Agar TSA

(Agar Tripticasa Soja), Agar Gelatina, Caldo Nutritivo, etc.

2. MEDIOS ESPECIALES: Son aquellos que se formar a partir de un medio común al

cual se le adiciona diversas sustancias de acuerdo a la finalidad deseada. Pueden

ser:

2.1. MEDIOS ENRIQUECIDOS: Cuando se les adiciona sustancias de mayor poder

nutritivo como huevos, extracto de levadura, sangre, vitaminas, etc. Sirven

para cultivar microrganismos exigentes en sus necesidades nutricionales. de

Ejemplos:

Agar Sangre: Cuando a un medio común se le adiciona entre 5 y 10%

de sangre. Permite el cultivp de bacterias patógenas.

Agar Ogawa o Lowenstein – Jensen: Medio enriquecido que permite el

cultivo de Mycobacterium tuberculosis(Bacilo de Koch).

Agar Chocolate: Se sintetiza al calentar el agar sangre a temperatura

entre 60 – 80°C, tomando el color chocolate característico. Sirve para

el crecimiento de Neisseria meningitis (meningococo) y

Neisseriagonorrhoeae (gonococo).

Caldo Cerebro – Corazón (Brain, Heart Infusión. BHI): Sirve para

microrganismos exigentes.

Caldo de Carne, Hemina y Vitamina K: Permite el crecimiento de

microrganismos anaerobios exigentes.

2.2. MEDIOS SELECTIVOS: Son medios de cultivo que tienen la finalidad de

favorecer el crecimiento y desarrollo de una bacteria y al mismo tiempo

inhibir el desarrollo de otras. Para este fin se le adicionan sustancias con

efectos INHIBIDORES tales como sal, colorantes, antibióticos o sales biliares. A

estos medios también se les denomina Medios de Aislamiento. Ejemplos:

Agar Mac Conkey, para E.coli y otras enterobacterias.

Agar Cetrimide, para Pseudomonas.

Agar Manitol Salado, para estafilococos.

Agar MitisSalivarius, para estreptococos orales.

Agar Clindamicina, para Eikenellacorrodens.

Agar GMC (Gelatina, Metronidazol y Cadmio), para el asilamiento de

Actynomicesviscosus, Actynomicesnaeslundi y

Actynomicesodontolyticus.

Agar TCBS, para Vibriumcholerae.

Agar Sabouraud, para hongos.

2.3. MEDIOS DIFERENCIALES: Son los medios que permiten evidenciar las

actividades bioquímicas de un microrganismo frente a sustrato determinado,

cambiando sus características observables y permitiendo su identificación.

Ejemplos:

Medio Ox – Ferm, para procesos de Oxidación y Fermentación.

Citrato de Simmons, para determinar el uso del citrato como fuente

decarbono.

TSI (Triple Azúcar Hierro), para determinar el uso de Lactosa, Glucosa

y producción de H2S.

LIA (Lisina Agar), para determinar el metabolismo de la Lisina.

Agar Manitol Salado, para determinar la reacción con el Manitol.

Agar Urea.

Agar SIM.

2.4. MEDIOS DE TRANSPORTE: Medios especiales que mantienen viables a los

microrganismos y permiten su transporte desde el lugar de muestra hasta el

laboratorio. Ejemplos:

Medio Cary Blair.

Medio Stuart.

Medio Amies.

Caldo Hajna.

Caldo de Tioglicolato.

A veces se combina las características de cada un de estos medios y por lo tanto el medio

resultante será Enriquecido, Selectivo y Diferencial. Esta clasificación es flexible y se plantea con

fines didácticos.

PREPARACION DE MEDIOS DE CULTIVO

MATERIALES:

Agar común deshidratado.

Placas Petri.

Tubos de ensayo.

Mechero.

Algodón.

Gasa.

Papel kraft.

Hilo pavilo.

Matraces o balones.

Cocina eléctrica.

Plumón marcador.

PROCEDIMIENTO

Pesar los medios respectivos en relación con los volúmenes requeridos.

Disolver los medios en agua destilada y hervir en un matraz.

Esterilizar en autoclave a 121°C/15PSI por 15’.

Repartir en placas y tubos dentro del área de seguridad que brinda el mechero.

Se comprueba la esterilidad de los medios colocándolos en la estufa a 37°C por 24 horas.

CUESTIONARIO

1. Investigue y señale la composición del Agar Nutritivo y Agar Sangre.

2. Indique 05 medios de cultivo selectivos y su importancia.

3. esquematice las precauciones que se debe tener en la preparación de los medios de

cultivo: pesado, preparado y autoclavado.

4. Esquematice y dibuje lo realizado.

PRÁCTICA N°04

SIEMBRA Y AISLAMIENTO DE BACTERIAS – LECTURA E INTERPRETACIÓN DE COLONIAS

OBJETIVOS:

Conocer e identificar las diferentes técnicas de siembra y aislamiento de muestras

microbianas en medios de cultivo.

Conocer e identificar los tipos y características de crecimiento bacteriano en medios de

cultivo para su identificación final.

INTRODUCCIÓN

I. SIEMBRA Y AISLAMIENTO DE BACTERIAS

Cuando las bacterias se siembran en un medio de cultivo y en condiciones adecuadas, ocurre un

incremento marcado del número de células. Algunas especies alcanzan una población máxima a

las 24 horas y otras necesitan un periodo prolongado para alcanzar su máximo desarrollo. Por esta

razón la siembra es uno de los pasos principales e iniciales del estudio completo de un

microrganismo y es indispensable ejecutarlo cumpliendo con las máximas condiciones de

esterilidad, desde la toma de muestra hasta la siembra, que debe ser efectuada a la brevedad

posible.

Es necesario precisar algunos términos:

SIEMBRA: Es el procedimiento por el cual se pone en contacto un microrganismo con el medio de

cultivo. Si el medio es sólido se formarán colonias y si el medio es líquido se observará turbidez,

sedimento, película, etc.

RESIEMBRA O AISLAMIENTO: Consiste en extraer, con un asa o aguja de kölle, una fracción de

colonia y sembrarla en un medio líquido o sólido, logrando así la pureza del cultivo.

TRANSPLANTE O REPICAJE: Consiste en la separación primaria de la cepa a un medio de cultivo

adecuado contenido en un tubo. Conservándose la cepa pura y por seguidos transplantes en

medios especiales, se conocerá las propiedades culturales y bioquímicas, lográndose su

identificación específica de aquella. Los transplantes se pueden realizar:

a) De líquido a sólido.

b) De líquido a líquido.

c) De sólido a líquido.

d) De sólido a sólido.

COLONIA: Es el conjunto de microrganismos resultantes del crecimiento y multiplicación en un

medio de cultivo sólido, y que está constituido por un mismo tipo de microrganismos.

CULTIVO PURO: Cultivo que consta de una sola especie bacteriana a partir de la cual se estudia sus

características morfológicas, fisiológicas y bioquímicas.

CEPA: Es un cultivo puro plenamente identificado y ubicado en su taxonomía correspondiente.

MUESTRA BIOLÓGICA: Es cualquier material biológico de origen humano susceptible de

conservación y que alberga microrganismos. Pueden ser: sangre, orina, esputo, heces, LCR, uñas,

pelos, fluido gingival, paca dental, saliva, abscesos, etc.

TÉCNICAS DE SIEMBRA

La técnica de siembra a utilizar varía según el medio de cultivo a usar, ya sea líquidos o sólidos. Si

es líquido la Siembra por Inoculación será la indicada; si el medio es sólido las técnicas a usar

pueden ser Estría Simple, Por Puntura, Por Incorporación o Por Dispersión o Agotamiento.

SIEMBRA POR INOCULACIÓN

Con el asa de siembra previamente esterilizada, tomar una cantidad

suficiente de inóculo y ponerla en contacto con el medio líquido.

SIEMBRA POR ESTRÍA SIMPLE

Útil para estudio bioquímico y desarrollo bacteriano. Consiste en deslizar suavemente, en zigzag,

el asa de siembrasobre el medio de cultivo sólido contenido en una placa Petri o tubo.

SIEMBRA POR PUNTURA O PICADURA

Sirve para estudio bioquímico bacteriano. Con la aguja de kolle, tomar una pequeña cantidad de

muestra y sembrar introduciendo la aguja hasta cerca del fondo del tubo que contiene medio

sólido(a); después al momento de retirar la aguja de abajo hacia arriba hacer una estría simple(b).

SIEMBRA POR INCORPORACIÓN

Técnica que sirve para el recuento de bacterias y determinar si son anaeróbicas facultativas o

microaerófilas. Consiste en diluir la muestra y añadir el medio de cultivo licuado y enfriado a 45°C,

luego repartir la mezcla en placas Petri, dejar enfriar e incubar.

a)

b)

SIEMBRA POR DISPERSION O AGOTAMIENTO

Técnica utilizada para obtener colonias aisladas y consiste en repartir el inóculo sobre la superficie

del medio sólido en zigzag en 4 o 5 campos de la placa o también por estría simple en toda la

placa.

MATERIALES

Agar TSA en placas y tubos.

Caldo nutritivo.

Mechero.

Asas de siembra.

Aguja de kölle.

Hisopos.

Solución salina fisiológica.

Tubos de ensayo

Láminas portaobjetos.

PROCEDIMIENTO

Identificar la técnica adecuada para la siembra y proceder a realizarla ya sea en un medio

líquido o sólido. Siempre con el asa o aguja de siembra esterilizada antes y después de su

uso.

La boca de los tubos se flamean al destaparlos y antes de volver a tapar.

Las manipulaciones de siembra se deben realizar en el área de seguridad que brinda el

mechero.

Giro de placa

45°

45° 45°

45°

Una vez realizada la siembra y rotuladas las placas y tubos, proceder a incubar en la estufa

a 37°C por 24 horas, al cabo de las cuales se hace la lectura correspondiente.

LECTURA E INTERPRETACIÓN DE COLONIAS

Si se han seguido correctamente las técnicas de siembra y cultivo, sobre algunos planos del medio,

se podrá visualizar masas microbianas definidas y separadas entre si, llamadas colonias en medio

sólido; y turbidez, sedimento, película o flóculos en medio líquido.

Cada colonia es el resultado de la multiplicación logarítmica de una bacteria depositada en un

punto del medio sólido, que en condiciones óptimas de crecimiento forman una progenie con sus

características de especie o de grupo, las cuales nos permitirán su identificación.

Las principales características morfológicas que presentan las colonias son:

FORMA: Circular, elíptica, puntiforme y filamentosa.

ELEVACIÓN: Plana, convexa, acuminada, umbilicada.

BORDE: Entera, ondulado, dentado, filamentoso.

SUPERFICIE: Lisa, rugosa, granulada.

TAMAÑO: Diámetro en milímetros.

CONSISTENCIA: Cremosa, membranosa, mucosa.

CROMOGENENESIS: Pigmentación verde, amarilla, roja, etc.

GRADO DE TRANSPARENCIA: Transparente, translúcido, opaco.

MATERIALES

Cultivos en placa Petri, sembradas por técnicas diversas.

Cultivos en medio diferenciales de diferentes microrganismos.

Set de coloración Gram.

Lápices.

Gradilla.

Microscopio.

Aceite de cedro.

PROTOCOLO

TÉCNICA DE SIEMBRA

DESCRIPCIÓN DE LA SIEMBRA

MEDIO DE CULTIVO USADO

ESTRÍA SIMPLE

DISPERSIÓN AGOTAMIENTO

PUNTURA

INOCULACIÓN

CARACTERISTICAS DE LA COLONIA

OBSERVACIÓN DE COLONIAS

MEDIO DE CULTIVO USADO

FORMA

ELEVACIÓN

BORDES

SUPERFICIE

TAMAÑO

CONSISTENCIA

CROMOGÉNESIS

GRADO DE TRANSPARENCIA

RESULTADO DE SIEMBRAS REALIZADAS:

CUESTIONARIO

1. Cuál es el fin de usar una siembra por estría simple?

2. Cuál es el objetivo de la siembra por estría por dispersión o agotamiento?

3. Para qué sirve la siembra por puntura?

4. De sus placas y tubos sembrados, describa las características morfológicas de las colonias

encontradas.

5. Esquematice las observaciones de la práctica.

PRÁCTICA N°05

PRIMERA PRÁCTICA CALIFICADA

PRÁCTICA N°06

METABOLISMO BACTERIANO

OBJETIVOS:

Reconocer e identificar los diferentes sistemas enzimáticos usados en el metabolismo

bacteriano.

Utilizar las características metabólicas para el aislamiento e identificación bacteriana.

INTRODUCCIÓN

La identificación bacteriana en forma inicial pude realizarse mediante la determinación de las

características de las colonias y a través de las diferentes tinciones; sin embargo para identificar

una bacteria desconocida a nivel de género y especie, no basta con un aislamiento, sino que deben

llevarse a cabo ciertos estudios de los sistemas enzimáticos que son únicos para cada género y

especie y sirvan como marcadores de identificación.

A nivel de laboratorio, estos sistemas enzimáticos se van a identificar sembrando una porción de

colonia bacteriana aislada en los diferentes medios de cultivos que contienen sustrato e

indicadores químicos específicos que nos permiten detectar cambios de pH o la presencia de

subproductos específicos, características que nos permitirán la identificación bacteriana.

I. REACCIONES DE OXIDACION – FERMENTACION DE AZUCARES

MEDIO TSI (Triple Sugar Iron)

Este medio de cultivo fue diseñado para la diferenciación de bacilos gramnegativos,

basándose en la capacidad de estas bacterias para fermentar azúcares, producir sulfuro

de hidrogeno (H2S) y producir Gas.

El medio contiene tres carbohidratos: glucosa, lactosa y sacarosa en proporciones de

1:10:10 respectivamente, y para detectar los productos ácidos generados, se emplea u

indicador de pH, el rojo fenol, cuyo rango de viraje está entre pH 8.4 (rojo) y pH 6.8

(amarillo). Los patrones de fermentación de los bacilos gramnegativos ante los azúcares

presentes en el medio, pueden ser fundamentalmente tre:

a) Fermentación de glucosa únicamente.

b) Fermentación de glucosa + lactosa, glucosa + sacarosa o glucosa + ambos

carbohidratos.

c) No fermentación de carbohidratos.

Como producto de fermentación de los azucares, se puede formar Gas, que se detecta por

la presencia de burbujas, grietas o desplazamientos del medio de cultivo en el tubo.

De igual manera al medio se le ha adicionado Tiosulfato de Sodio como fuente de azufre

para generar H2S, y sales de hierro que al reaccionar con el gas forman un precipitado de

color negro insoluble denominado Sulfuro ferroso (FeS).

MATERIAL

Tubo con TSI en plano inclinado.

Cepas de control: Escherichia coli, Staphylococcus aureus y Salmonella typhi.

PROCEDIMIENTO

Con el asa de kolle, haga una siembra por puntura en el tubo con TSI.

Rotular e incubar a 37°C por 24 horas.

INTERPRETACION

1. FERMENTACIÓN DE AZUCARES

Alcalina/alcalina: Lactosa y Sacarosa (-), Glucosa (-) (K/K): Rojo/rojo o anaranjado

Ejemplo: Pseudomonas

Acida/Acida: Lactosa y Sacarosa (+) y Glucosa (+) (A/A): Amarillo/ amarillo

Ejemplo: E. coli, Klebsiella, Citrobacter, Enterobacter, etc

Alcalina/Acida: Lactosa y Sacarosa (-) y Glucosa (+) (K/A): Rojo/amarillo

Ejemplo: Salmonella (H2S+), Shigella (H2S -), Yersinia.

2. PRODUCCION DE H2S

Producción de pigmento negro en fondo de tubo: H2S (+)

No pigmento negro en fondo de tubo: H2S (-)

3. PRODUCCION DE GAS

Presencia de burbujas, grietas o desplazamiento en medio : Gas (+)

No burbujas, no grietas, no desplazamientos: Gas (-)

II. PRUEBA DE LA CATALASA

La Catalasa es una enzima que posee la mayoría de las bacterias aerobias y anaerobias

facultativas y que va a convertir el peróxido de hidrógeno (H2O2) en agua y oxigeno, de

acuerdo a la siguiente reacción:

2H2O2 2 H2O + O2

El peróxido de hidrogeno es uno de los productos finales del metabolismo oxidativo de los

carbohidratos y si se acumula es letal para el microorganismo.

Esta prueba es vital para la diferenciación de los estreptococos (catalasa negativa) y los

estafilococos (catalasa positiva)

MATERIALES

Cepas control: S. aureus y Streptococcus o Enterococcus.

Solución de peróxido de hidrogeno (H2O2) al 3%.

Láminas portaobjeto.

Asa de siembra.

Gotero.

PROCEDIMIENTO

Con el asa de siembra estéril, transferir parte el inóculo a una lámina portaobjeto.

Añadir 1 o 2 gotas de H2O2 al 3%.

Observar si se forman burbujas o no inmediatamente después de añadir las gotas

de H2O2 al 3%.

Descartar la lámina en un recipiente con desinfectante.

Precauciones: La prueba debe realizarse en cultivos hasta de 24 horas, cultivos

más viejos pueden perder su actividad catalasa dando un falso negativo. Además

evitar el contacto de peróxido de hidrogeno con la piel.

INTERPRETACION

Formación de burbujas o efervescencia : Catalasa Positiva.

No formación de burbujas y efervescencia : Catalasa Negativa.

Nota: Algunas bacterias poseen enzimas diferentes a la catalasa que descomponen el

H2O2 dando pocas burbujas diminutas durante 20 – 30´, estas no son Catalasa positiva.

III. PRUEBA DE LA CITOCROMO OXIDASA

Los Citocromos son hemoproteínas que actúan como último eslabón de la cadena

respiratoria aerobia, transfiriendo electrones (H) al oxigeno con formación de agua. Este

sistema de citocromos se encuentran en los microrganismos aerobios y anaerobios

facultativos, permitiéndonos identificar a los microrganismos que carecen de la enzima y

los anaerobios anaerobios estrictos.

En laboratorio se ahce reaccionar a la bacteria con un sustrato oxidable como el dimetil o

tetrametil - p – fenilendiamina (Reactivo de Kovacs), y que se presenta en solución, discos

o tiras llamados comúnmente oxidasa.

MATERIAL

Cepa control: sembrada previamente en agar nutritivo.

Reactivo oxidasa.

Goteros.

PROCEDIMIENTO

Método Directo: Se añade directamente a las placas sobre las colonias bacterianas

02 o 03 gotas del reactivo oxidasa.

INTERPRETACION

Colonias bacterianas con actividad citocromo oxidasa viran a color lavanda :

Oxidasa Positivo

Colonias bacterianas sin actividad citocromo oxidasa no viran de color :

Oxidasa Negativo

IV. PRUEBA DEL MANITOL

Para esta prueba se utiliza el agar manitol salado, medio de cultivo selectivo y diferencial

que permite el crecimiento de estafilococos, y que en su composición cuenta con el

sustrato Manitol, el cual tras su fermentación se libera ácidos que serán detectados por el

indicador rojo fenol el cual hará viraje a color amarillo.

Esta prueba permite diferenciar Staphylococcus aureus del Staphylococcus epidermidis y

otras especies perteneciente a este género bacteriano.

MATERIAL

Cepas de S.aureus y S. epidermidis.

Placas Petri con agar manitol salado.

Asas de siembra.

PROCEDIMIENTO

Realizar siembra por estría simple de ambas cepas bacterianas.

Rotular e incubar a 37°C por 24 horas.

INTERPRETACION : A la observación macroscópica de las colonias bacterianas en agar

manitol salado:

Presencia de colonias amarillas y medio con halos de color amarillo :

Manitol Positivo

Presencia de colonias blancas o cremas con medio sin cambio de color:

Manitol Negativo

V. PRUEBA DE LAS HEMOLOSINAS

Algunos microorganismos tienen la capacidad de producir enzimas y toxinas que pueden

ser detectadas al sembrar los microorganismos en placas con Agar Sangre, produciendo la

lisis de los eritrocitos. Esta capacidad de los microorganismos se relaciona directamente

con su virulencia y patogenicidad. Ahora según el tipo de lisis que producen se pueden

clasificar en Hemolisinas Alfa, que producen una lisis parcial o incompleta de eritrocitos; y

Hemolisinas Beta, productoras de una lisis total o completa.

MATERIAL

Cepa bacteriana.

Placas con Agar Sangre.

PROCEDIMIENTO

Con el asa de kölle realizar una siembra por estria simple en una placa con agar

sangre.

Incubar a 37°C por 24 horas.

INTERPRETACION

Hemólisis Parcial ------- Presencia de halos verduzcos grisáceos -------- Hemólisis Alfa

Hemólisis Total ------- Presencia de halos transparentes -------- Hemólisis Beta

No hemólisis ------- No presencia de halos -------- Hemólisis Gamma

En la hemolisis alfa, el enverdecimiento del medio se debe a la salida de un derivado del

tipo de la metahemoglobina, que al ser oxidado ser convierte en un compuesto del tipo de

la biliverdina.

VI. PRUEBA DE LA COAGULASA

La coagulasa es una proteína producida por varios microorganismos que permite la

conversión del fibrinógeno en fibrina. En el laboratorio, se usa para distinguir entre

diferentes tipos de Staphylococcus. Un resultado de coagulasa positivo indica que la

muestra contiene S. aureus.

La coagulasa reacciona con la protrombina en la sangre. El complejo resultante se llama

staphylothrombina, y permite que la enzima proteasa convierta el fibrinógeno en fibrina.

Esto hace que se coagule la sangre.

La coagulasa está estrechamente relacionada con la superficie de la bacteria S. aureus y

puede revestir su superficie con fibrina al entrar en contacto con la sangre. Se cree que

está cubierta de fibrina del Staphylococcus es capaz de resistir la fagocitosis haciendo que

esta bacteria tenga un factor de virulencia mayor.

MATERIALES

Cepa de S.aureus y S. epidermidis.

Tubos con plasma sanguíneo.

Asas de siembra.

PROCEDIMIENTO

Con el asa de kölle, realizar una siembra por inoculación en los tubos de plasma

sanguíneo.

Incubar a 37°C por 4 horas.

INTERPRETACION

Si hay coagulación de plasma ------- Coagulasa Positivo

No hay coagulación de plasma ------- Coagulasa Negativo

VII. PROTOCOLO

PRUEBA BIOQUIMICA

MEDIO DE CULTIVO

REACTIVO O INDICADOR

LECTURA

TSI: a) Glucosa: b) Lactosa: c) H2S d) Gas

CATALASA

CITOCROMO OXIDASA

MANITOL

HEMOLISINAS

COAGULASA

CUESTIONARIO:

Esquematice y grafique los resultados obtenidos en la lectura de las pruebas bioquímicas

anteriormente realizadas.

PRÁCTICA N°07

ACCIÓN DE AGENTES FISICOQUÍMICOS SOBRE EL CRECIMIENTO BACTERIANO

ANTIBIOGRAMA

OBJETIVOS:

Reconocer e identificar los factores físicos químicos que influyen sobre el crecimiento

bacteriano.

Conocer e identificar el uso del antibiograma para determinar sensibilidad bacteriana a

fármacos antibióticos.

INTRODUCCIÓN

Hasta ahora hemos venido considerando el crecimiento de las bacterias en función de su fondo genético, en relación con los nutrientes, y en unas hipotéticas condiciones ideales (óptimas). Sin embargo, el trabajo experimental con microorganismos ha de tener en cuenta los factores ambientales, es decir, una serie de agentes físicos y químicos que:

1. Modifican la velocidad de crecimiento, provocando cambios que, a determinados valores de dichos factores pueden llegar a ocasionar la muerte de microorganismos;

2. Condicionan la distribución de los microorganismos en sus ecosistemas y hábitats naturales.

3. Permiten a los humanos controlar el crecimiento microbiano, por medio de la fijación de parámetros para: a) La mutagénesis. b) La esterilización y desinfección. c) La quimioterapia.

No todos los microorganismos toleran del mismo modo un determinado factor ambiental. Así,

unas determinadas condiciones pueden ser nocivas para una especie bacteriana, y en cambio ser

neutras o beneficiosas para otra. Además conviene distinguir entre los efectos que un

determinado agente puede tener sobre la viabilidad y los efectos que pueden simplemente afectar

al crecimiento, a la capacidad de diferenciación (si la hubiera) o de reproducción. Los principales

tipos de factores a considerar son:

Agentes Físicos Agentes Químicos

Temperatura Desinfectantes y antisépticos

Desecación Quimioterápicos de síntesis

Radiaciones Antibióticos

Ondas sonoras

Presión hidrostática

Presión osmótica

El Antibiograma es una prueba en laboratorio clínico que se utiliza para medir la actividad

antibacteriana de los antibióticos y quimioterápicos empleados, permite por lo tanto seleccionar

el antibiótico o quimioterápico mas adecuado para la terapia de enfermedades infecciosas.

Consiste en sembrar la muestra de estudio sobre la superficie de una placa de Agar Müeller

Hinton o TSA, y luego colocar discos de sensibilidad que contienen antibióticos y después de una

incubación de 24 horas se observan las zonas de inhibición alrededor del disco.

En la presente práctica, el método utilizado es le Difusión en Agar, según Kirby – Bauer y col.

MATERIALES

Placas con Agar TSA.

Placas con Agar Müellen Hinton

Tubos con caldo nutritivo

Tubos y placas con cultivo bacterianos

Asas de siembra.

Hisopos estériles.

Discos de papel filtro.

Discos de sensibilidad antibiótica para grampositivos.

Discos de sensibilidad antibiótica para gramnegativos

Pinza porta algodón.

Mechero.

Vasos dapen

Agua oxigenada

Eugenol

Savlon

Alcohol medicinal

Alcohol yodado

PROCEDIMIENTO 01: DISCOS IMPREGNADOS CON DESINFECTANTES Y ANTISEPTICOS .

Hacer siembra por difusión en una placa con agar TSA.

Con la pinza porta algodón, coger los discos y sumergirlos en los vasos dapen conteniendo

los desinfectantes y antisépticos.

Colocar los discos impregnados con los diferentes desinfectantes y antisépticos sobre la

superficie del agar, en forma equidistante.

Incubar a 37°C durante 24 horas

Lectura y medición en mm de las zonas de inhibición.

PROCEDIMEINTO 02: TUBOS INOCULADOS VS TEMPERATURA

Inocular los tubos con caldo nutritivo.

Colocar el Tubo 1 en baño maria a 37°C durante 15 minutos.

Colocar el Tubo 2 en baño maria a 70°C duarnte 15 minutos.

Incubar ambos tubos a 37°C durante 24 horas.

Lectura de crecimiento bacteriano.

PROCEDIMEINTO 03: ANTIBIOGRAMA

Sumergir los hisopos estériles en los cultivos bacterianos, escurrirlos en las paredes del

tubo y sembrar uniformemente sobre la superficie del Agar Müellen Hinton.

Dejar reposar 5 minutos a temperatura ambiente.

Con la pinza estéril, colocar los discos impregnados con antibióticos sobre la superficie del

agar. La distancia entre los discos debe ser de 20 mm.

Incubar a 37°C durante 24 horas.

Lectura:

o Medir en mm el diámetro de las zonas de inhibición del desarrollo bacteriano

alrededor de los discos, incluyendo el diámetro del disco.

o Comparar con la tabla el diámetro de las zonas de inhibición obtenidas y

determinar la sensibilidad del microorganismo: Resistente (R), Intermediio (I) o

Susceptible (Sensible) (S), a los diferentes antimicrobianos utilizados.

o Anotar e interpretar los resultados.

CUESTIONARIO

1. Desarrollar y esquematizar un cuadro indicando los resultados obtenidos en la práctica.

2. Mediante dibujos o fotografías, fundamentar los resultados del cuadro anterior.

3. Cual es la importancia de la aplicación del antibiograma?

4. Qué indica la Resistencia o Susceptibilidad de un microrganismo en un antibiograma?

5. Qué indica un resultado Intermedio en esta prueba?