facultad de oencws moÍxxbcñb - core
TRANSCRIPT
H-r'/WIU {: p u n i r t i
F A C U L T A D D E O E N C W S m O Í X X B C ñ B
division m e s t u d i o s d e p o s t o b a d o
' V M i A M i t ^ r i o Y c m m : r m u M M M D E U N A B o m m M c m m o D u a i m P O R M A O Í Q F A G O S
O P T A R Al., G R A D O Î, M A E S T R O i c u m s
C O N E i B P E G l M v T D A D ]
I N M Í M O B I O L O G I A
M O H Ï . F H R K Y , N. í m ío D I
1020091623
T M
tthlo
F c £ >
H ß i
FONDO TESSS /
62911
UNIVERSIDAD AUTONOMA DE NUEVO LEON
FACULTAD DE CIENCIAS BIOLOGICAS
DIVISION DE ESTUDIOS DE POSTGRADO
" AISLAMIENTO Y CARACTERIZACION DE UNA SUSTANCIA
PRODUCIDA POR MACROFAGOS CON ACTIVIDAD
OUIMIOTACTICA PARA LINFOCITOS "
T E S I S
PRESENTADA COMO REQUISITO PARCIAL PARA
OPTAR AL GRADO DE MAESTRO EN CIENCIAS
CON ESPECIALIDAD EN :
I N M U N O B I O L O G I A
POR
Q.B.P. RICARDO ALBERJO GOMEZ FLORES
APROBADA:
DIRECTOR:
SECRETARIO:
VOCAL:
COMISION T E TESIS:
JO AVILA
MONTERREY, NUEVO LEON JULIO DE 1989
El v iento , la palabra« *
P a r a que me la h a s d a d o
si n o puedo par ir
h u r a c a n e s al alba*
t S. F e r n a n d e z
A l a Dra . E n r i q u e t a Fe rnández , por e l g r a n
c a r i ñ o que l e t e n g o y por que hemos c o m p a r t i d o
v i vene i as i n o l v i d a b l e s .
A mis hermanos, Car las» R o g e l i o , P e r l i t a y
Mónica, as í como a mis padres , por e l apoyo
e t e r n o que r e c i b o inmerec idamente de e l l o s .
A mis i n s e p a r a b l e s amigos, Leonardo y José
L u i s porque han e s t a d o conmigo en l o s momentos
de é x i t o y en l a a d v e r s i d a d en forma
d e s i n t e r e s a d a .
A mis compañeros d e l l a b o r a t o r i o de
Inmuno log í a y V i r o l o g í a, por l a i m p o r t a n c i a que
t u v o para* mi, sus c r í t i c a s en t o d o momento
c o n s t r u c t i v a s .
A todas a q u e l l a s personas que
i n v o l u n t a r i a m a n t e omi to , que de una u o t r a forma
me apoyaron cuando de a l g u n a manera l o
n e c e s i t a b a .
AREA DE TRABAJO
E l p r e s e n t e t r a b a j o se d e s a r r o l l ó en e l l a b o r a t o r i o
de I n m u n o l o g í a y V i r o l o g í a de l a F a c u l t a d de
C i e n c i a s B i o l ó g i c a s de l a U n i v e r s i d a d Autónoma de
Nuevo León.
INTRODUCCION
ANTECEDENTES
MATERIAL Y METODOS
RESULTADOS
DISCUSION
FIGURAS Y TABLAS
BIBLIOGRAFIA
INTRODUCCION
Los f a g o c i t o s monunucleares en. c u l t i v o s e c r e t a n una g r a n
v a r i e d a d de mo lécu las con i m p o r t a n t e s f u n c i o n e s b i o l ó g i c a s .
Es tas mo lécu las s e c r e t a d a s i n c l u y e n a p r o t e a s a s b i e n d e f i n i d a s
capaces de a f e c t a r p r o t e i ñas e x t r a c e l u l a r e s C t a l como
co lagenasa , e l a s t a s a , a c t i v a d o r de p i a s m i nógeno )C1 -3D ,
mo lécu las i n v o l u c r a d a s en p rocesos de i n f l a m a c i ó n y d e f e n s a
C l a s p r o t e i ñas d e l complemento Cz o CU, i n t e r f e r o n e
l i s o z i m a ) C 4 - 6 ) , y una v a r i e d a d de m o l é c u l a s d e f i n i d a s
p r i n c i p a l m e n t e por s u c a p a c i d a d pa ra i n f l u e n c i a r e n l a
conducta de o t r a s c é l u l a s * I n c l u i d a s en e l 01Limo g r u p o se
e n c u e n t r a n mo lécu las l i n f o e s t i m u l a t o r i a s l a s c u a l e s p o d r í a n
se r i m p o r t a n t e s en modular a lgunas e tapas de l a r e s p u e s t a
inmune C7-105• La i n t e r a c c i ó n m a c r ò f a g o - l i n f o c i t o es un
e v e n t o c e n t r a l t a n t o en e l i n i c i o como en l a r e g u l a c i ó n de l a
r e s p u e s t a inmune C l l ) . E l c o n t a c t o e n t r e e l macròfago y e l
l i n f o c i t o puede ser f a c i l i t a d o por un f a c t o r q u i m i o t á c t i c o
p r o d u c i d o por l o s l i n f o c i t o s T e l c u a l a t r a e macrófagos C12 ) .
Por o t r o l a d o , se ha demostrado que l a i n t e r l e u c i n a - 1
p r o d u c i d a por macrófagos t i e n e e f e c t o q u i m i o t á c t i c o s o b r e
n e u t r ó f i l o s , monoc i tos , y l i n f o c i t o s T y B C9, IO , 1 3 , 1 4 } . Ward.
r e p o r t ó que l o s s o b r e n d a n t e s de 24 h o r a s de c u l t i v o s de
macrófagos e s t i m u l a d o s con a n t i g e n o e r a n capaces de i n d u c i r
q u i mi o t á x i s en n e u t r ó f i 1 o s , macrófagos y 1 i n f o c i t o s C155 •
Es tos f a c t o r e s q u i m i o t á c t i c o s p o d r í a n Jugar no s ó l o un pape l
i m p o r t a n t e en l a r e g u l a c i ó n de l a m i g r a c i ó n y t r á f i c o c e l u l a r
in vivo , s i n o tamb ién a c t u a r en l a e tapa i n d u c t i v a de l a
r e s p u e s t a inmune. Se ha demostrado que inmed ia tamente después
de l a e n t r a d a d e l a n t í geno, se i n c r e m e n t a l a c a n t i d a d de
c é l u l a s de l a c o r t e z a p r o f u n d a de l o s g á n g l i o s l i n f á t i c o s
C16-18D. B a j o l a h i p ó t e s i s de que d u r a n t e l a f a s e temprana de
l a r e s p u e s t a inmune, l a i n t e r a c c i ó n e n t r e e l macròfago y e l
l i n f o c i t o p o d r í a f a c i l i t a r s e por l a p r o d u c c i ó n de s u s t a n c i a s
q u i m i o t á c t i c a s por p a r t e de l o s macrófagos , se r e a l i z ó e l
p r e s e n t e t r a b a j o , e n c o n t r a n d o a c t i v i d a d q u i m i o t á c t i c a en l o s
sob renadantes de 6 y 24 ho ras de l o s macrófagos e s t i m u l a d o s
con e r i t r o c i t o s de c a r n e r o , s i e n d o los - l i n f o c i t o s pequefíos l a s
p r i n c i p a l e s c é l u l a s respondedoras a l s o b r e n a d a n t e de 6 h o r a s ,
m i e n t r a s que a l o s sob renadantes de 24 ho ras t a m b i é n
r es pond i er on neut r ó f i 1 o s en f or ma s i g n i f i e a t i v a . Las c é l u l a s
respondedoras a l s o b r e n a d a n t e de 6 ho ras p a r e c e n se r
l i n f o c i t o s T ya que c é l u l a s de bazo de r a t a s desnudas n u / n u
son incapaces de r e s p o n d e r a d i c h o e s t i m u l o , m i e n t r a s que l a s
c é l u l a s de l o s padres h e t e r o c i g o t o s s i l o hacen* La p r o d u c c i ó n
de sob renadantes con a c t i v i d a d q u i m i o t á c t i c a e s t á a s o c i a d a a
l a p r e s e n c i a de a n t í g e n o en l o s c u l t i v o s de c é l u l a s a d h e r e n t e s
de exudado p e r i t o n e a l . Aunque l a a c t i v i d a d q u i m i o t á c t i c a de
l o s sob renadantes de 24 ho ras se ha r e p o r t a d o p r e v i a m e n t e , no
e x i s t en r epor t e s de ac t i v i d a d q u i mi o tác t i ca a 1as 6 hor as .
E s t a a c t i v i d a d q u i m i o t á c t i c a de l o s sob renadantes de 6 ho ras
es p r o d u c i d a aún después de t r a t a r c é l u l a s a d h e r e n t e s de
exudado p e r i t o n e a l con a n t i c u e r p o s a n t l c é l u l a s T y B,
i n d i c ando que es un. pr o due t o n e t o de 1 os macróf agos. En 1 a
c a r a c t e r i z a c i ó n i n i c i a l , hemos e n c o n t r a d o que l a a c t i v i d a d en
l o s sob renadantes de 6 horas es i n h i b i d a por t r i p s i n a ,
o
q u i m i o t r i p s i n a , p a p a i n a , p a p a i n a con u rea 8M y a TO C / 3 0 ' y o
100 C I O ' .
ANTECEDENTES
U1t i ma ment e ha r ec i b i do rauc ha a l ene i ón e l es t u d i o de 1 a
c i n é t i c a y f a c t o r e s s o l u b l e s p r o d u c i d o s por l o s macrófagos,
as í como l a i m p o r t a n c i a de l a i n t e r a c c i ó n de e s t a s c é l u l a s con
l o s l i n f o c i t o s T y B.
En l o s 60 ' s , F ishman y A d l e r e n f o c a r o n s u a t e n c i ó n a l
p r o b a b l e p rocesamien to d e l a n t í g e n o por e l macròfago. Sus
t r a b a j o s se f undamenta ron en que e l ARN de macrófagos
i ncubados p r e v i ámente con bac t e r i ó f agos» er a capaz de
e s t i m u l a r l a s í n t e s i s de a n t i c u e r p o s c o n t r a d i c h o s f a g o s , por
c é l u l a s de g á n g l i o s l i n f á t i c o s en cámaras de d i f u s i ó n ( 1 9 ) .
Askonas y Rhodes r e p o r t a r o n que t a l e s e x t r a c t o s de ARN
c o n t e n í a n a n t i g e n o y s u g i r i e r o n que l o s macrófagos p o d í a n
p r o c e s a r e l a n t í g e n o p a r a h a c e r l o a l t a m e n t e inmunogén ico ( 2 0 ) .
Subsecuentemente A d l e r , F ishman y Dray d e s c r i b i e r o n un segundo
t i p o de ARN de macrófagos que e r a capaz de i n d u c i r l a s í n t e s i s
de ant i c uer pos espee i f i eos 1 os c u a l e s 11evaban un marcador
a l o t í p i c o d e l macròfago . E s t o i m p l i c a b a que l a i n f o r m a c i ó n
g e n é t i c a habí a s i d o t r a n s f e r i d a d e l macròfago a l a c é l u l a
p r o d u c t o r a de a n t i c u e r p o s ( 2 1 ) .
Por o t r a p a r t e , Mo ise r demostrò t n v»t tro que l a r e s p u e s t a
p r 1 m a r i a de a n t i c u e r p o s por c é l u l a s de bazo de r a t ó n c o n t r a
e r i t r oc i t o s de c a r n e r o dependí a de l a i n t e r acc i ón de c é l u l a s
a d h e r e n t e s a l v i d r i o C f r a c c i ó n r i c a en macrófagos) y c é l u l a s
no adheren tes C f r a c c i ó n r i c a en l i n f o c i t o s ) . La remoc ión de
c u a l q u i e r a de e s t a s . f r a c c i o n e s i n h i b í a l a r e s p u e s t a C22) . De
l a misma forma Oppenheim, L e v e n t h a i y Hersh demost ra ron que l a
transformación in nitro de linfociios humanos inducida por el a n t í g e n o e r a i n h i b i d a marcadamente cuando l o s macrófagos e r a n
e l i m i n a d o s de l a s s u s p e n s i o n e s de l e u c o c i t o s humanos a l pasar
e s t a s a t r a v é s de columnas con p e r l a s de v i d r i o C235. La
r e s t a u r a c i ó n de l a r e s p u e s t a se l o g r a b a a l a g r e g a r macrófagos
a l a s s u s p e n s i o n e s de l e u c o c i t o s C 2 4 ) .
R o s e n t h a l C 25) p ropone un i n t e r e s a n t e modelo de
i n t e r a c c i ó n m a c r ò f a g o - l i n f o c i t o . En e s t e , e l e v e n t o i n i c i a l es
una i n t e r a c c i ó n i n d e p e n d i e n t e de a n t í g e n o e n t r e e l macròfago y
e l l i n f o c i t o , l a c u a l es r e v e r s i b l e , - e s p e c í f i c a de e s p e c i e y
depend i e n t e d e l m e t a b o l i smo d e l macròfago. S i 1 os macrófagos
l l e v a n a n t i geno p a r a l o c u a l un l i n f o c i t o dado posee un
r e c e p t o r e s p e c í f i c o , entonces o c u r r e un segundo e v e n t o , e l
c u a l es i r r e v e r s i b l e y depend i e n t e de a n t í geno p a r a 1a
e s t a b i l i z a c i ó n de l a u n i ó n m a c r ò f a g o - l i n f o c i t o . E s t a ú l t i m a
e t a p a r e q u i e r e que e l macròfago y e l l i n f o c i t o sean
h i s t o c o m p a t i b l e s . F i n a l m e n t e , l u e g o de s i n t e t i z a r ADN, e l
1 i n f o c i t o se d i v i de, i n i c i ando l a l i n f opr o l i . f e r a c i ó n y por
ende l a r e s p u e s t a inmune . E s t e modelo se resume a
c o n t i n u a c i ó n . MO, macròfago; L, l i n f o c i t o ; Ag, a n t í g e n o :
MO • L • Ag ^ [MO-U • Ag ^ [MO-Ag] • L
[MO-A0-L1
?
Recientemente , Oppenheim demostró que muestras de
i n t e r l e u c i n a - 1 a l t a m e n t e p u r i f i c a d a s no t i e n e n a c c i ó n
q u i m l o t á c t i c a £n v i t r o , y que por e l c o n t r a r i o e x i s t e n o t r a s
s u s t a n c i a s con a c t i v i d a d q u i m l o t á c t i c a t a l e s como un f a c t o r
p r o t e i c o denominado factor quirriiotÁc tico p a r a nexitrófilos
derivado de numeró fagos (FQNDM2 cuyo peso m o l e c u l a r es de 6500
C 2 7 ) . De i g u a l fo rma , Wolpe y c o l . , d e m o s t r a r o n que una
p r o t e í n a de b a j o peso m o l e c u l a r C8000) , l a c u a l f u é 11 amada
p r o t e i n a inflamatoria del macròfago CPIM2, i n d u c í a l a
q u i mi oc i nes i s de l o s n e u t r ó f i l o s C28)• •
E x i s t e n s u s t a n c i a s que pueden i n d u c i r l a q u i m i o c i n e s i s de
l i n f o c i t o s i n vi tro. T a l e s s u s t a n c i a s i n c l u y e n a l a c a s e l n a ,
e l componente d e l compi emento Csa , y e l f -Met - L e u - P h e , 1 os
c u a l e s son c o n t i nua ment e u t i 1 i zados c oreo c o n t r o l e s en
exper imentos de m i g r a c i ó n C 2 9 ) . En e s t e p u n t o debe h a c e r s e una
d i s t i n c i ó n e n t r e q u i m i o c i n e s i s y q u i m i o t á x i s . La q u i m i o c i n e s i s
es e l mov imiento a l a za r de l a s c é l u l a s , m i e n t r a s que l a
q u i mi o t á x i s es un movi mi e n t o d i r i g i d o hac i a e l agente
a t r a y e n t e y s u d e m o s t r a c i ó n depende d e l uso de g r a d i e n t e s
C 3 0 - 3 1 ) .
Un hecho n o t a b l e en l a i n t e r a c c i ó n m a c r ò f a g o - l i n f o c i t o es
que 1 os 1 i n f oc i t o s t i enden a adher i r s e a l r e d e d o r d e l
macròfago. Los t i m o c i t o s C 3 2 - 3 4 ) , l i n f o c i t o s de s a n g r e
per i f ér i c a C 3 5 - 3 6 ) , y l o s l i n f o c i t o s pr o v e n i e n t e s de g á n g l i os
l i n f á t i c o s y o t r o s t e j i d o s l i n f o i d e s C 3 2 - 3 4 ) , han mostrado
adhes i ón a 1 os mac r ó f agos. La adher ene i a a 1 os macrófagos
p e r i t o n e a l e s f u é más f u e r t e que a macrófagos a l v e o l a r e s ,
n e u t r ó f i l o s , e o s i n ó f i l o s o f i b r o b l a s t o s C3E, 373. Además, l a
a d h e r e n c i a f u e mucho mayor en p r e s e n c i a de una r e a c c i ó n
i nmune. S a l v i n y c o l . C 34) , obser var on que l o s 1 i n f o c i t o s de
cobayo s e n s i b i l i z a d o s a a n t í g e n o m o s t r a r o n l o c o m o c i ó n t a n t o en
p r e s e n c i a como en a u s e n c i a de a n t í g e n o y que se a d h e r í a n a l o s
macròfagos s ó l o en p r e s e n c i a de a n t í g e n o , m i e n t r a s que l o s
l i n f o c i t o s no s e n s i b i l i z a d o s no l o h a c í a n .
E s t e fenómeno de a d h e s i ó n de l i n f o c i t o s inmunes a
mac r ó f agos es una fo rma muy e s p e c i a l i zada de a d h e s i ó n
i n t e r c e l u l a r l a c u a l podr í a Jugar p a p e l e s muy i importantes,
como e l de p e r m i t i r e l c o n t a c t o n e c e s a r i o c é l u l a - c é l u l a p a r a
l a i n t e r a c c i ó n e n t r e e l macròfago y e l l i n f o c i t o T cooperador
C 3 8 } .
MATERIAL Y METODOS
Animales. En l o s exper imentos r e p o r t a d o s en e s t e t r a b a j o se
u t i z a r o n r a t a s s i n g é n i c a s de 2 - 3 meses de l a s cepas W i s t a r ,
n u / n u y n u / + . Es tos a n i mal es f u e r o n donados por e l
Departamento de In immolog í a d e l H o s p i t a l U n i v e r s i t a r i o ,
M o n t e r r e y , Nuevo León.
Pr&pcLTCLC tón de células fagocí t icas mononuc leares. Se
o b t u v i e r o n c é l u l a s de exudado p e r i t o n e a l de r a t a mediante
1avado per i t o n e a l u t i 1 i z a n d o medi o mi n i mo e s e n c i a l e s t é r i 1
CMEM, G ibco L a b o r a t o r i e s , Grand I s i a n d , N. Y. D C 3 9 , 4 0 ) . Las
c é l u l a s recuperadas se c o n t a r o n y se d e p o s i t a r o n en c a j a s a
p e t r i de v i d r i o de 60 x 15 mm. a una c o n c e n t r a c i ó n de 3 x 10 o
c é l u l a s / c a j a . Las c é l u l a s se i n c u b a r o n toda l a noche a 37 C.
P o s t e r i o r m e n t e , l a s c é l u l a s no a d h e r e n t e s se r e m o v i e r o n
m i e n t r a s que l a s c é l u l a s adheren tes se l a v a r o n una vez con
s o l u c i ó n de Gey C41) y t r e s veces con una s o l u c i ó n de NaCl a l
0 . 8 5 X. Más d e l 9556 de l a p o b l a c i ó n f i n a l e r a n macrófagos ,
de te rminados as í por l a m o r f o l o g í a c e l u l a r .
Pr-oducción de sobrenadantes con aclividad qxiimioLÁc tica. La
p o b l a c i ó n de macrófagos o b t e n i d a se i n c u b ó con 4 mi de e> o
s o l u c i ó n de Gey y 10 e r i t r o c i t o s de c a r n e r o CECa) a 37 C.
Los sobrenadantes se c o l e c t a r o n desde l o s 30 minutos has ta
l a s 48 horas de i n c u b a c i ó n , l a s c é l u l a s se r e m o v i e r o n por o
c e n t r i f u g a c i ó n a 1600 r . p . m . por 10 minutos a 6 C y o
l o s sobrenadantes se m a n t u v i e r o n conge lados a - 2 0 C has ta su
uso en pruebas de q u i m i o t á x i s . Los c o n t r o l e s f u e r o n 1os
s i g u i e n t e s : s o l u c i ó n de Gey C c o n t r o l n e g a t i v o ) , s o l u c i ó n de
se p r o b a r o n pa ra a c t i v i d a d q u i m i o t á c t i c a C45 ) .
Electroforésis• en geles de poliacri lamida con dodecil sulfato
de sodto. E s t e t i p o de e l e c t r o f o r é s i s se l l e v ó a cabo de
acuerdo a l método de Laeml i C46) u t i l i z a n d o g e l e s s e p a r a d o r e s
a l 11 X C2 mm. de g r o s o r y 12 en. de l a r g o ) . Las muestras
c o n t e n i e n d o p r o t e í ñ a s se d e s n a t u r a l i z a r o n en d o d e c i l s u l f a t o
de s o d i o a l 4 X b a j o c o n d i c i ones r e d u c t o r as , c a l e n t á n d o l a s a
e b u l 1 i c i ón por 5 mi ñ u t o s . P o s t e r i ormente a l í quotas de 1 as
muestras se d e p o s i t a r o n en e l g e l s e p a r a d o r . E l g e l entonces
se c o r r i ó a 100 v o l t s , has ta que e l f r e n t e de m i g r a c i ó n h a b í a
a l c a n z a d o un 90 X de 1 a 1 o n g i t u d d e l g e l . Se u t i 1 i z a r on 1 os
s i g u i e n t e s marcadores de peso m o l e c u l a r : a l b ú m i n a b o v i n a C 66
Kd) , a lbúmina de huevo C 45 Kd) , g l i c e r a l d e h i d o - 3 - f o s f a t o
d e s h i d r o g e n a s a C 36 Kd) , a n h i d r a s a c a r b ó n i c a C29 Kd) ,
t r i p s i nógeno C 24 Kd) , i n h i b i dor de t r i p s i n a C 2 0 . 1 Kd) y
<x - lacta lbúmina C14 .2 Kd) . Es tos e s t á n d a r e s se o b t u v i e r o n de
SIGMA.
bemos t rae i ón de los macró fagos como las células prodxic toras
djel factor qxiimiotác t ico de las 6 horas. Se t r a t a r o n
c u l t i v o s de c é l u l a s a d h e r e n t e s de exudado p e r i t o n e a l con
a n t i c u e r p o s monoc lona les a n t i l i n f o c i t o s T y t i m o c i t o s
CSEROTEC, MCA 5 2 ) , más a n t i c u e r p o s monoclona les a n t i l i n f o c i t o s
B CSEROTEC, MCA 340) y complemento de cobayo, de l a s i g u i e n t e
manera: l o s c u l t i v o s de macrófagos se t r a t a r o n con una mezcla
de a n t i c u e r p o s monoclona les a n t i c é l u l a s T y B a l 1 X , y se
caseína C0.7S-3 mg/ml, control positivo, MERCK, Haucalpan,
México) y sob renadantes de 6 Horas de macrófagos incubados s i n
a n t í g e n o o mi tógeno ( c o n t r o l n e g a t i v o ) .
Preparactón de células linfoides de sangre periférica y bazo.
Se o b t u v i e r o n l e u c o c i t o s de r a t a s s i n g é n i c a s V i s t a r , n u / n u y
n u / + de c u a l q u i e r sexo. En cada e x p e r i m e n t o se o b t u v i e r o n
asép t icamente e l bazo y s a n g r e p e r i f é r i c a de una r a t a y l a
s u s p e n s i ó n de c é l u l a s r e s u l t a n t e se c e n t r i f u g ó e n s o l u c i ó n de
F i c o l l - H y p a q u e 1 . 0 0 7 . Las c é l u l a s r e c u p e r a d a s se l a v a r o n 2
veces en s o l u c i ó n de Gey y f i n a l m e n t e se r e s u s p e n d i e r o n en l a
misma s o l u c i ó n a una c o n c e n t r a c i ó n de 1 x 10 c é l u l a s / l n l .
Prueba de 9U1 miot áx i s. Pa ra l a pr ueba de q u i mi o t á x i s se
u t i 1 i z ó l a pr ueba de mi g r ac i ón en f i 1 1 r os d e s a r r o l 1 a d a por
W i l k i n s o n C 4 1 ) . Se u t i l i z a r o n f i l t r o s Gelman CVersapor 3000,
Gelman Sc iences I n c . Ann. Harbor MI ) de 3 mi e r a s de tamaño de
po ro . E l c o m p a r t i m i e n t o i n f e r i o r de cada cámara c o n t e n i a s ó l o
e l m a t e r i a l de p rueba d i l u í do en s o l u c i ó n de Gey C 1 : 2 ) y f u é
l l e v a d o a un vo lúmen f i n a l de 5 mi. E l c o m p a r t i m i e n t o
s u p e r i o r de cada cámara c o n t e n í a 0 . 2 5 mi. de una s u s p e n s i ó n de
c é l u l a s de bazo o s a n g r e p e r i f é r i c a a una c o n c e n t r a c i ó n de 1 x <5
10 c é l u l a s X m l en s o l u c i ó n de Gey. Las cámaras se i n c u b a r o n por o
t r e s horas a 37 C. Después de l a i n c u b a c i ó n l a s cámaras se
desensambla ron y l o s f i l t r o s se f i j a r o n con e t a n o l a b s o l u t o ,
s i g u i é n d o s e e l s i g u i e n t e p roceso de t i n c i ó n s
Agua d e s t i l a d a C1 m i n ) , h e m a t o x i l i n a C25 s e g ) , agua d e s t i l a d a
C1 m i n ) , agua c o r r i e n t e CIO m i n ) , e t a n o l a l 70X C 2 m i n ) ,
e t a n o l a l 95% C3 m i n ) , mezcla de e t a n o l a l 80X y b u t a n o l a l
SO X C5 m i n ) , y x i l o l CIO m i n ) . C 4 1 , 4 2 ) . Pa ra l a m e d i c i ó n
c u a n t i t a t i v a , se u t i l i z ó e l método de c o n t e o de l a s u p e r f i c i e
i n f e r i or de 1 os f i 1 t r o s y se c o n t ó e l número t o t a l de c é l u l a s
que m i g r a r o n en cada f i l t r o . Se r e g i s t r a r o n l o s promedios de
a l menos dos d e t er mi nac i ones por t r i p l i c ado en cada
exper i ment o.
Pruebas cruzadas Cch&cherboard assaysZ. Pa ra d e t e c t a r s i l a
a c t i v i d a d encont r ada en 1 os sob renadantes de 6 hor as e r a
q u i m i o t á c t i c a o q u i m i o c i n é t i c a se • d e s a r r o l l a r o n p ruebas
c r uzadas en gr a d i en t es• Los sobr enadantes de 6 hor as se
c o l o c a r o n s ó l o en e l c a m p a r t i m i e n t o i n f e r i o r C g r a d i e n t e
p o s i t i v o d e l f a c t o r q u i m i o t á c t i c o ) , en ambos c o m p a r t i m i e n t o s
( a u s e n c i a de g r a d i e n t e ) , o s ó l o en e l c o m p a r t i m i e n t o s u p e r i o r
( g r a d i e n t e n e g a t i v o ) de acuerdo a l método d e l "checlcerboard
a s s a y " d e s a r r o l l a d o por Zigmond y H i r s c h C 3 1 ) .
Esquema, de Inmunización . Pa ra d e t e r m i n a r s i l a i n m u n i z a c i ó n
con e l a n t í g e n o t e n í a a l g u n a i n f l u e n c i a s o b r e l a r e s p u e s t a de
c é l u l a s de bazo a l f a c t o r q u i m i o t á c t i c o , se i n o c u l a r o n r a t a s
Wi s t a r b a j o e l s i g u i e n t e esquema de i nmuni z a c i ó n ,
a d m i n i s t r a n d o e l a n t í g e n o por l a v í a i n t r a p e r i t o n e a l : D í a 0 , 1
mi. de ECa CIO ) en Adyuvante Completo de FreUnd ; d i a 15, 1 P 0
mi. de ECa CIO ) ; d í a 25, 1 mi. de ECa CIO ) ; d í a 29, se
u t i l i z a r o n c é l u l a s de bazo de e s t a s r a t a s p a r a p ruebas de
q u i m i o t á x i s p r e v i a d e m o s t r a c i ó n de l a p r e s e n c i a de a c t i v i d a d
h e m o l í t i c a en l o s s u e r o s de e s t o s an ima les med iante una prueba
d i r e c t a de h e m ó l i s i s con e l mismo a n t í g e n o .
Determinación de la viabilidad celular. La viabilidad de las
c é l a l a s u t i 1 i z a d a s en todos 1 os expe r imentos f u é s u p e r i o r a l
95 X. La v i a b i l i d a d f u e d e t e r m i n a d a por e l método de e x c l u s i ó n
d e l a z u l t r i p a r t o C43 ) .
Suscept ibilidad a enzimas. Los sob renadantes de 6 ho ras
p r o v e n i e n t e s de c u l t i v o s de macrófagos e s t i m u l a d o s con
e r i t r o c i t o s de c a r n e r o se t r a t a r o n ccfn t r i p s i n a C1 mg/ml ,
SIGMA Chemical S t . L o u i s MO, EC. 3 . 4 . 2 1 . 4 , t i p o I ) ,
q u i m i o t r i p s i n a C1 mg/ral, SIGMA, EC. 3 . 4 . 2 1 . 1 , t i p o I - S ) , o o
r i b o n u c l e a s a C4U/ml , SIGMA, t i p o X - A ) , por 3 ho ras a 37 C;
d i c h o s sob renadantes f u e r o n t a m b i é n t r a t a d o s con p a p a í n a C1
mg/ml , SIGMA, EC. 3 . 4 . 2 2 . 2 . , t i p o I I I ) y con p a p a i n a más u r e a o 8M por una ho ra a 37 C C44 ) .
Estabilidad al calor. Se d e t e r m i n ó l a e s t a b i l i d a d de l o s
sob renadantes de 6 ho ras de macrófagos e s t i m u l a d o s o o o
a n t i g é n i c a m e n t e , a 56 CX30», 70 CS309 y 100 G^IO» C 4 5 ) .
Effecto de l a ac ti nonti ciña D en l a p r o d u c c i ó n del /actor
qxiimiotÁc t ico. A lgunos c u l t i v o s de macróf agos se
t r a t a r o n con a c t i n o m i c i n a D C1 ¿¿g/"ml. Pharmac ia ) por una o
h o r a a 37 C y l u e g o se i n c u b a r o n con e r i t r o c i t o s de c a r n e r o p
CIO ) por 6 h o r a s . Los sob renadantes de e s t o s c u l t i v o s se
c o l e c t a r o n y se u t i l i z a r o n pa ra p ruebas de a c t i v i d a d
q u i m i o t á c t i c a C45 ) .
Estimulación con LPS. Se t r a t a r o n macrófagos p e r i t o n e a l e s con
l i p o p o l i s a c á r i d o CIO ¿¿g'ml, SIGMA, de E. coli 0111: B4) por 6 o
horas a . 3 7 C. P o s t e r i o r m e n t e se c o l e c t a r o n l o s sob renadantes y
o
i n c u b a r o n a 4 C / 3 0 * . P o s t e r i o r m e n t e l o s c u l t i v o s se l a v a r o n 2
veces con s o l u c i ó n de Gey y se l e s a ñ a d i ó s u e r o de cobayo a l o
10 X. Los c u l t i v o s se i n c u b a r o n a 37 C 4 5 * y se l a v a r o n 3
veces con l a s o l u c i ó n de Gey. F i n a l m e n t e se l e s a ñ a d i e r o n
e r i t r o c i t o s de c a r n e r o y se c o l e c t a r o n l o s sob renadantes de 6
hor as .
Presentación y anÁlisis de los datos. Los r e s u l t a d o s
o b t e n i d o s en e s t e e s t u d i o r e p r e s e n t a n 1a media + / - e l e r r o r
e s t á n d a r de l a inedia de a l menos dos d e t e r m i n a c i o n e s por
t r i p l i cado. Se u t i 1 i z ó l a p rueba F y 1 a p rueba t p a r a
d e t e r m i n a r l a s i g n i f i c a n c i a e s t a d í s t i c a de l a s d i f e r e n c i a s
obse rvadas en a l g u n o s e x p e r i m e n t o s .
RESULTADOS
Producción de sobrenadantes con ac tividad quimiotÁc t ica. Los
r e s u l t a d o s que se muest ran en l a F i g u r a 1 i n d i c a n que l o s
macróf agos e s t i m u l a d o s i n v i tro con ECa, p roducen
sob renadantes con a c t i v i d a d q u i m i o t á c t i c a a l a s 6 y 24 ho ras
después de l a e s t i m u l a c i ó n . R e s u l t a d o s s i m i l a r e s se o b t u v i e r o n
cuando se u s a r o n c é l u l a s de s a n g r e p e r i f é r i c a como b l a n c o de
l a a c t i v i d a d q u i m i o t á c t i c a . La tínica d i f e r e n c i a o b s e r v a d a f u é
que é s t a s c é l u l a s r e s p o n d í a n mejor que l a s c é l u l a s de bazo a
l o s sob renadantes de 24 horas C F i g . 2 ) :
Células blanco de los sobrenadantes con actividad
quimiotÁc t ica. Las p r i n c i p a l e s c é l u l a s r e s p o n d e d o r a s a l o s
sobr enadantes de 6 hor as f uer on 1 i n f oc i t o s pequeños C 6^ ) >
m i e n t r a s que l o s n e u t r ó f i l o s t a m b i é n r e s p o n d i e r o n
s i g n i f i c a t i v a m e n t e a l o s sob renadantes de 24 h o r a s C F i g s . 2 y
3 ) . En l a f i g u r a 4 s e muest ran r e s p u e s t a s de m i g r a c i ó n de
c é l u l a s de bazo a l o s sob renadantes de 6 y 24 ho ras y h a c i a l a
s o l u c i ó n de Gey. Observamos una mayor r e s p u e s t a de m i g r a c i ó n
h a c i a e l sob renadante de 6 horas comparada con e l sob renadante
de 24 horas y l a s o l u c i ó n de Gey. Por o t r a p a r t e , n u e s t r o s
e x p e r i mentos s u g i e r e n que 1as c é l u l a s T son p robab lemente l a s
p r i n c i p a l e s c é l u l a s b l a n c o h a c i a e l f a c t o r q u i m i o t á c t i c o de
l o s sob renadantes de 6 horas dado que c é l u l a s de bazo de r a t a s
desnudas Cnu/rtu) no r e s p o n d i e r o n a e s t e s o b r e n a d a n t e m i e n t r a s
que sus padres h e t e r p c i g o t o s s i l o h i c i e r o n CF ig* 5)« La
r e s p u e s t a de n u / + a l sob renadante de 6 ho ras f u é
s i g n i f i c a t i v a m e n t e mayor que a l s o b r e n a d a n t e de 6 ho ras de
macrófagos incubados c o n s o l u c i ó n de G e y CP < 0 .013 o a l a
s o l u c i ó n de Gey CP < 0 .001 ! ) . La r e s p u e s t a de n u / + a c u a l q u i e r
t r a t a m i e n t o f u é mayor que l a r e s p u e s t a de n u / n u CP < 0 . 0 1 > .
Todas l a s demás d i f e r e n c i a s e n t r e g rupos e x p e r i m e n t a l e s no
a l c a n z a r o n s i g n i f i c a n c i a e s t a d í s t i c a con una P • 0 . 0 5 .
Dependencia antigénica para producir sobrenadantes con
ac t ividad quirniotÁc L ica. Se demostró también l a dependencia
a n t i g é n i c a en l o s c u l t i v o s de macrófagos p a r a p r o d u c i r
s u s t a n c i a s con a c t i v i d a d q u i m i o t á c t i c a h a c i a l i n f o c i t o s . La
F i g u r a 6 muestra r e s p u e s t a s de m i g r a c i ó n de c é l u l a s de bazo de
r a t a s inmun izadas in vivo con ECa h a c i a e l s o b r e n a d a n t e de 6
hor as p r o v e n ! e n t e de macróf agos e s t i muíados i n vilro con ECa
C IA ) o de macrófagos no e s t i m u l a d o s C1 B> y l a s r e s p u e s t a s de
c é l u l a s de bazo de r a t a s no s e n s i b i l i z a d a s h a c i a sob renadantes
de 6 horas p r o v e n i e n t e de macrófagos e s t i m u l a d o s in vi tro
C 2 / 0 o de macrófagos no e s t i m u l a d o s C 2 6 ) . Como se puede
o b s e r v a r s ó l o l o s sob renadantes p r o v e n i e n t e s de macrófagos
e s t i m u l a d o s i n v i t r o p r o d u j e r o n a c t i v i d a d q u i m i o t á c t i c a . No
hubo d i f e r ene i a en 1 a r espues t a hac i a e l es t í muío
q u i m i o t á c t i c o de l a s c é l u l a s l i n f o i d e s de a n i m a l e s inmun izados
o no. Las d i f e r e n c i a s e n t r e l o s g rupos 1A o 2A con l o s g rupos
1B, 2B o s o l u c i ó n de Gey f u e r o n s i g n i f i c a t i v a s con una P »
0. 05.
Caracterización parcial de sobrenadantes de 6 horas con
actividad quimiotÁctica. E l p r o d u c t o a c t i v o en l o s
sob renadantes de 6 ho ras parece se r una p r o t e í n a » l a c u a l es
s u s c e p t i b l . e a v a r i a s enz imas como t r i p s i n a , q u i r a i o t r i p s i n a y
1020091623
o o
p a p a í n a y es i n e s t a b l e a 70 C / 3 0 ' y 100 C I O * . La t a b l a I
muest ra l a s d i f e r e n c i a s obse rvadas e n t r e l a s r e s p u e s t a s de
m i g r a c i ó o n h a c i a e l m a t e r i a l de p rueba más t r a t a m i e n t o y
c o n t r o l e s s i n t r a t a m i e n t o . Los r e s u l t a d o s mostrados
coresponden a l p o r c e n t a j e de r e d u c c i ó n de l a a c t i v i d a d
comparando muestras d e l mismo l o t e d e l s o b r e n a d a n t e . La
a d i c i ó n de a c t i n o m i c i n a D a l o s c u l t i v o s de macrófagos an tes
de l a e s t i m u l a c i ó n con ECa, i n h i b i ó l a p r o d u c c i ó n d e l f a c t o r
de l a s 6 h o r a s , i n d i c a n d o que s u p r o d u c c i ó n depende de
s í n t e s i s a c t i v a de p r o t e í ñ a s b a j o e s t í m u l o a n t i g é n i c o . E l
t r a t a m i e n t o con l i p o p o l i s a c á r i d o no e s t i m u l a l a p r o d u c c i ó n d e l
componente a c t i v o en l o s sob renadantes de 6 h o r a s CTabla
I I ) .
Hemos l l e v a d o a cabo c o r r i m i e n t o s e l e c t r o f o r é t i c o s con y s i n
D o d e c i 1 S u l f a t o de S o d i o y hemos e n c o n t r a d o una p r o t e í na de
a p r o x i madamente 1 7 , 0 0 0 d a l t o n e s p r e s e n t e s ó l o en l o s
sob renadantes de 6 horas de macrófagos e s t i m u l a d o s por 6 horas
con ECa. C F i g . 7 ) .
Pru&bas de tablero CChecherboard assays}. Como se muestra en
l a F i g . 8, se demostró a c t i v i d a d q u i m i o t á c t i c a en pruebas de
gr a d i e n t e s . La mayor r e s p u e s t a de mi g rac i ó n de c é l u l a s de
bazo se e n c o n t r ó en g r a d i e n t e s p o s i t i v o s , m i e n t r a s que l a s
r e s p u e s t a s h a c i a e l g r a d i e n t e n e g a t i v o o en a u s e n c i a de e s t e ,
f u e r o n comparat ivamante menores. Todas l a s d i f e r e n c i a s e n t r e
g rupos e x p e r i m e n t a l e s t u v i e r o n s i g n i f i c a n c i a e s t a d í s t i c a con
una P < 0 . 0 1 .
Demos i rae i ón de los macrófagos como las células produc toras
del factor quirniotÁc tico de las 6 horas. En la tabla I I I se
puede a p r e c i a r que e l t r a t a m i e n t o de c é l u l a s a d h e r e n t e s de
exudado p e r i t o n e a l con a n t i c u e r p o s a n t i c é l u l a s T y B no t i e n e
n i n g ú n e f e c t o s o b r e l a p r o d u c c i ó n d e l f a c t o r q u i m i o t á c t i c o de
l a s 6 h o r a s , s u g i r i e n d o que l o s macrófagos son l a f u e n t e de
d i c h o f a c t o r . En é s t a t a b l a se puede t a m b i é n o b s e r v a r l a s
r e s p u e s t a s de m i g r a c i ó n de c é l u l a s de bazo h a c i a sob renadantes
de 6 ho ras de c u l t i v o s de macrófagos de r a t a s W i s t a r o n u / n u
i ncubados con ECa. Además se puede a p r e c i a r l a r e s p u e s t a de
m i g r a c i ó n h a c i a s u e r o de cobayo a l ÍO X y h a c i a s o l u c i ó n de
Ge y . Los t r a t a m i e n t o s A, B o C m o s t r a r o n d i f e r e n c i a s
s i g n i f i c a t i v a s con r e s p e c t o a l o s t r a t a m i e n t o s E o D con una P
• 0 . 0 5 . Todas l a s demás d i f e r e n c i a s e n t r e t r a t a m i e n t o s no
a l c a n z a r o n s i g n i f i c a n c i a e s t a d í s t i c a con una P • 0 . 0 5 .
6 2 9 1 1
DISCUSION
Se ha demostrado p r e v i a m e n t e C 4 7 , 4 8 ) que l a s c é l u l a s T
a c t i vadas pueden p r o d u c i r s u s t a n c i a s q u i m i o t á c t i c a s pa ra
macrófagos de modo que l a i n t e r a c c i ó n l i n f o c i t o — m a c r ó f a g o se
f a c i l i t e .
Nues t ros e x p e r i m e n t o s se d i s e c a r o n p a r a demost ra r e l
e f e c t o opues to , es d e c i r , que l o s macrófagos p roducen a l g ú n
Cos) f a c t o r Ces) q u i m i o t á c t i c o Cs) p a r a l i n f o c i t o s T después
de un e s t í m u l o a n t i g é n i c o en l a e tapa temprana de l a r e s p u e s t a
inmune.
Las c é l u l a s a d h e r e n t e s de exudado p e r i t o n e a l p r o d u j e r o n a l
menos dos s u s t a n c l a s CSi y Sa) 1 as c u a l e s a t r a e n l i n f o c i t o s .
Si se p roduce 6 ho ras depués de e s t í mulo a n t i g é n i c o , m i e n t r a s
que S2 se p roduce l u e g o de 24 toras de e s t i m u l a c i ó n .
La s u s t a n c i a p r o d u c i d a a l a s 24 h o r a s p o d r í a s e r
i n t e r l e u c i n a - 1 CIL-»1) , una mo lécu la b i e n e s t u d i a d a por K iosecc
y o t r o s C9, 1 0 , 1 3 , 1 4 , 4 4 ) l a c u a l t i e n e a c t i v i d a d q u i m i o t á c t i c a
pa ra l i n f o c i t o s , n e u t r ó f i l o s y monoc i tos .
E s t e hecho h i z o e n f o c a r n u e s t r a a t e n c i ó n a l f a c t o r de l a s
6 horas d e b i d o a que no ha s i d o r e p o r t a d o aún.
Las c é l u l a s de bazo r e s p o n d i e r o n b i e n a l o s sob renadantes
de 6 ho ras , m i e n t r a s que l a s c é l u l a s de s a n g r e p e r i f é r i c a
tambi én r e s p o n d í e r o n a 1 os sob renadantes de 24 y 25 h o r a s .
Par ec e haber una s e l e c c i ó n de l a s c é l u l a s par a r es ponder a
d i c h o s s o b r e n a d a n t e s , ya que n o s o t r o s encontramos que
l i n f o c i t o s pequemos C6¿J) responden p r e f er ene i a l mente a l o s
sobrenadantes de 6 h o r a s , m i e n t r a s que n e u t r ó f i l o s
r e s p o n d i e r o n en fo rma s i g n i f i c a t i v a a l o s sob renadantes de 24
h o r a s . La p r e s e n c i a de a l menos dos s u s t a n c i a s p r o d u c i d a s en
d i f e r e n t e s e tapas de l a r e s p u e s t a inmune pueden promuever
r e s p u e s t a s de m i g r a c i ó n de d i f e r e n t e s c é l u l a s .
La s u s t a n c i a p r o d u c i d a a l a s 6 horas pa rece e s t i m u l a r s ó l o
a c é l u l a s T ya que l a s c é l u l a s de r a t a s desnudas Cnu/nuD no
r e s p o n d i e r o n a l t r a t a m i e n t o , m i e n t r a s que l a s de sus padres
C n u / + ) s i l o h i c i e r o n .
Por o t r o lado» parece se r que l o s macróf agos son l o s
r e s p o n s a b l e s de p r o d u c i r l a s u s t a n c i a q u i r a i o t á c t i c a de l a s 6
ho ras ya que c é l u l a s a d h e r e n t e s . de exudado p e r i t o n e a l
t r a t a d a s con a n t i c u e r p o s monoc lona les a n t i c é l u l a s T y
B c o n t i n ú a n p r o d u c i e n d o d i c h a s u s t a n c i a . O t r a e v i d e n c i a es
que l a s c é l u l a s adheren tes de r a t a s n u / n u ( c a r e n t e s de t i m o y
por t ant o de 1 i n f oc i t o s T) p roducen sobr enadantes de 6 hor as
con a c t i v i d a d q u i m i o t á c t i c a , después de e s t í m u l o a n t i g é n i c o .
O t r o aspecto i m p o r t a n t e de e s t e t r a b a j o f u é demost rar s i
e l f a c t o r r e s p o n s a b l e de l a a c t i v i d a d q u i m i o t á c t i c a en l o s
sobrenadantes de 6 h o r a s , e r a I L - 1 . La c a r a c t e r i z a c i ó n p a r c i a l
ha most r ado una a l t a suscept i b i 1 i d a d a l a d i ges t i ó n por
t r i p s i n a , q u i m i o t r i p s i n a y p a p a í n a , e s t o s da tos no concuerdan
con a q u e l l o s r e p o r t a d o s pa ra i n t e r l e u c i n a - 1 , l a c u a l es
r e l a t i v a m e n t e r e s i s t e n t e a l t r a t a m i e n t o con e s t a s enzimas
C44 ) . Más aún n u e s t r a s u s t a n c i a no es p r o d u c i d a b a j o
e s t i muí ac i ón mi t ogén i c a u t i 1 i z a n d o LPS e l cua l es un p o t e n t e
i n d u c t o r de I L - 1 . La ú n i c a c a r a c t e r í s t i c a en común es que l o s
pesos mo lecu la res de l a I L - 1 y de n u e s t r a s u s t a n c i a son
s i m i l a r e s , l a I L - l murirta y humana pesa 1 7 , 4 5 0 d a l t o n e s C49) ,
m i e n t r a s que n u e s t r a s u s t a n c i a pesa aproximadamente 1 7 , 0 0 0
d a l t o n e s .
Se c onc1uye que 1as c é l u l a s a d h e r e n t e s de exudado
per i t onea 1 C mac r ó f agos ) , pr odu j er orí una s us t anc i a
q u i m i o t á c t i c a en l a e t a p a temprana de l a r e s p u e s t a Inmune
Csobrenadantes de 6 h o r a s ) , cuyo b l a n c o p r o b a b l e son l o s
l i n f o c l t o s T. Esta s u s t a n c i a p o d r í a j u g a r un pape l en l a
ac 11rae i ón 1 n i e l a l de l a r espues t a 1nmune y puede ser
r e s p o n s a b l e de l a acumu lac ión e s p e c í f l e a de l i n f o c l t o s T en
l o s ó rganos p e r i f é r i c o s después de un r e t o a n t i g é n i c o . Es ta
mo lécu la no t i e n e e f e c t o s e s p e c í f i c o s de a n t í g e n o d e b i d o a que
c é l u l a s s e n s i b l e s a l a n t í geno y no s e n s i b l e s responden de 1 a
misma manera a e s t a s u s t a n c i a . Es n e c e s a r i o e s t a b l e c e r s i é s t a
s u s t a n c i a tamb ién c o l a b o r a en l a a c t i v a c i ó n de c é l u l a s T.
RESPUESTA DE MIGRACION (cuentas celulares)
Ö?5 l!ö \ CASEINA (mg/ml)
RESPUESTA DE MIGRACION (cuentae celularee)
260
200
160
100
60
0
• LINF0QT08 TOTALES DE BAZO • UNFOCITOS TOTALES DE 8ANGRE PERIFERICA 0 NEUTROFILOS
ZL
6 HORAS
J L
i 7Z?
24 HORAS 25 HORAS SOLUCION DE GEY
RESPUESTA DE MIGRACION (cuentas celular«®)
TIEMPO (horas)
A ECa-6hs
B ECa-24hs
C Solucidn de Qey
RESPUESTA DE MIGRACION (cuentas celulares) 260
I IU/+
nu/nu
6hsECa 6hsQEY SOLUCION DE QEY
RESPUESTA DE MIGRACION <ouenta» 0«lul«r»») 300
1A
• 1B 2A 2B SOLUCION
DE GEY
BB
45 3B
29
24
20.1
14.2
RESPUESTA DE MIGRACION (cuentas celulares) 100
GRADIENTE AUSENCIA GRADIENTE POSITIVO DE NEGATIVO
GRADIENTE
REDUCCION TRATAMIENTO DE LA
ACTIVIDAD (%>
TRIPSINA 95
QUIMIOTRIPSINA 95
RNaaa O
PARAINA 70
PAPAINA • 70 UREA 8M
66°C/30' 1
70*C/30' 70
100°C/10' 93
RESPUESTA DE
MIGRACION TRATAMIENTO (cuentas celulares)
ECa-6hs 140 t 27
ACTINOMICINA D* 57 1 13 • ECa
LPS-6hs 45 * 11
SOLUCION DE GEY 74 • 2
Se cultivaron macro'fagos previamente con actlnomicina D por 1 hora e inmediatamen-te se incubaron con ECa por 6 horas.
RESPUESTA DE TRATAMIENTO , MIGRACION
(cuentas celulares)
A Antl-células T/B ' 44 • / - 10
B ECa-6hs 57+/« 10
C Nu/nu-6hs 65 • / - 24
D Suero de cobayo 9 • / - 6
E Solución de Gey 18 • / - 13
BIBLIOGRAFIA
Gordon, S . , Unke less , J . , Z. A. Cohn. 1974. I n d u c t i o n
o f macrophage p l a s m i n o g e n a c t i v a t o r by e n d o t o x i n
s t i m u l a t i o n and p h a g o c y t o s i s . Ev idence f o r a t w o - s t a g e
p r o c e s s . J .Exp .Med . 1 0 4 : 9 9 5 .
Werb, 2. , S. Gordon. 1975. S e c r e t i o n o f a s p e c i f i c c o l l a g e n a s e
by s t i m u l a t e d macrophages. J. Exp. Ned. 1 4 2 : 3 4 6 .
Werb, Z . , S. Gordon. 1975. E l a s t a s e s e c r e t i o n by s t i m u l a -
t e d macrophages. J. Exp. Med.142; 361»
C o l t e n , H.R. 1974. B i o s y n t h e s i s o f serum complement, i n B r e n t
L, Hoiborow J Ceds)* Progress in 1mmxaxology, Amsterdam,
N o r t h - H o l l a n d , P u b l i s h i n g Company, pp 183.
Smi th , T . J . , R. R, Wagner. 1967. R a b b i t macrophages
i n t e r f e r o n s . I . C o n d i t i o n s f o r b i o s y n t h e s i s by v i r u s - i n f e c t e d
and u n i n f e c t e d c e l l s . J . Exp. Med. 185125 :559 .
Gordon, S . , Todd, J . , Z. A, Cohn. 1974. In vitro s y n t h e s i s and
s e c r e t i o n o f l ysozyme by mononuclear phagocy tes . J* Exp. Med.
139 :1228 .
Gery , I . , Gershon, R. IC. , B. H, Waskman. 1972. P o t e n t i a t i o n o f t h e
T 1ymphocyte r e s p o n s e t o mi t o g e n s . I . The r e s p o n d i ng e e l 1 . J.
Exp. Med. 1 3 6 : 1 2 8 .
C a l d e r o n , J . , E. R, Unanue. 1975. Two B i o l o g i c a l a c t i v i t i e s
r e g u l a t i n g c e l l p r o l i f e r a t i o n f o u n d i n c u l t u r e s o f p e r i t o n e a l
exudate c e l l s . N a t u r e CWashington) . 553« 359.
M iossec , P . , Yu -Cha, L . , M. Z i f f . 1984. Lymphocyte chemotact lc
a c t i v i t y o f human i n t e r l e u k i n - 1 . J. Immunol. 133 :2007 .
. Sauder , D. N . , Movnessa, N . L . , Katz , S. I , D l n a r e l l o , C .A , J . I ,
G a l l i n . 1984. Chemotact lc c y t o k i n e s : t h e r o l e o f l e u k o c y t i c
pyrogen and epidermal cell thymocyte-actirating factor in
n e u t r o p h i l chemotax is . J. Immunol. 1 3 2 : 8 2 8 .
R o s e n t h a l , A. S, L i p s k y , P. E, E. M, Shevach. 1975.
Macrophage - l ymphocyte i n t e r a c t i o n and a n t i g e n r e c o g n i t i o n .
Fed. P roc . 34«1743.
Ward, P . A . , Remold, H.G, J . R . D a v i d . 1969. L e u k o t a c t i c
f a c t o r p roduced by s e n s i t i z e d l ymphocytes . Sc ience . 163t1079.
G r a n s t e i n , R. D . , M i z e l , M. S, D. N, Sauder . 1985. In vivo
chemotact ic a c t i v i t y o f e p i d e r m a l c e l l - d e r i v e d thymocyte
a c t i v a t i n g f a c t o r CETAF) and i n t e r l e u k i n - 1 i n t h e mouse.
J . L e u k . B i o l . 37* 709.
L u g e r , T. A, Charon , J. A, C o l o t , M. , Micksche, M. , J. J,
Oppenheim. 1 9 8 3 . C h e m o t a c t i c p r o p e r t i e s o f p a r t i a l l y p u r i f i e d
human e p i d e r m a l c e l l - d e r i v e d thymocytes a c t i v a t i n g f a c t o r
CETAF3 f o r p o l y m o r p h o n u c l e a r c e l l s . J. Immunol . 131t816 .
Ward, P. A, Unanue, E. R, G o r a l n i c k , S. J, G. F , S c h r e i n e r .
1977. Chemotaxis o f r a t l ymphocy tes . J . Immunol . I l 9 t 416.
C a h i l l , R . N . P , F r o s t , H . , Z. T rnka . 1976. The e f f e c t s o f
r e c i r c u l a t i n g l ymphocytes t h r o u g h s i n g l e lymph nodes. J . Exp.
Med. 1 4 3 : 8 7 0 .
C u t l e r , J . E . 1974. A s i m p l e i n vitro method f o r s t u d i e s on
chemotax is . P roc . Soc. Exp. Med. 147s 471.
Ward, P. A, R. V, Y u r t . 1985. Respuesta i n f lama t o r i a y pape l
d e l complemento. I n f e c t o l o g i a . num. lOs p. 265.
F ishman, M. , F. L. A d l e r * 1963. A n t i b o d y f o r m a t i o n i n i t i a t e d
i n v i t r o . I I A n t i b o d y s y n t h e s i s i n X - i r r a d i a t e d r e c i p i e n t s o f
d i f f u s i o n chambers c o n t a i n i n g n u c l e i c a c i d d e r i v e d f r o m
macrophages i n c u b a t e d w i t h a n t i g e n . J .Exp .Med . 1 1 7 : 5 9 5 .
protein with inflamatory and neutrophil cheraokinetic
p r o p e r t i e s , J. Exp. Med. 167 ;570 .
29. E l - N a g g a r , A. K . , Van Epps, D. E . , R. C . , W i l l i a m s J r . 1980.
Human-B and T - l y m p h o c y t e l o c o m o t i o n i n response t o c a s e i n ,
C5a, and f - m e t - l e u - p h e . C e l l u l a r Immunology. 56 :365 .
30. R u s s e l l , R . J . , W i l k i n s o n , P .C . , S I e s s , F. , D. M. V. , P a r r o t .
1975. Chemotaxis o f l y m p h o b l a s t s . Nature CLondorO. 256 :646 .
31. Zigmond, S. H . , J. G . , H i r s h . 1973. Leukocyte l o c o m o t i o n and
chemotaxis . New methods f o r e v a l u a t i o n , and d e m o n s t r a t i o n o f a
c e l l - d e r i v e d chemotact ic f a c t o r . J .Exp.Med. 137 :387 .
32. L i p s k y , P . E . , A. S . , Rosen tha l . 1973. Macrophage - l y m p h o c y t e
1nterac t i on. I . C h a r a c t e r i s t i c s o f t h e a n t i g e n - i »dependent
b i n d i n g o f gu inea p i g thymocytes and lymphocytes t o syngeneic
macrophages. J .Exp.Med. 138 :900 .
33. Lopez, L . R . , V a t t e r , A. E . , D .W. , TaImage. 1977. The
requ i rement o f v i a b l e thymocytes f o r s p e c i e s - s p e c i f i c
attachment t o and r e l e a s e f r o m macrophages. J. Immunol.
H Q : 1668.
34. S a l v i n , S. B . , S e l l , S . , J. N i s h i o . 1971. A c t i v i t y in vitro o f
lymphocytes and macrophages i n de layed h y p e r s e n s i t i v i t y . J.
Immunol. 107:655.
35. Berman, L. 1966. Lymphocytes and macrophages in vitro. T h e i r
a c t i v i t i e s i n r e l a t i o n t o f u n c t i o n s o f s m a l l lymphocytes . Lab.
I n v e s t . 15 :1084 .
36. Mc F a r l a n d , W., D . H . , Hei lman. 1965. Lymphocyte f o o t
appendage: I t s r o l e , i n lymphocyte f u n c t i o n and immunolog ica l
r e a c t i o n s . Nature ( L o n d o n ) . 205 :887 .
37. S i e g e l , I . 1970. N a t u r a l and a n t i b o d y - i n d u c e d adherence o f
guinea pig phagocytic cells to autologous and heterologous
thymocytes. J. Immunol. 1OS:879.
38. P a r r o t , D. M. V . , P . C . , W i l k i n s o n . 1981. Lymphocyte l o c o r a t i o n
and m i g r a t i o n . P rog . A l l e r g y . 2 8 : 1 9 3 .
39. C a l d e r o n , J . , K i e l y , J -M, L e f k o , J . L , E. R. Unanue. 1975. The
m o d u l a t i on o f 1ymphocyte f u n c t i o n s by m o l e c u l e s s e c r e t e d by
macrophages. D e s c r i p t i o n and p a r t i a l b i o c h e m i c a l a n a l y s i s .
J . E x p . R e d . 1 4 2 : 1 5 1 .
40. Unanue, E. R . , K i e l y , J -M, J. C a l d e r o n . 1976. The m o d u l a t i o n o f
l ymphocyte f u n c t i o n s by mo lecu les s e c r e t e d by macrophages. I I .
C o n d i t i o n s l e a d i n g t o i n c r e a s e d s e c r e t i o n . J . E x p . Med. 1 4 4 : 1 5 5 .
41. W i l k i n s o n , P . C . 1977. N e u t r o p h i l l e u k o c y t e f u n c t i o n t e s t s , i n
Thompson RA C e d ) : Techniques in Clinical Immunology, O x f o r d ,
B l a c k w e l l S c i e n t i f i c P u b l i c a t i o n s , p 201.
42. Ward, P . A . , O f f e n , C. D . , J . R Motgomery. 1971. C h e m o a t t r a c t a n t s
o f l e u k o c y t e s , w i t h s p e c i a l r e f e r e n c e t o l ymphocy tes . Fed.
P roc . 3 0 : 1 7 2 1 .
43. Mi s h e l l , B. B, S h i i g i , S. M . , Henry , C . , Chan, E. L . , N o r t h , J . ,
G a l l i l y , R . , S l omich , M . , M i l l e r , K . , Marbrook, J . , P a r k s , D . ,
A. H. Good. 1 9 8 0 . P r e p a r a t i o n s o f mouse c e l l s u s p e n s i o n s , i n
H i s h e l l BB, S h i i g i SM C e d s ) : Selected Methods in Cellular
Immunology, San F r a n c i s c o , Freeman WH and Company, p. 3*
44. M i z e l , S. B. . 1982. I n t e r l e u k i n 1 and T c e l l a c t i v a t i o n .
Immunol. Rev. 6 3 : 5 1 .
45. Takeda, Y . , Shimada S . , Sug imoto M. , Woo H . J . , H i g u c h i M. , T.
Osawa. 1985. P u r i f i c a t i o n and c h a r a c t e r i z a t i o n o f a c y t o t o x i c
f a c t o r p roduced by a mouse macrophage hybr idoma. C e l l .
Immunol. 9 6 : 2 7 7 .
Laera l i , U.K. 1970. C l e a v a g e o f s t r u c t u r a l p r o t e i n s d u r i n g t h e
assembly o f t h e head o f b a c t e r i o p h a g e T4. N a t u r e . s 680.
Ward, P. A . , R. W. Y u r t . 1985. Respuesta I n f l a m a t o r i a y p a p e l
d e l complemento. I n f e c t o l o g i a , afío V, NUHUIO, p . 265.
Uñarme, E .R . 1976. S e c r e t o r y f u n c t i o n o f mononuclear
phagocytes . Am. J. P a t h o l . 8 3 : 3 9 6 .
Hopp, T . P . , Dower, S. K . , C . J . March. 1986. The m o l e c u l a r
fo rms o f i n t e r l e u k i n - 1 . Immunol. Res. 5 : 2 7 1 .
