低コスト生産が可能な 安定型vhh抗体の迅速開発 …...1...
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低コスト生産が可能な安定型VHH抗体の迅速開発法
琉球大学大学院医学研究科助教 村上 明一
2
抗体とは?
生体に侵入した異物に特異的に結合し、それを除去するタンパク質
CH2
CH3
CH2
CH3
~150KDaIgG
FcHinge
可変部
定常部
ドメイン:自立的に折り畳まれるタンパク質構造の中の安定なユニット部分。
CDR1-L
CDR3-L
CDR2-L
CDR1-H
CDR3-HCDR2-H
2本のH鎖と2本のL鎖で構成される相補性決定領域(CDR)
超可変領域
ドメイン構造
VH VL
一本鎖抗体(scFv)~25KDa
3
抗体の利用法
イムノクロマトグラフィー
目視による判定
医療分野(治療用抗体・検査用抗体など)環境保全分野(環境ホルモン・アレルゲン物質など)危機管理分野(生物化学兵器・爆発物・麻薬など)
食品管理分野(残留農薬・微生物・食物アレルゲンなど)
:どこでも、誰でも、機器が不要、短時間(3~30分)
・ 結核菌群同定・ インフルエンザウイルス検出・ アデノウイルス検出・ 大腸菌ベロトキシン検出・ レジオネラ属菌検出・ 妊娠検査・ 心筋梗塞検査・ 腎機能・ 指定薬物検出・ 食物アレルゲン検出 など多数
既存製品例
治療用抗体 ・ 検査用抗体 ・ バイオセンサー
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抗体製品の問題点とニーズ
開発期間が長く高コスト ・ 生産コストが高い ・ 安定性が悪い
安価かつ短期間で開発 ・ 低コストで大量に生産 ・ 高い変性耐性
• ラクダ科H鎖抗体可変部(VHH)を利用
• ライブラリー法による迅速、低コスト開発
• 大腸菌などを使用した、低コスト・大量生産
当該技術
一般的なIgG
CH2
CH3
CH2
CH3
C1NAR
C2NAR
C3NAR
C4NAR
C5NAR
IgNARhcIgG
H鎖のみで構成される抗体
サメ類由来NAR: New Antigen Receptor
ラクダ科動物由来hcIgG: heavy chain IgG
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一般的な抗体Camel: 50-80%South american camelid: 10-25%
発見者:Hamers-Casterman et al., 1993ラクダ科H鎖抗体
L鎖可変部 H鎖可変部
黄色が相互作用に関与する疎水性アミノ酸残基
CDR1
CDR2CDR3
安定性が高い(熱・変性剤・pH)
大腸菌等での大量生産が可
親和性は通常抗体と同等
隠れたエピトープも認識可
加工が容易
基本特許が終了
H鎖抗体可変領域(抗原結合領域)
scFv
ラクダ科H鎖抗体
VHH<15KDa
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一般的なモノクローナル抗体作製法
1975年にミルスタイン先生らにより発明されたハイブリドーマ法(1984年ノーベル生理学・医学賞)
B細胞 親株
寿命抗体産生
サルベージ回路
短有○
長無×
HAT培地でのセレクション
ハイブリドーマ
~1ヶ月
細胞融合 & HAT選択
初回免疫 追加免疫 追加免疫 追加免疫 最終免疫
~2ヶ月
動物免疫作業
クローニング(ハイブリドーマの単クローン化)
~1ヶ月
抗体発現・精製
8
抗体作製法の比較ポリクローナル抗体
ハイブリドーマ法
• 期間 1~4週間
• 必要抗原量 ≦100mg
• 動物免疫不要
• in vitro 親和性成熟法
• 交差反応性抗体の除去
• 分子生物学的手法技術
• 単一のエピトープを認識
• 無限 / ロット差が無
• 自己、低免疫原性、抗毒物抗体
• 完全ヒト抗体作製可
• 期間 1~3ヶ月
• 必要抗原量 数mg
• 動物免疫
• 親和性成熟
• 自己反応性抗体除去
• 抗血清からの抗体精製
• 複数のエピトープを認識
• 有限 / 個体差・ロット差がある
• 期間 4~6ヶ月
• 必要抗原量 数mg
• 動物免疫
• 親和性成熟
• 自己反応性抗体除去
• ハイブリドーマ作製技術
• 単一のエピトープを認識
• 無限 / ロット差が無
ライブラリー法
モノクローナル抗体
動物飼育施設・経費動物愛護
9
抗体ライブラリーとは
多様な抗体を表面に発現し、それぞれの抗体遺伝子情報とリンクさせた集団
Filamentous phage抗体分子とその遺伝子をリンク
集団の大きさ≒多様性
10
どんな餌(抗原)でも良い魚(抗体)が釣れる!?
ライブラリー多様性の概念図
11
生体での抗体の多様性形成メカニズム
Vh D J
VH:
H鎖・L鎖の組合せ
遺伝子断片の再構成
接合部の不均一性 体細胞超突然変異
4つの多様性形成のメカニズム
Vh Vh Vh Vh D D D D J J J
V(D)J遺伝子再構成
接合部分での塩基の追加あるいは欠失が起こる(TdTやエクソヌクレアーゼが関与)
(マウス V遺伝子: >100、D遺伝子: 約15、J遺伝子: 5)
CDR1 CDR2 CDR3
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VHHライブラリーの多様性創製戦略
B細胞
PelB
CH2Hinge
1st PCR
2nd PCR
pPANA-01 PLac Stuffer DgIIIp
SfiI SfiI/NotI
FR1 CDR1 FR2 CDR2 CDR3FR3 FR4
FR1 CDR1 FR2 CDR2 CDR3FR3 FR4
FR1 CDR1 FR2 CDR2 CDR3FR3 FR4Leader
3rd PCR
CDR1
CDR2CDR3
mRNA
cDNA
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構築したVHHライブラリー
Day 1 Day 4Day 2 Day 3 Day 5
形質転換大腸菌数≒多様性:(4.0~4.2x109) x 5 ≧ 2x1010
Long hinge PCR #1 Short hinge PCR #1
計算上のVHH完全長遺伝子の多様性{ ( 11頭アルパカ ) x 1x107 B細胞 } 2≒ 1x1016
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VHHライブラリーの評価CSAVRandomclone#01 aa 1 QLQLVESGGGLVQAGGSLRLSCAASRSILSINAM-G-WYRQAPGKQRELVARISSGSS-THYADSVKGRFTISRHNANNTVYL-QMNNLKPEDTAVYYCATLRVVSLD-PWEY-----VYDY-T-GQGTQVTVSSAHHSEDPTASAA- 135CSAVRandomclone#02 aa 1 ELQLVESGGGLVQPGGSLRLSCEFSGSIFFYK-MG-WYRQAPG-KQRELVANISTTGRPY-YADAVKGRFTISKDSAKNTVH-LM-NSLKPEDTAVYYCNA--R-YLLT------Y-------W-GQGIQVTVSSEPKTPKPQSASAA 125CSAVRandomclone#04 aa 1 XXQLVESGGGFVQPGGSLRLSCTASGSIFGIVPM-G-WYRQAPGKQRDLVAMFTANGS-EWYAASVKGRFTISRDNAKNTVYL-QMNSLKPEDTGVYYCARCAGHVCFDVMDR-----DD-D-W-GQGTEVTVSSAHHSEDPTASAA- 135CSAVRandomclone#05 aa 1 QLQLVESGGGLVQTGDSLRLSCVYSGLT-FSEYGIAWFRQAPG-KEREGVSGISSSDGSTFYPNSVKGRFTISRDNAENTV-YLQMNSLKPEDTAVYYCAAR-GFAGLG-YSAH-E---YP-YW-GPGTQVTVSSAHHSEDPTASAA- 136CSAVRandomclone#06 aa 1 QVQLVESGGGVVQPGESLRLSCAATGFTFDYKGIA-WFRQVPG-KEREGVSCLTIYDGKTYYSDSVKGRFTISRDNAKNTVY-LQMNSLEPEDTAVYYCHAE-GPWPGVN-----Y-------W-GQGTQVTVSSEPKTPKPQSASAA 131CSAVRandomclone#07 aa 1 ELQLVESGGGLVQAGGSLRLSCEASGFIHDDTTIG-WFRQAPG-KEREGVSCIGRRDGSTDYADSVKGRFTISRDNAKKTIF-LEMSRLKPEDTAVYYCNEK-VTTGQG-MA---HRTGNY--W-GQGTQVTVSSEPKTPKPQSASAA 137CSAVRandomclone#09 aa 1 ELQLVESGGGLAQAGGSLKLSCATSGFTAFDH-AIGWFRQAPG-REREGVSCISIEDGRTIYGDSVKGRFTISIDSANNNTVYLQMNTLKPEDTAVYACN-W-G-------G--------H--W-GQGIQVTVPSAHHSEDPTASAA- 125CSAVRandomclone#10 aa 1 QLQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGTLFSFNTMG-WYRQAPG-KERELVAVTTSGGSTN-YADSVKGRFTISMDNTKNTVY-LQMDSLKPEDTAVYHCHVD-RPYGND------Y-------W-GQGTQVTVSSEPKTPKPQSASAA 129CSAVRandomclone#11 aa 1 EVQLVESGGGLVQAGGSLRLSCAASGFRFDDDSIG-WFRQAPG-KEREGVSCISSSAGSTYCTDSVKGRFTISRDGAKNTVF-LQMISLKPEDTAVYYCKMN-RGAYYR-YD---F-------W-GQGTQVTVSSEPKTPKPQSASAA 132CSAVRandomclone#12 aa 1 ELQLVESGGGLVQPGGSLRLSCVASGFTFSSYCM-YWV-RQAPGKGLEWVSAINTRGDNIYYADSVKGRFTASRDDAKNTVFL-QMNSLKPEDTAVYYC--------GMIRWGT--SPDD---W-GQGTQVTVSYAHHSEDPTASAA- 130CSAVRandomclone#13 aa 1 ELQLVESGGGLVQAGGSLRLSCAASGSIFGINTM-G-WYRQAPGKQRELVATIDQLSK-TNYANSVKGRFTISRDNAKNTLYL-QMNSLKSEDTAVYYCAKWVKKVVLTTAYY-----YGMDYW-GKGTLVTVSSAHHSEDPTASAA- 137CSAVRandomclone#14 aa 1 EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCSISGITSDYYAIG-WFRQAPE-KEREAVLCLSSSDESTYYDDSVKGRFTISRDNAKNTVY-LQMNSLKPEDTAVYYCAAK-YYSDYA-YD---Y-------W-GQGMQVTVSSEPKTPKPQSASAA 132CSAVRandomclone#15 aa 1 ELQLVESGGDLVQPGGSLRLSCAASGFTFRTYYM-AWV-RQAPGKGLEWVSSIDSRGITTTYADSVKGRFSISRDTAKNTVYL-QLNNLTPEDTAVYRCAA----TDGFVESPL--STYEYPYW-GQGTQVTVDSAHHSEDPTASAA- 137CSAVRandomclone#16 aa 1 EVQLVESGGGQVQPGGSLRLSCAGTGFTFDRNAIG-WFRQVPG-KEREGISCISSRGDSTGYVDSVKGRFTISRDNAKNTVY-LQMNSLKPEDTAVYYCVSL-GY------------------W-GQGTQVTVSSEPKTPKPQSASAA 125CSAVRandomclone#17 aa 1 QLQLVESGGGLVQAGGSLRLSCAASGRTFSSYAMG-WFRQAPG-KEREFVAALSWSGLSTYYADSVKGRFTISRDNAKNTLY-LQMNRLKPEDTAVYYCAAK-LSWSGVWYDIA-TWSGYD-YW-GQGTQVTVSSEPKTPKPQSASAA 141CSAVRandomclone#18 aa 1 ELQLVESGGGLVQAGGSLRLSCVASGTIFNINN--GFWYRQAPGNQREWVATIS-GYGGTDYADSVKGRFTISRDSAKNTVYL-QMDRLEPEDTAVYYCAIDYIGPYGSVVAWK--TRGYDS-W-GQGTQVTVSSAHHSEDPTASAA- 139CSAVRandomclone#19 aa 1 EVQLVESGGDLVQPGGSLRLSCSASGSIVNFTAM-G-WYRQAPGKQRESVAAIATD-----YAASVKG-FTISRDNAKNTLYL-QMNGLKPEDTAVYRCAAATRCTDGSRYPIT--S-GVDY-W-GKGTLVTVSPAHHSEDPTASAA- 133CSAVRandomclone#20 aa 1 EVQLVESGGGLVRAGGSLRLSCEASGSNLDAVDGFGWFRQ-APDKAREGLACISNRDGTTYYAASVKGRFTISRDNTKNTVYL-QMNSLIPDDTGNYTCVATW----GSQIHAA--AGIATHTYSGQGTQVTVSSAHHSEDPTASAA- 139CSAVRandomclone#21 aa 1 QVQLVESGGGSAQTGGSLRLSCAAPDGISSAISMG-WYRQAPGNQR-EKVASITATGVAL-YADSVKGRFTISRDNAKSTLYLQ-MDNLKPEDTAVYYCSLDYGYVCN---ERYRSLAGVADFYRK-GILVTVSSAHHSEDPTASAA- 139CSAVRandomclone#22 aa 1 EVQLVESGGGLVQAGGSLRLSCAVSGFTFDDYAIG-WFRQAPG-KEREAVSCISKIDGNTYYADSVKGRFTISRDNTEYTAY-LRMNSLKPEDTAVYYCNVK-GHVGIV-P----RKYDA---W-GQGTQVTVSSEPKTPKPQSASAA 135CSAVRandomclone#23 aa 1 EVQLVESGGGLVQPGNSLRLSCVGYGITLEDRAIG-WFRQAPG-KDREGVSCIQDDGST-YYTGSVKGRFTISRDNAKSTVN-LQMNNLKPEDTAVYYCART-TG-PAP---VE-G--GYK-DR-GQGTQVTVSSEPKTPKPQSASAA 134CSAVRandomclone#24 aa 1 QVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCVASVSFFSTYAL-G-WYRQAPGKQRELVAGIASGGI-TNYADSVKGRFTISRDNAKNTVYL-QMNSLKPEDTAVYYCNAKYGLGYGDPYEY-----D--Y-W-GQGTQVTVSSAHHSEDPTASAA- 134
CDR3 amino acid sequence CDR3 length Ig sub-class (CDR3 region from)Clone #01 ATLRVVSLDPWEYVYDYT 18 IgG3-Short hingeClone #02 NARYLLTY 8 IgG2-Long hingeClone #04 ARCAGHVCFDVMDRDDD 17 IgG3-Short hingeClone #05 AARGFAGLGYSAHEYPY 17 IgG3-Short hingeClone #06 HAEGPWPGVNY 11 IgG2-Long hingeClone #07 NEKVTTGQGMAHRTGNY 17 IgG2-Long hingeClone #09 NWGGH 5 IgG3-Short hingeClone #10 HVDRPYGNDY 10 IgG2-Long hingeClone #11 KMNRGAYYRYDF 12 IgG2-Long hingeClone #12 GMIRWGTSPDD 11 IgG3-Short hingeClone #13 AKWVKKVVLTTAYYYGMDY 19 IgG3-Short hingeClone #14 AAKYYSDYAYDY 12 IgG2-Long hingeClone #15 AATDGFVESPLSTYEYPY 18 IgG3-Short hingeClone #16 VSLGY 5 IgG2-Long hingeClone #17 AAKLSWSGVWYDIATWSGYDY 21 IgG2-Long hingeClone #18 AIDYIGPYGSVVAWKTRGYDS 21 IgG3-Short hingeClone #19 AAATRCTDGSRYPITSGVDY 20 IgG3-Short hingeClone #20 VATWGSQIHAAAGIATHTYS 20 IgG3-Short hingeClone #21 SLDYGYVCNERYRSLAGVADFYRK 24 IgG3-Short hingeClone #22 NVKGHVGIVPRKYDA 15 IgG2-Long hingeClone #23 ARTTGPAPVEGGYKDR 16 IgG2-Long hingeClone #24 NAKYGLGYGDPYEYDY 16 IgG3-Short hinge
CDR1
CDR2CDR3
次のラウンドへ
抗体遺伝子の単離
結合ファージの溶出
非結合ファージ除去
ライブラリー
大腸菌へ感染
洗浄 溶出
抗原との反応
抗原
ファージ産生
ライブラリーからのスクリーニング法(パニング:1ラウンド2日)
16
抗エボラウィルス抗体
0.0
0.5
1.0
1.5
2.0
2.5
3.0
3.5
4.0
4.5
A1
A3
A5
A7
A9
A11 B
1B
3B
5B
7B
9B
11 C1
C3
C5
C7
C9
C11 D
1D
3D
5D
7D
9D
11 E1
E3
E5
E7
E9
E11 F1 F3 F5 F7 F9 F11
G1
G3
G5
G7
G9
G11 H
1H
3H
5H
7H
9H
11
Abs
orba
nce(
O.D
.490
)
Ebora EBoV GP1 coat
2nd パニング後に得た単クローンファージを用いたELISA
PCR によるVHH遺伝子増幅↓
HhaI で消化↓
2% アガロースゲル電気泳動
HhaI 認識配列
GCGCCGCG
VHH遺伝子解析による独立したクローンの選択
Ebola GP1 protein coat
Ebola virus (Sudan) Glycoprotein / GP1 (mucin domain deleted) protein (aa Met1-Asp320, His Tag)
所要期間:6日
17
Clone #II:KD = 1.525e-9 M
100 nM VHH
50 nM VHH25 nM VHH12.5nM VHH
Clone #I : KD = 4.947e-9 M
25 kDa20 kDa
I II I II I II
固定化抗原:Recombinant HA (Sino Biological Inc.), 290.2 RU
抗インフルエンザ抗体HA(H1N1)特異的VHHの作製
0.0
0.5
1.0
1.5
2.0A
1A
3A
5B
1B
3B
5C
1C
3C
5D
1D
3D
5E
1E
3E
5 F1 F3 F5 G1
G3
G5
H1
H3
H5
A7
A9
B8
C7
C9
D8
E7
E9 F8 G7
G9
H8
A10
A12
B11
C10
C12
D11
E10
E12 F1
1G
10G
12H
11
Abs
orba
nce
(O.D
.490
)
H1 protein coat Human serum albumin coat
2nd パニング後に得た単クローンファージを用いたELISA
大腸菌での発現精製
18
抗インフルエンザ抗体広範な亜型結合性抗体の作製
0
1
2
3
4
5
6
H1-HA1-3 H1-E9 H1/5-G9 H1/5-2E4 H1/7-2B3 H1/7-2D1
Abs
orba
nce
(O.D
.490
)
H1 coat H5 coat H7 coat NP coat
1st panning 2nd panning 3rd panning
ヘマグルチニン• 少なくとも16種類 (H1~H16)• 細胞表面のシアル酸に結合して感染• エンドソームと融合してゲノムを細胞内に挿入
A H1N1 (A/California/04/2009 ) Hemagglutinin ProteinA H5N1 (A/Indonesia/5/2005) Hemagglutinin Protein A H7N7 (A/Netherlands/219/2003) Hemagglutinin Protein
19
熱耐性の高いVHH単離法
0.0
0.5
1.0
1.5
2.0
2.5
3.0
A1
A3
A5 B1 B3 B5 C1
C3
C5
D1
D3
D5 E1 E3 E5 F1 F3 F5 G1
G3
G5
H1
H3
H5
A7
A9
A11 B7 B9 B1
1C
7C
9C
11 D7
D9
D11 E7 E9 E1
1 F7 F9 F11
G7
G9
G11 H
7H
9H
11
Abs
orba
nce(
O.D
.490
)
cTnI coat cTnT coat
耐熱性スクリーニング法由来 通常スクリーニング由来
2nd パニング後に得た単クローンファージを用いたELISA
組織特異的なトロポニンアイソフォームの心筋トロポニンIと心筋トロポニンTは心筋梗塞などにおける心筋損傷のバイオマーカーとして知られる
トロポミオシンTCI
トロポニン
アクチン
特殊な耐熱性スクリーンング方法を検証
20
耐熱性 抗トロポニンT抗体
50% inhibition temp. (℃)
VHH-H-A1 75VHH-H-A5 >80VHH-H-A6 >80VHH-A10 62VHH-A11 >80VHH-B7 51scFv-01 46scFv-09 52scFv-11 54
0
20
40
60
80
100
120
30 40 50 60 70 80
% b
indi
ng
Treated temperature (oC)VHH-HA1 VHH-HA5 VHH-HA6 VHH-A10 VHH-A11VHH-B7 scFv-01 scFv-09 scFv-11
赤:耐熱性スクリーニングにより得られたVHHクローン青:通常スクリーニングにより得られたVHHクローン緑:一本鎖抗体(scFv)
VH VL
一本鎖抗体(scFv)
VHH
VHH
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まとめ
既存抗体製品
開発期間が長く高コスト ・ 生産コストが高い ・ 安定性が悪い
• ラクダ科H鎖抗体可変部(VHH)を利用
• ライブラリー法による迅速、低コスト開発
• 大腸菌などを使用した、低コスト・大量生産
発表技術
安定性が高い(熱・変性剤・pH)
1~2週間で従来法では得られない抗体を開発できる
22
企業への期待
VHHライブラリー構築
抗原準備(標的選択)
スクリーニング
発現精製
VHHの評価・標識
製品化
鳥型インフルエンザSARS、MERSデング熱など(感染症)がん関連分子リウマチ・アルツハイマーアレルゲン環境因子・・・・・・・・・・・・・・, etc.
様々な標的抗原に対して
1~2週間で
安価に大量生産できる
安定なVHHを取得可能
≧2x1010の多様性
アイデア・要望・用途に応じて迅速に安定・安価なVHHが得られる
治療用や疾患検査用などは勿論ですが、
バイオセンサーとして医療分野以外への導入を加速したい
23
本技術に関する知的財産権
• 多様性に富むVHHライブラリーを所有
• 様々なスクリーニング系を所有
取得抗体を個別に特許化する方針です
共同研究開発を希望
24
産学連携の経歴
• Panasonic株式会社
• (株)抗体工学研究センター
• イノベックスサイエンス株式会社
• プロテックス株式会社
• 大手医療機器メーカー
研究費
• 第一回JSTマッチングプランナープログラム
• 沖縄科学技術イノベーションシステム構築事業
25
お問い合わせ先
琉球大学
研究推進機構 研究企画室
上席リサーチ・アドミニストレーター
殿 岡 裕 樹
〒903-0213 沖縄県中頭郡西原町千原1番地
TEL:098-895-8703
FAX:098-895-8837
E-mail: [email protected]