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中国生物工程杂志　ＣｈｉｎａＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２０１０，３０（４）：１３１９

促进 ＣＨＯ细胞生长及其产物 ｈＮＧＦ表达的培养条件的初步研究

宋小红　于　婷　李　冰　付　玲　侯利华　陈　薇（军事医学科学院微生物流行病研究所病原生物生物安全国家重点实验室　北京　１０００７１）

摘要　以稳定表达人神经生长因子（ｈＮＧＦ）的重组工程ＣＨＯ细胞株为对象，采用无血清流加悬浮培养（Ｆｅｄｂａｔｃｈｃｕｌｔｕｒｅ）方式，考察使用基础培养基（无特殊添加物），分别添加丁酸钠、ＤＭＳＯ、ＫＨ２ＰＯ４的培养基及不同培养温度（３２℃和３７℃）对细胞生长和重组蛋白表达的影响。每日取样检测细胞密度、细胞活率、葡萄糖浓度、重组蛋白浓度。结果表明细胞培养温度由３７℃下降至３２℃，细胞生长周期明显延长，重组蛋白产量增加。５ｍｍｏｌ／Ｌ丁酸钠和２％ ＤＭＳＯ的加入虽然提高了重组蛋白的表达量，但严重抑制细胞生长。最大的蛋白比生成速率（ｑＮＧＦ）出现在３７℃培养且添加２％ ＤＭＳＯ的培养条件下，而最高蛋白表达量则出现于３２℃培养添加３．６５ｍｍｏｌ／ＬＫＨ２ＰＯ４的培养条件下。研究表明，将培养温度设为３２℃，在基础培养基中添加３．６５ｍｍｏｌ／ＬＫＨ２ＰＯ４或１％ ＤＭＳＯ是提高ｈＮＧＦ表达水平的有效方法。关键词　ＣＨＯ细胞　丁酸钠　二甲基亚砜　ＫＨ２ＰＯ４中图分类号　Ｑ３４３．６

收稿日期：２００９１２１４　　修回日期：２０１００１０８ 通讯作者，电子信箱：ｃｈｅｎｗｅｉ０２２６＠ｙａｈｏｏ．ｃｏｍ．ｃｎ，ｈｏｕｌｉｈｕａ＠ｓｉｎａ．ｃｏｍ

　　由于哺乳动物细胞表达的重组蛋白具有与天然蛋

白最大的相似性，使其成为蛋白类生物产品的理想宿

主细胞。目前欧美市场上，动物细胞表达的产品在整

个生物制药市场中的份额占到７０％以上。近些年来，

在国内进行哺乳动物细胞大规模培养的研究越来越

多［１］，但由于哺乳动物细胞规模化培养技术复杂，多数

蛋白表达水平较低，一直是影响其规模化生产的重要

因素之一。

　　ＣＨＯ细胞（中国仓鼠卵巢细胞）是用于哺乳动物

细胞表达的最主要的细胞系，约占哺乳动物表达细胞

的９０％以上，目前利用流加悬浮培养（Ｆｅｄｂａｔｃｈ）生产

的重组抗体的最高表达量已突破１０ｇ／Ｌ［２］。通常在筛

选到高水平表达的细胞克隆之后，要采取各种方式来

优化细胞培养工艺，以获得更高的蛋白产量。常用的

提高蛋白表达水平的技术手段有优化培养基成分、降

低细胞培养温度、加入丁酸钠、ＤＭＳＯ等一些阻止细胞

生长的添加物等。但是针对每一个细胞培养个例，不

同的方法起到的作用是不一样的，需要综合考虑。

　　在本研究中我们在已获得表达重组人神经生长因

子（ｈＮＧＦ）细胞株的基础上，进行提高重组蛋白表达产

量的研究。在实验中综合考察了温度、不同浓度的

ＤＭＳＯ、丁酸钠和ＫＨ２ＰＯ４对细胞生长、重组蛋白表达水

平的影响，为优化中试规模制备ｈＮＧＦ的细胞培养工艺

奠定了基础。

１　材料与方法

１．１　细胞株

　　稳定分泌表达重组人神经生长因子（ｈＮＧＦ）的

ＣＨＯ细胞工程株由本实验室构建。将含有人神经生长

因子 基 因 ｃＤＮＡ的 真 核 表 达 质 粒 转 染 ＣＨＯ Ｓ

（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）细胞，经 Ｇ４１８加压筛选获得阳性表达克

隆，该细胞克隆经传代适应于无血清悬浮培养。

１．２　细胞培养

　　将ＣＨＯ细胞培养于１２５ｍｌ摇瓶中（Ｃｏｒｎｉｎｇ），培养

基为无血清培养基（Ｈｙｃｌｏｎｅ），在培养基中添加一定量

中国生物工程杂志 ＣｈｉｎａＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｖｏｌ．３０Ｎｏ．４２０１０

的大豆水解物、酵母粉、胰岛素及 ２ｍｍｏｌ／Ｌ的谷氨酰

胺。细胞采用流加培养（Ｆｅｄｂａｔｃｈ）方式，根据葡萄糖

消耗情况，每日添加浓缩培养基，使细胞能够持续高密

度生长。摇瓶置于固定温度的培养箱内，转动速度为

１００ｒ／ｍｉｎ。

１．３　不同培养条件的细胞生长比较

　　将表达ｈＮＧＦ的ＣＨＯ工程株细胞复苏后，培养于Ｔ

７５ｃｍ２细胞培养方瓶（Ｃｏｒｎｉｎｇ）中，置于３７℃，５％ ＣＯ２细

胞培养箱（Ｆｏｒｍａ），待细胞密度增长至２．０×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍｌ，

转至摇瓶中培养，不断增加培养体积，至培养终体积达到

１０００ｍｌ，细胞密度为７×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍｌ以上。

　　用注射用水将丁酸钠（Ｓｉｇｍａ）配制为１００ｍｍｏｌ／Ｌ母

液，将 ＫＨ２ＰＯ４配制为 ７３ｍｍｏｌ／Ｌ母液，０．２２μｍ膜

（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）滤过后保存于４℃，使用时按照要求加入到

培养基中，ＤＭＳＯ（Ｓｉｇｍａ）直接加入到培养基中。

　　将达到高密度的细胞离心收集，分别更换不同的

培养基，每瓶２０ｍｌ，活细胞密度６．６×１０６ｃｅｌｌ／ｍｌ。培

养条件如下：第一组：（１）培养基（Ｍｅｄｉｕｍ，无特殊添加

物）；以下条件的培养基中分别添加；（２）丁酸钠（ＮａＢ

，１ｍｍｏｌ／Ｌ）；（３）丁酸钠（ＮａＢ，５ｍｍｏｌ／Ｌ）；（４）ＤＭＳＯ

（１％）；（５）ＤＭＳＯ（２％）；（６）ＫＨ２ＰＯ４（０．７３ｍｍｏｌ／Ｌ）；

（７）ＫＨ２ＰＯ４（３．６５ｍｍｏｌ／Ｌ），培养温度为３７℃；第二组：

细胞培养温度设为３２℃，其它条件同第一组。实验重

复两次。

１．４　检测方法

　　每日从摇瓶中取样品检测细胞密度、细胞活率、葡

萄糖浓度及ｈＮＧＦ表达量。利用台盼兰染色方法，使用

Ｃｏｕｎｔｅｓｓ自动细胞计数仪（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）读取活细胞密度

和细胞活率，使用 Ｒｏｃｈｅ葡萄糖检测试纸检测葡萄糖

浓度，每一样品重复检测一次，取平均值。

１．５　ｈＮＧＦ表达量检测

　　将每日样品离心后于 －８０℃冻存，细胞培养周期

结束后检测ｈＮＧＦ表达量。使用夹心法 ＥＬＩＳＡ检测试

剂盒（ＢＤ，ＤＹ２５６）测定培养上清中的 ｈＮＧＦ含量，以捕

获抗体包被９６孔板（Ｇｒｅｉｎｅｒ，Ｇｅｒｍａｎｙ），封闭后，加入

待测样品及标准品，然后加入检测抗体，再加入ＨＲＰ标

记的链亲素后，通过 ＯＰＤ进行显色反应后，在 ５５０ｎｍ

波长下读取ＯＤ值。通过标准品做标准曲线，计算样品

中ｈＮＧＦ的含量。检测时每个样品做复孔，取平均值。

１．６　ｈＮＧＦ比生成速率（ｑＮＧＦ）的计算

　　根据以下公式计算ｈＮＧＦ比生成速率。

ｑＮＧＦ＝１ＸｄＰｄｔ≈

２（Ｐｔ－Ｐ０）（Ｘ０＋Ｘｔ）·Δｔ

　　在本实验中，Ｘ０代表细胞起始培养时活细胞密度

（１０６ｃｅｌｌｓ／ｍｌ），Ｘｔ代表达到最高蛋白表达量时的活细

胞密度（１０６ｃｅｌｌｓ／ｍｌ），Ｐｔ代表最高蛋白浓度（μｇ／ｍｌ），Ｐ０代表细胞起始培养时的蛋白浓度，Δｔ代表达到最高蛋白浓度的时间（ｄａｙ）。

２　结果与分析

２．１　不同培养条件下细胞的生长情况　　对细胞培养来说，降低温度、添加抑制细胞生长的

丁酸钠、ＤＭＳＯ等物质会减缓细胞的生长速度，在本研究中先将细胞培养至较高的密度（６．６×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍｌ），然后再将细胞更换至含有不同添加物质的培养基中，

观察这些培养条件的变化对细胞生长和蛋白产量的影

响。实验进行两次，图中给出了一次实验的研究结果。

从图１ａ中可看出，与未添加其它物质的培养基相比，细

胞在含有 １ｍｍｏｌ／Ｌ丁酸钠、５ｍｍｏｌ／Ｌ丁酸钠、１％ＤＭＳＯ和２％ ＤＭＳＯ的情况下生长均受到抑制，细胞密

度及细胞活率均低于基础培养基。３７℃培养时，在基础培养基中，细胞生长持续６天。在添加 ＤＭＳＯ的培

养条件下，细胞生长持续５天，细胞密度呈持续下降趋势。在添加丁酸钠的培养条件下，细胞密度同样呈持

续下降趋势，细胞在添加１ｍｍｏｌ／Ｌ丁酸钠的培养基中生长时间较５ｍｍｏｌ／Ｌ丁酸钠培养基中延长１天。而在添加０．７３ｍｍｏｌ／Ｌ和３．６５ｍｍｏｌ／ＬＫＨ２ＰＯ４的培养条件下，活细胞密度在培养初期稍有下降之后，后期呈缓慢

上升趋势，最终分别达到 ６．５×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍｌ和 ７．３×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍｌ，细胞生长时间比基础培养基条件下延长１天，最终至７天。细胞培养初期密度下降的原因是细

胞需要适应新的培养基及培养容器。

　　从图１ｂ可以看出，与基础培养基相比，丁酸钠和

ＤＭＳＯ的添加严重影响了细胞生长状态，从第二天开始细胞活率降到８０％左右。添加１ｍｍｏｌ／Ｌ丁酸钠对细胞

活率的影响较添加５ｍｍｏｌ／Ｌ丁酸钠小，１％ ＤＭＳＯ对细胞活率的影响较２％ ＤＭＳＯ小，随着丁酸钠和ＤＭＳＯ浓

度的提高，细胞状态下降很多。在镜下观察，细胞形态

大小不均一，细胞碎片很多。而加入 ０．７３ｍｍｏｌ／Ｌ和３．６５ｍｍｏｌ／ＬＫＨ２ＰＯ４后，细胞活率较其它条件相比明显升高，除最后一天外，培养过程中细胞活率维持在９０％以上。在镜下观察发现，加入ＫＨ２ＰＯ４的细胞状态比其它

培养条件下均好，细胞形态大小均一，细胞碎片很少。

４１

２０１０，３０（４） 宋小红 等：促进ＣＨＯ细胞生长及其产物ｈＮＧＦ表达的培养条件的初步研究

图１　３７℃培养条件下生长于不同培养基中的细胞生长曲线

Ｆｉｇ．１　ＧｒｏｗｔｈｐｒｏｆｉｌｅｓｏｆＣＨＯｃｅｌｌｓｃｕｌｔｕｒｅｄｉｎｄｉｆｆｅｒｅｎｔｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓａｔ３７℃

　　接下来，进一步考察了在３２℃培养条件下生长于不

同培养基中的细胞生长情况（图２）。降低细胞培养温度

明显延长了细胞生长周期，与３７℃培养条件相比，细胞生

长周期由７天延长至１４天。在４种培养基中，细胞生长

图２　３２℃培养条件下生长于不同培养基中的细胞生长曲线

Ｆｉｇ．２　ＧｒｏｗｔｈｐｒｏｆｉｌｅｓｏｆＣＨＯｃｅｌｌｓｃｕｌｔｕｒｅｄｉｎｄｉｆｆｅｒｅｎｔｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓａｔ３２℃

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周期达到了１４天，包括基础培养基（ｍｅｄｉｕｍ），添加１％

ＤＭＳＯ、０．７３ｍｍｏｌ／Ｌ和３．６５ｍｍｏｌ／ＬＫＨ２ＰＯ４的培养基，

其中在基础培养基（ｍｅｄｉｕｍ）、添加０．７３ｍｍｏｌ／Ｌ和３．６５

ｍｍｏｌ／ＬＫＨ２ＰＯ４的培养基中活细胞密度均达到了１０×

１０６ｃｅｌｌｓ／ｍｌ以上，细胞生长状态明显好于其它培养基。在

添加１ｍｍｏｌ／Ｌ丁酸钠和２％ ＤＭＳＯ的培养基中细胞生长

周期为１０天，两者生长曲线相似。细胞在添加５ｍｍｏｌ／Ｌ丁

酸钠的培养基中只培养了６天，细胞密度呈不断下降趋

势，说明５ｍｍｏｌ／Ｌ丁酸钠严重抑制细胞生长。

　　综合以上条件，细胞在３２℃培养比在３７℃培养能

够获得更好的生长状态，细胞培养周期延长，细胞活率

能够较长时间维持在９０％以上。在不考虑重组蛋白表

达量的情况下，比较细胞生长曲线，添加０．７３ｍｍｏｌ／Ｌ

和３．６５ｍｍｏｌ／ＬＫＨ２ＰＯ４的培养基中细胞生长状态优于

基础培养基，而添加 ＤＭＳＯ与丁酸钠在一定程度上抑

制了细胞生长。

２．２　不同培养条件对ｈＮＧＦ表达量的影响

　　优化培养条件的目的并非为了获得更高的细胞密

度或更长的培养周期，本质上是通过培养条件的改变

来获得更高的重组蛋白产量。在 ３７℃培养条件下，

ｈＮＧＦ最高表达量出现于添加了３．６５ｍｍｏｌ／ＬＫＨ２ＰＯ４的培养条件下，达到１．５５ｍｇ／Ｌ，与基础培养基中最高表

达量０．８３ｍｇ／Ｌ相比，表达量提高了８７％。在其它培养

条件下，最高表达量比起基础培养基条件来均有所提

高，提高的幅度在４６％至７０％之间，详细数据见表１。表１　３７℃培养条件下最高活细胞密度、

最高蛋白表达量和ｑＮＧＦ

Ｔａｂｌｅ１　Ｔｈｅｍａｘｉｍｕｍｖｉａｂｌｅｃｅｌｌｄｅｎｓｉｔｙ，ｍａｘｉｍｕｍ

ｐｒｏｄｕｃｔｉｖｉｔｙａｎｄｑＮＧＦｏｆＣＨＯｃｅｌｌｓｃｕｌｔｕｒｅｄａｔ３７℃

培养条件（３７℃）最高活细

胞密度

（１０６ｃｅｌｌｓ／ｍｌ）

最高蛋白

表达量

（ｍｇ／Ｌ）

表达量提高

（与基础培

养基相比）

ｑＮＧＦ（ｎｇ／１０６ｃｅｌｌ·ｄａｙ）

Ｍｅｄｉｕｍ ６．６ ０．８３ ０ ３０１ｍｍｏｌ／ＬＮａＢ ６．６ １．３２ ５９％ ５７５ｍｏｌ／ＬＮａＢ ６．６ １．２１ ４５％ ６１１％ ＤＭＳＯ ６．６ １．３６ ６４％ ５８２％ ＤＭＳＯ ６．６ １．４１ ７０％ ７３０．７３ｍｍｏｌ／ＬＫＨ２ＰＯ４

６．６ １．１６ ３９％ ３０

３．６５ｍｍｏｌ／ＬＫＨ２ＰＯ４

７．３ １．５５ ８７％ ４５

　　在３２℃培养条件下，ｈＮＧＦ最高表达量同样出现于

添加了 ３．６５ｍｍｏｌ／ＬＫＨ２ＰＯ４ 的培养条件下，达到

５．７ｍｇ／Ｌ，与基础培养基最高表达量２．２９ｍｇ／Ｌ相比，表

达量提高了１４９％。在添加５ｍｍｏｌ／Ｌ丁酸钠的培养条

件下，由于此浓度的丁酸钠严重抑制细胞生长，细胞培

养只维持了６天，在培养过程中细胞密度及活率都较

差，ｈＮＧＦ的最高表达量仅为１．５４ｍｇ／Ｌ。添加１ｍｍｏｌ／Ｌ

丁酸钠及添加 ０．７３ｍｍｏｌ／ＬＫＨ２ＰＯ４的培养条件下，

ｈＮＧＦ最高表达量与基础培养基相当，无明显提高。添

加１％ ＤＭＳＯ和２％ ＤＭＳＯ的培养条件下，最高表达量

与基础培养基相比，分别提高了３８％和１１６％，详细数据

见表２。表２　３２℃培养条件下最高活细胞密度、

最高蛋白表达量和ｑＮＧＦ

Ｔａｂｌｅ２　Ｔｈｅｍａｘｉｍｕｍｖｉａｂｌｅｃｅｌｌｄｅｎｓｉｔｙ，ｍａｘｉｍｕｍ

ｐｒｏｄｕｃｔｉｖｉｔｙａｎｄｑＮＧＦｏｆＣＨＯｃｅｌｌｓｃｕｌｔｕｒｅｄａｔ３２℃

培养条件

（３２℃）

最高活细

胞密度

（１０６／ｍｌ）

最高蛋白

表达量

（ｍｇ／Ｌ）

表达量提高

（与基础培

养基相比）

表达量提

高（３２℃与３７℃相比）

ｑＮＧＦ（ｎｇ／１０６ｃｅｌｌ·ｄａｙ）

Ｍｅｄｉｕｍ ９．９ ２．２９ ０ １７６％ ２７１ｍｍｏｌ／ＬＮａＢ ６．６ ２．４１ ５％ ８３％ ６９５ｍｏｌ／ＬＮａＢ ６．６ １．５５ ３２％ ２８％ ６４１％ ＤＭＳＯ ６．６ ３．１７ ３８％ １３３％ ４９２％ ＤＭＳＯ ６．６ ４．９４ １１６％ ２５０％ ７００．７３ｍｍｏｌ／ＬＫＨ２ＰＯ４

１１．５ ２．３９ ４％ １０６％ ２６

３．６５ｍｍｏｌ／ＬＫＨ２ＰＯ４

１０．５ ５．７０ １４９％ ２６８％ ５８

　　比较３７℃与３２℃培养温度下 ｈＮＧＦ表达量的变

化，在同样的培养条件下，在３２℃时 ｈＮＧＦ最高表达量

均高于３７℃（图３）。在基础培养基条件中，３２℃时的

最高表达量比３７℃时的最高表达量提高了１７６％，而在

加入３．６５ｍｍｏｌ／ＬＫＨ２ＰＯ４的培养条件下最高表达量提

高了２６８％，说明降低培养温度是一种有效而又简便易

行的提高表达量的方法。通过降低培养温度，细胞生

长速度减缓，生长周期延长，从而获得更高的重组蛋白

表达量。

　　蛋白比生成速率（ｑ）反映了单位时间内单位细胞

生成重组蛋白的能力。从表１中可以看出，在３７℃培

养时，最大的ｑＮＧＦ出现在添加２％ ＤＭＳＯ的培养条件

下，达到 ７３ｎｇ／１０６ｃｅｌｌ·ｄａｙ，除了添加 ０．７３ｍｍｏｌ／Ｌ

ＫＨ２ＰＯ４的培养条件与基础培养基中的 ｑＮＧＦ相同外，

其它培养条件都促进了 ｑＮＧＦ的提高。在 ３２℃培养

时，最大的ｑＮＧＦ同样出现在添加２％ ＤＭＳＯ的培养条件

下，达到７０ｎｇ／１０６ｃｅｌｌ·ｄａｙ。添加０．７３ｍｍｏｌ／ＬＫＨ２ＰＯ４的培养条件与基础培养基中的 ｑＮＧＦ最低。比较同样培

养基而在不同培养温度下的 ｑＮＧＦ，在基础培养基、添

加１％ ＤＭＳＯ和添加 ０．７３ｍｍｏｌ／ＬＫＨ２ＰＯ４的培养基

中，３２℃培养条件的ｑＮＧＦ低于３７℃，说明在该条件下

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２０１０，３０（４） 宋小红 等：促进ＣＨＯ细胞生长及其产物ｈＮＧＦ表达的培养条件的初步研究

温度较高时，蛋白的比生成速率较高。而在加入

１ｍｍｏｌ／Ｌ丁酸钠、５ｍｍｏｌ／Ｌ丁酸钠和 ３．６５ｍｍｏｌ／Ｌ

ＫＨ２ＰＯ４的培养基中，３２℃培养条件时的 ｑＮＧＦ高于

３７℃，说明不同外源物质对于温度变化所引起的蛋白

生成速率的影响是不同的。

　　综合以上分析，将培养温度设为３２℃，在基础培养

基中添加 ３．６５ｍｍｏｌ／ＬＫＨ２ＰＯ４或 １％ ＤＭＳＯ是提高

ｈＮＧＦ表达水平的有效方法，添加３．６５ｍｍｏｌ／ＬＫＨ２ＰＯ４通过明显延长细胞培养时间（１４天）获得最高的表达

水平，虽然添加２％ ＤＭＳＯ能够通过提高蛋白比生成速

率在较短的时间获得较高的蛋白表达量，但由于严重

抑制细胞生长，细胞活率下降，并没有获得最高的蛋白

产量。

图３　不同细胞培养条件下ｈＮＧＦ表达量的变化

Ｆｉｇ．３　ＰｒｏｄｕｃｔｉｖｉｔｙｏｆｈＮＧＦｉｎｄｉｆｆｅｒｅｎｔｃｕｌｔｕｒｅｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ

３　讨　论

　　在本研究中，综合比较了温度、丁酸钠、ＤＭＳＯ和ＫＨ２ＰＯ４对 ＣＨＯ细胞生长和 ｈＮＧＦ表达水平的影响。通过降低温度来提高细胞产物的表达水平，已有较多

研究［３５］。Ｙｏｏｎ等［４］的研究表明细胞培养温度由３７℃降至３２℃（批培养模式），ＥＰＯ的最高浓度提高了１．７倍，ＦＳＨ的最高浓度提高了４．２倍，降低培养温度提高了蛋白的比生成速率。但经过低温适应培养的细胞与

马上降温培养的细胞相比，蛋白产量反而会降低。Ａｈｎ等［５］的研究表明降低培养温度能够增加 ＥＰＯ的产量（灌注培养模式），细胞在３２℃或在３０℃时的 ｑＥＰＯ高于３７℃时。在我们的研究中发现，就基础培养基相比，

降低温度虽然提高了蛋白的最高表达量，但并没有提

高ｑＮＧＦ（表１、表２）。　　丁酸钠能够增加 ＣＨＯ细胞中的蛋白表达水平［６８］，但加入 ５ｍｍｏｌ／Ｌ的丁酸钠严重抑制了细胞生长，细胞状态及活率下降很快，在细胞培养中不适宜添

加。在３２℃培养时，加入１ｍｍｏｌ／Ｌ丁酸钠的细胞密度、活率与基础培养基相比均有所下降，但最高蛋白浓度

有微弱提高，体现了丁酸钠对于提高蛋白产量的作用。

相对于添加ＤＭＳＯ或ＫＨ２ＰＯ４的培养条件，丁酸钠提高蛋白表达水平的效果并不突出。

　　ＤＭＳＯ对细胞生长的影响作用与丁酸钠相似［９］，通

过抑制细胞生长而提高蛋白产量，Ｌｉｕ等［１０］发现加入

２％ ＤＭＳＯ严重抑制细胞生长，细胞密度只达到对照的

７１

中国生物工程杂志 ＣｈｉｎａＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｖｏｌ．３０Ｎｏ．４２０１０

２０％，但对蛋白表达量的提高作用最明显。在我们的

研究中也发现同样的现象，在比较的几个培养条件中，

对细胞生长的抑制作用最强烈，但ｑＮＧＦ最高。大量细

胞死亡释放出蛋白酶，使得重组蛋白浓度在后期培养

中下降较快，培养末期蛋白产量与加入１％ ＤＭＳＯ的效

果差不多，但加入１％ ＤＭＳＯ的细胞生长状态更好，在

细胞培养中加入１％ ＤＭＳＯ是个较好的选择。

　　在考察的几种培养条件中，添加ＫＨ２ＰＯ４获得了最

好的细胞生长状态及最高的细胞产量，在以往的文献

中我们并未检索到这方面的相关研究，在细胞培养中

后期，由于钾离子的消耗，补液中钾离子浓度较低，导

致培养基中钾离子浓度偏低，造成细胞内液高钠低钾

的情况，不利于细胞生长，及时补加钾离子能够增强细

胞活力，细胞生长状态的提升导致了细胞产物的增加，

从而提高蛋白产量。

　　综上所述，本研究探索了通过优化细胞培养工艺

而获得了蛋白表达量提高的方法，下一步将这些方法

用于ＣＨＯ细胞的中试规模培养，以期获得更高的重组

蛋白产量。

参考文献

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［９］ＲｏｄｒｉｇｕｅｚＪ，ＳｐｅａｒｍａｎＭ，ＨｕｚｅｌＮ，ｅｔａｌ．Ｅｎｈａｎｃｅｄｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ

ｏｆｍｏｎｏｍｅｒｉｃｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎｂｅｔａｂｙＣＨＯｃｅｌｌｓｔｈｒｏｕｇｈｔｈｅｃｏｎｔｒｏｌｏｆ

ｃｕｌｔｕｒｅｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ．ＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌＰｒｏｇ，２００５，２１（１）：２２３０．

［１０］ＬｉｕＣＨ，ＣｈｅｎＬＨ．Ｐｒｏｍｏｔｉｏｎｏｆｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔｍａｃｒｏｐｈａｇｅｃｏｌｏｎｙ

ｓｔｉｍｕｌａｔｉｎｇｆａｃｔｏｒｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎｂｙｄｉｍｅｔｈｙｌｓｕｌｆｏｘｉｄｅａｄｄｉｔｉｏｎｉｎ

Ｃｈｉｎｅｓｅｈａｍｓｔｅｒｏｖａｒｙｃｅｌｌｓ．ＪＢｉｏｓｃｉＢｉｏｅｎｇ，２００７，１０３（１）：４５

４９．

８１

２０１０，３０（４） 宋小红 等：促进ＣＨＯ细胞生长及其产物ｈＮＧＦ表达的培养条件的初步研究

ＥｎｈａｎｃｅｄＰｒｏｄｕｃｔｉｏｎｏｆＨｕｍａｎＮｅｒｖｅＧｒｏｗｔｈＦａｃｔｏｒｂｙＣＨＯＣｅｌｌｓＴｈｒｏｕｇｈｔｈｅＣｏｎｔｒｏｌｏｆＣｕｌｔｕｒｅＣｏｎｄｉｔｉｏｎｓ

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