243

1．はじめに脳のなかでは成体であっても海馬や脳室下帯

といった限られた部分では絶え間なく新しいニューロンが生まれ続けている．脳室の周囲の脳室下帯という部分には神経幹細胞が存在し，神経幹細胞からより速い増殖をする一過性増殖細胞を作り出し，さらに一過性増殖細胞が新生ニューロンへと分化し，新生ニューロンはRMSと呼ばれる経路を長距離移動して成熟しながら

嗅球へ到達する（図1）1，2）．近年，脳梗塞などの脳損傷モデルにおいて神経幹細胞から新しいニューロンが供給されて神経の再生が起こることが報告され，現在ではほとんど不可能とされている中枢神経の修復に内在性神経幹細胞が利用できるのではないかと期待されている．しかし，神経幹細胞を利用した神経再生の実現化のためには神経幹細胞の安全性の確立や神経再生の効率化という課題があり，神経幹細胞や神経

平成23年度名古屋市立大学医学会賞受 賞 論 文

成体マウス脳内を移動する新生ニューロンにおけるDiversin の発現と増殖促進機能

池 田 麻記子名古屋市立大学大学院医学研究科 再生医学・整形外科学

Expression of Diversin and its function in the proliferation of migrating neuroblasts.

MAKIKO IKEDADepartment of Developmental and Regenerative Biology,

Institute of Molecular Medicine, and Department of Orthopedics,Nagoya City University Graduate School of Medical Sciences

Abstract

The subventricular zone（SVZ）is the largest neurogenic region in the adult rodent brain. Inthe adult SVZ, unlike in the embryonic brain, neuronally committed precursor cells（neuroblasts）maintain their proliferative activity while migrating toward the olfactory bulb（OB），suggestingthat they are inhibited from exiting the cell cycle. The ability to undergo proliferation during migra-tion is a unique feature of neuroblasts, however, its molecular mechanisms are largely unknown.Here we studied the expression and function of Diversin, a component of the Wnt signaling path-ways. The Diversin mRNA and protein were expressed in neuroblasts and mature neurons in theadult SVZ and hippocampus. We found that retrovirus-mediated overexpression of Diversin pro-moted the proliferation of neuroblasts and increased the number of neuroblasts that reached theOB. Conversely, the knockdown of Diversin decreased the proliferation of neuroblasts. These re-sults indicate that Diversin plays an important role in the proliferation of neuroblasts in the SVZ ofthe adult brain.

243

Nagoya Med. J.（2012）52,243―248

244

前駆細胞，新生ニューロンの増殖や分化・移動のメカニズムがさらに解明される必要がある．新生ニューロンは嗅球へ移動しながら増殖を続けているが3―5），この移動しながら増殖能を維持するというユニークな特徴のメカニズムはあまり明らかになっていない．一方で，神経幹細胞と神経前駆細胞の増殖に

Wnt シグナルが関与している事が近年明らかにされおり6―13），本研究ではWnt シグナルに着目した．Wnt シグナルは分泌性タンパクによって活性化されるシグナルで，神経発生において多様な機能を果たしている14）．Wnt シグナルには1）β-catenin 依存性の canonical 経路と，2）PCPをコントロールする non-canonical 経路（Wnt／PCP 経路）の2つの経路がある．Wnt／PCP 経路の下流分子RhoAは神経前駆細胞の移動をアクチン集合とともにコントロールしていることが明らかになっており15，16），canonical経路は SVZにおいて神経前駆細胞の増殖を促進することが報告されている17）．このようにWnt シグナルは中枢神経系において細胞の増殖と移動の両方に関与するシグナルである．Diversin はショウジョウバエで同定された

Diego の哺乳類相同分子であり，canonical および PCP経路に関与するWnt シグナル構成分子の一つである18，19）．Diversin はWnt-canonical経路において，β-catenin 分解複合体に caseinkinase をリクルートしてWnt シグナルを抑制すること18），PCP経路を促進してショウジョウバエの複眼，ゼブラフィッシュの原腸陥入や心形成を制御することが知られている20―22）．Di-versin は胎生期の海馬や脳室下帯，RMSなどに発現している事が報告されており23），神経新生に関与していることが示唆されていたが，その成体脳での発現や機能は明らかにされていなかった．本研究ではDiversin の成体脳神経新生領域における発現と機能を解析した24）．

2．Diversin は新生ニューロンと成熟ニューロンに局在している．

はじめに，成体脳でのDiversin mRNAの発現部位を in situ hybridization 法で調べたところ，嗅球顆粒細胞層，海馬歯状回，脳室下帯，RMSに発現しており，神経新生に関わる可能性が示唆された（図2）．次に，その発現を細胞種ごとに特定するため

にDiversin の抗体を作製した．ウェスタンブロット法にて脳室下帯，海馬のサンプルで予想される大きさのバンドを検出できた事から，この抗体を用いて脳切片を染色した．新生ニューロンのマーカーとして doublecortin（Dcx）25），成熟ニューロンのマーカーとしてNeuNを使

図1 脳室下帯におけるニューロン新生脳室の周囲の脳室下帯という部分には神経幹細胞が存在し，神経幹細胞からより速い増殖をする一過性増殖細胞を作り出し，さらに一過性増殖細胞が新生ニューロンへと分化し，新生ニューロンはRMSと呼ばれる経路を長距離移動して成熟しながら嗅球へ到達する．

図2 Diversin の発現パターン（in situ hybridiza-tion）

Diversin mRNAは嗅球顆粒細胞層，海馬歯状回，脳室下帯，RMSに発現していた．（文献24から改変）

245

用してDiversin の抗体とともに共染色を行ったところ，脳室下帯においてDiversin はほぼすべてのDcx 陽性細胞の新生ニューロンと嗅球のNeuN陽性細胞の成熟ニューロンに発現していた．また，海馬でも同様にDiversin は新生ニューロンと成熟ニューロンに発現している事が明らかになったさらに幼若マウスにおけるDiversin の発現

を調べたところ，幼若マウスの脳でも成体脳とほぼ同じように脳室下帯および海馬歯状回でDiversin は新生ニューロンと成熟ニューロンに発現していた．これらの結果からDiversin が新生ニューロンで何らかの機能をしている可能性が高いと考えて，その可能性を検討した．

3．レトロウィルスによるDiversin 過発現によって嗅球に到達した新生ニューロンの数が増加した．

Diversin の脳室下帯における機能を調べるために，まずDiversin を過剰に発現させる実験を行った．Diversin を GFPと同時に発現するレトロウィルスを作成し，脳室下帯へ注入して，脳室下帯の増殖している細胞（主に神経幹細胞と一過性増殖細胞，新生ニューロンの一部）に感染させ，Diversin 過発現が一過性増殖細胞，新生ニューロンの存在比に影響を与えるかを検討した．一過性増殖細胞のマーカーとしてMash1を使用し26，27），脳室下帯での一過性増殖細胞と新生ニューロンとの細胞数の比を調べた．その結果，コントロールに比べ，Diversinを過発現させたサンプルでは，GFP陽性細胞中の新生ニューロン（Dcx 陽性細胞）が増加しており，一過性増殖細胞（Mash1陽性細胞）は有意に減少していた（図3左）．次に，Diversin 過発現が脳室下帯以外の場所

で影響を与えたかを調べた．ウィルスを脳室下帯に注入し感染させているので，感染細胞の多くは新生ニューロンとなりRMSを通って嗅球へと移動すると考え，脳室下帯，RMS，嗅球にわたっての感染細胞の分布を調べた．その結果，嗅球に到達した新生ニューロンの数に変化があることが明らかになり，コントロールと比

較して，Diversin を過発現させたサンプルでは嗅球内部に到達したDcx 陽性の新生ニューロンが増加していた（図3右）．

4．Diversin 過発現によって新生ニューロンの増殖が促進した．

次に，嗅球での新生ニューロンの増加の原因として増殖が促進した可能性を検討した．増殖マーカーであるKi67抗体と新生ニューロンのマーカー（Dcx）とで共染色したところ27），コントロールに比べDiversin 過発現でKi67陽性の新生ニューロンの数が増えていることがわかった（図4）．このことからDiversin は新生ニューロンの増殖を促進すると考えられた．一方，アンキリンリピートを部分欠損させた

Diversin は PCP経路を活性化することができない事が報告されているが（図4上）21），このアンキリンリピート部分欠損させたDiversinを組み込んだレトロウィルスを作成し，同様の方法で増殖率を解析した所，増殖促進効果が観察されなかった（図4）．このことからDiversinによる増殖の促進には PCP経路の活性化が必

図3 レトロウィルスによるDiversin 過発現によって嗅球に到達した新生ニューロンの数が増加した．

コントロールに比べ，Diversin を過発現させたサンプルでは，GFP陽性細胞中の新生ニューロン（Dcx 陽性細胞）が増加しており，一過性増殖細胞（Mash1陽性細胞）は有意に減少していた（左）．また，Diversin 過発現で嗅球内部に到達したDcx陽性の新生ニューロンが増加していた（右）．（文献24から改変）

246

要であることが示唆された．さらに，新生ニューロンの増殖に PCP経路

が関わっているかを明らかにするために，PCP経路下流で活性化される JNKの活性型フォームに対する抗体を用いて29，30），新生ニューロンで PCP経路が活性化されているかを検討した．核染色で細胞分裂中であることが確認できる新生ニューロンに着目して活性型 JNKの発現を調べたところ，分裂中の新生ニューロンの多くが活性型 JNK陽性細胞であった．これらのことからDiversin の新生ニューロン増殖促進効果は PCP経路を介している可能性あると考えられた．

5．Diversin ノックダウンで新生ニューロンの増殖が抑制された．

最後にDiversin の生理的機能を明らかにするためにRNA干渉法を用いてDiversin の機能阻害実験を行った．Diversin に対するショートヘアピン構造RNAを発現するレトロウィルスを作成し，脳室下帯に注入する事によってノックダウンを行い，増殖マーカーと新生ニューロンのマーカーで共染色した．Diversin を過発現

させた時とは対照的に，コントロールに比べてこのように増殖マーカーを発現する新生ニューロンの数が減少し，新生ニューロンの増殖が抑制された（図5）．このことから，Diversin が新生ニューロンの増殖を制御している事が明らかになった24）．

6．ま と め本研究ではDiversin の成体脳における発現

パターンとWnt シグナルを介していると考えられる新生ニューロンの増殖のメカニズムの一部を解明した．今後，脊髄損傷や脳損傷，疾患後の神経再生に神経幹細胞が応用されていくには，その安全性，効率性が課題である．近年，脳が傷害を受けると，脳室下帯から新生ニューロンが傷害部位へと移動し，失われたニューロンの一部を再生することが報告されている．またその時，傷害部位へ移動する過程では新生ニューロンの増殖が促進されていることが近年報告されていることから31），新生ニューロンの増殖のコントロールは中枢神経系の神経再生には重要であると考えられる．また，新生ニューロンは幹細胞から神経への分化が決定した細胞であり未分化な細胞よりも安全性が高い可能性があり，その増殖の制御機構の一部を解明した事は意義があると考える．また今後，さらに詳細なメカニズムを解明することが重要である．

図5 Diversin ノックダウンで新生ニューロンの増殖が抑制された．

コントロールに比べて，Diversin ノックダウンではKi67陽性のGFP陽性細胞（左）とKi67と新生ニューロンのマーカー（Dcx）の二重陽性のGFP陽性細胞（右）が減少し，新生ニューロンの増殖が抑制された．（文献24から改変）

図4 Diversin の過発現によって新生ニューロンの増殖が促進した．

コントロールに比べ，Diversin 過発現で増殖マーカーであるKi67陽性のGFP陽性細胞が増加していた（左）．また，Ki67と新生ニューロンのマーカー（Dcx）の二重陽性のGFP陽性細胞が増加しており（右），新生ニューロンの増殖が促進された．新生ニューロンの増殖促進効果はアンキリンリピート部分欠損させた変異型Diversin では観察されなかった．（文献24から改変）

247

謝 辞このたびは名古屋市立大学医学賞という栄誉

ある賞をいただき，心より感謝申し上げます．ご指導いただきました再生医学分野の澤本和延教授をはじめとする研究室の皆様，整形外科の大塚隆信教授，慶應義塾大学の坂口昌徳先生，山田理先生，岡野栄之教授，東北大学加齢医学研究所の木田泰之先生，小椋利彦教授に深く感謝申し上げます．

References1）Luskin MB. Restricted proliferation and mi-

gration of postnatally generated neurons de-rived from the forebrain subventricular zone.Neuron11（1）:173-89,1993.

2）Lois C, Alvarez-Buylla A. Long-distance neuro-nal migration in the adult mammalian brain.Science264（5162）:1145-8,1994.

3）Menezes JR, Smith CM, Nelson KC, LuskinMB. The division of neuronal progenitor cellsduring migration in the neonatal mammalianforebrain. Mol Cell Neurosci6（6）:496-508,1995.

4）Smith CM, Luskin MB. Cell cycle length of ol-factory bulb neuronal progenitors in the rostralmigratory stream. Dev Dyn213（2）:220-7,1998.

5）Coskun V, Luskin MB. Intrinsic and extrinsicregulation of the proliferation and differentia-tion of cells in the rodent rostral migratorystream. J Neurosci Res69（6）:795-802,2002.

6）Qu Q, Sun G, Li W, Yang S, Ye P, Zhao C, YuRT, Gage FH, Evans RM, Shi Y. Orphan nu-clear receptor TLX activates Wnt / beta-catenin signalling to stimulate neural stem cellproliferation and self-renewal. Nat Cell Biol12（1）:31-40; sup pp1-9,

7）Lee SM, Tole S, Grove E, McMahon AP. A lo-cal Wnt-3a signal is required for developmentof the mammalian hippocampus. Development127（3）:457-67,2000.

8）Hirabayashi Y, Itoh Y, Tabata H, Nakajima K,

Akiyama T, Masuyama N, Gotoh Y. The Wnt/beta-catenin pathway directs neuronal differ-entiation of cortical neural precursor cells. De-velopment131（12）:2791-801,2004.

9）Galceran J, Miyashita-Lin EM, Devaney E,Rubenstein JL, Grosschedl R. Hippocampus de-velopment and generation of dentate gyrusgranule cells is regulated by LEF1. Develop-ment127（3）:469-82,2000.

10）Chenn A, Walsh CA. Regulation of cerebralcortical size by control of cell cycle exit in neu-ral precursors. Science297（5580）:365-9,2002.

11）Yu JM, Kim JH, Song GS, Jung JS. Increase inproliferation and differentiation of neural pro-genitor cells isolated from postnatal and adultmice brain by Wnt-3a and Wnt-5a. Mol CellBiochem288（1-2）:17-28,2006.

12）Jho EH, Zhang T, Domon C, Joo CK, FreundJN, Costantini F. Wnt/beta-catenin/Tcf sig-naling induces the transcription of Axin2, anegative regulator of the signaling pathway.Mol Cell Biol22（4）:1172-83,2002.

13）Lie DC, Colamarino SA, Song HJ, Desire L,Mira H, Consiglio A, Lein ES, Jessberger S,Lansford H, Dearie AR, Gage FH. Wnt signal-ling regulates adult hippocampal neurogenesis.Nature437（7063）:1370-5,2005.

14）Patapoutian A, Reichardt LF. Roles of Wntproteins in neural development and mainte-nance. Curr Opin Neurobiol10（3）:392-9,2000.

15）Tada M, Kai M. Noncanonical Wnt/PCP sig-naling during vertebrate gastrulation. Ze-brafish6（1）:29-40,2009.

16）Wallingford JB, Habas R. The developmentalbiology of Dishevelled : an enigmatic proteingoverning cell fate and cell polarity. Develop-ment132（20）:4421-36,2005.

17）Adachi K, Mirzadeh Z, Sakaguchi M,Yamashita T, Nikolcheva T, Gotoh Y, Peltz G,Gong L, Kawase T, Alvarez-Buylla A, Okano H,Sawamoto K. Beta-catenin signaling promotesproliferation of progenitor cells in the adult

248

mouse subventricular zone. Stem Cells25（11）:2827-36,2007.

18）Schwarz-Romond T, Asbrand C, Bakkers J,Kuhl M, Schaeffer HJ, Huelsken J, Behrens J,Hammerschmidt M, Birchmeier W. Theankyrin repeat protein Diversin recruits Ca-sein kinase Iepsilon to the beta-catenin degra-dation complex and acts in both canonical Wntand Wnt/JNK signaling. Genes Dev16（16）:2073-84,2002.

19）van Amerongen R, Nawijn MC, Lambooij JP,Proost N, Jonkers J, Berns A. Frat oncopro-teins act at the crossroad of canonical and non-canonical Wnt-signaling pathways. Oncogene29（1）:93-104,

20）Cirone P, Lin S, Griesbach HL, Zhang Y, Slusar-ski DC, Crews CM. A role for planar cell polar-ity signaling in angiogenesis. Angiogenesis11（4）:347-60,2008.

21）Moeller H, Jenny A, Schaeffer HJ, Schwarz-Romond T, Mlodzik M, Hammerschmidt M,Birchmeier W. Diversin regulates heart for-mation and gastrulation movements in devel-opment. Proc Natl Acad Sci U S A103（43）:15900-5,2006.

22）Miyasaka KY, Kida YS, Sato T, Minami M,Ogura T. Csrp1regulates dynamic cell move-ments of the mesendoderm and cardiac meso-derm through interactions with Dishevelledand Diversin. Proc Natl Acad Sci U S A104（27）:11274-9,2007.

23）Tissir F, Bar I, Goffinet AM, Lambert DeRouvroit C. Expression of the ankyrin repeatdomain6gene（Ankrd6）during mouse braindevelopment. Dev Dyn224（4）:465-9,2002.

24）Ikeda M, Hirota Y, Sakaguchi M, Yamada O,Kida Y, Ogura T, Otsuka T, Okano H,Sawamoto K. Expression and proliferation-promoting role of Diversin in neuronally com-mitted precursor cells migrating in the adultmouse brain. Stem Cells28（11）:10,2010.

25）Brown JP, Couillard-Despres S, Cooper-Kuhn

CM, Winkler J, Aigner L, Kuhn HG. Transientexpression of doublecortin during adult neuro-genesis. J Comp Neurol467（1）:1-10,2003.

26）Sakaguchi M, Shingo T, Shimazaki T, OkanoHJ, Shiwa M, Ishibashi S, Oguro H, NinomiyaM, Kadoya T, Horie H, Shibuya A, MizusawaH, Poirier F, Nakauchi H, Sawamoto K, OkanoH. A carbohydrate-binding protein, Galectin-1,promotes proliferation of adult neural stemcells. Proc Natl Acad Sci U S A103（18）:7112-7,2006.

27）Parras CM, Galli R, Britz O, Soares S, GalichetC, Battiste J, Johnson JE, Nakafuku M, VescoviA, Guillemot F. Mash1specifies neurons andoligodendrocytes in the postnatal brain.EMBO J23（22）:4495-505,2004.

28）Brown DC, Gatter KC. Monoclonal antibody Ki-67:its use in histopathology. Histopathology17（6）:489-503,1990.

29）Kolomeichuk SN, Terrano DT, Lyle CS, Saba-pathy K, Chambers TC. Distinct signalingpathways of microtubule inhibitors--vinblastineand Taxol induce JNK-dependent cell deathbut through AP-1-dependent and AP-1-independent mechanisms, respectively. FEBSJ275（8）:1889-99,2008.

30）Xia Y, Wang J, Xu S, Johnson GL, Hunter T, LuZ. MEKK1 mediates the ubiquitination anddegradation of c-Jun in response to osmoticstress. Mol Cell Biol27（2）:510-7,2007.

31）Zhang RL, LeTourneau Y, Gregg SR, Wang Y,Toh Y, Robin AM, Zhang ZG, Chopp M. Neuro-blast division during migration toward theischemic striatum: a study of dynamic migra-tory and proliferative characteristics of neuro-blasts from the subventricular zone. J Neuro-sci27（12）:3157-62,2007.