ヒト腺癌の新規血清診断バイオマーカーEPHA2

東洋大学 理工学部 生体医工学科

教授 加藤 和則

腫瘍マーカー検査

検査方法

血液検査 腫瘍マーカー検査

画像検査

超音波(エコー)検査

X線(レントゲン)検査

CT(コンピューター断層画像)

MRI(磁気共鳴撮影)

PET(陽電子放出断層撮影)

内視鏡検査

生検検査／病理検査

http://kenshin.nakayamakai.com/examination/shuyo-marcker.php

EphA2とは

• Ephファミリーの1つで、臨床的に多くの癌で発現する。

• EphA2発現陽性の患者は5年生存率が低く、予後不良である。

• 酵素により細胞表面から遊離し、可溶化体EphA2(sEphA2)として体液中に産生される。

• 癌の標的分子として医薬品の開発が進められている

Eph(erythropoietin-producing hepatocellular) A2

soluble form of EphA2 : “sEphA2”

MMP-?

Background

癌細胞

癌組織におけるEphA2発現の免疫染色

http://www.cstj.co.jp/products/6347.html

Ovarian cancer tissues stained with anti-EphA2 antibody (CST)

EphA2 IHC H/E staining

EphA2定量ELISAの感度

Detection limit

< 35 [pg/ml]

Coating: SHM41 (anti EphA2 mAb)

（独自に樹立した抗体）

Blocking

Sample: recombinant EphA2 protein,

Culture sup., Serum

Detection Ab-biotin: Polyclonal antibody

(R&D Systemsより購入）

HRP-Streptavidin

TMB Substrate

Absorbance at 450nm

EphA2定量ELISAの特異性

sEphA1 sEphA2 sEphA3 sEphA4

癌細胞表面におけるEphA2の発現

EphA2の発現

細胞数

膵臓癌・前立腺癌細胞膜表面においてEphA2発現を確認

22Rv1 LNCap PC3

TCC-Pan2PK-1 SUIT-2

膵臓癌

前立腺癌

sEphA2産生メカニズム

MMP-9がEphA2遊離に関与することが示唆

Culture sup. (Prostate Can.)

Concentrate culture sup.

Electrophoresis

Enzymatic reaction

CBB staining

Decoloration

MMP活性

22Rv1 ―

LNCap MMP-2

PC3 MMP-9

Sample Ave. SD

健常人

(Healthy Donors)0.25 ± 0.08

膵臓癌患者

(Pancreas Cancer)0.56 ± 0.37

前立腺癌患者

(Prostate Cancer)0.55 ± 0.30

膵臓癌および前立腺癌患者血清検体中におけるsEphA2

患者血清検体 陽性 陰性

膵臓癌

(Pancreas Cancer)

7/13

(54%)

6/13

(46%)

前立腺癌

(Prostate Cancer)

12/25

(48%)

13/25

(52%)

膵臓癌患者血清検体におけるCEACEA

CEAとsEphA2との間に正の相関が認められた。

sEphA2

CEA

前立腺肥大症・前立腺癌患者血清検体におけるPSA値

PSA

前立腺肥大症患者と前立腺癌患者

血清検体におけるPSAに有意な差

は認められなかった。

患者血清検体PSA

陽性 陰性

健常人(Healthy Donor)

5/25 15/25

前立腺肥大症(BPH)

9/10 1/10

前立腺癌(Prostate Cancer)

16/25 9/25

前立腺肥大症・前立腺癌患者血清検体におけるsEphA2値

sEphA2

前立腺癌患者において健常人・

前立腺肥大症患者より有意に

sEphA2が高値を示した。

患者血清検体sEphA2

陽性 陰性

健常人(Healthy Donor)

1/25 24/25

前立腺肥大症(BPH)

1/10 9/10

前立腺癌(Prostate Cancer)

12/25 13/25

前立腺癌におけるsEphA2とPSAの相関

PSA陰性

前立腺癌患者

sEphA2

PSA

PSAとsEphA2との間に弱い正の相関が認められた。

PSA陰性の2検体でsEphA2は高値を示した。

Sample Ave. SD

健常人(Healthy Donors)

0.20 ± 0.07

肺癌患者(Lung Cancer)

1.20 ± 0.72

卵巣癌患者(Ovarian Cancer)

0.63 ± 0.38

肺癌・卵巣癌患者血清中におけるsEphA2

肺癌の従来マーカーCYFRAとの相関

卵巣癌の従来マーカーCA125との相関

coating: anti-EphA2 Abs (230-1)↓blocking↓Antigen: standard rhEphA2 (R&D)↓biotinylated 57-1(anti-EphA2 Ab)↓Streptavidin-HRP↓Peroxidase Substrate↓stop solution↓read at 450 nm

・230-1xbiotin-57-1・高感度のバッファー系・EphA2標準蛋白の定量曲線

EphA2 mAbによる新規ELISA構築

1 10 100 1000 10000

0.01

0.1

1

10

y = -6E-11x3 + 1E-07x2 + 0.0006x + 0.0144R² = 0.99983

Absorb

ance a

t 450nm

(re

f.570nm

)

rhEphA2 concentration (pg/ml)

新規EphA2-ELISAの特異性と血清値A

bso

rba

nce

at 4

50

nm

(re

f.5

70

nm

)

Protein concentration (pg/ml)

EphA2

EphA1, EphA3, EphA4

本研究シーズのまとめ•がん患者血清中に存在するEphA2を高感度かつ高特異的に検出できるELISA系の構築に成功。

•健常人血清と比較して、膵臓がん、前立腺がん、肺がん、卵巣がん患者由来血清中のEphA2は有為に高値を示した。

•既存の血清バイオマーカーCYFRA（肺がん）、CEA（膵臓がん）と正の相関性を示した。

•既存バイオマーカーが陰性のがん患者を検出可能

（PSA陰性前立腺がん）

新技術の特徴・従来技術との比較•従来技術の問題点であった、ポリクローナル抗体（市販）を、モノクローナル抗体１クローン（１２クローン中）を選択することに成功した。

•従来はポリクローナル抗体を使用していたために、ロット間の反応性の補正が必要であったが、均一に生産できるモノクローナル抗体に変更することで、データの再現性、特異性および感度が向上した。

•本技術に使用しているハイブリドーマ（抗体産生細胞株）を保有しているために、安定した大量産生が可能となる。

実用化に向けての課題•本研究に用いた患者血清は市販購入品であるために、詳細な患者情報に制限がある。

• また同一患者の経時的な血清が入手不可能であった。

•実用化に向けて、①対象癌種を決定する、②詳細な臨床データとリンクした患者血清を測定する必要あり。

•癌検診などの初期診断に適応できるバイオマーカーなのか、病態および治療効果を判定するバイオマーカーなのかを検討する必要あり。

企業への期待•臨床検査薬としての実用化を目指した、共同研究企業を希望。

• ELISA法ではなく、迅速かつ高感度測定技術を有している企業との共同研究を希望。特にマルチマーカーを一度に測定する技術や、イムノクロマト法などに応用できる技術を有する企業を希望。

•血清検査だけではなく、in vivoイメージングなどの新分野への応用も期待。

本技術に関する知的財産権

•発明の名称 ：抗EPHA2抗体及びこれを用いたEPHA2の免疫学的検出

•出願番号：特願2017-009349

•出願人 ：東洋大学、第一三共（株）

•発明者 ：加藤和則、我妻利紀、長谷川純

お問い合わせ先

東洋大学 産官学連携推進部

産官学連携推進課 松浦徹治、早川克也

ＴＥＬ ０３－３９４５ － ７５６４

ＦＡＸ ０３－３９４５ － ７９０６

e-mail tetsuharu＠toyo.jp