岡山医学会雑誌　第114巻

May 2002, pp. 39-51原 著

抗 リン脂質抗体症候群 における動脈血栓の発症機序:

β2-グ リコプ ロテイン Ⅰに特異的 な リガン ドと自己抗体の関与

劉 慶 平

キ ー ワ ー ド:antiphospho1ipid syndrome(APS), atherosclerosis, autoantibody,

β2-glycoprotein I (β2-GPI), oxidized LDL (oxLDL)

緒 言

抗 リン脂質抗 体症候 群(antiphospholipid syn

drome, APS)と は,動 ・静脈血栓や 習慣 流産 な どの

臨床症状 を有す る難治性 の 自己免疫疾患 で,抗 カル

ジオ リピン抗体(aCL)や ループスアンチ コアグラン

トな どの いわゆ る “抗 リン脂質抗体 ”による易血栓

性 が基本病態であ る1)2).1990年 に3つ の研究 グルー

プ,す なわち,Matsuuraら3), McNeilら4), Galli

ら5)によって,aCLが カルジオ リピン(CL)そ の も

の を認識 してい るのではな く,CLな どの陰性荷電 リ

ン脂質 とβ2-グ リコプ ロテイン Ⅰ(β2-GPI)と の

複合 体 に結合 す る こ とが明 らか に され,さ らに,

Matsuuraら6)は,β2-GPIそ の ものが真の対 応抗

原であることを明 らかに した.

β2-GPIは,5個 のスシ ドメイン と呼ばれ る繰 り

返 し構 造か らな る分子量約5万 の塩 基性糖 タンパ ク

質で,リ ン脂質7,ヘ パ リン8),あ るいは活性化 血小

板や アポ トー シス細胞9)10)と結合す る.第5ド メイン

の リン脂質結合部位 を介 して β2-GPIが リン脂質

な どに結合す る と,crypticな エ ピ トープが現れ るこ

とが 示 さ れ て い る11-14)一 方,aCLの β2-GPIに 対

す る 親 和 性 が 低 い こ と も 示 さ れ て い る15-18).

β2-GPIは,肝 臓 で 合 成 され,単 独 も し くはVLDL

やHDLな ど の 血 漿 リポ タ ン パ ク 質 との 複 合 体 と し

て 正 常 人 血 漿 中 を 約200μg/mlの 濃 度 で 循 環 す る19).

β2-GPIは,リ ン脂 質 依 存 的 な 血 液 凝 固 反 応 の 抑 制

活 性,す な わ ち,内 因 性 凝 固 反 応 の 抑 制20),ADP依

存 的 な 血 小 板 凝 集 の 抑 制21),お よ び ト ロ ン ビ ン やXa

の 生 成 阻 害22)23)な どの 活 性 を有 す る こ とが 知 られ て い

る ほ か,リ ポ タ ン パ ク質 リパ ー ゼ を活 性 化 す る こ と

よ りア ポ リポ タ ン パ ク質Hと も呼 ば れ て い る24).

と こ ろ で,LDLの 酸 化 に は,動 脈 硬 化 の 発 症 ・進

展 に 重 要 な 意 義 が あ る.す な わ ち,動 脈 硬 化 病 変 の

初 期 段 階 で,単 球 由 来 の マ ク ロ フ ァ ー ジ が ス カ ベ ン

ジ ャ ー 受 容 体 を 介 して 酸 化LDLを 取 り込 む こ と で

泡 沫 化 し,動 脈 硬 化 巣 を 形 成 す る25-30).

方,APSに お い て,動 脈 血 栓 形 成 へ のaCLの

関 与 に つ い て も 議 論 さ れ て い る31-33).1997年 に

Hasunumaら は,β2-GPIお よ び 抗 β2-GPI自

己 抗 体 の 結 合 に よ っ て,Cu2+に よ る酸 化LDLの マ

ク ロ フ ァ ー ジ に よ る 取 り込 み が 著 明 に 増 加 す る こ と

を 報 告 した34).さ ら に,筆 者 ら は,β2-GPIの 特 異

的 な リガ ン ド(oxLig-1)が コ レ ス テ リル リ ノ レ ー

トの 酸 化 体 の1種,9-(7-ketocholest-5-en-3β

ylOxy)9-oxononanoic acd,で あ る こ と を 明 ら

か に した35).今 回 は,oxg-1を は じめ と す る オ キ

シ ス テ ロ ー ル(7-ケ トコ レ ス テ ロ ー ル7KC)と

(平成13年12月3日 受 理)

岡山大 学 院 医 歯 学総 合 研 究科 細 胞 化 学 分 野

指 導:保 田立 二教 授

論文 請 求 先:岡 山大 学 大学 院 医歯 学 総 合研 究 科 細 胞 化学 分 野

TEL: 086-235-7402 FAX: 086-235-7404

E-mall:tyasuda@md.okayama-u.ac.jp

40　 劉 慶 平

ω 位-カ ル ボキシル化短鎖脂肪酸 との コレステ リル

エ ステルが,β2-GPIお よび抗 β2-GPI自 己抗体

の関与す るマ クロファー ジに よる酸化LDLの 取 り

込 みお よびAPSで の動脈血栓(動 脈硬化)の 形成

に関与 してい るこ とが示唆 され たので報告す る.

材 料 と 方 法

1)　 試 薬

L-α-Dipalmitoylphosphatidylserine (DPPS),

7-ketocholesterol (5-cholesten-3β-ol-7-one,

7KC)お よ びcholesteryl linoleate(5-cholesten

3β-3-lino1eate)は, Sigma Chemical Co. (St.

Louis, MO)よ り購 入 し た. Dioleoylphosphatidyl

choline (DOPC)は, Avanti Polar Lipids Inc.

(Alabaster, AL)よ り 購 入 し た. L-3-Phos

phatidyl-[n-methyl-3H] choline, 1, 2-dipal

mitoyl ([3H]-DPPC) (80Ci/mmol)は, Amersham

Pharmacia Biotech (Uppsala, Sweden)よ り購 入

し た.そ の 他 の 試 薬 に つ い て は,試 薬 特 級 の も の を

用 い た.

2)　 ヒ ト β2-GPIの 精 製

β2-GPIは,健 常 人 血 漿 を ヘ パ リ ン ー セ フ ァ ロ ー

ス カ ラ ム,DEAEセ ル ロ ー ス カ ラ ム,お よ び 抗 β2

GPI抗 体 ア フ ィ ニ テ ィー カ ラム を用 い て 精 製 し た36).

さ ら に,プ ロ テ イ ンA-セ フ ァ ロ ー ス カ ラ ム に か け て

爽 雑 す るIgGを 除 去 した.な お,結 合 脂 質 を 除 去 す

る た めn-プ タ ノ用 ル に よ る洗 浄 を行 っ た.

3)　 モ ノ ク ロ ー ナ ル 抗 体

WB-CAL-1抗 体(IgG 2a)は,APSの 動 物 疾 患

モ デ ル(NZW×BXSB) F1 (WBF 1)マ ウ ス か

ら樹 立 し た β2-GPIのcrypticな 構 造 を 認 識 す る

モ ノ ク ロ ー ナ ル 抗 β2-GPI自 己 抗 体 で あ る37). Cof

23(IgG 1)お よ びCof-22 (IgG 1)は,ヒ ト β2

GPIを マ ウ ス に 免 疫 し て 得 た ヒ ト β2-GPI の

native な 構 造 を 認 識 す る モ ノ ク ロ ー ナ ル 抗 体 で あ

る12).

4)　 酸 化LDLの 調 製

LDL(比 重: 1.019-1.063g/ml)は,健 常 人 血 漿

か ら超 遠 心 法 に よ り調 製 した38).タ ン パ ク質 濃 度 と し

て100μg/mlのLDLを,5μMCuSO4と 共 に37℃,

8時 間イ ンキュベー トした後,EDTA(最 終濃度1

mM)を 加 えて反応 を止め,1mMEDTAを 含むPBS

で24時 間透析 した.マ ロン ジアルデ ヒ ドを標準物質

として,チ オバ ル ビツー ル酸 反応性物 質量 を測定 し

たほか39),アガロース電気泳動 による移動度 を指標に

LDLの 酸化度 を確認 した.調 製 した未処理LDLお

よび酸化LDLか らFolchら40)の 方法 に よ り脂 質抽

出 を行 った.

5)　LDL脂 質画分 への β2-GPIお よび抗 β2-GPI

自己抗体の結合試験

β2-GPI結 合 量の測定 の ため に,脂 質 画分(40

μg/ml, 100μ1/we11)をELISAプ レー ト(lmmulon

lB, Dynex Technologies Inc, Chantilly)に 固相

化 し,β2-GPI (30μg/ml, 50μ1/well)お よび抗 β

2-GPI抗 体(Cof-23)を 順 次室温 で1時 間 インキュ

ベー トした.抗 β2-GPI自 己抗体の結合量の測定

の場合 には,同 じ脂質 固相 化プ レー トで β2-GPI (15

μg/ml)お よびWB-CAL-1自 己抗体 を同時に1時

間インキュベー トした.さ らに,西 洋 ワサ ビペ ルオ

キシダーゼ(HRP)標 識抗マ ウスIgG抗 体 をこれ

らのプ レー トに入れ1時 間 インキュベ ー トした後,

o-フ ェニ レンジア ミンで発色 させ490nmの 吸光 度 を

測定 した.各 処理 間に,0.05% Tween 20含 有PBS

でウエ ルを充分に洗浄 した.

6)　薄層 クロマ トグラフィー(TLC)と リガ ン ドプ

ロ ッ ト

シ リカゲル薄層プ レー ト(Polygram, Machery

Nagel, Duren, Germany(リ ガ ン ドブ ロッ ト用)あ

るいは PLC silica gel-60, Merck, Darmstadt,

Germany(分 取用))に 脂質検体 をスポッ トし,ク ロ

ロホルム/メ タノール/30%ア ンモニア水/水(120/80/

10/5,溶 液A)ま たは クロロホルム/メ タノール(8/

1,溶 液B)で 展 開 した.展 開後,脂 質 をヨウ素 あ

るいはモ リブデ ン試薬 に よ り染 色 した.

リガ ン ドプ ロッ トは,展 開後 のTLCプ レー トを

1%BSA含 有PBSで ブロッキングの後,β2-GPI

(20μg/ml),適 宜希釈 したCof-22あ るいはWB.

CAL-1抗 体,お よびHRP標 識抗 マウスIgG抗 体

β2-GPIリ ガ ン ドと抗 β2-GPI自 己抗体　 41

を 順 次 イ ン キ ュ ベ ー トし て 行 っ た35).な お,発 色 に は,

H2O2と4-methoxy-1-naphtholを 用 い た.

7)　 高 速 液 体 ク ロ マ トグ ラ フ ィ ー(HPLC)

TLC分 画 に よ り得 ら れ た β2-GPIリ ガ ン ド粗 画

分 を逆 相HPLCに よ り さ ら に 精 製 し た.精 製 に は,

C18カ ラ ム(250×4.6mm Sephasyl peptide, Phar

macia)を 用 い,溶 媒C(ア セ トニ ト リ ル/イ ソ プ ロ

パ ノ ー ル,3/7)と 溶 媒D(0.2%酢 酸)の 濃 度 勾

配 移 動 相{(50%溶 媒C-50%溶 媒D混 液(0分)

100%溶 媒C(l5分-40分)}お よ び 流 速0.5m1/min

で 溶 出 し た.234nmの 吸 光 度 を モ ニ タ ー し た.

8)　 質 量 分 析

HPLCに よ り精 製 し た β2-GPIリ ガ ン ド(oxLig

2)の 質 量 分 析 をShim-pack VP-ODSカ ラ ム

(150×4.6mm)を 接 続 し たLC/MS-QP8000α

(Shimadzu Corp., Kyoto, Japan)に よ るAPCI法

で行 っ た.HPLCは,溶 媒C(ア セ トニ ト リル/イ ソ

プ ロ パ ノー ル,3/7)と 溶 媒D(0.2%酢 酸)の 濃

度 勾 配 移 動 相{(50%溶 媒C-50%溶 媒D混 液(0分)

100%溶 媒C(15分-30分)}お よ び 流 速0.5ml/min

で 行 っ た.

9)　 β2-GPIリ ガ ン ドの 合 成

(1) 9-(7-ketocholest-5-en-3β-yloxy)-9-

oxononanoic acid (oxLig-1)の 合 成7KC(50.1

mg, 0.125mmol)と azelaic acid (70.6mg,0.375

mmol)を 含 む ア セ ト ン4mlに1-ethyl-3-(3-

dimethylaminopropyl) carbodiimide hydrochlor

ide (WSC: 95.8mg, 0.50mmol)と4-dimeth

ylaminopyridine (DMAP: 30.5mg, 0.25mmol)を

添 加 し,室 温 で2日 間 撹 拝 し た 後 遠 心 し,ク ロ ロ ホ

ル ム で 抽 出 し36.0mgの 合 成 品 を得 た.1H-NMR (300

MHz, CDCI3): δ=5.71(s, H, H-6), 4.78-

4.69 (m,H, H-3); C-NMR (75.5MHz, CDCI

3): δ=202.5, 179.7, 164.5, 127.1, 72.4, 55.2,

50.4, 50.2, 45.8, 43.5, 39.9, 38.7, 36.6, 36.1,

29.2, 28.9, 28.4, 25.3, 25.0, 24.2, 23.2, 23.0,

19.3, 17.7, 12.4; m/z (FD-MS): 571 [(M+H)+,

C36H59O5 requires 571]で あ っ た.

(2) 13-(7-ketocholest-5-en-3β-yloxy)-13

oxotridecanoic acid (13-COOH-7KC)の 合

成

7KC (50.1mg, 0.125mmo1)と tridecanedioic

acid (brassylic acid: 61.8mg, 0.25mmol)を 含 む

ア セ トン4mlにWSC (95.8mg, 0.50mmol)とDMAP

(30.5mg, 0.25mmol)を 添 加 し,室 温 で2日 間 撹 拝

し た 後 遠 心 し,ク ロ ロ ホ ル ム で 抽 出 し44mgの 合 成 品

を 得 た.1H-NMR (300MHz, CDCI3): δ=5.69 (s,

1H, H-6), 4.80-4.67 (m,1H, H-3); 13C-NMR

(75.5MHz, CDCI3): δ=202.2, 179.6, 173.1,

164.7, 126.9, 72.3, 55.3, 50.5, 50.1, 45.3, 43.5,

40.6, 39.2, 38.6, 36.5, 36.0, 29.1, 28.8, 28.3,

25.2, 24.9, 24.1, 23.1, 22.9, 19.2, 17.6, 12.3;

m/z(FD-MS): 627 [(M+H)+, C40H67O5 requires

627]で あ っ た.

10)　 リ ボ ソ ー ム の 調 製

β2-GPIリ ガ ン ド含 有 リ ボ ソ ー ム は,西 川 ら の 方

法 に 準 じ,次 の よ う な モ ル 比 で 調 製 し た41)(DOPC/

ホ ス フ ァ チ ジ ル セ リ ン(DOPS),コ レ ス テ リル リ ノ

レー ト, oxLig-1, oxLig-2, 13-COOH-7KC/3H

DPPC (80Ci/mmol) (100/0/0.00225; 90/10/

0.00225; 75/25/0.00225; 70/30/0.00225; 50/50/

0.00225)).

11)　 マ ク ロ フ ァ ー ジ へ の リボ ソー ム の 結 合 試 験

マ ウ ス マ ク ロ フ ァー ジ様 細 胞(J774A.1細 胞)

を12ウ エ ル プ レー トで8×105cells/well, 37℃ で24

時 間 培 養 し た 後,無 血 清 培 地(Celgrosser-P,住 友

製 薬,大 阪)に 置 換 し て さ ら に2時 間 培 養 し た.PS

ま た は リガ ン ド含 有 リ ボ ソ ー ム を 加 え(100nmol脂

質/well),4℃ で2時 間 イ ン キ ュベ ー ト した.さ らに,

J774A.1細 胞 に,β2-GPI (200μg/ml)お よ びWB

CAL-1 (100μg/ml)存 在 下 で,コ レ ス テ リル リ ノ

レ ー トま た は 各 種 リガ ン ド含 有 リボ ソー ム(50nmol

脂 質/well)を 加 え,細 胞 に 結 合 し た 放 射 能 と細 胞 の

タ ン パ ク質 量 を 測 定 し た.

42　 劉 慶 平

結 果

1)　LDL脂 質画分への β2-GPIお よび抗 β2-GPI

自己抗体 の反応性

未処理LDLお よび酸化LDL由 来の脂質 画分へ

の β2-GPIお よび抗 β2-GPI抗 体の結合 をELISA

にて調べ た ところ,β2-GPIは 酸化LDL由 来の脂

質画分 に特 異的に結合 したが,未 処理LDL由 来の

脂質 画分 には結合 しなか った(表1).同 様 に,抗 β2

GPI抗 体(WB-CAL-1)は,β2-GPI依 存的に

酸化LDL由 来の脂質画分 に強 い結合性 を示 した.

2)β2-GPIリ ガン ドのTLCに よる解析

未処理LDLま たは酸化LDLか ら抽出 した脂質

をTLCプ レー トにスポ ッ トし,溶 液Aで 展開 した.

図1Aに は,ヨ ウ素染色 およびモ リブデ ン試薬に よ

る リンの検 出を行 った結果 を示 している.Cu2+処 理

した酸化LDLか らの抽 出脂質画分に リゾホスファ

チジル コリン(lysoPC)の 増加が見 られ た.図1B

には,TLCプ レー ト上 で β2-GPIお よび抗 β2-

GPI自 己抗体 を用 いて行 った リガ ン ドブ ロッ トの結

果 を示 した.β2-GPIお よび β2-GPIに 依 存的な

WB-CAL-1抗 体 の結合 を示す複数 のバ ン ドが酸化

LDL由 来 の脂質画分 に見 られた.

3)　β2-GPIリ ガン ド(酸 化脂質)の 精 製 と同定

図1に 示 したTLCと 同 じ展開溶媒Aと 分 取用 シ

リカゲルTLCプ レー トを用 い,Band-1お よびBand

2(分 取用プ レー トに よるTLCで は3本 のバ ン ド

の 中,下 側 の2本 につ いては分離 できなか った)部

分の シ リカゲルをプ レー トよ り削 り取 り,ク ロロホ

ル ム/メ タ ノー ル 混 液 で 抽 出 の 後HPLCを 施 行 した.

C18カ ラ ム に よ る 逆 相HPLCで,各 々Band-1お

よ びBand-2の 画 分 よ りoxLig-1お よ びoxLig-

2が27.2分 お よ び26.7分 に 溶 出 さ れ た(図2A,B).

ま た,図2Cに は,合 成13-000H-7KCの 精 製 時

のHPLCク ロ マ トグ ラ ム を示 し た(28.9分 に 溶 出 さ

れ た).こ の 様 に し て,精 製 さ れ た3種 類 の β2-GPI

リガ ン ドのTLC-リ ガ ン ドブ ロ ッ トの 結 果 を 図3に

示 し た.

ま た,質 量 分 析 の 結 果 を表2に 示 し た.oxLig-1

に つ い て は,9-(7-ketocholest-5-en-3β-yloxy)

9-oxononanoic acidで あ る こ とを既 に 報 告 した35).

今 回,oxLig-2の ピ ー ク をMSで 解 析 す る と,正 イ

オ ン モ ー ドで,プ ロ トン 化 分 子 イ オ ン(M+H)+と し

てm/z627,お よ び フ ラ グ メ ン トイ オ ンm/z383を,

ま た,負 イ オ ン モ ー ドで は 脱 プ ロ トン 化 フ ラ グ メ ン

トイ オ ン(m/z243)お よ びm/z625お よ びm/z627

が 検 出 さ れ た.m/z383は,7KCの プ ロ トン化 フ ラ

表1　 LDL脂 質画分 へ の β2-GPIお よび抗 β2-GPI自 己

抗体 へ の結合

未処理LDLま たは酸化LDLの 脂質画分 を固相 化 したELISAプ レー

トで,β2-GPIとCof-23抗 体 あ るいはWB-CAL-1抗 体 をインキュベ

トした.

数字は結合 を490nmの 吸光 度(n=2)を 示す.

図1　 LDL脂 質画分 のTLCお よび リガ ン ドブ ロ ッ ト.

未処 理LDLお よび酸 化LDLよ り調 製 した脂質 画分

のTLCを,溶 媒Aを 用 い て行 っ た.パ ネ ルA:ヨ ウ

素 お よび モ リブデ ン試薬 に よる染 色,パ ネルB:リ ガ

ン ドブ ロッ トに よ る β2-GPIお よび β2-GPI依 存

的抗 β2-GPI自 己抗 体 の結合 性 の解 析結 果Chol:

コ レステ ロー ル,Glu-Cer;グ ル コ シルセ ラ ミ ド,Gal

Cer:ガ ラ ク トシルセ ラ ミ ド,CL:カ ル ジオ リピン,

PE:ホ ス アチ ジ ルエ タ ノー ルア ミン,PC:ホ スファチ

ジル コ リン,PS:ボ ス フ ァチ ジルセ リン,PA:ホ スフ

ァチ ジ ン酸,lysoPC:リ ゾ ホス ファ チ ジル コ リン

β2-GPIリ ガン ドと抗 β2-GPI自 己抗体　 43

グ メ ン ト と一 致 し た.

表3に は,β2-GPIリ ガ ン ド,す な わ ち,合 成oxLig

1,精 製oxLig-2(以 下 に 解 析 結 果 を示 す),お よ

び 合 成13-COOH-7KCに 対 す る β2-GPIお よ び

抗 β2-GPI自 己 抗 体(WB-CAL-1)のELISAに

お け る反 応 性 を 示 し た.対 照 で あ り,β2-GPIリ ガ

図2　 β2-GPIリ ガ ン ドの 逆 相 カ ラ ム に よ るHPLC.

パ ネ ルA:合 成oxLig-1,パ ネ ルB:精 製oxLig-2,

パ ネ ルC:合 成13-COOH-7KCのC18カ ラム に よ る

HPLCク ロマ トグ ラ ム.

溶 媒C(ア セ トニ ト リル/イ ソ プ ロ パ ノー ル,3/7)

と 溶 媒D(0.2%酢 酸)の 濃 度 勾 配 移 動 相(50%溶 媒-

50%溶 媒D(0分)～100%溶 媒C(15分-40分),流

速0.5m1/minで 溶 出 した.234nmの 吸 光 度 を モ ニ ター

し た.

図3　 精 製 β2-GPIリ ガ ン ドのTLCと リ ガ ン ドブ ロ ッ ト.

パ ネ ルA:ヨ ウ 素 染 色,パ ネ ルB:リ ガ ン ドブ ロ ッ ト.

表2　 β2-GPIリ ガ ン ドの質 量分 析

(M+H)+:プ ロ トン化 分 子 イ オ ン,(M-H)-:脱 プ ロ トン化 分 子 イ オ ン,

LC/MS(APCI)に よ る.

表3　 リガ ン ドへ の β2-GPIお よび抗 β2-GPI自 己抗 体

へ の結 合

β2-GPIリ ガ ン ドを 固 相 化 し たELISAプ レ ー トで,β2-

GPIと,Cof-22抗 体 あ る い はWB-CAL-1抗 体 を イ ン キ ュ

ベ ー ト し た .数 字 は 結 合 を490nmの 吸 光 度(平 均+/-SD,

n=3)を 示 す.

Chol-linoleate:コ レ ス テ リル リノ レー ト.

44　 劉 慶 平

ン ドにな り得 る被 酸化 物質であ るコレステ リル リノ

レー トに対 しては,β2-GPIお よびWB-CAL-1

抗体 の反応が全 く見 られ なか ったのに対 し,3種 類

の リガ ン ド(oxLig-1, oxLig.2,お よび13-COOH

7KC)の 全 てに対 して強い結合 が見 られた.

4)　 リボソー ムの マ クロフ ァー ジへ の結合

PS, oxLig-1, oxLig-2,あ るいは13-COOH-

7KC含 有 リボ ソー ム を調 製 し,マ ウスマ クロファ

ジ系の細 胞であ るJ774A.1と 共に,4℃,2時

間イ ンキュベ ー トして,結 合 を調べ た.PS含 有 リポ

ソー ムでは,PS含 量に依 存 した リボソー ムのマ クロ

フ ァー ジへ の結合 が見 られた(表4).oxLig-1,

oxLig-2あ るいは13-COOH-7Kc含 有 リボソーム

で も同様 の傾 向は認め られ る ものの,PS含 有 リボソ

ムほ ど顕著 ではなか った.次 に,同 様の実験 を,

抗 β2-GPI自 己抗体(す なわ ち,WB-CAL-1)

共存下 で行 った(表5).β2-GPIとWB-CAL-1

抗体 の共存下 では,コ レステ リル リノレー ト含有 リ

ポ ソームの結合 に比 して,oxLig-1で 最 も高 い結合

促 進(50倍 以上)が 見 られ,oxLig-2あ るいは13-

COOHで も10倍 以上の増加 が見 られ た.こ れ らの結

合は,ス カベ ンジャー受容体 を介 す る結合量(表4)

と比べ て有意に大 きか った.さ らに,デ ー タは示 し

て いないが,カ ルボキシル基 をメチル化 したoxLig

2あ るいは13-COOH-7KC含 有 リボ ソームでは,

β2-GPIとWB-CAL-1抗 体 の共存下で も結合 の

増加 は全 く見 られなか った.

考 察

酸化変性 を受けた血漿LDLは,動 脈 硬化発 症の

初期段階 に深 く関与す る病 因因子であ る26).Brown

お よびGoldsteinは42),マ クロファー ジが変性LDL

を取 り込む機序 として スカベ ンジャー受容体 の存在

を提 唱 し,そ の後,Steinbergら は43),生 体 内に存在

す る主 な変性LDLが 酸化LDLで あるこ とを示 し

た.ス カベ ンジャー受容体 は,down-regulationを

表4　 β2-GPIリ ガ ン ド含 有 リボ ソー ムのマ クロ ファー ジへ の結合

無 血清培 地Celgrosser-Pで2時 間 培養 したJ774A.1細 胞 に,リ ガ ン ドを上 記 の濃 度(mol

%)含 有 した リボ ソー ム を加 え,4℃ で2時 間 イ ンキュベ ー トし,細 胞 に結 合 した放 射 能 と

タ ンパ ク質 量 を測定 した(pmol3H-DPPC/mgタ ンパ ク質,平 均+/-SD, n=3).

表5　 β2-GPIリ ガ ン ド含 有 りポ ソー ムの マ ク ロフ ァー ジへ の β2-GPIお よび抗 β2-GPI抗 体依 存 的 な結合

無 血 清 培 地Celgrosser-Pで2時 間 培 養 し たJ774A.1細 胞 に,β2-GPIお よ びWB-CAL-1存 在 下 で,30mol%リ ガ ン ド含

有 リ ボ ソー ム を加 え,4℃ で2時 間 イ ン キ ュベ ー トし,細 胞 に 結 合 し た放 射 能 と細 胞 の タ ンパ ク質 量 を 測 定 し た(pmol3H-DPPC/

mgタ ン パ ク質,平 均+/-SD, n=3).

Chol-linoleate:コ レ ス テ リル リ ノ レー ト.

β2-GPIリ ガ ン ドと抗 β2-GPI自 己抗体　 45

受け ないため際限な く変性LDLを 取込み細胞内に

コレステ ロールエ ステル を蓄積 し泡沫化 す る.ス カ

ベ ンジャー受容体 ファ ミリー として,タ イプA受 容

体(SR-A)44)お よびCD3645)な どの タイプB受 容体,

また,内 皮細胞 に発現す る酸化LDLの 受容体 とし

てLOX-146)お よびFcγ47)受 容体の存在が明 らかに

なってい る.こ れ らの スカベ ンジャー受容体 ファ ミ

リーが関わ り合 って酸化LDLが 取 り込 まれ る と考

えられ る.

方,in vitroで の変性LDLモ デル として,2

価の金属(銅 イオ ン,Cu2+,あ るいは鉄 イオ ン,Fe2+)

による酸化LDLお よび種々の変性LDL(マ ロンジ

アルデヒ ド(MDA)修 飾LDL,ア セチル化LDL,

糖化LDL,な ど)が 用 い られ ているが, in vivoで

のLDLの 酸化 機序についてはい まだ不 明な点が 多

い27,48-54).動脈硬化 の発症 と泡沫細胞の形成機序に関

す る研究 で,Cu2+に よる酸化LDLが ヒ トの動脈硬

化巣か ら精製 した酸化LDLと 類似 の物理化学的 お

よび免疫化学的性質 を有す ることが示 されてい る28).

LDL粒 子 中で,こ の様 な酸化 を受 け る物質 は,二

重結合 を2個 以上 もつ不 飽和脂 肪酸 であ る.ヒ ト

LDL中 に含 まれる不飽和脂肪酸 は主に リノール酸 で

あ り,コ レステロー ルエ ステル として存在 している.

Cu2+に よる酸化LDL中 には, cholesteryl hydroper

oxyoctadecadienoate (Chol-HPODE)お よ び

cholesteryl hydroxyoctadecadienoate (Chol-

HODE)が 酸化体 として検 出され るが55),こ のChol

HPODEは,血 小板 か らの成長 因子 を不活性化 す る

こ とが報告 されている56).また,ス テロール環 に関 し

ては,7-hydroxycholesterolがLDL酸 化 の初期

に現れ る主 なオキ システ ロール(oxysterol)で あ り,

7KCは 酸化反応の後期に検出 され る57).ま た,側 鎖

脂肪 酸に関 しては,9, 10位 あるいは12, 13位 のエ

ポキシ体,あ るいはこれ らの位置に,ヒ ドロキシル

体,ケ トンや アルデ ヒ ドな どの カルボニル基が導入

された誘導体が存在 することが報告 されている55, 58-60).

筆 者 らに よる一連 の検討 で,β2-GPIリ ガ ン ドに

関 して以下 の点が 明 らか になった.1)酸 化LDL脂

質画分 よ り精製 した β2-GPI 特異的 な リガ ン ド

(oxLig-1お よ びoxLig-2)は,い ず れ も コ レ ス

テ リル リ ノ レ ー トの 酸 化 分 解 物 で,ス テ ロ ー ル 環 が

7KCで,エ ス テ ル 化 さ れ た 脂 肪 酸 の 末 端(ω 位)に

カ ル ボ キ シ ル 基 を 持 つ 化 合 物 と 推 定 さ れ た.2)

oxLig-2に つ い て は,正 イ オ ン モ ー ドで,プ ロ トン

化 分 子 イ オ ン(M+H)+と し てm/z627,お よ び フ

ラ グ メ ン トイ オ ンm/z383を,ま た,負 イ オ ン モ ー

ドで は 脱 プ ロ ト ン化 フ ラ グ メ ン トイ オ ン(m/z243),

お よびm/z625お よ び627が 検 出 さ れ て い る.m/z383

は,7KCの プ ロ トン化 分 子 イ オ ン と同 じ質 量 数 で,

oxLig-1に も見 ら れ る.ま た 陰 イ オ ン モ ー ドで 脱 プ

ロ トン化 フ ラ グ メ ン トイ オ ン と考 え ら れ るm/z243

の ピ ー ク が 観 察 さ れ る.従 っ て,oxLig-2は 分 子 量

626の7KCの 脂 肪 酸 エ ス テ ル で あ る と考 え られ る.

さ ら に,陰 イ オ ン モ ー ドで,m/z625の 脱 プ ロ トン 化

分 子 イ オ ン お よ びoxLig-2の ジ ヒ ドロ 体 の ピー ク

(m/z627)が 検 出 さ れ て お り,こ れ ま で のCu2+に

よ る 酸 化LDLに 関 す る 報 告 を勘 案 す る と,oxLig-

2の 側 鎖 部 分 は12位 の 炭 素 が カ ル ボ キ シ ル 化,9位

に ケ トン 基 が 存 在 す る脂 肪 酸 で あ る4, 12-dioxo-12

(7-ketocholest-5-en-3β-yloxy) dodecanoic

acidと 考 え られ る.

本 研 究 で は,精 製oxLig-2の 他 に, oxLig-1

(9-(7-ketocholest-5-en-3β-yloxy)-9-

oxononanoic acid)お よ び13-COOH-7KC (13-

(7-ketocholest-5-en-3β-yloxy)-13-

oxotridecanoic acid)を 化 学 合 成 し,β2-GPIお

よ び β2-GPI依 存 的 な 抗 β2-GPI抗 体(aCL)の

反 応 性,お よ び こ れ ら が 関 与 す る マ ク ロ フ ァ ー ジ へ

の 酸 化LDLの 取 り込 み に つ い て 検 討 し た .こ れ ら

3種 類 の β2-GPIリ ガ ン ドの い ず れ に も,ω 位(脂

肪 酸 末 端)に カ ル ボ キ シ ル 基 が 存 在 す る.さ ら に,

デ ー タ は 示 し て い な い が,こ れ ら の 遊 離 カ ル ボ キ シ

ル 基 を メ チ ル 化 す る こ とで β2-GPIお よ び β2-GPI

依 存 的 な 抗 β2-GPI 抗 体 の リガ ン ドへ の 結 合 性

(ELISAお よ び リ ガ ン ドブ ロ ッ ト)お よ び マ ク ロ フ

ァ ー ジへ の 結 合･取 り込 み が 完 全 に 消 失 し た.以 上

の こ と よ り,コ レ ス テ リル リ ノ レ ー トの 酸 化 反 応 に

よ り付 加 さ れ る ω 位(脂 肪 酸 末 端)の カ ル ボ キ シ ル

46　 劉 慶 平

基 が β2-GPIの 結合 に必須で あるこ とが考 えられ

る.

今 回,Cu2+に よる酸化LDLの 脂質画分 よ り精製

したoxLig-1(あ るいは合 成oxLig-1),精 製

oxLig-2,お よび合 成13-COOH-7KCを 含有す る

リボソーム のマ クロファー ジへ の結合 は,対 照のPS

含有 リボソー ムの結合 に比べ,著 明ではなか った.

PSが マ クロファー ジのスカベ ンジャー受容体 に認識

され るため,酸 化LDLの モデル としてPSリ ポソ

ムが しば しば用 い られ る.し か しなが ら,こ れ ら

β2-GPIリ ガン ドは,ス カベ ンジャー受容体 の リガ

ン ドとの結合 はそれ程度 強 くない.一 方,β2-GPI

お よび抗 β2-GPI自 己抗体 の共存下 では β2-GPI

リガ ン ド含 有 リボソームの顕著 なマ クロフ ァージへ

の結合･取 り込みの増加 が観察 された.こ の取 り込

みは,ス カベ ンジャー受容体 ではな く,Fcγ 受容体

を介 す るもの と考 えられ る(図4)61-64).

ところで,ご く最近 の我 々の検討 で,SLEを 合併

す る2次 性APS患 者におけ る動脈血栓症 の既往例

と,oxLig-1・ β2-GPI複 合体 に対す る自己抗体 の

陽性 例 との問に高 い関連性が示 された(投 稿 中).さ

らに,同 疾患 にお いて,血 中酸化LDLの 高値例 と

動脈血栓 症の既往 例の間 に有意 な相関 も認め られて

い る.Georgeら は,LDLレ セプ ター 欠損マ ウス を

β2-GPIで 免疫す ると動脈壁 の脂肪斑形成 が促進 さ

れ るこ とや,ヒ ト動脈硬化病巣 で β2-GPIが 存在

す るこ と65)を報告 して いる.こ れ らの結果 は,マ クロ

ファー ジを用い るin vitroの 実験 で示 され た抗 β2

-GPI抗 体 の動 脈硬化 発症への関与の可能性 を支持す

る もので ある.

この よ うに,我 々の一連の研 究 で,APSに おけ る

動脈血栓(動 脈硬化)発 症 に,酸 化LDL・ β2-GPI

複合体に対す る抗 β2-GPI抗 体 の免疫応答が関与

しているこ とを示す新 たな知見が得 られ たこ とにな

る.さ らに これ らの事実 よ り,APSの 診断には,抗

β2-GPI自 己抗体の測定 に加 えて,血 中酸化LDL

の測定が必須で あるこ とも明 らか となった.

図4　 β2-GPIお よび抗 β2-GPI自 己抗体 の関与 す る酸化

LDLの マ クロ ファー ジへ の取 り込 み.泡 沫化 の機 序.

結 論

1)　抗 リン脂質抗体 症候群 にお いて 自己抗体の関与

す る動脈硬化発症機序 を解明す る 目的 で,Cu2+で

酸化 した酸化LDLの 脂質画分 よ りβ2-グ リコプ

ロテインI (β2-GPI)に 対す る リガン ドを精製

し構造 を解析 した.

2)　β2-GPIに 特 異的な リガ ン ドは,コ レステ リル

リノレー トの酸化体 で,ス テロー ル環が7-ケ トコ

レステロー ル(7KC,オ キシステロー ルの1つ)

であ り,エ ステル結合 した側鎖脂肪酸が ω-カ ルボ

キ シル体 であった.

3)　β2-GPIと の結合,お よび,こ の結合 を介す る

抗 β2-GPI抗 体依存的 なマ クロファー ジへの結

合･取 り込みが,β2-GPIリ ガン ドの側鎖脂肪酸

の遊離 カルボン酸 を メチル化す るこ とで消失す る

ことは,こ れ らβ2-GPIリ ガン ドの生理活性(結

合活性)中 心 が ω 位-カ ルボキシル基 であ るこ と

を示 してい る.

4)　β2-GPIリ ガ ン ド含有 リボソームのマウスマ ク

ロファー ジへ の結合 は,β2-GPIお よび抗 β2-

GPI抗 体 に依存的 であるこ と,お よび,動 脈血栓

の既往 のあ る抗 リン脂質抗体症候群(APS)患 者

で,高 率 に血 中酸化LDL高 値例お よび β2-GPI.

リガン ド複合体 に対す る 自己抗体 陽性例 が存在 す

β2-GPIリ ガ ン ドと抗 β2-GPI自 己抗体　 47

ることより,APSに おいて,動 脈 血栓(動 脈硬化)

形成に,酸 化LDL,β2-GPI,お よび抗 β2-GPI

抗体 が関与す る機序 が存在 す る可能性 が示め され

た.

文 献

1) Hughes GRV, Harris EN and Gharavi AE: The

anticardiolipin syndrome. J. Rheumatol. (1986) 13,

486-489.

2) Harris EN, Gharavi AE, Boey ML, Patel BM,

Mackworth-Young CG, Loizou S and Hughes GRV:

Anticardiolipin antibodies: detection by radioim

munoassay and association with thrombosis in sys

temic lupus erythematosus. Lancet (1983) 2, 1211

-1214.

3) Matsuura E, Igarashi Y, Fujimoto M, Ichikawa K

and Koike T: Anticardiolipin cofactor (s) and differ

ential diagnosis of autoimmune disease. Lancet

(1990) 336, 177-178.

4) Galli M, Comfurius P, Maassen C, Hemker HC, De

Baets MH, Van Breda Vriesman PJC, Barbui T,

Zwaal RFA and Bevers EM: Anticardiolipin anti

bodies (ACA) directed not to cardiolipin but to a

plasma protein cofactor. Lancet (1990) 335, 1544

-1547.

5) McNeil HP, Simpson RJ, Chesterman CN and Krilis

SA: Anti-phospholipid antibodies are directed

against a complex antigen that includes a lipid

binding inhibitor of coagulation: ƒÀ2-glycoprotein I

(apolipoprotein H). Proc. Natl. Acad. Sci. USA.

(1990) 87, 4120-4124.

6) Matsuura E, Igarashi Y, Yasuda T, Triplett DA and

Koike T: Anticardiolipin antibodies recognize ƒÀ2

glycoprotein I structure altered by interacting with an

oxygen modified solid phase surface. J. Exp. Med.

(1994) 179, 457-462.

7) Wurm, H: ƒÀ2-glycoprotein-I (apolipoprotein H)

interactions with phospholipid vesicles. Int. J.

Biochem. (1984) 16, 511-515.

8) Polz, E: Isolation of a specific lipid-binding protein

from human serum by affinity chromatography using

heparin-Sepharose in Provides of biological fluids

(Peeters, H, Ed) Pergamon Press, Oxford (1988) pp.

817-820.

9) Vazquez-Mellado J, Llorente L, Richaud-Patin Y

and Alarcon-Segovia D: Exposure of anionic phos

pholipids upon platelet activation permits binding of

ƒÀ2-glycoprotein I and through it that of IgG antiphos

pholipid antibodies. Studies in platelets from patients

with antiphospholipid syndrome and normal subjects.

J. Autoimmun. (1994) 7, 335-348.

10) Price BE, Rauch J, Shia MA, Walsh MT, Lieberthal

W, Gilligan HM, O'Laughlin T, Koh JS and Levine

JS: Anti-phospholipid autoantibodies bind to

apoptotic, but not viable, thymocytes in a ƒÀ2-glyco

protein I-dependent manner. J. Immunol. (1996) 157,

2201-2208.

11) Koike T, Tsutsumi A, Ichikawa K and Matsuura E:

Antigenic specificity of the "anticardiolipin" anti

bodies. Blood (1995) 85, 2277-2278.

12) Igarashi M, Matsuura E, Igarashi Y, Nagae H,

Ichikawa K, Triplett DA and Koike T: Human ƒÀ2

glycoprotein I as an anticardiolipin cofactor deter

mined using deleted mutants expressed by a

baculovirus system. Blood (1996) 87, 3262-3270.

13) Chamley LW, Duncalf AM, Konarkowska B,

Mitchell MD and Johnson PM: Conformationally

altered ƒÀ2-glycoprotein I is the antigen for anti

cardiolipin autoantibodies. Clin. Exp. Immunol.

(1999) 115, 571-576.

14) Wang SX, Sun YT and Sui SF: Membrane-induced

conformational change in human apolipoprotein H.

Biochem. J. (2000) 348, 103-106.

15) Roubey RAS, Eisenberg RA, Harper MF and

Winfield JB: "Anticardiolipin" autoantibodies recog

nize ƒÀ2-glycoprotein I structure in the absence of

phospholipid. Importance of Ag density and bivalent

binding. J. Immunol. (1995) 154, 954-960.

16) Tincani A, Spatola L, Prati E, Allegri F, Ferremi

P, Cattaneo R, Meroni P and Balestrieri G: The anti

-ƒÀ2-glycoprotein I activity in human anti

phospholipid syndrome sera is due to monoreactive

low-affinity autoantibodies directed to epitopes locat

ed on native ƒÀ2-glycoprotein I and preserved during

species' evolution. J. Immunol. (1996) 157, 5732

-5738.

17) Sheng Y, Kandiah DA and Krilis SA: Anti-ƒÀ2

glycoprotein I autoantibodies from patients with the

antiphospholipid syndrome bind to ƒÀ2-glycoprotein

48　 劉 慶 平

I with low affinity: dimerization of ƒÀ2-glycoprotein I

induces a significant increase in anti-ƒÀ2-glycoprotein

I antibody affinity. J. Immunol. (1998) 161, 2038

-2043.

18) Lutters BCH, Meijers JCM, Derksen RHM and

Arnout J: Dimers of ƒÀ2-glycoprotein I mimic the in

vitro effects of 62-glycoprotein I-anti-ƒÀ2-glyco

protein I antibody complexes. J. Biol. Chem. (2001)

276, 3060-3067.

19) Polz E and Kostner GM: The binding of ƒÀ2-glyco

protein-I to human serum lipoproteins. Distribution

among density fractions. FEBS Lett. (1979) 102, 183

186.

20) Schousboe I: 82-glycoprotein I: a plasma inhibitor

of the contact activation of the intrinsic blood coagu

lation pathway. Blood (1985) 66, 1086-1091.

21) Nimpf J, Wurm H and Kostner GM: 62-glyco

protein I (apo-H) inhibits the releasereaction of

human platelets during ADP-induced aggregation.

Atherosclerosis (1987) 63, 109-114.

22) Nimpf J, Bevers EM, Bomans PH, Till U, Wum H,

Kostner GM, Zwaal RF: prothrombinase activity of

human platelets is inhibited by ƒÀ2-glycoprotein I.

Biochim. Biophys. Acta (1986) 884, 142-149.

23) Ogasawara M, Aoki K, Matsuura E, Kunimatsu M,

Ohkubo I, Galli M, Sasaki M, Yagami Y: Anticar

diolipin antibodies in patients with pregnancy loss

induce factor Xa production in the presence of ƒÀ2

-glycoprotein I. Am. J. Reprod. Immunol. (1995) 34,

269-273.

24) Nakaya Y, Schaefer EJ and Bryan Brewer H Jr:

Activation of human post heparin lipoprotein lipase

by apolipoprotein H (ƒÀ2-glycoprotein I). Biochem.

Biophys. Res. Commun. (1980) 95, 1168-1172.

25) Ross R: The pathogenesis of atherosclerosis-an up

date. N. Engl. J. Med. (1986) 314, 488-500.

26) Ross R: The pathogenesis of atherosclerosis: a per

spective for the 1990s. Nature. 362, 801-809.

27) Palinski W, Rosenfeld ME, Yla-Herttuala S, Gurt

ner GC, Socher SS, Butler SW, Parthasarathy S,

Carew TE, Steinberg D and Witztum JL: Low den

sity lipoprotein undergoes oxidative modification in

vivo. Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1989) 86, 1372

1376.

28) Yla-Herttuala S, Palinski W, Rosenfeld ME, Parth

asarathy S, Carew TE, Butler S, Witztum JL and

Steinberg D: Evidence for the presence of

oxidatively modified low density lipoprotein in ather

osclerotic lesions of rabbit and man. J. Clin. Invest.

(1989) 84, 1086-1095.

29) Penn MS and Chisolm GM: Oxidized lipoproteins,

altered cell function and atherossclerosis. Atheros

clerosis (1994) 108 (Suppl.), 21-29.

30) Steinberg D: Role of oxidized LDL and antioxidants

in atherosclerosis. Adv. Exp. Med. Biol. (1995)

369, 39-48.

31) Vaarala O, Alfthan G, Jauhiainen M, Leirisalo-Repo

M, Aho K and Palosuo T: Crossreaction between

antibodies to oxidized low-density lipoprotein and to

cardiolipin in systemic lupus erythematosus. Lancet

(1993) 341, 923-925.

32) Tinahones FJ, Cuadrado MJ, Khamashta MA,

Mujic F, Gomez-Zumaquero JM, Collantes E and

Hughes GRV: Lack of cross reaction between anti

bodies to ƒÀ2-glycoprotein-I and oxidized low-density

lipoprotein in patients with antiphospholipid syn

drome. Br. J. Rheumatol. (1998) 37, 746-749.

33) Romero FI, Amengual O, Atsumi T, Khamashta

MA, Tinahones FJ and Hughes GRV: Arterial dis

ease in lupus and secondary antiphospholipid syn

drome: Association with anti-ƒÀ2-glycoprotein I anti

bodies but not with antibodies against oxidized low

density lipoprotein. Br. J. Rheumatol. (1998) 37,

883-888.

34) Hasunuma Y, Matsuura E, Makita Z, Katahira T,

Nishi S and Koike T: Involvement of ƒÀ2-glyco

protein I and anticardiolipin antibodies in oxidatively

modified low-density lipoprotein uptake by macro

phages. Clin. Exp. Immunol. (1997) 107, 569-573.

35) Kobayashi K, Matsuura E, Liu QP, Furukawa JI,

Kaihara K, Inagaki J, Atsumi T, Sakairi N, Yasuda

T, Voelker DR and Koike T: A specific ligand for

ƒÀ2-glycoprotein I mediates autoantibody-dependent

uptake of oxidized low density lipoprotein by macro

phages. J. Lipid. Res. (2001) 42, 697-709.

36) Matsuura E, Igarashi Y, Fujimoto M, Ichikawa K,

Suzuki T, Sumida T, Yasuda T and Koike T:

Heterogeneity of anticardiolipin antibodies defined

by the anticardiolipin cofactor. J. Immunol. (1992)

148, 3885-3891.

β2-GPIリ ガ ン ドと抗 β2-GPI自 己抗 体　 49

37) Hashimoto Y, Kawamura M, Ichikawa K, Suzuki T,

Sumida T, Yoshida S, Matsuura E, Ikehara S and

Koike T: Anticardiolipin antibodies in NZW•~BXSB

FI mice. A model of antiphospholipid syndrome. J.

Immunol. (1992) 149, 1063-1068.

38) Havel RJ, Eder HA and Bragdon JH: The distribu

tion and chemical composition of ultracentrifugally

separated lipoproteins in human serum. J. Clin.

Invest. (1955) 43, 1345-1353.

39) Ohkawa H, Ohishi N and Yagi K: Assay for lipid

peroxides in animal tissues by thiobarbituric acid

reaction. Anal. Biochem. (1979) 95, 351-358.

40) Folch J, Lees M and Sloane-Stanley GH: A simple

method for the isolation and purification of total

lipids from animal tissues. J. Biol. Chem. (1957)

226, 497-509.

41) Nishikawa K, Arai H and Inoue K: Scavenger

receptor-mediated uptake and metabolism of lipid

vesicles containing acidic phospholipids by mouse

peritoneal macrophages. J. Biol. Chem. (1990) 265,

5226-5231.

42) Brown MS and Goldstein JL: A receptor-mediated

pathway for cholesterol homeostasis. Science (1986)

232, 34-47.

43) Steinberg D, Parthasarathy S, Carew TE: Beyond

cholesterol-modification of low density lipoprotein

that increace its atherogenicity. N. Engl. J Med.

(1989) 320, 915-924.

44) Kodama T, Freeman M, Rohrer L, Zabrecky J,

Matsudaira P and Krieger M: Type I macrophage

scavenger receptor contains ƒÀ2-helical and collagen

like coiled coils. Nature (1990) 343, 531-535.

45) Endemann G, Stanton LW, Madden KS, Bryant CM,

White RT and Protter AA: CD36 is a receptor for

oxidized low density lipoprotein. J. Biol. Chem. 268,

11811-11816.

46) Sawamura T, Kume N, Aoyama T, Moriwaki H,

Hoshikawa H, Aiba. Y, Tanaka T, Miwa S,

Katsura Y, Kita T and Masaki T: An endothelial

receptor for oxidized low-density lipoprotein. Nature

(1997) 386, 73-77.

47) Stanton LW, White RT, Bryant CM, Protter AA

and Endemann G: A macrophage Fc receptor for IgG

is also a receptor for oxidized low density lipoprotein.

J. Biol. Chem. (1992) 267, 22446-22451.

48) Heinecke JW, Baker L, Rosen H and Chait A:

Superoxide-mediated modification of low density

lipoprotein by arterial smooth muscle cells. J. Clin.

Invest. (1986) 77, 757-761.

49) Parthasarathy S, Fong LG, Quinn MT and Steinberg

D: Oxidative modification of LDL: comparison

between cell-mediated and copper-mediated modifica

tion. Eur. Heart J. (1990) 11 (Suppl. E), 83-87.

50) Lamb DJ and Leake DS: Acidic pH enables cerulo

plasmin to catalyze the modification of low-density lipoprotein. FEBS Lett. (1994) 338, 122-126.

51) Tribble DL, Chu BM, Levine GA, Krauss RM and

Gong EL: Selective resistance of LDL core lipids to

iron-mediated oxidation. Implications for the biologi

cal properties of iron-oxidized LDL. Arterioscler.

Thromb. Vasc. Biol. (1996) 16, 1580-1587.

52) Goldstein JL, Ho YK, Basu SK and Brown MS:

Binding site on macrophages that mediates uptake

and degradation of acetylated low density lipoprotein,

producing massive cholesterol deposition. Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1979) 76, 333-337.

53) Sakurai T, Sugioka K and Nakano M: O2- genera

tion and lipid peroxidation during the oxidation of a

glycated polypeptide, glycated polysine, in the pres ence of iron-ADP. Biochim. Biophysica Acta (1990)

1043, 27-33.

54) Mcknight RC, Hunter FE: Effects of inoganic iron

on the thiobarbituric acid method for determination

of lipid peroxides. Biochim. Biophys. Acta (1965)

98, 640-643.

55) Kritharides L, Jessup W, Gifford J and Dead RT: A

method for defining the stages of low-density lipo

protein oxidation by the separation of cholesterol-and choleteryl ester-oxidation products using HPLC.

Anal. Biochem. (1993) 213, 79-89.

56) Van Heek M, Schmitt D, Toren P, Cathcart MK and

DiCorleto PE: Cholesteryl hydroperox

yctadecadienoate from oxidized low density lipo

protein inactivates platelet-derived growth factor. J. Biol. Chem. (1998) 273, 19405-19410 .

57) Brown AJ, Leong S, Dean RT and Jessup W . 7 hydroperoxycholesterol and its products in low den

sity lipoprotein and human atherosclerotic plaque . J. Lipid. Res. (1997) 38, 1730-1745.

58) Kamido H, Kuksis A, Marai L and Myher JJ:

50　 劉 慶 平

Identification of cholesterol-bound aldehydes in

copper-oxidized low density lipoprotein. FEBS Lett.

(1992) 304, 269-272.

59) Kamido H, Kuksis A, Marai L and Myher JJ: Lipid

ester-bound aldehydes among copper-catalyzed per

oxidation products of human plasma lipoproteins. J.

Lipid. Res. (1995) 36, 1876-1886.

60) Hoppe G, Ravandi A, Herrera D, Kuksis A and Hoff

HF: Oxidation products of cholesteryl linoleate are

resistant to hydrolysis in macrophages, form com

plexes with proteins, and are present in human atherosclerotic lesions. J. Lipid Res. (1997) 38, 1347

1360.

61) Lopes-Virella MF, Binzafar N, Rackley S, Takei A,

La Via M and VirellaG : The uptake of LDL-IC by

human macrophages: predominant involvement of

the FcyRI receptor. Atherosclerosis (1997) 135, 161

170.

62) Khoo JC, Miller E, Pio F, Steinberg D and Witztum

JL:Monoclonal antibodies against LDL further

enhance macrophage uptake of LDL aggregates.

Arterioscler. Thromb. (1992) 12, 1258-1266.

63) Kiener PA, Rankin BM, Davis PM, Yocum SA,

Warr GA and Grove RI: Immune complexes of LDL

induce atherogenic responses in human monocytic

cells. Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol. (1995) 15,

990-999.

64) Morganelli PM, Rogers RA, Kitzmiller TJ and

Bergeron A: Enhanced metabolism of LDL aggre

gates mediated by specific human monocyte IgG Fc

receptors. J. Lipid. Res. (1995) 36, 714-724.

65) George J, Harats D, Gilburd B: Immunolocalization

of ƒÀ2-glycoprotein I (apolipoprotein H) to human

atherosclerotic plaques: potential implications for

lesion progression. Circulation (1999) 99, 2227-2230.

β2-GPIリ ガ ン ドと抗 β2-GPI自 己抗体　 51

A mechanism of development of arterial thrombosis:

ƒÀ2-glycoprotein I-specific ligand and autoantibody

Qingping Liu

Department of Cell Chemistry,

Okayama University Graduate School of Medicine and Dentistry,

Okayama 700-8558, Japan

(Director: Prof. T. Yasuda)

ƒÀ 2-Glycoprotein I (ƒÀ2-GPI) is a major antigen for anticardiolipin antibodies (aCL) appeared in patients

with antiphospholipid syndrome (APS). We recently reported that ƒÀ2-GPI specifically binds to oxidized

low-density lipoprotein (oxLDL) and that on of the ƒÀ2-GPI's major ligands derived from oxLDL, oxLig-1,

is 9-(7-ketocholest-5-en-3ƒÀ-yloxy)-9-oxononanoic acid (J. Lipid Res. 42, 697, 2001). In the present study,

it was demonstrated that carboxylated variants of cholesteryl linoleate have a critical role for ƒÀ2-GPI

binding. In vitro experiments indicate that oxLDL was uptaken by macrophages via an interaction among

the ligand such as oxLig-1, ƒÀ2-GPI, and anti-p2-GPI autoantibodies. The uptake was not occurred by

cholesterol or its ester without a free carboxyl residue, i.e., cholesteryl lenoleate, by cholesterol, or by 7

-ketocholesterol alone, even in the presence of ƒÀ2-GPI and anti-ƒÀ2-GPI antibodies. Thus, carboxyl variants

of cholesteryl ester specific for ƒÀ2-GPI may mediate anti-ƒÀ2-GPI Ab-dependent uptake of oxLDL by

macrophages and autoimmune atherogenesis developed in APS.