タンパク質の分離・精製

生体材料

タンパク質の抽出

・ホモジネート

・遠心分離

分別沈殿（塩析）

脱塩

・クロマトグラフィー

・電気泳動

・限外ろ過

生体材料

・動物臓器

・動物培養細胞

・植物組織

・微生物

微生物

培養

前培養

大量培養

集菌 ホモジネート、破砕

機械破砕

超音波破砕

加圧減圧処理

タンパク質の定量

フェノール試薬法（Lowry法）タンパク質

（還元性基）リンモリブデン酸 リンモリブデンブルー

500から750 nmの吸光度を測定

フェノール類と反応して青色を示すフェノール試薬

（リンモリブデン酸）を用いる。

タンパク質（還元性基）

チロシン、システイン、

トリプトファンなど

・比較的感度が高い。

・特定のアミノ酸残基に依存する。

・還元性物質の影響を受ける。

ビウレット法

タンパク質（アルカリ溶液） + CuSO4 錯体形成

紫紅、青紫を呈色

540から560 nmの吸光度を測定

紫外吸収法

１．280 nmの吸光度

トリプトファン ε278 = 5550 M-1cm-1

チロシン ε275 = 1340 M-1cm-1

フェニルアラニン

２．215, 225 nmの吸光度の差

タンパク質のペプチド結合（190-230 nm）

３．280, 205 nmの吸光度の比

色素結合法

クマシーブリリアントブルー

陽イオン型 陰イオン型中性型

470 nm（赤） 650 nm（緑） 595 nm（青）

タンパク質と結合すると陰イオン型になる。

CH2

-O3S

N

C2H5

R

C

R

N+

H2C

C2H5

SO3-

NH

OC2H5

R = H CBB R-250R = CH3 CBB G-250

クロマトグラフィー

二相間の分配に基づく分離法

移動相

固定相

試料注入

時間または容量

t0

V0

Vr

tr

V0：ボイド容量

　カラムに保持されずに出てくる

　溶出容量

tr

：保持容量

：保持時間

Vr

タンパク質の分離には液体クロマト

グラフィーを用いる。

Vr = tr × f

：流速f

N =t rσ

2

N = 16t rW

2

時間または容量

trA

N = 5.54t r

W1 /2

2

W1 /2

理論段数 W = 4 σ

：半値幅

t0

V0

VrA

trB

VrB

試料注入

保持される度合い

容量比（Capacity factor）k'

k' =Vr – V0

V0=

tr – t0t0

分離係数（Separation factor）α

α =k'(

A)k

'(B)

A B

液体クロマトグラフィーの種類

１．イオン交換クロマトグラフィー 静電的結合

２．ゲルろ過クロマトグラフィー 分子ふるい

３．疎水性クロマトグラフィー 疎水的相互作用

４．吸着クロマトグラフィー 水素結合、ファンデル

　　（ヒドロキシアパタイト） ワールス力

５．逆相クロマトグラフィー 疎水的相互作用

６．アフィニティークロマトグラフィー 特異的親和性

１．イオン交換クロマトグラフィー

pHの平衡化 試料の添加 イオン強度：低 高

陽イオン交換樹脂

陽イオン性物質

陰イオン性物質

分取目的タンパク質の必要な基本情報

　・等電点

　・安定性

4 6 8 10pH

電

荷

+

-

タンパク質の電荷とpHの関係

等電点

タンパク質が安定なpH領域

例えばこの場合

pH 5　陽イオン交換体を使用

pH 8　陰イオン交換体を使用

緩衝溶液

緩衝成分がイオン交換体に吸着されれば、ｐＨのずれを

生じるので、そのような組み合わせはさける。

従って、

陰イオン交換体には、　　　　　　　　　　　　　型

陽イオン交換体には、　　　　　　　　　　　　　型

を用いる。

BH+ B + H+

AH A- + H+

２．ゲルろ過クロマトグラフィー

平衡化 試料の添加 一定の緩衝液による溶出

多孔性樹脂

低分子量物質

高分子量物質 利点

固定相への吸着がないため、タンパク質が変性しにくい。

ｐＨやイオン強度に影響されにくい。

分子ふるい

３．疎水性クロマトグラフィー

塩濃度の違いによる溶出平衡化 試料の添加 塩強度：高 低

疎水性樹脂

疎水性物質

親水性物質

タンパク質の疎水性相互作用を利用する。

疎水性アミノ酸　Ｗ，Ｉ，Ｐ，Ｆ，Ｌ，Ｖ　などが含まれるため。

吸着脱離に関する要因

ａ．温度

　　疎水結合の強度は温度変化に大きく依存する。

ｂ．イオン

　　疎水結合はイオンの種類や濃度によって大きく影響される。

　　アニオン　　疎水結合を弱める　　　　　疎水結合を強める

　　SCN ->I->CLO4->NO3

->Br->Cl->CH3COO->F->SO42-

　　カチオン

　　Ba 2+>Ca2+>Mg2+>Li+>Cs+>Na+>K+>Rb+>NH4+

　　高濃度硫安(NH 4)2SO4によって疎水結合は強められる。

ｃ．界面活性剤

４．吸着クロマトグラフィー

　（ヒドロキシアパタイト）

Ca10(PO4)6(OH)2 六角柱結晶

a面：酸性タンパク質が主に吸着

c面：塩基性タンパク質が主に吸着

a、c面の溶出：リン酸緩衝溶液

c面の溶出：KCl, NaCl, CaCl2, MgCl2

a面（b面は等価）

c面

リン酸イオン濃度：

低

ヒドロキシアパタイト・クロマトグラフィー

平衡化 試料の添加 KCl濃度：

低 高

ヒドロキシアパタイト担体

酸性タンパク質

塩基性タンパク質

高

ｃ面の溶出 a、ｃ面の溶出

５．逆相クロマトグラフィー有機溶媒濃度の違いによる溶出

平衡化 試料の添加 有機溶媒濃度：低 高

疎水性担体

疎水性物質

親水性物質 固定相：オクタデシルシラン（ＯＤＳ）など

移動相：水溶液、水溶液・有機溶媒混合溶液

疎水性有機化合物、ペプチド、核酸」の分離

６．アフィニティークロマトグラフィー

生化学的な特異的親和性を利用

試料添加

目的タンパク質

不純物

目的タンパク質の

吸着

目的タンパク質の

溶出

吸着体固定化カラム