インフルエンザウイルスの 転写機構を視る -...
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インフルエンザウイルスの転写機構を視る
野田 岳志京都大学ウイルス研究所 ウイルス微細構造研究領域JSTさきがけ
160716
京都大学ウイルス研究所
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鴨川
「視る研究」
見る…なんとなく見る。観る…見物する、観賞する。視る…考えながら注意深く見る。
「視る研究」
見る…なんとなく見る。観る…見物する、観賞する。視る…考えながら注意深く見る。
さまざまな顕微鏡を使った研究
蛍光顕微鏡原子間力顕微鏡
透過型電子顕微鏡
クライオ電子顕微鏡当研究室の顕微鏡
なぜ、さまざまな顕微鏡が必要なのか？
視るウイルス研究の究極の目標
1. 細胞の中で（その場で）2. 原子レベルで
（非常に高い分解能で）3. 構造・変化・動き
（生きている状態で）
を視覚的に明らかにして、ウイルスの増殖機構を理解する。
これらを満たす究極の顕微鏡は存在しない
なぜ、さまざまな顕微鏡が必要なのか？
それぞれの特徴・長所がある。これらを組み合わせて使う必要がある。
動き・変化
分解能
その場
動
静
in situ
in vitro
低高
電顕
原子間力顕微鏡
NMR
X線結晶
蛍光顕微鏡
蛍光顕微鏡
○見たいものが見える○その場で見られる○動きも見られる
▲そのものの構造は見えない▲分解能が高くない▲見たいもの以外は見えない
(高速)原子間力顕微鏡
○比較的高い分解能○動きも見られる
▲その場では見えない▲小さいものしか見られない▲何を見てるか断言できない
(クライオ)電子顕微鏡
○比較的高い分解能○画像解析で高分解能○その場で見ることも可能
△固定・脱水・染色等の処理▲動き・変化は見られない▲何を見てるか断言できない
「視る研究」
特徴を理解して使えば、顕微鏡法はパワフルな研究ツール！
1. 百聞は一見に如かず
間接的な証拠を集めるより、1枚の写真で証明。
2. 代替法がない。
見ないとどうしてもわからないこともある。
見て初めてわかることもある
百聞は一見に如かずの例：インフルエンザウイルスのゲノムパッケージング機構
インフルエンザウイルスの遺伝子RNA
1
2
3
4
5
6
7
8
各遺伝子分節から様々なタンパク質が作られる
PB2
PB1/PB1-F2
PA
HA
NP
NA
M1/M2
NS1/NS2
vRNA
NP
PB1
PB2
PA
1 2 3 4 5 6 7 8
50-
120nm
12nm
遺伝子RNA-タンパク質複合体 (RNP）
インフルエンザウイルスの増殖環
インフルエンザウイルスの増殖環
インフルエンザウイルスの増殖環
インフルエンザウイルスの増殖環
感染性を持つ完全なウイルス粒子を形成するためには…
８種類のRNA分節をウイルス粒子内に取り込む必要がある
インフルエンザウイルスの増殖環
1 2 3 4 5 6 7 8
８種類のRNA分節を個々のウイルス粒子がもれなく取り込むのはとても難しい
1 2 3 4 5 6 7 8
1 2 3 4 5 6 7 8
1 2 3 4 5 6 7 8
1 2 3 4 5 6 7 8
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感染細胞内でゲノムが複製
８種類のRNA分節を個々のウイルス粒子がもれなく取り込むのはとても難しい
123
4 5
6
7 8
1 2
3
4
5
6
7
8
1
234
5
6
78
12
3
4 56
7
8
感染細胞
123
4 5
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1 2
3
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1
234
5
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感染細胞
1 2 3 45 6
7
7 8
袋から８種類を選びとる
ランダム説
数も種類もバラバラに取り込まれる。
たまたま8種類を取り込んだウイルスのみ感染性を持つ。あるいは、複数の不完全なウイルスが１つの細胞に感染する。
Noda & Kawaoka
PNAS 20１2
8種類8本が選択的に取り込まれる。
ウイルス粒子はすべて感染性を持つ。
Noda & Kawaoka
PNAS 20１2
選択仮説
個々のウイルス粒子がどのようにゲノムを取り込むのか？
ウイルス粒子の中を観察
50年以上もの謎
？
？
縦断面を観察
100nm
vRNA
NP
PB1
PB2
PA
RNP
横断面を観察
50nm
Noda et al. Nature, 2006
8本のRNP
電子線トモグラフィー(3次元電子顕微鏡法)
電子顕微鏡で様々な角度から試料を撮影し、それらをコンピューターで組み合わせ、試料の3次元立体構造を作る。
電子線トモグラフィー
電子線トモグラフィー
電子線トモグラフィー
Noda et al. Nature communications, 2012
12345678
ほぼすべてのウイルス粒子が8本のRNPを取り込んでいた。8本のRNPは長さが違っていた。
8種類のゲノムRNAを取り込む
百聞は一見に如かずの例：インフルエンザウイルスのゲノムパッケージング機構
代替法がないの例：
見ないとどうしてもわからないこともある。
見て初めてわかることもある。
インフルエンザウイルスの転写機構
セントラルドグマ
DNA
タンパク質
mRNA
(-) vRNA
(+) mRNA
インフルエンザウイルスの転写・複製
複製転写
(+) cRNA
(-) vRNA
(+) mRNA
インフルエンザウイルスの転写・複製
複製転写
(+) cRNA
翻訳
タンパク質
・ウイルスゲノムのコピー
・ウイルスRNAポリメラーゼ
(-) vRNA
(+) mRNA
インフルエンザウイルスの転写・複製
複製転写
(+) cRNA
翻訳
タンパク質
・ウイルスRNAポリメラーゼ
・mRNAを合成
インフルエンザウイルスの遺伝子RNA
1
2
3
4
5
6
7
8
各遺伝子分節から様々なタンパク質が作られる
PB2
PB1/PB1-F2
PA
HA
NP
NA
M1/M2
NS1/NS2
5’ 3’ vRNA
NP
RNA polymerase
(PB2, PB1, PA)
RNP
vRNAはNPとウイルスポリメラーゼとともに二重らせんのRNP複合体として存在する
インフルエンザウイルスvRNAの転写
NP
RNP
5’ 3’ vRNA mRNAの合成転写
vRNAはRNPの状態で
転写されるRNA polymerase
(PB2, PB1, PA)
インフルエンザウイルスvRNAの転写
感染細胞におけるウイルスゲノムの転写
核
細胞質
ウイルス粒子
吸着
侵入核
細胞質
感染細胞におけるウイルスゲノムの転写
脱殻
膜融合
核
細胞質
感染細胞におけるウイルスゲノムの転写
核内輸送
核
細胞質
感染細胞におけるウイルスゲノムの転写
Pol II
DNA
m7G
宿主pre-mRNA
宿主PolIIがpre-mRNAを合成
CTD
感染細胞におけるウイルスゲノムの転写
Cap
Pol IIm7G
宿主pre-mRNA
CTD
感染細胞におけるウイルスゲノムの転写
RNPがPolIIに結合
Cap
転写開始
Pol II
宿主pre-mRNA
感染細胞におけるウイルスゲノムの転写
1. Cap結合
Cap
Pol II
宿主pre-mRNA
感染細胞におけるウイルスゲノムの転写
2. Cap-RNAの切断
Cap
Pol II
感染細胞におけるウイルスゲノムの転写
3. 転写開始(プライマー依存的)
Pol II
感染細胞におけるウイルスゲノムの転写
4. 伸長反応（vRNA 3’→5’）
Pol II
感染細胞におけるウイルスゲノムの転写
5. Poly(A)付加(U track)
ウイルスゲノムの転写
1. Pre-mRNAのCapに結合2. Cap-RNA切断（Cap snatching）3. プライマー依存的転写開始反応4. 伸長5. U trackによるPoly(A)付加
転写中のRNPの構造?
ウイルスゲノムの転写
1. Pre-mRNAのCapに結合2. Cap-RNA切断（Cap snatching）3. プライマー依存的転写開始反応4. 伸長5. U trackによるPoly(A)付加
疑問点
3’
3’
RNP構造変化モデル?
AAA
3’
3’
5’
5’
ポリメラーゼ移動モデル?
[目的]
[方法]
in vitro 転写系を用いて、転写中RNPの顕微鏡解析
転写中のRNPの構造を明らかにする構造変化の有無?どのような構造変化?
謝辞
[京都大学ウイルス研究所]
中野雅博
神道慶子
村本裕紀子
[沖縄科学技術大学院大学]
Matthias Wolf
杉田征彦
[金沢大学バイオAFM先端研究センター]
古寺哲幸
[東京大学医科学研究所]
河岡義裕