シラノール基は塩基性化合物のテー リングの原因...
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日本薬学会日本薬学会129129年会年会 11
㈱ クロマニック テクノロジーズ
長 江 徳 和
シラノール基シラノール基は塩基性化合物のテーは塩基性化合物のテーリングの原因リングの原因 –– いや違う!いや違う!
日本薬学会日本薬学会129129年会年会 22
【【緒言緒言】】
逆相型固定相中の残存シラノール基は,吸着や
ピークテーリング等の原因であるとされている
残存シラノール基に基づく主な相互作用は,吸着,
イオン交換,水素結合である
これらの二次効果相互作用を積極的に利用するこ
とで,極性化合物に対して特異的な保持を示す新
規な逆相固定相の創出が可能であると思われる
二次効果相互作用の制御方法として熱処理を行っ
たC18固定相を用いた塩基性化合物と金属配位性
化合物の分離を行った
日本薬学会日本薬学会129129年会年会 33
シラノールの形態とピリジンのピークシラノールの形態とピリジンのピーク
OSi
O
OH
OSiSi
O
SiO
OH
Si
OH
OSi
O
HH
C18カラムを用いた場合の
ピリジンのピーク形状
60% CH3OH/H2O
Column AColumn B
Column C
Isolated Silanol
Vicinal Silanol
Geminal Silanol
日本薬学会日本薬学会129129年会年会 44
疑問疑問
シラノール基は塩基性化合物のテーリングの原因か?
シリカゲルを用いた,逆相と同じ移動相で分離するヒリックモードでは,塩基性化合物はテーリングしない!
従って,シリカゲル表面に存在するシラノール基は塩基性化合物のテーリングの原因ではない
しかし,残存シラノール基を含むC18固定相では
塩基性化合物はテーリングする
なぜか?
日本薬学会日本薬学会129129年会年会 55
シリカゲルによるシリカゲルによるヒリックモードのヒリックモードの塩基性化合物の分離塩基性化合物の分離
Waters技術資料より
塩基性化合物は有機溶媒と緩衝液の移動相でテーリングすることなく溶出する
日本薬学会日本薬学会129129年会年会 66
シリカゲルのヒリックモードにおける保持機構シリカゲルのヒリックモードにおける保持機構
※日本ウォーターズ㈱資料を基に作成
Silica gel(HILIC)Gradient2.0mL/min
ODS silica(RP)Gradient1.4mL/min
1
2
2
O Si
O
OHO
Si
OH
O
Si
Si OH
O
SiO
O
Si
O
O
Si O
Si
O
Si
OSi
OSi
O
OH
O
OHO
Si
OH
O-
Si
O-
Si
O
O O-
OH
O-
OH
O
O
O OSi
Si
O
O
OSi
OH
OH
SiO OSi
O
O
O
Si
O
O
Si
O
Si
O
OO
O
SiO
O
SiO
O
OHO
O
O
O
Si
O
O
O
Si
OH
O
O O
Si
O
O
O
Si
O
O
O
O
O
Si
OO
OO
Si
SiO
O
Analyte
Analyte
Analyte
Mobile PhaseMobile Phase
ElectrostaticInteraction
HydrophilicPartitioning
H2O
H2O
H2O
H2O
H2O
H2O
H2O
H2O
H2O
H2O
H2O
H2O
H2O
H2O
H2O
H2O
H2O
1
Morphine3-β-D-Glucuronide
Morphine
日本薬学会日本薬学会129129年会年会 77
逆相での塩基性化合物のテーリングの原因は?逆相での塩基性化合物のテーリングの原因は?
疎水場の近くに存在するシラノール基は,疎水場の影響により
水和が妨害され,不完全な水和状態である
シラノール基が安定に水和している状態では塩基性化合物はテーリングしない
シリカゲルを用いるヒリックモードでは塩基性化合物良好
もし不完全な水和状態のシラノール基が存在すれば
イオン交換的吸着により塩基性化合物はテーリングする
日本薬学会日本薬学会129129年会年会 88
C18C18固定相の残存シラノール基の状態固定相の残存シラノール基の状態
高吸着性シラノール
O
Si
HO
Si
HO
SiO
O
SiSi
HO
HH
日本薬学会日本薬学会129129年会年会 99
塩基性化合物をテーリングさせなくする方法塩基性化合物をテーリングさせなくする方法
水和の不十分な,または水和していないシラノール基をなくす
シラノール基のシロキサン化
疎水場近くのシラノール基のみシロキサン化,疎水場から離れた水和しているシラノール基はそのまま
塩基性化合物はテーリングせず,イオン交換相互作用で,保持増加
TMS化などのエンドキャッピング
エンドキャップにより,さらに疎水場が増え,全てのシラノール基をエンドキャップすることになる
塩基性化合物はテーリングしないが,疎水性が増し,保持は減少する
一般的なエンドキャップ型C18 新規なノンエンドキャップ型C18
日本薬学会日本薬学会129129年会年会 1010
C18C18固定相の残存シラノール基の状態固定相の残存シラノール基の状態
高吸着性シラノール
O
Si
HO
Si
HO
SiO
O
SiSi
HO
HH
シロキサン結合に変換
O
Si
HO
SiO
O
SiSi Si
OHH
日本薬学会日本薬学会129129年会年会 1111
【【実験実験】】
基材シリカゲル細孔径:12 nm,比表面積:340 m2/g,粒子径:5 µm
オクタデシルトリクロロシランの導入炭素含量:14%比較対象として,TMS化固定相も調製
熱処理 (真空乾燥機中で熱処理,シロキサン化)処理温度:200 °C,処理時間:48時間
有機溶媒/緩衝液で水和出来る部位の再シラノール化
比較対照として,未熱処理固定相も調製
評価カラム:内径4.6 mm,長さ150 mm移動相:メタノールまたはアセトニトリル/水または緩衝液
日本薬学会日本薬学会129129年会年会 1212
ピリジンピリジンののピークピーク形状形状比較比較
移動相: CH3OH/H2O(30:70)流 速: 1.0 mL/min温 度: 40 ºC試 料: 1=ウラシル
②②==ピリジンピリジン
3=フェノール
a)
b)
c)
1
1
1
3
②②
3
3
0 5 10 15 20Retention time / min
②②
②②
熱処理C18Sunrise C18-SAC
未熱処理C18
TMS化C18Sunrise C18
OH
NNH
NH
O O
日本薬学会日本薬学会129129年会年会 1313
キサンチン類の分離キサンチン類の分離
カラムサイズ:4.6 x 150 mm移動相:メタノール/20mMリン酸二水素カリウム pH4.5 (30:70) 流 速:1.0 mL/min温 度:40 ºC
1=テオブロミン 2=テオフィリン
3= カフェイン 4=フェノール
N
N NH
NH
O
CH3
O
CH3
N
N N
NH
O
CH3
O
CH3
CH3 OH
N
NH N
NH
O
O
CH3
CH3
熱処理C18Sunrise C18-SAC
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11
Time (min)
1
1
2
2
3
3
4
4
TMS化C18Sunrise C18
日本薬学会日本薬学会129129年会年会 1414
三環系抗うつ剤の分離三環系抗うつ剤の分離
TMS化 C18 Sunrise C18
アセトニトリル/20mMリン酸緩衝液 pH6.0 (80:20)
熱処理C18 Sunrise C18-SAC
アセトニトリル/20mMリン酸緩衝液 pH6.0 (80:20)
1
23
4
5
1
23
4
5
0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65
保持時間(min)
NH
NH
O OO
OH
NH CH3
CH3
NHCH3
NCH3
CH3
1=ウラシル 2=プロプラノロール 3=ノルトリプチリン 4=アミトリプチリン 5=トルエンCH3
日本薬学会日本薬学会129129年会年会 1515
移動相移動相pHpHによる保持時間の制御による保持時間の制御
イオン交換相互作用の保持機構が働く成分は移動相pHにより保持を大きく変化させることが可能
アセトニトリル/20mMリン酸緩衝液pH3.0 (50:50)
アセトニトリル/20mMリン酸緩衝液pH4.5 (50:50)
1
1
2
2
3
3
4
5
5
カラム:TMS化C18, Sunrise C184.6 x 150 mm
熱処理C18, Sunrise C18-SAC4.6 x 150 mm
流速:1.0 mL/min温度:40 ºC試料:1=ウラシル,2=プロプラノロール,
3=ノルトリプチリン,4=アミトリプチリン,5=トルエン
アセトニトリル/20mMリン酸緩衝液pH6.0 (80:20)
1
2 34
5
0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65
保持時間(min)
4
日本薬学会日本薬学会129129年会年会 1616
酢酸アンモニウムを用いた塩基性化合物の酢酸アンモニウムを用いた塩基性化合物の分離:分離:pHpHの影響の影響
0 5 10 15 20 25 30 35 40保持時間(min)
カラム:熱処理C18,Sunrise C18-SAC 4.6 x 150 mm移動相:
アセトニトリル/100mM 酢酸アンモニウム (70:30)流速:1.0 mL/min温度:40 ºC試料:1=ウラシル,2=トルエン, 3=プロプラノロール,
4=ノルトリプチリン,5=アミトリプチリン
pH 6.8
pH 4.1
pH 5.0
pH 5.9
pH 3.5
pH 2.7
N=13,000
N=12,500
N=11,500
N=11,500
N=11,500
1
1
1
1
1
1
2
2
2
2
2
2
3
3
3
3
3
3 4
4
4
4
4
4
5
5
5
5
5
5
アンチカオトロピックイオンであるアンモニウムイオンが安定な水和層を形成
日本薬学会日本薬学会129129年会年会 1717
酢酸アンモニウムを用いた塩基性化合物の酢酸アンモニウムを用いた塩基性化合物の分離:塩濃度の影響分離:塩濃度の影響
カラム:熱処理C18, Sunrise C18-SAC 4.6 x 150 mm
移動相:
アセトニトリル/ 酢酸アンモニウム pH 4.1 (70:30)流速:1.0 mL/min温度:40 ºC試料:1=ウラシル,2=トルエン, 3=プロプラノロール,
4=ノルトリプチリン,5=アミトリプチリン
25 mM
100 mM
50 mM
200 mM
15
5
5
5
4
4
4
4
3
3
3
3
2
2
2
2
1
1
1
N=13,500
N=12,000
N=12,500
N=13,000
0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 26保持時間(min)
10 mM 543
21
N=12,000
25 mM
100 mM
50 mM
200 mM
15
5
5
5
4
4
4
4
3
3
3
3
2
2
2
2
1
1
1
N=13,500
N=12,000
N=12,500
N=13,000
0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 26保持時間(min)
10 mM 543
21
N=12,000
日本薬学会日本薬学会129129年会年会 1818
緩衝液濃度と保持指数との関係緩衝液濃度と保持指数との関係
0.0
0.2
0.4
0.6
0.8
1.0
1.2
1.4
0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0log [buffer concentration]
log
k
0
2,000
4,000
6,000
8,000
10,000
12,000
14,000
N [a
mitr
ipty
line]
Toluene Propranolol Nortriptyline Amitriptyline N (ami)
log log[ ] log[ ] log logkzz
Azz
AVV z
KB
A
B
A
r
m AAB= − + + +
1
AA::溶離剤イオン,溶離剤イオン,BB:測定:測定イオン,イオン, kk::BBの保持指数,の保持指数,KK::選択係数選択係数ZZAA, , ZZBB:各:各イオンの電荷イオンの電荷,,VVrr, , VVmm:カラム内の樹脂体積と移動相体積:カラム内の樹脂体積と移動相体積
日本薬学会日本薬学会129129年会年会 1919
緩衝液の塩の保持時間への影響緩衝液の塩の保持時間への影響
リン酸
ナトリウム
クエン酸
ナトリウム
酢酸
ナトリウム
ギ酸
ナトリウム
リン酸
アンモニウム
クエン酸
アンモニウム
酢酸
アンモニウム
ギ酸
アンモニウム
トリス
0
5
10
15
20
25
プロカインアミド
N-アセチルプロカインアミド
保持時間
(分)
カラム:熱処理C18, Sunrise C18-SAC 4.6 x 150 mm
移動相:メタノール/20mM 緩衝液 pH 6.8 (50:50)流速:1.0 mL/min温度:40 ºC試料:1=プロカインアミド
2=N-アセチルプロカインアミド
日本薬学会日本薬学会129129年会年会 2020
リン酸
ナトリウム
クエン酸
ナトリウム
酢酸
ナトリウム
ギ酸
ナトリウム
リン酸
アンモニウム
クエン酸
アンモニウム
酢酸アンモニウム
ギ酸
アンモニウム
トリス
1
1.2
1.4
1.6
1.8
2
2.2
2.4
プロカインアミド
N-アセチルプロカインアミド
緩衝液の塩のピーク対称性への影響緩衝液の塩のピーク対称性への影響対称性
(テーリングファクター)
カラム:熱処理C18, Sunrise C18-SAC 4.6 x 150 mm
移動相:メタノール/20mM 緩衝液 pH 6.8 (50:50)流速:1.0 mL/min温度:40 ºC試料:1=プロカインアミド
2=N-アセチルプロカインアミド
日本薬学会日本薬学会129129年会年会 2121
金属配位性化合物の分離金属配位性化合物の分離
カラム:他社高純度ODS 5μm, 4.6x150 mm熱処理C18, Sunrise C18-SAC4.6x150 mm
移動相:A)アセトニトリル/20mM リン酸 (10:90)B)アセトニトリル/50mM ギ酸 (10:90)C)アセトニトリル/50mM 酢酸 (10:90)
流速:1.0 mL/min温度:40 ºC試料:1=8-キノリノール,2=カフェイン
0 2 4 6 8 10 12 14 16保持時間(min)
0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22保持時間(min)
1 2
1
1
1
1
1
2
2
2
2
2
A: 20mM リン酸
C: 50mM 酢酸
B: 50mM ギ酸
他社高純度ODS 熱処理C18Sunrise C18-SAC
日本薬学会日本薬学会129129年会年会 2222
核酸塩基類の分離例核酸塩基類の分離例
カラム:熱処理C18, Sunrise C18-SAC, 5 µm4.6 x 150 mm
移動相: 20 mM KH2PO4 pH4.5流 速: 1.0 mL/min温 度: 25 ºC試 料: 1=シトシン
2=ウラシル
3=シチジン
4=チミン
*=不純物
12
4
3
Retention time / min0 5 10 15
*
N
NH
O NH2
NH
NH
O O
N
N
O NH2
O
H
OH
OH
H
CH3
HOH
NH
NH
O O
CH3
日本薬学会日本薬学会129129年会年会 2323
【【まとめまとめ】】
C18固定相中にシラノール基を高度に残存させることにより,極性化合物,特に塩基性化合物の保持を増加させることが可能であった
熱処理により調節されたシラノール基は塩基性化合物をテーリングさせなかった
さらに,シラノール基によるイオン効果相互作用が認められ,塩基性化合物の保持を移動相のpHや塩濃度により調整可能であった
金属配位性化合物の分離に有効であり,詳細は未解明であるが,シラノール基の水和状態や特性の変化が金属不純物の影響の抑制に寄与していると推定された