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アミノアシル化ヌクレオチド類の効率合成
(高知大総研セ1 ・ 高知大理2 ・ 高知大医3)
○片岡 正典1、 福井 千春1、 本家 孝一3、 小槻 日吉三2
IMT.KOCHI
安価な原料(ヌクレオシド) 1kgあたり2000円程度
革新的な製造技術
簡易短工程で価値を10万-5000万倍に!
高価な化学物質(ヌクレオチド類)
!
ヌクレオチド合成の重要性IMT.KOCHI
・ユニバーサル核酸 ・短鎖RNA ・アミノアシルtRNA ・ヌクレオシド環状二量体 ・糖ヌクレオチド ・全塩基核酸塩基標識法 ・含ヌクレオチド天然有機化合物 ・人工核酸 ・ncRNA
無細胞タンパク質合成の概略IMT.KOCHI
Patrick O'Donoghue, Jiqiang Ling, Yane-Shih Wang & Dieter Söll* Nature Chemical Biology 9, 594‒598 (2013) doi:10.1038/nchembio.1339 Published online 17 September 2013
ヌクレオシド(原料)
ジヌクレオチドpdCpA
アミノアシルpdCpA アミノアシルtRNA
CHEMICAL PROCESS
二量体合成 アミノアシル化 ライゲーションO
CytO
OPO–O O
OAde
HO OH
P–OO–O
OCytO
OPO–O O
OAde
O O
P–OO–O
HO
RNH2
HOO
Ade
HO OH
OCytO
OPO–O O
OAde
O O
P–OOO
HO
RNH2
tRNA
無細胞タンパク質合成に用いるヌクレオチド類の例IMT.KOCHI
共通前駆体pdCpA N型糖タンパク質合成基質 GlcNAc-Asn-pdCpA
標識導入基質 4-NH2-Phe-pdCpA
O HNHO
NHAcO
OH
NH2
O
TBA+ –OO– TBA+O
OCytO
OPOTBA+ –O O
OAde
O O
P
HHO
OCytO
OPOTBA+ –O O
OAde
O O
PTBA+ –OO– TBA+O
HONH2
H2N
OCytO
OPOTBA+ –O O
OAde
HO OH
PTBA+ –OO– TBA+O
全ての保護基の除去と TBA化を一挙におこなう
各工程の最適化によって競合技術よりも効率が高く、操作も簡素化されている
共通前駆体pdCpAの合成IMT.KOCHI
NCCH2CH2OOCH2CH2CNO
OAdeBzHO
HO OH
OAdeBzTBDMSO
TBDMSO OTBDMS
2.2 M CF3COOH
1.5 M [(CH3)3SiO]2
OCytBzHO
OPONCCH2CH2O O
OAdeBz
TBDMSO OTBDMS
OCytBzO
OPONCCH2CH2O O
OAdeBz
TBDMSO OTBDMS
P
OCytO
OPOTBA+ –O O
OAde
HO OH
PTBA+ –OO– TBA+O
1.2 M t-C4H9(CH3)2SiCl1.8 M imidazole
0.20 M
OAdeBzHO
TBDMSO OTBDMSdichloromethane, 25°C, 2 h
0.36 M dC-phosphramidite0.45 M benzimidazolium triflateMS 4A
0.030 M
0.30 M
0.29 M CCl3COOH
dichloromethane, 25°C, 2 h
0.45 M (NCCH2CH2O)2PN(i-C3H7)20.60 M benzimidazolium triflateMS 4A
0.30 M
1.5 M [(CH3)3SiO]2
10% TBAOH
0.030 M
DMF, 25°C, 2days>99%
water—THF (1 : 4)25°C, 5 - 6 h83 %yield
dichloromethane25°C, 1 h
dichloromethane25°C, 10 min68 %yield (3 steps)
dichloromethane25°C, 1 h65 %yield (2 steps)
water—methanol—dioxane (9 : 7 : 1)0.80 GPa, 25°C, 14 h~100 %yield
1
短工程製造技術 効率的縮合反応+超高圧脱保護
競合技術1 Koster法
競合技術2 改良Koster法
製造工程 8 13 12
精製回数 5 8 9
収率 30% <10% <10%
純度 >99・5% ~90% ~90%
高知法のアドバンテージ 製造工程が競合技術に比べて短く(競合技術の12−13工程に対してシーズ技術は9工程)、中間体の精製操作は5回で、競合技術の8−9回を凌ぐことから、合成コストの面からも価格競争力が高い。危険な薬品や大規模な設備を必要としないことから、小規模製造場所でグラムスケールの生産が十分に可能である。 競合技術によって生産されたものはすでに流通しているが、製品品質は低く、技術面でも大きなアドバンテージを有する。
出願番号:特願 2014-48194
pdCpA製造技術比較IMT.KOCHI
従来のアミノアシル化反応IMT.KOCHI
OCytO
OPO–O O
OAde
HO OH
P–OOHO
amino acid (large excess)
OCytO
OPO–O O
OAde
O O
P–OOHO
HO
H2NR
mixture of regio isomers
stoichiometric
pdCpA + aminoacyl pdCpAH2N COOCH2CN
R
1 equiv 5 equiv 20-30%
ジヌクレオチドpdCpA アミノアシル化pdCpA
TYPICAL CONDITION
検討に用いる縮合剤と添加剤IMT.KOCHI
ADDITIVE
CONDENSING AGENT (ACTIVATOR)
NN
NMeO
MeO
N+ O
Me
Cl-NCN
N
N
O
N N
PF6
O CNO
N O
N NO
PF6 NNN
O PN
NN
PF6
N N N N
O
DMT-MM DIC HBTU COMU PyBOP CDI
NN
N
OHN N
NN
OHO CNO
N OH
MeN O
HOBt HOAt Oxyma NMM
アミノアシル化条件の探索-1IMT.KOCHI
entry coupling reagent (equiv) additive (equiv)
1 DMT-MM (1) HOBt (2)2 DMT-MM (5) HOBt (2)3 DMT-MM (10) HOBt (10)45 HBTU (5) HOBt (10)6 PyBOP (1) HOBt (2)
HBTU (1) HOBt (1)
yield, %a
458425
1120
57
a) Determined by HPLC.
7 COMU (1) Oxyma (2) 13
アミノアシル化条件の探索-2IMT.KOCHI
entry additive (equiv)
1 DMT-MM (5) HOBt (2)2 DMT-MM (5) HOAt (2)3 DMT-MM (5)4 DMT-MM (5) NMM (2)
8435
—b
24Oxyma (2)
coupling reagent (equiv) yield, %a
a) Determined by HPLC. b) Side reactions were observed.
アミノアシル体の合成IMT.KOCHI
entry N-Boc-amino acid isolation yield, %
1 N-Boc-Phe 502 N-Boc-4-NH2-Phe 223 N-Boc-Asn 19
OCytO
OPO–O O
OAde
HO OH
P–OOHO
50 mM N-Boc-amino acid250 mM DMT-MM100 mM HOBT
DMF25 °C, 5 h
OCytO
OPO–O O
OAde
O O
P–OOHO
HO
H2NR50 mM
変換率は90%以上精製は改善可能
N型糖タンパク質合成用基質 GlcNAc-Asn-pdCpAIMT.KOCHI
GlcNAc-Asn-pdCpA
pdCpA + GlcNAc-Asn-pdCpA
1 equiv 5 equiv
O HNBnO
BnO
NHAcO
OBn
COOCH2CN
NHBoc×
A TRYAL BY THE TYPICAL PROCEDURE
O HNHO
NHAcO
OH
NH2
O
TBA+ –OO– TBA+O
OCytO
OPOTBA+ –O O
OAde
O O
P
HHO
GlcNAc-Asn-pdCpA の合成IMT.KOCHI
出願番号:PCT/JP2014/58711
849.0 1040.6 1232.2 1423.8 1615.4 1807.0Mass (m/z )
1.3E+4
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
% In
tens
ity
TOF/TOF™ Reflector Spec #1 MC[BP = 954.6, 12614]
954.5668
916.9097
1119.6761
1360.9719
1077.9105
1189.9360
952.5826
996.9929
1018.9600
1286.5602
1141.6709
1574.9703
906.2728
851.5216
1521.9758
1238.2418
1402.9971
1324.4833
1372.1987
924.6241
1344.9043
1115.5927
1596.9779
881.3270
1447.0170
950.9760
1170.9023
1093.8907
1490.0444
975.7003
1619.1130
1047.5995
1642.2249
1211.9203
1466.0511
1266.2983
1075.9469
1788.9845
1676.9469
1553.9482
Chemical Formula: C31H45N11O20P2 Exact Mass: 953.23 Molecular Weight: 953.70 m/z: 953.23 (100.0%), 954.24 (34.8%), 955.24 (10.0%), 954.23 (4.1%), 956.24 (2.3%), 955.23 (1.5%) Elemental Analysis: C, 39.04; H, 4.76; N, 16.16; O, 33.55; P, 6.50
MA
LDI-T
OF
MA
SS S
PEC
TRU
M
Bn基とBoc基 の除去
M+1 954.5868
methanol, 25 °C
1 mol% Pd/silica1 atm H2
O HNBnO
NHAcO
OBn
NHBocO
TBA+ –OO– TBA+O
OCytO
OPOTBA+ –O O
OAde
O O
P
O HNBnO
BnO
NHAcO
OBn
COOH
NHBoc
50 mM
250 mM DMT-MM100 mM HOBT
DMF, 25 °C2 h, 34%
50 mM
+
H
22 h, 93%
O HNHO
NHAcO
OH
NH2
O
TBA+ –OO– TBA+O
OCytO
OPOTBA+ –O O
OAde
O O
P
HBnO HO
TBA+ –OO– TBA+O
OCytO
OPOTBA+ –O O
OAde
HO OH
P
まとめIMT.KOCHI
・DMT-MM/HOBtを用いるアミノアシル化反応を開発
・アミノ酸の使用量を化学量論量まで削減
・高い変換効率
・従来法で合成できないGlcNAc-Asn-pdCpAの合成に成功
・精製操作の最適化を残す
OCytO
OPO–O O
OAde
HO OH
P–OOHO
50 mM N-Boc-amino acid250 mM DMT-MM100 mM HOBT
DMF25 °C, 5 h
OCytO
OPO–O O
OAde
O O
P–OOHO
HO
H2NR50 mM
本技術に関する知的財産
発明の名称:N-グリコシル酸アミドアミノ酸-核酸誘導体およびその製造方法出願番号:PCT/JP2014/58711 出願人:国立大学法人高知大学 発明者:片岡正典、本家孝一、小槻日吉三、福井千春
発明の名称:アミノアシルヌクレオチド化合物の製造方法出願番号: 特願2014-48194 出願人:国立大学法人高知大学 発明者:片岡正典、本家孝一、小槻日吉三、福井千春