ウカセセヺマ内に存在するrna （（（（rna …...ultracentrifugation vs. total exosome...

1Proprietary & ConfidentialThe world leader in serving scienceProprietary & Confidential

エキソソーム内に存在するエキソソーム内に存在するエキソソーム内に存在するエキソソーム内に存在するRNA（（（（RNA ”Cargo” ）研究ワークフローの提案）研究ワークフローの提案）研究ワークフローの提案）研究ワークフローの提案

テクニカルサポート部

木坂真由美

2Proprietary & Confidential

エクソソームとは？？

from: The Scientist, July 2011

• エクソソームは核酸やタンパク質を内包する小型膜小胞（直径30～150nm程度）

• すべての細胞で分泌される

• さまざまな体液内に存在

血液・唾・尿・乳汁・細胞培養上

• さまざまな機能

• 細胞間コミュニケーション

• 細胞内のお掃除：不要な細胞内成分

を外に放出する為の機構


エクソソームに内包される代表的な物質

100nm

エクソソームの膜に

存在する物質

• テトラスパニン類

（CD9, CD63, CD81など）

• 抗原提示関連タンパク質

（MHC I, MHC IIなど）

• 接着分子

（インテグリン, ICAM-1など）

• サイトカイン/ サイトカイン受容体

（EGFRv III, TGF-βなど）

エクソソーム内物質

• 核酸

miRNA(100種以上）

mRNA (1300種以上）

• タンパク質（100～300種）

- 熱ショックタンパク質

（HSP70, HSP90など）

- 骨格タンパク質

（アクチン・チューブリンなど）

脂質の特徴

セラミド、コレステロール、ホスフォチジルセリンなど細胞膜の構成と異なる

4Proprietary & Confidentialfrom: Montecalvo et al. (2012) BLOOD, vol. 119, pp. 756-766

Exosomeの生物学的機能の生物学的機能の生物学的機能の生物学的機能

• exosome中のcargo(取り込まれている内容物）が、多くの機能や役割を担っていることが示唆されている：

• 高分子メッセージ(macromolecular message ：RNA & protein)-細胞間のコミュニケーションおよびシグナリングを可能に

• 免疫反応の促進、抗原提示（antigen presentation）、プログラム細胞死、血管形成、炎症、凝固

• 癌細胞から分泌され、がん遺伝子を伝播

• 発生・分化の過程の極性の形成におけるMorphogen transporters（形態形成因子の輸送体

• 細胞間のプリオン・ウイルスなどの病原体の伝播


なぜエクソソームが注目されるのか?

癌診断Drug Delivery血液脳関門を経る

細胞間

コミュニケーション

出産前診断

その他アレルギー疾患、リューマチ、結核, 筋ジストロフィーの研究分野にも

神経疾患

老化

がんの転移・悪性化

免疫制御・免疫疾患

循環器疾患

血液疾患

消化器疾患

感染症（HIV, AIDS)


エクソソームに関する論文の年次変化

0

50

100

150

200

250

300

PubMed検索で “Exosome”をkeywordで検索した結果


Exosome研究の分野はまだスタートしたばかり：研究の分野はまだスタートしたばかり：研究の分野はまだスタートしたばかり：研究の分野はまだスタートしたばかり：

現在わずかな専門化されたツールしか存在していない現在わずかな専門化されたツールしか存在していない現在わずかな専門化されたツールしか存在していない現在わずかな専門化されたツールしか存在していない

• 研究者は細胞生物学の分野で開発されたホームメ研究者は細胞生物学の分野で開発されたホームメ研究者は細胞生物学の分野で開発されたホームメ研究者は細胞生物学の分野で開発されたホームメ

イド試薬やツールを使用するしかなく、イド試薬やツールを使用するしかなく、イド試薬やツールを使用するしかなく、イド試薬やツールを使用するしかなく、

exosome研究用に自ら最適化を行っている研究用に自ら最適化を行っている研究用に自ら最適化を行っている研究用に自ら最適化を行っている

• 標準化が不十分：標準化が不十分：標準化が不十分：標準化が不十分：

データの比較や再現性が困難データの比較や再現性が困難データの比較や再現性が困難データの比較や再現性が困難

標準化された標準化された標準化された標準化されたProtocol および解析法および解析法および解析法および解析法

�exosomeの抽の抽の抽の抽出方法出方法出方法出方法

�定量およびサイズ測定法定量およびサイズ測定法定量およびサイズ測定法定量およびサイズ測定法

� cargo(取り込まれている内容物）の解析方法取り込まれている内容物）の解析方法取り込まれている内容物）の解析方法取り込まれている内容物）の解析方法

� in vivo でトレースするための標識法でトレースするための標識法でトレースするための標識法でトレースするための標識法

Exosome研究者に緊急でもとめられているもの研究者に緊急でもとめられているもの研究者に緊急でもとめられているもの研究者に緊急でもとめられているもの

8Proprietary & ConfidentialThe world leader in serving scienceProprietary & Confidential

The Complete Exosome Workflow Solution: From Isolation to Characterization of RNA Cargo


Exosome workflow


Exosome isolation & Exosome check


超遠心法：

現行ではexosome抽出法の “Gold Standard”

• 立証済のプロトコール

• クリーンアップされたexosomeを回収

• さまざまなタイプのサンプルに対応可能

• 以後の解析に対応可能

But…

• 多くの場合、大量のスタートサンプル量が必要

• スケールの変更ができない

• 収量が低い

• exosome pelletや分画を失いやすい

• 多くの時間とコストが必要• 大きな労力が必要�サンプルやプロトコールにもよるが通

常は1-2 日間必要

• 広範囲におよぶトレーニングが必要


Exosome Isolation Reagentさまざまな体液サンプルに対応

最高の回収効率：最高の回収効率：最高の回収効率：最高の回収効率：さまざまなタイプのアプリケーションに対応可能なインタクトなexosomeを回収

•簡便性：簡便性：簡便性：簡便性：シンプルで信頼性の高いprotocolでexosomeを抽出

•時間短縮：時間短縮：時間短縮：時間短縮：超遠心のステップを外すことで時間を短縮

•最高のフレキシビリティ最高のフレキシビリティ最高のフレキシビリティ最高のフレキシビリティ–スタートサンプル量に応じて、スケールアップおよびスケールダウンが可能

Cell Culture Media Reagent

P/N 4478359

Blood Serum Reagent

P/N 4478359

Blood Plasma Reagent

P/N 4484450

Urine ReagentP/N 4484452

Reagent for Other Body Fluids

P/N 4484453


1. Exosomeの遠心回収のための前処理の遠心回収のための前処理の遠心回収のための前処理の遠心回収のための前処理

�Centrifuge the sample to remove cells and debris

�Optional Proteinase treatment (e.g. plasma)

2. Exosomeの回収処理の回収処理の回収処理の回収処理

�Transfer the clarified sample to a new tube

�Add Total Exosome Isolation reagent and Mix

�Incubate the sample

�Centrifuge the sample at 10,000 × g

�Discard the supernatant

�Re-suspend the exosome pellet in 1X PBS

�Exosome storage

• 2°C to 8°C for up to 1 week

• ≤-20°C for long-term storage

Total Exosome Isolation Reagent Basic Protocol

• 実際の実際の実際の実際のHans-on-time はははは <60mi• Exosome回収に必要なトータル時間は回収に必要なトータル時間は回収に必要なトータル時間は回収に必要なトータル時間は <4h

エクソソームの保存条件

凍結融解は1回


• Similar size distribution of exosomes for all samples• Nanoparticles are all smaller than 300 nm, majority 50-150 nm in size.

UltracentrifugationReagent

NanoSight® Analysis Comparison: Ultracentrifugation vs. Total Exosome Isolation Reagents for Serum and CM

HeLa Cell Culture Media

Human Blood Serum



NanoSight® Analysis Comparison: Ultracentrifugation vs. Total Exosome Isolation Reagents for Serum and CM


Human Blood Serum




Reagent Ultracentrifugation


( from 1mL)

4～8 x 109 2～4 x 109

Human Blood Serum

( from 100µL)

1.5～3 x 1011 1.5～5 x 1010

Reagentでは上記のエキソソーム収量に対して、培地上清では 100µL～50mL血清では 50µL～5mLのサンプル量でエクソソーム回収量は、スタートサンプル量に応じた直線性を示すことを確認

Yield of the exosomes ：Ultracentrifugation vs. Total Exosome Isolation Reagents for Serum and CM


Western blot analysis :exosomalmarker proteins CD63 and CD9 in HeLa cell culture media


Human Blood Serum


• Enriched exosomes by new reagent vs. ultracentrifugation

• RNA was isolated with Total Exosome RNA and Protein Isolation kit (P/N 4478545)

RNA Analysis for Serum and CM:qRT-PCR for mRNA and miRNA Targets (Taqman®)

Hela Cell Culture Media

Human Blood Serum

Reagent isolation shows improved results compared t o ultracentrifugation


Characterization of exosome RNA content using the Ion Torrent Personal Genome Machine


実験モデル

exosomes vs. parental HeLa cells

培養上清からエク

ソソームを回収

細胞ペレット

から

RNA精製エクソソーム

ペレットから

RNA精製Total Exosome RNA & Protein Isolation Kit

エクソソームRNAおよび細胞内のtotal RNAを網羅的に解析＆比較

exosomes vs. parental serum samples

健常2検体

血清を採取

血清からエクソソ

ームを回収

血清全体

から

RNA精製エクソソーム

ペレットから

RNA精製Total Exosome RNA & Protein Isolation Kit

エクソソームRNAおよび血清のtotal RNAを網羅的に解析＆比較


Total Exosome RNA & Protein Isolation Kit

Total RNA Isolation

オプション：Small RNA (<200nt)分画

Cat# 4478545


エキソソーム由来RNAの特徴と収量

�含有するRNA：mRNA, rRNA, ncRNA, microRNAなどすべてのRNA

�回収されるRNAのサイズ： 20～300nt

�予想収量

～8 ng / 30mL HeLa CM (超遠心法：～4ng/ 30ｍL-CM）～2ng / 4mL serum (超遠心法：～1pg/ 4mL serum)

� Assayに必要なRNA量( for realtime PCR)RNA from 30uL-culture media/ reactionRNA form 3uL- serum / reaction注： qRT-PCRの1チューブあたりに必要なRNA量をスタートサンプル等で換算した

( for 次世代シーケンサー：PGM)RNA from 10～50mL-culture media/ reactionRNA form 1～5mL- serum / reaction注：上記スタート量でPGM解析に十分な量のRNAが回収できる。回収後は濃度調整をし、適切な濃度に設定する


• 5 microRNAs (miR16, miR24, miR26a, miR451, and let7e) の発現レベルをTaqMan miRNA assays を用いて定量した

• 5 microRNAsはエクソソームに中に存在することが報告されている

RNA Analysis for Serum and CM:qRT-PCR for 5 miRNAs (miR16, miR24, miR26a, miR451, and let7e) Targets (Taqman®)

Hela Cell Culture Media

Human Blood Serum


イオントレントデータ解析概要

Ion 318™ Chipを使用 500～600万 read/ sample 90～98％が既存のtranscriptにマッピングできた


RNA sequencing result :exosomes vs. parental HeLa cells

Zooming into 0–10% range


RNA representation :exosomes vs. parental HeLa cells:

top 10 RNA transcripts organized by RNA type

miRNA Cell vs. Exosome

tRNA Cell vs. Exosome

mRNA Cell vs. Exosome

ncRNA Cell vs. Exosome


Differential representation of specific RNA:exosomes vs. parental HeLa cells

miRNA

ncRNAtRNA

mRNA


RNA sequencing result :exosomes vs. parental serum


RNA representation :exosomes vs. parental serum:

top 10 RNA transcripts organized by RNA type

miRNA Serum vs. Exosome

tRNA Serum vs. Exosome

mRNA Serum vs. Exosome

ncRNA Serum vs. Exosome


Differential representation of specific miRNAs:exosomes vs. parental serum samples


Conclusions

• エクソソームは細胞間コミュニケーションや疾患など多くの生物学的機能を有しており、今後多くの研究が展開されるポテンシャルがある。

• 現在で報告されている論文では、標準化されたプロトコールがないため、研究者によって、矛盾した結果が報告されているケースがある。

• 今回、我々はエクソソームRNA研究の完全なワークフローを確立し、エクソソーム研究を行う研究者の皆様の今後の研究に利用頂けるよう提案を行った。


www.lifetechnologies.com/exosomes

ウカセセヺマ内に存在するrna （（（（rna …...ultracentrifugation vs. total exosome...

Documents