ヒトt 細胞白血病ウイルス1型の生体内維持機構と...

ヒトT 細胞白血病ウイルス1型の生体内維持機構と発がんにおける役割

安永純一朗京都大学ウイルス・再生医科学研究所

無症候

悪性疾患

炎症性疾患

脊髄症

気管支炎

ぶどう膜炎

関節炎

成人T細胞白血病（ATL）

ヒトT細胞白血病ウイルス1型HTLV-1

> 90% of carriers

日和見感染症

ヒトT細胞白血病ウイルス1型（HTLV-1）感染者の分布

全世界で1000~2000万人？

Nat Med. 2018

日本は世界最大のHTLV-1蔓延国である

u約80万人の感染者が国内に存在する（約30年前は120万人と推定）。

u都市部で感染者が増えている。

u水平感染（男女間の感染）がおそらく年間4000例程起こっている。

u感染者の5%が生涯の内にATLを発症する。

u年間1000例以上のATL患者が報告されている。

u一旦発症すると、ほとんどの症例が治療抵抗性であり、強力な化学療法をもってしても、1年前後で死亡する。

ATL

ATL細胞

正常リンパ球

Ø HTLV-1感染細胞のモノクローナル増殖Ø CD4+CD25+CCR4+CADM1+T細胞Ø Foxp3を高頻度に発現し、Tregに類似した免疫形質を呈する

Provirus

Viral RNA

Env

Gag

Virion

Virological synapse

MTOC

HTLV-1はcell-to-cellでのみ感染する（母乳、精液、血液中の感染細胞）

Extracellular viral assemblies

Biofilm-like extracellular assemblies

Infected cells Target cells

このためHTLV-1は生体内で感染細胞を増加させている

Cell-to-cell��

��%ATL&

�� (��Tax CTL)

"#$!��

��(de novo infection)

��(clonal expansion)

HTLV-1の生体内動態

��

ORF I

ORF II

ORF II

ORF III

p12(I)

p13(II)

p30(II)

rex(III)

ORF IV tax(IV)

Spliced HBZ*

Unspliced HBZ*

HTLV-1 provirusgag pol env pX5’LTR 3’LTR Oncogenic

*HBZ: HTLV-1 bZIP factor

HTLV-1のがん遺伝子taxとHBZ

Wnt pathway

NFkB pathway

��

��

��

1. ��! "#��

2. ��

SAC function (MAD1)

Centrosome amplification (RANBP1, TAX1BP2)��

3. DNA ��DNA damage checkpoint (p53, CHK1, CHK2)

DNA repair (BER, NMR, MMR)

Telomerase (hTERT)

DNA ��

Tax

Tax

Tax

AP-1 pathway

TGF-b pathway

CREB pathway

Tax の多彩な機能

Taxトランスジェニックマウスは腫瘍及び炎症を発症する

Nerenberg M et al. Science, 1987.

Hasegawa H et al. Nat Med, 2006.

Iwakura Y et al. Science, 1991.

Grossman WJ et al. PNAS, 1995.

tax

GAPDH

HBZ

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

ATL 患者 HTLV-I 感染者

Proviral load was very low (less than 0.1 %)

Satou Y et al, PNAS, 2006

多くのATL 症例ではTaxの発現が著しく低い

RT-PCR

Taxは宿主免疫の主要な標的であることが知られている

Age (weeks)

Inci

denc

e (%

)

0

20

40

60

80

100

1 3 5 7 9 11 13 15 17 19

HBZ-Tg (n=10)non-Tg (n=10)

HBZ-Tg

non-Tg

Skin

Chronic inflammation T-cell lymphoma

LN LN

Lung Bone marrow

Months

Inci

denc

e (%

)

4 8 12 16 3220 24 28

non-Tg (n=27)HBZ-Tg (n=37)

0

10

20

30

40

50

P < 0.001

HBZ geneCD4

Enh Sil poly A Prom

HBZ-Tg mouse

Satou Y et al, PLoS Pathog, 2011

HBZトランスジェニックマウスも腫瘍及び炎症を発症する

IKKa IKKbIKKg/NEMO

IkBap65

p50

p65p50

TRAF6

TRAF2

RIP

IL-1RsTLRs TNFR

TRADD

TRAF3

LTbRCD40

NIK

p100

RelB

p52 RelB

p52

RelB

IRAK

ProteasomalDegradation

TAK1TAB

Nucleus

Cytopla

sm

IKKa IKKaIKKg/NEMOTax Tax

��NF-kB�� NF-kB��

Taxは古典的・非古典的NF-κB経路を活性化する

TaxsHBZ

--

++

usHBZ -

+-- - -

++- -

0

5

10

15

20

25

30

Fold

luci

fera

seac

tivty

**

**

*

++- -

HBZTTG- -

- - - - - -

Zhao et al. Blood, 2008

HBZ �RelA��v RelA�DNA��v RelA��

0

1

2

3

4

5

6

7

Fold

Luci

fera

se a

ctiv

ity

p52

sHBZ

-

-

++

-

+

��NF-kB ��NF-kB

HBZはTaxによる古典的NF-κB活性化を抑制する

TGF-b receptor

SARA

SMAD2/3

Tax

TGF-b

SMAD2/3

SMAD4

SMAD2/3

SMAD4

CBP/p300

HBZ

NucleusCytoplasm

TGF-bTax

sHBZ

+ + + +

- + - +

- - + +

0

2

4

6

8

10

12

3TP

-Lu

x F

old

Act

ivat

ion

Zhao et al. Blood, 2011

HBZとTaxはTGF-β/SMAD経路にて相反する作用を有する

v HBZ �SMAD2/3��

v p300��

WNT3a

GSK3APC

DVL

b-cat

AXIN

LEF/TCF Target

LRP5/6

b-cat

b-cat

Ca2+

Ror1/2

PKC

Rac RhoA

JNK

Cdc42

Ca2+ pathway Planar cell polarity pathway

Target

WNT5a

P

��Wnt�� Wnt��

古典的Wnt 経路と非古典的Wnt 経路

0

2

4

6

8

10

Fold

act

ivat

ion

0

100

200

300

400

Fold

act

ivatio

n

Dvl2 - + + + + +DAPLE - + + + + +Tax - + + + + +HBZ - -

TopFop

TopFop

WT b-cat - + + - -CA b-cat - - - + +HBZ - - + - +

GSK3APC

DVLAXIN

LEF/TCF Target

b-cat

b-cat

PTax

DAPLE

HBZ

HBZはTaxによる古典的Wnt経路の活性化を抑制する

Ma et al, Oncogene, 2012

CBP/p300LEF/TCF

IKKa IKKbIKKg/

NEMO

IkBap65

p50

p65p50

NIK

p100

RelB

p52 RelB

p52

RelB

IKKa IKKaIKKg/

NEMOTax Tax

Classical NF-kB pathway

Alternative NF-kBpathway

Cytoplasm

Nucleus

SARA

SMAD2/3

Tax

SMAD2/3

SMAD4

SMAD2/3

SMAD4HBZ

TaxとHBZの相反する機能

TGF-b / SMADsignaling

GSK3APC

DVLAXIN

LEF/TCF

b-cat

b-cat

P

DAPLE

Wnt/b-cateninpathway

Tax

HBZ

Cytoplasm

Nucleus

CREBCBP/p

300

Tax

CREBCBP/p

300

HBZ

CREB pathway

Nucleus

AP-1 signaling

PI3K

Tax

AktP

c-Jun / JunB

HBZ

Cytoplasm

Nucleus

JUN FOS

Cytoplasm

NucleusHBZ

Curr Opin Virol, 2013

まとめ（その1）Ø TaxとHBZは炎症と発がんに重要な役割を果たしている。

Ø TaxとHBZは同じシグナル伝達経路、宿主因子を標的とし、多くの場合相反する機能を有している。

Ø HTLV-1感染細胞ではこれらの発現、機能は厳密に制御されていることが示唆される。

tax

GAPDH

HBZ

1 2 3 4 5 6 7ATL patients


RT-PCR

TaxとHBZのATL細胞における発現

01234510

15

20

25

ATL patients

qRT-PCR

tax/GA

PDH

Tax (+)34%

5’LTR deletion 30%

Mutations12%

Methylation10%

Unknown14%

Tax (-)66%

tax

GAPDH

HBZ

1 2 3 4 5 6 7ATL patients


RT-PCR

TaxとHBZのATL細胞における発現

01234510

15

20

25

ATL patients

qRT-PCR

tax/GA

PDH

Tax (+)34%

5’LTR deletion 30%

Mutations12%

Methylation10%

Unknown14%

��ATL��Tax��

ATL細胞株 MT-1はごく一部の細胞がウイルス抗原を発現している

taxHBZ

Global Z score-2 -1 0 1 2

MT-1の一部がTaxを発現しているSingle-cell qRT-PCR

Tax

EGFP

102

103

105

104

0

102

103

105

104

0

102 103 1051040 102 103 1051040

0 % 0 %

99.5 % 0.5 %

0.1 % 0.3 %

99.5 % 0.1 %

Isotype control anti-Tax antibody

18x21 TREs

d2EGFP

MT-1

Stable transfectant

Tax protein

Mahgoub et al. PNAS, 2018

18x21 TREsd2EGFP

Tax

EGFP

102

103

105

104

0102

103

105

104

0

102 103 1051040 102 103 1051040

0 % 0 %

99.5 % 0.5 %

0.1 % 0.3 %

99.5 % 0.1 %


MT-1

Stable transfectant


MT-1の一部がTaxを発現している

8

(hrs)

16

24

8

16

24

18x21 TREsd2EGFP

Tax

EGFP

102

103

105

104

0102

103

105

104

0

102 103 1051040 102 103 1051040

0 % 0 %

99.5 % 0.5 %

0.1 % 0.3 %

99.5 % 0.1 %


MT-1

Stable transfectant

Transient(76%)

Fluctuating(6%)

Continuous(18%)

0

50

100

150

200200300400

Max

ium

umin

tens

ity

Taxの発現は一過性である


一部の細胞に発現するTaxは細胞集団全体の生存に必須である

3.6% 16.7%

Annexin-V

103

105

104

0

102 103 1051040

shNC shTax4

7-AA

D

Days

Dea

d ce

lls (%

)

MT-1

GFP competition assay

Tax knockdown

103

105

104

0

102 103 1051040

MT-1

0

20

40

60

60 3 9 12

80

15 18 21

shNCshTax1shTax4

shR

NA-

trans

duce

d ce

lls (%

)

Days

0

20

40

60

200 10 30 40

shNCshTax4

shRNA+GFP+

lentivirus

%GFP=~50%

MT-1 cells

Disadvantage Neutral AdvantageMahgoub et al. PNAS, 2018

5’LTR tax

5’LTR tax

Tax

5’LTR taxTax

5’LTROFF

5’LTRON

5’LTRON-Tax

tax mRNA

Tax protein

kon koff

km

kp

kbind

kunbind

kbind

kunbind

ka

ϕ

ϕ

dm

dp

Decay

Decay

Time (days)

Cum

ulat

ive d

istrib

utio

n of

Tax

-inte

rval

0

0.25

0.50

100 200 3000

1.00

0.75

Time (hours)

Dist

ribut

ion

of T

ax-p

erio

d

0

0.02

0.04

20 40 600

ExperimentSimulation

Tax発現の数理モデル化とコンピューターシミュレーション

九州大学数理生物学、岩見真吾先生との共同研究

5’LTR tax

5’LTR tax

Tax

5’LTR taxTax

5’LTROFF

5’LTRON

5’LTRON-Tax

tax mRNA

Tax protein

kon koff

km

kp

kbind

kunbind

kbind

kunbind

ka

ϕ

ϕ

dm

dp

Decay

Decay

Time (days)

Cum

ulat

ive d

istrib

utio

n of

Tax

-inte

rval

0

0.25

0.50

100 200 3000

1.00

0.75

Time (hours)

Dist

ribut

ion

of T

ax-p

erio

d

0

0.02

0.04

20 40 600

ExperimentSimulation

Tax発現の数理モデル化とコンピューターシミュレーション


90％の細胞がTax発現を経験するためには約150日もの日数が必要

↓ノックダウンの結果と合わない

[0 - 40]

[0 - 40]

[0 - 600]

[0 - 600]

10kb

TNFRSF9

40

40

600

600

(-)

(+)

(-)

(+)

MT1

KK1

d2EGFP

[0 - 220]

[0 - 220]

[0 - 2200]

[0 - 2200]

TRAF1

(-)

(+)

(-)

(+)

MT1

KK1

d2EGFP220

220

2200

2200

10kb

MT1 KK1

Up-regulated genes in Tax+ cells

Down-regulated genes in Tax+ cells

136 31 1000 134 19 705

MT1 KK1

Tax発現細胞と非発現細胞 (HBZ発現細胞)における網羅的発現解析

RNA-seq


HBZtaxTNFRSF9LSP1CCL22RGS1NR4A2GADD45BID2LY75BCL2L1STAT4TNFAIP3TRAF1CD82CFLARSTAT3PHF13NR4A1DUSP2CCND2NFKBIANFKB2MAP3K14STAT5ASTAT5BSMAD7CADM1

IL2RAACTB

CCR4

Bulk cells Sorted EGFP+ cellsGlobal Z score-2 -1 0 1 2

1510

50

1510

50

HBZ ID2TRAF1 CD82DUSP2 CCND2TNFAIP3

1510

50

1510

50

tax LSP1NR4A2PHF13 NR4A1TNFRSF9GADD45B

Expr

essi

on (l

og2)

tax (-) (+) (-) (+) (-) (+) (-) (+) (-) (+) (-) (+) (-) (+)

1510

50

CCL22RGS1 LY75STAT4 CFLARNFKBIA NFKB2

1510

50

BCL2L1 STAT3STAT5A SMAD7 CADM1ACTBMAP3K14

(-) (+) (-) (+) (-) (+) (-) (+) (-) (+) (-) (+) (-) (+)

Single-cell qPCR

Tax発現細胞では抗アポトーシス遺伝子の発現が上昇している

1510

50

CFLAR

NFKBIA

TNFAIP3

tax

TRAF1

CCND2

HBZ

NR4A1

TNFRSF9

GADD45B

Expr

essi

on (l

og2)

Apoptosis-related genes

Viral genes

-5

20

1510

50

-5

20

1510

50

-5

20

1510

50

-5

20

Bulk cells

Sorted EGFP+

cells

Expr

essi

on (l

og2)

-4-2

02

4

-6

-10-5

05

1015

-4-2

02

4

d2EGFP+ (Tax+)

d2EGFP- (Tax-)

DUSP1

Anti-apoptotic genes high

Anti-apoptotic genes med

Anti-apoptotic genes low

Tax非発現細胞はアポトーシス関連分子の発現が異なる2つの集団が存在する


0 5 1510 200

5

10

15

Ratio

of T

ax-o

n ce

lls (%

)

Time (days)

0 5 1510 200

30

40

10

20

50

% o

f cel

ls th

at a

re

shRN

A-tra

nsdu

ced

Time (days)

shNCshTax4Transition On to Off

(sampling from t-period)

Transition On to Off(sampling from t-period)

Transition Off to On(sampling from t-interval)Ton ToffAhigh ToffAlow Apoptosis

ApoptosisTon ToffAhigh ToffAlow

(sampling from t-interval)

gon

gon

g

g

g

g

p

p* δ

δ

Taxノックダウンによる細胞死誘導のシミュレーション



Tax+ (normal condition)

Tax-Anti-apoptoticProliferative

Cell population is maintained

Tax-Apoptotic

Tax+Anti-apoptotic

TonToff Ahigh

Toff Alow

Tax- (Tax knockdown)

Tax-Anti-apoptoticProliferative

Cell number is decreased

Tax-Apoptotic

Ton

Toff Ahigh

Toff Alow

ApoptosisApoptosis

TaxによるATL細胞集団の維持機構


Cel

l num

ber (

x105

)d2

EGFP

+(%

)

Time (days)1 3 5 7

8

4

0

10

5

0

Passage (-)Passage (+)

Passage (-)Passage (+)

0

5

10

15

20

25 24 hours48 hours

H2O2

d2EG

FP+

(%)

(uM)25 500 100

0

5

10

15

20

25 0 uM1 uM2 uM

Cisplatin

d2EG

FP+

(%)

Mock NAC

Overgrowth

Taxはストレスによって誘導される


Tax/HBZ statusAnti-apoptotic genes

Expr

essio

n le

vels

Time

HBZ

Tax

ApoptosisAnti-apoptotic

��

Cytotoxic stresses

まとめ（その2）

Proliferative

��(ATL)

��

HTLV-1感染から発がんまでの経過

�%&��

��

DNA�� !�" $�'#��

Tax HBZ

ATL患者

治療への展開：治療ワクチン開発の試み九州がんセンター、九州大学などの施設で医師主導治験「成人T細胞白血病/リンパ腫の治癒を目指したHTLV-1ウイルス標的樹状細胞ワクチン療法の確立: 薬事承認

を目的とした第II相医師主導治験」が行われている

採血単球分離

樹状細胞樹立

抗原で刺激

Tax ペプチド

活性化した樹状細胞患者に接種

�� 5��6320/533 (60%)

ワクチン開発に有用な霊長類モデルSTLV-1感染ニホンザル

STLV-1 '��"$ )/14-3

CD3

CD4

�'%!#240�

,3T ��+*3.1�5STLV-16(HTLV-1 &��'� ��+*3.

Miura et al. Retrovirology, 2013

TaxおよびHBZ (SBZ)搭載ワクシニアウイルス

��*�� *+)')-#+

�(-%$#( $#(#

�&�,'%"

�#'�$$&.-%(%( �� $#(#

;679354:8 ��'� ��

�)')&)$.,

+#!)' %(�-%)(

��;679354:8

�� $#(#

�(-%$#( $#(#

��Tax: M22/21S258A��HBZ: LL/AA��

Tax

a-tubulin

rVV-TaxNT M

ock

M22

S258

A<

< N.S.

HBZ

a-tubulin

NT Moc

kHBZ

LL/A

A��

RK13

��0��

(WB)

東京都医学総合研究所、小原道法先生との共同研究

Sugata et al. Blood, 2015

Post-vaccination (week)

rVV-sTax

��

(%)

0

10

20

30

0 10 20 30

rVV-SBZ

JM09

0 10 20 300

40

80

120

160CD4- PBMCs

CD8- PBMCsSBZ peptide

0

5

10

15

20

0 10 20 30Post-vaccination (week)

Nu

mb

er

of

clo

ne

s i

n 1

06

PB

MC

s

0

3000

2000

1000

5 clonesJM08

400

40

10000

8000

6000

4000

2000

00

Post-vaccination (weeks)

45 clonesJM09

Post-vaccination (weeks)

JM08

Vaccination

0 10 20 30

IFN

-gsp

ots

/ 105

cells

0

200

400

600

800CD4- PBMCs

CD8- PBMCssTax peptide

STLV-1感染ニホンザルへのSTLV-1抗原発現ワクシニアウイルスの接種

Sugata et al. Sci Rep, 2016

048121620

0246810

-50 0 5 10 15 20 25 -50 0 5 10 15 20 25

0 55 60 65 70 75 8053 0 55 60 65 70 75 8053

JM10 JM11STLV

-1 P

VL (%

)

�� (weeks)

CD

4+ ,s

Tax+

cells

(%)

0246810

-50 0 5 10 15 20 25

JM10JM11

Mogamulizumab�� (week)0 55 60 65 70 75 8053

JM10JM11

Mogamulizumab

0 1 2 3 53(week)

rVV sTax M22 + SBZ LL/AA

57 61 65 69

�� (weeks)

Mogamulizumab�� (week)

�� (weeks)

Mogamulizumab�� (week)

抗CCR4抗体投与後のTax+SBZワクチンにてTax発現細胞がさらに減少する

謝辞京都大学

ウイルス・再生医科学研究所ウイルス制御松岡雅雄

（熊本大学医学部血液膠原病感染症内科兼任）Guangyong Ma

Mohamed Mahgoub菅田謙治

ウイルス感染症モデル明里宏文

久留米大学医学部病理学

大島孝一

国立病院機構九州がんセンター血液内科・細胞治療科

末廣陽子

九州大学理学研究院数理生物学岩見真吾小泉吉輝

北海道大学先端生命科学研究院

数理生物学中岡慎治

東京都医学総合研究所感染制御プロジェクト

小原道法

ヒトt 細胞白血病ウイルス1型の 生体内維持機構と...

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