fibrosi cistica definitiva - unimi.it
TRANSCRIPT
�
Sperimenta il Biolab
Analisi molecolare di mala.e gene0che. Il caso della FIBROSI CISTICA
Università degli Studi di Milano
1. Conoscenze propedeu<che
1.1 Le mutazioni Nella specie umana esistono 23 coppie di cromosomi che contengono circa 21.000 geni. Le mala:e gene;che sono causate da mutazioni, cioè da alterazioni del corredo gene;co (genoma) di un individuo. Se le mutazioni avvengono nelle cellule che formano i game;, cioè nelle cellule germinali, allora possono essere trasmesse alla discendenza dove saranno presen; in ogni cellula dell’individuo affeFo. Queste mutazioni possono sorgere come mutazioni nuove nei game; di uno dei genitori oppure possono essere ereditate dai genitori. Viceversa le mutazioni che avvengono nelle cellule soma;che non sono trasmesse alle generazioni successive, ma determinano una differenza gene;ca tra le cellule dello stesso organismo (mosaicismo). La conseguenza può essere l’insorgenza e lo sviluppo di un cancro. Le mutazioni possono riguardare il numero dei cromosomi (mutazioni genomiche), la struFura dei cromosomi (mutazioni cromosomiche) o i singoli geni (mutazioni geniche).
1.1.2 Mutazioni geniche Le mutazioni geniche che insorgono all’interno di un gene possono alterare l’espressione e la funzionalità della proteina prodoFa o, se insorgono all’interno delle regioni di controllo di un gene,
possono invece influenzarne il livello di trascrizione. Le mutazioni si suddividono in (fig. 1): • sinonime: sos;tuzione di una base del DNA con
un altro codone codificante per lo stesso amminoacido
• missenso: sos;tuzione di una base del DNA che determina l’inserzione nella proteina di un diverso amminoacido
• non-‐senso: sos;tuzione di una base del DNA con un codone di stop che provoca la fine prematura della sintesi della proteina o un prodoFo proteico incompleto
• frameshiR: delezioni o inserzioni di un numero di bp non mul;plo di 3, che altera la leFura dei codoni
• mutazioni che alterano lo splicing (rimozione degli introni): interessa una sequenza nucleo;dica cruciale per il meccanismo di splicing di un trascriFo primario di RNA; come conseguenza si avrà il blocco o la modificazione dello schema di splicing di quel trascriFo, con la mancata produzione del mRNA corrispondente o la produzione di un mRNA modificato
• ripe;zioni di tripleFe
� 2
Fig. 1: ;pi diversi di mutazione. Le mutazioni pun;formi (faFa eccezione per le mutazioni sinonime) e le piccole delezioni causano quasi sempre la produzione di una proteina con funzionalità alterata.
Per descrivere una mutazione, si usa una nomenclatura par;colare che permeFe di capire se la mutazione è stata descriFa in termini di cambiamento nel DNA genomico (g.), nel cDNA (c.) o nella proteina codificata (p.); nel caso in cui la mutazione cada in un esone, si indica quale amminoacido è coinvolto, in quale posizione si trova e come sia stato modificato (se sia stato sos;tuito da un altro amminoacido, da un codone di stop o se sia stato deleto); nel caso in cui la mutazione sia in un introne si indica quale nucleo;de è stato modificato, la sua posizione (espressa rela;vamente all’ul;mo nucleo;de dell’esone che lo precede) e con quale nucleo;de sia stato sos;tuito.
1.2 Le leggi di Mendel e le malaBe monogeniche Le mala:e ereditarie monogeniche sono determinate da mutazioni in singoli geni che si trasmeFono nelle famiglie secondo leggi ben definite scoperte dall’abate Gregorio Mendel nella seconda metà dell’OFocento. Per questo mo;vo le mala:e monogeniche o monofaForiali vengono anche chiamate “mendeliane”. In par;colare bisogna ricordare che i geni possono avere alleli diversi (varian; alterna;ve di uno stesso gene) ossia essere polimorfici. Gli organismi diploidi hanno due copie di ogni gene, cioè due alleli: se i due alleli sono uguali, l’individuo è omozigote (ad esempio ha geno;po AA oppure aa); se i due alleli sono diversi, l’individuo è eterozigote (ad esempio il geno;po è Aa). L’allele dominante si manifesta allo stato eterozigote, quello recessivo è mascherato dall’allele dominante e si manifesta solo allo stato omozigote, mentre si parla di codominanza quando si hanno due alleli dis;nguibili entrambi espressi allo stato eterozigote, che agiscono sul feno;po in modo indipendente. La I legge di Mendel o legge dell’uniformità della prima generazione ibrida afferma che l’incrocio tra individui della generazione parentale, ciascuno omozigote per due alleli diversi di uno stesso gene (ad esempio AA x aa) e che quindi differisce dall’altro genitore per una caraFeris;ca (ad esempio pelo nero o marrone), dà una progenie cos;tuita da individui tu: eterozigo;, iden;ci tra loro (ad esempio Aa). Durante la meiosi i due alleli di un gene segregano e si distribuiscono ciascuno in un gamete aploide (II legge di Mendel, legge della segregazione). Un individuo omozigote produce un solo ;po di gamete (A oppure a) rela;vamente a un dato locus (la posizione occupata da un gene in un cromosoma). Un individuo eterozigote produce due ;pi di game; (A e a) in ugual quan;tà, cioè in una percentuale del 50% ciascuno. Una buona rappresentazione grafica della segregazione si o:ene costruendo il “quadrato di PunneF”. Alleli appartenen; a geni diversi localizza; su cromosomi diversi segregano in modo indipendente (III legge di Mendel, legge della segregazione indipendente). L’1% circa dei neona; è affeFo da una mala:a gene;ca monogenica. La mutazione genica è presente fin dal concepimento anche se non sempre si manifesta feno;picamente alla nascita. Alcune di queste mala:e comportano conseguenze già apprezzabili nel neonato. Altre mala:e monogeniche si manifestano, invece, durante le età successive della vita. La corea di Hun;ngton, ad esempio, è una mala:a gene;ca a insorgenza tardiva che si manifesta solo in età adulta. Si definisce mala:a autosomica quella in cui l’allele malato è presente nelle coppie di cromosomi non coinvol; nella determinazione del sesso, gli autosomi; si parla invece di mala:a legata all’X quella in cui l’allele si trova nel cromosoma sessuale X. In questo caso la trasmissione segue modalità par;colari in quanto la maggior parte dei geni rappresenta; sul cromosoma X non sono rappresenta; sul cromosoma Y. Il cromosoma Y, infa:, è molto più piccolo e con;ene quasi
� 3
esclusivamente i geni per la determinazione del sesso. Nelle mala:e autosomiche, se l’allele normale è dominante, la mala:a si rende manifesta solo nella condizione di omozigote recessivo, ossia negli individui in cui entrambi gli alleli del gene sono altera; (mala:a autosomica recessiva); se invece è l’allele alterato a prevalere su quello sano, la mala:a si rende sempre evidente, anche nella condizione di eterozigote, ossia è sufficiente che uno solo dei due alleli sia alterato perchè la mala:a si manifes; (mala:a autosomica dominante). Nelle mala:e legate all’X, se l’allele è recessivo, come nella maggior parte dei casi, i maschi ricevono l’X difeFoso dalla madre, ma non possono bilanciarlo con un allele sano nell’Y in quanto questo cromosoma non con;ene l’allele corrispondente; le femmine invece manifestano la mala:a solo nella condizione di omozigote. Di conseguenza la frequenza delle mala:e recessive legate al cromosoma X è maggiore nei maschi che nelle femmine. Nel caso di mala:e dominan; le femmine manifestano la mala:a anche nella condizione eterozigote.
1.2.2 Analisi dei pedigree Uno degli aspe: della gene;ca è lo studio dei meccanismi con cui i geni sono trasmessi dai genitori ai figli. A tale scopo i gene;s; effeFuano accoppiamen; tra organismi della stessa specie, per analizzare la trasmissione dei caraFeri. Nella gene;ca umana, gli accoppiamen; sperimentali ovviamente non sono possibili. Molte delle nostre conoscenze sull’ereditarietà dei caraFeri umani derivano perciò dalla analisi degli alberi genealogici o pedigree. In pra;ca, il pedigree è la rappresentazione sistema;ca della storia familiare aFraverso l’uso di simboli standardizza;. Il pedigree viene s;lato partendo da un’intervista ai componen; di una famiglia, al fine di ricostruirne la storia (anamnesi); in questo modo è possibile seguire la trasmissione di un dato caraFere aFraverso parecchie generazioni in una data famiglia. L’analisi del pedigree permeFe di determinare se il caraFere ha una modalità di trasmissione recessiva o dominante e se il gene in ques;one è localizzato su un autosoma o su un cromosoma sessuale; permeFe in ul;ma analisi di informare i membri di una famiglia sulla probabilità di trasmeFere queste mala:e ai propri figli. Nell’analisi del pedigree ci si basa sui principi dell’eredità di Mendel per escludere le modalità di trasmissione che sono incompa;bili con il pedigree. Ad esempio, la presenza nell’albero genealogico di femmine malate ci permeFe di escludere la trasmissione legata all’Y. Dall’analisi di un pedigree si può determinare (talvolta non in modo univoco, in quanto un pedigree può essere compa;bile con più di una modalità di trasmissione ereditaria) come viene trasmesso un dato caraFere. Analizziamo le caraFeris;che dei pedigree rela;vi a caraFeri con differen; modalità di trasmissione: • autosomici recessivi (AR): possono
essere affe: sia i maschi sia le femmine; in genere gli individui affe: hanno genitor i sani (portator i asintoma;ci). I genitori, entrambi portatori sani, hanno il 25% di probabilità di avere figli mala; ad ogni
� 4
gravidanza; l’incidenza della mala:a aumenta in caso di consanguineità. Tu: i figli di genitori entrambi affe: (omozigo;) sono a loro volta affe: (fig. 2).
• autosomici dominan< (AD): possono essere affe: sia i maschi sia le femmine; gli individui affe: possono essere presen; in tuFe le generazioni e hanno sempre un genitore affeFo. Poiché i geni responsabili di mala:e autosomiche dominan; sono rari, in genere gli individui affe: sono eteroz igo;. Rar i ss imi sono g l i omozigo;, che possono nascere solo da genitori entrambi eterozigo;. Ogni affeFo (eterozigote) ha il 50% di probabilità di avere figli mala;; individui non affe: del pedigree che sposano individui non affe: non hanno discenden; affe:. Genitori entrambi affe: (eterozigo;) possono avere figli sani (25%), mentre genitori di un bambino malato possono essere sani, non portatori: in questo caso si può dedurre che la mala:a sia indoFa da una nuova mutazione verificatasi durante la formazione di un gamete (mutazione “de novo”) (fig. 3).
• lega< al cromosoma X recessivi (XR): la frequenza della mala:a è maggiore nei maschi che nelle femmine, le quali possono essere portatrici sane. Le donne portatrici hanno un rischio del 50% di avere figli maschi mala;; i maschi affe: hanno figlie portatrici sane e figli maschi sani, mentre la madre di un individuo affeFo è portatrice sana. I l caraFere si trasmeFe a zig-‐zag con maschi affe: in generazioni diverse (eredità
� 5
Fig. 2: albero genealogico e quadrato di PunneF di una mala:a a trasmissione autosomica recessiva.
Fig. 3: albero genealogico e quadrato di PunneF di una mala:a a trasmissione autosomica dominante.
diaginica). La metà delle figlie femmine di madri portatrici sono anche loro portatrici (fig. 4).
• lega< al cromosoma X dominan< (XD): maschi affe: generano solo femmine affeFe e maschi sempre sani. F e mm i n e e t e r o z i g o ; a ff e F e trasmeFono il caraFere al 50% dei figli ( s ia masch i che femmine) . La frequenza nelle femmine è solitamente doppia che nei maschi (fig.5).
• lega< al cromosoma Y: i pochi caraFeri individua; si manifestano solo nei maschi e sono trasmessi direFamente da padre a figlio (eredità olandrica) (fig. 6).
1.3 Eterogeneità gene<ca Per alcune mala:e ereditarie monogeniche tu: gli individui affe: portano un’iden;ca mutazione: l’anemia falciforme ne è un esempio. Per molte altre mala:e ci sono invece più mutazioni che possono produrre lo stesso quadro patologico. Quando le diverse mutazioni sono a carico dello stesso gene si parla di eterogeneità allelica. Nel caso dell’emofilia A, ad esempio, il catalogo OMIM riporta 270 varian; alleliche. La fibrosi cis;ca è causata da più di 1000 mutazioni diverse nel gene CFTR. Le diverse mutazioni possono produrre feno;pi di gravità diversa. Nel caso in cui le mutazioni avvengono in geni diversi che collaborano alla determinazione di un feno;po, si parla di eterogeneità di locus. Ad esempio, in una stessa via metabolica, mutazioni in geni diversi possono portare alla stessa modificazione del feno;po. E’ il caso delle due forme di ipercolesterolemia familiare A e B dovute rispe:vamente a mutazioni del gene del receFore che lega le lipoproteine LDL e del gene della apoproteina B-‐100 che media il legame delle par;celle LDL al receFore.
� 6
Fig. 5: albero genealogico e quadrato di PunneF di una mala:a a trasmissione X-‐linked dominante.
Fig. 4: albero genealogico e quadrato di PunneF di una mala:a a trasmissione X-‐linked recessiva.
Fig. 6: albero genealogico e quadrato di PunneF di una mala:a a trasmissione Y-‐linked.
1.4 Pleiotropia Questo conceFo sta a indicare che un solo gene può essere responsabile di feno;pi diversi. Un esempio di pleiotropia nell’uomo è quello dell’anemia falciforme, una mala:a caraFerizzata da diversi sintomi a carico di organi e tessu; diversi. Ques; possibili effe: feno;pici derivano tu: dall’azione di un solo allele mutato presente in omozigosi. L’effeFo direFo dell’allele dell’anemia falciforme è quello di indurre i globuli rossi a produrre molecole anomale di emoglobina che tendono a unirsi fra loro e cristallizzare. Di conseguenza, i globuli rossi si deformano, assumendo forme a falce con contorni frastaglia;, sono più fragili e lisano e tendono ad aggregarsi e a occludere i capillari. TuFo questo produce molteplici danni a carico di organi e tessu; diversi.
2. Fibrosi Cis<ca
La fibrosi cis;ca (CF) è la mala:a ereditaria, autosomica recessiva, più comune nella popolazione caucasica e colpisce un neonato su 2500-‐3500 na; vivi; la frequenza dei portatori sani (eterozigo; asintoma;ci) è di 1/25-‐30 individui. La patologia interessa molteplici funzioni, come la respiratoria, la diges;va e la riprodu:va; colpisce sia i maschi che le femmine ed è caraFerizzata da un’anomala regolazione del trasporto degli eleFroli; da parte degli epiteli e quindi da una conseguente alterazione della composizione salina delle secrezioni delle ghiandole esocrine (fig. 7). Spesso nella fibrosi cis;ca si ha la completa perdita di funzione del canale del cloro, che causa la produzione di secrezioni disidratate e di muco denso. In tu: gli individui colpi;, le ghiandole sudoripare producono un eccesso di sale, nel pancreas il muco inspessito blocca il trasporto degli enzimi diges;vi, con conseguente graduale distruzione della ghiandola, i polmoni producono un muco denso e vischioso, che conges;ona i condo: respiratori rendendo difficile la respirazione, ed infine, nei maschi, il muco blocca i do: che portano lo sperma con la conseguenza che solo il 2-‐3% dei maschi colpi; dalla mala:a è fer;le.
2.1 Sintomatologia, terapia e prognosi La fibrosi cis;ca è una mala:a cronica progressiva complessa, non ancora guaribile, ma sicuramente curabile. CaraFeris;ca della mala:a è che l’esordio, l’en;tà dei sintomi e il decorso sono estremamente variabili. Alcuni mala; possono presentare precocemente gli aspe: polmonari della mala:a (infezioni respiratorie ricorren;) e le manifestazioni gastrointes;nali già alla nascita, segui; dalla sindrome da malassorbimento dovuta all’insufficienza pancrea;ca; altri hanno sintomi respiratori contenu; fino all'adolescenza con quadro diges;vo normale; per altri
� 7
Fig. 7: struFure ed appara; colpi; dalla CF.
ancora i sintomi predominan; sono quelli dell'epatopa;a o del diabete. Le forme della mala:a diagnos;cate in età adulta hanno come manifestazione episodi di pancrea;te ricorrente e nei maschi frequentemente si ha infer;lità. La prognosi è determinata dall'en;tà della broncopneumopa;a che, nella maggior parte dei casi, si aggrava nel tempo, ma è influenzata anche dallo stato di nutrizione (migliore nei sogge: diagnos;ca; precocemente) e dal programma di cure. Gli approcci terapeu;ci, spesso combina;, per curare la fibrosi cis;ca sono:
• fisioterapia respiratoria: per aiutare a liberare le vie aeree dal muco che può causare infezioni
• esercizio fisico: u;le quale forma di fisioterapia e per il benessere generale • terapie farmacologiche: somministrazione di diversi farmaci (mucoli;ci, an;bio;ci ecc.)
assun; per via inalatoria, orale o endovenosa per ripulire il muco e combaFere le infezioni • nutrizione ed assunzione di enzimi pancrea;ci, per aiutare a digerire il cibo • terapia delle complicanze: specifiche terapie per curare le complicanze tardive della
mala:a (sterilità, diabete, epatopa;a, calcoli biliari ecc.) • trapianto d’organo, in par;colare polmone e fegato
L'aspeFa;va di vita rimane poco prevedibile individualmente; mediamente è ridoFa rispeFo a quella della popolazione generale, ma va progressivamente aumentando e dipende dalla eterogeneità clinica della mala:a.
2.2 La proteina CFTR La fibrosi cis;ca è causata da mutazioni nel gene che codifica per una proteina, chiamata cys%c fibrosis transmembrane regulator (CFTR), che regola la secrezione di ioni cloro, sodio e bicarbonato nei tessu; epiteliali (fig. 8). La proteina CFTR appar;ene alla superfamiglia dei trasportatori con casseFe che legano ATP, denominate ABC (ATP binding casse:e), ed ha diverse funzioni: proteina regolatrice del pH di organelli citoplasma;ci, trasportatore di membrana, cana le i on i co ed è anche co invo l ta ne l processamento di glicoproteine. La proteina con;ene 1480 amminoacidi e ha massa 168142 Da, con una localizzazione intramembrana di circa l’80%. La proteina è formata da due regioni idrofobiche transmembrana, ciascuna cos;tuita da sei α-‐eliche (TM – trans membrane helices) e da una regionecitoplasma;ca aFa a legare l’ATP (NBD -‐ nucleo%de binding domain). Un grosso dominio centrale di regolazione (R domain) collega le due par; della molecola e presenta si; mul;pli di fosforilazione da parte di diverse chinasi, come la proteina chinasi AMP ciclico dipendente (PKA) o la proteina chinasi C (PKC).
� 8
Fig. 8: La proteina CFTR è localizzata nella membrana plasma;ca della cellula e regola il movimento degli ioni cloro tra i due la; della membrana. Nella maggior parte dei casi di CF la proteina è priva della regione 1 di legame.
Per la piena funzionalità del canale ionico è necessaria la dimerizzazione della proteina CFTR, indoFa mediante fosforilazione.
2.3 Il gene CFTR Il gene CFTR si trova sul braccio lungo del cromosoma 7, in posizione 7q31.2 (fig. 9). E’ un gene molto grande, cos;tuito da 27 esoni distribui; su una regione di lunghezza pari a 250188 basi. La fibrosi cis;ca può essere causata da più di 1000 mutazioni diverse situate in qualunque punto del gene, ma quelle più comuni nella popolazione sono rela;vamente poche (tab. 1 e fig. 11); in tab. 2 sono riportate le mutazioni che ricorrono nelle varie regioni italiane. TuFe le mutazioni sono cambiamen; di un singolo nucleo;de (mutazioni missense, nonsense) o di un piccolo numero di nucleo;di (mutazioni frameshiR) e mutazioni che alterano lo splicing, localizzate prevalentemente negli esoni o nelle giunzioni tra esoni ed introni, più raramente negli introni. In base al ;po di mutazione si hanno diversi effe: sull'espressione e sulla funzionalità della proteina. Sono state individuate sei classi di mutazioni:
• classe I (difeFo di produzione): causano l'interruzione prematura della trascrizione e la proteina è assente
• classe II (difeFo di maturazione): le proteine mutate non raggiungono la membrana cellulare e vengono degradate nell'apparato del Golgi
• classe III (difeFo di regolazione): le proteine mutate sono presen; sulla membrana cellulare, ma non possono essere a:vate
• classe IV (difeFo di trasporto): le proteine mutate sono presen; e a:ve sulla membrana cellulare, ma è alterato il trasporto degli ioni cloro
• classe V (rallentata sintesi): si verifica la sintesi d i p rote ine norma l i , ma in quan;tà notevolmente ridoFe
• classe VI (degradazione precoce): le proteine sono normalmente espresse e a:ve, ma vanno incontro a degradazione precoce.
Poiché la mala:a è autosomica recessiva, un soggeFo malato ha entrambe le copie del suo gene CFTR mutate e le due mutazioni possono essere uguali o diverse tra loro. Questo è una ulteriore causa della eterogeneità clinica della mala:a.
� 9
Fig.9: localizzazione del gene CF sul cromosoma 7.
Mutazione Localizzazione %
p.F508del esone 10 81,0
p.Gly551Asp esone 11 3,5
p.Gly542X esone 11 1,1
c.621+1G>T introne 4 1,0
c.1898+1G>A introne 12 0,9
Tab. 1: mutazioni più frequenti nel gene CFTR; p e c indicano rispettivamente che la mutazione è descritta nella proteina e nel cDNA; > significa “cambia in”, X significa un codone di stop; +1 significa che è coinvolto il primo nucleotide dell’introne successivo all’esone che termina con il nucleotide indicato dal numero che precede il segno +.
L'iden;ficazione delle specifiche mutazioni non è predi:va della severità della mala:a polmonare anche per questo si suppone l'intervento, accanto al gene CFTR, di geni modificatori e di faFori ambientali. Una correlazione geno;po-‐feno;po è documentata solo per alcune mutazioni e lo stato di sufficienza o insufficienza pancrea;ca o nel caso di sogge: adul; con infer;lità secondaria. In ques; casi, tuFavia, l'interpretazione del risultato fornito dall'analisi del geno;po è molto complessa.
� 10
Tab. 2: frequenza percentuale delle 12 più frequen; mutazioni CFTR nelle regioni italiane (3442 cromosomi CFTR) (Rendine et al. 1997).
2.4 La mutazione p.F508del (ΔF508) L a mu t a z i o n e p . F 5 0 8 d e l ( d e l e z i o n e dell’amminoacido fenilalanina F in posizione 508) (fig. 10) è la più comune nella popolazione nordeuropea e cos;tuisce il 70-‐80% di tuFe le mutazioni della fibrosi cis;ca in molte popolazioni. In Italia questa mutazione rappresenta il 51% del totale, ma con una notevole variabilità nelle diverse regioni. Questa mutazione, appartenente alla II classe, è determinata dalla delezione di tre paia di basi codifican; per la fenilalanina al codone 508 e causa il mancato processamento a livello del re;colo endoplasma;co della proteina CFTR. La proteina non raggiunge la membrana non perché la sua struFura sia dras;camente alterata dalla mutazione, ma in quanto la maturazione post-‐traduzionale della proteina non può essere completata a causa della mancanza di un segnale specifico in cui è coinvolta la F508. La proteina con la delezione F508 quindi non supera il severo controllo di qualità a cui sono soFoposte tuFe le proteine a livello del re;colo endoplasma;co e quindi viene trasportata ai proteasomi dove viene degradata.
2.5 La diagnosi di fibrosi cis<ca Nonostante l’alta frequenza di portatori, per la fibrosi cis;ca è difficile realizzare un test diagnos;co di massa a causa della variabilità allelica della mala:a. L'alterna;va pra;cabile è la diffusione di un programma di screening gene;co nei sogge: che hanno probabilità aumentata, rispeFo alla popolazione generale, di essere portatori del gene FC o rischio aumentato di avere la mala:a. Alla nascita si esegue un test basato sul dosaggio della tripsina ema;ca (enzima pancrea;co che serve per digerire le proteine) su una goccia di sangue del neonato u;lizzata anche per la diagnosi neonatale di altre mala:e gene;che. Se il "test della goccia" dimostra che i livelli di tripsina nel sangue sono eleva; non è deFo che il bambino sia effe:vamente affeFo da FC, ma il centro di screening richiama la famiglia per effeFuare il secondo dosaggio, tra i 15-‐20 giorni di vita del neonato. L’elevata concentrazione di tripsina nel sangue è probabilmente dovuta all'ostruzione dei do: pancrea;ci, condizione presente in quasi tu: i neona; con FC, indipendentemente dallo sviluppo successivo di insufficienza pancrea;ca. In caso di valori eleva; di tripsina la diagnosi va confermata o esclusa ricorrendo ad altri test. Per la diagnosi di fibrosi cis;ca, in prima baFuta si esegue un semplice esame per stabilire il livello di ioni Na+ e Cl-‐ nel sudore. Un an;co proverbio tedesco del XVII° secolo così recitava: “morirà
� 11
Fig. 10: Classi delle mutazioni del gene CFTR e i loro effe: (Cimino et al. 2012).
presto il bambino, la cui fronte sa di sale se baciata”. Nei tempi an;chi nell’Europa del Nord, durante cerimonie di purificazione, si era soli; leccare la fronte di neona; e bambini. Se veniva percepito un sapore salato, il bambino veniva deFo stregato e des;nato a morte precoce. In tal modo, la saggezza popolare aveva già an;cipato quanto l’osservazione medica avrebbe poi scoperto negli anni ’50 e la ricerca scien;fica non ancora completamente chiarito. Infa: il testo di questo an;co proverbio tedesco ci indica, nella concentrazione di sali nel sudore, il metodo di diagnosi per la fibrosi cis;ca. È proprio questa caraFeris;ca del sudore par;colarmente salato, avver;to dalle madri quando baciavano i bambini affe:, che farà chiamare la fibrosi cis;ca “la mala:a del bacio salato”. Per la diagnosi gene;ca si usano analisi a vari livelli: le tecniche di primo livello ricercano le mutazioni più frequen; del gene CFTR (Reverse Dot Blot, Amplifica%on Refractory Muta%on Systems, Oligonucleo%de Specific Allele e Oligonucleo%de Liga%on Assay). Le tecniche di secondo livello, che analizzano tu: gli esoni e le regioni limitrofe cercando variazioni di sequenza, sono esami più sensibili, ma di più difficile interpretazione perchè evidenziano anche mutazioni non patologiche (Denaturing Gradient Gel Electrophoresi, Denaturing High Performance Liquid Cromatography, sequenziamento dire:o). Le tecniche di terzo livello ricercano, infine, delezioni ed inserzioni nella sequenza genica (Quan%ta%ve Mul%plex Polymerase Chain Reac%ons of Short Fluorescent Fragments). AFualmente è possibile aggiungere anche un quarto livello di analisi che si basa sullo studio del mRNA che permeFe di iden;ficare mutazioni negli introni che, pur non adiacen; agli esoni, causano alterazioni nello splicing. Nel caso della gravidanza di una coppia cos;tuita da due portatori si può effeFuare una diagnosi prenatale per sapere se il nascituro ha ereditato entrambi i geni difeFosi presen; nei genitori, e quindi se è malato di fibrosi cis;ca o meno. Per poter eseguire la diagnosi prenatale è necessario aver in precedenza individuato i geni difeFosi presen; in entrambi i genitori e talora a questo scopo può essere necessaria un’analisi gene;ca in altri familiari. Per eseguire la diagnosi prenatale è necessario un campione di DNA, che abitualmente viene oFenuto con un prelievo di villi coriali, un tessuto placentare che con;ene lo stesso DNA del feto, eseguito tra la decima e la dodicesima se:mana di gravidanza, o, più raramente, u;lizzando cellule contenute nel liquido amnio;co, oFenute tramite amniocentesi, eseguita tra la sedicesima e la dicioFesima se:mana di gravidanza. L’analisi prenatale può essere effeFuata anche dopo ecografie che mostrano determinate anomalie, come iperecogenicità (aumento della densità) delle anse intes;nali. Sono in fase di studio nuove tecniche per la diagnosi prenatale non invasiva (NIPD) di fibrosi cis;ca con metodiche analoghe a quelle già u;lizzate per la diagnosi di patologie cromosomiche; durante la gravidanza alcuni frammen; di DNA del feto e della placenta circolano nel sangue materno. Il DNA fetale è rilevabile sin dalla quinta se:mana di gestazione, la sua concentrazione aumenta nelle se:mane successive e scompare dopo il parto. Il test si esegue mediante il prelievo di un campione di sangue della madre, a par;re dalla decima se:mana di gravidanza, da cui viene isolato il DNA fetale libero, presente nel circolo materno che viene successivamente sequenziato.
2.6 Il vantaggio seleBvo degli eterozigo< Perché vi è una notevole diffusione delle mutazioni del gene CFTR nelle popolazioni di pelle bianca? La teoria del vantaggio del portatore ipo;zza che il portatore di una mutazione CFTR abbia avuto, in tempi remo;, un vantaggio nella salute sugli altri individui non portatori, per la resistenza a
� 12
qualche mala:a cui invece il resto della popolazione era susce:bile, come il ;fo o il colera, mala:e che in passato hanno scatenato epidemie gravissime. Recentemente una ricerca condoFa in una popolazione indonesiana, in un’area in cui il ;fo è endemico, cioè presente abitualmente in quella regione, ha confermato che effe:vamente i portatori di FC hanno un rischio di contrarre il ;fo molto più basso dei non portatori. Nel 1994 Gabriel et al., usando dei modelli murini che correlano streFamente con feno;po FC per quanto riguarda il traFo intes;nale (omozigo; recessivi, eterozigo; e normali rispeFo al CFTR), hanno dimostrato che i topi eterozigo; per il CFTR mutato hanno una secrezione (perdita di liquidi), in risposta alla tossina colerica, del 50% inferiore rispeFo ai topi normali; nessuna risposta è riscontrata nei topi con CFTR mutato allo stato omozigote in accordo alle preceden; evidenze sull’uomo. Come nel modello animale, nell’uomo eterozigote un più basso livello di CFTR funzionante a livello intes;nale si dovrebbe tradurre in un meccanismo prote:vo che evita o riduce la disidratazione in risposta alla tossina colerica. È stato inoltre evidenziato in vitro come altri baFeri enteroinvasivi come E. Coli o Salmonella Dublin possano modulare la secrezione di cloro e la funzione di barriera intes;nale. Pier et al. ipo;zzano che il ΔF508 eterozigote possa essere prote:vo nei confron; della febbre ;foide, contribuendo a spiegare perché i ΔF508 siano così diffusi in alcune popolazioni. Una rassegna del U.S. Cys%c fibrosis founda%on registry non è riuscita a trovare un solo caso di febbre ;foide tra i pazien; FC (Prince, 1998).
� 13
Fig. 11: prevalenza approssima;va alla nascita di individui affe: da FC nel mondo e rela;ve mutazioni più frequen; in tali regioni (O’Sullivan BP and Freedman SD, 2009).
2.7 Tecniche di laboratorio per la diagnosi di fibrosi cis<ca Analisi di primo livello • Reverse Dot Blot (RDB)
Prevede una reazione di PCR mul;pla in grado di amplificare contemporaneamente differen; regioni del gene. A questa fa seguito una reazione di ibridazione colorimetrica allele-‐specifica, che si basa sull’ibridazione dei prodo: di PCR con sonde molecolari oligonucleo;diche complementari alla sequenza normale e alle sequenze mutate. Il metodo è rapido, affidabile e non prevede l’u;lizzo di strumentazioni sofis;cate.
• Amplifica0on Refractory Muta0on Systems (ARMS) Prevede una reazione di PCR (Polymerase chain reac%on -‐ amplificazione di una parte di DNA u;lizzando un enzima chiamato Taq polimerasi che genera un nuovo filamento di DNA, a par;re da un innesco chiamato primer, complementare a quello in analisi) con uno dei due primer costruito in modo che il nucleo;de in posizione 3’ sia complementare alla sequenza mutata o a quella normale del gene. Il DNA genomico non verrà amplificato quando si userà il primer non perfeFamente complementare alla sequenza in esame. La visualizzazione degli ampliconi viene normalmente eseguita mediante eleFroforesi su gel di agarosio (tecnica di separazione del DNA in base alla massa e alla generazione di un campo eleFrico).
• Oligonucleo0de Liga0on Assay (OLA) E’ basata sull’u;lizzo di sonde fluorescen; specifiche e della ligasi termostabile rTth, un enzima per la riparazione del DNA. La reazione di PCR con sonde complementari all’allele mutato e normale è seguita da una reazione di ligasi che unisce le sonde che si sono legate al DNA bersaglio, discriminando tra quelle con complementarietà completa e incompleta. La visualizzazione dei risulta; avviene mediante eleFroforesi capillare su sequenziatore automa;co.
Analisi di secondo livello Come per le analisi mutazione-‐specifiche, anche le metodiche di II livello che permeFono di effeFuare lo scanning dell’intero gene alla ricerca di eventuali mutazioni sono piuFosto numerose. In passato il sequenziamento dell’intero gene CFTR era considerato complesso e costoso e quindi applicabile solo a casi molto limita;. Per questo, nel corso degli anni ’90, sono nate e si sono diffuse numerose tecniche, che permeFono di eseguire uno screening delle variazioni nucleo;diche, per ridurre al minimo le analisi di sequenziamento. Tra queste metodiche ricordiamo quelle che hanno dato i risulta; migliori, permeFendo di iden;ficare il 94%-‐98% delle mutazioni (la percentuale delle mutazioni non iden;ficate dipende dalla frequenza dei riarrangiamen; genici e delle mutazioni localizzate nelle regioni introniche): DGGE (Denaturing Gradient Gel Electrophoresis) e D-‐HPLC (Denaturing High PerformanceLiquid Chromatography). In ques; ul;mi anni, vis; i progressi della tecnologia legata al sequenziamento del DNA, i laboratori di gene;ca molecolare preferiscono procedere al sequenziamento completo del gene CFTR anziché effeFuare all’analisi D-‐HPLC. • Sequenziamento direIo del DNA
PermeFe di leggere la sequenza di basi azotate mutate, pertanto questa tecnica segue le preceden; per caraFerizzare la mutazione, con una sensibilità vicina al 100%.
• Denaturing Gradient Gel Electrophoresis (DGGE)
� 14
SfruFa il principio che la temperatura di denaturazione del DNA dipende dalla sua sequenza nucleo;dica ed è peculiare di ogni frammento. Variazioni di un singolo nucleo;de (mutazioni o polimorfismi) modificano la temperatura di denaturazione del frammento e di conseguenza la sua mobilità. La variazione nella Tm (temperatura di legame) di un dato frammento di DNA può essere controllata su un gel di poliacrilammide a concentrazioni di denaturan; crescen; poiché il raggiungimento della temperatura di denaturazione (in questo caso della concentrazione di denaturante ad essa equivalente) comporta una parziale apertura della doppia elica e quindi un rallentamento nella progressione del frammento sul gel. E’ una tecnica con buona sensibilità (>95%), ma di difficile messa a punto e non automa;zzabile.
• Denaturing High Performance Liquid Cromatography (DHPLC) Rappresenta l’evoluzione in automa;co del DGGE e permeFe l’iden;ficazione di varian; nucleo;diche in brevissimo tempo. Si traFa di una cromatografia ionica in fase inversa che sfruFa, in condizione di parziale denaturazione, la diversa ritenzione delle molecole di DNA in assenza/presenza di variazioni di sequenza. Ha una buona sensibilità (>95%) ed è semiautoma;zzabile.
Analisi di terzo livello Tra le metodiche che permeFono la quan;ficazione del DNA per rilevare la presenza di riarrangiamen; genici, ricordiamo: l’analisi QMPSF (Quan0ta0ve Mul0plex PCR of Short Fluorescent Fragments) e l’analisi MLPA (Mul0plex Liga0on-‐dependent Probe Amplifica0on). Entrambe si basano sull’amplificazione simultanea di piccoli frammen; di DNA seguita dalla quan;ficazione della fluorescenza di ciascun frammento amplificato. In Italia le delezioni/duplicazioni hanno una frequenza pari al 2-‐3% e le delezioni più frequen; sono: delezione degli esoni 22-‐23; delezione esoni 22-‐24; delezione esone 2; delezione esoni 2-‐3; delazione esoni 17a-‐18; delezione esone 1. Recentemente sono sta; riporta; dei da; oFenu; mediante la ricerca dei riarrangiamen; u;lizzando la tecnica dell’array CGH (Array Compara0ve Genomic Hybridiza0on), tecnica per valutare la perdita o acquisizione di materiale gene;co) che dimostrano una maggiore sensibilità e specificità del sistema e hanno permesso l’iden;ficazione di estese duplicazioni non evidenziabili con le tecniche QMPSF e MLPA.
3. Tecniche u<lizzate in laboratorio per la diagnosi di malaBe gene<che
3.1 Reverse Dot Blot (RDB) La tecnica del Reverse Dot Blot fu per la prima volta descriFa nel 1989 da Saiki et al. e u;lizzata per la geno;pizzazione HLA-‐DQA e per l’iden;ficazione di mutazioni che provocano la beta-‐talassemia. Su un filtro di nylon vengono applica; degli oligonucleo;di specifici per la variante normale o mutata di un determinato gene; si effeFua una ibridazione sul filtro con DNA sano o mutato oFenuto mediante PCR con un primer a cui è aFaccata una molecola di bio;na o u;lizzando dUTP coniuga; alla bio;na (Chehab and Wall, 1992). L’ibridazione viene rilevata dopo il legame della strepdavidina con la bio;na; poichè la streptavidina è coniugata con una perossidasi, il legame tra DNA del paziente e l’oligonucleo;de viene visualizzato dalla reazione colorimetrica in seguito al traFamento con H2O2 (fig. 12).
� 15
Questa tecnica permeFe di valutare simultaneamente più mutazioni sullo stesso filtro, rendendo questa analisi rapida e affidabile. Infa: è stata applicata anche alla diagnosi di CF: in par;colare nello studio condoFo da Chehab and Wall nel 1992, è stato messo a punto un reverse dot-‐blot in grado di permeFere simultaneamente lo screening dell’85% dellemutazioni più frequen; tra i caucasici nord europei, u;lizzando oFo coppie di sonde che permeFono di iden;ficare altreFante mutazioni (di ;po missenso, non-‐senso, frameshiR o che alterano lo splicing).
3.2 Sequenziamento Il processo di sequenziamento del DNA permeFe di iden;ficare la successione di nucleo;di che cos;tuiscono il frammento da analizzare. Questa tecnica si è affinata negli anni, permeFendo di iden;ficare la sequenza di DNA di varie specie in tempi brevi e con cos; contenu; e progressivamente diminu;. Il sequenziamento è diventato quindi una tecnica di elezione anche per la diagnosi di mala:e gene;che. Le metodologie di sequenziamento del DNA sono state ideate verso la metà degli anni ’70, ma già dieci anni prima il gruppo di Robert Holley fece i primi tenta;vi per sequenziare il tRNA; questo metodo prevedeva la diges;one dell’RNA con RNAsi sequenza-‐specifiche, il frazionamento degli oligoribonucleo;di risultan; e la determinazione dell’ordine delle basi per ogni frammento con una diges;one ad opera di un’esonucleasi. Successivamente vennero fa: mol; tenta;vi, tu: rilevatesi poi poco adegua;, per applicare questo metodo al sequenziamento del DNA, aFraverso il taglio in frammen; più piccoli con l’endonucleasi IV o con elemen; chimici. Dieci anni dopo vennero proposte due nuove tecniche: Sanger mise a punto il metodo a terminazione di catena, in cui la sequenza di DNA single strand veniva determinata aFraverso la
� 16
Fig. 12: rappresentazione del reverse dot-‐blot: sulle sonde posizionate sul filtro viene ibridato il DNA di vari individui di una stessa famiglia per determinarne il geno;po.
sintesi enzima;ca di catene polinucleo;diche complementari, di lunghezza variabile e terminan; con nucleo;di marca;, mentre Maxam e Gilbert determinarono la sequenza di una molecola di DNA a doppio filamento mediante traFamento con reagen; chimici capaci di tagliare la molecola in posizioni specifiche. La facilità di automazione del metodo ideato da Sanger e la tossicità dei reagen; chimici usa; da Maxam e Gilbert hanno contribuito alla maggior diffusione del metodo a terminazione di catena. Sanger e Gilbert hanno ricevuto entrambi il Premio Nobel nel 1980. La tecnica di sequenziamento ideata da Sanger prevede l’u;lizzo di un templato di DNA a singolo filamento, di un primer specifico per l’avvio della reazione di polimerizzazione, di una DNA polimerasi, di normali dNTPs e di 3’ddNTPs, didesossinucleo;di modifica; con un atomo di H al posto del convenzionale gruppo -‐OH sul carbonio in posizione 3’ dello zucchero, e marca; con 32P, 33P o 35S in modo da renderli iden;ficabili. Quando un ddNTP viene incorporato nel nuovo filamento, a causa della mancanza del 3’-‐OH, non può formare il legame fosfodiesterico con il successivo dNTP e pertanto la sintesi del filamento si arresta. Poiché la polimerasi non è in grado di discriminare tra dNTPs e ddNTPs, il prodoFo della reazione è cos;tuito da una popolazione di catene di nucleo;di di lunghezza differente in base alla distanza tra il primer e il sito di incorporazione del ddNTP. I ddNTPs vengono aggiun; in quan;tà inferiore ai dNTPs in modo da permeFere la formazione di frammen; sufficientemente lunghi per consen;re la loro analisi. In differen; proveFe si aggiungono i quaFro diversi ddNTPs, un solo ;po per ogni campione, e vengono quindi prodo: filamen; che coprono tuFa la lunghezza della regione da sequenziare. I campioni oFenu; vengono poi carica; in quaFro pozze: con;gui di un gel di poliacrilammide: la corsa eleFrofore;ca, rilevata mediante autoradiografia, permeFe di determinare la sequenza del campione analizzato, confrontando la posizione dei quaFro ddNTPs nei rispe:vi traccia;; il frammento più piccolo, cioè quello con una corsa maggiore, rappresenta la prima base azotata della sequenza (fig. 13A). AFualmente i ddNTPs usa; per il sequenziamento non sono più marca; con isotopi radioa:vi, ma legano in posizione 3’ un fluorocromo, diverso per ogni ;po di base azotata (fig. 14). I frammen; oFenu; con la PCR in presenza di ddNTP marca; con fluorocromo vengono analizza; tu: insieme da un sequenziatore automa;co che li separa, in base alle loro dimensioni, mediante corsa lungo un capillare del diametro di 50 µm contenente un polimero di corsa che svolge la stessa funzione del gel di poliacrilammide. I sequenziatori più efficien; u;lizzano 96 capillari che permeFono di sequenziare fino a 100.000 bp per corsa. Al termine della corsa i frammen;, sono ordina; in base alle dimensioni, dal più piccolo al più grande, e qui un raggio laser eccita le molecole di fluorocromo associate all’ul;mo nucleo;de di ciascun frammento; queste emeFono dei segnali rileva; dal computer e un soRware elabora i da; oFenu; da un fotomol;plicatore o da un disposi;vo CCD (Charge-‐Coupled Device) e li rappresenta su di un tracciato chiamato eleFroferogramma come un insieme di picchi colora; per i quaFro diversi fluorocromi (fig. 13B). La sequenza dei colori presen; nel tracciato permeFe, quindi, di ricostruire la sequenza delle basi azotate nel filamento del DNA, mentre la diversa altezza dei picchi dipende dal numero di molecole di quella data lunghezza che si sono forma; durante il processo di duplicazione; sequenziando più volte lo stesso frammento troveremo quindi sempre la stessa sequenza di colori, ma non la stessa altezza dei picchi perché l’inserimento dei ddNTPs al posto del dNTPs è casuale.
� 17
3.3 Percorso bioinforma<co
Ensembl Il sito di Ensembl, hFp://www.ensembl.org, ha una interfaccia di facile leFura (fig. 15). Ensembl (un gioco di parole fra “ensemble” cioè “insieme” e “EMBL” la sigla del European Molecular Biology Laboratory), è un progeFo sviluppato in collaborazione tra Sanger Center (uno dei più importan; centri di ricerca sul genoma a Cambridge) e EMBLEBI (European Bioinforma%cs Ins%tute) per sviluppare un sistema soRware di annotazione automa;ca dei genomi animali. Con il termine “annotazione” si intende l’inserimento di tuFe le informazioni riguardan; la funzione di una determinata sequenza. In questa pagina di ingresso si possono osservare i link alle sequenze dei genomi di diverse specie. AFualmente sono note le sequenze di molte più specie rispeFo a quelle qui elencate, sia di organismi procario; che eucario;, tuFavia Ensembl prende in considerazione sopraFuFo le sequenze degli organismi del regno animale, importan; perchè molto simili al
� 18
Fig. 13: A -‐ sequenziamento mediante autoradiografia B -‐ Sequenziamento con u;lizzo di ddNTPs fluorescen;
Fig. 14: ddNTP con H in 3’
nostro. Cliccando su Homo sapiens si apre la pagina rela;va al genoma umano.
�
Fig. 15: homepage Ensembl
OMIM OMIM, Online Mendelian Inheritance in Man, è una banca da; che con;ene informazioni sui geni umani e sulle mala:e gene;che realizzata e mantenuta dall’NCBI, the Na%onal Center for Biotechnology Informa%on (fig. 16). La banca con;ene la descrizione dei geni e delle mala:e ad essi associate, i quadri clinici e i riferimen; bibliografici, oltre a link a sequenze e ad altre risorse web. Si traFa della versione on line del testo “Mendelian Inheritance in Man” a cura del gene;sta medico Victor A. McKusick e di un gruppo di colleghi della Johns Hopkins University e di altre is;tuzioni. La banca da; è aggiornata quo;dianamente e riporta solo mala:e che sono state associate ad uno o più geni.
� 19
!
BLAST BLAST (Basic Local Alignment Search Tool) è un programma euris;co (ogni principio o espediente che contribuisca a ridurre la quan;tà di ricerca media necessaria per la soluzione di un problema) per la ricerca di omologie locali di sequenza. Il soRware BLAST (fig. 17) in realtà è composto da diversi algoritmi che consentono di allineare non solo sequenze nucleo;diche con sequenze nucleo;diche, ma anche sequenze proteiche fra di loro, sequenze nucleo;diche con sequenze proteiche e viceversa, ovviamente u;lizzando le regole del codice gene;co per passare dalle sequenze nucleo;diche a quelle amminoacidiche.
! Fig. 17: homepage BLAST
� 20
Fig. 16: homepage NCBI
Deep View Le struFure tridimensionali (3D) delle proteine possono essere determinate con una serie di approcci sperimentali, fra i quali i più u;lizza; e in grado di fornire le informazioni più deFagliate sono la cristallografia ai raggi X e la risonanza magne;ca nucleare. E’ inoltre possibile effeFuare delle previsioni di struFura per proteine che mostrino un sufficiente livello di iden;tà di sequenza con proteine la cui struFura sia stata determinata sperimentalmente. Questo ;po di analisi è ovviamente molto meno accurato, ma può fornire informazioni molto importan; sulla struFura e sulla funzione di una proteina. Le coordinate tridimensionali di ogni singolo atomo vengono scriFe in un file che è poi possibile visualizzare mediante diversi soRware. In par;colare noi u;lizzeremo il soRware Deep View (fig. 18). I file contenen; le coordinate molecolari delle molecole la cui struFura 3D è già stata risolta sono raccol; (in diversi forma; u;lizzabili con diversi ;pi di soRware) in un database chiamato PDB (Protein Data Bank) (fig. 19). Deep View è un potente programma di grafica, oFenibile da Expert Protein Analysis System (ExPASy) Molecular Biology Server di Ginevra. Il programma è semplice da usare e consente di vedere la struFura di una proteina e creare modelli dando una sequenza di amminoacidi; permeFe di vedere diverse proteine contemporaneamente e sovrapporle per comparare la loro struFura e sequenza. Per proteine di sequenze conosciute ma struFura sconosciuta, Deep View soFomeFe la sequenza a ExPASy per trovare analogie con altre proteine, con cui potete allineare la vostra sequenza per costruire un modello preliminare in tre dimensioni. Deep View soFopone il vostro allineamento a ExPASy, il server SWISS_MODEL costruirà un modello finale, chiamato homology model, e lo invierà al vostro indirizzo email. Il soRware permeFe di osservare la struFura terziaria della proteina, iden;ficare domini e struFure secondarie, familiarizzando con le diverse visualizzazioni (ribbon diagram, backbone e sidechains), permeFendo di iden;ficare, all’interno della struFura, i residui eventualmente interessa; da mutazioni patologiche (es: ΔF508del), confrontando la struFura 3D della proteina sana con quella malata.
!
� 21
Fig. 18: homepage Deep View
! Fig. 19: homepage PDB
� 22
PARTE PRATICAScenario 1 e simulazione di consulenza gene<ca In consultorio si presenta una giovane coppia (Davide e Sofia). Hanno 2 figli, Pietro di 6 anni sano, e Maria, di 4 anni, che soffre spesso di tosse, raffreddore e infezioni polmonari. Sofia racconta di avere una sorella e un fratello sani, ma una sua sorella maggiore è morta giovane di fibrosi cis;ca (CF), mentre nella famiglia di Davide non ci sono casi di mala:a. Sofia è in aFesa di un terzo figlio (è alla fine della sesta se:mana di gravidanza) e vorrebbe informazioni sul rischio di avere un figlio affeFo da CF. Viene suggerito alla coppia di soFoporre Maria al test del sudore per stabilire il livello di ioni Na+ e Cl-‐, un test semplice di valore diagnos;co per la CF, e di ritornare con i risulta; delle analisi.
Con i da; a vostra disposizione in questo momento costruite l’albero genealogico di questa famiglia e rispondete alle seguen; domande:
Il test del sudore conferma la diagnosi di fibrosi cis;ca (livello di Na+ di 87 nmol/l, molto superiore al valore normale di 60 nmol/l). In base a questa nuova informazione, rispondete nuovamente alle domande:
La CF è sempre causata da mutazioni del gene CFTR sul cromosoma 7. La mala:a è recessiva e quindi se Maria è malata, devono essere mutate entrambe le copie del suo gene CFTR. NB: Le due mutazioni possono essere uguali o diverse. A questo punto il gene;sta suggerisce di accertare, mediante analisi del DNA, quali sono le mutazioni presen; in Maria e nei suoi genitori. Sofia deve inoltre soFoporsi ad amniocentesi, per determinare, aFraverso l’analisi del DNA, il geno;po del nascituro.
� 23
• quale è il rischio che Sofia sia portatrice di CF? • quale è il rischio che Davide sia portatore di CF? • quale è il rischio che il nascituro sia affetto da CF? • che probabilità ha il nascituro di essere sano? Di essere portatore?
• quale è il rischio che Sofia sia portatrice di CF? • quale è il rischio che Davide sia portatore di CF? • quale è il rischio che il nascituro sia affetto da CF? • che probabilità ha il nascituro di essere sano? Di essere portatore?
• Quale è il genotipo dei genitori? • Quale è il genotipo di Maria? • Quale è il genotipo del feto?
� 24
Sequenza WT
Sequenza eterozigote
Sequenza mutato
� 25
Scenario 2 e simulazione di consulenza gene<ca In consultorio si presenta una giovane coppia (Sara e Tommaso). Sara ha una sorella affeFa da fibrosi cis;ca mentre Tommaso ha un fratello che soffre spesso di tosse, raffreddore e infezioni polmonari; Tommaso lo invita a soFoporsi al test del sudore per scoprire se i suoi sintomi siano riconducibili alla fibrosi cis;ca. La coppia richiede una consulenza gene;ca perchà la donna è incinta e vuole sapere quale sia la probabilità che il nascituro sia affeFo da CF. Con i da; a vostra disposizione in questo momento costruite l’albero genealogico di questa famiglia e rispondete alle seguen; domande:
Il test del sudore conferma la diagnosi di fibrosi cis;ca (livello di Na+ di 87 nmol/l, molto superiore al valore normale di 60 nmol/l). In base a questa nuova informazione, rispondete nuovamente alle domande:
La CF è sempre causata da mutazioni del gene CFTR sul cromosoma 7. La mala:a è recessiva e quindi se il feto è malato, devono essere mutate entrambe le copie del suo gene CFTR. NB: Le due mutazioni possono essere uguali o diverse. A questo punto il gene;sta suggerisce di accertare, mediante analisi del DNA, quali sono le mutazioni presen; nelle famiglie . Sara deve inoltre soFoporsi ad amniocentesi, per determinare, aFraverso l’analisi del DNA, il geno;po del nascituro.
� 26
• quale è il rischio che Sara sia portatrice di CF? • quale è il rischio che Tommaso sia portatore di CF? • quale è il rischio che il nascituro sia affetto da CF? • che probabilità ha il nascituro di essere sano? Di essere portatore?
• quale è il rischio che Sara sia portatrice di CF? • quale è il rischio che Tommaso sia portatore di CF? • quale è il rischio che il nascituro sia affetto da CF? • che probabilità ha il nascituro di essere sano? Di essere portatore?
• Quale è il genotipo dei genitori? • Quale è il genotipo degli individui affetti? • Quale è il genotipo del feto?
� 27
Sequenza WT 508
Sequenza eterozigote
Sequenza omozigote recessivo
� 28
Sequenza WT G542X
Sequenza eterozigote
Sequenza omozigote recessivo
� 29
Scenario 3 e simulazione di consulenza gene<ca In consultorio si presenta una giovane coppia (Barbara e Luca). Hanno 2 figli, Sabrina di 4 anni sana, e Gabriele, di 6 anni, che soffre spesso di tosse, raffreddore e infezioni polmonari. Luca racconta di avere una zia da parte di sua mamma morta giovane di fibrosi cis;ca (CF), mentre nella famiglia di Barbara non ci sono casi di mala:a. Barbara è in aFesa di un terzo figlio (è alla fine della sesta se:mana di gravidanza) e vorrebbe informazioni sul rischio di avere un figlio affeFto da CF. Viene suggerito alla coppia di soFoporre Gabriele al test del sudore per stabilire il livello di ioni Na+ e Cl-‐, un test semplice di valore diagnos;co per la CF, e di ritornare con i risulta; delle analisi.
Con i da; a vostra disposizione in questo momento costruite l’albero genealogico di questa famiglia e rispondete alle seguen; domande:
Il test del sudore conferma la diagnosi di fibrosi cis;ca (livello di Na+ di 87 nmol/l, molto superiore al valore normale di 60 nmol/l). In base a questa nuova informazione, rispondete nuovamente alle domande:
La CF è sempre causata da mutazioni del gene CFTR sul cromosoma 7. La mala:a è recessiva e quindi se Gabriele è malato, devono essere mutate entrambe le copie del suo gene CFTR. NB: Le due mutazioni possono essere uguali o diverse. A questo punto il gene;sta suggerisce di accertare, mediante analisi del DNA, quali sono le mutazioni presen; in Gabriele e nei suoi genitori. Barbara deve inoltre soFoporsi ad amniocentesi, per determinare, aFraverso l’analisi del DNA, il geno;po del nascituro.
� 30
• quale è il rischio che Barbara sia portatrice di CF? • quale è il rischio che Luca sia portatore di CF? • quale è il rischio che il nascituro sia affetto da CF? • che probabilità ha il nascituro di essere sano? Di essere portatore?
• quale è il rischio che Barbara sia portatrice di CF? • quale è il rischio che Luca sia portatore di CF? • quale è il rischio che il nascituro sia affetto da CF? • che probabilità ha il nascituro di essere sano? Di essere portatore?
• Quale è il genotipo dei genitori? • Quale è il genotipo di Gabriele? • Quale è il genotipo del feto?
� 31
Sequenza WT G551D
Sequenza eterozigote
Sequenza omozigote recessivo
Sequenza omozigote recessivo
� 32
Scenario 4 e simulazione di consulenza gene<ca In consultorio si presenta una giovane coppia (AntonieFa e Davide), due cugini discenden; entrambi dagli ebrei Ashkenazi. Sono in aFesa di un figlio e vorrebbero informazioni sul rischio di avere un figlio affeFto da CF perché Alessio, il nipote di Davide, figlio di sua sorella, soffre di ripetute infezioni polmonari ed è stato da poco soFoposto al test del sudore per stabilire il livello di ioni Na+ e Cl-‐, un test semplice di valore diagnos;co per la CF. Davide riferisce anche che sua sorella ha un altro figlio maschio sano.
Con i da; a vostra disposizione in questo momento costruite l’albero genealogico di questa famiglia e rispondete alle seguen; domande:
Il test del sudore conferma la diagnosi di fibrosi cis;ca (livello di Na+ di 87 nmol/l, molto superiore al valore normale di 60 nmol/l). In base a questa nuova informazione, rispondete nuovamente alle domande:
La CF è sempre causata da mutazioni del gene CFTR sul cromosoma 7. La mala:a è recessiva e quindi se Alessio è malato, devono essere mutate entrambe le copie del suo gene CFTR. NB: Le due mutazioni possono essere uguali o diverse. A questo punto il gene;sta suggerisce di accertare, mediante analisi del DNA, quali sono le mutazioni presen; in Alessio e nei genitori del feto. AntonieFa deve inoltre soFoporsi ad amniocentesi, per determinare, aFraverso l’analisi del DNA, il geno;po del nascituro.
� 33
• quale è il rischio che Antonietta sia portatrice di CF? • quale è il rischio che Davide sia portatore di CF? • quale è il rischio che il nascituro sia affetto da CF? • che probabilità ha il nascituro di essere sano? Di essere portatore?
• quale è il rischio che Antonietta sia portatrice di CF? • quale è il rischio che Davide sia portatore di CF? • quale è il rischio che il nascituro sia affetto da CF? • che probabilità ha il nascituro di essere sano? Di essere portatore?
• Quale è il genotipo dei genitori? • Quale è il genotipo di Alessio? • Quale è il genotipo del feto?
� 34
Sequenza WT W1282X
Sequenza eterozigote
Sequenza omozigote recessiva
�
� 35
N
Percorso bioinforma<co
Ensembl www.ensembl.org
Nel campo search di Ensembl • scegliete “human” • scrivete nel campo bianco “CFTR” • dalla tendina scegliete CTFR(human gene) • cliccate sul primo transcript-‐>transcript ID
� 36
• sulla sinistra della pagina cliccate sul link: cDNA
Nella parte bassa della pagina si visualizzerà la sequenza del cDNA e si potranno localizzare le principali caraFeris;che del cDNA/mRNA, per esempio:
• 5’UTR (5’ UnTranslated Region) • start codon (inizio della traduzione, ATG (AUG) il codone della me;onina) • CDS (CoDing Sequence) • stop codon (fine della traduzione, TAA (UAA)/ TAG (UAG) / TGA (UGA)
� 37
Visualizzazione della stru_ura 3D della proteina CF e confronto tra la proteina sana e quella mutata (ΔF508).
Aprite il file (con estensione “.pdb”) contenente la struFura 3D della proteina in esame disponibile anche sul sito “Protein Data Bank” (hFp://www.rcsb.org/pdb/) inserendo nella casella search il riferimento 2BBO (wild type) (scaricare il file in PDB format). Aprite il file con il soRware di visualizzazione “DeepView” (disponibile su hFp://www.expasy.org/spdbv/)
Deep View Deep View è un potente programma di grafica, oFenibile da Expert Protein Analysis System (ExPASy) Molecular Biology Server di Ginevra. Deep View è semplice da usare e consente di vedere la struFura di una proteina e creare modelli dando una sequenza di amminoacidi; permeFe di vedere diverse proteine contemporaneamente e sovrapporle per comparare la loro struFura e sequenza. Per proteine di sequenze conosciute ma struFura sconosciuta, Deep View soFomeFe la sequenza a ExPASy per trovare analogie con altre proteine, con cui potete allineare la vostra sequenza per costruire un modello preliminare in tre dimensioni. Deep View soFopone il vostro allineamento a ExPASy, il server SWISS_MODEL costruirà un modello finale, chiamato homology model, e lo invierà al vostro indirizzo email. Aprite DeepView, comparirà la seguente finestra.
� 38
�
Per inserire la proteina da analizzare, andate su File, cliccate su Open PDB File, scegliete un file con estensione pdb e apritelo. Automa;camente la struFura della proteina verrà inserita in una finestra posta soFo la precedente.
La finestra superiore dà accesso al menu e ai più comuni strumen; u;li per manipolare la proteina mentre la finestra posta in basso mostra la struFura della proteina.
Manipolazione della proteina
Le icone poste soFo il menu della prima finestra consentono di manipolare la proteina.
L’icona� posta all’estrema sinistra consente di portare la proteina al centro dello schermo.
Le tre icone successive, � poste sopra la scriFa Move all, servono a trascinare, zoomare e ruotare la proteina. Una volta che l’icona è selezionata, (cliccando su di essa con il mouse) si può manipolare la proteina, mostrata nella finestra soFostante, muovendo il mouse tenendo premuto il pulsante destro.
Le icone del terzo gruppo, poste a destra,� permeFono di compiere alcune operazioni di misura come ad esempio la distanza tra atomi, gli angoli tra atomi, ecc. di cui però non ci occupiamo.
Cliccando sull’icona � a forma di pagina scriFa, situata in basso, vicino alla scriFa Move all, si apre un’altra finestra dove sono elencate molte informazioni sulla proteina, compresa la sua sequenza amminoacidica.
Control Panel
Si può aprire la finestra del Control Panel andando sul menu, cliccando su Wind e su Control Panel, vi si aprirà sulla sinistra dello schermo, una nuova finestra. Con il mouse potete trascinare la finestra del Control Panel dove meglio ritenete più opportuno e cambiare le sue dimensioni agendo sui bordi. Si usa il Contro Panel per selezionare, osservare e nascondere parte del modello agendo sui singoli amminoacidi che sono elenca; sulla sinistra della finestra. Il primo click sulla finestra l’a:va senza cambiare nulla. Quando si selezionano gli amminoacidi (group), essi diventano rossi. Si possono selezionare cliccando su ciascuno di essi o cliccando e trascinando il mouse su di essi tenendo premuto il pulsante destro. Premendo Invio sulla tas;era, gli amminoacidi scompariranno tranne quelli seleziona; (in rosso). Da notare che appare, nella colonna show del Contro Panel, un segno di spunta accanto a ciascun amminoacido selezionato, indicando che essi sono resi visibili. Può esserci un segno di spunta
� 39
anche nella colonna side indicando che i residui R degli amminoacidi sono visibili. A sinistra della colonna group ci sono altre due streFe colonne, la prima è vuota se la proteina è formata da un’unica catena, mentre se è formata da più catene in questa colonna compariranno delle leFere A, B ecc. ad indicare le varie catene presen; nel cristallo; nel Control Panel è presente una catena corrispondente ai residui amminoacidici 389-‐678, corrispondente al dominio funzionale NBD1 della proteina. La seconda colonna con;ene una h se il residuo fa parte di un alfa elica o una s se il residuo fa parte di un beta foglieFo (beta sheet). Si può selezionare la catena A semplicemente cliccando su una A qualsiasi, tu: i gruppi A diventeranno rossi, premendo Invio la catena A comparirà nella finestra. La stessa cosa vale per le h o le s, premendo su una qualsiasi verranno selezionate tuFe le alfa eliche (o le beta sheet). Se si vogliono selezionare due gruppi diversi, stacca; tra loro, basta selezionare un gruppo e poi selezionare il secondo gruppo tenendo premuto il tasto Control, una volta seleziona; premere Invio per visualizzarli.
Selezionate alcuni amminoacidi e provate a cliccare sulle colonne show, side, labl, surface (un quadrato di pun;ni) e ribn e guardate l’effeFo.
• Labl: mostra il nome degli amminoacidi seleziona;. • Surface: mostra per ogni amminoacido, aFraverso dei pun;ni, la superficie di van der
Waals. Altri ;pi di superficie sono oFenibli nel piccolo menu posto soFo il simbolo (triangolino nero).
• Ribn: disegna la struFura tridimensionale della protena Sempre tenendo premuto il pulsante del mouse e trascinandolo lungo le colonne del Control Panel si possono selezionare o deselezionare i gruppi; si può oFenere lo stesso risultato cliccando in cima alla colonna. Ricordate che potete centrare, spostare, zoomare, ruotare la figura nella finestra del display u;lizzando le apposite icone. Per visualizzare la struFura ad alfa elica (in rosso) e beta foglie: (in giallo), nel Control Panel selezionate tu: gli amminoacidi soFo la colonna ribn (tenendo cliccato control e shib sulla tas;era), dal menu Color selezionate secondary structure e dal menu display scegliete render in 3D.
Colorazione (menu Color) Deep View consente di dare diversi ;pi di colorazione al modello. La colorazione consente di evidenziare e rivelare le configurazioni struFurali e chimiche della proteina. Andare su menu Color e cliccate su:
• Secondary Structure: le alfa-‐eliche verranno colorate di rosso e i beta foglie: in giallo e le altre in grigio. Contemporaneamente la colorazione apparirà anche sul Contro Panel, nella colonna in cui compaiono piccoli quadra;.
• Secondary Structure Succession: colora le eliche e i folglie: ma l’ordine dei colori rifleFe l’ordine aFraverso cui le varie struFure compaiono nella proteina. Risulta così più facile seguire la formazione di struFure secondarie lungo la catena polipep;dica.
� 40
• Chain: colorerà di colore diversi le singole catene che possono cos;tuire una proteina. Naturalmente, se una proteina è formata da una singola catena apparirà colorata uniformemente.
• Type: gli amminoacidi vengono colora; in base alle proprietà chimiche, i gruppi non polari in grigio (da notare che mol; gruppi non polari sono verso l’interno perchè sono idrofobici), i gruppi acidi in rossi e basici in blu.
• CPK: questa operazione riporta i gruppi ai colori standard: bianco per il carbonio, rosso per l’ossigeno, blu per l’azoto e giallo per lo zolfo.
N.B Potete cambiare i colori scel; dal programma per indicare gli atomi, gli amminoacidi, le struFure secondarie, le catene o lo sfondo andando su Preferences e cliccando su color, si apriranno nuove finestre aFraverso cui potete selezionare i colori che preferite.
Menu Select Da menu Select si possono selezionare i soFomenu:
• All: seleziona tu: gli amminoacidi della proteina, premendo invio verranno mostra; • Secondary structure: permeFe di selezionare e mostrare premendo Invio varie par; della
proteina. - Helices: seleziona e mostra gli amminoacidi che formano un alfa elica, - Strand: seleziona e mostra solo le beta sheet - Coil: seleziona e mostra il resto degli amminoacidi
• Group property: permeFe di selezionare e mostrare, sempre premendo Invio, solo gli amminoacidi basici, acidi, polari o non polari.
Menu Wind Dal menu Wind si possono selezionare i soFomenu:
• Ramachandran Plot: Si usa questa finestra per giudicare la qualità del modello, consente di visualizzare i residui i cui angoli conformazionali stanno fuori dal range permesso. Si possono anche cambiare gli angoli conformazionali del modello.
• Layer Infos:questa tavola permeFe il controllo di molteplici modelli proteici, permeFendo di scegliere quale modello rendere visibile, quale muovere ecc.
� 41
• Alignment: La finestra alignment appare in basso, mostra la sequenza di amminoacidi delle proteina. Si usa questa finestra quando si confrontano due o più proteine.
Provate ora a selezionare nell’elenco degli amminoacidi la fenilalanina in posizione 508 e coloratela di blu; nell’immagine in 3D visualizzerete la posizione dell’amminoacido e nella sequenza che è comparsa soFo la figura, nella finestra Alignment, si evidenzierà l’amminoacido prescelto. Per confrontare la struFura della proteina CFTR sana con la proteina che presenta la delezione della fenilalanina nella posizione 508, aprite il file 1XMJ.pdb con il soRware Deep View (avete già aperta in 3D la proteina sana); le due proteine si appaieranno e, selezionando, nel Control Panel con un colore diverso, gli amminoacidi della zona intorno alla posizione 508, vi accorgerete che manca la fenilalanina. La struFura 1XMJ corrisponde ai residui amminoacidici 389-‐678. Per confrontare le due struFure, bisogna affiancarle nella stessa finestra. Prima avvicinare una struFura all’altra bisogna permeFere il movimento ad una sola delle due, spuntando la voce can move, in Control Panel, solo in quella che si vuole muovere ed avvicinare (nel nostro caso la 1XMJ).
� 42
Al di soFo dell’immagine in 3D c’è l’allineamento tra le due catene amminoacidiche. Per confrontare meglio le due struFure, prima di sovrapporle colorate la proteina normale (2BBO) omogeneamente in rosa (per agire su una delle due proteine, per cambiare i colori ecc., dovete scegliere il file da modificare dal menu a tendina subito soFo Control Panel). Per sovrapporre le due struFure, selezionare dal menu Fit, la voce Magic Fit. Noterete che la struFura 3D della proteina mutata si sovrappone quasi completamente alla struFura della proteina normale.
La mutazione F508del causa il mancato processamento a livello del re;colo endoplasmico della proteina CFTR. La proteina non raggiunge la membrana non perché la sua struFura è dras;camente alterata dalla mutazione, ma in quanto la maturazione post-‐traduzionale della proteina non può essere completata a causa della mancanza di un segnale specifico in cui è coinvolta la F508. La proteina con la delezione F508 non supera il severo controllo di qualità a cui sono soFoposte tuFe le proteine a livello del re;colo endoplasmico; di conseguenza, viene trasportata ai proteasomi dove viene degradata.
4. Test di autovalutazione
Un cara_ere recessivo presente sul cromosoma X: A. Si manifesta solo nelle femmine B. Si manifesta solo nei maschi C. Non viene mai trasmesso dai maschi alle figlie femmine D. Si manifesta sempre nei maschi E. Si manifesta sempre nelle femmine
La fibrosi cis<ca è una malaBa: A. Non diagnos;cabile prima della nascita B. In cui vi è un vantaggio sele:vo per gli omozigo; C. Guaribile con opportune e lunghe terapie
� 43
D. Causata da mutazioni in più di mille geni differen; E. Con una grande eterogeneità clinica
Due genitori, eterozigo< per due diverse mutazioni del gene CFTR, potranno avere: A. Solo figli sani B. Solo figli affe: da fibrosi cis;ca C. 75% figli sani e 25% affeB da fibrosi cis<ca D. 25% figli sani e 75% affe: da fibrosi cis;ca E. Figli affe: da fibrosi cis;ca in una percentuale che dipende dalla frequenza delle due
mutazioni nella popolazione
Quale tra le seguen< affermazioni sulla proteina CFTR NON è corre_a? A. Regola la secrezione degli ioni Cl-‐, Na+ e HCO3-‐ B. È una proteina trasportatrice che lega ATP C. È coinvolta nel processamento delle gligoproteine D. Regola il pH di organelli citoplasma;ci E. Possiede due regioni citoplasma<che e una regione transmembrana
La mutazione p.F508del NON: A. È localizzata nell’introne10 B. È descriFa nella proteina C. Determina la delezione di tre paia di basi D. Causa il mancato inserimento di una molecola di fenilalanina nella proteina E. È la più diffusa in Italia
Quale tra le seguen< affermazioni rela<ve alla tecnica Reverse Dot Blot NON è corre_a: A. È usata come tecnica di primo livello nella diagnosi di fibrosi cis;ca B. Richiede una PCR mul;pla C. Non richiede il sequenziamento del DNA D. Richiede più PCR su frammen< diversi E. PermeFe di analizzare simultaneamente circa ľ85% delle mutazioni più diffuse
La frequenza di portatori sani per la fibrosi cis<ca è: A. 1/25-‐30 B. 1/100 C. 1/250-‐300 D. 1/1000 E. 1/2500-‐3500
L’anamnesi di un paziente è: A. La rappresentazione del suo albero genealogico B. L’insieme dei sintomi della sua mala:a C. La terapia che deve seguire D. La sua storia sanitaria E. La sua aspeFa;va di vita
Si parla di una mutazione “de novo”: A. Quando due genitori sani, entrambi eterozigo;, hanno un figlio malato
� 44
B. Quando la mala:a compare una seconda volta nella stessa famiglia C. Quando due genitori, entrambi eterozigo;, hanno un figlio sano D. Quando la mala:a colpisce un individuo con genitori e nonni tu: sani E. Quando due genitori sani, entrambi omozigo<, hanno un figlio malato
In seguito alla mutazione p. F508del la proteina CFTR: A. Non viene prodoFa B. Viene prodoFa in quan;tà insufficiente C. Viene degradata nell’apparato di Golgi D. È presente sulla membrana, ma non è a:va E. È a:va sulla membrana, ma viene rapidamente degradata
Quale delle seguen< affermazioni rela<ve ai nucleo<di modifica< u<lizza< per il sequenziamento del DNA NON è corre_a?
A. Possono contenere isotopi radioa:vi dello zolfo o del fosforo B. Interrompono la sintesi del nuovo filamento C. Possono legare un fluorocromo alla base azotata D. Sos<tuiscono l’idrogeno in posizione 3’ con un gruppo ossidrile E. Vengono aggiun; alla mix di PCR in quan;tà circa 1000 inferiore a quella dei nucleo;di non
modifica;
Quale programma perme_e di confrontare sequenze nucleo<diche con sequenze amminoacidiche?
A. Deep view B. OMIM C. BLAST D. Ensembl E. PDB
� 45
5. Glossario
AmpliconiFrammen; di DNA o RNA prodo: da amplificazione naturale o ar;ficiale (PCR)
Bio;naVitamina (H o B7) solubile capace di legarsi a proteine cellulari (residui specifici di lisina nella struFura degli istoni)
CCDCharge-‐Coupled Device -‐ circuito integrato in grado di accumulare carica eleFrica proporzionale alla radiazione eleFromagne;ca che lo colpisce
CFTR Cys%c fibrosis transmembrane regulator -‐ proteina canale per il cloro
ChinasiEnzima che catalizza il trasferimento di un gruppo fosfato dall'ATP o da un composto fosforilato ad altra molecola
CodoneTripleFa di nucleo;di che codifica per una specifico amminoacido o interrompe la sintesi proteica (codone di stop) alla base del codice gene;co
Da Dalton -‐ unità di misura della massa atomica (uma)
DimerizzazioneReazione che coinvolge due molecole iden;che (monomeri) per la formazione di una singola en;tà molecolare (dimero)
EleFroferogrammaTracciato oFenuto dal sequenziamento del DNA caraFerizzato da una succesione di picchi, di quaFro colori diverdi ciascuno corrispondente a una diversa base azotata
EndonucleasiEnzimi idroli;ci che scindono i legami fosfodiesterici degli acidi nucleici all'interno di una molecola
Esoni Sequenza codificante del gene degli eucario;
EsonucleasiEnzimi idroli;ci che scindono i legami fosfodiesterici degli acidi nucleici all'estremità 3' o 5' di una molecola
Eterogeneità allelica Esistenza di più mutazioni in uno stesso gene che causano feno;pi diversi
Eterogeneità clinicaVariabilità individuale nei sintomi di una patologia causata da eterogeneità allelica
Eterogeneità di locus Mutazioni in geni diversi che causano una stessa alterazione feno;pica
FluorocromoSostanza che emeFe fluorescenza se colpita da fotoni con una par;colare lunghezza d'onda
Introni Sequenza non codificante del gene degli eucario;
Mosaicismo Presenza di geno;pi diversi in cellule dello stesso organismo
Mutazione frameshiRDetermina uno spostamento della cornice di leFura e produzione di una proteina alterata a valle della mutazione
Mutazione missenso Causa ľinserimento di un amminoacido diverso nella proteina
Mutazione nonsenso Sos;tuisce un codone rela;vo ad un amminoacido con un codone di stop
NIPDTecniche non invasive di diagnosi prenatale basate su analisi del sangue materno
Pedigree Albero genealogico
� 46
6. Bibliografia e Sitografia
Chehab and Wall. Detec%on of mul%ple cys%c fibrosis muta%ons by reverse dot blot hybridiza%on: a technology for carrier screening. Hum Genet. 1992;89(2):163-‐8
Cimino et al. Fibrosi cis%ca: nuove acquisizioni. Rivista Italiana di Gene;ca e Immunologia Pediatrica -‐ Italian Journal of Gene;c and Pediatric Immunology. 2012
Gabriel et al. Cys%c fibrosis heterozygote resistance to cholera toxin in the cys%c fibrosis mouse model. Science. 1994;266(5182):107-‐9
Pier et al. Salmonella typhi uses CFTR to enter intes%nal epithelial cells. Nature 1998;393:79-‐82
Prince. The CFTR advantage-‐capitalizing on quirk of fate. Nat Med 1998;4:663-‐664
O'Sullivan BP and Freedman SD. Cys%c fibrosis. Lancet. 2009;30;373(9678):1891-‐904. Review.
Rendine et al. Gene%c history of cys%c fibrosis muta%ons in Italy. I. Regional distribu%on. Ann Hum Genet. 1997;61(Pt 5):411-‐24
Saiki et al. Gene%c analysis of amplified DNA with immobilized sequence-‐specific oligonucleo%de probes. Proc Natl Acad Sci U S A. 1989;86(16):6230-‐4.
hFp://www.gene;capediatrica.it/archives/2012/number2/allega;2/12.pdf hFp://www.nlm.it/www.nlm.it/documents/SIGU_Linee_guida_Fibrosi_Cis;ca.pdf hFp://www.genecards.org/cgi-‐bin/carddisp.pl?gene=CFTR hFp : / /ww2 . un ime . i t / a c cadem i ape l o r i t a n a / pubb l i c a z i o n i / c l a s s e 2 / pd f 2006 /Relazione_tra_celiachia_e_fibrosi_cis;ca.pdf hFp://www.fibrosicis;ca-‐marche.org/fibrosi-‐cis;ca/ hFp://www.tes�c.org/Upload/DynaPages/Percorso_Specialis;_Fibrosi_Cis;ca.php hFp://cf.eqascheme.org/info/public/cf/assayrdb.xhtml hFp://www.ncbi.nlm.nih.gov/omim
Processamento Modificazioni post-‐traduzionali delle proteine
ProteasomaComplesso cellulare mul;proteico che degrada le proteine non funzionali o mal assemblate
Splicing Rimozione degli introni dal pre-‐mRNA
StreptavidinaProteina estraFa da Streptomyces avidinii, con al;ssima affinità per la bio;na, usata in immunocitochimica
Trasportatori a casseFeProteine transmembrana formate da più subunità: due domini di trasporto e due domini (casseFe) che legano ATP
� 47
hFp://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi hFp://spdbv.vital-‐it.ch/
� 48