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FilmArray system versus RT-PCR method in meningitidis and sepsis management: an example
of routine-emergency integration
Relatore: D.ssa Loria Bianchi, PhD
U.O. Laboratorio Analisi Chimico-Cliniche- Sezione Microbiologia, Ospedale S.Jacopo, Pistoia
14 ottobre, 2014
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Elenco dei microrganismi responsabili di meningiti acute
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Rapidità della diagnosi di meningite e prognosi del paziente
Meno gravi delle forme batteriche, di regola a decorso acuto, con risoluzione completa della sintomatologia
Meningite virale
Sono a liquor limpide, asettiche, iniziano con una pleiocitosi con presenza di PMN, seguita poi da aumento di linfociti
Più alta incidenza nei bambini e giovani adulti. Diagnosi: importante per escludere una meningite batterica
Meningite batterica
Postumi come sordità, cecità, paresi, ritardo mentale sono caratteristici delle forme batteriche ed assenti in quelle virali
•Haemophilus influenzae tipo b: bassa mortalità (3%) ma causa di deficit intellettivi in oltre il 30% dei bambini colpiti
•Meningite pneumococcica: alto tasso di letalità (12%), ma solo raramente lascia esiti nei sopravvissuti
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Meningite batterica • Aspetto: torbido • Globuli bianchi 1000-5000/µl • Neutrofili % > 80% • Glucosio < 34 mg/dl • R gluliquor/glusiero ≤ 0.23l
Meningite virale • Aspetto: limpido
• Linfomonociti 100-1000/ µl • Glucosio 40-80 mg/dl •R gluliquor/glusiero >0.4
In presenza di cellularità liquorale > 6-200 Leucociti/mm3 le caratteristiche dell’esame chimico-fisico hanno un VPP di meningite infettiva maggiore dell’ 80% ( 3% dei casi)
ALGORITMO DIAGNOSTICO BASATO SUL RISULTATO DELL’ESAME CHIMICO FISICO
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In presenza di un liquor : • Limpido • Incolore • Lieve e moderata pleiocitosi: 6-200 Leucociti/mm3 : 27% dei casi
totali (65/240) Prevalenza di PMN (> 60%) si esegue pannello batterico e successivamente pannello virale (12% dei casi) Prevalenza di cellule mononucleate (> 80%) si esegue il pannello virale (15% dei casi ) Presenza di pleiocitosi con PMN < 60% e cellule mononu- cleate < 80%) viene eseguito si il pannello virale che quello batterico (73% dei casi)
VPP DELL’ESAME CHIMICO-FISICO IN PRESENZA DI LIEVE E MODERATA PLEIOCITOSI
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Obiettivi
Valutare: 1. sensibilità e specificità della tecnologia FilmArray (TFA:
applicazione “off label” della metodica) su LCR rispetto alle metodiche «tradizionali» e all’RT-PCR
2. il valore predittivo negativo (VPN) della RT-PCR e della
tecnologia TFA su campioni di liquor, sangue e liquidi cavitari (pleurico, peritoneale, pericardico, articolare) con validazione clinica della metodica
3. l’efficacia nella gestione della sepsi calcolando il Turn Around
Time (TAT) rispetto alle metodiche tradizionali
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Casistica
Metodologia impiegata
240 campioni di LCR raccolti dal 2009-2014 180 campioni di sangue raccolti dal 2012-2014 9 liquidi cavitari
• Esame chimico fisico LCR : valutazione macroscopica: volume, aspetto, colore valutazione microscopica: conta delle cellule e differenziazione
• Esami biochimici (liquor/siero) ed ematologici: glicemia, elettroliti (Na, K, Cl), enzimi epatici (transaminasi, gamma-GT, etc), proteine totali, albumina, emocromo, PT, PTT;
• Esami microbiologici: estrazione degli antigeni solubili, esame colturale (piastre di agar cioccolato e sangue, etc in CO2), emocoltura (Becton Dikinson)
• Esami molecolari: Real Time Polymerase Chain Reaction (RT-PCT) Tecnologia FilmArray (TFA)
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Tecnologia FilmArray
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Microrganismi e fattori di resistenza valutati con TFA e RT-PCR su LCR e sangue
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0
2
4
6
8
10
12
N. meningitidis L. monocytogenes E. coli S. pneumoniae H. influenzae K. pnuemoniae Streptococcogruppo B
N°
pat
oge
ni r
ileva
ti
CONFRONTO TRA METODICHE: NUMERO DI PATOGENI RILEVATI NEI LIQUOR
Antigeni solubili Batterioscopico Gram Colturale liquor Emocoltura RT-PCR TFA
LIQUOR Antigeni solubili Batterioscopico
Gram Colturale liquor Emocoltura RT-PCR TFA
N. casi
Sensibilità
N. casi
Sensibilità N.
casi Sensibilit
à N.
casi Sensibilit
à N.
casi Sensibilit
à N.
casi Sensibilit
à N. meningitidis 1 33,33% 1 33,33% 1 33,33% 1 33,33% 3 100,00% 1 33,33%
L. monocytogenes - - 5 71,43% 4 57,14% 5 71,43% 7 100,00% 4 57,14% E. coli 0 0,00% 1 25,00% 1 14,29% 2 28,57% 4 100,00% 3 75,00%
S. pneumoniae 5 45,45% 5 45,45% 5 71,43% 5 71,43% 11 100,00% 8 72,73% H. influenzae 1 20,00% 1 20,00% 2 28,57% 1 14,29% 5 100,00% 3 60,00%
K. pneumoniae - - 0 0,00% 0 0,00% 1 100,00% 1 100,00% 1 100,00% Streptococco gruppo
B 0 0,00% 0 0,00% 0 0,00% 0 0,00% 1 100,00% 0 0,00%
Totale positivi 7 29,17% 13 40,63% 13 40,63% 15 46,88% 32 100% 20 62,50% VPP 100,00% 100,00% 100,00% 100,00% 100,00% 100,00% VPN 89,27% 91,63% 91,63% 92,44% 100,00% -
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CONFRONTO FRA METODICHE: NUMERO DI PATOGENI RILEVATI NEL SANGUE
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SENSIBILITÀ E VPN DELLE METODICHE PER LA RICERCA DI PATOGENI NEL SANGUE
RISULTATI SANGUE Emocoltura RT-PCR TFA
Patogeno N. casi Sensibilità N. casi Sensibilità N. casi Sensibilità
N. meningitidis 1 50,00% 2 100,00% 1 50,00%
S. pneumoniae 7 87,50% 8 100,00% 3 37,50%
H. influenzae 4 80,00% 4 80,00% 1 20,00%
E. coli 6 85,71% 5 71,43% 2 28,57%
K. pneumoniae 2 100,00% 1 50,00% 1 50,00%
S. agalactiae 3 100,00% 3 100,00% 1 33,33%
C. albicans 2 100,00% - - 2 100,00%
C. parapsilosis 1 100,00% - - 1 100,00%
Enterococco 5 100,00% - - 2 40,00%
S. aureus 8 100,00% 8 100,00% 4 50,00%
S. marcences 1 100,00% - - 0 0,00%
P. aeruginosa 7 100,00% 7 100,00% 4 57,14%
A. baumannii 1 100,00% - - 1 100,00%
S. capitis 1 100,00% - - - -
P. mirabilis 2 100,00% - - 1 50,00%
Salmonella spp. 1 100,00% - - - -
Totale positivi 52 92,86% 38 67,86% 24 42,86%
Totale germi rilevabili 56 92,86% 42 90,48% 54 44,44%
VPN 96,88% 87,32% 79,49%
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CONCLUSIONI (1)
Su LCR, la RT-PCR è la metodica più sensibile (sensibilità e VPN del 100%); inoltre, rilevando il patogeno nella matrice primaria (LCR/sangue) si riduce il TAT (2h e 20’) rispetto all’esame colturale e all’emocoltura.
Su sangue, l’emocoltura è la metodica più sensibile (92,86%) con il più elevato VPN (96.88%) e rimane il «gold» standard nella gestione della sepsi. L’RT-PCR è di grande aiuto per la rapidità di risposta (TAT= 2h e 20 min) anche se ha il limite del ridotto numero di patogeni rilevabili
Su sangue, la TFA deve incrementare la resa estrattiva per aumentare sensibilità (42.66%) e VPN (44.44%) non adeguati per il management della sepsi.
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CONCLUSIONI (2)
Su LCR la TFA ha sensibilità più elevata (65%) rispetto al batterioscopico Gram ed estrazione degli antigeni solubili. La facilità di allestimento (2-4 min operatore), di interpretazione del test e il suo TAT di 1h la rendono, quindi, la tecnica più efficace nella gestione del liquor in urgenza
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ESAME CHIMICO-FISICO LCR
PERCORSO DIAGNOSTICO NEL SOSPETTO MENINGITE INFETTIVA
Negativo
* in flaconi da emocoltura e processati in automatico nelle ore di chiusura della microbiologia **colorato e refertato entro le ore 12 del 1°gg feriale dal microbiologo RT-PCR pannello batterico e virale (vedere richiesta clinica ed esame chimico-fisico)
Approfondimento diagnostico con metodica RT-PCR in regime di urgenza – routine rapida (entro ore 12 del 1° gg feriale)
• Esame colturale su piastre agar cioccolato e sangue (37°C; CO2)* • Gram**
Positivo
Pannello batterico
• FilmArray (Pannello BCDI)
• Esame colturale su piastre agar cioccolato e sangue (37°C; CO2)* • Gram**
• FilmArray (Pannello BCDI)
Negativo
Pannello virale:
HSV-1, HSV-2, HHV-6, HHV-7 CMV EBV Parechovirus Enterovirus Varicella zoster
???
Positivo
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Collaboratori Dr. Roberto Giannecchini Dr. Fabiano Santoni Dr. Roberto Toscano Dr. Leonardo Rizzi D.ssa Rosalba Gori D.ssa Cappelli Donatella D.ssa Margherita Niccolai D.ssa Patrizia Lencioni Un grazie particolare a: D.ssa Zaleida Napoli Dr. Swan Donati Dr. Riccardo Lari: Responsabile Area Diagnostica di Laboratorio
Grazie anche a tutto il personale tecnico della microbiologia e
non solo!!
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???
ESAME CHIMICO-FISICO LCR
Positivo Negativo
*RT-PCR batterico se LCR arrivato festivo/notturno ** in flaconi da emocoltura e processati in automatico nelle ore di chiusura della microbiolobia ***colorato e refertato entro le ore 12 del 1°gg feriale dal microbiologo RT-PCR pannello batterico e virale (vedere richiesta clinica ed esame chimico-fisico)
Approfondimento diagnostico con metodica RT-PCR in regime di urgenza – routine rapida (entro ore 12 del 1° gg feriale)
se LCR festivo/notturno
• Estrazione degli antigeni solubili* • Esame colturale su piastre agar cioccolato e sangue (37°C; CO2)** • Gram***
• Estrazione degli antigeni solubili* • Esame colturale su piastre agar cioccolato e sangue (37°C; CO2)** • Gram***
Pannello batterico
Pannello virale:
HSV-1, HSV-2, HHV-6, HHV-7 CMV EBV Parechovirus Enterovirus Varicella zoster
PERCORSO DIAGNOSTICO NEL SOSPETTO MENINGITE INFETTIVA
N.meningitidis S.pneumoniae L. monocytogenes E.Coli S-agalactiae H.Influenzae K.pneumoniae
Pannello batterico:
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Sensibilità delle metodiche colturali e molecolari per la ricerca di patogeni nei liquidi cavitari
LIQUIDI CAVITARI Casi positivi rilevati con:
ESAME
COLTURALE RT-PCR TFA
Liquidi peritoneali (n=4)
E. coli 2 2 1
K. pneumoniae 1 1 1
P. aeruginosa 1 1 1
Liquidi pleurici (n=4)
S. pneumoniae 1 2 1
K. pneumoniae (KPC) 1 1 1
H. influenzae 0 1 0
Liquidi articolari (n=1)
S. aureus 1 1 1
Totale positivi 7 9 6
Sensibilità 77,78% 100% 66,67%
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Kit Produttore Patogeno Target bp
EusepScreen
Adulti Eurospital
N. meningitidis ctrA (capsule polysaccharide
export outer membrane
protein) -
S. pneumoniae lytA (N-acetomuramoyl-L-
alanine amidase) -
H. influenzae
bexA (involved in the
synthesis of the
polysaccharide capsule
structure)
-
Adenovirus L4 (hexon assembly protein) -
EusepScreen
Lattanti Eurospital
K. pneumoniae phoE (outer membrane
phospoporin protein E) -
E. coli uidB (glucuronide transporter) -
S. agalactiae sip (streptococcal surface
immunogenic protein) -
L. monocytogenes iap (invasion associated
protein) -
HSV1 HSV2 VZV R-
gene Argene
HSV1 US7 116
HSV2 US2 123
VZV gp19 114
ENTEROVIRUS R-
gene Argene Enterovirus 5' UTR 146
CMV HHV6,7,8 R-
gene Argene
CMV ppUL83 283
HHV6 U57 116
HHV7 U42 123
HHV8 ORF26 146
EBV R-gene Argene EBV BXLF1 (thymidine kinase) 169
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