fim predavanja i dio bez adresa animacija
DESCRIPTION
fiziologija ind.moTRANSCRIPT
-
FIZIOLOGIJA INDUSTRIJSKIH MIKROORGANIZAMAtemeljni modul diplomskih studija Bioprocesno inenjerstvo i Molekularna biotehnologija
doktorskog studija Biotehnologija i bioprocesno inenjerstvo 6 ECTS bodova
1. dio
izv. prof. dr. sc. Anita Slavica i prof. dr. sc. Sran Novak
1
-
sadraj
2
1. Fiziologija industrijskih mikroorganizama - uvod.............................................................3
2. Metode u fiziologiji industrijskih mikroorganizama.........................................................36
3. Biomembrane - graa i funkcija....................................................................................107
4. Biomembrane i bioenergetika.......................................................................................127
5. Transport otopljenih molekula kroz membranu stanice................................................151
6. Metabolizam - katabolizam...........................................................................................188
7. Metabolizam - anabolizam............................................................................................235
8. Struktura stanice mikroorganizma................................................................................264
-
3FIZIOLOGIJA INDUSTRIJSKIH MIKROORGANIZAMA - UVOD
-
fiziologija industrijskih mikroorganizama (1)
4
FIZIOLOGIJA
...znanost o procesima u ivim organizmima; objanjava mehanizam, uzrone veze i odnose izmeu
ivotnih pojava, istrauje ope zakone ivota, rad i funkciju pojedinih organa, tkiva i stanica; slui
se eksperimentalnim metodama fizike, kemije i biologije, pa je povezana s biokemijom i
biofizikom... (Hrvatski opi leksikon, Leksikografski zavod MK, Zagreb, 1996.)
MIKROBNA FIZIOLOGIJA
- prouava procese u mikrobnim stanicama
- interakcija i preklapanja s mikrobiologijom, genetikom, biokemijom, molekularnom biologijom
- holistiki pristup: prouava stanicu kao cjelinu
-
5fiziologija industrijskih mikroorganizama (2)
FIZIOLOGIJA INDUSTRIJSKIH MIKROORGANIZAMA
- prouava procese u stanicama mikroorganizama koji se koriste u biotehnologiji
(bakterije, kvasci, alge, plijesni, stanice biljnih i ivotinjskih tkiva)
- dvije suprotne tendencije:
uvoenje sve veeg broja novih vrsta u industrijsku proizvodnju,
ubacivanje gena iz novih, slabo poznatih vrsta, u stare, dobro poznate vrste
(ugroavanje bioloke raznolikosti)
-
6fiziologija industrijskih mikroorganizama: neki industrijski vani mikroorganizmi i njihov potencijal (1)
- (pre-)biblijski industrijski bioprocesi- vino, pivo, ocat, mlijeni proizvodii...
-20. stoljee - zlatno doba industrijske mikrobiologije: proizvodnja otapala, antibiotika, enzima,vitamina, aminokiselina, nukleotida(pojaivai okusa), polimeri, steroidi i dr.
- u ovom predavanju osvrt na industrijski primijenjene stanice:bakterija kvasacafilamentoznih fungabiljnih i ivotinjskih tkiva
-
7podsjetimo se: karakteristike stanica mikroorganizama - stanica prokariota
-
8podsjetimo se: karakteristike stanica mikroorganizama - stanica eukariota
animacija: Eukaryotic organelles
-
9usporedba karakteristika prokariotske i eukariotske stanice
karakteristika prokariot eukariot
jezgra bez membrane, nema mitoze prava jezgra, jezgrina membrana, mitoza
DNA raspored jedna molekula, bez histona vie ili mnogo kromosoma, veinom s histonima
sastav membrana nema sterola sadri sterole
respiratorni sustav dio plazmine membrane ili u membranskim organelama, mitohondrijima
mezosoma, nema mitohondrija
fotosintetske strukture na unutranjim membranama, u membranskim organelama, kloroplastima
nema kloroplasta
veliina ribosoma 70S (50S + 30S) 80S (60S + 40S), osim ribosoma u organelama(mitohondriji i kloroplasti sa 70S)
citoplazmino gibanje rijetko ili ga nema esto
stanina stijenka kemijski sloeni polimeri jednostavni polimeri i drugi organski i anorganski
(peptidoglikan) materijal
bi submikroskopske veliine, mikroskopske veliine, svaki flagelum sadri 20
svaki flagelum jedan fibril fibrila karakteristinog rasporeda (2x9)+2
seksualna reprodukcija fragmentarni proces, nema kompletan proces, mejoza, preraspodjela potpunog
mejoze, dio genskog materijala broja kromosoma
vakuole rijetko prisutne esto prisutne
-
10
podsjetimo se: primarni metaboliti
-
11
neki industrijski vani mikroorganizmi i njihov potencijal (2)
bakterije mogu se postii visoke koncentracije bakterijske biomaseAcetobacter sp. (octena kiselina)Bacillus sp. (vitamini, industrijski enzimi: amilaze, proteaze, lipaze)
Bacillus subtilis (transport proteina iz stanice - ind. primjena)Clostridium sp. (aceton, butanol)Corynebacterium sp. (aminokiseline) ( 4.5 - 109 USD; 2004)
Corynebacterium glutamicum
- proizvodnja aminokiselina: ekstrakcija iz hidrolizata proteinasinteza
biotehnoloki bioproces (cjelovita stanica biokatalizatora)enzimska kataliza (Japan)
-
12
neki industrijski vani mikroorganizmi i njihov potencijal (3)
bakterije mogu se postii visoke koncentracije bakterijske biomaseAcetobacter sp. (octena kiselina)Bacillus sp. (vitamini, amilaze, proteaze, lipaze)
Bacillus subtilisClostridium sp. (aceton, butanol)Corynebacterium sp. (aminokiseline) ( 4.5 - 109 USD; 2004)
Corynebacterium glutamicum
Escherichia coli (dominantni prokariotski biokemijski i genetiki model, domain tvornicama proteina, aceton, etanol, ...)
Lactobacillus sp. i Streptococcus sp. (mlijena kiselina)
Streptomyces sp. (vitamin B12, enzimi, antibiotici)Streptomyces coelicolor (20-tak sekundarnih metabolita)
-
13
neki industrijski vani mikroorganizmi i njihov potencijal (4)
kvasci mogu se postii visoke koncentracije kvaeve biomase etanol, mlijena kis.Saccharomyces cerevisiae (transportira heterologne proteine u podlogu,
posttranslacijske modifikacije overglikozilacija) Hansenula polymorpha (Pichia angusta; koristi metanol - metilotrof, glikozilacija)Pichia pastoris (metilotrof, glikozilacija; heterologni proteini)Pichia stipitis (obnovljive sirovine, celuloza ksiloza etanol)
filamentozni fungi - obligatni aerobitransport proteina iz stanice; organske kiseline, enzimi, polisaharidi, antibioticiAshbya gossypii (istraivanje fiziologije mikroorganizma)Aspergillus nidulans (istraivanje fiziologije mikroorganizma)Aspergillus niger (limunska kiselina)Aspergillus oryzae (-amilaza)Aspergillus terreus (biofarmaceutska ind.)Neurospora crassa (istraivanje fiziologije mikroorganizma)Penicillium chrysogenum (-laktamski antibiotici)
-
14
neki industrijski vani mikroorganizmi i njihov potencijal (5)
trite razliitih proizvoda biotehnoloke industrijske proizvodnje: 48 109 (2010)porast u 2012. godini za > 180 % (86.4 109 )
vrijednost proizvoda vs volumen
volumen proizvoda
v
r
i
j
e
d
n
o
s
t
p
r
o
i
z
v
o
d
a
farmaceutski proizvodi
fine kemikalije
dodaci preh. proizvodima
bulk kemikalije
antibiotici kiralni spojevi enzimi
vitamini antioksidansi pojaivai okusa
etanol druga otapala dodaci stonoj hrani (aminokis.) polimerni spojevi
rekombinanti proteini statini i drugi proizvodi
Biotechnology uses substances,materials or extracts derived from living cells, employing 22 million Europeans in a 1.5T endeavour, being the premier global economic growth opportunity this century....
Biotechnology will deliver solutions to unimagined problems,providing food security, health and well-being to mankind forcenturies to come.
KMA Gartland et al., Current Opinion in Biotechnology, 24S, S6-S13, 2013.
-
15
neki industrijski vani mikroorganizmi i njihov potencijal (6)
neki biotehnoloki proizvodi i ekonomska vrijednost njihove proizvodnje na poetku 21. stoljeasekundarni metaboliti
penicilinski antibiotici P. chrysogenum 4 . 109 USDcefalosporinski a. Acremonium chrysogenum 11 . 109 USD
Streptomyces clavuligerusstatini Aspergillus terreus 9 . 109 USDtaksol biljne stanice 1 . 109 USD
rekombinantni proteiniinzulin S. cerevisiae 3 . 109 USD
E. colieritropoetin chinese hamster ovary (CHO) cell 3.6 . 109 USD humani hormon rasta E. coli 1 . 109 USDinterferoni E. coli 2 . 109 USDvakcine bakterije i kvascimonoklonska antitijela hibridoma stanice 7 . 108 USD
-
16
neki industrijski vani mikroorganizmi i njihov potencijal (7)
neki biotehnoloki proizvodi i ekonomska vrijednost njihove proizvodnje na poetku 21. stoljeaenzimi
enzimi / detergenti Bacillus sp., Aspergillus sp. 6 . 108 USDenzimi / krob Bacillus sp., Aspergillus sp. 2 . 108 USDkimozin Aspergillus sp.
polimeriksantan Xanthom. campestris 4 . 108 USDpolihidroksialkanoati Alcaligenes erytrophus
DNAvakcine E. coligenska terapija E. coli
-
17
drugi industrijski vani organizmi, proizvodi i njihov potencijal (8)
- alge, stanice viih biljaka i ivotinja
- hormoni, steroidi, citokini (vanstanini proteini koji se izluuju zbog promjene funkcija stanice, npr. upala, tzv. imuno-odgovor), vanstanini polisaharidi, ergot alkaloidi, pigmenti, insekticidi, ...
- proizvodnja kiralnih (meu)spojeva i finih kemikalija npr. sinteza S-6-hidroksinorleucina(antihipertenzijski lijek Omapatrilat) visoke uinkovitostis pomou razliitih m.o. i/ili enzima mikrobnog porijekla
- proizvodnja rekombinantnih proteina transgene biljke (uljana repica - citokin enkefalin)stanice sisavaca (CHO)sustav za proizvodnju mlijeka (svinje, ovce)uro-trakt
- proizvodnja tkiva (kono, hrskavino, kotano tkivo, tkivo jetre)- proizvodnja biljaka za ishranu rastue populacije (zlatna ria s provitaminom A, -karotenske rajice, ...)
-
18
E. colipreivljava u vrlo irokom rasponu razliitih parametara bioprocesabrzo i precizno modificira svoj genom uz vrlo visoku ponovljivostrelativno se lako uzgaja, brzo raste, postie visoka koncentracija biomase u jeftinim podlogama
postiu relativno visoki prinosi odreenih proizvodareducira aktivnost proteazekod sinteze proteina izbjegava ugradnja analoga aminokiselinakontrolira promotorformiraju disulfidne vezesintetizira heterologni protein uz udio do 50% suhe tvari bakterijske biomasedobra sekrecija proteina
ne provodi posttranslacijske modifikacije proteinarelativno visok udio endotoksinaagregacija proteina (inkluzijska tijela)
neke prednosti i nedostaci domaina za proizvodnju rekombinantnih proteina (1)
animacija: Translation-Linked Protein Secretion
-
19
S. cerevisiaeGRAS (eng. Generally Regarded As Safe) nije patogen za ovjekaproizvodnja s tradicijom u industrijskom mjerilumogue neke posttranslacijske modifikacije proteina (kovalentne preinake) npr. glikozilacija
dostupan ogranien broj vektora za kloniranjeglikozilacija nije identina glikozilaciji kod sisavacagenetiki neto manje poznat od E. coli
filamentozni fungiiskustvo u proizvodnji u industrijskom mjerilumikroorganizmi pogodni za proizvodnju brojnih industrijski primijenjenih enzimaizvrstan transport proteina
relativno niska ekspresija heterolognih proteinagenetiki manje poznati
neke prednosti i nedostaci domaina za proizvodnju rekombinantnih proteina (2)
-
20
stanice sisavacaistovjetna bioloka aktivnost kao kod prirodnog proteinadostupan relativno velik broj vektora
problemi pri rastu stanica u bioreaktorustanice sporo rastuniska produktivnost bioprocesarelativno skup bioproces
stanice insekatamogu relativno visoka ekspresija ciljanog genamogue posttranslacijske modifikacije proteina (fosforilacija, glikozilacija, signalno cijepanje peptida, proteoliza)
proteini rijetko pokazuju (oekivanu) relativno visoku aktivnostrazliiti mehanizmi regulacije odreenih procesa i prijenosa informacija jo uvijek nepoznati
neke prednosti i nedostaci domaina za proizvodnju rekombinantnih proteina (3)
-
21
neki industrijski vani mikroorganizmi i njihov potencijal (9)
Time
White Biotechnology
Bio-feedstocks Replacement of fossil fuel by sugars and starch
Bio-processes Production of chemicalsusing bioprocesses, e.g. vitamins
Bio-products polymers enzymes food ingredients
Today
Marked
Thepotentialpotencijal
industrijska biotehnologija
danas vrijeme
Obnovljive sirovinezamjena fosilnih sirovina razliitimizvorima C (npr. celuloza, krob, obnovljive i dr. sirovine)
Bioprocesiproizvodnja razliitih proizvoda (npr. biokemikalija) optimiranim bioprocesima (npr. proizvodnja vitamina)
Bioproizvodi polimeri enzimi sastojci preh. proizvoda
-
22
podsjetimo se: biotehnologija podjela (the biotechnological rainbow*)
crvena biotehnologija* - zdravlje, medicina, dijagnostikaYellow Biotechnology - Food Biotechnology, Nutrition Scienceplava biotehnologija* - akvakultura, biotehnologija obale i morazelena biotehnologija* - poljoprivreda, biotehnologija okolia, biogoriva, biognojivo,
bioremedijacija i geomikrobiologijasmea biotehnologija* - biotehnologija sunih podruja i pustinjacrna biotehnologija - bioterorizam, bioloki rat, biokriminal, ratovanjepurpurna biotehnologija* - patenti, publikacije, izumi, intelektualno vlasnitvoWhite BiotechnologyGold Biotechnology - Bioinformatics, Nanobiotechnology
siva biotehnologija - biokemijsko inenjerstvo i bioprocesna tehnologija
bijela biotehnologija* - gene-based bioindustrija
uta biotehnologija* - prehrambena biotehnologija, nutricionizam
zlatna biotehnologija - bioinformatika, nanobiotehnologija
-
predobrada bioproces izdvajanje i proiavanje
priprava konanog proizvoda
sirovinabiokemikalije
ibiogoriva
istraivaki najintenzivniji dio
lanac vrijednosti u industrijskoj biotehnologiji
neki industrijski vani mikroorganizmi i njihov potencijal (10)
23
FIM
-
24
9 MORA BITI ISTA KULTURA9 MORA BITI GENETIKI STABILAN9 MORA BRZO RASTI I LAKO SE UMNAATI9 NE SMIJE BITI PATOGEN, TOKSIAN9 NE SMIJE STVARATI INFLAMATORNE TVARI9 MORA PROIZVODITI ELJENI PROIZVOD TO BRE9 POELJNA SAMOZATITA OD KONTAMINACIJE9 MORA SE LAKO ODRAVATI9 MORA BITI PRILAGOEN TEHNOLOKIM UVJETIMA
karakteristike industrijskog mikroorganizma
-
25
- dio je prirodnih stanita- u mikrobiolokoj zbirci (ATCC, DSMZ, NRRL, ...)- mutant dobiven mutagenezom- rekombinant je (rekombinacija in vivo)- r-DNA mikroorganizam (rekombinacija in vitro)
Definicija vrsteMikroorganizmi istorodni po svojim morfolokim, fiziolokim i genetikim odlikama, ali meu kojima postoji odreeni stupanj raznolikosti (varijabilnosti) dajui podvrste (subspecies), varijetete i klonove. Vie kategorije od vrste su rod, porodica, red, razred i carstvo.
Definicija sojaNajee podrazumijeva klon oznaen na temelju nekoliko tipinih, dovoljno stabilnih karakteristika po kojima se razlikuje od ostalih sojeva iste vrste.
gdje se nalazi (potencijalni) industrijski mikroorganizam
eng. the Agricultural Research Service Culture Collection, ranije poznat pod nazivomNorthern Regional Research Laboratory
-
26
izolacija iste kulture mikroorganizma
Metode:iscrpljivanjauzastopnog razrijeivanjakoritenja selektivnih podloga i razliitih uvjeta uzgoja visee kapimikromanipulacije
Prvi odabir (eng. screening): npr. razliiti indikatori, dodatak CaCO3, replika ploa, testmikroorganizam.
Drugi odabir: vrste i tekue podloge, auksonografska analiza.(auksotrof - divlji tip ili genetski modificirani divlji tip koji ne moesintetizirati odreeni organski spoj koji mu je potreban za rast; takav jespoj potrebno dodati u hranjivu podlogu u kojoj se eli uzgojiti ovajmikroorganizam)
animacija: Streak Plate Procedure
-
27
za prouavanje fiziologije odreenog mikroorganizma potrebno je:1. izolirati ga iz prirode,2. uzgojiti ga kao istu kulturu,3. prirediti ga i uvati kao trajnu kulturu (zbirka),4. moi ga uzgojiti po elji u odgovarajuem volumenu i koncentraciji s ponovljivim uspjehom.
PREMA NOVIJIM ISTRAIVANJIMA 90% BAKTERIJA JO NIJE IZOLIRANO I OKARAKTERIZIRANO JER SE NE MOGU UZGOJITI POZNATIM METODAMA!
metode mikrobne fiziologije (1)
-
28
Optimiranje uvjeta uzgoja mikroorganizma:
1. sastav podloge (izvori C, N, P, S; minerali; faktori rasta; prekursori)
2. optimalna temperatura uzgojaPSIHROFILI < 20CMEZOFILI 20 - 42CTERMOFILI 42 - 80CEKSTREMNI TERMOFILI > 80C (npr. 80 - 113C)
Termorezistentni mikroorganizmi podnose visoke temperature, ali pri njima ne rastu.
metode mikrobne fiziologije (2)
-
29
Optimiranje uvjeta uzgoja mikroorganizma (nastavak):
3. pH optimum (za bakterije uglavnom pH 6 - 8, a za kvasce i plijesni pH 4 - 6)
4. kisik (obligatni aerobi, obligatni anaerobi, fakultativni anaerobi, mikroaerofili)
5. aktivnost vodea) halofili - trebaju povienu koncentraciju soli.
slabi (1 - 6% NaCl)srednji (6 - 15% NaCl)ekstremni (15 - 30% NaCl)
Halotolerantni mikroorganizmi podnose vie koncentracije soli, ali ih ne trebaju.
b) osmofili - rastu pri visokim koncentracijama ugljikohidrata.c) kserofili - rastu na vrlo suhim supstratima.
metode mikrobne fiziologije (3)
-
30
tzv. ekstremna stanita prokariota i malog broja eukariota:
geotermalni izvori (80 - 121C)
polarni pojasevi (-20 do 20C)
kiseli (pH < 4) i alkalni (pH > 8) izvori
slana jezera (2 - 5 M NaCl)
hladne dubine (< 5C) oceana uz visoki tlak
vulkani i hidrotermalni izvori (< 400C)
Ovi su mikroorganizmi vrlo moan alat za provoenje potencijalnih industrijskih bioprocesa i to zbog stabilnosti njihovih enzima pri visokim temperaturama, ekstremnim vrijednostima pH i tlaka, visokim koncentracijama soli i organskih otapala, kao i relativno visokim koncentracijama metala.
metode mikrobne fiziologije (4)
-
31
neki primjeri enzima izoliranih iz mikroorganizama i cjelovitih stanica mikroorganizama koji obitavaju u tzv. ekstremnim stanitima, a koji nalaze primjenu u industrijskoj biotehnologiji:
mikroorganizam stanite s enzim/stanica primjena u proizvodnjitermofil visokom temp. amilaze glukoze, fruktoze (zaslaivai)
45 - 65C ksilanaze papira (izbjeljivanje)65 - 85C proteaze piva, detergenata, itd.< 85 DNA polim. rekomb. mo (gen. inenjerstvo)
psihrofil niskom temp. proteaze sira, mlijenih proizvodadehidrogenaze biosenzoraamilaze detergenata (razgr. polimera)
acidofil niskom pH vrijednosti oks. sumpora ugljenaalkalofil visokom pH vrijednost celulaze detergenata (razgr. polimera), PHBhalofil visokom konc. soli celulaze poli(-glutaminske kiseline)(PGA)piezofil visokim tlakom cjelovite stanice mo gelova i granula krobametalofil visokom konc. metala cjelovite stanice mo metala izluivanjem, bioremedijac.radiofil visokom radijacijom cjelovite stanice mo radionuklida bioremedijacijommikroaerofil niskom konc. O2 (< 21%)
metode mikrobne fiziologije (5)
-
32
jo primjera ekstremnih uvjeta u kojima rastu i preivljavaju neki mikroorganizmi
Pyrococcus sp., Pyrodictium sp. 105C (vulkanska podruja, gejziri)Sulfolobus sp. pH 1, 80C (vulkanska podruja)Bacillus alkalophilus, Natronobacterium sp. pH 10.5 (alkalna jezera)Thiobacillus ferroxidans pH 2.0 - 8.0 (rudarske isplake)Halobacterium sp. 30% NaCl (slana jezera, soljena riba)osmofilni kvasci i plijesni 50% eera (pekmez, eerni sirupi)kserofilne gljive 90% suhe tvari (brano, sueno voe)
metode mikrobne fiziologije (6)
-
33
Uzgoj mikroorganizama u laboratoriju:
1. POVRINSKI (kosi agar, Petryjeva zdjelica)2. SUBMERZNO (u tekuoj hranjivoj podlozi u epruveti,
u tikvici u termostatu ili laboratorijskom bioreaktoru
a) arni uzgoj (krivulja rasta)b) pritoni uzgojc) polukontinuirani uzgojb) kontinuirani uzgoj (kemostat)
3. NA (POLU-)VRSTIM SUPSTRATIMA/SIROVINAMA
metode mikrobne fiziologije (7)
-
34
1. A.L. Demain (2001) Genetics and microbiology of industrial microorganisms. Molecular genetics and industrial microbiology - 30 years of marriage, Journal of Industrial Microbiology & Biotechnology 27, 352-356.
2. D.C. Demirjan, F. Mors-Varas, C.S. Cassidy (2001) Enzymes from extremophiles, Current Opinion in Chemical Biology5, 144-151.
3. K. Egorova, G. Antranikian (2005) Industral relevance of thermophilic Archaea, Current Opinion in Microbiology 8, 649-655.
4. Grupa autora: Hrvatski opi leksikon, A. Kovaec (ed.) Leksikografski zavod Miroslav Krlea, Zagreb (1996).5. Grupa autora: Biotehnologija - osnovna znanja, P. Raspor (ed.), Bia, Ljubljana (1996).6. D.R. Higgins Overview of protein expression in Pichia pastoris, Current Protocols in Protein Science, J.E. Coligan, B.M.
Dunn, D.W. Speicher, P.T. Wingfield (eds.), Chapter 5: Unit5.7. (2001). 7. C.P.Hollenberg, G. Gellissen (1997) Production of recombinant proteins by methylotrophic yeasts, Current Opinion in
Biotechnology 8, 554-560. 8. J. Hugenholtz, E.J. Smid (2002) Nutraceutical production with food-grade microorganisms, Current Opinion in
Biotechnology 13, 497-507.9. M. Ikeda (2003) Advances in biochemical engineering / biotechnology, vol. 79. Springer, Berlin Heidelberg New York, pp
1-35.10. A. Kern, E. Tilley, I.S. Hunter, M. Legia, A. Glieder (2007) Engineering primary metabolic pathways of industrial micro-
organisms, Journal of Biotechnology 129, 6-29. 11. www.ebtna.net (European Biotechnology Thematic Network Association)
literatura (1)
-
35
12. O.P. Kuipers (1999) Genomics for food biotechnology: prospects of the use of high-throughput technologies for the improvement of food microorganisms, Current Opinion in Biotechnology 10, 511-516.
13. W. Leuchtenberger, K. Huthmacher, K. Drauz (2005) Biotechnological production of amino acids and derivatives: current status and prospects, Applyed Microbiology and Biotechnology 69, 1-8.
14. P. Li, A. Anumanthan, X.G. Gao, K. Ilangovan, V.V. Suzara, N. Dzgne, V. Renugopalakrishnan (2007) Expression of recombinant protens in Pichia pastoris, Applied Biochemistry and Biotechnology 142, 105-124.
15. V. Mari, B. antek: Biokemijsko inenjerstvo, A. Reetar (ed.) Golden marketing - Tehnika knjiga, Zagreb (2009).16. Z.S. Olempiska-Beer, R.I. Merker, M.D. Ditto, M.J. DiNovi (2006) Food-processing enzymes from recombinant
microorganisms a review, Regulatory Toxicology and Pharmacology 45, 144-158.
17. R.N. Patel (2001) Biocatalytic synthesis of intermediates for the synthesis of chiral drug substances, Current Opinion in Biotechnology 12, 587-604.
18. M. Rai, H. Padh (2001) Expression systems for production of heterologous proteins, Current Science 80, 1121-1128.
19. K.M.A. Gartland, F. Bruschi, M. Dundar, P.B. Gahan, M.P. Viola Magni, Y. Akbarova (2013) Progress towards the Golden Age of biotechnology, Current Opinion in Biotechnology 24S, S6-S13.
20. the ENCODE project, http://www.genome.gov/1000510721. the brain research through innovative neurotechnologies (BRAIN), http://www.humanbrainproject.eu
literatura (2)
-
36
METODE U FIZIOLOGIJI INDUSTRIJSKIH MIKROORGANIZAMA
-
37
- pomou razliitih metoda mogue je:
identificirati, okarakterizirati i izolirati (izdvojiti) pojedine mikroorganizme i proizvode u ciljane svrhe;
opisati rasprostranjenost i aktivnost odreenih mikroorganizama;
(bio)kemijsko i fizikalno-kemijsko meudjelovanje mikroorganizama i njihovih stanita;
povezanost biokemijskih reakcija u stanici i dogaanja na nivou stanice i itave populacije;
razliite biokemijske puteve i mehanizme prijenosa informacije u stanici i izvan stanice;
mehanike karakteristike stanice (npr. turgor, elastinost, ...);
raspodjelu i kretanje odreenih molekula u razliitim odjeljcima stanice;
...
metode u fiziologiji industrijskih mikroorganizama
-
38
- vizualizacija: stanice (udjel vode u stanici!)
organela
molekula (!)
neke metode koje se mogu primijeniti u istraivanju fiziologije stanice (2)
* k = 103 a K = 2102801024 Yyotta-2701021 Zzetta-2601018 Eexa-2501015Ppeta-2401012Ttera-230109Ggiga-220106Mmega-210103k ili K *kilo---102 hhecto---101 Ddeka-20100--(-)--10-1 ddeci---10-2 ccenti---10-3 mmilli---10-6 mmicro---10-9 nnano---10-12 ppico---10-15 ffemto---10-18 aatto---10-21 zzepto---10-24 yyocto-
potencija baze 2potencija baze 10simbol(i)prefiks
* k = 103 a K = 2102801024 Yyotta-2701021 Zzetta-2601018 Eexa-2501015Ppeta-2401012Ttera-230109Ggiga-220106Mmega-210103k ili K *kilo---102 hhecto---101 Ddeka-20100--(-)--10-1 ddeci---10-2 ccenti---10-3 mmilli---10-6 mmicro---10-9 nnano---10-12 ppico---10-15 ffemto---10-18 aatto---10-21 zzepto---10-24 yyocto-
potencija baze 2potencija baze 10simbol(i)prefiks
-
39
mikroskopija (1)
1. svjetlosna mikroskopija = 0.4 - 0.7 m (boje)rezolucija 0.2 m ili 200 nm (difrakcija)
- izravna (transmisijska)- fazno-kontrastna- diferencijalno-kontrastna (Nomarski)- tamnog polja
2. elektronska mikroskopija (rezolucija 1 , 100x bolja od svjetlosne) - eng. Transmission Electron Microscope (TEM)- eng. Scanning Electron Microscope (SEM)
- tehnike: diferencijalno bojanjemikrotomski presjekeng. freeze-fractureeng. freeze-etch
(TEM) (SEM)
freeze-fracture
freeze-etch
-
40
mikroskopija (2)
2. elektronskamikroskopija
-
41
difrakcija X-zraka
- = 10 - 0.01 nm- prouavanje strukture makromolekula (, 0.1 nm, 10-10 m)
difrakcija X-zraka primjer: aktivno mjesto enzima
supstrat
struktura proteina / enzima
-
42
dobivanje i analiza ekstrakta stanica
- dobivanje ekstrakta stanica: ultrazvukomosmotskim okomu tarionicima i kuglinim mlinovimaproputanjem kroz mali otvor pod visokim tlakom
- upotreba ekstrakcijskih reagensa: liza stanice i ekstrakcija (rekombinantnih) proteina iz E. coli npr. B-PER(eng. Bacterial Protein Extraction Reagent)
- analiza: izolacija i proiavanje proteina i dr. makromolekulaodreivanje enzimske aktivnosti (kinetika)primjena inhibitora i analogona
1 - vijak
2 - teflonska kuglica
3 - cilindar
4 - pokretni klip
5 - suspenzija stanica
6 - donji cilindar
7 - ekstrakt stanica
-
43
frakcioniranje staninih sastojaka: ultracentrifugiranje
- primjena ultracentrifuga- diferencijalno centrifugiranje
male brzine npr.1,000 g / 10 minsrednje brzine 20,000 g / 20 minvelike brzine 80,000 g / 1 satvrlo velike brzine 150,000 g / 3 sata
g relativna centrifugalna sila ili centrifugalni uinak
- razdvajanje u gradijentu gustoe (saharoza, CsCl)
- razdvajanje na temelju gustoe plutanja- mikroskopska, kemijska i/ili enzimska analiza razliitih frakcija stanica
animacija: The Meselson-Stahl Experiment (CsCl gradient)
animacija: Cell Fractionation (Sonication, Differential and Buoyant Density Centrifugation)
-
izdvajanje, proiavanje i analiza makromolekula: tekuinska kromatografija (1)
- kromatografija: razdjelna (tankoslojna, papirna)kromatografija u koloni: ionsko-izmjenjivaka (A)
gel-filtracija (B)bio-specifina (afinitetna) kromatografija
(npr. epoksi-aktivirana sefaroza za izdvajanje i proiavanje amilaza)
Superdex 200 HR 10/30 MonoQA - protein B - protein
44eng. Fast Protein Liquid Chromatography (FPLC)
-
izdvajanje, proiavanje i analiza makromolekula: tekuinska kromatografija (2)
- kromatografija: razdjelna (tankoslojna, papirna)kromatografija u koloni: ionsko-izmjenjivaka (C)
gel-filtracijabio-specifina (afinitetna) kromatografija
Supelcogel C-610H
.
C - oligosaharidi (G2 G7)
45eng. High Pressure Liquid Chromatography (HPLC)
-
- N- i C-terminalni tag-ovi: Strep(NH2-WSHPQFEK-COOH)
His (6 x His)GST Flag
Strep-tag
izdvajanje, proiavanje i analiza makromolekula: tekuinska kromatografija (3)
46
glutation-S-transferaza (GST), 35 kDa
FPLC
-
izdvajanje, proiavanje i analiza makromolekula: tekuinska kromatografija (3a)
47
- N- i C-terminalni tag-ovi
-
- nanoLC, hplc-chip-ms_384 hyperlink
- 2D tekuinska kromatografija (npr. IEX + RP)
izdvajanje, proiavanje i analiza makromolekula: tekuinska kromatografija i MS (4)
48
-
- GC i 2D GC
izdvajanje, proiavanje i analiza aminokiselina: plinska kromatografija (5)
GC analiza AT-1701 kolona (Alltech Heliflex) (V = 2 L, 1 : 6 split ratio)
0
50000
100000
150000
200000
250000
300000
350000
400000
450000
500000
5 7 9 11 13 15 17 19
U
(
V
)
t (min)
A
l
a
G
l
y
V
a
l
L
e
u
I
l
e
P
r
o
P
h
e
M
e
t
t
r
a
n
s
-
U
C
A
L
y
s
T
y
r
T
r
p
G
l
u
A
s
p
C
y
s
H
i
s
T
h
r
S
e
r
A
s
n
G
l
n
49
R COOH
CH
NH2
aminokiselina
izobutil kloroformatmetanol / piridin
RT / 2 min
CHR
NH
O
O
CH3
OCH2CH(CH3)2
N-alkoksikarbonil ester
derivatizacija aminokiselina
-
50
Izdvajanje, proiavanje i analiza proteina: gel elektroforeza
- gel elektroforeza (SDS-PAGE, native PAGE, IEF, 2D)
SDS-PAGE native-PAGE IEF
1 2 pI calibration kit
5.85
5.20
4.55
pH
M
W
2D elektroforeza
animacija: Gel Electrophoresis (DNA)Heat Changes Protein Structure
-
51
analiza proteina: UV/Vis spektrofotometrija
- UV/Vis spektrofotometrija
FAD-zavisna oksidaza D-aminokiselina
H3C
H3C
N
N N
NH
O
O
H
H
FADH2
C HH
C
C
C
C
H
H
H
H H
OH
OH
OH
O
PO O
O
-
PO O
O
- CH2O
H
HO OH
H HH
N
N N
N
NH2
-
52
analiza proteina: specifine (ciljane) modifikacije (1) - tokasta mutacija
ionsko-izmjenjivaka kromatografija (FPLC) - Mono Q
-
53
analiza proteina: specifine (ciljane) modifikacije (2) i kemijske modifikacije
FAD
CD
-SH + DTNB
-SH + DTNB
tokasta mutacija
-
54
aktivnost enzima: primjena mikrosenzora (O2) (1)
-
55
aktivnost enzima: primjena mikrosenzora (O2) (2)
time (min)
4 6 8 10 12 14 16 18 20
o
x
y
g
e
n
(
m
o
l
l
-
1
)
0
200
400
600
800
1000
1200
s0 (O2) (mol l-1)
0 200 400 600 800 1000 1200
v
0
(
m
o
l
l
-
1
s
-
1
)
0
2
4
6
8
10
12
14rDAO
Cys108Asp
princip: smanjenje intenziteta fluorescencije
(eng. quenching) kisikom
-
56
analiza proteina: kapilarna elektrokromatografija
- kapilarna elektrokromatografijaHPLC + CE (kapilarna elektroforeza),elektrolit prolazi kroz kolonu (kapilaru) tjeran elektrinim poljem,detekcija: UV/Vis, fluorecencija, MS i dr.
uzorak pufer pufer
kapilara
elektrode
detekcija p (2-12 bar)
V = 25 kVC jakost (A)t = 20Cp = 10-12 bar25 mM ACN/Tris.HCl, pH 8
-
57
luminiscencija: molekule odreene tvari u pobuenom stanju emitiraju svjetlost odreene valneduljine
fosforescencija: e- u orbitali vieg energetskog nivoa ima isti spin kao e- u orbitali nieg (osnovnog) energetskog nivoa, povratak e- u orbitalu nije povoljan i odvija se relativno sporo (103-100 s-1) uz emisiju fotona
fluorescencija: e- u orbitali vieg energetskog nivoa ima suprotan spin s obzirom na e- u orbitali nieg energetskog nivoa, povratak u orbitalu je povoljan i odvija se brzo (108 s-1) uz emisiju fotona
analiza proteina: fluorescentna spektrometrija
210
S0
Jaboski dijagram
S1
S2
apsorpcijahA
meukonverzija
hA hFfluorescencija T1
fosforescencija
hP
prijelaz izmeu dvaju sustava
-
58
fluorescentna spektrometrija: GFP i nekovalentno obiljeavanje proteina
amonijeva sol 8-anilino-1-naftalen sulfonske kiseline (ANS)
GFP (eng. Green Fluorescent Protein)
- npr. Aequorea victoria, Renilla reniformis, itd.
- varijacije GFP (cijan, uti, crveni,...)
- FRET (eng. Fluorescence Resonance Energy
Transfer)
- neke primjene GFP-a: obiljeavanje stanica i
organela, porijeklo stanica, marker kod fuzije,
ekspresija gena, protein-protein meudjelovanje,
lokalizacija proteina,...
oksidaza 1 + ANS
oksidaza 2 + ANS
oksidaza 3 + ANS
EX = 388 nmEM = 495-460 nm
-
59
oksidativna posttranslacijska modifikacija: FAD-zavisna oksidaza D-aminokiselina (TvDAO)
Predviena trodimenzionalna struktura TvDAO
N
N*
Cys108 is alkylated
Cys108 is oxidized to Cys-SO2H
loop Pro98-Pro112
MS
-
60
mehanizam inaktivacije: oksidacija (signalno cijepanje - fragmentacija) i agregacija TvDAO
N...nativeN*..oxidatively modifiedF...fragmentedA...apo-protein form green...activered...inactive
animacija: Life Cycle of a Protein
-
61
protona citometrija
- vrlo precizna metoda koja koristi principe apsorpcije svjetlosti, rasapa svjetlosti (eng. light scattering), pobuivanja svjetlou (eng. light excitation) i emisije svjetlosti odreene valne duljine
- tijekom analize uzorka (estica, dijelova stanice ili cijelih stanica promjera 0.5-40 m) nastaje set vieparametarskih podataka koji su karakteristini za uzorak
specifina fluorescencija
uzorak
komora
optika
hidrodinamiko fokusiranje
izvor svjetlostinpr. laser
-
- prvi spektrometar masa- prvi MS strunjak: Antoine Laurent de Lavoisier (1743-1794)
- MS analiza: prikupljanje, obrada i interpretacija spektara masa iona i njihovih fragmenata
J. B. Fenn, Nobelova nagrada za kemiju 2002. godine (1/4),Fenn J.B., Mann M., Meng C.K., Wong S.F., Whitehouse C.M. (1989) Electrospray ionization for mass spectrometry of
large biomolecules, Science, 246(4926):64-71.Karas M., Hillenkamp F. (1988) Laser desorption ionization of proteins with molecular masses exceeding 10,000 daltons,
Anal. Chem. 60(20):2299-301.
- naredna generacija MS sustava: MS putovnice (identifikacija proteoma)- naredna generacija MS strunjaka: carinski slubenik- POVIJEST I PRIPREMA UZORKA!(npr. denaturacija proteina, redukcija, alkilacija, tripsin, zaustavljanje reakcije)- komponentne MS sustava:
62
spektrometrija masa (eng. mass spectrometry, MS)
ulaz uzorka
ionizacija analizator detektorspremanje i obrada podataka
-
63
spektrometrija masa (MS): ESI (eng. ElectroSpray Ionization) (soft ionization) (1)
ulaz otopine iz nanoLC sustava ili pomou pumpe s pricom
igla ili kapilara sprej
konusna elektroda
kapilara
smjer strujanja N2
skimmer
dalje u spektrometar masa do detektora
izvor napona
+ -
kapljica otopinevrh igle ili kapilare
molekula
isparavanje otapala
Rayleigh limit
Coloumb eksplozija
konusna elektroda
kapljica otopine s viestrukim nabojem
ion
p M + p e-
p M+ + 2p e-
ionizacija
fragmentacija(CID)
q M+ r A+ s B+
p = q + r + s
-
64
spektrometrija masa (MS): ESI (eng. ElectroSpray Ionization) (soft ionization) (2)
Software: ChemStation
nanoLC
ion trap
-
65
spektrometrija masa (MS): IT (eng. Ion Trap) spektrometar masa (3)
rf napon
dodatni ac
spektar masa
pojaiva signala
m/z(u, amu, Da, Th)
eng. collision induced dissociation (CID)
NH2 R CO NH R CO NH R COOH
x y z
a b c
hyperlinksdampinggas capture scanning_ms detection_ms elimination collision trapping_msms scanning_msms
-
66
spektrometrija masa (MS): analiza FAD-zavisne oksidaze D-aminokiselina (ESI/MS)
-
67
peptid 2
slijed a.k. VEADIAGHGQEVLIR
masa (m) 1605.8
naboj (z) + 2
m/z 803.9
spektrometrija masa (MS): analiza mioglobina (nanoLC/ESI/MS, MaxRes)
Izotopi (gr. isos- isti, topos- mjesto)
su atomi istog kemijskog elementa koji
imaju isti broj protona i elektrona, a
razliit broj neutrona, zbog ega imaju
ista kemijska svojstva, ali razliiti
atomski broj.
-
68
spektrometrija masa (MS): odreivanje primarne strukture mioglobina (nanoLC/ESI/MS/MS)
298.2
383.21+
500.41+
690.9
834.5
951.61+
1008.71+
1079.71+
1192.81+
1319.71+
1432.81+
39. +MS2(804.3), 33.4-33.9min (#909-#924)
0.0
0.2
0.4
0.6
0.8
1.0
5x10Intens.
200 400 600 800 1000 1200 1400 1600 1800 2000 m/z
b2229.0
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15
VE A D I A G H G Q E V L I R
b3300.4
y2288.2
y3401.3
b4415.3
y4
b5528.2
y5629.5
y6757.4
b6599.2
b7656.3
b8793.4
b9850.6
b10978.6
b111107.5
b121206.6
b13
b14
y8
y9
y10
y121307.8
y131378.9
y141507.9
b151588.8
-
69
spektrometrija masa: on-line interpretacija i vrednovanje rezultataPeptide Mass Search: Matrix ScienceUser: Anita Email: [email protected] Search title : MS data file: C:\Dokumente und Einstellungen\Slavica\EigeneDateien\Data\DataAnalysis\Anita051202\
MyoDenaturatedDigTry051202-2\Analysis.mgf Database: SwissProt 40.39 (201563 sequences; 110352130 residues) Timestamp: 24 Jan 2003 at 08:32:44 GMT Significant hits: P02188 Myoglobin STANDARD VARSPLIC; STANDARD VARIANT; STANDARD CONFLICT FROM P02188P02188-00-00-01 Myoglobin STANDARD VARSPLIC; STANDARD VARIANT; REF. 1 FROM P02188 P02170 Myoglobin P02187 Myoglobin P14396 Myoglobin Probability Based Mowse Score
Score is -10*Log(P), where P is the probability that theobserved match is a randomevent. Individual ions scores> 40 indicate identity or extensive homology (p
-
70
in silico analiza i interpretacija MS spektara peptide sequencing (Sherenga, Spectrum Mill v2.7)User: Anita Email: [email protected]
peptide 7 (analysis via Spectrum Mill)
GGEQEGGSTAYAPSYGFESSGALH104GK
preferential ionization of His residues
N
N
O
N
O O
NN
N O
NN
O
N
Zn
2.09
2.14
2.05
2.05 2.52 109.3
108.7
112.2
94.5
127.6His 64
His 62
His 104
pentanoic acid
98.3
Fe
-
71
in silico analiza: de novo sequencing
Gln158 - Cys159 (opposite direction)
Cys145 Ile146
disulfide bond Asn192 Cys193
peptide de novo sequencing (Sherenga, Spectrum Mill v2.7)User: Anita Email: [email protected]
-
72
in silico analiza: eng. multiple sequence alignment
Pam250, ClustalW
cysteine residues are not conserved (< 30 sequences, search in TrEMBL)
Trigonopsi 1 : ---MAKIVVIGAGVAGLTTALQLLR-KGHEVTIVSEFTPGDLSIGYTSPWAGANWLTFYDGGKLADYDAVSYPILRELARSSPEAGIRLISQRS--HVLK : 94 Fusarium_s 1 : --MSNTIVVVGAGVIGLTSALLLSKNKGNKITVVAKHMPGDYDVEYASPFAGANHSPMATEE-SSEWERRTWYEFKRLVEEVPEAGVHFQKSRIQRRNVD : 97 Rhodospori 1 : MHSQKRVVVLGSGVIGLSSALILARKGYSVHILARDLPEDVSSQTFASPWAGANWTPFMTLTDGPRQAKWEESTFKKWVELVPTG------------HAM : 88 Mus_muscul 1 : ----MRVAVIGAGVIGLSTALCIHERYHPTQP-LHMKIYADRFTPFTTSDVAAGLWQPYLSDPSN-PQEAEWSQQTFDYLLSCLHSPNAEK--------M : 86 Rattus_nor 1 : ----MRVAVIGAGVIGLSTALCIHERYHPAQP-LHMKIYADRFTPFTTSDVAAGLWQPYLSDPSN-PQEAEWNQQTFDHLQSCLHSPNAEK--------M : 86 Sus_scrofa 1 : ----MRVVVIGAGVIGLSTALCIHERYHSVLQPLDVKVYADRFTPFTTTDVAAGLWQPYTSEPSN-PQEANWNQQTFNYLLSHIGSPNAAN--------M : 87 homo_sapie 1 : ----MRVVVIGAGVIGLSTALCIHERYHSVLQPLDIKVYADRFTPLTTTDVAAGLWQPYLSDPNN-PQEADWSQQTFDYLLSHVHSPNAEN--------L : 87 Oryctolagu 1 : ----MRVVVIGAGVIGLSTALCIHELYHSALQPLDMTIYADRFTPLTNTDVAAGLWQPYLSDPSN-PQEADWSRQTFNHLLSHIHSPSAEK--------M : 87 Caenorhabd 1 : --MANIIPKIAIIGEGVIGCTSALQISKAIPNAKITVLHDKPFKKSCSAGPAGLFRIDYEENTEYGRASFAWFSHLYRTTK---GSETGVK--------L : 87 Trigonopsi 95 : RDLPKLEVAMSAICQRNPWFKNTVDSFEIIEDR--SRIVHDDVAYLVEFRSVCIHTGVYLNWLMSQCLSLGATVVKRRVNHIKDANLLHSSGSRPDVIVN : 192 Fusarium_s 98 : TEKAQRSGFPDALFSKEPWFKNMFEDFREQHPS--EVIPGYDSG--CEFTSVCINTAIYLPWLLGQCIKNGVIVKRAILNDISEAKKLSHAGKTPNIIVN : 193 Rhodospori 89 : WLKGTRRFAQNEDGLLGHWYKDITPNYRPLPSS--ECPPGAIGVT---YDTLSVHAPKYCQYLARELQKLGATFERRTVTSLEQAFDG------ADLVVN : 177 Mus_muscul 87 : GLALISGYNLFRDEVPDPFWKNAVLGFRKLTPS-EMDLFPDYG-YGWFNTSLLLEGKSYLPWLTERLTERGVNLIHRKVESLEEVARGG-----VDVIIN : 179 Rattus_nor 87 : GLALISGYNLFRDEVPDPFWKSTVLGFRKLTPS-ELDMFPDYS-YGWFNTSLLLEGKSYLSWLTERLTERGVKFIHRKVASFEEVVRGG-----VDVIIN : 179 Sus_scrofa 88 : GLTPVSGYNLFREAVPDPYWKDMVLGFRKLTPR-ELDMFPDYR-YGWFNTSLILEGRKYLQWLTERLTERGVKFFLRKVESFEEVARGG-----ADVIIN : 180 homo_sapie 88 : GLFLISGYNLFHEAIPDPSWKDTVLGFRKLTPR-ELDMFPDYG-YGWFHTSLILEGKNYLQWLTERLTERGVKFFQRKVESFEEVAREG-----ADVIVN : 180 Oryctolagu 88 : GLALISGYNLFRKAVPDPSWKDTVLGFRKLTLR-ELDMFPGYS-YGWFNTSLILDGRSYLQWLTKRLTERGVKLFQRKVESFDEVAGGG-----VDVIVN : 180 Caenorhabd 88 : VSGHIQSDNLESLKQQQRAYGDIVYNFRFLDDRERLDIFPEPSKHCIHYTAYASEGNKYVPYLKNLLLEQKIEFKQQEVTSLDAVADAG-----YDVIVN : 182 Trigonopsi 193 : CSGLFARFLGGVEDKKMYPIRGQVVLVRNSLPFMASFSSTPEKENEDEALYIMTRFDG-TSIIGGCFQPNNWSSEPDPSLTHRILSRALDRFPELTKDG- : 290 Fusarium_s 194 : ATGLGSYKLGGVEDKTMAPARGQIVVVRNESSPMLLTSGVE--DGGADVMYLMQRAAGGGTILGGTYDVGNWESQPDPNIANRIMQRIVEVRPEIANGKG : 291 Rhodospori 178 : ATGLGAKSIAGIDDQAAEPIRGQTVLVKSPCKRCTMDSSDP-----ASPAYIIPRPGG-EVICGGTYGVGDWDLSVNPETVQRILKHCLRLDPTISSDGT : 271 Mus_muscul 180 : CTGVWAGALQADA--SLQPGRGQIIQVEAPWIKHFILTHDPSLGIYNSPYIIP---GSKTVTLGGIFQLGNWSGLNSVRDHNTIWKSCCKLEPTLKNARI : 274 Rattus_nor 180 : CTGVWAGALQADA--SLQPGRGQIIQVEAPWIKHFILTHDPSLGIYNSPYIIP---GSKTVTLGGVFQLGNWSELNSVHDHNTIWKSCCQLEPTLKNARI : 274 Sus_scrofa 181 : CTGVWAGVLQPDP--LLQPGRGQIIKVDAPWLKNFIITHDLERGIYNSPYIIP---GLQAVTLGGTFQVGNWNEINNIQDHNTIWEGCCRLEPTLKDAKI : 275 homo_sapie 181 : CTGVWAGALQRDP--LLQPGRGQIMKVDAPWMKHFILTHDPERGIYNSPYIIP---GTQTVTLGGIFQLGNWSELNNIQDHNTIWEGCCRLEPTLKNARI : 275 Oryctolagu 181 : CTGVWASALQPDP--LLQPGRGQIIKVDAPWVKHFIITHDPESGIYKSPYIIP---GVHAVTLGGIFQMGNWSEGNSTDDHNTIWKGCCSLEPTLKDARI : 275 Caenorhabd 183 : CAGLYGGKLAGDDD-TCYPIRGVILEVDAPWHKHFNYRD-------FTTFTIP---KEHSVVVGSTKQDNRWDLEITDEDRNDILKRYIALHPGMREPKI : 271 Trigonopsi 291 : --PLDIVRECVGHRPGREGGPRVELEKIPG----------------------VGFVVHNYGAAGAGYQSSYGMADEAVSYVERALTRPNL-------- : 356 Fusarium_s 292 : VKGLSVIRHAVGMRPWRKDGVRIEEEKLDD----------------------ETWIVHNYGHSGWGYQGSYGCAENVVQLVDKVGKAAKSKL------ : 361 Rhodospori 272 : IEGIEVLRHNVGLRPARRGGPRVEAERIVLPLDRTKSPLSLGRGSARAAKEKEVTLVHAYGFSSAGYQQSWGAAEDVAQLVDEAFQRYHGAARESKL- : 368 Mus_muscul 275 : VGELTGFRPVR--PQVRLEREWLRFGSS------------------------SAEVIHNYGHGGYGLTIHWGCAMEAANLFGKILEEKKLSRLPPSHL : 346 Rattus_nor 275 : MGELTGFRPVR--PQVRLERERLRFGSS------------------------SAEVIHNYGHGGYGLTIHWGCAMEAANLFGKILEEKNLSRMPPSHL : 346 Sus_scrofa 276 : VGEYTGFRPVR--PQVRLEREQLRFGSS------------------------NTEVIHNYGHGGYGLTIHWGCALEVAKLFGKVLEERNLLTMPPSHL : 347 homo_sapie 276 : IGERTGFRPVR--PQIRLEREQLRTGPS------------------------NTEVIHNYGHGGYGLTIHWGCALEAAKLFGRILEEKKLSRMPPSHL : 347 Oryctolagu 276 : VGEWTGFRPVR--PQIRLGREQLSAGPS------------------------KTEVIHNYGHGGYGLTIHWGCALEAAKLFGKILEEKKSSRMPPSHL : 347 Caenorhabd 272 : IKEWSALRPGR--KHVRIEAQKRTSVGNSK----------------------DYMVVHHYGHGSNGFTLGWGTAIEATKLVKTALGL----------- : 334
Cys 193
-
in silico analiza: eng. multiple sequence alignmentLactobacillus sp. alpha-amylases consisted of 412-440 amino acid residues (Vector NTI Software)
(alignment settings: ClustalW2,
slow alignment, gap open 10, gap
extension 0.20, gap distance 5,
no end gaps, clustering NJ)
-
74
in silico analiza: 3D model proteina
http://swissmodel.expasy.org
hyperlink
-
75
in silico modeli
- set primarnih informacija koji se odnosi na odreeni (mikro)organizam
- baza podataka nainjena od biokemijskih, genetikih i drugih podataka iji se meuodnos moe
opisati matematikim jednadbama
-
76
in silico modeli: razvoj metabolikog modela E. coli
reakcijegenimetaboliti
godina
razvoj
genomika era
b
r
o
j
p
u
b
l
i
k
a
c
i
j
a
rekonstrukcija odjeljaka stanice (periplazma)metabolizam stanine stijenka (fosfolipidi, murein, LPS)termodinamika reakcija
drugi putevi koritenja ugljikakarakterizacija kinonabilanca razliitih elemenata i naboja
metabolizam masnih kiselinatransport u i iz stanice - proirena verzijadio genoma
biosinteza sastojaka stanine stijenkebiosinteza kofaktorafunkcije biomase vezane uz rast stanica
sinteza aminokiselina i nukleotida
-
77
in silico model stanice patogena Mycoplasma genitalium
FtsZ protein formira prsten gdje se kasnije formira septum (dioba bakt. stanice);ordinary differential equation, ODE.
1. Odabrano 28 kljunih procesa u stanici;
2. za svaki od 28 odabranih procesa u stanici formiran matematiki model;
3. simulacija funkcioniranja stanice ograniena na korake u trajanju od t = 1 s;
4. na kraju svakog koraka dobiju se vrijednosti za 16 varijabli;
5. simulacija zavrava/zapoinje diobom stanice.
1.2.4.
5.
-
78
primjena kemostata u istraivanjima fiziologije mikroorganizama - istraivanja uz koritenje kultura uzgojenih arnim postupkom npr. tijekom uzgoja uz stresanje:
hranjiva podloga nacijepljena relativno niskom koncentracijom stanica,
stanice rastu uz stalno smanjenje koncentracije supstrata,
stanice iz eksponencijalne faze rasta.
D = - uzgoj stanica u (ne)kontroliranim (ustaljeno stanje) i ponovljivim uvjetima- stanice kemostat kulture natjeu se za limitirajui supstrat
- problemi vezani za uspostavljanje ustaljenog stanja:neidealno mijeanje (koncentracijski gradijenti)rast biomase na stijenkamakoncentriranje stanica u pjenivrijeme obrade uzorka prije analize
- kemostat
- konstantan volumen odrava se preljevnom cijevi
- supstrat ulazi u bioreaktor i troi se za rast stanica
pa je konc. supstrata u izlaznom toku manja od ulazne
- stanice u reaktoru rastu brzinom () koja je odreenadotokom svjee podloge (D), a istom se brzinom i
razrjeuju, pa je konc. stanica u reaktoru konstantna
-
79
primjena kemostata u istraivanjima fiziologije mikroorganizama
limitacija supstratom
suboptimalni uvjeti rasta stanice (glad, D!)
alarmon mutacija
(brza) promjena i prilagodba na novonastale uvjete
transport
metabolizam
respiracija
evolucija
- istraivanje odziva staninog metabolizma na promjene u okolini stanice, stupnjevite i pulsne
-
80
primjena kemostata kod in vivo istraivanja fiziologije mikroorganizama (1)
- uzorkovanje (A) i analiza (B) supstrata i vanstaninih proizvoda (B1), unutarstaninih meuspojeva (B2) i
energetskih spojeva ATP/ADP/AMP/Pi (B3) nakon pulsa glukoze u vremenu t = 0 - 120 s
A1B
B1 B2 B3
J. Villadsen, M. Reuss
(CSTR)
(vakumirane ohlaene epruvete koje sadre odgovarajuu smjesu)
stopped-flow metod a(enzimska kinetika)
komora za
mijeanje
S. cerevisiae: dinamika glikolize
A2
B1S
B1P1
B1P2
B1P3
-
81
primjena kemostata kod in vivo istraivanja fiziologije mikroorganizama (2)
- analiza (B) supstrata i vanstaninih proizvoda (B1), unutarstaninih meuspojeva (B2) i energetskih spojeva
ATP/ADP/AMP/Pi (B3) nakon pulsa glukoze u vremenu t = 0 - 120 s
Metabolic Control Analysis (MCA)
kontinuirani uzgoj, puls glukoze
(npr. S = 20 mg L-1, puls glukoze S = 1 g L-1)
promjene u koncentraciji spojeva (t s) zbog regulacije metabolizma
(promjene konc. proteina zanemarive)
BB1 B2 B3
J. Villadsen, M. Reuss
S. cerevisiae: dinamika glikolize
B1S
B1P1
B1P2
B1P3
-
82
primjena kemostata kod in vivo istraivanja fiziologije mikroorganizama (3)
- analiza (B) supstrata i vanstaninih proizvoda (B1), unutarstaninih meuspojeva (B2) i energetskih spojeva
ATP/ADP/AMP/Pi (B3) nakon pulsa glukoze u vremenu t = 0 - 120 s
Metabolic Control Analysis (MCA)
glukoza glicerol (B1P1)acetat (B1P2)
etanol (B1P3)
BB1 B2 B3
J. Villadsen, M. Reuss
S. cerevisiae: dinamika glikolize
B1S
B1P1
B1P2
B1P3
-
83
primjena kemostata kod in vivo istraivanja fiziologije mikroorganizama (4)
- analiza (B) supstrata i vanstaninih proizvoda (B1), unutarstaninih meuspojeva (B2) i energetskih spojeva
ATP/ADP/AMP/Pi (B3) nakon pulsa glukoze u vremenu t = 0 - 120 s
Metabolic Control Analysis (MCA)
promjena koncentracije unutarstaninih
meuspojeva pokazuje kontrolu metabolizma
glukoze povratnom spregom
nakon pulsa glukoze raste brzina metabolizma
glukoze za 6 puta (B1S) viak glukoze se fosforilira (heksokinaza, HK) i
tako se poveava unutarstanina koncentracija
G6P (B2) (aktivnost fosfofruktokinaze,PFK, je slaba)
PFK se aktivira zbog opadanja konc. ATP (B3) i
zbog poveanja konc. F6P (B2), AMP i ADP (B3)
BB1 B2 B3
J. Villadsen, M. Reuss
S. cerevisiae: dinamika glikolize
heksokinaza
B1S
B1P1
B1P2
B1P3
-
84
primjena kemostata kod in vivo istraivanja fiziologije mikroorganizama (5)
- analiza (B) supstrata i vanstaninih proizvoda (B1), unutarstaninih meuspojeva (B2) i energetskih spojeva
ATP/ADP/AMP/Pi (B3) nakon pulsa glukoze u vremenu t = 0 - 120 s
Metabolic Control Analysis (MCA)
opada potronja glukoze jer G6P (B2) inhibira
njezin transport (transport permeazom)
koncentracije F1,6P i GAP (B2) ostaju visoke
kroz period od 100 s zbog regulacijeglikolize i pentoza-P puta
porast konc. G6P na poetku povezan je s
porastom konc. 6P-glukonata i porastom
potronje glukoze kroz pentoza-P put
zbog toga i konc. F1,6P i GAP ostaju
relativno konstantne i visoke kroz ovaj period
BB1 B2 B3
J. Villadsen, M. Reuss
S. cerevisiae: dinamika glikolize
heksokinaza
B1S
B1P1
B1P2
B1P3
-
85
primjena kemostata kod in vivo istraivanja fiziologije mikroorganizama (6)
- analiza (B) supstrata i vanstaninih proizvoda (B1), unutarstaninih meuspojeva (B2) i energetskih spojeva
ATP/ADP/AMP/Pi (B3) nakon pulsa glukoze u vremenu t = 0 - 120 s
Metabolic Control Analysis (MCA)
koncentracija PEP (B2) opada zbog aktivacije
piruvat kinaze (PK) i to visokom konc. F1,6P
porast konc. F1,6P vodi ka brzom
opadanju konc. PEP koji se prevodi u piruvat
nakon pulsa glukoze val ugljika prenosi se niz
glikolizu
BB1 B2 B3
J. Villadsen, M. Reuss
S. cerevisiae: dinamika glikolize
B1S
B1P1
B1P2
B1P3
-
86
primjena kemostata kod in vivo istraivanja fiziologije mikroorganizama (7)
- analiza (B) supstrata i vanstaninih proizvoda (B1), unutarstaninih meuspojeva (B2) i energetskih spojeva
ATP/ADP/AMP/Pi (B3) nakon pulsa glukoze u vremenu t = 0 - 120 s
Metabolic Control Analysis (MCA)
raste konc. NADH u citoplazmi kao i konc. PO43-
(B3); PK vue 1,3-DPG; odvija se transport
glicerola iz stanice (B1P1) i smanjuje se konc.
NADH u stanici
BB1 B2 B3
J. Villadsen, M. Reuss
S. cerevisiae: dinamika glikolize
B1S
B1P1
B1P2
B1P3
-
87
primjena kemostata kod in vivo istraivanja fiziologije mikroorganizama (8)
- analiza (B) supstrata i vanstaninih proizvoda (B1), unutarstaninih meuspojeva (B2) i energetskih spojeva
ATP/ADP/AMP/Pi (B3) nakon pulsa glukoze u vremenu t = 0 - 120 s
Metabolic Control Analysis (MCA)
konc. ATP opada brzo nakon pulsa glukoze
ATP se troi za fosforilaciju (HK i PFK) bre
nego to ATP nastaje u kasnijim reakcijama glikolize
ne nastaje glikogen jer je za taj proces potrebna
visoka konc. ATP
BB1 B2 B3
J. Villadsen, M. Reuss
S. cerevisiae: dinamika glikolize
B1S
B1P1
B1P2
B1P3
-
88
NMR analiza metabolikih flukseva (1)
NMR - nuklearna magnetna rezonancija
- in vivo NMR je neinvazivna metoda odreivanja koncentracije metabolitau razliitim odjeljcima stanice
- princip: u magnetnom polju elektroni odreenog atoma krue u smjeru ovog polja;kruenjem elektrona nastaje drugo, suprotno magnetno polje oko jezgre atoma; gustoa elektrona oko jezgre atoma ovisi o vrsti jezgre i vrsti veza kod odreenemolekule (npr. metanol)B
B
metanol
-
89
NMR analiza metabolikih flukseva (2)
- princip: jezgre atoma koji imaju neparan atomski broj (npr. 1H i 13C) imaju spin (slian spinu elektrona);jezgra predstavlja nabijenu esticu koja se kree i samim time stvara magnetno polje; bez
vanjskog magnetnog polja jezgre atoma imaju tzv. sluajnu orijentaciju, primjenom magnetnogpolja jezgre ovih atoma orijentiraju se paralelno s poljem; EM se koristi za okretanje (eng. flip)spinova; koliina energije koju je potrebno uloiti za flip ovisi o jaini magnetnog polja
bez magnetnog polja magnetno polje
B
h
pobueno stanje
B
-
90
NMR analiza metabolikih flukseva (3)
- osnovne komponente NMR sustava: uzorak smjeten u magnetnom polju pobudi se pulsevimaradio frekvencije, tada magnetno polje inducira radio signalkoji se koristi za formiranje izlaznog signala, Fourier analizakompleksnih izlaznih signala formira konani spektar
- primjena: NMR analiza 31P omoguavapraenje metabolizma ugljikohidratajer se ovom metodom mogu razlikovati unutarstanini i van-stanini anorganski fosfat, zatimpirofosfat, ATP, ...;NMR analiza 13C zahtijevakoritenje spojeva bogatih naovom izotopu;metaboliko inenjerstvo
-
91
NMR analiza metabolikih flukseva (3a)
-
92
primjena radioizotopa
- Geiger i scintilacijski brojai- primjena:
stupnjevita (eng. step) ili udarna (eng. pulse-chase) pobuda(kratkotrajna pobuda radioaktivnim materijalom koji se ispire i zamjenjuje molekulama koje ne pokazuju radioaktivnost)
odreivanje redoslijeda reakcija u biokemijskim putevimapraenje ugradnje graevnih blokova u polimere
lokalizacija odreenih funkcija u staniciautoradiografija (istraivanje funkcija tkiva pod mikroskopom)analiza frakcija stanica
prouavanje transporta u stanicu
-
93
primjena radioizotopa - transport supstrata u stanicu mikroorganizma
transport glukoze u stanice kvasca Saccharomyces cerevisiae
scintilacijsko brojanje: odreivanje radioaktivnog raspada odreene tvari tj. odreivanje koliine radioaktvnosti u uzorku.U koktelu se odvijaju fizikalno-kemijske reakcije tj. energija koja se oslobaa tijekom radioaktivnog raspada prevodi se u energiju koja se mjeri scintilacijskim brojaem.
scintilacijski broja: fotoelija visoke rezolucije koja moe detektirati -estice (jezgre He), -estice (elektroni), - i x-zrake, te pozitrone, Comptonove i Angerove elektrone.
Najee su se koristile 14C, 3H i 32P tj. detektirale -estice.
-
94
- protuijela su proteini koje proizvode kraljenjacikao obranu nakon infekcije
- to su jedinstveni proteini koji prepoznajuspecifinu molekulu - antigen
- odreeni antigen izaziva sintezu odreenogproteina
- obiljeavanje fluorecentnim spojevima(fluorescentna mikroskopija, FM)
primjena protutijela
- visoka specifinost reakcije antigen-protutijelo- antigeni: proteini, DNA, RNA, polisaharidi,
organeli, druga antitijela
- heteroklonska protutijela (B-limfociti, antiserum, ivotinje)
- monoklonska protutijela (tehnologija hibridoma)
antitijelo
antigen
-
95
primjena antitijela kloniranje B-limfocita koji proizvode
jednu vrstu antitijela
(homogena monoklonalna antitijela)
B-limfociti iz imunizirane ivotinje
fuzirani s besmrtnim tumornim B-
limfocitima
animacija: Producing Monoclonal Antibodies
-
96
primjena antitijela
Primarne stanicestanice osloboene od ostalog dijela tkiva uzgojene u prikladnim uvjetimarastu i razmnoavaju se tek nekoliko generacija
Besmrtne stanice(kontinuirane stanine linije)posebni izolati koji se razmnoavaju beskonano
Hibridoma hibrid izmeu primarnih stanica B limfocita i mutiranih - tumornih stanicaB limfocita,besmrtne stanice sa znaajkama primarnih stanica
Uzgoj biljnih i ivotinjskih stanica omoguava industrijsku proizvodnjuvakcina, virusa, specifinih proteina koji se ne mogu proizvesti drugim organizmima; monoklonska antitijela u terapeutske, dijagnostike i znanstvene svrhe;specifinih metabolita biljaka i ivotinja (prehrambeni aditivi, parfemi, agrokemikalije,insekticidi, ...)
-
97
primjena antitijela
- mogunost kvalitativne i kvantitativne analizespecifinih antigena
- RIA (eng. RadioImmunoAssay; antitijela sa radioizotopom)
- ELISA (eng. Enzyme-Linked Immunosorbent Assay;antitijela s enzimom)
animacija: Enzyme-Linked Immunosorbent Assay (Direct & Indirect ELISA Method)
-
98
primjena antitijela
- imunocitokemija (antitijela s feritinom za TEM;fluorescentna antitijela za FM)
- afinitetna kromatografija (High-Performance Immuno Affinity Chromatography, HPIAC):
izdvajanje i analiza specifinih biolokih spojeva(RF, GC, CE, kiralni spojevi, tandem affinity)
analiza teofilina pomou HPIAC, kompetitivno vezanje teofilina na imuno-afinitetnu kolonu, teofilin povezan s liposomom koji sadrikarboksifluorescein kao marker
-
99
proizvodni mikroorganizam moe biti izolat iz prirode (nasumino)inducirani mutant (nasumino)konstruiran tehnologijom rDNA (selektivnost)
povijesni pregled1869 Miescher izolirao DNA1944 Avery dokazao da je genetika informacija zapisana u DNA, a ne u proteinima1953 Watson i Crick prikazali strukturu DNA modelom dvostruke uzvojnice na temelju rezultata
kristalografije X-zrakama za koji su zasluni Franklin i Wilkins1961 Marmur i Doty otkrili renaturaciju DNA ime su omoguene reakcije hibridizacije DNA1962 Arber otkrio restrikcijske endonukleaze, za njihovu purifikaciju i primjenu u genetikom
inenjerstvu zasluni Nathans i H. Smith1966 Nirenberg, Ochoa i Khorana objanjavaju genetiki kod1967 Gellert otkrio DNA ligazu, enzim koji se koristi za spajanje fragmenata DNA1972-1973 Boyer, Cohen, Berg (Stanford, UC San Francisco) razvili tehnike kloniranja1975-1977 Sanger i Barrel, te Maxam i Gilbert razvili brzu metodu za sekvencioniranje DNA (odreivanje redosljeda
nukleotida)
genetika informacija moe biti prepisana iz DNA davatelja gena (niska selektivnost)banke gena davatelja (vii stupanj selektivnosti)mRNA davatelja gena (vii stupanj selektivnosti)
genetiko inenjerstvo - tehnologija rekombinantne DNA (rDNA)
-
100
genetiko inenjerstvo
restrikcijske endonukleaze restrikcijski fragmenti i restrikcijske mape DNA ligaza: kloniranje heterologne DNA uplazmide i viruse
transformacija plazmidne ili virusne DNA ustanicu domaina
tehnike hibridizacije reverzna transkriptaza: kopiranje mRNA ucDNA (komplementarna, kopirana)
(automatsko) odreivanje redosljeda baza(eng. sequencing)
odreivanje redosljeda aminokiselinaproteina iz redoslijeda baza
genomika (sekvencioniranje ukupnoggenoma; omics)
proteinsko inenjerstvo
http://www.neb.com/nebecomm/products/productN6701.asp
-
101
vanost genetikog inenjerstva u biotehnologiji:
mogunost dobivanja rijetkih proteina iz bilo kojeg izvora u dostatnim koliinama zaistraivanje,
odreivanje redoslijeda aminokiselina u proteinima preko redoslijeda nukleotida u DNA, odreivanje redoslijeda nukleotida cijelog genoma,
proizvodnja specifinih proteina u industrijskom mjerilu, metaboliko inenjerstvo (dobivanje novih proizvoda metabolizma ubacivanjem gena za nove enzime),
razvitak vektora za ubacivanje heterolognih gena u ivotinjske i biljne stanice(transgenine ivotinje i biljke).
genetiko inenjerstvo - tehnologija rekombinantne DNA (rDNA)
-
102
baze podataka
-
103
genetiko inenjerstvo
dobivanje i prouavanje mutanata mutanti: apsolutni i uvjetni (npr. temperaturni) odreivanje redoslijeda reakcija kod biokemijskih puteva prouavanje regulacijskih mehanizama prouavanje transporta izrada genetike mape (genetike rekombinacije)
ccpA catabolite control protein A
cre catabolite responsive element
noxE NADH oksidaza (H2O)
animacije:The Meselson-Stahl ExperimentHigh-Throughput SequencingConstruction of a DNA Library
Life Cycle of an mRNAThe Polymerase Chain Reaction (PCR)Plasmid Cloning
-
104
1. L. Bachmann, W.W. Schmitt (1971) Improved cryofixation applicable to freeze etching, Proceedings of the National Academy of Sciences USA 68, 2149-2152.
2. D. Branton et al. (2005) The invention of freeze fracture EM and the determination of membrane structure, The Journal of Cell Biology 168, 174-175.
3. B.F. Brehm-Stecher , E.A. Johnson (2004) Single-cell microbiology: tools, technologies, and applications, Microbiology and Molecular Biology Reviews 68(3), 538-559.
4. B-PER Protein Extraction Reagents : http://www.piercenet.com/products.5. Fenn J.B., Mann M., Meng C.K., Wong S.F., Whitehouse C.M. (1989) Electrospray ionization for mass spectrometry of
large biomolecules, Science, 246(4926):64-71.6. A.M. Feist, B.. Palsson (2008) The growing scope of applications of genome-scale metabolic reconstructions using
Escherichia coli, Nature Biotechnology 26(6) 659-667.7. T. Ferenci (2007) Bacterial physiology, regulation and mutational adaptation in a chemostat environment, Advances in
Microbial Physiology 53, 169-229.8. Genome News Network: http://www.genomenewsnetwork.org/articles/03_01/Genomes_lit.shtml9. Grupa autora: Biochemical Engineering Principles, M. Berovi, A.W. Nienow (eds.), Faculty of Chemistry and Chemical
Technology, University of Ljubljana, Slovenia (2006).10. D.S. Hage (1999) Affinity chromatography: a review of clinical applications, Clinical Chemistry 45, 593-615.11. Huek, P. (1995) Simultaneous profile analysis of plasma amino and organic acids by capillary gas chromatography,
Journal of Chromatography B, 669, 352-357.12. Karas M., Hillenkamp F. (1988) Laser desorption ionization of proteins with molecular masses exceeding 10,000
daltons, Anal. Chem. 60(20):2299-301. 13. J.R. Lakowicz: Pinciples of Fluorescence Spectroscopy, 2nd edition , Kluwer Academic/Plenum Publishers, New York
(1999).14. V. Mari, B. antek: Biokemijsko inenjerstvo, S. Grba, P. Horvat, P. Raspor (eds.) Golden marketing - Tehnika
knjiga, Zagreb (2009).15. M. Mueller, R. Kratzer, M. Schiller, A. Slavica, G. Rechberger, M. Kollroser, B. Nidetzky (2010) The role of Cys108 in
Trigonopsis variabilis D-amino acid oxidase examined through chemical oxidation studies and point mutations C108S and C108D, Biochimica et Biophysica Acta, 1804: 1483-1491.
literatura (1)
-
105
16. A. Mueller-Taubenberger, K.L. Anderson (2007) Recent advances using green and red fluorescent protein variants, Applied Microbiology and Biotechnology 77, 1-12.
17. Plazmid: http://www.neb.com/nebecomm/products/productN6701.asp 18. A.R. Neves et al. (2005) Overview on sugar metabolism and its control in Lactococcus lactis The input from in vivo
NMR, FEMS Microbiology Reviews 29, 531-554.
19. Protein Data Bank: http://www.rcsb.org/pdb.
20. D. Santos Pontes et al. (2007) Molecular approaches: advantages and artifacts in assesing bacterial diversity, Industrial Microbiology and Biotechnology 34, 463-473.
21. A. Slavica, I. Dib, B. Nidetzky (2005) Single-site oxidation, cysteine 108 to cysteine sulfinic acid, in D-amino acid oxidase from Trigonopsis variabilis and its structural and functional consequences, Applied and Environmental Microbiology 71(12):8061-8068.
22. D. Straganz, A. Slavica, H. Hofer, U. Mandl, W. Steiner, B. Nidetzky, (2005) Integrated approach for production of recombinant acetylacetone dioxygenase from Acinetobacter johnsoni, Biocatalysis and Biotransformation 23(3-4):261-9, 2005.
23.The Genome Database: http://www.ncbi.nlm.nih.gov24. C. Trampitsch, A. Slavica, W. Riethorst, B. Nidetzky (2005) Reaction of Trigonopsis variabilis D-amino acid oxidase with
2,6-dichloroindophenol: kinetic characterization and development of an oxygen-independent assay of the enzyme activity, Journal of Molecular Catalysis B: Enzymatic 32:271-278.
25. Trodimenzionalni model proteina: http://swissmodel.expasy.org26. J.V. Shanks (1988) Metabolic engineering applications of in vivo 31P and 13C NMR studies of Saccharomyces
cerevisiae, PhD Thesis.
27. A. Trontel, et al., A. Slavica, S. Novak (2010) (analysis of amino acids) to be published.28. A. Trontel, et al., A. Slavica, S. Novak (2010) (analysis of oligosaccharides) to be published.
literatura (2)
-
106
29. J. Varnerm D. Ramkrishna (1999) Mathematical models of methabolic pathways, Current Opinion in Biotechnology 10, 146-150.
30. R.A. Weusthuis et al., Chemostat cultivation as a tool for studies on sugar transport in yeasts, Microbiological Reviews 58, 616-630.
31. J. Gunawardena (2012) Silicon dreams of cells into symbols, Nature Biotechnology 30, 838-840.32. http://www.ncbi.nlm.nih.gov
literatura (3)
-
107
BIOMEMBRANE GRAA I FUNKCIJA
-
108
biomembrane (1)
plazmina membrana: hidrofobni lipidni dvosloj irine 4-5 nm (30 -10 nm), dinamino organiziran okomitoi lateralno, predstavlja granicu ivota i smrti za stanicu
kako i gdje je nastala prva stanica ?
(ko-)evolucija citoplazme i membrane: meudjelovanje povrina i problem formiranja stanice
-
109
biomembrane - zajednike karakteristike (2)
sastoje se iz lipida (35-50%) i proteina (50-65%)
molekule lipida poredane su u neprekinuti dvostruki sloj (lipidni dvosloj)
lanci masnih kiselina su hidrofobni, dok je ostatak polaranpolarna glava: glicerol + fosforna kiselina + alkoholamin
molekula fosfolipida je amfifilna
lipidni dvosloj predstavlja osmotsku barijeru (nepropustan je za veinu u vodi otopljenih molekula)
proteini membrane (membranski proteini) otopljeni su u lipidnom dvosloju
lipidni dvosloj je dvodimenzionalna tekuina, ima dinaminu i fluidnu strukturu (velika horizontalnapokretljivost molekula lipida i proteina)
lipidomics
oko 5% gena eukariotske stanice kodira za sintezu lipida
citoplazma
periplazma
-
110
biomembrane - zajednike karakteristike (3)
lipidomics - MS/MS
ionizacija
kvadrupol
kolizijaMS
(kvadrupol, TOF, IT)
detektor,pojaiva signala
2. m/z filter1. m/z filter
-
111
biomembrane - sinteza i transport lipida (4) sinteza lipida odvija se u
endoplazmatskom retikulumu (mreici) i brzo setransportiraju do drugih organela; Golgi kompleksu i transportiraju doendosoma, vakuola, ER, plazminemembrane;mitohondrijima (kvasci i sisavci)
plazmina membrana nije odjeljakgdje se odvija autonomna sintezastrukturnih lipida, ovdje se odvijajuspecifine reakcije (protein-lipidreakcije) kao dio signalnih kaskada
sve organele sadre lipide koji sutransportirani od odjeljka gdje susintetizirani
sisavci kvasci
PL - fosfolipid
plavi PL - struktura
crveni PL - signaling
CHOL - kolesterol (sisavci)
ERG - ergosterol (kvasci)
PC - fosfatidil-kolin
PE - fosfatidil-etanolamin
PI - fosfatidil-inozitol
PS - fosfatidil-serin
PA - fosfatidna kiselina
PG - fosfatidil-glicerol
Cer - ceramid
TG - triacilglicerol
SM - sfingomijelin
GSL - glikosfingolipid
ISL - inozitol-sfingolipid
DAG - diacil-glicerol
CL - kardiolipin
Sph - sfingozin
plazmina membrana
endoplazmatski restikulum
mitohondrij
Golgi
nucleus
endosom
-
112
biomembrane - lipidi (5)
struktura lipida membrane
1 i 2 - masne kiseline
N+(CH3)3
-
113
biomembrane - lipidi (6)
struktura lipida membrane
arhebakterije: eteri glicerola i dugolananih alkohola izoprenske strukture (C20-C40)
prave bakterije i eukarioti: esteri glicerola tzv. glicerofosfolipidi (derivati fosfatidne kiseline)najei: fosfatidil-kolin (eukarioti)
fosfatidil-etanolamin (eukarioti i eubakterije)fosfatidil-serin (eukarioti i eubakterije)fosfatidil-inozitol (eukarioti)
-
114
struktura lipida membrane glicerofosfolipidi fosfatidil-glicerolbisfosfatidil-glicerol
generika imena za cijelu grupu spojeva ovisno o tome koji su radikali (acili)masnih kiselina vezani za molekulu glicerola; u pravilu su to masne kiseline sparnim brojem ugljikovih atoma (C10-C20); po strukturi to mogu biti:
1. ravni zasieni lanci: najee palmitinska (C16) i stearinska kiselina (C18; CH3(CH2)14COO-).
2. ravni nezasieni lanci (cis dvostruka veza): oleinska kiselina (C18:1; CH3(CH2)7CH=CH(CH2)7COO-).
3. razgranati lanci (prokarioti).
4. lanci sa ciklopropanom (prokarioti).
biomembrane - lipidi (7)
CH3
CO
CH3(CH2)6CH2C
O
COH3C
H3C
CO
H3C
-
115
biomembrane - lipidi (8)
pored glicerofosfolipida u grai lipida membrane sudjeluju iglikolipidi (oligosaharidi vezani na glicerofosfolipid)steroli (kolesterol, zimosterol, ergosterol)
steroli stabiliziraju membranu i poveavaju fluidnost membrane; regulacija fluidnosti membrane od bitne jevanosti za stanine funkcije, naroito za funkcije proteina membrane.
fluidnost lipidnog dvosloja ovisi o strukturi lipida membrane
-
116
biomembrane - lipidi (9)
osnovne funkcije lipida u stanici:
spremite energije i spojeva (m. kis. i steroli) za biogenezu membrana stanice
polarni lipidi dio su matriksa staninih membrana (entropijski povoljna reakcija asocijacijehidrofobnih dijelova lipida, kao i njihovih hidrofilnih dijelova koji reagiraju jedni s drugima i smolekulama vode, osnova je spontanog formiranja membrana/organela)
osim barijere, lipidi omoguavaju pupanje, fuziju i druge promjene membrana kojesu preduvjet za procese diobe stanice, reprodukcije i transporta
lipidi sudjeluju u procesima prijenosa signala/informacija u membrani (hidrofobni dio) icitosolu (hidrofilni dio)
-
117
biomembrane - lipidi: struktura i signaling (10)
hidrofobnost
(eng. messenger lipids)
-
118
biomembrane - lipidi (11)
osnovne funkcije lipidnog dvosloja:
osmotska barijera
smjetaj proteina membrane koji obavljaju brojne funkcije membrane:
- transport odreenih molekula u stanicu i iz stanice- oksidoredukcijske reakcije (respiracijski lanac)- fosforilacija (H+-ATP-sintaze)- fotofosforilacija- biosinteza stanine stijenke- primanje signala iz okoline stanice (proteini-receptori)- povezivanje citoskeletona i vanjskog omotaa (strukturni proteini)- pretvorba energije potrebne organelima za proces pokretanja
prokarioti: sve pobrojane funkcije odvijaju se u plazminoj membrani; ako ova povrina nije dostatna zapotrebe stanice, onda se obino povrina membrane poveava invaginacijom u obliku mjeinica, cjevica,membranskih slojeva i tilakoida
eukarioti: stanice su znatno vee, pa je i omjer povrine i volumena znatno manji; manjakmembranskepovrine nadoknauje se unutarstaninim membranama koje formiraju odvojene odjeljke stanice -organele; kod ivotinjskih stanica plazmina membrana ini samo 2-5% ukupnih membrana stanice.
citoplazma
periplazma
-
119
biomembrane - proteini (12)
veina proteina membrane ugraeno je u lipidni dvosloj hidrofobnim interakcijama sa lipidnim molekulama
nano-motor za pumpanje protona
mitohondrijska sekundarna
pumpa
citosol pH 7,4
matriks pH 7,4
membrana
membrana
meumembranskiprostor mitohondija pH 7,0
animacija: ATP Synthase Mechanism
-
120
biomembrane - odjeljci stanice (13)
-
121
organele s dvostrukom membranomjezgra mitohondrij
kloroplast
biomembrane - organele (14)
-
122
organele s jednostrukom membranom
endoplazmatska mreica (retikulum) Golgijev kompleks (usmjeravanje proteina ka razliitim odreditima)
lizozom peroksizom
biomembrane - organele (15)animacija: Vesicle Budding and Fusing
-
123
biomembrane - organele (16)
-
124
biomembrane (17)poveimo prvo predavanje i biomembrane: proizvodnja aminokiselina s pomou bakterija C. glutamicum i
E. coli - transport molekula i iona u stanicu i iz stanice
-
125
biomembrane (18) transport vezikulama kod eukariota
a1, a2, a3, a4-izoforme ATPaze
animacija: Vesicle Budding and Fusing
Protein Secretion
-
126
1. A. Burkovski, R. Krmer (2002) Bacterial amino acid transport proteins: occurence, functions, and significance for biotechnological applications, Applied Microbiology and Biotechnology 58, 265-274.
2. G. Griffiths (2007) Cell evolution and the problem of membrane topology, Nature Reviews 8, 1018-1024.3. Grupa autora: Molecular biology of the cell, B. Alberts, D. Bray, J. Lewis, M. Raff, K. Roberts, J.D. Watson (eds.),
Garland Publishing, Inc., New York (1983).4. Grupa autora: Biology of the procaryotes, J.W. Lengeler, G. Drews, H.G. Schlegel (eds.) Georg Thieme Verlag, Stuttgart,
Germany (1999).5. Grupa autora: Applied Microbial Physiology, P.M. Rhodes, P.F. Stanbury (eds.), IRL Press at Oxford University Press,
Oxford, UK (1997).6. V. Marshansky, M. Futai (2008) The V-type H+-ATPase in vesicular trafficking: targeting, regulation and function, Current
Opinion in Cell Biology 20, 415-426.7. S. Martens, H.T. McMahon (2008) Mechanisms of membrane fusion: disparate players and common principles, Nature
Reviews 9, 543-556.8. A.G. Moat, J.W. Foster: Microbial physiology, 3rd edition, A.G. Moat, J.W. Foster (eds.), Wiley-Liss, New York, USA
(1995).9. G. van Meer, D.R. Voelker, G.W. Feigenson (2008) Membrane lipids: where they are and how they behave, Nature
Reviews 9, 112-12410. C. Wolf, P.J.Quinn (2008) Lipidomics: practical aspects and applications, Progress in Lipid Research 47,15-36.
literatura
-
127
BIOMEMBRANE I BIOENERGETIKA
-
128
bioenergetika (1) bioenergetika prouava molekulske mehanizme pretvorbe energije u ivim stanicama
sa gledita termodinamikeiva stanica je NEIZOLIRANI, OTVORENI SUSTAV to znai da moe obavljati izmjenu
tvari i energije s okolinom;
iva stanica je vrlo ureena struktura (niske entropije) koja ima sposobnost
samoreprodukcije pretvorbom jednostavnih kemijskih spojeva iz okoline;
(iva stanica naizgled prkosi II zakonu termodinamike; meutim,...)
IVA JE STANICA KEMIJSKI SUSTAV KOJI DJELUJE U UVJETIMA KONSTANTNOG TLAKA,
VOLUMENA I TEMPERATURE I PROVODI PRETVORBU ENERGIJE IZ JEDNOG OBLIKA U
DRUGI, U SKLADU SA ZAKONIMA TERMODINAMIKE.
-
129
bioenergetika (2)
STANICA NE MOE PROIZVODITI ENERGIJU IZ NIEGA (I zakon termodinamike), NITI MOE TERMALNU ENERGIJU PRETVARATI U DRUGE OBLIKE SLOBODNE ENERGIJE (II zakon
termodinamike)
POVEANJE REDA (SMANJENJE ENTROPIJE) U STANICI POSLJEDICA JE POVEANJA NEREDA (ENTROPIJE) U OKOLINI STANICE
-
130
bioenergetika (3) iva stanica koristi ove izvore energije:1. KEMIJSKA ENERGIJA (sva iva bia)
1.1. reducirani spojevi (SUPSTRATI: metan, alkani, alkoholi, organskekiseline, ugljikohidrati, H2, H2S, NH3, itd.; KOENZIMI:NAD(P)H + H+, FAD(H2), FMN(H2))
1.2. spojevi sa velikom energijom hidrolize (SUPSTRATI: 1,3-BPG, PEP, PP, acetil-CoA,
acetil-fosfat; KOENZIMI: ATP, ADP, GTP i drugi trifosfonukleotidi)
1.3. gradijent protona (p)
2. ENERGIJA SVJETLOSTI (h)
-
131
bioenergetika: transmembranski gradijent protona pokree niz energetskih procesa u stanici (4)
potencijal elektrona
E
GRADIJENT PROTONA
p
proizvodnja topline
sinteza NADPH
aktivni transport
rotacija bakterijskih
flagelaATP
~P
-
132
kemijske reakcije koje u ukupnosti ine metabolizam stanice dijele se na katabolike i anabolike
KATABOLIZAM ANABOLIZAM
razgradnja sinteza
dobivanje energije troenje energije
dobivanje ATP troenje ATP
dobivanje ekvivalenata redukcije troenje ekvivalenata redukcije
poveanje entropije smanjenje entropije
energetski metabolizam biosinteza staninog materijala
bioenergetika: metabolizam stanice (5)
-
133
dobivanje ATP u katabolikim reakcijama odvija se na tri naina:1. fosforilacija u lancu supstrata (citoplazma, glikoliza)
2. oksidativna fosforilacija (biomembrane)
3. fotofosforilacija (biomembrane)
oksidativna fosforilacija (stanino disanje ili respiracija)prokarioti: plazmina membrana
eukarioti: unutranja membrana mitohondrija
povezivanje oksidativne fosforilacije i reakcije ATP-sintaze: oksido-redukcijske reakcije u membranidovode do stvaranja transmembranskog protonskog gradijenta; tok protona niz gradijent
koncentracije kroz protonski kanali (podjedinica F0 ATP-sintaze) dovodi do sinteze ATP iz ADP i
fosfata na podjedinici F1 ATP-sintaze
bioenergetika: dobivanje ATP (6)
-
134
prijenos elektrona - kemiosmotski mehanizam prijenos elektrona i stvaranje gradijenta protona
npr. procesi oksidacije metabolitaili h
proteini membrane
(lanac za prijenos elektrona)
ion-nepropusna membrana
ion-nepropusna membrana
ion-nepropusna membrana
transmembranski gradijent protona (p)
-
135
prijenos elektrona i fosforilacija ADP (eng. electron-transport-coupled phosphorylation, ETP)
standardni redoks potencijal (E0) razliitih donora i akceptora elektrona pri pH 7lanac za prijenos elektrona i ATP-sintaza u
citoplazmatskoj membrani bakterija
Dred donor (npr. sukcinat)
Aox akceptor (npr. O2)
cilj: sinteza ATP
oxphos
redoks parovi
Acetaldehid / etanolPiruvat / laktatDHAP / glicerol-POksaloacetat / malat
Fumarat / sukcinatNO2- / NH4+Trimetilamin oksid / trimetilaminDimetilsulfoksid / dimetilsulfid
-
136
QH2
aerobna i anaerobna respiracija (disanje) kod E. coli
glicerol-3-P dehidrogenaza
NADH dehidrogenaza
formijat dehidrogenaza
sukcinat dehidrogenaza
hidrogenaza
laktat dehidrogenaza
fumarat reduktaza
nitrat reduktaza
nitrit reduktaza
dimetil sulfoksid reduktaza
trimetilamin-N-oksid reduktaza
quinol oksidaza
fumarat
sukcinat
NO3-
NO2-
NO2-
NH4+
(CH3)2S=O
(CH3)2S
(CH3)3NO
(CH3)3NH+
O2
H2O
glicerol-P
DHAP
NADH
NAD+
HCO2-
CO2
sukcinat
fumarat
H2
2 H+
laktat
piruvat
Q
ubikinon/ubikonol, menakinon/menakinol ili
demetilmenakinon (-ol) je redoks medijator izmeu
dehidrogenaza i reduktaza (E. coli)
donori e-
(redukcija Q)
Q
akceptori e-
(oksidacija Q)
glc (aer)
animacija: Electron Transport: Aerobic and Anaerobic Conditions
-
137
RL eukarioti (unutranja membrana mitohondrija)
e- e- e-
kompleks I (protonska pumpa) NADH ubikinon oksidoreduktaza (L-oblik kod svih organizama)
kompleks II sukcinat dehidrogenaza (sukcinat kompleks II ubikinon)
kompleks III (protonska pumpa) ubikinol cytokrom c oksidoreduktaza (citokrom bc1 kompleks)
kompleks IV (protonska pumpa) citokrom c oksidaza
kompleks V F1F0-ATP sintaza (F0 pumpanje protona, F1 katalitika domena, sinteza ATP)
ATP energetska moneta u stanici
animacija: Electron Transport Chain
animacija: ATP Synthase Mechanism
-
138
RL protonske pumpekompleks I (protonska pumpa) NADH ubikinon oksidoreduktaza
NADH FMN FeSred QoksNAD+ FMNH2 FeSoks Qred
kompleks III (protonska pumpa) ubikinol cytokrom c oksidoreduktaza (citokrom bc1 kompleks)
QH2 cyt b (+3) FeS (+2) cyt c1 (+3) cyt c (+2)
Q cyt b (+2) FeS (+3) cyt c1 (+2) cyt c (+3)
kompleks IV (protonska pumpa) citokrom c oksidaza
cyt c (+2) cyt a (+3) cyt a3 (+2) Cu (+2) H2Ocyt c (+3) cyt a (+2) cyt a3 (+3) Cu (+1) O2
-
139
lanci za prijenos elektrona kod prokariota (Azotobacter vielandii) i eukariotaciklus limunske kiseline
(mitohondrij)
1135 mV
ulaz e- u RL
razgranati lanci za transport elektrona
NADH + H+
NADPH + H+
NADH + H+
-
140
neciklika oksidativna fosforilacija
FOTOSUSTAV I (+)
FOTOSUSTAV II
alge, fitoflagelati, zelene biljkefotosinteza (fotoliza vode) H2O + NADP+ NADPH + H+ + O2h
h h
1 V
1 V
(u tilakoidima)
NADPH + H+
animacija: Harvesting Light
-
141
RL: usporedba fotofosforilacije i oksidativne fosforilacijeQ - prijenosnik e- slian ubikinonu
e-
e-
e-
b-ckompleks
b-fkompleks
b-c1kompleks
citokromoksidaza
-
142
regulacija transporta H+ za sintezu citosolnog ATP (1)
-
143
regulacija transporta H+ za sintezu citosolnog ATP (2)
-
144
regulacija transporta H+ za sintezu citosolnog ATP (3)
-
145
regulacija transporta H+ za sintezu citosolnog ATP (4)
-
146
RL: ovjek kompleks I kompleks II kompleks III kompleks IV kompleks V
sukcinat fumarat
-
147
bioenergetika: neki vani energijom bogati spojevi ATP/ADP/AMP i ATP-Mg2+ kompleks
Oadenin
OH
O CH2P
O-
O-
O
OP
O-
O
OP
O-
O
HO
N
N
N
N
NH2
ribozaadenozin
trifosfat
ATP
ADP
AMP
OCH2O- OP
O-
O
OP
O-
O
N
N
N
N
NH2
OHHO
OCH2O- OP
O-
O
N
N
N
N
NH2
OHHO
OCH2
N
N
N
N
NH2
OHHO
O OP
O
O
P
O OP
O
O
Mg2+
O
O
ATP-Mg2+ kompleks
anhidro-veze
-
148
ATP - energetska moneta stanice promjena standardne slobodne energije hidrolize nekih energijom bogatih spojeva u fiziolokim uvjetima
reakcija G0 (kJ mol-1)
PEP piruvat + ortofosfat -61.91,3-DPG 3-PG + ortofosfat -54.5acetil-P acetat + ortofosfat -42.3ATP AMP + difosfat -37.4acetil-CoA acetat + koenzim A -35.1aminoacil-tRNA aminokiselina + tRNA -35.1ATP ADP + ortofosfat -34.5difosfat 2 ortofosfata -33.4glc-1-P glukoza + ortofosfat -20.9alanin-glicin alanin + glicin -16.7glc-P glc + ortofosfat -13.8
ATP se po standardnoj slobodnoj energiji hidrolize nalazi izmeu spojeva koji sudjeluju u energetskommetabolizmu prilikom izgradnje organske tvari i spojeva koji predstavljaju graevne blokove za izgradnjuosnovnih sastojaka stanice (povezuje procese katabolizma i anabolizma)
-
149
hipoteza: integracija organela za pridobivanje energije u eukariotsku stanicu ili evolucija oksidativne fosforilacijeH+
ATP ADP + Pi
H+
ADP + Pi ATP
H+
e-
H+
e-
1
2
3
fermentacija (proizvodnja kiselina), unutarstanino zakiseljevanje pumpanje H+ izvan stanice na raun energije hidrolize ATP
pumpanje H+ bez hidrolize ATP, ATP seuva za druge procese u stanici, membranski
proteini energiju dobivenu tijekom prijenosa
e- sa razliitih molekula koriste za
pumpanje H+ izvan stanice
donori
akceptori
molekule razliitog redoks potencijala
nefermentabilne organske kiseline
elektrokemijski gradijent (p) nastao djelovanjem respiratornog (disajnog) lanca (RL) koristi se za
pumpanje H+ natrag u stanicu i na raun ovog
transporta (pridobivene energije) fosforilira se ADP
animacija: The Evolution of Cellular Organelles
-
150
1. A. Barrientos (2002) In vivo in organello assessment of OXPHOS activities, Methods 26, 307-316.2. Grupa autora: Molecular biology of the cell, B. Alberts, D. Bray, J. Lewis, M. Raff, K. Roberts, J.D. Watson (eds.),
Garland Publishing, Inc., New York (1983).3. Grupa autora: Biology of the procaryotes, J.W. Lengeler, G. Drews, H.G. Schlegel (eds.) Georg Thieme Verlag, Stuttgart,
Germany (1999).4. Grupa autora: Applied Microbial Physiology, P.M. Rhodes, P.F. Stanbury (eds.), IRL Press at Oxford University Press,
Oxford, UK (1997). 5. M. Huettemann, I. Lee, A. Pecinova, P. Pecina, K. Przyklenik, J.W.Doan (2008) Regulation of oxidative phosphorylation,
the mitochondrial membrane potential, and their role in human disease, Journal of Bioengineering and Biomembrane 40, 445-456.
6. M. Klingenberg (2008) The ADP and ATP transport in mitochondria and its carrier, Biochimica et Biophysica Acta 1778, 1978-2021.
7. A.G. Moat, J.W. Foster: Microbial physiology, 3rd edition, A.G. Moat, J.W. Foster (eds.), Wiley-Liss, New York, USA (1995).
8. H. Schaegger (2002) Respiratory chain supercomplexes of mitohondria and bacteria, Biochimica et Biophysica Acta1555, 154-159.
9. J. Vonck, E. Schfer (2008) Supramolecular organization of protein complexes in the mitohondrial inner membrane, Biochimica et Biophysica Acta , doi:10.1016/j.bbamcr.2008.05.19.