Flow CytometerQuality Control

美商貝克曼庫爾特公司台灣分公司經銷商台灣信錡股份有限公司

技術專員 林姿嫻2009/03/31

PurposePurpose

• 流式細胞技術是一項應用於臨床以及醫學研究實驗室，對不同細胞群體進行多參數動態分析的技術，能同時檢測細胞表面與胞內抗原表達、DNA定量分析及細胞功能評估。一般通過細胞表面抗原的表達及染色的強度，來鑑別特定細胞亞群的存在和含量，以達到疾病診斷及疾病研究的目的，例如評測病患基礎細胞免疫。

• 流式檢驗報告的正確與否與分析前、分析中和分析後的多種因素相關，如何使各相關因素都得到控制，建立一套確實可行的品質控制體系，進而保證檢驗品質，是國內外各類實驗室多年來追求的主要目標。

ObjectivesObjectives

Daily• Checking optic alignment and fluid system using Flow-Check

• Standardization for Voltage of each parameter using Flow-Setcompensation for spectral overlap when more than one dye is

used

• Run a control such as Immuno-Trol or Cyto-Trol Control Cells to monitor accuracy of procedure

Monthly• Run Immuno-Brite to check the linearity of the log data

1.光學系統及液流系統的校準-每日

流式細胞儀主要由1.光學系統 2.液流系統 3.電子系統 以及4.電腦系統所組成。美國臨床檢驗室標準委員會(National Committee for Clinical Laboratory Standards，NCCLS) 建議應定期依製造廠商建議流程進行各系統之校準。

在評估流式細胞儀的各個系統設置上，首先必須注意光學系統的校準。它對於獲得足夠靈敏度的光學信號是非常重要的，同時它也是正確調節螢光補償的必要前提。

此外，當液流系統順暢無阻塞時，方能確保每顆細胞能夠精準的通過細胞流動室(Flow Cell)，讓雷射光源精準的掃描到每一顆細胞。

光學系統以及液流系統之校準建議使用大小均一（10 um）、浸染螢光染料的塑膠微球(Flow-Check Fluorospheres)作為標準品管液，依照製造廠商建議的儀器設定來分析標準微球，將各個參數的平均螢光讀值(Mean Channel Number)以及變異係數(HPX-CV) 詳實記錄於校準日誌中，或者以Levy-Jennings Charts方式繪圖統計，以利日後的長期監控。每間實驗室應在更換每批標準品管液時，建立常規校準用的儀器條件設定，並建立自己的期望值，當每日校準評測的結果超出期望值時，則必須請原廠維修工程師進行光學系統的調挍，才可進行常規檢驗。

Daily 1. Flow-Check Fluorospheres: Optic and Fluid Alignment

紀錄 FS，FL1-FL4 的 HPCV 和Peck Mean (or Peck Position)

評估：

HPCV< 3

Peck Mean 落於 ± 2SD 間(SD由20次分析值計算而得)

繪製每個參數 HPCV 和 Mean 的Levey-Jennings Chart

LeveyLevey--Jennings ChartsJennings Charts

2.2.散射光及螢光強度標準化散射光及螢光強度標準化--每日每日當液流系統以及光學系統校準完成後，接著使用Flow-Set™

Fluorospheres 標準品管液來校正電子系統(High Voltage and Gain)以標準化流式細胞儀的散射光以及螢光強度。

Flow-Set™ Fluorospheres 標準品管液為模擬正常人類白血球大小(3.6 µm)以及陰性螢光表現的塑膠微球(fluorescence emission ranges from 525 nm to 700 nm when excited at 488 nm)，設計作為細胞表面抗原免疫分型(immunophenotype)分析的標準品(DNA 分析則建議使用雞的紅血球作為標準品) 。

各個實驗室自行依照檢驗項目設定分析檢體的目標螢光強度(Target Channels)，例如將FS Lin訊號強度定位在Channel =100，然後記錄將 Flow-Set™ 微球調至相同的散射光以及螢光強度時，所使用的偵測器電壓值(HV)以及Gain值。每使用一批新的標準品管液，必須在5天內進行至少20次測試，建立平均值(Average)以及可接受的變化範圍(Average ±2SD or ±1%)。每更換一次微球的批號，也都需要重新建立這個範圍。

藉由Flow-Set™ Fluorospheres能夠排除掉由於儀器本身光學系統以及電子系統的耗損或定期維修校正，所造成分析檢體的散射光及螢光強度的改變，讓不同時間分析的實驗數據能夠相互進行比對。

Daily 2. Flow-Set Standardization

Example of an instrument protocol using FLOW-SET Fluorospheres to standardize a flow cytometer for four-color analysis.

A table to record FLOW-SET Fluorospheres peak intensities, high voltage and gain/total gain settings when establishing fluorescence and/or light scatter target ranges.

A table to record FLOW-SET Fluorospheres peak intensities, high voltage and gain/total gain settings when establishing instrument HV/Total Gain Ranges.

繪製每個參數 Voltage 的 Levey-Jennings Chart

3.3.螢光補償螢光補償(Compensation)(Compensation)校正校正--每日每日

螢光補償(Compensation)取決於不同螢光染劑的數量、種類及搭配方式，調節補償時必須非常注意，以免一種螢光染劑的信號漏進其他螢光偵測器。螢光染劑之間的補償問題也必須在設定檢體分析條件時予以考慮，並且每天追蹤其變化。

螢光補償之校正可藉由螢光微球，或者用生物性標準品(Cyto-Comp cell kit + Cyto-Comp Reagent kit)來建立。螢光補償可藉由手動方式或是自動方式進行調整。每日先以Flow-Set™Fluorospheres進行偵測器HV及Gain值校正後，在此校正條件下，接著進行螢光補償的調整，最後紀錄每個螢光參數的強度(X-Mean、Y-Mean)，並且計算螢光強度差 (Target Channel Differential)，X mean for regions 1 and 3 and the Y mean for regions 3 and 4 are the same within +/- 0.1，同時需記錄校正後的電壓值、Gain值以及螢光補償比率(%)。

Cyto-Comp cell kit為冷凍乾燥的正常人類淋巴細胞，可搭配Cyto-Comp Reagent kit或是使用相互排斥的淋巴球細胞表面抗體(例如: CD4-FITC/CD8-PE)進行染色，當上機進行分析時，需將兩群陽性細胞分別調整至與陰性細胞相同的螢光強度位置上，如進行3色補償則用CD4-FITC/CD8-PE/CD3-PC5抗體組合。

Daily

3. Cyto-Comp cell kit with Cyto-Comp Reagent (or CD4/CD8):Compensation Setting

以分析 Flow-Set 或 IsotypicControl 而得的 Voltage 值分析Cyto-Comp Cell

調整 FITC/PE 間的螢光補償值，直到：

象限 1 的 X mean = 象限 3 的 X mean 象限 4 的 Y mean = 象限 3 的 Y mean

Uncompensated Compensated

4.4.分析標準品管細胞分析標準品管細胞--每日每日

當完成所有系統校準後，最後必須使用Immuno-Trol™ Cells或是CYTO-TROL™ Control Cells來確認檢體的前處理流程以及儀器分析條件是否正確，確保系統能夠提供正確的分析數據。

Immuno-Trol™ Cells或CYTO-TROL™ 標準品管細胞是針對細胞表面抗原分析項目所設計的標準品，每一批標準品說明書中，附載了常用表面抗原表現百分比以及可接受範圍值，當標準品分析結果符合標準範圍時，證明該實驗室的流式細胞儀系統能夠提供正確的分析數據，也可增加分析未知檢體時的可信度。若當分析結果不符合標準範圍時，則必須進行檢體前處理流程以及儀器狀態以及條件設定(偵測器電壓值、Gain值以及螢光補償值)的故障排除。

Repeated staining• CD3/CD19, CD3/CD56,CD3/CD4,CD3/CD8 etc..• <=3% difference between CD3 staining

T cell % + B cell % + NK cell % = 100%(±5%)• CD3• CD19• CD56/16

Daily

Immuno-Trol Control Cells Package Insert：

5.螢光的線性度-每個月

螢光檢測的線性度主要會受幾個因素影響，包含雷射功率、電阻抵銷、放大器線性度、與光路精準度等。螢光檢測的線性度應在儀器出廠前便己最佳化，而且此一參數通常相當穩定，不會無端失準，除非雷射不穩定。一般來說，儀器螢光檢測的線性度應每個月檢查一次，唯如有從事螢光定量實驗者，如本公司FlowCytomix多重微球細胞激素分析，則建議用户需增加評測次數。

螢光線性度可以用五組不同螢光強度的微球(Immuno-Brite Fluorospheres)混和物來檢測，各組微球螢光強度的平均值已知，且成比例遞增。每隔一段時間用同樣的PMT電壓來運行微球，統計每一組微球的平均螢光值，是否穩定不變或在一個可接受的範圍內變化；也可以用双對數表繪圖求得線性回歸常數。

每個螢光參數的線性指數r2必須大於 98%

評估：

儀器保養儀器保養1. Routine cleaning：每日關機前清洗2支5% Clorox(原倍為5% sodium hypochlorite),2支

Cleanse,2支dist.H2O2. 每週保養(每週須執行一至兩次)：

當執行完每日關機必要流程後，用Clenz酵素液沖洗整個管路3-5分鐘，直接關閉機器，讓Clenz酵素液在管路中浸泡隔夜。當隔天再次啟動機器時，暖機晚完成後，機器再度充壓，將Sheath buffer打進管路中，Clenz酵素液便會流入廢液桶內。

注意：使用Clenz酵素液浸泡管路不可超過24小時，否則可能造成管路受損。

3. 原廠定期維修保養: 每三個月執行一次，由Beckman Coulter原廠工程師進行儀器液流系統以及光學系統的校正。

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