FLOW SİTOMETRİFLOW SİTOMETRİ(AKAN HÜCRE ÖLÇER)(AKAN HÜCRE ÖLÇER)

Dr.Handan AksoyDr.Handan Aksoy

Akım Hücre Ölçer (AHÖ)Akım Hücre Ölçer (AHÖ)

Çeşitli hücrelerin bir süspansiyon halinde bir akış Çeşitli hücrelerin bir süspansiyon halinde bir akış kanalı boyunca tek tek geçmesi ve bu sırada kanalı boyunca tek tek geçmesi ve bu sırada hücre büyüklüğü ve granülaritesine göre hücre büyüklüğü ve granülaritesine göre sınıflandırılması esasına dayanan bir cihazdır.sınıflandırılması esasına dayanan bir cihazdır.

TarihçeTarihçe 1870-Savart- hızla akan sıvının yüksek frekansla vibrasyonu 1870-Savart- hızla akan sıvının yüksek frekansla vibrasyonu

sonrası ayrımını (SORTİNG) geliştirmişsonrası ayrımını (SORTİNG) geliştirmiş

1934-Moldoven-fotoelektrik alıcıyı geliştirmiş akım boyunca 1934-Moldoven-fotoelektrik alıcıyı geliştirmiş akım boyunca kan hücrelerinin sayımı sağlanmıştırkan hücrelerinin sayımı sağlanmıştır

1949-1956 Coulter kan sayım cihazı geliştirilmiş1949-1956 Coulter kan sayım cihazı geliştirilmiş

1969-Van Dilla- argon lazer sisteme ilave edilmiş1969-Van Dilla- argon lazer sisteme ilave edilmiş

1980- Becton Dickinson ile flow sorter (floresan aktive cell 1980- Becton Dickinson ile flow sorter (floresan aktive cell sorter) geliştirilmiştir.sorter) geliştirilmiştir.

1 milyon hücre bir dakikadan daha 1 milyon hücre bir dakikadan daha kısa bir sürede değerlendirilebilir ve kısa bir sürede değerlendirilebilir ve çok parametreli bir değerlendirme çok parametreli bir değerlendirme yapılabiliryapılabilir

Kullanım alanlarıKullanım alanları İmmün fenotiplemeİmmün fenotipleme DNA analiziDNA analizi Hücre prolifersyonuHücre prolifersyonu Hücre ölümüHücre ölümü RNA ve protein içerik analiziRNA ve protein içerik analizi Membran permeabilite ve potansiyellerinin Membran permeabilite ve potansiyellerinin

değerlendirilmesideğerlendirilmesi Drug uptake ölçümüDrug uptake ölçümü Mikroorganizma tayiniMikroorganizma tayini Hücre içi kalsiyum iyon teknikleriHücre içi kalsiyum iyon teknikleri PH ölçümleriPH ölçümleri Glutatyon ölçümleriGlutatyon ölçümleri Virüs ve viral ürün tayinleriVirüs ve viral ürün tayinleri Transplantasyon….Transplantasyon….

Çalışma prensibiÇalışma prensibi

3 ana sistemden oluşur3 ana sistemden oluşur– Hidrolik sistemHidrolik sistem

Akış sistemi; partiküllerin lazer önünden geçişi için taşıyıcı Akış sistemi; partiküllerin lazer önünden geçişi için taşıyıcı sistemsistem

– Optik sistemOptik sistem Lazer önünden geçen hücrelerden açığa çıkan floresan Lazer önünden geçen hücrelerden açığa çıkan floresan

saçılımının çapraz ve silindirik filtereler ile toplanarak düzgün saçılımının çapraz ve silindirik filtereler ile toplanarak düzgün bir şekilde fotodedektörlere aktarılmasında görev alırbir şekilde fotodedektörlere aktarılmasında görev alır

– Elektronik sistemElektronik sistem Elde edilen optik sinyalin Elde edilen optik sinyalin Photo Multiplier TubesPhoto Multiplier Tubes (PMT) ile (PMT) ile

amplifiye edilerek elektrik sinyaline çevriminden ve analiz amplifiye edilerek elektrik sinyaline çevriminden ve analiz için bilgisayara aktarımından sorumludur.için bilgisayara aktarımından sorumludur.

LAZERLAZER Vücut sıvıları doğal süspansiyon halindedirVücut sıvıları doğal süspansiyon halindedir Ancak taze ve fikse edilmiş solid dokularla çalışmak için Ancak taze ve fikse edilmiş solid dokularla çalışmak için

süspansiyon haline getirmek gerekirsüspansiyon haline getirmek gerekir

– Süspanse hale getirilmiş hücrelerin analizi için floresan işaretli Süspanse hale getirilmiş hücrelerin analizi için floresan işaretli monoklonal antikorlarla direkt/indirekt olarak işaretlenmesi monoklonal antikorlarla direkt/indirekt olarak işaretlenmesi gerekirgerekir

Sistem floresan yoğunluğu ölçümü prensibine bağlı Sistem floresan yoğunluğu ölçümü prensibine bağlı olduğundan işaretli hücrelerden bu floresanı açığa çıkaracak olduğundan işaretli hücrelerden bu floresanı açığa çıkaracak güç kaynağı olarak güç kaynağı olarak LAZER LAZER kullanılmaktadırkullanılmaktadır

– Bu kaynak; Argon, Kripton, Helium-Kadmiyum,Helium-Neon veya Bu kaynak; Argon, Kripton, Helium-Kadmiyum,Helium-Neon veya daha yüksek yoğunluktaki ışık kaynakları olabilir.daha yüksek yoğunluktaki ışık kaynakları olabilir.

– Masa üstü sistemlerde genellikle argon kullanılır ve Masa üstü sistemlerde genellikle argon kullanılır ve FITC(fluorescein isothiocyanate), PE(phycoerytrine) gibi floresan FITC(fluorescein isothiocyanate), PE(phycoerytrine) gibi floresan boyaları 488nm’de aktive ederek hücre düzeyinde ve/veya içinde boyaları 488nm’de aktive ederek hücre düzeyinde ve/veya içinde floresan yoğunluğu ölçümüne olanak sağlamaktadır.floresan yoğunluğu ölçümüne olanak sağlamaktadır.

Süspansiyon halindeki hücreler hava basıncı ile sıvı içinden geçirilir, Süspansiyon halindeki hücreler hava basıncı ile sıvı içinden geçirilir, Sıvının çok hızlı akışı yüksek bir hidrostatik basınç oluşturur Sıvının çok hızlı akışı yüksek bir hidrostatik basınç oluşturur Bu basınçla hücreler cam ve ya kuartzdan yapılmış (flow cell) akış kabinine Bu basınçla hücreler cam ve ya kuartzdan yapılmış (flow cell) akış kabinine

gelirlergelirler Bu kabinin geometrik şekli ve sıvının laminer akışı hücrelerin tek bir sıra Bu kabinin geometrik şekli ve sıvının laminer akışı hücrelerin tek bir sıra

halinde lazer kaynağı önünden geçişini sağlarhalinde lazer kaynağı önünden geçişini sağlar– Sistemde Forward scatter(FS), Side scatter(SS) ve floresan (FL-1,2,3…) Sistemde Forward scatter(FS), Side scatter(SS) ve floresan (FL-1,2,3…)

dedektörleri bulunurdedektörleri bulunur FS: hücre yüzey alanı ve büyüklüğüFS: hücre yüzey alanı ve büyüklüğü SS: granülarite ve iç yapısıSS: granülarite ve iç yapısı

Forward scatter dedektörü

•Side scatter dedektörü

Işık kaynağı

Floresan boyama teknikleriFloresan boyama teknikleri İmmünfenotipleme:İmmünfenotipleme:

Hücre yüzeyinde eksprese olan antijen moleküllerine karşı Hücre yüzeyinde eksprese olan antijen moleküllerine karşı özgül antikorlar kullanılarak hücrelerin tanımlanmasıdır.özgül antikorlar kullanılarak hücrelerin tanımlanmasıdır.

Hücre yüzeyindeki bu antijenik yapılar CD(cluster of Hücre yüzeyindeki bu antijenik yapılar CD(cluster of differentiation) molekülleri olarak adlandırılmaktadırdifferentiation) molekülleri olarak adlandırılmaktadır

AHÖ kullanılarak CD molekülleriyle hücrelerin fenotipik AHÖ kullanılarak CD molekülleriyle hücrelerin fenotipik özellikleri tespit edilmekte ve istenilen hücreler özellikleri tespit edilmekte ve istenilen hücreler saflaştırılabilmektedirsaflaştırılabilmektedir

Örnek hazırlama için en sık kullanılan yöntem tam kan lizis Örnek hazırlama için en sık kullanılan yöntem tam kan lizis yöntemidir. yöntemidir.

(Eklem ve plevra sıvılarından hücre süspansiyonu (Eklem ve plevra sıvılarından hücre süspansiyonu hazırlarken lizis metoduna gerek yoktur.)hazırlarken lizis metoduna gerek yoktur.)

Lizis solüsyonu NH4Cl, KHCO3 ve EDTA karışımından Lizis solüsyonu NH4Cl, KHCO3 ve EDTA karışımından oluşmaktadır ve ticari olarak bulunmaktadır.oluşmaktadır ve ticari olarak bulunmaktadır.

Antikorlar özgül olarak epitopa, Fc reseptörlerine veya Antikorlar özgül olarak epitopa, Fc reseptörlerine veya nonspesifik olarak bağlanabilir.nonspesifik olarak bağlanabilir.– İzotipik kontrol antikoru veİzotipik kontrol antikoru ve– Otofloresan kontrol analizi yapılmalıdır. (bu iki analizin benzer Otofloresan kontrol analizi yapılmalıdır. (bu iki analizin benzer

sonuç vermesi gerekir, öyle değilse problem vardır)sonuç vermesi gerekir, öyle değilse problem vardır)

İsotip kontrolİsotip kontrol

Mouse anti human Mouse anti human CD14-FITC –Ig2aCD14-FITC –Ig2a Mouse isotip-Mouse isotip-FITC-Ig2aFITC-Ig2a : nonspesifik : nonspesifik

kontrolkontrol

Temel boyama prosedürüTemel boyama prosedürü1.1. Primer mAb ve florokrom işaretli ikinci antikorlarPrimer mAb ve florokrom işaretli ikinci antikorlar

Hücre süspansiyonu+epitop özgül işaretsiz mAb inkübasyon, santrifüjHücre süspansiyonu+epitop özgül işaretsiz mAb inkübasyon, santrifüj Florokrom işaretli ikinci antikor ile inkübasyonFlorokrom işaretli ikinci antikor ile inkübasyon Yıkama+%2 formaldehitli PBSYıkama+%2 formaldehitli PBS ANALİZANALİZ

2.2. Primer mAb ve biyotinlenmiş veya hapten konjuge antikorlarPrimer mAb ve biyotinlenmiş veya hapten konjuge antikorlar Epitop özgül işaretsiz biyotinlenmiş veya hapten konjuge mAb inkübasyonu, santrifüjEpitop özgül işaretsiz biyotinlenmiş veya hapten konjuge mAb inkübasyonu, santrifüj Florokrom işaretli avidin veya anti hapten antikorla inkübasyonFlorokrom işaretli avidin veya anti hapten antikorla inkübasyon

3.3. Direkt konjuge antikorlarDirekt konjuge antikorlar Epitop özgül florokrom konjuge mAb Epitop özgül florokrom konjuge mAb İnkübasyon, yıkama, fiksasyonİnkübasyon, yıkama, fiksasyon

Çok renkli Çok renkli immünfenotiplemeimmünfenotipleme

Boyama yöntemleri aynı anda kullanılırBoyama yöntemleri aynı anda kullanılır Çok farklı lenfosit alt gruplarının fenotipik ve fonksiyonel Çok farklı lenfosit alt gruplarının fenotipik ve fonksiyonel

analizleri yapılmaktadır.analizleri yapılmaktadır. Cihazın lazer kompozisyonuna göre aynı anda 20 farklı Cihazın lazer kompozisyonuna göre aynı anda 20 farklı

yüzey antijeni analizi yapılabilmektediryüzey antijeni analizi yapılabilmektedir Rutinde 4 renkli boyama kullanışlı olmaktadırRutinde 4 renkli boyama kullanışlı olmaktadır

FlorokromlarFlorokromlar FITC (fluorescein isothiocyanate)FITC (fluorescein isothiocyanate) PE (phycoerytrin)PE (phycoerytrin) PETR (phycoerytrin-texas red tandem kompleksi)PETR (phycoerytrin-texas red tandem kompleksi) PECy5 (phycoerytrin-cyanin 5 tandem kompleksi)PECy5 (phycoerytrin-cyanin 5 tandem kompleksi) PerCP (perdinin chlorophil-P)PerCP (perdinin chlorophil-P)

Tümü 488nm’de eksite olurlar, çok renkli boyama yapılırken Tümü 488nm’de eksite olurlar, çok renkli boyama yapılırken kompensasyon ayarlarına dikkat edilmelidirkompensasyon ayarlarına dikkat edilmelidir

Önemli noktalarÖnemli noktalar Analiz yapılacak hücre konsantrasyonu önemlidirAnaliz yapılacak hücre konsantrasyonu önemlidir

– Boyama ve yıkama sırasında hücreler kaybedilirlerBoyama ve yıkama sırasında hücreler kaybedilirler– Hücre pelleti 0.3-1ml’de süspanse edilirHücre pelleti 0.3-1ml’de süspanse edilir– Cihazdan saniyede 100-1000 hc geçmesi normaldirCihazdan saniyede 100-1000 hc geçmesi normaldir– <1000/hc zaman kaybı, >1000/hc kümeleşmeye sebep olur <1000/hc zaman kaybı, >1000/hc kümeleşmeye sebep olur

Önemli noktalarÖnemli noktalar İnkübasyon oda ısısında olmalıdır (22’C)İnkübasyon oda ısısında olmalıdır (22’C)

– Prosedür ve kimyasal kitlere bağlı olarak buzdolabı(4’C) veya Prosedür ve kimyasal kitlere bağlı olarak buzdolabı(4’C) veya buzda yapılabilirbuzda yapılabilir

Minimum 1 saatlik fiksasyon zamanı önerilmektedirMinimum 1 saatlik fiksasyon zamanı önerilmektedir– Aldehitle fikse edilmiş hücrelerin FSC/SSC dağılımları ilk 8 Aldehitle fikse edilmiş hücrelerin FSC/SSC dağılımları ilk 8

saatte değişmektedirsaatte değişmektedir– Fiksasyondan granülosit ve monosittler etkilenir (granüllü Fiksasyondan granülosit ve monosittler etkilenir (granüllü

hücreler boyamadan sonra hemen okutulmaalıdır)hücreler boyamadan sonra hemen okutulmaalıdır)– Fikse edilmiş hücre süspansiyonu 3 gün içinde analiz Fikse edilmiş hücre süspansiyonu 3 gün içinde analiz

edilmelidir.edilmelidir.

Veri analiziVeri analizi AHÖ, geniş hc toplulukları hakkındaki verilerin hızlıca AHÖ, geniş hc toplulukları hakkındaki verilerin hızlıca

toplanmasını ve analizini sağlartoplanmasını ve analizini sağlar Saniyede >70 000 partikül sayar ve her partikül veya hc Saniyede >70 000 partikül sayar ve her partikül veya hc

için 9 farklı renk ve iki yöne saçılan ışık sinyallerini saptariçin 9 farklı renk ve iki yöne saçılan ışık sinyallerini saptar yazılım:yazılım:

– Cihaz kontrolü, veri kazanımı, analiz ve görüntüleme Cihaz kontrolü, veri kazanımı, analiz ve görüntüleme mümkünmümkün

– System II yazılımları firmalarca sağlanmaktaSystem II yazılımları firmalarca sağlanmakta– WinMDI 2.9, FlowJo ücretsiz internetten indirilebilir WinMDI 2.9, FlowJo ücretsiz internetten indirilebilir

yazılımlarla analiz yapılabiliryazılımlarla analiz yapılabilir

Cihaz kontrolüCihaz kontrolü– Lazer ve dedektör kontrolleri, kalibrasyonu boyalı Lazer ve dedektör kontrolleri, kalibrasyonu boyalı

boncuklar kullanılarak elde edilen histogram grafiklerle boncuklar kullanılarak elde edilen histogram grafiklerle yapılıryapılır

– İki farklı histogramın üst üste getirilmesiyle (overlay) İki farklı histogramın üst üste getirilmesiyle (overlay) çoklu örneklerden alınan elde edilen parametre çoklu örneklerden alınan elde edilen parametre verilerinin eşzamanlı gösterilmesi mümkün olmaktadırverilerinin eşzamanlı gösterilmesi mümkün olmaktadır Spesifik protein ekspresyon taranmasıSpesifik protein ekspresyon taranması Anormal gen ekspresyonu gösteren hücre sayılarının Anormal gen ekspresyonu gösteren hücre sayılarının

belirlenmesibelirlenmesi Eksternel faktörlere yanıt olarak popülasyonun gen Eksternel faktörlere yanıt olarak popülasyonun gen

ekspresyonu ve proliferasyonunun denetlenmesiekspresyonu ve proliferasyonunun denetlenmesi

Verilerin lineer veya logaritmik ölçekle Verilerin lineer veya logaritmik ölçekle görüntülenmesigörüntülenmesi– Floresan ve saçılan ışığın yoğunluğunun lineer veya Floresan ve saçılan ışığın yoğunluğunun lineer veya

logaritmik olarak ölçmek mümkündürlogaritmik olarak ölçmek mümkündür– DNA’nın boyandığı hc siklusu ölçümünde her zaman DNA’nın boyandığı hc siklusu ölçümünde her zaman

lineer amplifikasyon seçilmektedirlineer amplifikasyon seçilmektedir– İmmünfloresan için seçilen logaritmik amplifikasyon hem İmmünfloresan için seçilen logaritmik amplifikasyon hem

zayıf hem de kuvvetli sinyallerin aynı skala üzerinde zayıf hem de kuvvetli sinyallerin aynı skala üzerinde gösterilmesini sağlargösterilmesini sağlar

Lineerden logaritmik görüntülemeye geçerek ölçek, pozitif Lineerden logaritmik görüntülemeye geçerek ölçek, pozitif olgular için sıkıştırılırken, negatif olgular için genişletilir. olgular için sıkıştırılırken, negatif olgular için genişletilir. Böylece pozitif ve negatif olgular arasındaki farkı daha Böylece pozitif ve negatif olgular arasındaki farkı daha iyi değerlendirirken sayılar aynı kalıriyi değerlendirirken sayılar aynı kalır

Kompensasyon(telafi)Kompensasyon(telafi)– Çok renkli deneylerde çok yakın veya çakışan emisyon Çok renkli deneylerde çok yakın veya çakışan emisyon

spektrumundaki boya veya florokromların yarattığı floresan spektrumundaki boya veya florokromların yarattığı floresan interferensi olasılığıinterferensi olasılığı

– Çok renkli veri yorumlarını basitleştirmek ve ikili parametre Çok renkli veri yorumlarını basitleştirmek ve ikili parametre histogramlarında popülasyonları ayırt etmek için çakışan histogramlarında popülasyonları ayırt etmek için çakışan floresanı matematiksel olarak uzaklaştıran özgül yazılım veya floresanı matematiksel olarak uzaklaştıran özgül yazılım veya donanım manipülasyonu kastedilmektedirdonanım manipülasyonu kastedilmektedir

– Çoğu zaman araştırıcının deneyimine bağlıdırÇoğu zaman araştırıcının deneyimine bağlıdır

İstatistiksel analizİstatistiksel analiz Total sayımTotal sayım Popülasyon yüzdeleriPopülasyon yüzdeleri OrtalamaOrtalama MedianMedian Varyasyon katsayısı (CV)Varyasyon katsayısı (CV) Standart sapma(SS)Standart sapma(SS) Hücrenin floresan yoğunluğunun nicelendirilmesiHücrenin floresan yoğunluğunun nicelendirilmesi

– Standart kalibrasyon birimiStandart kalibrasyon birimi– Eşdeğer solubl florokrom molekülleriEşdeğer solubl florokrom molekülleri

MESF ( molecules of equivalent soluble MESF ( molecules of equivalent soluble fluorochrome)fluorochrome)

MFI (Mean fluoresence intensity)MFI (Mean fluoresence intensity)

Zaman parametresinin uygulanmasıZaman parametresinin uygulanması– Zamana karşı floresan yoğunluğunun değişiminin takip Zamana karşı floresan yoğunluğunun değişiminin takip

eden kalsiyum flux gibi kinetik deneyler uygulanabilireden kalsiyum flux gibi kinetik deneyler uygulanabilir– Zaman ve floresan oranı kombine edilerek detaylı Zaman ve floresan oranı kombine edilerek detaylı

fagositoz, kemotaksi veya oksidatif patlama gibi nötrofil fagositoz, kemotaksi veya oksidatif patlama gibi nötrofil fonksiyonları gözlemlenebilirfonksiyonları gözlemlenebilir

Hücre içi sitokin ölçümüHücre içi sitokin ölçümü İmmün hücrelerden sitokin salınımı ve üretimi hem protein İmmün hücrelerden sitokin salınımı ve üretimi hem protein

hem de mRNA seviyesinde çalışılabilirhem de mRNA seviyesinde çalışılabilir– ELİSA, Bioassay, mRNA+ protein ve hc içi sitokin ölçümü gibi ELİSA, Bioassay, mRNA+ protein ve hc içi sitokin ölçümü gibi

farklı metodlar kullanılmaktadırfarklı metodlar kullanılmaktadır İşaretli anti sitokin antikorlar kullanılarak yapılmaktadırİşaretli anti sitokin antikorlar kullanılarak yapılmaktadır

Sander, paraformaldehit fiksasyonu sonrası saponinle Sander, paraformaldehit fiksasyonu sonrası saponinle permeabilize hücrelerin İndirekt immünfloresan ile permeabilize hücrelerin İndirekt immünfloresan ile boyanması ile tek hücrede sitokin üretimini göstermişboyanması ile tek hücrede sitokin üretimini göstermiş

Jung, hc içi protein transportunu önleyerek sitokinlerin golgi Jung, hc içi protein transportunu önleyerek sitokinlerin golgi cihazında birikimini sağlayan monensin varlığında cihazında birikimini sağlayan monensin varlığında uygulanmış ve AHÖ ile gösterilmişuygulanmış ve AHÖ ile gösterilmiş

Süspansiyon haldeki hücrelerde sitokin ölçümü için ön bir Süspansiyon haldeki hücrelerde sitokin ölçümü için ön bir uyarım ve monensin ve brefeldin A ile amplifikasyon uyarım ve monensin ve brefeldin A ile amplifikasyon sağlanmalıdırsağlanmalıdır

İonomisin ve PMA kan T hücreleri için iyi bir uyarandırİonomisin ve PMA kan T hücreleri için iyi bir uyarandır BAL T hücreleri için anti-CD2 ve anti-CD28 antikoru iyi uyarandırBAL T hücreleri için anti-CD2 ve anti-CD28 antikoru iyi uyarandır

Sitokin özgül antikorların hc içine penetrasyonu Sitokin özgül antikorların hc içine penetrasyonu ve sitokin proteinlerine bağlanması için fiksasyon ve sitokin proteinlerine bağlanması için fiksasyon ve permeabilizasyon gereklidirve permeabilizasyon gereklidir– %4 paraformaldehit ve %1 saponin Thc ve monosit için %4 paraformaldehit ve %1 saponin Thc ve monosit için

optimaldiroptimaldir

Prensip;Prensip;– Geçirgenliği sağlanan hedef hücre Geçirgenliği sağlanan hedef hücre

membranından diffüze olabilen floresan membranından diffüze olabilen floresan işaretli antikorların ölçülmesi esasına işaretli antikorların ölçülmesi esasına dayanır.dayanır.

yöntemyöntem Salgılanan protein boyamalarıSalgılanan protein boyamaları

– SitokinSitokin– HormonHormon

Protein transportu engellenmeliProtein transportu engellenmeli– Brefeldin A ile inkübasyonBrefeldin A ile inkübasyon

Golgiden hücreye hareketin engellenmesiGolgiden hücreye hareketin engellenmesi– Monensin ile inkübasyonMonensin ile inkübasyon

Protein hareketi inhibitörüProtein hareketi inhibitörü Hücreler arası hareketi sağlayan metalloproteinazları da Hücreler arası hareketi sağlayan metalloproteinazları da

etkilediği gösterilmişetkilediği gösterilmiş

1.1. Hedef hücre fiksasyonuHedef hücre fiksasyonu Formaldehit (paraformaldehit)Formaldehit (paraformaldehit)

Fiksasyonu diğerlerinden daha güçlüFiksasyonu diğerlerinden daha güçlü Formaldehit ve metanol, protein yapılar arasında Formaldehit ve metanol, protein yapılar arasında

bağlantılar yaparak antijenik yapıları bozarbağlantılar yaparak antijenik yapıları bozar MetanolMetanol AsetonAseton

2.2. PermeabilizasyonPermeabilizasyon1.1. Tween 20 (zayıf membran çözücüleri) Tween 20 (zayıf membran çözücüleri) 2.2. SaponinSaponin

3.3. NP-40 (kuvvetli membran çözücüleri, nükleus membranını NP-40 (kuvvetli membran çözücüleri, nükleus membranını çözer, nükleer antikor boyaması için uygun)çözer, nükleer antikor boyaması için uygun)

4.4. TritonTriton

3.3. Antikorla boyamaAntikorla boyama1.1. Yüzey boyamaYüzey boyama2.2. Hücre içi boyamaHücre içi boyama

4.4. AHÖ ile ölçümAHÖ ile ölçüm

Hücre içi stokin boyamasını klinik kullanımıHücre içi stokin boyamasını klinik kullanımı

Asemptomatik HIV+ hastaların CD4 T hücrelerinde IFNg Asemptomatik HIV+ hastaların CD4 T hücrelerinde IFNg üretiminin azaldığı, IL-4 üretiminin arttığı saptanmışüretiminin azaldığı, IL-4 üretiminin arttığı saptanmış

Semptomatik hastalarda IL2 ve IFNg üreten hücrelerin Semptomatik hastalarda IL2 ve IFNg üreten hücrelerin azaldığı, ileri dönemlerde ise IL-10 üreten hücrelerin azaldığı, ileri dönemlerde ise IL-10 üreten hücrelerin sayısında artış olduğu saptanmışsayısında artış olduğu saptanmış

Astımda çocuklarda IL5 üreten Thc sayısı fazlayken, erişkin Astımda çocuklarda IL5 üreten Thc sayısı fazlayken, erişkin astımlıda daha az sayıda IFNg sekrete eden Thc ve normal astımlıda daha az sayıda IFNg sekrete eden Thc ve normal IL5 üreten hücre saptanmış.(yaşa bağlı immünolojik IL5 üreten hücre saptanmış.(yaşa bağlı immünolojik değişiklikler)değişiklikler)

DNA analiziDNA analizi

Kanser hücresinde hücrelerin ploidisi ve malign Kanser hücresinde hücrelerin ploidisi ve malign hücrelerin çoğalma kapasitesi saptanabilirhücrelerin çoğalma kapasitesi saptanabilir

– İstenen hücre tipinin biraraya getirilmesi ve istenen İstenen hücre tipinin biraraya getirilmesi ve istenen bilgiye sahip materyalin boyanması ve görünür hale bilgiye sahip materyalin boyanması ve görünür hale getirilmesigetirilmesi

DNA içeriği ve hücre döngüsü saptanmasıDNA içeriği ve hücre döngüsü saptanması

DNA boyalarıDNA boyaları DNA’ya 1:1 oranda bağlanma (stoişiyometrik)DNA’ya 1:1 oranda bağlanma (stoişiyometrik) Okunan boya ile DNA miktarı arasında ilişki kurulması mümkün Okunan boya ile DNA miktarı arasında ilişki kurulması mümkün

olmaktaolmakta

DNA aminoasit dizileri arasına girerek DNA boyanmasını sağlarDNA aminoasit dizileri arasına girerek DNA boyanmasını sağlar Boyanın ve AHÖ cihazının özellikleri bilinmelidirBoyanın ve AHÖ cihazının özellikleri bilinmelidir

– 3 grup DNA boyası var3 grup DNA boyası var Ethidium bromide ve propidium iodide Ethidium bromide ve propidium iodide

– RNA boyama özelliğiRNA boyama özelliği BenzimidlerBenzimidler

– Hoechst 33342 boyası:Hoechst 33342 boyası: DNA’da özellikle A-T zengin DNA’da özellikle A-T zengin bölgelere bağlanma gösterirbölgelere bağlanma gösterir

AntibiyotiklerAntibiyotikler– Mitramisin ve Kromamisin A:Mitramisin ve Kromamisin A: G-C zengin bölgelere bağlanır G-C zengin bölgelere bağlanır

Acridine orangeAcridine orange– Çift sarmal DNA molekülleri arasına girme özelliğine sahiptir Çift sarmal DNA molekülleri arasına girme özelliğine sahiptir

Amaç tek hücre süspansiyonu haline Amaç tek hücre süspansiyonu haline getirmektirgetirmektir

Vücut sıvılarıVücut sıvıları– Kan, BAL, asit sıvısı, BOSKan, BAL, asit sıvısı, BOS– Hücre membranının kaldırılması, gerekirse RNaz kullanılarak Hücre membranının kaldırılması, gerekirse RNaz kullanılarak

DNA’nın boyanmaya açık hale getirilmesi gerekirDNA’nın boyanmaya açık hale getirilmesi gerekir

Doku ve parafin bloklarDoku ve parafin bloklar

DNA analiziDNA analizi Hücre döngüsü fazlarındaki ortalama DNA içeriğiHücre döngüsü fazlarındaki ortalama DNA içeriği Hücre sayısıHücre sayısı

Analiz sırasında normal hücrelerin DNA içeriklerinin Analiz sırasında normal hücrelerin DNA içeriklerinin histogramda düştüğü kanal sayısını doğrulamak amacıyla iç histogramda düştüğü kanal sayısını doğrulamak amacıyla iç ve dış kontrol materyali kullanılırve dış kontrol materyali kullanılır– Sağlıklı bireyin lenfositleriSağlıklı bireyin lenfositleri– Solid tm incelenirken, tm dokusu dışında kalan sağlam Solid tm incelenirken, tm dokusu dışında kalan sağlam

dokudan benzer örnekler hazırlanması gibi..dokudan benzer örnekler hazırlanması gibi.. Dış kontrol: DNA örneğinden önce AHÖ cihazından ayrı bir tüpte Dış kontrol: DNA örneğinden önce AHÖ cihazından ayrı bir tüpte

geçirilen örneklergeçirilen örnekler İç kontrol: DNA analizinin yapıldığı tüpe eklenen ve tek bir defada İç kontrol: DNA analizinin yapıldığı tüpe eklenen ve tek bir defada

değerlendirilen konroldeğerlendirilen konrol

DNA ANALİZ TERİMLERİDNA ANALİZ TERİMLERİ CV (coefficent variation)CV (coefficent variation)

– Yapılan DNA analizinin geçerli olması için önemliYapılan DNA analizinin geçerli olması için önemli

CV= G0/G1 orta yüksek genişliği/pik kanal sayısıx2.35CV= G0/G1 orta yüksek genişliği/pik kanal sayısıx2.35

– Değerlendirilen hücrelerden elde edilen G0/G1 pikinin Değerlendirilen hücrelerden elde edilen G0/G1 pikinin ince ve uzun olması olarak ifade edilirince ve uzun olması olarak ifade edilir

Taze dokularda CV<4, parafin bloklarda<6 olması istenirTaze dokularda CV<4, parafin bloklarda<6 olması istenir CV değerleri bu düzeyde olmayan DNA örnekleri asla CV değerleri bu düzeyde olmayan DNA örnekleri asla

değerlendirilmezdeğerlendirilmez

DNA ANALİZ TERİMLERİDNA ANALİZ TERİMLERİ

DNA indeksi (DI)DNA indeksi (DI)– Çalışılan hücre popülasyonunun G0/G1 fazında bulunan hücrelerin DNA içeriğinin Çalışılan hücre popülasyonunun G0/G1 fazında bulunan hücrelerin DNA içeriğinin

diploidi içeren normal hc popülasyonunun G0/G1 fazındaki DNA içeriğine diploidi içeren normal hc popülasyonunun G0/G1 fazındaki DNA içeriğine bölünmesi ile edinilen değerbölünmesi ile edinilen değer

DI = 1 diploidiDI = 1 diploidi DI<1 hipodiploidiDI<1 hipodiploidi DI>1 hiperdiploidiDI>1 hiperdiploidi

Germ hc: haploid (n)Somatik hc: diploid (2n)

Mitoz: tetraploid (4n)

DNA ANALİZ TERİMLERİDNA ANALİZ TERİMLERİ

Proliferatif indeksProliferatif indeks– Araştırılan hücrelerin çoğalma kapasitesiAraştırılan hücrelerin çoğalma kapasitesi (S+G2+M/G0G1+S+G2+M)X100(S+G2+M/G0G1+S+G2+M)X100

Özellikle malignitelerde yapılan çalışmalarda önemli ve malign hc çalışma kapasiteleri hakkında bilgi verir.

Klinik kullanımıKlinik kullanımı

Malignite varlığının gösterilmesiMalignite varlığının gösterilmesi Tedavi yanıtının değerlendirilmesiTedavi yanıtının değerlendirilmesi PrognozPrognoz Sağlıklı kişilerde tarama testiSağlıklı kişilerde tarama testi Patolojik olarak malignite (-) örneklerin, DNA Patolojik olarak malignite (-) örneklerin, DNA

analizi+nükleer hacim ölçümü ile malignite analizi+nükleer hacim ölçümü ile malignite saptanmaktadırsaptanmaktadır

Cross-Match (CM) teknikleriCross-Match (CM) teknikleri Transplantasyonda antikorları belirlemek için kullanılan Transplantasyonda antikorları belirlemek için kullanılan

standart teknik komplemana bağlı sitotoksik CM standart teknik komplemana bağlı sitotoksik CM (CDCCM)’dir(CDCCM)’dir

CM, alıcı serumunda vericinin HLA antijenlerine karşı CM, alıcı serumunda vericinin HLA antijenlerine karşı antikor oluşması esasına dayanırantikor oluşması esasına dayanır

AHÖCM tekniği 1983’de kullanılmaya başlandıAHÖCM tekniği 1983’de kullanılmaya başlandı Hedef lenfositlere bağlanan insan alloantikorlarını saptamak Hedef lenfositlere bağlanan insan alloantikorlarını saptamak

için indirekt immünfloresan kullanılıriçin indirekt immünfloresan kullanılır– Süspansiyon haldeki hücrelere işaretsiz antikor bağlanırSüspansiyon haldeki hücrelere işaretsiz antikor bağlanır– İkinci olarak işaretli antikor eklenir ve ilk antiikora bağlanırİkinci olarak işaretli antikor eklenir ve ilk antiikora bağlanır

AHÖCM’de 2.antikor önemliAHÖCM’de 2.antikor önemli– İyi saptanan özgüllüğü olmalı(AHÖ özgül)İyi saptanan özgüllüğü olmalı(AHÖ özgül)– Arka plan boyamayı azaltmak için Fab2 veya fab fragmenti Arka plan boyamayı azaltmak için Fab2 veya fab fragmenti

olmalıolmalı– Fare ve at IgG’leri ile çapraz reaksiyon vermemeliFare ve at IgG’leri ile çapraz reaksiyon vermemeli– 2.antikor florokrom seçimi mAb ‘a göre belirlenir 2.antikor florokrom seçimi mAb ‘a göre belirlenir

Solid organ CM’inde CD3 T hc, CD19 ve CD20 B hücreleri tanınırSolid organ CM’inde CD3 T hc, CD19 ve CD20 B hücreleri tanınır CD3 PE, CD19 PE/CD20-PE ve IgG-FITC kullanılır (ikili boyama)CD3 PE, CD19 PE/CD20-PE ve IgG-FITC kullanılır (ikili boyama) CD3-PerCP, CD19-PE ve IgG-FITC (üçlü boyama)CD3-PerCP, CD19-PE ve IgG-FITC (üçlü boyama)

Kontrol serumlarıKontrol serumları AHÖCM’de negatif ve pozitif kontrol serumları AHÖCM’de negatif ve pozitif kontrol serumları

kullanılırkullanılır

– Pozitif serumPozitif serum, yüksek HLA antikoru bulunduran serumların , yüksek HLA antikoru bulunduran serumların havuzlanması ile oluşturulurhavuzlanması ile oluşturulur

– Negatif serumNegatif serum,, anti HLA ab içermez anti HLA ab içermez Kan transfüzyonu yapılmamışKan transfüzyonu yapılmamış Transplantasyon yapılmamışTransplantasyon yapılmamış Kadın ise gebeliği olmayanKadın ise gebeliği olmayan AB kan grubuna sahip sağlıklı bireylerin serumları olmalıdırAB kan grubuna sahip sağlıklı bireylerin serumları olmalıdır

Cut off (pozitiflik) değeriCut off (pozitiflik) değeri– Negatif serum ve en az 20 kişiden alınan serum Negatif serum ve en az 20 kişiden alınan serum

karışımının, yine 20 kişiden alınan hücrelerle ayrı ayrı karışımının, yine 20 kişiden alınan hücrelerle ayrı ayrı testlenmesi ile elde edilirtestlenmesi ile elde edilir

– Çalışmanın negatiflik sınırını her laboratuvar farklı Çalışmanın negatiflik sınırını her laboratuvar farklı parametrelerle belirleyebilirparametrelerle belirleyebilir Median veya yüzde değerler verilebilirMedian veya yüzde değerler verilebilir T AHÖCM için ortalama 2SS, B için ortalama 3 SS olarak T AHÖCM için ortalama 2SS, B için ortalama 3 SS olarak

hesaplanırhesaplanır

Tranplantasyon kime yapılır?Tranplantasyon kime yapılır?

AHÖCM (-), CDCCM(+) nakil yapılmazAHÖCM (-), CDCCM(+) nakil yapılmaz– Komplemanı bağlamayan antikorlar nedeniyleKomplemanı bağlamayan antikorlar nedeniyle

Hiperakut rejeksiyon riski yüksek!Hiperakut rejeksiyon riski yüksek!

AHÖCM(+), CDCCM(-)AHÖCM(+), CDCCM(-)– Öncesinde transplantasyonu olmayanÖncesinde transplantasyonu olmayan– Gebelik geçirmemişGebelik geçirmemiş– Kan transfüzyonu yapılmamış kişilere transplantasyon Kan transfüzyonu yapılmamış kişilere transplantasyon

yapılabiliryapılabilir

Apoptoz tayininde AHÖ ölçümleriApoptoz tayininde AHÖ ölçümleri– Hc büyüklük ve granülaritesindeki değişikliklerHc büyüklük ve granülaritesindeki değişiklikler

Işık saçınımının analiziIşık saçınımının analizi– Plazma membran geçirgenliğindeki Plazma membran geçirgenliğindeki

değişikliklerdeğişiklikler Höechst 33342 ve PI ile boyamaHöechst 33342 ve PI ile boyama

– Hc yüzeyindeki değişikliklerHc yüzeyindeki değişiklikler Annexin V bağlanmasıAnnexin V bağlanması F actin kaybıF actin kaybı

– Mitokondri ve lizozomlardaki değişikliklerMitokondri ve lizozomlardaki değişiklikler Rhodamine 123 ve PI ile boyamaRhodamine 123 ve PI ile boyama JC-1 ile boyamaJC-1 ile boyama Lizozom protein pompasıLizozom protein pompası

– DNA fragmentasyonuDNA fragmentasyonu TUNEL yöntemiTUNEL yöntemi Sub G1 pik ve DNA analiziSub G1 pik ve DNA analizi

– Kaspaz aktivasyonuKaspaz aktivasyonu– Hc içi Ca değişikliklerinin ölçümüHc içi Ca değişikliklerinin ölçümü

PI, membran bütünlüğü bozulmuş ölü hücrelerin PI, membran bütünlüğü bozulmuş ölü hücrelerin içine girip, DNA veya çift sarmal RNA’ya içine girip, DNA veya çift sarmal RNA’ya bağlanarak kırmızı floresan veren bir boyadırbağlanarak kırmızı floresan veren bir boyadır– Membran bütünlüğünü koruyan hücreler PI’iMembran bütünlüğünü koruyan hücreler PI’i

hc içine almazlar ve boyanmazlarhc içine almazlar ve boyanmazlar– Canlı hücreler aktif olarak HO33342’yi alır ve hücresel Canlı hücreler aktif olarak HO33342’yi alır ve hücresel

DNA’yı mavi floresan şeklinde gösterirDNA’yı mavi floresan şeklinde gösterir Canlı hc--- maviCanlı hc--- mavi Nekrotik hc--- kırmızıNekrotik hc--- kırmızı Apoptotik hc---sönük maviApoptotik hc---sönük mavi

HO/PI BOYAMASIHO/PI BOYAMASI

Erken apoptozisi göstermemesi Erken apoptozisi göstermemesi Deneyin duyarlılığının zamana bağlı oluşuDeneyin duyarlılığının zamana bağlı oluşu HO boya eksitasyonu için UV kullanımı HO boya eksitasyonu için UV kullanımı

nedeniyle pratikte sınırlıdırnedeniyle pratikte sınırlıdır

ANNEXİN V bağlanmasıANNEXİN V bağlanması

Annexin V’in FITC ile konjuge Annexin V’in FITC ile konjuge edilmesiyle apoptotik hc görülebiliredilmesiyle apoptotik hc görülebilir

Annexin V-FITC /PI boyaması ölü ve Annexin V-FITC /PI boyaması ölü ve canlı hücrelerin ayrımına olanak verircanlı hücrelerin ayrımına olanak verir– Bu teknik solid dokular ve yapışan hücrelerde Bu teknik solid dokular ve yapışan hücrelerde

çalışılmamalıdırçalışılmamalıdır– Ayrılma sırasında plazma membran hasarı olduğundanAyrılma sırasında plazma membran hasarı olduğundan

F- actin kaybıF- actin kaybı– Erken apoptoz sırasında plazma membran Erken apoptoz sırasında plazma membran

yapılarının hızlı kaybı (psödopod ve mikrovillus)yapılarının hızlı kaybı (psödopod ve mikrovillus)– F-actin pödopodunu yapısındaF-actin pödopodunu yapısında– Phallotoxinler ise F-actine bağlanan ve Phallotoxinler ise F-actine bağlanan ve

depolimerizasyonu engelleyen toksik depolimerizasyonu engelleyen toksik peptidlerdirpeptidlerdir

– Floresanla konjuge phallotoxinler, F-aktin probu Floresanla konjuge phallotoxinler, F-aktin probu olarakı kullanılırolarakı kullanılır Apoptoz sırasında f-actin kaybı nedeniyle phallotoxin Apoptoz sırasında f-actin kaybı nedeniyle phallotoxin

bağlanmazbağlanmaz Paraformaldehit ile hc fiksasyonu sonrasında f-actin Paraformaldehit ile hc fiksasyonu sonrasında f-actin

ve DNA sırasıyla FITC işaretli phalloidin ve PI ile ve DNA sırasıyla FITC işaretli phalloidin ve PI ile boyanması temeline dayanırboyanması temeline dayanır

DNA FRAGMANTASYONUDNA FRAGMANTASYONU

TUNEL yöntemiTUNEL yöntemi– Endonüleazların aktivasyonu sonucunda Endonüleazların aktivasyonu sonucunda

yoğun DNA kırılmaları ile oluşan DNA yoğun DNA kırılmaları ile oluşan DNA fragmantasyonu apoptotik hc fragmantasyonu apoptotik hc gösterilmesinde altın standarttırgösterilmesinde altın standarttır Sarmal kırıklarında açığa çıkan 3’OH uçları Sarmal kırıklarında açığa çıkan 3’OH uçları

ekzojen enzimler kullanılarak kataliz edilip ekzojen enzimler kullanılarak kataliz edilip modifiye nükleotidler ile işaretlenir(FITC-modifiye nükleotidler ile işaretlenir(FITC-dUTP,biotin-dUTP)dUTP,biotin-dUTP)

Ekzojen enzimler olarak tek zincirlerin kırılması Ekzojen enzimler olarak tek zincirlerin kırılması TdT, tek zincirli kırılmalar için DNA polimeraz TdT, tek zincirli kırılmalar için DNA polimeraz kullanılırkullanılır

Biotinlenebilmesi için sırayla Biotinlenebilmesi için sırayla floresanla konjuge avidin, floresanla konjuge avidin, digoksigenin ve Br-dU antikorları digoksigenin ve Br-dU antikorları kullanılırkullanılır

YöntemeYönteme– Terminal deoxynucleotidyl transferase-Terminal deoxynucleotidyl transferase-

mediated d-UTP Nick End Labeling mediated d-UTP Nick End Labeling ‘’TUNEL’’ adı verilir, DNA analizi ile ‘’TUNEL’’ adı verilir, DNA analizi ile birlikte değerlendirilirbirlikte değerlendirilir

Apoptoz sırasında DNA içeriği ve morfolojik Apoptoz sırasında DNA içeriği ve morfolojik değişiklikler olmadan erken dönemde DNA değişiklikler olmadan erken dönemde DNA kırıklarının gösterilmesikırıklarının gösterilmesi

Tüm hc tiplerine uygulanabilir olmasıTüm hc tiplerine uygulanabilir olması Apoptototik hc siklusunun takibiApoptototik hc siklusunun takibi

Kantitatif olması Kantitatif olması avantajkenavantajken Pahalı, zor, apoptotik hc hazırlık Pahalı, zor, apoptotik hc hazırlık

aşamasında kaybedilmesi, TdT ve DNA aşamasında kaybedilmesi, TdT ve DNA polimeraz gibi enzimlerin ısıya çok duyarlı polimeraz gibi enzimlerin ısıya çok duyarlı olması gibi dezavantajları vardırolması gibi dezavantajları vardır

Sub G1 pik ve DNA analiziSub G1 pik ve DNA analizi– Subdiploik DNA piki apoptozun özgül belirtecidirSubdiploik DNA piki apoptozun özgül belirtecidir– Apoptotik hücreler G0/G1 evresindeki hücrelere göre Apoptotik hücreler G0/G1 evresindeki hücrelere göre

daha az PI bağlayabilir ve subdiploid floresan yoğunluğu daha az PI bağlayabilir ve subdiploid floresan yoğunluğu gösterirgösterir

– DNA degradasyonu için deterjenlar kullanılarak floresan DNA degradasyonu için deterjenlar kullanılarak floresan boyaların (PI/DAPİ) hc membranınıdan içeri girmeleri boyaların (PI/DAPİ) hc membranınıdan içeri girmeleri sağlanırsağlanır

İşlem öncesi RNAaz ile muamele edilmelidirİşlem öncesi RNAaz ile muamele edilmelidir Yöntemin avantajı hc DNA içeriği ve apoptoz hakkında bilgi Yöntemin avantajı hc DNA içeriği ve apoptoz hakkında bilgi

sağlamasıdırsağlamasıdır

Kaspaz aktivasyonuKaspaz aktivasyonu Kazpaz uyarımlı substratlar renklenir ve ya floresan ürünler Kazpaz uyarımlı substratlar renklenir ve ya floresan ürünler

oluştururlaroluştururlar Kaspaz 1, 3 ve 8 için ticari kitler vardırKaspaz 1, 3 ve 8 için ticari kitler vardır

– Kaspazların ölüm substratlarından olan poly ADP-riboz Kaspazların ölüm substratlarından olan poly ADP-riboz polimerazın (PARP) tespit edilmesi yöntemleri vardırpolimerazın (PARP) tespit edilmesi yöntemleri vardır

PARP, DNA hasarına cevap olarak aktive olan DNA tamirinde yer PARP, DNA hasarına cevap olarak aktive olan DNA tamirinde yer alan bir enzimdiralan bir enzimdir

Erken apoptozda , PARP özellikle kaspaz 3ile kesilir, 89 ve 24kDa Erken apoptozda , PARP özellikle kaspaz 3ile kesilir, 89 ve 24kDa PARP fragmanları oluşurPARP fragmanları oluşur

89 kDa parçayı tanıyan antikor ve DNA için farklı boyalarla 89 kDa parçayı tanıyan antikor ve DNA için farklı boyalarla apopyotik hc popülasyonları ve hc siklusu,DNA ploidisini kapsayan apopyotik hc popülasyonları ve hc siklusu,DNA ploidisini kapsayan ayrıntılı analizler yapılabilirayrıntılı analizler yapılabilir

Canlı hücrelerdeki kaspazların Canlı hücrelerdeki kaspazların değerlendirilmesi değerlendirilmesi

– FLİCA (fluorochrome labelled inhibitor of FLİCA (fluorochrome labelled inhibitor of caspase) ile kaspaz aktivasyonu gösterilircaspase) ile kaspaz aktivasyonu gösterilir Kaspazların aktif enzim merkezlerinin ligandlarına Kaspazların aktif enzim merkezlerinin ligandlarına

benzer olarak yapılmışlardırbenzer olarak yapılmışlardır Bütünlüğü bozulmamış plazma membranlarından Bütünlüğü bozulmamış plazma membranlarından

geçebilmesi, aktif kaspazlara kovalan bağlanması geçebilmesi, aktif kaspazlara kovalan bağlanması nedeniyle canlı hücrede aktif kaspazlar incelenebilr nedeniyle canlı hücrede aktif kaspazlar incelenebilr