Fluorescencja 8-azaksantyny i jej pochodnych w środowisku

wodnym: jeszcze raz fototautomeria.

Jacek Wierzchowski

Katedra Fizyki i Biofizyki UWM w Olsztynie

N

N

NO

O

H

H

N

H

NNH

N

NO

O

H

H

N

ksantyna 8-azaksantyna (8-azaX) (X)

2-aminopuryna N1,N6-etenoadenozyna formycyna A 8-azaguanina

max ~ 360 nm max ~ 410 nm max ~ 340 nm max ~ 390 nm

~ 0.6 = 0.55 = 0.08 ~ 0.08 ÷ 0.3

Najważniejsze zastosowania:Badania oddziaływań enzym-ligand oraz asocjacji białek, polinukleotydów itd.Badania dynamiki DNA i RNAFluorymetryczne oznaczanie aktywności enzymów

Fluoryzujące pochodne i analogi puryn, stosowane w badaniach

enzymologicznych (przykłady).

N

N

N

NH

NH2

NH

N

NN

N

R

NN

N

NH

NH2

R

NH

NNH

N

N

NH2

O

Czy 8-azaksantyna fluoryzuje?

Deaminaza guaninowa (GDA) działa na 8-azaguaninę, produkując 8-azaX:

NH

NNH

N

N

NH2

O

NNH

NH N

O

O

NH

+ NH3GDA

Gdyby produkt fluoryzował, mielibyśmy metodę oznaczania aktywności GDA.

Enzym ten jest ważny klinicznie - stanowi marker zakażenia HCV!

Inne możliwe pożytki z fluorescencji 8-azaX:• Badanie oddziaływań z oksydazą ksantynową.• 8-azaX to silny inhibitor urykazy (enzym utleniajacy kwas moczowy).• Pochodne metylowe – analogi kofeiny, teofiliny etc. to potencjalne ligandy dla receptorów adenozynowych.

Pierwsze podejście: produkt deaminacji 8-azaguaniny nie fluoryzuje

NH

N

N

N

NH2

O

_

NN

NH

N

N

NH2

O

_

N

NH

N

NH

O

O

_

NN

NH

NH

N

O

O

_

Własności kwasowo-zasadowe puryn i 8-azapuryn.

Związek Główna forma anionowa

pKa fluorescencja w pH 7

Guanina (G) 9.2 nie (forma obojętna)

8-azaG 6.5 tak (390 nm) – forma obojętna

Ksantyna (X) 7.2 nie(mieszanina form)

8-azaX 4.7 nie (monoanion!!)

Albert, A. Chemistry of 8-azapurines. Adv. Heterocycl. Chem. 1986, 39, 117-178.

Czy forma obojętna 8-azaX (pH < 5) fluoryzuje? TAK!! ale…

(▬▬), absorpcja w pH 2; (▬ ▬), absorpcja w pH 7; (○○○), wzbudzenie fluorescencji w pH 4;

(●●●), fluorescencja w 1 mM HCl; (++++), fluorescencja w metanolu.

0

0.2

0.4

0.6

0.8

1

1.2

190002400029000340003900044000

Wavenumber [cm-1]

Ab

so

rba

nc

e/f

luo

res

ce

nc

e

Tautomeria formy obojętnej 8-azateofiliny:L’abbe G., Persoons M-A., Toppet S. Magn. Res. Chem. 25 (1985), 362-4.Sanchez M.P., Romnero MA, Salas JM, Cardenas DJ, Molina J, Quiros M.. J. Mol. Struct. 344 (1995), 257-264.

NNH

N

N

N

O

O

CH3

CH3

NN

N N

O

O

N

CH3

CH3

H

>

N(8)H N(7)HDMSO: 80% <20%Kryształ: 100%

Wygląda na to, że główną formą 8-azaX jest forma N(8)H. Zatem czy to ona fluoryzuje? Model:

NN

NH

NH

N

O

O

CH3

Fluorescencja N8-metylo-azaX:

0

0.2

0.4

0.6

0.8

1

1.2

1.4

1.6

1.8

2

180002300028000330003800043000

Wavenumber [cm-1]

Ab

so

rba

nc

e/f

luo

res

ce

nc

e

(▬▬), absorpcja w pH 3; (▬ ▬), absorpcja w pH 11; (○○○), wzbudzenie fluorescencji w pH 3; (∆∆∆),wzbudzenie fluorescencji w pH 11. (●●●),

fluorescencja w 1 mM HCl; (×××), fluorescencja w pH 11; (++++), fluorescencja w metanolu.

Wydajność fluorescencji (pH 9) - 60% (!!!)

0

20

40

60

80

100

120

140

160

0 2 4 6 8 10 12pH

Flu

ore

scen

ce

Fluorescencja 8-azaX (●--●) i N8-m-azaX (■■), mierzona

w 420 nm, jako funkcja pH.Wartości pKa stanu podstawowego: 4.7 (8-azaX) i ~7.2 (N8-m-azaX).

------------------------------------

Ale dlaczego fluorescencja N8-m-azaX poniżej i powyżej 7.2

jest identyczna?

Kwasowość molekuł w stanach wzbudzonych może różnić się znacznie od kwasowości w stanie podstawowym:

OH O

+ H+

-naftol: pKa = 9.3 pK* ~ 2.8

fluorescencja formy anionowej występuje w pH > 2.5 (obok formy obojętnej!)-----------

cykl Foerstera pozwala na obliczenie pK* na podstawie widm formy protonowanej i zdysocjowanej:

)(101.2/)(10ln* 00003

0000 AHAAHA kThcpKpK

A00

;

AH00 - liczby falowe (w cm-1) przejść 0-0 dla obu form.

Przesunięcie widm o 475 cm-1 w temperaturze 300 K oznacza pK* - pK = 1

Jakie jest pK* dla N8-metylo-azaX (pKa ~7.4)?

A00 ≈ 29000 cm-1AH00 ≈ 32900 cm-1 pK* - pK ~ - 8 (± 0.5)

pK* ~ -0.5 (!!!!)

SO3-SO3-

SO3- OH

COOH

Przykłady literaturowe:

ZwiązekpKa pK* ΔpK

fenol 10.6 3.6 -7.0

β-naftol 9.3 2.8 -6.5

(piranina) 7.7 1.3 -6.4

3.7 6.9 +3.2

NNCH3

N

NO

O

H

H

N

NNCH3

N

NO

O

H

H

N

NN

N

NO

O

H NCH3

NNCH3

N

NO

O

H N

_

_

**

pK = 7.4

h - H+

fluorescencja 420 nm

- H+

fluorescencja 340 nm(tylko w metanolu)

pH>7.4

Wytłumaczenie pochodzenia fluorescencji N8-metylo-azaX w środowisku wodnym (420 nm) i metanolowym (340 nm)

NNH

N

NO

O

H

H

N

NNH

N

NO

O

H

H

N

NN

N

NO

O

H

H

N

NNH

N

NO

O

H N

_

_

**

pK = 4.7

h - H+

fluorescencja 420 nm

(nie fluoryzuje)

- H+

fluorescencja 335 nm (tylko w metanolu)

A jeśli tak, to…

Wytłumaczenie pochodzenia fluorescencji 8-azaX w środowisku wodnym i metanolowym (fototautomeria anionu!)

**Zagadka: jakie jest pK* dla 8-azaX?

Dlaczego w środowisku wodnym nie pojawia się forma obojętna związku?

[AH]* [A- ]* + H+k1

k -1

dyfuzyjna stała przeniesienia protonu: V-1 = kdif 10-pH[A-]*

kdif=5·1010 M-1·s-1 (dla przeniesienia protonu)

k1 = k-1(pH=pK*) = V-1/[A-]*= 100.5·5·1010·s-1 ≈ 1.6·1011 s-1;czas przeniesienia protonu 6.3 ps.

czas zaniku fluorescencji [AH]* (mierzony w metanolu): 0.85 ns

Czy rzeczywiście ten sam chromofor świeci w 8-azaX i N8-metylo-8azaX?

Pomiary czasów zaniku fluorescencji (J. Sepioł, IChF PAN):

0

2

4

6

8

10

12

14

0 2 4 6 8 10 12

pH

deca

y tim

e [n

s]

1.0E+01

1.0E+02

1.0E+03

1.0E+04

0 10 20 30 40 50

time [ns]co

unts

N8-me-8-azaX, pH 11

8-azaX, pH 1.3 - 5.6

Lampa

Wnioski: a) ten sam chromofor w obu związkach i całym zakresie pH; b) w pH < 3 obserwujemy tłumienie dynamiczne.

Trochę wspomnień:Wierzchowski J.; Shugar, D. Luminescence studies on formycin, its aglycone, and their N-methyl derivatives: tautomerism, sites of protonation and phototautomerism. Photochem. Photobiol. 1982, 35, 445-458.

NH2

NN

N

NH

H R

NH2

NN

NH

N

R

NH2

NN

N

NH

R

hv, -H+

*

+

Wierzchowski, J.; Szczęśniak, M.; Shugar D. Fluorescence emission properties of the cation of 4-aminopyrazolo[3,4-d]pyrimidine, an adenine analogue: evidence for phototautomerism. Z. Naturforsch. 1980, 35c, 878-889.

NH2

NH

NN

N

H

NH2

NN

N

NH

NH2

NH

NN

N

hv, -H+

*

+

Inne przypadki fototautomerii wśród analogów purynowych:

Taylor C.A., El-Bayoumi A.A., Kasha M., 1969, PNAS 63, 253-260. 7-azaindol

N-H

N N-H

N N

N-H N

N-H

*hv

Wenska G.; Skalski B; Insinska M.; Paszyc S.; Verrall, R.E. Ground and excited state prototropic behavior of 1-(purin-6-yl)-3-methylimidazolium chloride. J. Photochem. Photobiol. A 1997, 108, 135-142.

N

CH3-N

NH

N

N

N

N

CH3-N

N

N

NH

N

+ +

hv

*

C. Santhosh and P. C. Mishra. Electronic spectra of 2-aminopurine and 2,6-diaminopurine: phototautomerism and fluorescence reabsorption. Spectrochimica Acta Part A: Molecular Spectroscopy, 1991, 47, 1685-1693.S. K. Srivastava and P. C. Mishra. Phototautomerism of the G---C base pair of DNA. Journal of Theoretical Biology, 93, 1981, 655-666.

Zastosowanie w enzymologii: reakcja 8-azaX z fosforylazą ksanozynową (PNPII) z E. coli - (synteza 8-

azaksantozyny -???) – B. Kierdaszuk.

Puryna + rybozo-1-fosforan → nukleozyd + Pi

220 240 260 280 300 3200.0

0.2

0.4

0.6

0.8 276AzaXao

AzaXan265

Ab

so

rban

ce

Wavelength, nm

Warunki: ~100 M 8-azaX, pH ~5, 2 mM rybozo-1-fosforan, 25 C....

Reakcja idzie.... tylko czy to aby na pewno produktem jest 8-azaksantozyna???

... i 9-benzylo-azaX

NN

NH

NH

N

O

OCH2Ph

240 260 280 300 320 3400.00

0.02

0.04

pH 9

pH 12pH 7

pH 5.3

pH2

90% MeOH276 AzaXao

305

Abs

orba

nce

Wavelength, nm

-0.1

0

0.1

0.2

0.3

0.4

0.5

0.6

200 250 300 350 400 450 500

Wavelength [nm]

Abso

rban

ce/fl

uore

scen

cepKa ~ 7.2; pKa ~ 5.7

Anion: absorpcja 305 nm, Anion: absorpcja 279 nm Emisja 440 nm Emisja 365 nm

Porównajmy....

Nukleozyd (??)

350 400 450 5000.0

0.2

0.4

0.6

0.8

1.0AzaXao

exc=275 nm

440 nm

90% MeOHpH 12

pH 2

Fluo

resc

ence

Inte

nsity

Wavelength, nm

H I J K L M

Co się dzieje?

NN

NH

NH

N

O

O

O

OHOH

HOCH2

NN

NH

NH

N

O

O

O

OHOH

HOCH2

NN

NH

NH

N

O

O

O

HOCH2

OH

OH

N9-nukleozyd?Chyba nie!

N8-nukleozyd?N7-nukleozyd?

A jak reaguje PNP ze ssaków? – Brak reakcji!!

Dla porównania: Reakcja E. coli PNP-II z AzaGua:

240 260 280 300 320 3400.00

0.02

0.04

0.06

Agua_product_pHeff

9

126.5

4.5

Ab

so

rban

ce

Wavelength, nm

Porównanie widm produktu reakcji z widmami 8-azaguanozyny pokazuje, że w tym wypadku rybozylacja idzie na N-9 (z możliwą małą domieszką innych form).

Dlaczego??

NN

NH

NH

N

O

O

-D-rybozyl

NN

NH

N

N

O

NH2

-D-rybozyl

Jakie mogą być z tego pożytki?

• jeśli N8-metylo-azaGuanina jest substratem dla GDA….. to mielibyśmy czułą metodę analityczną dla tego enzymu

• W kompleksach z białkami procesy ESPT będą przebiegały inaczej niż w wodzie – jak??? Na pewno można odróżnić ligand wolny od związanego….

• Aza-analogi kofeiny, teofiliny, teobrominy…… fluorescencyjne badania oddziaływań z receptorami?

• ------• PNPII – pierwszy enzym rybozylujący puryny (lub

analogi) w pozycji innej niż N9?? • A w ogóle to dlaczego inne formy PNP rybozylują puryny

na N9, jeśli N7-nukleozydy podlegają fosforolizie?

REKLAMA

Katedra Fizyki i Biofizyki UWM ogłosi wkrótce

konkurs na stanowisko asystenta