Fény- és fluoreszcens mikroszkópia

Fluoreszcens mikroszkópos mérési

technikák (live cell imaging)

Fluoreszcens live cell imaging - in vivo / in vitro

- brightfield kombináció

- multikolor detekció, detektor

- vastagság: 10 nm – 200 mm; üvegfelszín!

- widefield / rétegek / letapadási

felszín

- időbeliség

- T, pH, CO2, O2, stb – inkubációs kamra

http://www.microscopyu.com/articles/livecelli

maging/fpimaging.html

http://zeiss-

campus.magnet.fsu.edu/articles/livecellimaging/imagingsystems.html

http://www.microscopyu.com/articles/livecellima

ging/culturechambers.html

http://www.microscopyu.com/articles/livecelli

maging/livecellmaintenance.html

http://www.microscopyu.com/articles/livecellimaging/

chamberresources.html

FRET (Förster / Fluorescent resonant energy transfer)

• kvantitatív információ fehérjék, lipidek, enzimek, nukleinsavak közötti

interakció tér- és időbeli változásáról

• távolság-függő, nem-radiativ kvantummechanikai folyamat -> szenzitizált

akceptor emisszió

• Theodor Förster, 1940s

• rezonancián alapuló, dipólus-dipólus

kölcsönhatás

http://www.olympusmicro.com/primer/techniques/confocal/applications/fretintro.html

http://www.microscopyu.com/tutorials/flash/spectralimaging/fretbiosensors/index.html

FRET (Förster / Fluorescent resonant energy transfer)

• szükséges feltételek:

1. donor emissziója és akceptor gerjesztési

spektruma fedjen át

2. donor és akceptor távolsága < 10 nm

3. donor és akceptor dipólus-szerkezete

megfelelő elrendezésű legyen

Förster távolság (50% E)

energiatranszfer hatékonysága

donor – akceptor

közötti távolság

FRET-re alkalmas távolság

FRET (Förster / Fluorescent resonant energy transfer)

• legtöbbször a kölcsönhatásra igen/nem válasz – valódi molekuláris távolság

mérésére csak korlátozottan használható

• fontos gyakorlati tényezők:

- donor és akceptor hasonló fényességű legyen

- donor és akceptor sztöchiometria 10:1 – 1:10 között (ideális az 1:1, vagy

az akceptor fölösleg)

- bleed-through és átgerjesztés

• donor gerjesztése az

akceptort is gerjeszti

• donor emissziója az

akceptor emissziójával

átfed

- FRET-pár térszerkezetét a jelölés/negyedleges szerkezet hogyan

befolyásolja

- photobleaching

FRET (Förster / Fluorescent resonant energy transfer)

• Raichu FRET szenzorok: Ras and interacting protein chimeric unit

http://www.fret.lif.kyoto-u.ac.jp/e-phogemon/

intermolekuláris (bimolekuláris) intramolekuláris (unimolekuláris)

teljes (complete) részleges (incomplete)

FRET (Förster / Fluorescent resonant energy transfer)

• Raichu FRET szenzorok: Ras and interacting protein chimeric unit

http://www.fret.lif.kyoto-u.ac.jp/e-phogemon/

távolság-függő orientáció-függő

FRET (Förster / Fluorescent resonant energy transfer)

• Raichu FRET szenzorok: Ras and interacting protein chimeric unit

http://www.fret.lif.kyoto-u.ac.jp/e-phogemon/

- kis GTPáz-ok aktivitásának sejten belüli meghatározására

- donor (CFP), akceptor (YFP), adott GTP-áz (pl.

H-Ras), adott GTP-áz kötőpartnerének a GTP-ázt

kötő doménje (pl. Raf Ras-kötő doménje; RBD)

- nem egyszerű jól kialakítani

• megfelelő kötődomén legyen: endogén GAP-

okkal kompetíció alakulhat ki -> GAP inhibíció ->

nem-stimulált állapotban is magas GTP szint ->

a szenzor szűk dinamikus tartományú lesz

• spacer: ált. (Gly-Gly-Ser-Gly-Gly)1-6x

• sejten belüli lokalizáció: K-Ras4B CAAX-box –

plazmamembrán lokalizáció

• megfelelő FRET-párok a jó SNR-hez

FRET (Förster / Fluorescent resonant energy transfer)

FRET (Förster / Fluorescent resonant energy transfer)

• hogyan lehet mérni?

1. szenzitizált emisszió / két színű, raciomentrikus mérés

• elvileg a legegyszerűbb – DE crosstalk!

• főleg bioszenzoroknál

• sok kontroll kell

FRET+ esetén a 2 molekula ko-lokalizációját fixált sejtekben is ellenőrizni kell!

FRET (Förster / Fluorescent resonant energy transfer)

• hogyan lehet mérni?

2. akceptor photobleaching (donor dequenching)

• akceptor photobleaching után a donor emissziója megnő – 2

mérés csak (előtte / utána)

• min. 90% akceptor bleaching a donor emisszió változtatása

nélkül!

• gond: irreverzibilis, relatíve lassú, kinetikai mérésekre nem jó –

gyak. csak fixált prepiken

• bleaching alatt fotokonverzió is történhet....

• előny: rel. egyszerű, kivitelezése gyors

FRET (Förster / Fluorescent resonant energy transfer)

• hogyan lehet mérni?

3. Fluorescence Lifetime Imaging Microscopy (FLIM)

• donor molekula fluoreszcens élettartamát az akceptorral való

interakció befolyásolja

• nagyon gyors kinetikájú (nsec) mérések

• gond:

• előny:

- akceptornak nem kell fluoreszkálnia

- donor gerjesztési műtermékek nem

befolyásolják

- drága berendezés

- gyors változásokhoz rel. lassú imaging

- a fluor élettartam-csökkenés nem mindig illeszthető

exponenciálisan http://www.olympusmicro.com/primer/techniques/confocal/applications/flimintro.html

FRET (Förster / Fluorescent resonant energy transfer)

• hogyan lehet mérni?

4. Spektrális imaging

• 2 gerjesztésnél a teljes emissziós

spektrumot felveszik

• kisebb jel – zaj érték, mint a 2

csatornás detekciónál

5. Fluorescence polarizációs anizotrópia

http://www.microscopyu.com/articles/fluorescence/

fret/fretintro.html

• polarizált gerjesztés: a

gerjesztett molekula fluor.

élettartama alatt nem mozdul

-> emisszió ugyanúgy

polarizált (izotróp)

• FRET -> anizotrópia

Fluoreszcens környezeti jelző molekulák

• detektálni kívánt szabad koncentráció: <50 nM és >50 mM is lehet! ->

festék Kd értéke (ált. 0.1-10x Kd-vel arányos [Ca2+]IC mérhető)

„Bioszenzorok”

- Ca2+, Mg2+, Zn2+, egyéb fémionok

- pH indikátorok

- Na+, K+,Cl-, foszfát, nitrit, egyéb anionok

- membrán potenciál

Ca2+ szenzorok - fő szempontok

• sejtbe való bejuttatás, kompartmentalizáció, diffundálás

- acetoximetil (AM) észter variánsok

• szabad / kötött forma gerjesztési, ill.

detekciós hullámhossza

• kalibrálás, mérés: raciometrikus! (festéktöltés / szivárgás, vastagság / fókusz-drift,

fotobleaching ellen...)

- dextrán konjugátumok

http://www.invitrogen.com/site/us/en/home/References/Molecular-Probes-The-Handbook/Indicators-for-Ca2-Mg2-

Zn2-and-Other-Metal-Ions/Introduction-to-Ca2-Measurements-with-Fluorescent-Indicators.html#head1

Fluoreszcens környezeti jelző molekulák

• Fura2: raciometrikus,

340/380 nm ex, 510 nm em

- UV gerjesztés

Fluo3

Fura2

- látható fény gerjesztés

• Fluo3, Fura Red: nem

raciometrikusak, de együtt

használhatóak

• gyors gerjesztés-váltás kell:

Shutter DG4 / LED

http://www.invitrogen.com/site/us/en/home/Reference

s/Molecular-Probes-The-Handbook/tables/Summary-

of-fluorescent-Ca2-indicators-available-from-

Molecular-Probes.html

http://www.olympusmicro.com/primer/techniques/confo

cal/fluorophoresintro.html

Ca2+ szenzorok

Fluoreszcens környezeti jelző molekulák

• Cameleon: Calmodulin-M13 fehérje + CFP, YFP FRET pár -> Ca2+-

függő konformációváltozás hatására FRET

- fehérje-alapú Ca2+ indikátorok (genetically encoded Ca indicators;

GCaMP; GECI)

Ca2+ free

Ca2+

• Pericam: b-barrel doménhez kapcsolt Ca-szenzor

Ca2+ szenzorok

http://www.olympusmicro.com/primer/techniq

ues/confocal/applications/cameleons.html

Fluoreszcens környezeti jelző molekulák

Ca2+ szenzorok

Fluoreszcens környezeti jelző molekulák

Ca2+ szenzorok

• in vivo mérések: ált. 2PM

2PM

• bulk loading / pipette loading / genetikai

szenzorok

Fluoreszcens környezeti jelző molekulák

fluoreszcens fehérjék (optical highlighters)

• ált. GFP származékok

• fotofizikai jellemzők: emissziós / sötét állapotok, blinking

• adott l-ú fény hatására a b-barrel szerkezet megváltozik -> optikai

sajátságok megváltozása

http://www.olympusmicro.com/primer/techniques/confocal/applications/opticalhighlighters.html

http://zeiss-campus.magnet.fsu.edu/articles/probes/highlighterfps.html

• fotoaktiváció

• fotokonverzió

• fotoswitching

Uncaging (pl. glutamát)

Photoactivation

Photo-

conversion

Reverzibilis

photoswitching

Photoactivation (PA)

Fluoreszcens környezeti jelző molekulák

• gerjesztés UV vagy near-UV fénnyel ->

intramolekuláris dekarboxiláció

• PA-GFP: T203H – nagy UV elnyelés, de

450-550 nm között nem gerjeszthető ->

aktiváció után már 488 nm-en

gerjeszthető

• gond, hogy aktiválás előtt nehezen lokalizálható.....

• PA-mCherry: 405 nm megvilágítás -> aktiváció után már 564 nm-en

gerjeszthető, 595 nm emittál -> PA-GFP-vel kettős fotoaktiváció

• Phamret (Photoactivation-mediated resonance energy transfer):

• PA-GFP + ECFP FRET pár

• aktiváció nélkül 458 nm ex -> cián emisszió

• aktiváció (405 nm) után 458 nm ex -> zöld emisszió (FRET alakul ki)

• előny: lokalizálható, csak 1 gerjesztési hullámhossz kell; gond:

dimer-méretű

Fluoreszcens környezeti jelző molekulák

Photoswitching (PS)

• pl. PS-CFP: 405 nm-es gerjesztés

hatására emissziós változás (cián -> zöld),

így aktiválás előtt is lokalizálható

• ált. gyenge emisszió

és fotostabilitás

• irreverzibilis: ált. Glu222

dekarboxilációja

Photoconversion

Fluoreszcens környezeti jelző molekulák

• gerjesztés UV vagy near-UV fénnyel -> backbone

hasítás -> emissziós hullámhossz változás

- Kaede: zöld -> piros emisszió, 2000x arányváltozás - aerob körülmények mellett stabil és irreverzibilis fotokonverzió

- jó kontraszt, de tetramer szerkezet

- Dendra2 : monomer szerkezet

- EosFP / tdEosFP: 405 nm aktiváció -> 518 nm > 581 nm emisszió;

tandem szerkezet

- Kikume GR: 2Pi

aktiváció 760

nm-rel

Photoconversion

Fluoreszcens környezeti jelző molekulák

• gyakoribb jelenség, mint gondolták....

• szuperrezolúcióra, dinamikus folyamatok

elemzésére OK (de pl. FRET, photobleaching során

műtermék is lehet!)

Reverzibilis photoswitching

Fluoreszcens környezeti jelző molekulák

• fotokromizmus: sztohasztikus „blinking” a gerjesztés alatt (wtGFP, YFP)

• Dronpa: 405 / 488 nm gerjesztés az emissziót be / ki kapcsolja

- teljes bleaching előtt akár több százszor is ismételhető

- igen intenzív jel

• Kindling / KFP1: 525-582 nm ex -> 600 nm em, lassú elhalványulás

450-490 nm ex -> azonnali lekapcsolás

• UV -> reverzibilis cisz/transz izomerizáció

Fluoreszcens „stopper” (timer)

Fluoreszcens környezeti jelző molekulák

• DsRed: zöld -> piros emissziós átmenet rel. lassú, időben folytonos

folyamat

• mCherry változatok: kék -> vörös emissziós átmenet gyorsan (<15 min),

közepes (1,2 h) vagy lassú (9,8 h) sebességgel

génaktiváció idejét is jelzi

Photobleaching és fotoaktivációs technikák

FRAP (Fluorescence recovery after photobleaching)

FLIP (Fluorescence loss in photobleaching)

http://www.olympusmicro.com/primer/techniques/confocal/applications/flipandfrap.html

Photobleaching és fotoaktivációs technikák

Fotoaktiváció

uncaging

• biológiai jelzőmolekula (pl. Glu) kovalens kötésekkel fényérzékeny blokkoló

csoport(ok)hoz kötve -> rövid UV fényre fotolízis -> térben és időben

lokalizált felszabadulás

MNI-caged-L-glutamate

(4-Methoxy-7-nitroindolinyl-caged-L-glutamate)

• gond: sejtbe való bejuttatás

UV fény (-> 2PM manapság), fotolízis kinetikája és hatékonysága

fotolízis utáni reakciótermék gyakran mérgező (-> scavenger

megkötés)

Photobleaching és fotoaktivációs technikák

Photobleaching és fotoaktivációs technikák -

optogenetika

Channelrhodopsin2 (ChR2) – halorhodopsin (HR)

• ChR2: kék gerjesztésre Na+ ioncsatorna nyitása -

depolarizáció

• HR:

zöld/sárga

gerjesztésre

inward Cl-

pumpa –

hiperpolari-

záció

bacteriorhodopsin2 (BR)

Photobleaching és fotoaktivációs technikák -

optogenetika

• BR2: kék gerjesztésre outward H+ pumpa

FRAP

FLIP

PA

FLAP

FSM

FRET

TIRF

FCS

2Pi

Az f betűs szavak...

Hasznos honlapok

http://zeiss-campus.magnet.fsu.edu/index.html

http://www.olympusmicro.com/index.html

http://www.microscopyu.com/

http://www.invitrogen.com/site/us/en/home/References/Molecular-Probes-The-Handbook.html