fluorimetria 2015

AbsorciometríaSolución

PoP

Detector

ABSORCIOMETRIA vs. FLUORIMETRIA/FOSFORIMETRIA

D. von Baer 2003

AbsorciometríaSolución

PoP

Fluorimetría

Po

Detector

PF

Luz emitida

Detector

Solución

ABSORCIOMETRIA vs. FLUORIMETRIA/FOSFORIMETRIA

D. von Baer 2003

Fluorescencia y Fosforescencia Molecular• Son procesos fotoluminiscentes en que molécula emite

radiación que absorbió• Fluorescencia: Si emisión ocurre HASTA 10- 8 seg

después de absorción de luz• Fosforescencia: Si emisión ocurre DESPUES de 10- 8 seg

de Absorción de luz

• Absorción de luz obedece a ecuación: E = h *

Energía (erg)

Cte. de Planck

(erg seg)

Frecuencia(ciclos

seg)

• Niveles energéticos de las moléculas: relacionados con enlaces moleculares

D. von Baer 2003

Estado electrónico fundamental

So

Fluorescencia y Fosforescencia

Ener

gía

D. von Baer 2003


2° singlete excitado

1er singlete excitadoA

bsor

ciónAbs

orci

ón

So

S2

S1


Ener

gía

Energía absorbida por la mo-lécula se puede disipar como: • Calor• Reacción Fotoquímica• Calor + Fluoresencia• Calor + Fosforescencia

D. von Baer 2003



1er singlete excitadoCal

or

Fluo

resc

enci

a (<

10-8

seg)

Abs

orci

ónAbs

orci

ón

So

S2

S1


Ener

gía

D. von Baer 2003

Cruce entresistemas



1er singlete excitado

1er triplete excitadoC

alor

Fluo

resc

enci

a (<

10-8

seg)

Abs

orci

ónAbs

orci

ón

So

S2

S1

T1

Reo

rden

amie

nto

inte

rno


Ener

gía

D. von Baer 2003

Cruce entresistemas



2° triplete excitado

1er singlete excitado

1er triplete excitadoC

alor

Fluo

rese

ncia

(<10

-8se

g)

Abs

orci

ónAbs

orci

ón

Fosf

ores

cenc

ia

(> 1

0-8se

g)

So

S2

S1

T2

T1

Reo

rden

amie

nto

inte

rno


Ener

gía

D. von Baer 2003

emisión > excitación

D. von Baer 2003

Ranura

Selecc. excitación

FuenteLumi-nosa

Muestra

Filtro

Lectura Amplificador Detector

Luz transmitidaLuz emitida

Selecc. excitación

Po P

PF

(ESPECTRO) FLUORIMETRO

D. von Baer 2003

Ranura

Selecc. excitación

FuenteLumi-nosa

Muestra

Filtro



Selecc. emisión

Po P

PF


D. von Baer 2003

Ranura

Selecc. excitación

FuenteLumi-nosa

Muestra

Filtro



Selecc. emisión

Po P

PF


Lámpara de alta intensidad emisión• Xe: espectro continuo • Hg: esp. discreto

De alta sensibilidad (Fotomultiplicador)

Filtro omonocromador

Filtro omonocromador

D. von Baer 2003

CUBETAS DE MEDIDA FLUORIMETROS• Cuatro caras transparentes• Según rango , de vidrio o de cuarzo• Fluorimetría: técnica de muy alta sensiblidad

CUBETAS MUY LIMPIAS SOLVENTES MUY PUROS

Normal Para volúmenes pequeños

D. von Baer 2003

% I

Concentración0

100

Determinaciones Cuantitativas en Fluorimertía

Para soluciones diluídas: % I = k * c

Calibración escala de lectura:

Con blanco

Con Solución más concentrada

D. von Baer 2003

Ejemplos de Aplicaciones de la FluorimetríaEn Bioquímica: Cuantificación de DNA: Microplacas Cuantificación de AMP cíclico Estudios de enlace molecular (Binding)

En Química Ambiental: Detección de Compuestos Aromáticos Policíclicos Cuantificación de iones en aguas mediante reactivos Fluorogénicos

En Biología Celular: Estudios de enlace (binding) celular Determinación de Ca, K, Cl y pH en células mediante distintos

reactivos cromogénicos

En Inmunología: Cuantificación de Reacciones de Inmunoflurescencia

D. von Baer 2003

Absorciometría

Turbidimetría

Nefelometría

Solución

Luz transmitida

Suspensión

PoP

Po

Po

P

Ps

Detector

Luz dispersada

ABSORCIOMETRIA, TURBIDIMETRIA y NEFELOMETRIA

D. von Baer 2003

Absorciometría: Se mide luz absorbida

Turbidimetría: se mide disminución luz transmitida

Nefelometría: se mide directa-mente la luz dispersada

Solución

Luz transmitida

Suspensión

PoP

Po

Po

P

Ps

Detector

Luz dispersada

ABSORCIOMETRIA, TURBIDIMETRIA y NEFELOMETRIA

D. von Baer 2003

DETERMINACIONES CUANTITATIVAS EN TURBIDIMETRIA y NEFELOMETRIA

• En suspensiones diluídas, para un haz de rayos paralelos y una dada

log P/ Po = k b c

Dispersión de luz en la suspensión depende de:Número de partículas (concentración)Tamaño y forma de las partículas de la radiación. La luz azul de (< ) es dispersada más que luz roja

INTERFERENCIAS• Cualquier reabsorción de luz afectará medición luz DISPERSADA

Elegir en que muestras tengan mínimo de absorción Dependencia de T°, densidad y muchos otros parámetros

• Aplicaciones prácticas de turbidimetría y nefelometría generalmente se basan en procedimientos empíricos y se debe tomar especial cuidado en reproducir todas las condiciones de trabajo: T°, densidad, pH, agitación, concentración de reactivos y muchos otros parámetros

D. von Baer 2003

DETERMINACIONES CUANTITATIVAS EN TURBIDIMETRIA y NEFELOMETRIA

• En suspensiones diluídas• Para un haz de rayos paralelos• A una dada

log P/ Po = k b c

Dispersión de luz en la suspensión depende de:Número de partículas (concentración)Tamaño y forma de las partículas de la radiación. A Luz azul de (< ) es dispersada más que luz roja

INTERFERENCIAS• Cualquier reabsorción de luz afectará medición luz DISPERSADA

Elegir en que muestras tengan mínimo de absorción Número de partículas (concentración) Dependencia de T°, densidad y muchos otros parámetros

D. von Baer 2003

Ejemplos de Aplicaciones de la Turbidimetría y NefelometríaEn Química Clínica: Cuantificación de Proteínas en Líquidos Biológicos mediante Reactivo de Precipitación – Ac. Sulfosalicílico

En Química Ambiental: Determinación de turbidez de agua Cuantificación de iones en aguas mediante reactivos de precipitación. Ej: sulfato

En Microbiología: Cuantificación del número de células en un medio de cultivo : Curva de Crecimiento

En Inmunología: Cuantificación de Reacciones de Precipitación con Inmunoglobulinas altamente selectivas

D. von Baer 2003

fluorimetria 2015

Documents