fluoroquinolones : mode d’action et mecanismes de
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FLUOROQUINOLONES : MODE D’ACTION ET MECANISMES DE
RESISTANCE DEVELOPPES PAR LES BACTERIES Famille des quinolones : • Une des familles les + développées actuellement • Dérivée de l’acide nalidixique (Nal) - 1962 Produit intermédiaire de synthèse de la chloroquine • Antibiotiques (ATB) synthétiques • ATB à large spectre, bactéricides, à bonne diffusion tissulaire
• ATB très utilisés…..-> apparition de nombreuses résistances
I- STRUCTURE-CLASSIFICATION
A- Structure de base Bicyclique ® activité antibactérienne : •cycle A : cycle pyridone •cycle B : cycle aromatique (benzène, pyridine, pyrimidine) • +/- 3ème cycle
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COOH
B- Classification • avant 1980 : 1ères quinolones NAL, ac. pipémidique...etc.
• depuis 1980 : Fluoroquinolones (FQ)
® 2 modifications clés : atome de fluor (F) en 6 hétérocycle azoté en 7 (pipérazine) ® Activité antibactérienne spectre élargi meilleure tolérance
Pénétration à travers la paroi bactérienne
Spectre antibactérien
R1
R7
F
R5 O Site de fixation
X8 N 1
2
3
4 5
6
7
8
A B
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® Autres substituants en différentes positions :
FQ de nouvelle génération
LEVOFLOXACINE MOXIFLOXACINE
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II- SPECTRE D’ACTIVITE ANTIBACTERIENNE
A- Ac. nalidixique et dérivés spectre étroit • S : Certaines bactéries à Gram négatif (-) Entérobactéries, Haemophilus, Vibrio Neisseria • R : Pseudomonas Bactéries à Gram positif (+) Mycobactéries, chlamydiae, mycoplasmes Anaérobies
B- Fluoroquinolones spectre très élargi • activité sur entérobactéries (x100, 1000) • Extension aux Pseudomonas à certains Gram+ (Staphylococcus aureus) aux chlamydiae, mycoplasmes
à Mycobacterium tuberculosis • Activité insuffisante sur les cocci Gram + type streptocoques (Streptococcus pneumoniae) et anaérobies pour les FQ les plus anciennes
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• Nouvelles FQ commercialisées ou en développement : actives sur toutes ces bactéries Þ Classification des FQ par "génération"
Première
Deuxième
Troisième
Ac. nalidixique Ac. pipémidique
Norfloxacine Péfloxacine Ofloxacine Ciprofloxacine
Lévofloxacine Moxifloxacine Délafloxacine
Entérobacteries Entérobacteries P. aeruginosa Cocci Gram+ (Staphylocoque) Atypiques
Entérobacteries P. aeruginosa Atypiques Cocci Gram+ (Pneumocoque) Anaérobies
Urines Urines Inf. systémiques
Inf. systémiques +/- urines
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III- MECANISMES D’ACTION
A- Pénétration intrabactérienne
FQ : hydrophobicité et type ionique variables ® interactions variables avec enveloppes bactériennes (paroi, membranes)
1- Bactéries à Gram+
ü Pas de membrane externe, paroi constituée par un
peptidoglycane épais ü Pénétration des FQ par diffusion passive
2- Bactéries à Gram-
Phospholipides
Lipopolysaccharides
Porine
Antibiotique hydrophobe
Antibiotique hydrophile
Cations (Ca++, Mg++)
Charges électriques
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ü Voie des porines (Outer Membrane Protein) canaux hydrophiles, ex : porines Omp chez Escherichia coli, impliqués dans la pénétration ¹ ATB
® FQ hydrophiles et de petite taille (< 400 da) ® pas les FQ les + hydrophobes ü Voie du LPS FQ chélatent Mg2+ associés au LPS ® désorganisation du LPS découverte de zones hydrophobes d’où pénétration des FQ hydrophobes
3- Passage de la membrane cytoplasmique (diffusion passive)
B- Cibles moléculaires: topoisomérases (TP)
bactériennes de type II
1- Notions générales
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1-1 TP: enzymes modifiant la topologie de l’ADN (nombre d'enlacements)
ü enzymes essentielles pour réplication ADN et transcription, présentes dans toutes cellules, eucaryotes et eubactéries.
1-2. 4 classes de TP chez E. coli
ü TP de type I : cassure d’1 seul brin de la molécule d'ADN
double brin relâchent l’ADN, pas besoin d’ATP
ü TP de type II : coupent les 2 brins ATP-dépendantes, essentielles
- ADN gyrase ou topoisomérase II ® surenroulement de la double hélice ++
Gyrase et TP I régulent le niveau de surenroulement de l'ADN Þ réplication, transcription, expression des gènes.
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DNA plasmidiques relachés ou surenroulés (m.électronique)
- Topoisomérase IV ® décaténation des copies d’ADN circulaires après la réplication
ü Structure oligomérique : tétramères chez les eubactéries
2- ADN gyrase (études cristallographiques)
2-1. Structure protéique
2-1.1. Tétramère A2B2 : 2 SU GyrA + 2 SU Gyr B
ü GyrA 875 acides aminés (E. coli), codée par gyrA GyrB 804 aa, codée par gyrB
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2-1.2. Plusieurs domaines avec sites d’activité ¹
ü GyrA, 2 domaines : - N-terminal, fonctionnel
site actif de la gyrase (tyrosine 122) = lieu de coupure-resoudure de l'ADN très conservé, site de mutations («Quinolone Resistance Determining Region” ou QRDR) ® Résistance aux FQ
- C-terminal, structural
ü GyrB - N terminal, fonctionnel : interaction avec ATP - C terminal, structural : interaction avec GyrA et ADN
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2-2. Activité inhibitrice des FQ
ü GyrA : cible préférentielle des FQ
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ü Formation d’un complexe tertiaire ADN-ADN gyrase-FQ Þ blocage irréversible de la réaction au stade de complexe ADN-ADN gyrase ouvert ou complexe de clivage Þ blocage de la réplication avec arrêt de la fourche Þ induction de la réponse SOS chez la bactérie Þ évènements mal définis (facteurs protéiques) Þ mort bactérienne
3- Topoisomérase IV 3-1. Structure protéique
Tétramère : 2 SU ParC (parC) + 2 SU ParE (parE), homologues à GyrA et GyrB
3-2. Fonctions
ü Décaténation, ATP dépendante ® ségrégation des chromosomes lors de la division cellulaire
Effet bactéricide : mort cellulaire
Effet bactériostatique : inhibition de la synthèse d’ADN et de la croissance
ADN gyrase ADN
+
Quinolone Mutations de l’ADN gyrase
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IV- MECANISMES DE RESISTANCE ü Très étudiés chez E. coli, P. aeruginosa, S. aureus et
S. pneumoniae Majoritairement mutations chromosomiques Résistance plasmidique décrite plus récemment
ü 3 mécanismes :
ATB Modification de la cible ¯ accumulation intrabactérienne
Inactivation enzymatique
Mutations Modification enzymatique
Protection (efflux)
FQ +++ - + ++ (+)
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A- Altérations des cibles Mutations chromosomiques au niveau des domaines conservés appelés "QRDR" touchant les gènes codant pour les sous-unités des topoisomérases II :
- gyrA et gyrB (ADN gyrase) - parC et parE (topoisomérase IV)
Þ Résistance de haut niveau, croisée à toutes les FQ
1- Moyens d'étude moléculaire, exemple des altérations GyrA
GyrA, cible préférentielle des FQ ® rôle prépondérant dans la R acquise Altérations responsables de la mauvaise affinité de la gyrase pour FQ
1-1 Etudes génétiques • AMPLIFICATION PAR PCR ET SEQUENÇAGE DE LA QRDR
GYRA Choix d’amorces encadrant la QRDR gyrA, amplification et séquençage. • TEST DE DOMINANCE
Allèle gyrA sauvage dominant sur allèle gyrAR muté ® expce de complémentation en trans : introduction d’1 plasmide porteur du gène gyrA S dans bactérie R (gyrA muté) : R devient S Preuve que allèle gyrA R= mécanisme de Rce
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• ECHANGES ALLELIQUES (S. PNEUMONIAE, S. AUREUS)
Transformation d'une souche de pneumocoque sensible aux FQ avec des fragments d'ADN comprenant la QRDR gyrA ou parC de différents mutants caractérisés Þ recombinaison homologue Þ apparition d'une résistance aux FQ avec CMI
1-2 Etudes biochimiques
ü Purification enzymatique des sous-unités protéiques GyrA et GyrB
ü Etude inhibit° ADN gyrase par FQ pour souches S et R
(Concentration Inhibitrice 50) In vitro :GyrA (R) + GyrB (S) ® gyrase R ( CI50 FQ)
2- Altérations GyrA et ParC
- Prédominantes, QRDR localisées près du site actif des sous-unités, à l'extrémité N-terminale au niveau du site de fixation des FQ - Observées chez de très nombreuses bactéries Gram+ et -, mycobactéries, chlamydiae et mycoplasmes substitutions et positions » E. coli
2-1 QRDR GyrA
ü Acidez aminés 67-106 (numérotation E. coli)
ü Mutations ponctuelles isolées ou associées Niveau de Rce fonction du type et nb de mutations
ü Mutations les + fréquentes : positions 83 et 87
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2-2 QRDR ParC
Région homologue E. coli GyrA S83 D87 ParC S80 D84
3- Altérations GyrB et ParE ü Plus rares, moindre retentissement sur niveau de résistance ü QRDR définies également pour GyrB et ParE B- Protection de la cible ü Protéines constituées de répétitions de pentapeptides ü Chez les bactéries à Gram négatif (E. coli, Klebsiella, etc…) et
chez Mycobacterium tuberculosis 1. Exemple des BGN
ü Support plasmidique, transférable par conjugaison à d'autres
bactéries à Gram négatif. 1ère description en 1998 de la protéine Qnr chez K. pneumoniae. Identification du gène qnr au sein d'un intégron, dans le plasmide Þ code pour une protéine Qnr qui protège l'ADN gyrase de E. coli contre l'action inhibitrice de la ciprofloxacine.
ü Phénotype : résistance à l’acide nalidixique, faible niveau de R
aux FQ mais effet additionnel mutations chromosomiques + protection plasmidique Þ haut niveau de R
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ü Implication clinique ? Oui (Asie –Chine-, Inde, USA, Europe).
C- Défaut d’accumulation de l’ATB
Diminution de la quantité d’ATB atteignant la cible par défaut de pénétration efflux actif
1. Défaut de pénétration ou imperméabilité
• Chez des BGN : E. coli, P. aeruginosa • Diminution ou disparition des porines • Le plus souvent associée à l’efflux actif
2. Efflux actif
• Systèmes de protéines transmembranaires +/- complexes exportant les ATB en dehors de la bactérie
• Efflux actif ® énergie-dépendant (2 classes suivant la source d’énergie)
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• Résistance acquise de type MDR (« Multidrug Resistance ») à plusieurs familles d'ATB différentes
• Chez les BGN (E. coli, P. aeruginosa) et BGP (S. aureus, S. pneumoniae)
• Exemple : pompe NorA de S. aureus qui entraîne une résistance à plusieurs ATB, quinolones, blactamines, chloramphénicol, et autres composés divers
• Efflux actif impliqué dans la résistance naturelle et acquise aux FQ
Différentes pompes MDR bactériennes: 2 classes
ATB
ADP+Pi
S. aureus
NorA
H+
ATP
ATB
LmrA
L. lactis
H+
MbexterneOprM
MexB
MexA
ATB
P. aeruginosa
Mbinterne
Transporteur « ATP Binding Cassette »
Transporteurs utilisant la Force Proton Motrice
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IV- Impact clinique de la résistance aux FQ ü Apparition précoce, espèces pathogènes touchées : S. aureus et P. aeruginosa, entérobactéries (E. coli +++)
CHU de Bordeaux, 2019 : ³ 90%% des S. aureus et ³ 87% des entérobactéries sensibles à la lévofloxacine et ³ 82% des P. aeruginosa sensibles à la ciprofloxacine.
ü Autres espèces concernées :
- Campylobacter, salmonelle etc… Lien avec l'utilisation des FQ chez l'animal
- Gonocoque, IST bactérienne, 65% de résistance aux FQ en 2020 (CNR IST bactériennes)
V- CONCLUSION ü Résistance aux FQ décrite maintenant pour de nombreuses
espèces bactériennes ü Altération des cibles bien connue mais émergence de
nouveaux mécanismes (protection de la cible, efflux actif, inactivation enzymatique)
ü Association de plusieurs mécanismes de R en clinique Þ haut niveau de résistance ü Surveillance épidémiologique +++