仮想化技術を用いたNMRデータの統合的解析環境

大阪大学 蛋白質研究所： 小林直宏

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１．仮想化技術を利用した解析環境の構築 ２．化学シフトデータベースとその応用 ３．PDBj-BMRBにより開発されたツール群の紹介

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仮想化技術を利用した解析環境の構築

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40000

400000 800000

トラ

ンジ

スタ

数

1970 1980 1990 2000 2010

計算機の高速化、マルチコア化は急速に進む

Core-i7/5/3ファミリーの登場

Ivy Bridge プロセスルール:32nm 3次キャッシュ: 8MB 仮想化対応: VT-x,VT-d 2~4コア

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仮想化のメリット 少電力化、省スペース化が期待できる 仮想サーバーを冗長的に運用することで耐障害性向上が期待できる バックアップ、復元の操作が容易（仮想OSイメージをコピーすればいい） 研究支援プログラムなど長期運用が可能 ハードウエアの寿命、故障等の心配から解放される・・・？ 一度OSイメージのイメージが出来れば他の仮想環境への 移行は比較的簡単

仮想化のデメリット 何でも仮想化出来るわけではない（特殊デバイス、OSのタイプなど） Windows, MacOSXなどライセンス的に難しいものは対応が困難 非常に高いマシンスペックを必要とする OSイメージのバックアップなどに大量のストレージを消費する

現在稼働中のマシンの仮想化は大変難しい P2Vソフトを利用すればよいが、そう簡単ではない・・・

ライセンスの扱いには特に注意が必要です！ 5

高速なサーバー Xeon 560番台、６-Core X 2 (12-Core) 32GB メモリ 256GB SSD (~300MB/sec) 2TB RAID1+0 / 2TB RAID1+0 mirror ホストOS：CentOS 5.7-64bit / Xen

高速な仮想クライアント Core i7-2600 (4-Core) 12GBメモリ 128G SSD (~400MB/sec) 1TB ソフトウエアRAID1 USB3.0 (~300MB/sec) ホストOS：Windows7-64bit / VirtualBox

具体的な仮想化解析環境の設定事例

コア数、搭載メモリも多めに ストレージの転送速度も重要

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Institute for Protein Research firewall

FTP

BMRB Web

BMRB Mirror

SMS DEP

ADIT-NMR

DATA Serv.

サーバー群を仮想化する前の構成

Internet 7

サーバー群仮想化による耐障害性の強化

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多くの解析用アプリケーションをインストールした 仮想OSイメージにより環境設定の手間を省く

CentOS6.2-32bit/64bit + VirtualBox (Xen, KVM) NMRPipe, MagRO-NMRView, CcpNmr, MolMol, SPARTA+, ShiftX *Cyana, Xplor-NIH, CNS CS-ROSETTA, HADDOCK *Amber12, Gromacs, *Gaussian

* 商用に付きライセンスを購入する必要があります

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仮想化技術による解析とデータベース登録支援

サーバー

仮想サーバー

仮想クライアント

デスクトップ

NMR装置

NMR測定データ

Xen, VirtualBoxの解析環境 モニターを募集しています

BMRB PDB

公共データベース

データ交換

データ交換

データ交換

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化学シフトデータベースとその応用

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化学シフト：生体高分子のNMRデータとして最も重要なパラメータ

誘引効果 環電流効果

その他 動力学的状態の変化 化学交換、同位体効果、Strong couplingなど

水素結合

化学構造依存性

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化学シフト、シグナル帰属データの利用先は

リガンド滴定実験

15N核緩和によるダイナミックス解析

立体構造決定

配向試料の残余双極子

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NMRデータベースの運用・開発とその連携

Osaka University Programmer / Sysadmin.

Takeshi Iwata

University of Wisconsin-Madison Programmer / Sysadmin.

Dimitiri Maziuk

Tool dev. Kent Wenger

研究者の要望を元に、互いに連携しながら機能の向上を目的に開発を行なっている。

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BMRB (BioMagResBank)： 生体高分子NMRデータベース

NMR構造は年間500件以上 BMRBエントリーは600件以上 のペースで増え続けている

2011年12月末の時点で NMR構造は約9,200件

BMRBエントリーは約7,600件 に達している

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10,000

20,000

30,000

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60,000

70,000

80,000

20112009

20072005

20032001

19991997

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1991

NMR structure All

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1,000

2,000

3,000

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7,000

8,000

9,000

10,000

20112009

20072005

20032001

19991997

19951993

1991

NMR structure BMRB

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SPARTA: 主鎖側鎖２面角から化学シフト（1HN, 15N, 13CO, 13Cα and 13Cβ）

Shen Y. and Bax Ad J. Biomol NMR (2007)

Target 3D structure

Predicted chemical shifts, 1HN, 15Nα, 1Hα, 13C', 13Cα and 13Cβ

Tri-peptide set

200 proteins Chemical shifts from BMRB

Structures from RCSB

Tri-peptide database

24,000 tri-peptides

φ, ψ and χ1 angles

2nd chemical shifts

Ring current effect

Chemical shift similarity score H-bond effect

H N

C H H

N

H C

C

H N

C H

=

C O

=

C O

=

O

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化学シフトから主鎖２面角へ: TALOS/TALOS+

1HN, 15N, 13CO, 13Cα +13Cβ

2 Q CA 55.080 2 Q CB 30.760 2 Q HN 8.900 2 Q C 175.920 2 Q HA 5.249 2 Q N 123.220 .... 72 R HN 8.580 72 R HA 4.301 72 R N 123.420 72 R C 175.350 72 R CA 55.610 72 R CB 31.350

立体構造から化学シフトへ: SPARTA/SPARTA+

1HN, 15N, 13CO, 13Cα +13Cβ

2 Q CA 55.080 2 Q CB 30.760 2 Q HN 8.900 2 Q C 175.920 2 Q HA 5.249 2 Q N 123.220 .... 72 R HN 8.580 72 R HA 4.301 72 R N 123.420 72 R C 175.350 72 R CA 55.610 72 R CB 31.350

PDB

BMRB

φ、ψ２面角 類似検索

立体構造座標

PDB

BMRB

類似検索

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化学シフトから立体構造へ:

1HN, 15N, 13CO, 13Cα +13Cβ

2 Q CA 55.080 2 Q CB 30.760 2 Q HN 8.900 2 Q C 175.920 2 Q HA 5.249 2 Q N 123.220 .... 72 R HN 8.580 72 R HA 4.301 72 R N 123.420 72 R C 175.350 72 R CA 55.610 72 R CB 31.350

化学シフトをよく満たすフラグメントを検索

3D 構造

フラグメントのアセンブリ 化学シフトをよく満

たすアセンブリを選択

CS-ROSETTA Shen, Y. et al., Proc. Natr. Acad. Sci. (2008)

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化学シフトの更なる応用： 過渡的中間対構造のモデリング

A Transient and Low-Populated Protein-Folding Intermediate at Atomic Resolution D. M. Korzhnev, T. L. Religa, W Banachewicz, A. R. Fersht and L. E. Kay

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Neudecker, P. et al., Nature (2012)

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CS-ROSETTAをNMR構造の検証に使う

1HN, 1Hα, 15Nα, 13Cα, 13C’, 13Cβ

の化学シフトによるCS-ROSETTA構造 NOEベースの立体構造と重ね合わせ （主鎖RMSD: 1.4Å）

NOEベースの構造決定とは異なる原理で立体構造が得られるためチェーンフォールドの正しさを検証できる

Mizuno et al., JMB 2011

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３．PDBj-BMRBにより開発されたツール群の紹介

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MagRO-NMRView： NMRデータ解析とデータベース登録支援

MagRO-NMRViewがサポートする 複雑なNMR実験データの構造 GUIによるNMRデータの解析と登録準備の 支援機能

一般登録データ1050件の化学シフト 理研より登録された550件の化学シフト

SPARTA+を用いてNMR構造と化学シフトの整合性を確認 Kobayashi, et al., 2012 J Biomol NMR in press

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間違った側鎖帰属

no_NOE, bad contact L14:2HB-L14:HN viol_level: -0.440 no_NOE, bad contact L14:2HB-F29:HN viol_level: -1.339 no_NOE, bad contact F91:HA-F91:HN viol_level: -0.212 no_NOE, bad contact F91:2HB-F91:HN viol_level: -0.043 no_NOE, bad contact L14:3HB-C92:HN viol_level: -2.447 no_NOE, bad contact W102:HZ2-L14:HG viol_level: -0.222 no_NOE, bad contact F29:2HB-L141:HD1 viol_level: -0.354 no_NOE, bad contact F29:3HB-L141:HD1 viol_level: -0.591 no_NOE, bad contact W102:HE3-L31:HG viol_level: -0.810 no_NOE, bad contact I106:3HG1-L31:HG viol_level: -2.083 no_NOE, bad contact F29:2HB-F29:HD1 viol_level: -3.712 ... ... no_NOE, bad contact W102:HZ3-F29:3HB viol_level: -1.296 no_NOE, bad contact F80:HZ-F91:2HB viol_level: -2.903 no_NOE, bad contact L14:3HB-F91:3HB viol_level: -2.990 no_NOE, bad contact F80:HZ-F91:3HB viol_level: -2.435 no_NOE, bad contact F91:HD1-F91:3HB viol_level: -1.487

正しい側鎖帰属

MagRO-Mol： NMR構造、NOE解析データの表示

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２つに分かれているのは明白だが...ちょっと分かりにくい

-2.5

-2

-1.5

-1

-0.5

0

0.5

1

1.5

2

2.5

-2.5 -1.5 -0.5 0.5 1.5 2.5

多次元尺度構成法で2次元にembedしたmap明確なクラスターが２つ見える

fit_robot: マルチドメイン構造に対しても構造重ね合わせを自動実行

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MagRO_Validation: NMR構造の決定精度を化学シフトのみから評価する方法確立の試み

NMR構造がどの程度確からしいか、客観的な評価法は 現在まで確立されていない

＜ なるべくNOE以外の要素で評価させる ＞ ・NMR構造のクオリティー 主鎖コンホメーションの正常さ 側鎖ロタマーの正常さ 分子の水和、水素結合、VdW衝突 ・立体構造から逆算された予測化学シフトとのずれ

構造決定の自動化が困難になる 手作業で構造決定する場合もいつ終わって良いか分からない

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NOEピークテーブル、化学シフトテーブルのみから 立体構造を高精度に決定できる定番ソフトウエア 化学シフト帰属ミス、不完全さに対して非常に高い耐性を示す

NOE完全自動帰属構造計算プログラム：CYANAについて

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5.0

10.0

15.0

20.0

25.0

1 21 41 61 81 101 121 141 161 181 201

0.0

1.0

2.0

3.0

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5.0

6.0

7.0

8.0

人為ミスを含むCYANA計算

化学シフ

トテー

ブルの

不完全

さ（

％）

正解構造

とのず

れRMSD(A)

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MagRO_Validationのベンチマーク CYANAは化学シフトテーブルでの

疎水残基側鎖間で入れ違いミス(swap)に非常に弱い

0.0

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8.0

10.0

12.0

1 41 81 121 161 201 241 281 321 361

single double triple

quad

2つのNMR構造について 化学シフト帰属ミスを人工的に発生

(1ペア～４ペアまでのswap) Randomに疎水残基の帰属をswap

４００個の帰属テーブルをもとに ４００回のCYANA計算を実行

良い構造から悪い構造まで人為的に多数発生させる 人為ミスを含むCYANA計算

正解構造

との

ずれRMSD(A)

α-Helixリッチなタンパク質 (151残基）

BMRB-ID: 10035 PDB-ID: 1WK1

α/β構造混在型タンパク質 (151残基)

BMRB-ID: 10036 PDB-ID: 1Wlm

＜CYANA計算の詳細＞

NOE peak list (15N, 13C-edited NOESY)

φψ角制限 (TALOSによる予測)

水素結合距離制限

Val, Leuメチルシグナルの立体特異帰属 28

MagRO_Validationの性能

7.0

12.0

17.0

22.0

27.0

0.0 1.0 2.0 3.0 4.0

横軸：正解構造とのずれRMSD(A)

-8.5

-7.5

-6.5

-5.5

-4.5

-3.5

-2.5

-1.5

-0.5

0.0 1.0 2.0 3.0 4.0

MagRO_Validation Score

bacbone normality score

0.2

0.3

0.4

0.5

0.6

0.7

0.0 1.0 2.0 3.0 4.0

SPARTA+ score

SPARTA+による評価 WHATCHECKによる評価

MagRO_Validationによる評価

SPARTA+によるNMR構造から HN, Cα, Hα, Cβ, Hβ, COの化学シフトの逆算を行う評価法では十分な精度が得られない WHATCHECKは良い性能を示しているが 2.0Å以上の良い構造を正しく評価できていない MagRO_Validationは2.0Å以上の良い構造を より正確に評価できている

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ツール群の公開サイト： NMRToolBox

googleなどで "BMRB osaka" を検索してください

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謝辞

阪大蛋白研

すべて敬称略

PDBj-BMRB: 藤原敏道、児嶋長次郎、岩田武史、高橋あみ 構造プロテオミクス：池上貴久 情報プロテオミクス：中村春木

Daron Standley 阪大微生物研 サントリー生有研 菅瀬謙治 理化学研究所 木川隆則 医薬基盤研究所 赤木謙一 広島大学 楯真一 立命館大学 北原亮 京都大学 片平正人、永田崇

米ウィスコンシン大学 BMRB: Eldon Ulrich, John Markley

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ご清聴ありがとうございました

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