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Práctica de Bioquímica Avanzada:

Efecto del fosfato en la liberación de la inulinasa por Kluyveromyces marxianus CDBB-L-278

J Nombre: Roberto Emeterio Armenta LÓpez

Matrícula: 96358682

I / Maestría en Biotecnología

i/' Asesor de la práctica: M. en C. Alma E. Cruz G. Clase: Bioquímica Avanzada

Profesores: Drs. Jorge Gómez y Gustavo Viniegra

/ México D.F., a 28 de enero de 1997

Casa abierta al tiemon

UNIVERSIDAD AUTONOMA METROPOLITANA DIVISION DE CIENCIAS BIOLOGICAS Y DE LA SALUD Posgrado en Biotecnologia

Marzo 13,1998.

hl. EN C. ALMA ELIZABETH CRUZ GUERRERO P R E S E N T E .

Por medio de este conducto, la Comisi6n del Posgrado en Biotecnologla, a través del Dpto. de Biotecnologia, otorga el presente reconocimiento por su participaci6n como asesor en el trabajo "Efecto del fosfato en la liberaci6n de la inulinasa por Kluvveromvces marxianus CDBB-L-278, realizado por el alumno ROBERTO EMETERIO ARMENTA LOPEZ, con número de matrlcula 96358682, en el trimestre 96-0 de la Maestría en Biotecnologla.

Le reitero el agradecimiento y esperamos seguir contando con su colaboración

A T E N T A M E N T E .

UNIDAD IZTAPALAPA Av Michoacan y La Purisirna, Coi. Vicentina, Mexico, D.F. 09340. Tels: (5) 723-63-51 (5) 72449-99, Fax: (5) 724-47-12, e-rnail:psgbt@xanurn. uarn rnx internet: http://v ww.iztapalapa.uarn.mx/iztapala.www/division.cbs/biotecnoio/iniciq. htm

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RESUMEN

En el presente trabajo se evaluó la liberación de la inulinasa (B-fructofructano hidrolasa

E.C. 3.2.1.7) producida por la levadura Kluyveromyces marxianus, utilizando el fosfato

de potasio; para esto la levadura fue inoculada en dos medios de cultivo distintos

(inulina-fosfato e inulina), después de la incubación por 24 horas a 30°C, se empleo a la

ultrafiltración para obtener los ultraconcentrados correspondientes. Finalmente, se

obtuvo que la adición de fosfatos al medio de cultivo aumenta la cantidad de inulinasa

liberada al medio, pero sólo el 8% aproximadamente.

i

OBJETIVO

Evaluar la liberacion de la inulinasa producida por Kluyveromyces marxianus cuando al

medio de cultivo se le agrega 1 % de fosfato de potasio, y comparar su actividad

enzimática con la obtenida empleando solamente inulina.

.

ANTECEDENTES

La inulinasa (0-fructofructano hidrolasa E.C. 3.2.1.7) es una glicoproteína extracelular

producida por varias levaduras y hongos filamentosos."2 Dicha enzima rompe

rápidamente los enlaces fructohranosídicos B-2- I y B-2-6, los cuales están presentes en

la sacarosa, rafinosa y oligofructosidos como la inulina.

La inulinasa se utiliza para hidrolizar la inulina contenida en extractos de plantas, con

lo cual se obtienen jarabes fructosados con 95% de f r u ~ t o s a . ~ . ~

La inulina es la fructosana más difundida; su hidrólisis total produce, además de

fructosa, de 5 a 6% de moléculas de glucosa que se considera se encuentran en los

extremos de la cadena.. La inulinasa es la enzima que actúa sobre los correspondientes

enlaces glocosídicos de este polímero; debido a que las fbranosas que contiene

(mictosa) hacen que la inulina sea muy lábil a la hidrólisis, se ha sugerido usarla como

fuente para la obtención comercial de fructosa de alta p u r e ~ a . ~

La sintesis de inulinasa es controlada por represión catabólica. Para obtener niveles

altos de enzima en cultivos empleando levaduras, tiene que considerarse el medio de

cultivo que contiene oligofiuctosidos tal como la inuhm6

En levaduras, se producen dos enzimas extracelulares (glicoproteínas) que son

asociadas con el crecimiento en sacarosa: la invertasa (E.C. 3.2.1.26) por

Saccharomyces cerevisiae, y la inulinasa por Kluyveromyces nzarxianus. Dichas

enzimas realizan la hidrólisis de la sacarosa pero difieren en la especificidad para altos

pesos moleculares como los oligosacaridos y fructanos del tipo de la inulina. La

relación SII (actividad relativa con sacarosa e inulina) es generalmente empleada para discriminar entre la invertasa e inulinasa. Cuando la relación S/I es pequeña nos indica que se trata de la inulinasa.

i-, b Originalmente, la clasificación de inulinasas se basa en el hecho de la especificidad dc

las enzimas en bacterias, mohos y plantas. Tanlo las inulinasas intra y extracelulares

raramente muestran actividades con sacarosa y rompen fructanos del tipo de la inulina,

llevando series de oligofructanos a sólo fnictosa. En contraste las levaduras producen

inulinasas capaces de hidrolizar inulina.

Se ha reportado el empleo de fosfatos en el medio de cultivo para la liberación de la

inulinasa, dicho compuesto ocasiona el rompimiento de los enlaces tiosulfatos, los

cuales unen a la enzima con la pared celular, aumentando la cantidad de enzima

liberada en el medio junto con la inulinasa extracelular producida por la misma

levadura.'

l,ii,i,,,',, I , . ' I , , , , , , . ,..,,, .: , . , I , l l i l i l ' . 5

MATERIAL Y MÉTODOS

Inducción d e la sintesis d e inulinasa (medio d e cultivo).

Se empleó la levadura Kiuyveromyces marxianus CDBB-L-278 (Cepario del

Departamento de Biotecnología y Bioingeniería del CINVESTAV, I.P.N), la cual se

inoculó en el medio de cultivo que se describe a continuación:

> Base de nitrógeno para levaduras (Difco Laboratories)-----O,67%.

> NH4S04 (Sigma)-----O. 1%.

P inulina (Sigma)-----0.25%.

> K2P04 (Sigma)----- I%.

Manejándose como control o testigo el mismo medio de cultivo pero sin la adición de

fosfatos.

Se preparó un litro de cada medio de cultivo (inulina-fosfato e inulina). La

fermentación se llevó a cabo en matraces de 500 ml con un volumen de trabajo de 100

. ml. Posteriormente cada matraz con el medio fue inoculado con la levadura

Kluyveromyces marxianus y se colocaron en una incubadora con agitación orbital

(Incubator Shaker, New Brunswick Scientific Co., Inc.) a 200 rpm y una temperatura

de 30°C por 24 horas.

i

Después de transcurrido el tiempo de incubación se procedió a separar el sobrenadante

de la biomasa por medio de centrifugación (centrifupa Beckman J2-MI con rotor ## JA-

14) a 4000 rpm por 30 minutos y una temperatura de 20°C. El sobrenadante se filtró a

través de membranas de poro de 0 . 4 5 ~ . Posteriormente la enzima se concentró por

ultrafiltración (Equipo de ultrafiltración Millipore Cole-Parmer) con membranas de

10,000 daltones.

...

Cuando ya se obtuvo el ultraconcentrado de los dos medios de cultivo, sc detcrniirió

proteína por el método de Lowry et al.8 (usando seroalbúmina dc bovino para l a curva

estándar) en cada uno de ellos, aclarando que dicho análisis también se le aplico a los

ultrafiltrados, para constatar que en ninguno de ellos se encontraba proteiiia,

comprobando de esta manera que se había retenido toda en las membranas.

Cuando ya se conocieron las cantidades de proteína de cada uno de los caldos de

fermentación (inulina-fosfato e inulina), se llevaron a cabo en cada uno de ellos la

determinacion de la actividad enzimática de la inulinasa.

Actividad enzimática de la inulinasa

La actividad enzimática se midió determinando el aumento de azúcares reductores por

el método de Nelson-Somogyi (1944) a partir de una solución de sacarosa, para lo cual

fue necesario elaborar los reactivos que a continuación se mencionan:

Reactivos

Reactivo I ;

Solución A: En 800 ml de agua destilada se disolvieron:

25 g de carbonato de sodio anhidro (Na2C03).

25 g de tartrato de sodio y de potasio (KNaC4)H405.4H20).

20 g de bicarbonato de sodio (NaHC03).

200 g de sulfato de sodio(Na,SO,).

Aforando a un litro.

Solución B: En 200 ml de agua destilada se agregaron 4 gotas de ácido sulfúrico

concentrado (H2S04) y se disolvieron 30 g de sulfato de cobre (CuSO4.5H20).

Para preparar el reactivo se mezcló un ml de la solución B y 25 ml de la solución A.

Solución A: En 450 ml de agua destilada se disolvió:

21 ml de ácido H2S0,.

25 g de molibdato de amonio ((NH4)6M07024.4H~O).

Solución B: En 25 ml de agua destilada se disolvieron 3 g de arseniato de sodio

heptahidratado (NaHAs04.7H20).

Las soluciones se mezclaron lentamente con agitación y se aforaron a 500 ml.

Posteriormente se calentó a 55OC durante 30 minutos.

Técnica

> Se preparó una serie de 5 tubos de ensaye y se agregó 1 ml del reactivo I .

> Se adicionaron 9 ml de solucion de sacarosa al 4% (preparado en una solución amortiguadora de acetatos O.IM, pH 5.0) y se incubó en un baño de agua a 50°C.

posteriormente se agregó 1 ml de la solución de enzima.

> Se tomaron muestras de la mezcla de reacción de 1 ml a 1,2,3 y 4 minutos respectivamente. Estas muestras se colocaron en cada uno de los tubos que contenían el reactivo 1 con lo cual se detuvo la reacción enzimática.

> Una vez que se habían tomado todas las muestras se continuó con la técnica del método de Somogyi-Nelson.

> Se colocó en un tubo de ensaye I ml de la muestra problema y se adicionó 1 mi del reactivo 1.

> Fue incubado durante 20 minutos en un baño de agua hirviendo.

> Se retiró del baño de agua y se dejó enfriar.

> Se agregó 1 ml del reactivo 2 y agitó vigorosamente.

> Se agregó 17 ml de agua destilada y se agitó.

> Se tomaron las lecturas en el espectrofotómetro (Espectrofotómetro Shimadzu UV-

NOTA: Cada actividad enzimática se realizó por triplicado. 160A) a 520 nm.

Electroforesis no desnaturalizante

Con los ultraconcentrados procedentes de los dos medios de cultivo empleados (inulina-fosfato e inulina), se llevo a cabo la electroforesis no desnaturalizante (Equipo de electroforesis BIO-RAD 11, cristales de I O x 8 cm, peines y separadores de espesor 0.75 mm y fuente de poder BIO-RAD Power-Pac 3000).

Reactivos

cid.%: I . Gel de separación-----Se trabajó un gel con una “T” de 10% (acrilamida) y una “C”

de 5% (bisacrilamida). Se pesaron 9.5 g de acrilamida y 0.75 g de bisacrilamida y se disolvieron en 100 ml de solución amortiguadora de separación (0.375M de base tris y pH=8.8). Se guardó en fiasco color ámbar y en refrigeración (dura hasta un mes).

2. Gel de concentración-----Se trabajó con un gel con una “T” de 3.125% y una “C” de

Se pesaron 2.5 g de acrilamida y 0.75 g de bisacrilamida y se disolvieron en 100 ml de solución amortiguadora de concentración (0.125M de base tris y pH=6.8). Se guardó en frasco color ámbar y en refrigeración (dura hasta 1 mes).

25%.

La polimerización de la acrilamida se llevó a cabo usando persulfato y TEMED como i

catalizadores.

PreparaciOn de la muestra Para proteger la muestra y poder seguir el avance de la electroforesis se prepara una

solución de sacarosa y colorante (azul de bromofenol en este caso). La solución debc tener sacarosa al 50% y azul de bromofenol al O. 1%. 1 volumen de muestra + 0.1 volumen de sacarosa-colorante. La corrida de los geles se llevó a cabo a corriente constante de 200 Volts, durante aproximadamente 60 min; posteriormente los geles se tiñeron con azul de coomassie y se destiñeron con una solución de agua:metanol:ácido acético (proporciones de 60:40: 10 respectivamente).

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RESULTADOS Y DISCUSI~N

I. Cuantificación de la proteína y actividad enzirnática.

Tabla 1. Cantidad de proteína en los en los dos medios de cultivo.

Se observa una mayor cantidad de proteína en el ultraconcentrado del sobrenadante del

medio inulina-fosfato, alrededor de 88 pg/ml más que en el de inulina, lo que podría

interpretarse como la liberación de la enzima (unida a la pared celular) al medio de

cultivo por la presencia del fosfato.

Tabla 2. Actividad enzirnática de la inulinasa en el ultraconcentradó del medio inulina-fosfato.

Fglucosa- fructosa (cantidad equimolar).

Los pg de glucosa-fnictosa (cantidad equimolar) obtenidos por minuto y pig ilc

proteína, a partir de la hidrólisis de la sacarosa por la inulinasa (actividad enzimática)

en el ultraconcentrado del medio inulina-fosfato fue de 9.4345, esta se obtuvo al dividir

la velocidad (Vo) entre la cantidad de proteína correspondiente (medio inulina-fosfato).

, . , . . I. , I .. . ,, , , . . . -.,.- . c I - I _ , - - c ~ ~ - . * ,I ~ .... , .<. .. . ~. ,,. ,. , . . , . , . , , b ip . p b Tabla 3. Actividad enzimatica de la inulinasa en el ultraconcentrado 1 P i

del medio inulina. de g-l

- uciosa ( 'cantidi id cquirnoiar)

Considerando dllución 1:lOO (Vo.diluci6n)

Vo-pg/min.rnl de enzima 2586.5600

Los pg de glucosa-fructosa (cantidad equimolar) obtenidos por minuto y pg de

proteína, a partir de la hidrólisis de la sacarosa por la inulinasa (actividad enzimática)

en el ultraconcentrado inulina fue de 8.6035.

l -.. I !* .

Comparaiido las relaciones U/pg de proteína (pg de g-E/min.pg de proteína) de los dos

ultraconcentrados, se observa que la del medio inulina-fosfato es mayor en 0.83 1 U/pg

de proteína, lo cual significa que en este medio se libero una mayor cantidad de

inulinasa, la cual se puede atribuir a la acción del fosfato en el rompimiento de los

enlaces tiosulfatos que unen a la enzima con la pared celular. 7

Sin embargo, el aumento en la cantidad de enzima liberada, el cual se visualiza en l a

relación U/pg de proteína, no es tan significativo, ya que se ha reportado que es posible

liberar hasta un 50% más inulinasa al medio utilizando alcohol isopropilico.y Además.

considerando que se tuvo que agregar 1% de fosfato al medio de cultivo, para sólo

aumentar el 8% la actividad enzimática, resultando ser poco redituable esta forma dc

liberación de dicha enzima.

Robert J. Rouwenhorst et a¿," afirman que la liberación de la inulinasa unida a la pared

celular puede llevarse a cabo haciendo perforaciones a la pared celular de la levadura.

Negoro y Kito,' sugieren la lisis de las células de levadura en presencia de al&n

detergente para la liberación de las inulinasas unidas a la pared celular. Sin embrago se

requiere para este proceso de una larga incubación de 90-1 O0 horas.

El proceso de autolisis, descrito por GrootWassink y Fleming,' es mucho más corto,

pero se rcquiere de una alta temperatura.

11. Electroforesís de la inulinasa.

A continuación se muestra un diagrama de lo observado en la electroforesis efectuada

con las muestras de inulinasas de los medios de cultivo.

I I Figura 1. Diagrama de electroforesis de la inulinasa en el

ultraconcentrado de los medios (inulina-fosfato e inulina) y el estándar.

i

Tabla 4. Rh de cada banda

En la tabla 4, puede observarse que tanto en el ultraconcentrado del medio inulina-

fosfato como en el de únicamente, se obtuvieron los mismos Rf, lo cual indica que en

los dos ultraconcentrados se obtuvieron las mismas proteínas, donde además de

encontrarse a la inulinasa se produjeron otros compuestos proteicos, esto al interpretar

las segundas bandas ( 1 b y 2b) que se observan en menor intensidad que las primeras

( la y 2a).(Ver la figura I) .

Las bandas l a y 2a son las que probablemente sean la inulinasa, ya que estas

concuerdan con las características reportadas para las proteínas glicosiladas, es decir.

son anchas y difusas, mientras que las bandas l b y 2b son otras moléculas de proteína

las cuales fueron retenidas en el equipo de ultrafiltración junto con la inulinasa.

Por último, al conocer los pesos moleculares de las diferentes bandas en el estándar, es

posible hacer una estimación, por comparación de los Rfs, de los pesos moleculares dc

las dos bandas presentadas en cada ultraconcentrado, resultando lo siguiente: (Ver tabla

5).

Tabla 5. Pesos moleculares aproximados de las bandas idas en la electroforesis.

Finalmente, la bibliografia reporta para el dímero de la inulinasa un peso molecular de

165,000 daltones," el cual es parecido a los valores obtenidos en las bandas l a y 2a,

que se presumen son inulinasa .

'ICJ 'n, 'd

. .

ILa

k b i

.. ~ .. . ~

CONCLUSIONES

La liberación de la inulinasa de Kluyveromyces marxianus cuando al medio de cultivo

con inulina se le agregó 1 % de fosfato de potasio, no se considera significativa, ya que

al hacer una comparación con el medio donde no se adicionó (sólo inulina), la

diferencia fue muy pequeña, aumentando sólo el 0.83 1 en actividad enzimática (pg de

g-E/min.pg de proteína) en el ultraconcentrado del medio sobrenadante del medio de

inulina-fosfato.

Por lo tanto la adición de fosfatos en la proporción de 1% en el medio de cultivo no !

resultaría redituable, porque el aumento en la cantidad de inulinasa al agregar fosfatoc

no es tan grande comparada con la obtenida en ausencia de ellos.

,. ... . . , . * .,.. , ,.I ,. . . ...* .+.-,,,."..-- - , --- ,.,.,, _* ...., _, ... ... . ~ ..,.., .., . . .. ,. . ,.,,.

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REFERENCIAS

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.. . .