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Monica Muratori
Sezione di Medicina della Sessualità e Andrologia, Università di Firenze
FRAMMENTAZIONE DEL DNA SPERMATICO
Il manuale WHO 2010 per l’esame del liquido seminale: luci e ombre
Bologna 29 Gennaio 2011
FRAMMENTAZIONE DEL DNA NEGLI SPERMATOZOI
• Ha un’origine probabilmente multifattoriale:
• Presenza di tagli a singola e doppia elica nel DNA degli spermatozoi
• E’ un anomalia genomica frequentemente rinvenuta nei pazienti sub e infertili (Gorczyca et al, 1993)
- apoptosi abortiva (nucleasi apoptotiche)
- difetti nella maturazione
cromatinica (topoisomerasi)
- stress ossidativo (ROS)
Determinare la frammentazione del DNA nel seme fornisce maggiori
informazioni sullo stato di fertilità maschile rispetto a quelle
ottenute con lo spermiogramma ?
I livelli di frammentazione nel seme predicono gli esiti della
riproduzione?
Spermiogramma
Limiti di predittività clinica
Necessità di nuovi parametri
La frammentazione del DNA si propone come candidato
a nuovo parametro predittivo della fertilità maschile
FRAMMENTAZIONE DEL DNA E QUALITA’ DEL SEME
Lopes et al, 1998; Irvine et al, 2000; Muratori et al, 2000
Sperm DNA Fragmentation
FRAMMENTAZIONE ED IMPATTO SULLA RIPRODUZIONE
Studi sull’animale: netto impatto negativo della frammentazione sugli indici riproduttivi e salute della progenie (Fatehi et al, 2006;
Fernandez Gonzalez et al, 2009).
impatto sul rate di fertilizzazione (Tarozzi et al, 2007):IVF: discussoICSI: inesistente
Controversa è l’associazione con:lo sviluppo embrionale, l’impianto, il tasso di gravidanza (Zini and Sigman 2009, Zini 2010)
Soggetti infertili hanno maggiori livelli di frammentazione del DNA rispetto a soggetti fertili (Sergerie et al, 2005; Evenson et al, 1999)
Invece c’è un buon accordo nel ritenere che aumentati livelli di danno al DNA spermatico causino un aumento degli aborti
(Zini et al, 2008)
FRAMMENTAZIONE ED IMPATTO SULLA RIPRODUZIONE
LE TECNICHE
Rivelano lo stesso tipo di danno?
I dati sono confrontabili?
SCSA
TUNEL
ISNT
Sperm Chromatin Structure Assay
(TdT)-mediated fluorescein-dUTP nick end labeling
In Situ Nick Translation
Acridine Orange Test
Sperm Chromatin Dispersion Test
COMET
AO Test
SCD test (Halosperm)
Single Cell Gel Electrophoresis assay
DNA Fragmentation
TUNELterminal deoxynucleotidyl transferase–mediated
fluorescein–dUTP nick end labeling
•- Microscopia a fluorescenza e Citofluorimetria•- Risultati come percentuale di cellule frammentate
SCSASperm Chromatin Structure Assay
DFI
DNA denaturato
DNA totaleDFI=
Fluorescenza rossa =DNA denaturato
Flu
ore
scenza
verd
e =
DNA n
ativo
Arancio di Acridina
•- Citofluorimetria•- Risultati come percentuale di cellule frammentate
COMETo SCGE, Single Cell Gel Electrophoresis
•Inclusione degli spermatozoi in gel di agarosio, lisi ed elettroforesi in elevate concentrazioni saline
•Microscopia a fluorescenza•Elevata sensibilità (50 single-strand breaks per cell)•Percentuale di cellule danneggiate e misura del danno/cellula
Cellula frammentata
Cellula non frammentata
TUNEL
Mancanza di standardizzazione delle procedure
Shen et al. 2000; Sergerie et al. 2005; Frydman et al. 2008; Pecou et al. 2009Subtraction method
Cohen-Bacrie P 2009; Muratori et al. 2000 and 2008a; Domínguez-Fandos D 2008; Zhang et al. 2008Threshold setting methodFLOW CYTOMETRY
DATA ANALYSIS
Muratori et al. 2008a, Sepaniak 2006; Frydman et al. 2008; Martin et al. 2005; Sergerie et al. 2005; Varum et al. 2007; Stronati et al. 2006; Ramos et al. 2008; Younglai et al. 2001; O'Flaherty et al. 2008
Flow cytometry
Chohan et al. 2006; R. Smith et al. 2006; Tesarik et al. 2004; Borini et al. 2006; Young et al, 2003; Avendaño et al. 2009a and 2009b; Smith et al. 2006; Tunc et al. 2008; Caglar et al. 2007
Fluorescence microscopyDETECTION
Varum et al. 2007; Sargerie et al. 2005; Piasecka et al. 2007; Younglai et al. 2001; Frydman et al. 2008; Muciaccia et al. 2007; Long et al. 2007; Martin et al. 2005; Zini et al. 2001
Indirect labeling Many commercial kits
O'Flaherty et al. 2008; Zhang et al. 2008; Aoki et al. 2006; Torregrosa et al. 2006; Young et al. 2003; Muratori et al. 2008a;.Greco et al. 2005; Paasch et al. 2004; Brugnon et al. 2006; Donelly et al. 2000
Direct labeling Many commercial kits
LABELLING
Chohan et al. 2006; Aoki et al. 2006; Caglar et al. 2007; Varum et al. 2007; Muratori et al. 2008a and 2009; Tunc et al. 2008; Frydman et al. 2008; Avendaño et al. 2009a and 2009b
Present 0.1; 1; 0.5 and 2% Triton X at different times
Martin et al. 2005; O'Flaherty et al. 2008; Young et al. 2003; Said et al. 2006Absent PERMEABILIZATION with detergents
Muratori et al. 2003; Caglar et al. 2007; Tarozzi et al. 2009; Domínguez-Fandos et al. 2008; Young et al. 2003; Avendaño et al. 2009a and 2009b; Stronati et al. 2006; Ramos et a. 2008; Tesarik et al. 2004
Formaldeyde At 1; 2; 3.5; 3.7%
Muciaccia et al. 2007; O'Flaherty et al. 2008; Cohen-Bacrie et al. 2009; Tunc et al. 2008; Martin et al. 2005
Alcohols EtOH, MeOH, MeOH-EtOH
FIXATION
Ramos et al. 2008; Avendaño et al. 2009a; Pecou et al. 2009Cryopreserved With or without cryoprotectant
Bian et al. 2004; Xia et al. 2005; Sepaniak et al. 2006; Stronati et al. 2006; Long et al. 2007; O'Flaherty et al. 2008
Frozen At -20°C, -70°C, -80°C
Muratori et al. 2000; Sergerie et al. 2005; Greco et al. 2005; Chohan et al. 2006; Smith et al. 2006; Domínguez-Fandos et al. 2008; Varum et al. 2007; Piasecka et al. 2007; Zhang et al. 2008; Cohen-Bacrie et al. 2009
Fresh
SAMPLE
REFERENCESVARIANTSSTEPS
Muratori et al, SBRM 2010
21.2±16.4Data analysis
26.0±16.0Labelling kit
(TMR vs FITC)
22.7±11.2Time storage
(0 vs 24 h)
15.1±11.2PFA concentration
(1% vs 3.7%)
CV%Effect of:
Intra-assay CV=4.3±1.4%, n=12
Muratori et al, J Androl, 2009
2.36±1.37%, n=29Younglai et al, 2001
39.82 ± 23.75%, n=66Domínguez-Fandos D et al, 2007
Letteratura 2000-2009, valori del TUNEL nel seme di soggetti subfertili
EFFETTO DELLE VARIANTI DEL TUNEL
Parte d
ella confli
ttualit
à della
letteratu
ra
può ris
iedere
nell’eteroge
neità
e nella
manca
nza di
standa
rdizzaz
ione d
elle
tecniche
Colorazione May-Grunwald Giemsa
Muratori et al, 2004 ; Marchiani et al, 2007
M540 Bodies:corpi apoptotici di probabile origine testicolare
Incidenza degli M540 Bodies nel seme di soggetti sub/infertili
N=Normozoospermici, AT= AsthenoteratozoospermiciT=Teratozoospermici, OAT=Oligoasthenoteratozoospermici
% M
540
bo
die
ssu
l to
tale
dei
bo
die
se
sper
mat
ozo
i
Muratori et al, 2004 ; Marchiani et al, 2007
% M
540
bo
die
svs
sp
erm
ato
zoi
M540 Bodies: un interferenza nelle analisi citofluorimetriche degli spermatozoi
Muratori et al, 2004 ; Marchiani et al, 2007
TUNEL/PI
Frammentazione del DNA
PI
Frammentazione del DNA
Controllo negativo Campione test
Propidium Iodide,PI
Bright field
Muratori et al, 2008
Muratori et al, Hum Reprod 2008
Percentuale ricavata dal semplice TUNEL meno percentuale ricavata dal TUNEL/PI
SIMPLE TUNEL versus TUNEL/PI
Simple TUNEL underestimates
Simple TUNEL overerestimates-50 -40 -30 -20 -10 0 10
Muratori et al, Cytometry A, 2008
Diversa relazione con la qualità del seme
Muratori et al, 2008
DNA Fragmentation
PI La frammentazione nella PI dimmer si associa strettamente a scarsa qualità del seme
La frammentazione nella PI brighterè indipendente dalla qualità del seme
0.001-0.3775Normal
morphology
0.005-0.2975Progressive motility
0.050-0.1975Total motility
0.001-0.3575Sperm concentration
(sperm/ml)
0.016-0.2575Sperm count (sperm/ejaculate)
prho
% diframmentazionesul totale deglispermatozoinParameters
0.000-0.51
0.000-0.41
0.003-0.32
0.000-0.52
0.000-0.46
prho
% diframmentazione
nellaPI Dimmer
La vitalità cellulare è diversa nelle due popolazioni
Test SampleP
I fluorescence
Dead cells(L-23101 fluorescence)
Negative Control
Il danno nella popolazione brighter è indipendente dalla qualità del seme.
E’ il danno della popolazione brighter a fornire informazioni addizionali/alternative sullo stato di fertilità maschile rispetto allo spermiogramma?
Le cellule della popolazione dimmer sono morte
Sono gli spermatozoi frammentati della brighter ad impattare negativamente sulla riproduzione?
CONFRONTO FRA SOGGETTI FERTILI ED INFERTILI
unpublished data PATIENTS FERTILE MEN
n=29 n=28
02468
101214161820222426283032
NS
FRAMMENTAZIONE DIMMER
0
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
*p<0.00001
FRAMMENTAZIONE BRIGHTER
PATIENTS FERTILE MEN
n=29 n=28
0
10
20
30
40
50
60
70
*p<0.001
FRAMMENTAZIONE TOTALE
Fertili= concepimento entro l’anno dalla data del test
Pazienti= afferenti al laboratorio di Seminologia per l’esecuzione dello spermiogramma
E’il da
nno de
lla pop
olazione
brighte
r il
param
etro in
dipend
ente d
alla qu
alità d
el sem
e
che dis
crimina
fra fer
tili ed
infertili
FRAMMENTAZIONE DEL DNA NEI SOLI SPERMATOZOI VIVI
Mitchell et al, 2010
Aitken et al, 2010
Spermatozoi vivi frammentati
FRAMMENTAZIONE DEL DNA E DANNO OSSIDATIVO RIVELATO CON LA COMET
Simon et al, 2010
= 8-hydroxy, 2 deoxy guanosine(8-OHdG)
Formamidopyrimidine-DNA Glycosylase =FPG
COMET
RINGRAZIAMENTI
Prof. Elisabetta Baldi Prof. Gianni FortiProf. Mario Maggi
Dr. Sara MarchianiDr. Lara TamburrinoDr. Marta CambiDr. Margarita MontoyaFrancesca Di FilippoDr.Erminio FilimbertiDr. Selene Degl’Innocenti
Dpt di Ginecologia, Perinatologiae Riproduzione Umana:
Prof. Ivo Noci
Azienda U.S.L. 3 di Pistoia
Presidio Ospedaliero di Pescia
Dr. Ilaria Natali
Dpt Fisiopatologia Clinica,
sz. Medicina della Sessualità e Andrologia: