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Istituto Zooprofilattico
Sperimentale del Piemonte,
Liguria e Valle d’Aosta
Frodi e specie ittiche: la genetica al nostro servizio
Maria Vittoria Riina
S.S. Genetica e ImmunobiochimicaTorino, 31 marzo 2017
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Istituto Zooprofilattico
Sperimentale del Piemonte,
Liguria e Valle d’Aosta
Perché identificazione genetica di specie?
• Prodotti lavorati
• Specie aliene
• Specie ibride
FINSForensically Informative Nucleotide Sequencing
tecnica che combina il sequenziamento del DNA e l’analisi filogenetica
basata su sequenze nucleotiche informative
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Perché analisi del DNA?• Il DNA è presente in ogni
cellula• è in gran parte stabile
DNA mitocondriale• Presenza di più copie nelle
cellule (1-10/mitocondrio)• Sequenza nota per molti
organismi• Marcatori con sequenza
diversa tra specie diverse, uguale nella stessa specie
FINS
1. Estrazione di DNA
2. PCR di un specifico frammento di DNA
3. Determinazione della sequenza nucleotidica
4. Analisi filogenetica↓
Identificazione della specie
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FINSEstrazione di DNA:
• filtrazione su colonnine
• precipitazione
• biglie magnetiche
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FINS
1. Estrazione di DNA
2.PCR di un specifico frammento di DNA
3. Determinazione della sequenza nucleotidica
4. Analisi filogenetica↓
Identificazione della specie
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FINS
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Gene che codifica per il citocromo b (cytb) e/o
gene che codifica per la citocromo ossidasi subunità 1 (COI)
mediante un’ unica reazione di PCR per le diverse specie (primer universali)
FINS1. Estrazione di DNA
2. PCR di un specifico frammento di DNA
3.Determinazione della sequenza nucleotidica
4. Analisi filogenetica↓
Identificazione della specie
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Liguria e Valle d’Aosta
FINS1. Estrazione di DNA
2. PCR di un specifico frammento di DNA
3. Determinazione della sequenza nucleotidica
4.Analisi filogenetica↓
Identificazione della specie
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Confronto della sequenza nucleotidica ottenuta con quelle di tutte le specie depositate nei database
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Allineamento sequenze nei database pubblici
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Costruzione dell’albero filogenetico a cui applicare il test di confidenza bootstrap
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COI
cytb
X 589 specie
206 campioni
Ricerca Sanitaria Finalizzata Regionale
“Valutazione di marker genetici per identificazione di specie, per la loro applicabilità nel controllo delle frodi
alimentari”
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A che scopo?
• Lotta alle frodi alimentari
• Tutela specie autoctone
• Studi di popolazione
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Nell’Unione Europea il pesce è uno dei 10 prodotti maggiormente oggetto di frodi
e il 72% degli illeciti sono connessi all’etichettatura e alla tracciabilità.
Oceana (www.oceana.org) ha raccolto oltre 100 studi svolti sulle frodi di
sostituzione: fino al 30% di illeciti.
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Perché interessa la frode di sostituzione di specie?
• Rischio sanitario
• Danno commerciale
• Il consumatore ha il diritto
di scegliere
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Rischi sanitari
• Specie tossiche (pesce palla, ruvetto)
• Specie provenienti da aree da cui è vietata l’importazione per motivi igienico-sanitari
• Specie a basso valore nutritivo
• Specie che possono provocare allergie
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RISULTATI DELL ’IZSPLVAnalizzati • 135 campioni• 41 merluzzi• 22 pesci piatti• 16 branzini• 16 orate• 14 storioni• 12 persici del Nilo• 11 cernie• 2 pagelli• 1 pangasio
0 2 (9%)00004 (36.4%)00
Non conformi6 campioni (4.4%)
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Attività di identificazione genetica nelle specie ittiche destinate al consumo umano
1 327 17 10
27 2641
9 15
40 65
118
68
165
44
0
20
40
60
80
100
120
140
160
180
200
2009 2010 2011 2012 2013 2014 2015 2016
campioni conformicampioni non conformi
16.7%
40.3%20.7%
18.5%
28.4%
13.6%
25.8%
10%
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FILETTI DI CERNIA NON CONFORMI
3 dal S
eneg
al
Brotula spp.
Chlorurus spp.
1 dal Vietnam
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Alcuni esempi
Filetto di tonno rosso dichiarato tonno pinne gialle
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Alcuni esempi
Trancio di squalo smeriglio venduto per pesce spada
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Alcuni esempi
Discriminazione di specie tra Aphia minuta (rossetto) e Sardina pilchardus(bianchetto) per Capitaneria di Porto di La Spezia
Frittelle di pesce ghiaccio vendute per frittelle di bianchetto
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Alcuni esempi
“Caviale russo” on line contenente uova di luccio oppure DNA di Xanthomonas campestris!!!
???
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ID SPECIE ESOTICHE E NON CONVENZIONALI
ID SPECIE E QUANTIFICAZIONE
ALIMENTI COMPOSTI: QUALI E QUANTE SPECIE?
RICERCA FINALIZZATA: “No more emergencies in DNA species identification: development and harmonization of molecular and next generation methods todetermine and quantify origin species in food and to discriminate frauds fromunintentional contamination.”
NEXT GENERATION SEQUENCING
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Non solo controlli di laboratorio!
Iniziative dell’IZSPLV a tutela del consumatore
INFORMAZIONE E INNOVAZIONE
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perché la genetica negli studi di popolazione?
• studi di dinamica di popolazione
• salvaguardare specie autoctone minacciate
• valutare lo stato di ibridazione e introgressione genica
• assetto nella nomenclatura del taxon
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salvaguardia delle popolazioni autoctone e studi di popolazione
Vairone
(Telestes muticellus)
• Grande interesse conservazionistico
(allegato II Direttiva Habitat)
• Indagare status distributivo
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salvaguardia delle popolazioni autoctone e studi di popolazione
Luccio
(Exos cisalpinus)
• Indagare la sua distribuzione
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Salmo marmoratus
Salmo trutta
salvaguardia delle popolazioni autoctone e studi di popolazione
• studio delle popolazioni per conoscere stato sanitario e genetico delle popolazioni selvatiche e negli impianti ittiogenici
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• metodo ad hoc per determinare la specie e discriminare il ceppo “atlantico” da quello “mediterraneo”
Indagine su avannotti di trota per conto della federazione italiana pesca sportiva ed attività subacquee � ceppo mediterraneo �ceppo adriatico
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CONCLUSIONI
Sinergia tra i metodi morfologici e biomolecolari per:
• smascherare frodi alimentari di sostituzione di specie
• analisi di popolazione per contrastare fenomeni di estinzione o l’esaurimento della componente genetica delle specie autoctone
• azioni di conservazione e proibizione di introduzione specie esotiche