fs-enzimi-2011-2012

Ak.god. 2011/2012.

Klinička enzimologijakorištenje podataka o aktivnostima enzima

u dijagnostičke svrhe

1.Uroñene greške metabolizma – nasljedne, genetski uvjetovane bolesti (enzimopatije)

2. Stečeni deficit enzima – obično zbog promjene funkcije organa (▼sinteza)

3. Razna patološka stanja – oštećenje stanica i izlazak enzima u izvanstaničnu tekućinu (▲

aktivnost)

Enzimi u stanicama

a) konstitutivni (sintetiziraju se stalnom brzinom – npr. kreatin kinaza,CK proporcionalna masi mišićnih stanica, pojava u serumu uglavnom posljedica nekroze )

b) Inducibilni (sinteza enzima mijenja se u ovisnosti o koncentraciji supstrata; najčešće enzimi koji pregrañuju tvari apsorbirane iz probavnog trakta; npr. glukokinaza)

Enzimi Enzimi u u

serumu/plazmiserumu/plazmi

MiMiššiiććnanaaktivnostaktivnost

Tkivna

Tkivna

sekrec

ij

sekrec

ijaa

Krvne

Krvne stanice

stanice

Obnova

Obnova stanicastanica

Endotel

Endotel

žžilaila

Uzroci oštećenja ili smrti stanice

• Hipoksija (gubitak krvi, anemije,...)

• Kemikalije (živa, olovo, .....)• Fizikalna oštećenja (smrzotine, opekotine, radijacija...)• Mikrobiološki agensi (bakterije, gljivice, virusi...)• Imunološki mehanizmi (citotokičnost)• Nutritivni čimbenici (nedostatak proteina, vitamina,

minerala...)

SadrSadržžaj enzima u krvi u svakom aj enzima u krvi u svakom trenutku uzimanja uzorka krvi trenutku uzimanja uzorka krvi

rezultat je:rezultat je:

�� oslobañanja iz stanicaoslobañanja iz stanica

nanaččina ulaska u cirkulacijuina ulaska u cirkulaciju

nanaččina eliminacije iz cirkulacijeina eliminacije iz cirkulacije

StaniStaniččni enzimi dospijevajuni enzimi dospijevajuu plazmu kao posljedica u plazmu kao posljedica obnove stanicaobnove stanica

StaniStaniččni enzimi pojani enzimi pojaččanoanodospijevaju u plazmu kao dospijevaju u plazmu kao posljedica oposljedica oššteteććenja ilienja iliproliferacije stanicaproliferacije stanica

�� oslobañanje iz stanicaoslobañanje iz stanica

Plazma membrana (ALP, GGT)Plazma membrana (ALP, GGT)

CitoplazmaCitoplazma (ALT, AST, LD, CK)(ALT, AST, LD, CK)

Mitohondrij (GLD, AST, CK)Mitohondrij (GLD, AST, CK)

Lizosom (ACP, NAGLizosom (ACP, NAG))

Mikrosomi (GGT)Mikrosomi (GGT)

SadrSadržžaj enzima u krvi u svakom aj enzima u krvi u svakom trenutku uzimanja trenutku uzimanja uzorkauzorka rezultat je:rezultat je:

oslobañanja iz stanicaoslobañanja iz stanica

�� nanaččina ulaska u cirkulacijuina ulaska u cirkulaciju(Mr, stupanj sinteze,stupanj o(Mr, stupanj sinteze,stupanj oššteteććenja stanice)enja stanice)

nanaččina eliminacije iz cirkulacijeina eliminacije iz cirkulacije

Mr dijagnostički važnih enzima

• Lipaza 48 000• Amilaza 50 000• Kreatin kinaza,CK 80 000• Aspartat-aminotransferaza, AST 90 000• Alanin-aminotransferaza, ALT 180 000• Kisela fosfataza, ACP 100 000• Laktat-dehidrogenaza, LDH 140 000• Alkalna fosfataza, ALP 140 000• γ-glutamil transferaza, GGT 82 000, 300 000,

1 000 000»

SadrSadržžaj enzima u krvi u svakom aj enzima u krvi u svakom trenutku uzimanja uzorka rezultat je:trenutku uzimanja uzorka rezultat je:

oslobañanja iz stanicaoslobañanja iz stanica

nanaččina ulaska u cirkulacijuina ulaska u cirkulaciju

→→ nanaččina eliminacije iz cirkulacije;ina eliminacije iz cirkulacije;(RES, eliminacija bubrezima(RES, eliminacija bubrezima--manje znamanje značčajna)ajna)

Poluživot enzima u plazmi

LD1 53 – 173 sataLD5 8 – 12 sata

CK 15 sati

AST 12 – 22 sata

ALT 37 – 57 sata

ALP 3 –7 dana

GGT 3 –7 dana

Enzimi kao tkivni biljezi

• Osjetljivost: proizlazi iz odnosa aktivnosti enzima u plazmi i pojedinim stanicama, odnosno tkivima

• Specifičnost: organ-specifični enzimi (i izoenzimi) /organ nespecifični enzimi

�� enzimi kao tkivni biljezienzimi kao tkivni biljezi

ASTASTALTALTLDLDCKCK

SerumSerum EritrocitiEritrociti JetraJetra SrceSrce MiMiššiićć

Tkivna osjetljivostTkivna osjetljivost Tkivna specifiTkivna specifiččnostnost

Enzimski profilEnzimski profil

Enzimi u plazmiEnzimi u plazmi

Enzimi iz jetreEnzimi iz jetreUloga u cirkulacijiUloga u cirkulaciji

Plazma specifiPlazma specifiččni enzimini enzimi Plazma nespecifiPlazma nespecifiččni enzimini enzimi

Serin proteaze:Serin proteaze:trombin, faktor XIItrombin, faktor XIIFibrinolitiFibrinolitiččki enzimiki enzimiLipoprotein lipazaLipoprotein lipaza

Enzimi sekrecijeEnzimi sekrecijeLipazaLipaza

AmilazaAmilaza

ProstatiProstatiččna kisela fosfatazana kisela fosfataza

StaniStaniččni enzimini enzimiLD, AST, ALTLD, AST, ALT

Plazma specifični enzimi

• Djeluju u plazmi• Sintetiziraju se u jetri• U plazmi su prisutni u većim koncentracijama nego u tkivu

• Klinički značajna: aktivnost• Promjene – pokazatelj funkcije jetre

Plazma nespecifični enzimi(aktivnosti manje u plazmi nego u tkivima)

a) enzimi sekrecije – egzokrine žljezde (pankreas, prostata, mukoza želudca);

klinički značajno: , zbog pojačane sinteze ili otežane eliminacije)

Klinički značajno: (stanice oštećene ili nekrotične)

b) Enzimi intermedijarnog metabolizma – koncentracije u tkivima vrlo visoke; oštećenje ili nekroza stanica omogućuje “bijeg”enzima u plazmu (CK, LD, AST, ALT....)

�� Referentni intervali za enzimeReferentni intervali za enzime

�� vrijeme uzimanja uzorka krvi vrijeme uzimanja uzorka krvi

�� dobdob

�� spolspol

�� rasarasa

�� fizifiziččka aktivnost, trudnoka aktivnost, trudnoćća, ciklia, cikliččke ke varijacije, lijekovi..varijacije, lijekovi..

Izražavanje aktivnosti: U/L; katal (?)

pH, vrste i ionske jakosti puferapH, vrste i ionske jakosti pufera

temperaturetemperature

koncentracije supstratakoncentracije supstrata

koncentracije aktivatorakoncentracije aktivatora

koncentracije inhibitorakoncentracije inhibitora

Metode Metode kontinuiranog kontinuiranog

mjerenjamjerenja

Metode Metode diskontinuiranog diskontinuiranog

mjerenjamjerenja

��Metode za odreñivanje katalitiMetode za odreñivanje katalitiččke aktivnosti enzimake aktivnosti enzima

1 (enzimska) U (aktivnost enzima koja u jednoj minutikatalizira promjenu 1 µmola supstrata (na/ L seruma)

1 katal (aktivnost enzima koja u jednoj sekundikatalizira promjenu 1 mola supstrata (na/ L seruma)

1U=16,67nkatal


mjerenjamjerenja

Metode Metode diskontinuiranog diskontinuiranog

mjerenjamjerenjaMetode Metode

jedne ili (dvije) tojedne ili (dvije) toččkeke

OptiOptiččki testki test

Metode s umjetnim supstratimaMetode s umjetnim supstratima

�� Metode za odreñivanje katalitiMetode za odreñivanje katalitiččke aktivnosti enzimake aktivnosti enzima


mjerenjamjerenja

OptiOptiččki testki test

Metode s umjetnim supstratimaMetode s umjetnim supstratima

OptiOptiččki test 1. stupnjaki test 1. stupnja



�� Metode za odreñivanje katalitiMetode za odreñivanje katalitiččke aktivnosti enzimake aktivnosti enzima

• A) Primarna reakcija:• Laktat + NAD →(LD)→piruvat + NADH +H+

• B) Primarna i indikatorska reakcija:• Aspartat + alfa-ketoglutarat →(AST) →oksalacetat +

glutamatOksalacetat + NADH + H+ (MDH) malat+ NAD

C) Primarna, pomoćna i indikatorska reakcija:• Kreatin-P + ADP→ (CK)→ kreatin + ATP

ATP + glukoza→ (HK)→ glukoza-6-P + ADPGlukoza-6-P + NADP+→ (G6PD) →6-fosfoglukonat + NADPH + H+

Promjene katalitičke aktivnosti enzima u serumu

Pojačana sintezaPoremećaj propusnosti stanične membrane

Nekroza staniceSmetnje u izlučivanju

Smanjena sintezaPojačana eliminacija uz normalnu sintezu

LAKTAT DEHIDROGENAZA (LD)LAKTAT DEHIDROGENAZA (LD)EC 1.1.1.27.EC 1.1.1.27. LL--laktat: NADlaktat: NAD++ oksidoreduktazaoksidoreduktaza

CH3

HCOHCOOH

+ NAD+↔ LD ↔

CH3C = OCOOH

+ NADH+H+

• infarkt miokardainfarkt miokarda·· megaloblastimegaloblastiččka anemijaka anemija·· akutno oboljenje jetreakutno oboljenje jetre·· akutno oboljenje bubrega (mokraakutno oboljenje bubrega (mokraćća)a)·· infarkt pluinfarkt pluććaa·· razlirazliččiti tipovi oboljenja miiti tipovi oboljenja miššiiććaa·· maligna oboljenjamaligna oboljenja

HH44 HH33MM HH22MM22 HH11MM33 MM44

LDLD11 LDLD22 LDLD33 LDLD44 LDLD55

Enzim se sastoji od 4 polipeptidna lanca koji Enzim se sastoji od 4 polipeptidna lanca koji pripadaju tipu H (pripadaju tipu H (heartheart--srce) i M (srce) i M (musclemuscle--mimiššiićć))

5 izoenzima5 izoenzima--organ specifiorgan specifiččni izoenzimini izoenzimi

ASPARTAT AMINOTRANSFERAZA (AST)ASPARTAT AMINOTRANSFERAZA (AST)EC 2.6.1.1.EC 2.6.1.1. LL--aspartataspartat--22--oksoglutarat aminotransferazaoksoglutarat aminotransferaza

UuUunutar stanice nalazi se u citoplazmi (izoenzim C; AST I; 35%) i nutar stanice nalazi se u citoplazmi (izoenzim C; AST I; 35%) i mitohondrijima (izoenzim M; AST II; 65%)mitohondrijima (izoenzim M; AST II; 65%)

·· infarkt miokardainfarkt miokarda·· virusni hepatitisvirusni hepatitis·· infektivni hepatitisinfektivni hepatitis·· toksitoksiččki hepatitiski hepatitis·· cirozaciroza·· primarni i metastatski tumori jetreprimarni i metastatski tumori jetre·· muskularna distrofijamuskularna distrofija··

LL--aspartat + aspartat + αααααααα--ketoglutarat ketoglutarat ↔↔ AST AST ↔↔ ooksalacetat + Lksalacetat + L--glutamatglutamatreverzibilna reakcija !!!reverzibilna reakcija !!!

AALANINLANIN AMINOTRANSFERAZA (AAMINOTRANSFERAZA (ALLT)T)EC 2.6.1.EC 2.6.1.22.. LL--alaninalanin--22--oksoglutarat aminotransferazaoksoglutarat aminotransferaza

UuUunutar stanice nalazi se u citoplazmi nutar stanice nalazi se u citoplazmi

·· virusni hepatitisvirusni hepatitis·· infektivni hepatitisinfektivni hepatitis·· toksitoksiččki hepatitiski hepatitis·· cirozaciroza·· ““komplikacijekomplikacije”” nakon infarktanakon infarkta·· akutni pankreatitisakutni pankreatitis

LL--alaninalanin + + αααααααα--ketoglutarat ketoglutarat ⇒⇒⇒⇒⇒⇒⇒⇒ AALLT T ⇒⇒⇒⇒⇒⇒⇒⇒ piruvatpiruvat + L+ L--glutamatglutamatreverzibilna reakcija !reverzibilna reakcija !

KREATIN KINAZA (CKKREATIN KINAZA (CK))EC 2.7.3.2.EC 2.7.3.2. ATPATP--kreatin Nkreatin N--fosfotransferazafosfotransferaza

Enzim u citoplazmi stanica je aktivan kao dimer Enzim u citoplazmi stanica je aktivan kao dimer polipeptidpolipeptidaa tipa M (tipa M (musclemuscle) i ) i polipeptida polipeptida tipa B (tipa B (brainbrain))

3 izoenzima3 izoenzima

CKCK--BB, CKBB, CK--MB i CKMB i CK--MMMM

KliniKliniččki je znaki je značčajna razliajna različčita raspodjela izoenzima u ita raspodjela izoenzima u skeletnim i skeletnim i srsrččanom mianom miššiićću (CKu (CK--MB)MB)

KREATIN KINAZA, CK

• Kreatin + ATP → pH 9 → kreatin-P + ADP← pH 6,7 ←

bolesti skeletnih mišićabolesti srcatraume centralnog nervnog sustava,CNStumori pluća, prostate, mjehura, dojke

reverzibilna reakcija !

ALKALNA FOSFATAZA (ALP)ALKALNA FOSFATAZA (ALP)EC 3.1.3.1.EC 3.1.3.1.oortofosfat monoester fosfohidrolazartofosfat monoester fosfohidrolaza

Alkalne fosfataze su skupina glikoproteina smjeAlkalne fosfataze su skupina glikoproteina smješštena tena uglavnom unutar staniuglavnom unutar staniččne membranene membrane.

osteoblasti kostijuosteoblasti kostijustanicstanicee hepatobilijarnog traktahepatobilijarnog trakta

stijenstijenkaka crijevacrijevatubuli bubregatubuli bubrega

placentplacentaa.

Bolesti kostijuBolesti kostiju(rahitis, Paget)(rahitis, Paget)

Bolesti jetreBolesti jetre(opstruktivne)(opstruktivne)

Maligne bolesti Maligne bolesti

Kisela fosfataza, ACPEC 3.1.3.2; ortofosfat monoester fosfohidrolaza

• Fosfataze s optimalnim pH<7,0• Lizosomi stanica (prostata, jetra, slezena, eritrociti,

trombociti, koštana srž )

• Karcinom prostate (!! 75% ima povećanu aktivnost 40-50x)• Upale, traume, nekroza prostate• Bolesti kostiju• Gaucher (sfingolipidoza)

γγγγγγγγ GLUTAMIL TRANSFERAZA (GLUTAMIL TRANSFERAZA (γγγγγγγγ--GT)GT)EC 2.3.2.2.EC 2.3.2.2. γγγγγγγγ--glutamilglutamil--peptid:aminokiselina peptid:aminokiselina γγγγγγγγ--glutamiltransferazaglutamiltransferaza

γγγγγγγγ--GT najviGT najvišše se nalazi ue se nalazi u bubregu, jetri, pankreasu i bubregu, jetri, pankreasu i bilijarnom traktubilijarnom traktu

KliniKliniččki znaki značčajno je odreajno je odreññivanje u serumu bolesnika:ivanje u serumu bolesnika:·· oboljenja jetreoboljenja jetre·· lijekovi, alkohol (indukcija enzimalijekovi, alkohol (indukcija enzima !!))··

AMILAZAAMILAZAEC 3.2.1.1.EC 3.2.1.1. αααααααα--1,41,4--glukan,4glukan,4--glukano hidrolazaglukano hidrolaza

Amilaza u serumu uglavnom potjeAmilaza u serumu uglavnom potječče iz acinarnih e iz acinarnih stanica stanica guguššterateračče, e, žžlijezda slinovnicalijezda slinovnica, testisa, ovarija, , testisa, ovarija,

pluplućća i masnog tkivaa i masnog tkiva

Amilaza ima malu molekulsku masu pa je jedan od enzima Amilaza ima malu molekulsku masu pa je jedan od enzima iz seruma koji se normalno nalazi u mokraiz seruma koji se normalno nalazi u mokraććii

αααααααα--amilaza (endoamilaza) hidrolizira linearne ili amilaza (endoamilaza) hidrolizira linearne ili razgranate ugljikohidrate sastavljene od razgranate ugljikohidrate sastavljene od αααααααα--D glukoze D glukoze bilo gdje u lancu stvarajubilo gdje u lancu stvarajućći brzo smjesu dekstrina, i brzo smjesu dekstrina,

maltoze i glukoze.maltoze i glukoze.

Kataliziraju istu kemijsku reakciju,ali

imaju različite fizikalno-kemijskeosobine

(izozimi, izoforme, varijante enzima, subfrakcije, podtipovi, podoblici...)

Što su IZOENZIMI ????

Različiti oblici istog enzima

• Izoenzimi (pravi) – mono-ili češće multimerni izoenzimi nastali pod kontrolom gena

• Multipli enzimski oblici-– nastali posttranslacijskim mehanizmima “in vivo” ili “in vitro

Razlike i sličnosti

Pravi izoenzimi Multipli oblici

Različiti po katalitičkim i imunokemijskim, Nema razlika u katalitičkimsvojstvima, stabilnosti, naboju, svojstvima, imunokemijski suvrlo male razlike u Mr slični, male razlike u

stabilnosti, razlike u naboju,velike razlike u Mr

Kovalentne/nekovalentne modifikacije (u organizmu, tijekom pročišćavanja, izolacije, pohranjivanja..)

• Deamidacija• Djelomično cijepanje polipeptidnog lanca• Promjenjena fosforilacija• Acilacija• Promjene u ugljikohidratnom dijelu lanca• Agregacija• Povezivanje s drugim biomolekulama (makroenzimi)

Metode analize izoenzima

• Elektroforeza • Kromatografija• Imunoinhibicija• Temperaturna stabilnost• Katalitička inhibicija• Specifičnost prema supstratu...

Izoenzimi u kliničkoj praksi (?)

• Kreatin kinaza (CK)• Laktat dehidrogenaza (LD)• Alkalna fosfataza (ALP)• Kisela fofataza*(ACP)• Amilaza• Kolinesteraza• Glukoza-6-fosfat dehidrogenaza*• N-acetil-beta-D-glukozaminidaza• Fosfoglukomutaza*• Aspartat aminotransferaza• Gama-glutamiltransferaza• Adenozin deaminaza*....• ...........• __________________________• * sudska medicina

Laktat dehidrogenaza-izoenzimi (LD 1-5)

▲▲▲ - akutni infarkt miokarda, hemolitičke bolesti, toksični hepatitis

▲ - virusni hepatitis, progresivna mišićna distrofija, infektivna mononukleoza, maligne bolesti

akutni infarkt miokarda (LD1)bolesti jetre (LDH4 i LDH5)

progresivna mišićna distrofija (LD5)maligne bolesti (LD5/LD1 < 1,3)

Kreatin kinaza (3 izoenzima)

Mr 80 000

CK-MM* → CK-MM1, CK-MM2, CK-MM3CKMB* → CK-MB1, CK-MB2CK-BB → CK-BB, (pseudo-MB)

Mr > 200 000

a) CK-imunoglobulini → makroCK tip 1 (autoimune bolesti)b) CK-MiMi → makroCK tip 2 (maligne bolesti)

(dimer) (oligomer)

�� enzimi kao tkivni biljezienzimi kao tkivni biljezi

Karakteristike profila promjene aktivnosti enzima uinfarktu miokarda (alfa-HBDH=LD-1)

satisati danidani

Alkalna fosfataza izoenzimi

• izoE genetska kontrola Mr___________________________________________________Placenta odvojeni gen 74000

intestinalna odvojeni gen 92000

koštana/ 94000jetrena/ 92400bubrežna zajednički gen 95800_____________________________________________________! Samo u slučaju placentarnog izoE- alelne varijacije; kod ostalih,heterogenost je posljedica posttranslacijskih modifikacija enzimske molekule

-

Alkalna fosfataza izoenzimi

Starost ALP izoenzimi (%)kost jetra ostali (intestinalni)

____________________________________________________________Djeca 85 5 < 10

Odrasli 45 45 < 10

Starije osobe 30 60 < 10___________________________________________________________normalna raspodjela

Slučaj 1.

65 godišnji muškarac dolazi u ambulantu s vidljivom žuticom kojaje intenzivne boje. Nema bolova ali je zamijetio da gubi težinu ida je njegova stolica blijeda. On umjereno pije i nije na nikakvojterapiji lijekovima. Njegovi funkcijski jetreni testovi su:

• Bilirubin 250 µmol/L (3-20 µmol/L)• AST 87 U/L (11-38)• ALT 92 U/L (12-48)• ALP 850 U/L (60-142)

• Što bi bila diferencijalna dijagnoza?• Koja druga ispitivanja bi bila od pomoći za postaviti dijagnozu?

ODGOVOR:

U ovom slučaju najvjerojatnija dijagnoza je karcinomglave pankreasa koji opstruira zajednički žučni kanal.To rezultira, obično bezbolnom žuticom s bilirubinom odoko 250 umol/L. To je nekomplicirana opstruktivnažutica koja je karakterizirana aktivnošću ALP koja jeviše nego tri puta iznad gornje granice ref.intervala.AST i ALT ne pokazuju teško hepatocelularno oštećenje.

Daljnja korisna ispitivanja uključuju slikanjestruktura u blizini glave pankreasa i zajedničkog žučnogkanala da se vidi uzrok opstrukcije.

Slučaj 2.

54-godišnja žena primljena je je u hitnuslužbu s akutnom abdominalnom boli utrajanju od 4 sata. Bol je epigastrična i širi seu leña. Kod ispitivanja bolesnica je bolna ihipotenzivna, postoji epigastrična mekoća.Ispitivanja pokazuju da je amilaza u serumu6 500 U/L (23-91 U/L). Koja je najvjerojatnijadijagnoza?

ODGOVOR:

Postoje mnogi uzroci povećanja serumske amilaze, alivrijednosti 10x veće od gornje granice normale sugotovo uvijek uzrokovane akutnim pankreatitisom, paje klinička slika u ovom slučaju sukladna ovoj dijagnozi.

Umjerenije povećanje (>5x) može biti uzrokovanopankreatitisom ali i drugim uzrocima abdominalne boli,kao perforiranim peptičkim vrijedom. Blago povećanjevidljivo je u bubrežnom poremećaju, budući se amilazačisti bubrezima.

Mira Grudić...ima 54 god. Primljena je u bolnicu prije 4 dana, 5sati nakon što je osjećala bolove u grudima.Liječnik u hitnoj službi uzeo je uzorak krvi zaodreñivanje koncentracije mioglobina, aktivnostiCK, CK-MB i koncentracije srčanog troponina T,cTnT. Rezultati su potvrdili dijagnozu akutnoginfarkta miokarda (AIM) i ona je hospitalizirana. Zbog odreñenih razlika u strukturi sličnih proteinau različitim tkivima (CK-MB, troponin) postavljenaje dijagnoza oštećenja stanica miokarda.

Mira Grudić ima AIM. Dijagnoza se djelom temelji navrijednostima CK-MB, mioglobina i cTnT. Rana dijagnozaje odlučujuća za odreñivanje terapijske intervencije kojaće se primjeniti. Mioglobin zbog svojih karakteristika ima negativnu prediktivnu vrijednost u prvih 2-6 satinakon pojave simptoma. cTnT se pojavljuje u serumurelativno kasno ali je vrlo specifičan za oštećenjemiokarda. U slučaju AIM najčešće se otkriva 3-5 satinakon pojave simptoma, pozitivan je u većini slučajevanakon 8 sati, a približava se osjetljivosti od 100% poslije10-12 sati Vrijednost ostaje povišena sljedećih 5-10 dana.

• Hvala na pozornosti !

fs-enzimi-2011-2012

Documents