Fumarate hydratase (EC. 4.2.1.2)

Amalina Ghaisani Komarudin10507008

Program Studi KimiaInstitut Teknologi Bandung

Agenda Presentasi

• Pendahuluan• Struktur Fumarase• Mekanisme Fumarase• Isolasi Fumarase• Pemurnian Fumarase• Karakterisasi Fumarase• Kinetika Fumarase• Defisiensi Fumarase

Pendahuluan

Siklus Krebs

Reaksi yang Dikatalisis

Reaction: (S)-malate = fumarate + H2O

Tata nama enzim Fumarase

EC 4 : LyaseEC 3.1 : Carbon-Oxygen LyaseEC 3.1.1 :Hydro-LyaseAccepted name: Fumarate Hydratase

Fumarase (EC. 4.2.1.2)

Hydro LyaseCarbon-Oxygen LyaseLyase

Penggolongan Enzim Fumarase

Fumarase

Class I

Fumarase A, Fumarase B

Class II

Fumarase C

•Klasifikasi berdasarkan penyusunan subunit, kebutuhan logam dan ketermostabilan.• Prokaryot memiliki tiga jenis Fumarase : Fumarase A, Fumarase B dan Fumarase C

Struktur Fumarase C dari E.coliTerdiri dari tiga domain, dimana posisi region 1-3

berjauhan

Memiliki dua buah dicarboxylate binding site

yaitu A site dan B site

A site dan B site teridentifikasi memiliki

area yang tidak terisi ligan

Residu pada sisi aktif Fumarase

Mekanisme Enzim Fumarase

Isolasi Fumarase Euglena gracilis var. bacillaris

E. gracilis•+ buffer 1 (50 mM triethanolamine-HCl pH 7.8

•+ malate 10 mM

•5 mM EDTA

•10 mM 2-mercaptoethanol

Diisolasi dari sel

yang kekurangan vitamin

B-12 mengguna

kan metode Trypsin

digestionDimurnikan dengan

sentrifugasi gradien densitas

Fumaras

e

50 g selCrude extract

• + 70 mL buffer• French pressure cell pada 10.000 lb/in2

•Sentrifugasi 27.000 x g selama 30 menit

•Dipanaskan pada suhu 50o C selama 3,5 menit•Sentrifugasi pada 27.000 x g selama 20 menit

Supernatan

pH dibuat menjadi 7.8 dengan 2 M triethanolamine

Ekstrak enzimFraksinasi dengan

amonium sulfat 40 % dan 60 %

Pemurnian Fumarase Euglena gracilis var. bacillaris

Hasil fraksinasiSupernatan

•Dialisis dengan bufer selama 3

jam

•Sentrifugasi

• Ditambah NADH, NAD+, NADPH, NADP+

Kromatografi afinitasMatrix gel Orange A

Karakterisasi Fumarase

Pemurnian Fumarase Euglena gracilis var. Bacillaris (lanjutan)

Karakterisasi Fumarase

Aktifitas enzim

•+ 2 mL 50 mM potassium phospate•+ 50 mM malat •Diukur serapan pada l 250 nm( 1 Unit enzim = 1 mmol fumarat/menit)

Berat molekul

•SDS-PAGE (gel 10%)•Native-PAGE

Hasil elektroforesis

Parameter kinetika Enzim Fumarase

•Aktivitas maksimum pada pH 8,4 • Km Malat = 0,14 mM• Km Fumarat = 0,031 mM• ATP merupakan inhibitor• Pada 10 mM Tris-acetate (pH 7.3) dan konsentrasi malat= 1 mM, 32,2 mU E. gracilis fumarase terinhibisi 50% oleh 0,35 mM ATP.

Defisiensi Enzim Fumarase• Defisiensi fumarase disebabkan

oleh mutasi gen yang mengkode fumarase

• Kekurangan Fumarase menyebabkan ensefalopati, retardasi mental yang berat, fitur wajah yang tidak biasa, kelainan otak, dan serangan epilepsi karena jumlah abnormal rendah fumarase dalam sel.

• Pola penurunan penyakit ini adalah autosomal resesif

Referensi• Purification, Characterization and Immunological Properties of Fumarase

from Euglena gracilis var. Bacilaris. Hitoshi Shibata, William E. Gardiner, Steven D. Schwartzbach. Journal of Bacteriology, Nov. 1985, P. 762-768

• The role of the allosteric B site in the fumarase reaction. Irwin A. Rose and Todd M. Weaver. www.pnas.orgcgidoi10.1073pnas.0307524101

• Structure of Free Fumarase C from Escherichia coli . Todd Weaver. Acta Cryst. (2005). D61. 1395-1401

SEKIAN DAN TERIMA KASIH