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FUNDAÇÃO OSWALDO CRUZ
CENTRO DE PESQUISAS AGGEU MAGALHÃES
MESTRADO EM BIOCIÊNCIAS E BIOTECNOLOGIA EM SAÚDE
IGOR VASCONCELOS ROCHA
IDENTIFICAÇÃO DE MECANISMOS DE RESISTÊNCIA ANTIMICROBIANA DE
BACTÉRIAS GRAM NEGATIVAS PREVALENTES EM SUPERFÍCIES E
HEMOCULTURAS DE UNIDADES DE TERAPIA INTENSIVA EM CARUARU-PE
RECIFE
2017
IGOR VASCONCELOS ROCHA
IDENTIFICAÇÃO DE MECANISMOS DE RESISTÊNCIA ANTIMICROBIANA DE
BACTÉRIAS GRAM NEGATIVAS PREVALENTES EM SUPERFÍCIES E
HEMOCULTURAS DE UNIDADES DE TERAPIA INTENSIVA EM CARUARU-PE
Dissertação apresentada ao curso de Mestrado em Biociências e Biotecnologia em Saúde do Centro de Pesquisas Aggeu Magalhães, Fundação Oswaldo Cruz, como um dos requisitos para a obtenção do título de Mestre em Ciências.
Orientadora: Dra. Nilma Cintra Leal
Coorientador: Dr. Danilo Elias Xavier
RECIFE
2017
Catalogação na fonte: Biblioteca do Centro de Pesquisas Aggeu Magalhães
R672i
Rocha, Igor Vasconcelos.
Identificação de mecanismos de resistência antimicrobiana de bactérias Gram negativas prevalentes em superfícies e hemoculturas de unidades de terapia intensiva em Caruaru-PE / Igor Vasconcelos Rocha. - Recife: [s.n.], 2017.
109 p. : ilus., graf., tab. Dissertação (Mestrado em Biociências e
Biotecnologia em Saúde) - Centro de Pesquisas Aggeu Magalhães, Fundação Oswaldo Cruz.
Orientadora: Nilma Cintra Leal; coorientador: Danilo Elias Xavier.
1. Infeção hospitalar. 2. Acinetobacter baumannii -
isolamento & purficação. 3. Klebsiella pneumoniae - isolamento & purficação. 4. Acinetobacter baumannii - microbiologia. 5. Acinetobacter baumannii - genética. 6. Resistência Microbiana a Medicamentos. 7. Contaminação de Equipamentos. 8. Genes bacterianos. 9. Farmacorresistência Bacteriana. 10. DNA Bacteriano - análise. 11. Proteínas de Bactérias - genética. 12. Reação em Cadeia da Polimerase. 13. Unidades de Terapia Intensiva. 14. Brasil. I. Leal, Nilma Cintra. ths. II. Xavier, Danilo Elias. III. Título.
CDU 614.447
IGOR VASCONCELOS ROCHA
IDENTIFICAÇÃO DE MECANISMOS DE RESISTÊNCIA ANTIMICROBIANA DE
BACTÉRIAS GRAM NEGATIVAS PREVALENTES EM SUPERFÍCIES E
HEMOCULTURAS DE UNIDADES DE TERAPIA INTENSIVA EM CARUARU-PE
Dissertação apresentada ao curso de Mestrado em Biociências e Biotecnologia em Saúde do Centro de Pesquisas Aggeu Magalhães, Fundação Oswaldo Cruz, como um dos requisitos para a obtenção do título de Mestre em Ciências.
Aprovado em: 21/02/2017
BANCA EXAMINADORA
________________________________________________
Dra. Nilma Cintra Leal
Centro de Pesquisas Aggeu Magalhães (CPqAM/FIOCRUZ-PE)
________________________________________________
Dra. Milena de Paiva Cavalcanti
Centro de Pesquisas Aggeu Magalhães (CPqAM/FIOCRUZ-PE)
________________________________________________
Dra. Márcia Maria Camargo de Morais
Universidade de Pernambuco (UPE)
AGRADECIMENTOS
À minha orientadora Profª Dra. Nilma Leal, pela confiança, atenção, carinho e por
todo o conhecimento compartilhado. Saiba que te admiro muito.
Ao meu coorientador Danilo Xavier, por todo o conhecimento compartilhado, atenção,
pelo incentivo de sempre e pela valiosa ajuda com os experimentos. Lembrarei sempre de sua
simplicidade, conselhos e das excelentes histórias e informalidades que tornam o dia-a-dia
mais divertido.
Aos membros da banca examinadora, por aceitarem o convite de participar da
avaliação deste trabalho.
À Profª. Sibele Ribeiro, pela amizade e imensurável ajuda na elaboração e execução
do projeto. Obrigado pelo incentivo à pesquisa desde minha iniciação científica e pelo apoio e
confiança em mim depositada durante toda a minha trajetória acadêmica.
Às alunas de iniciação científica e colaboradoras Isabelle Farias, Karoline Almeida e
Nataly Silva. Obrigado por toda a ajuda com as coletas, experimentos e pela vivência no
laboratório. Vocês foram fundamentais para a realização deste trabalho.
À Júlia Campos (Centro de Tecnologia e Estratégias do Nordeste - CETENE), pelo
carinho, disponibilidade, ensinamentos e auxílio na operação do espectrômetro de massas
(MALDI-TOF).
Ao Instituto de Microbiologia Paulo de Góes (Universidade Federal do Rio de Janeiro
- UFRJ), especialmente a Larissa Botelho e Eloiza Campana, pelo auxílio na identificação dos
isolados.
Aos colaboradores Antônio Rezende, Cássia Docena, Christian Reis, Túlio Campos e
Viviane Carvalho, pelo auxílio durante a realização deste trabalho.
À minha família, especialmente aos meus pais e irmã, por todo o apoio, amor, carinho,
suporte emocional e por me guiarem por bons caminhos, sempre apoiando e incentivando
minhas escolhas. Obrigado por tudo, desde sempre.
À Thaísa, namorada e melhor amiga, por estar sempre ao meu lado, me acompanhando
de perto desde a graduação. Obrigado pela compreensão em meus momentos de ausência,
pelas risadas, pelos momentos de descontração nas horas difíceis, pela paciência, conselhos,
apoio emocional e confiança.
À Bruna Silva, Eduardo Tavares, Vitor Couto, Rafaela Weiss, Dayanne Lourenço e
Jéssica Andrade, pelo apoio de sempre.
A todos os meus amigos e colegas do Departamento de Microbiologia do Centro de
Pesquisas Aggeu Magalhães (CPqAM), Adriana Neuman, Adriana Roberto, Ana Carolina,
Alline Santos, Camila Xavier, Cláudio Araújo, Diego Hollanda, Fabiana Laura, Gustavo
Lima, Kleison Merlo, Larissa Oliveira, Mariana Sobral, Silvana Santos e Yara Nakazawa. Em
especial, a Artur Leonel, Beatriz Toscano, Carlos Alberto, Felipe Lira, Gabriela Rodrigues,
Isis Cirino, Maria Ribeiro, Mayara Barbalho, Ludmila Arruda, Thaíse Cavalcanti e Wagner
Tenório, pelos vários momentos de descontração, companhia na bancada e auxílio com os
experimentos.
A todos os amigos da turma 2015.1 do mestrado e doutorado do CPqAM, em especial,
à Lilian Amorim e Gabriel Faierstein, pela amizade, pelos momentos únicos de convívio,
pelas noites de estudos e discussões científicas.
Ao CPqAM, por todos os recursos, ferramentas e suporte científico empregado neste
trabalho, e à Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES), por
todo o auxílio financeiro.
ROCHA, Igor Vasconcelos. Identificação de mecanismos de resistência antimicrobiana de bactérias Gram negativas prevalentes em superfícies e hemoculturas de unidades de terapia intensiva em Caruaru-PE. 2017. Dissertação (Mestrado em Biociências e Biotecnologia em Saúde) – Centro de Pesquisas Aggeu Magalhães, Fundação Oswaldo Cruz, Recife, 2017.
RESUMO
As Infecções Relacionadas à Assistência à Saúde (IRAS) são responsáveis por milhares de mortes em todo o mundo. No Brasil, este problema cresce ao longo dos anos, apresentando altos índices de morbidade e mortalidade. Em Unidades de Terapia Intensiva (UTI), a presença de bactérias em superfícies inanimadas compreende um importante problema de saúde pública, possibilitando a colonização e infecção de pacientes e favorecendo surtos de IRAS, sobretudo quando causadas por microrganismos resistentes aos antimicrobianos utilizados na prática clínica. O objetivo do estudo foi identificar os mecanismos de resistência antimicrobiana de bactérias Gram negativas isoladas de superfícies de ambiente hospitalar e hemoculturas, e sua relação com isolados associados a infecções à assistência à saúde. A identificação dos isolados foi feita por espectrometria de massas do tipo MALDI-TOF e o perfil de sensibilidade aos antimicrobianos foi determinado pela técnica de microdiluição em caldo. Os principais genes de resistência aos antimicrobianos foram identificados por PCR e pelo sequenciamento de DNA em larga escala, seguido pela comparação com bancos de dados disponíveis on-line. Os genes pesquisados incluíram blaOXA-23, -24, -51, -58 e -143-like, blaVIM-1, blaSPM-1, blaNDM-1, blaIMP-1, blaPER-1, blaKPC, blaBKC, mcr-1 e o elemento de inserção ISAba1. A relação genética entre os isolados foi estabelecida pela técnica de PFGE e MLST. Foram recuperados 70 isolados, dos quais 11 (15,7%) foram provenientes de hemoculturas e 59 (84,2%) provenientes das superfícies hospitalares distribuídas entre os leitos avaliados. As espécies bacterianas Gram negativas mais isoladas foram Acinetobacter baumannii e Klebsiella pneumoniae. Ambas as espécies apresentaram elevada resistência a antibióticos empregados na rotina clínica. Foram detectados genes de resistência aos β-lactâmicos, aminoglicosídeos, fluoroquinolonas, macrolídeos, fenicóis, sulfonamidas e trimetoprim dentre os isolados. A avaliação da relação clonal evidenciou a presença de pelo menos três clones entre os isolados de A. baumannii e cinco entre os isolados de K. pneumoniae. A presença das características de multirresistência e a ampla variedade de genes de resistência aos antimicrobianos encontrados em isolados provenientes de superfícies hospitalares reforça a importância que o ambiente desempenha como reservatório de microrganismos clinicamente relevantes. Palavras-chave: Infecção hospitalar. Resistência Microbiana a Medicamentos. Contaminação de Equipamentos.
ROCHA, Igor Vasconcelos. Identification of mechanisms of antimicrobial resistance of Gram negative bacteria prevalent on surfaces and blood cultures of intensive care units in Caruaru-PE. 2017. Dissertation (Master of Bioscience and Biotechnology for Health) –
Aggeu Magalhães Research Center, Oswaldo Cruz Foundation, Recife, 2017.
ABSTRACT
Health Care Associated Infections (HAI) are responsible for thousands of deaths worldwide. In Brazil, this problem has increased over the years, presenting high rates of morbidity and mortality. In Intensive Care Units (ICUs), the presence of bacteria on inanimate surfaces comprises an important public health problem, allowing the colonization and infection of patients and favoring HAI outbreaks, especially when caused by antimicrobial resistant microorganisms used in clinical practice. The objective of this study was to identify mechanisms of antimicrobial resistance of Gram negative bacteria isolated from hospital environment surfaces and its relation with isolates associated with health care infections. Isolates were identified by MALDI-TOF and the antimicrobial susceptibility profile was determinated by broth microdilution. The antimicrobial resistance genes were identified by PCR and by large-scale DNA sequencing, followed by comparison with databases available online. The genes studied included blaOXA-23, -24, -51, -58 and -143-like, blaVIM-1, blaSPM-1, blaNDM-
1, blaIMP-1, blaPER-1, blaKPC, blaBKC, mcr-1 and the insertion sequence ISAba1. Genetic relationship between isolates was established by PFGE and MLST technique. Seventy isolates were recovered, of which 11 (15.7%) were from blood cultures and 59 (84.2%) from hospital surfaces distributed among the evaluated ICUs. The most isolated species were Acinetonacter baumannii and Klebsiella pneumoniae. Both species presented high rates of resistance to antibiotics used in the clinical routine. Resistance genes to β-lactams, aminoglycosides, fluoroquinolones, macrolides, phenicols, sulfonamides and trimethoprim were detected among the isolates. The evaluation of the clonal relationship showed the presence of three different clones of A. baumannii and five among the isolates of K. pneumoniae. The resistance profile and genes found in isolates from hospital surfaces reinforces the importance that the environment plays as reservoir of clinically relevant microorganisms. Key words: Cross Infection. Microbial Drug Resistance. Equipment Contamination.
LISTA DE ILUSTRAÇÕES
Figura 1 - Hidrólise do anel β-lactâmico de penicilina .......................................................... 25
Quadro 1 - Modelos de classificação das β-lactamases ......................................................... 26
Figura 2 - Distribuição global de KPC em isolados de Klebsiella pneumoniae ..................... 31
Figura 3 - Distribuição global da Verona imipenemase (VIM) até o ano de 2009 ................. 33
Figura 4 - Distribuição global de isolados de Klebsiella pneumoniae produtores de NDM-1 34
Figura 5 - Distribuição das principais oxacilinases no território brasileiro ............................ 35
Quadro 2 - Oligonucleotídeos utilizados para a amplificação de genes determinantes de
resistência bacteriana e ISAba1 ............................................................................................ 51
Quadro 3 - Condições da eletroforese - PFGE em sistema CHEF-DR III (Bio-Rad) ............. 54
Quadro 4 - Distribuição dos isolados bacterianos provenientes de hemoculturas e superfícies
inanimadas coletados em 2015 de acordo com cada leito analisado ...................................... 60
Gráfico 1 - Distribuição das espécies isoladas nas superfícies hospitalares avaliadas ............ 63
Figura 6 - Padrões de PFGE, MLST, genes de resistência e perfil de sensibilidade observados
em Acinetobacter baumannii ...................................................................................................65
Figura 7 - Teste CarbAcineto: Detecção de carbapenemase em Acinetobacter baumannii .... 67
Figura 8 - Eletroforese dos produtos de PCR realizada para os isolados de Acinetobacter
baumannii ............................................................................................................................ 69
Figura 9 - Alinhamento das sequências de aminoácidos de GyrA e ParC de quatro isolados de
Acinetobacter baumannii ..................................................................................................... 70
Quadro 5 - Mecanismos de resistência adquiridos identificados a partir do alinhamento dos
genomas de Acinetobacter baumannii frente à base de dados ResFinder 2.1 ........................ 72
Figura 10 - Padrões de PFGE, genes de resistência, CarbaNP e perfil de resistência
observados em Klebsiella pneumoniae ................................................................................. 74
Figura 11 - Eletroforese dos produtos de PCR com oligonucleotídeos KPC-F e KPC-R em
Klebsiella pneumoniae ......................................................................................................... 75
Figura 12 - Teste CarbaNP Enterobacteriaceae: Detecção de carbapenemase em Klebsiella
pneumoniae.......................................................................................................................... 75
LISTA DE TABELAS
Tabela 1 - Concentrações avaliadas no teste fenotípico de resistência aos antimicrobianos ... 48
Tabela 2 - Distribuição das espécies bacterianas isoladas nas superfícies inanimadas avaliadas
............................................................................................................................................ 62
LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS
AMK - Amicacina
AMP/SUB - Ampicilina/Sulbactam
ASCES - Associação Caruaruense de Ensino Superior e Técnico
ATCC - American Type Culture Colection
BGNNF - Bacilos Gram negativos não-fermentadores
BHI - Brain Heart Infusion
BKC - Brazilian Klebsiella carbapenemase
BLAD - β-lactamase Data Base
BLAST - Basic Local Alignment Search Tool
CA-MHB - Cation-adjusted Müeller-Hinton broth
CAZ - Ceftazidima
CEP - Comitê de Ética em Pesquisa
CIP - Ciprofloxacina
CPqAM - Centro de Pesquisas Aggeu Magalhães
CRO - Ceftriaxona
CTX-M - Ativa contra cefotaxima, primeiro isolamento em Munique
DNA - Ácido desoxirribonucleico
dNTP - Desoxirribonucleotídeos fosfatados
EDTA - Ácido etilenodiamino tetra-acético
ESBL - β-lactamase de Espectro Estendido
EUA - Estados Unidos da América
FEP - Cefepime
FIOCRUZ - Fundação Oswaldo Cruz
GEN - Gentamicina
GES - Guiana-extend spectrum
GIM - German imipenemase
ICS - Infecções da corrente sanguínea
IMP - Imipenemase
IPM - Imipenem
IRAS - Infecções Relacionadas à Assistência à Saúde
IS - Elemento de inserção
KPC - Klebsiella pneumoniae carbapenemase
LB - Caldo Luria-Bertani
LVX - Levofloxacina
mA - Mili Ampere
MALDI-TOF - Matrix Assisted Laser Desorption Ionization-Time of Flight
MEM - Meropenem
mL - Mililitros
MLST - Multi Locus Sequencing Typing
MRSA - Methicillin-resistant Staphylococcus aureus
MβL - Metalo-β-lactamase
NDM - New Delhi metalo-β-lactamase
ORSA - Oxacillin-resistant Staphylococcus aureus
OXA - Oxacilinase
pb - Pares de bases
PMB - Polimixina B
PBP - Proteína Ligadora de Penicilina
PCR - Reação em cadeia da polimerase
PE - Pernambuco
PFGE - Eletroforese em campo pulsátil
pH - Potencial hidrogeniônico
QRDR - Quinolone resistance determining region
rpm - Rotações por minuto
rRNA - Ácido ribonucleico ribossomal
SHV - Sulfhydryl reagent variable
SPM - São Paulo metalo-β-lactamase
TEM-1 - Temoniera β-lactamase-1
TSA - Teste de sensibilidade aos antimicrobianos
TSB - Caldo triptona de soja
UTI - Unidade de Terapia Intensiva
VIM - Verona imipenemase
SUMÁRIO
1 INTRODUÇÃO ............................................................................................................... 16
2 REFERENCIAL TEÓRICO .......................................................................................... 18
2.1 Infecções Relacionadas à Assistência à Saúde (IRAS) ................................................ 18
2.2 O contexto do ambiente hospitalar no estabelecimento de IRAS ............................... 18
2.3 Principais espécies bacterianas de importância clínica .............................................. 19
2.4 Infecções da corrente sanguínea .................................................................................. 22
2.5 Formas de aquisição e principais mecanismos de resistência antimicrobiana ........... 22
2.6 Resistência antimicrobiana mediada por produção enzimática ................................. 23
2.6.1 Antibióticos β-lactâmicos e as β-lactamases ................................................................ 24
2.6.2 Principais grupos das β-lactamases .............................................................................. 28
2.6.2.1 Cefalosporinases ...................................................................................................... 28
2.6.2.2 β-lactamase de Espectro Estendido (ESBL) .............................................................. 29
2.6.2.3 Serino carbapenemases ............................................................................................ 30
2.6.2.4 Metalo-β-lactamases (MβL)...................................................................................... 32
2.6.2.5 Oxacilinases ............................................................................................................. 34
2.7 Elementos de inserção .................................................................................................. 35
2.8 Proteínas de membrana externa e a resistência aos carbapenêmicos ........................ 36
2.9 Mecanismos de resistência aos aminoglicosídeos ........................................................ 37
2.10 Mecanismos de resistência às fluoroquinolonas ............................................................ 37
2.11 Mecanismos de resistência às polimixinas .................................................................... 38
3 OBJETIVOS ................................................................................................................... 40
3.1 Objetivo geral ............................................................................................................... 40
3.2 Objetivos específicos .................................................................................................... 40
4 METODOLOGIA ........................................................................................................... 41
4.1 Desenho do estudo ........................................................................................................ 41
4.2 Cultura, isolamento e identificação dos espécimes bacterianos .................................. 42
4.3 Extração de DNA genômico, amplificação e sequenciamento .................................... 44
4.4 Teste de sensibilidade aos antimicrobianos ................................................................. 45
4.5 Teste in vitro de hidrólise enzimática dos carbapenêmicos ........................................ 49
4.6 Pesquisa de genes codificadores de β-lactamases ........................................................ 50
4.7 Determinação da relação genética entre os isolados estudados .................................. 52
4.7.1 Preparação dos blocos de agarose ................................................................................ 52
4.7.2 Restrição do DNA bacteriano ...................................................................................... 53
4.7.3 Eletroforese em campo pulsátil (PFGE) ....................................................................... 53
4.8 Sequenciamento do genoma bacteriano das principais representantes de
Acinetobacter baumannii .................................................................................................... 54
4.8.1 Extração e quantificação do DNA genômico ............................................................... 55
4.8.2 Preparação da biblioteca .............................................................................................. 55
4.8.3 Normalização da biblioteca ......................................................................................... 56
4.8.4 Sequenciamento da biblioteca...................................................................................... 56
4.9 Montagem e anotação dos genomas ............................................................................. 57
4.10 Considerações éticas ................................................................................................... 57
4.11 Análise dos dados ....................................................................................................... 58
5 RESULTADOS ............................................................................................................... 59
5.1 Distribuição e identificação dos isolados de superfícies inanimadas e de ICSs.......... 59
5.2 Acinetobacter baumannii .............................................................................................. 63
5.2.1 Análise da similaridade genética entre os isolados de A. baumannii ............................. 63
5.2.2 Perfil de sensibilidade aos antimicrobianos e mecanismos de resistência aos
antimicrobianos entre os isolados de A. baumannii ............................................................... 66
5.3 Klebsiella pneumoniae .................................................................................................. 73
5.3.1 Análise da similaridade genética e resistência antimicrobiana entre os isolados de K.
pneumoniae.......................................................................................................................... 73
6 DISCUSSÃO ................................................................................................................... 77
7 CONCLUSÕES ............................................................................................................... 85
REFERÊNCIAS ................................................................................................................. 86
APÊNDICE A - Condições de termociclagem da reação em cadeia da polimerase para
cada oligonucleotídeo iniciador ....................................................................................... 106
APÊNDICE B - Estatísticas decorrentes da montagem dos genomas de Acinetobacter
baumannii utilizando o algoritmo SPAdes....................................................................... 107
ANEXO A - Parecer 1.061.201 do Comitê de Ética em Pesquisa ................................... 108
16
1 INTRODUÇÃO
As Infecções Relacionadas à Assistência à Saúde (IRAS) são responsáveis por milhares
de mortes todos os anos em todo o mundo. No Brasil, este é um problema que vem crescendo
tanto em número quanto em complexidade, ocasionando perturbações econômico-sociais e
representando altos índices de morbidade e mortalidade (ALLEGRANZI et al., 2011; SOUZA
et al., 2015).
Em Unidades de Terapia Intensiva (UTIs), bactérias em superfícies inanimadas são
comuns, tornando-as reservatórios desses microrganismos e possibilitando a colonização e
infecção de pacientes. Este fato dificulta o prognóstico e favorece surtos de IRAS
principalmente por microrganismos resistentes a antibióticos comumente empregados na
terapêutica, ocasionando grandes limitações ao tratamento dos pacientes e representando, por
fim, grande ameaça à saúde pública (FERREIRA et al., 2011; KRAMER; SCHWEBKE;
KAMPF, 2006; LIVSHIZ-RIVEN et al., 2015; OLIVEIRA; DAMASCENO, 2010;
SILVEIRA et al., 2006).
O papel que o ambiente hospitalar exerce como reservatório de microrganismos, no
entanto, ganhou importância sobretudo nas últimas décadas, quando o mesmo passou a ser
considerado fator secundário na transmissão de IRAS, incluindo infecções da corrente
sanguínea (AGÊNCIA NACIONAL DE VIGILÂNCIA SANITÁRIA, 2004; CARREIRO;
FIGUEIREDO; BRANDÃO, 2014; KRAMER; SCHWEBKE; KAMPF, 2006; LÓPEZ-
CERERO, 2014).
Diversos são os mecanismos que conferem resistência antimicrobiana às bactérias, no
entanto, a principal forma envolvida inclui a produção de enzimas capazes de inativar a
atividade de determinado antimicrobiano (BECEIRO; TOMÁS; BOU, 2013; CLÍMACO,
2011).
Dentre as principais bactérias relacionadas a processos de IRAS, as Gram negativas se
destacam neste tipo de infecção, principalmente quando produtoras de β-lactamases - isto é,
enzimas com capacidade de degradar antibióticos da classe dos β-lactâmicos - incluindo
derivados da penicilina, cefalosporinas e carbapenêmicos, amplamente utilizados na prática
clínica (MEYER; PICOLI, 2011; ZANOL; PICOLI; MORSCH, 2010).
Em estudo anteriormente realizado pelo grupo de pesquisa (ROCHA et al., 2015a), foi
observada uma elevada frequência de microrganismos Gram negativos multirresistentes
presentes em superfícies e equipamentos de UTIs de um hospital de Caruaru-PE. No ano
seguinte, estudos realizados na mesma cidade reportaram a ocorrência de multirresistência em
17
73% dos Gram negativos isolados a partir de culturas de sangue (SILVA; OLIVEIRA-
SILVA; OLIVEIRA, 2014), atentando à possível participação do ambiente como reservatório
de microrganismos de importância clínica.
Considerando a possibilidade de contaminação cruzada de bactérias situadas em
superfícies hospitalares, sua capacidade de infecção de pacientes de UTI e, associado à
escassez de dados acerca do perfil de sensibilidade antimicrobiana de microrganismos
presentes em hospitais da região Agreste de Pernambuco, a proposta desse estudo é avaliar o
perfil de sensibilidade destes isolados bacterianos, comparando com os que causam infecção,
além da identificação dos mecanismos moleculares relacionados à resistência antimicrobiana.
O presente estudo poderá fornecer instrumentos para a elaboração de sistemas de
mapeamento que poderão orientar o direcionamento de medidas de controle pelo uso
adequado de antimicrobianos, e precauções de barreira que visem o controle da disseminação
destes agentes no ambiente intra-hospitalar, possibilitando assim a desaceleração dos
processos de resistência bacteriana e a redução da morbimortalidade ocasionada pelas IRAS.
18
2 REFERENCIAL TEÓRICO
2.1 Infecções Relacionadas à Assistência à Saúde (IRAS)
As Infecções Relacionadas à Assistência à Saúde (IRAS) são definidas como infecções
associadas a procedimentos assistenciais, sejam de caráter terapêutico ou diagnóstico, que
acometem o indivíduo no âmbito hospitalar ou ambulatorial (OLIVEIRA et al., 2012).
Embora estimativas acerca do impacto global das IRAS sejam dificultadas pela escassez
de dados no que se refere a infecções endêmicas em nível nacional e regional, sobretudo em
países com recursos limitados (ALLEGRANZI et al., 2011), no Brasil, estima-se que as IRAS
atinjam cerca de 10% dos pacientes hospitalizados e até 35% dos pacientes admitidos em
Unidades de Terapia Intensiva (NANGINO et al., 2012; OLIVEIRA et al., 2012; SOUZA;
FIGUEIREDO, 2008). Tal fato representa um problema grave que anualmente cresce em
incidência e complexidade, ocasionando diversas complicações sociais e econômicas, além de
representar a principal causa de morbidade e mortalidade em UTIs (ALLEGRANZI et al.,
2011; CASSIR et al., 2015; GELATTI et al. 2009; SOUZA; FIGUEIREDO, 2008).
A consolidação de sistemas de vigilância para o monitoramento de IRAS é considerada
uma medida primordial na prevenção de tais eventos, visto que favorece uma fidedigna
análise da situação e torna possível a formulação de ações efetivas no controle deste problema
(HENRIQUE et al., 2013; NOGUEIRA-JUNIOR, 2013; NOGUEIRA-JUNIOR;
PADOVEZE; LACERDA, 2014). No entanto, estudos revelam que poucos países de renda
baixa e média possuem sistemas nacionais de vigilância para as IRAS (ALLEGRANZI et al.,
2011).
2.2 O contexto do ambiente hospitalar no estabelecimento de IRAS
As IRAS podem ocorrer por três formas distintas: através do contato do paciente com
sua própria microbiota; pelo contato com microrganismos advindos de outros pacientes ou
profissionais de saúde; ou ainda por patógenos presentes no ambiente hospitalar (LÓPEZ-
CERERO, 2014).
A influência do ambiente hospitalar como reservatório de microrganismos foi abordada
principalmente nas últimas décadas, quando este passou a ser considerado constituinte
secundário como fonte de IRAS, sendo estas de trato respiratório, urinário ou ainda infecções
da corrente sanguínea, principalmente em pacientes com quadros de imunodeficiência
19
(AGÊNCIA NACIONAL DE VIGILÂNCIA SANITÁRIA, 2004; CARREIRO,
FIGUEIREDO; BRANDÃO, 2014).
As principais causas intra-hospitalares desta problemática relacionadas a processos de
contaminação cruzada ocorrem devido ao uso prolongado de dispositivos venosos centrais,
antibioticoterapia, estados de imunodepressão e tempo de permanência na UTI (PINHEIRO,
2014).
Em unidades de terapia intensiva, bactérias em superfícies inanimadas são comuns,
tornando-as reservatórios desses microrganismos e possibilitando a colonização e infecção de
pacientes. Tal fato dificulta o prognóstico e favorece surtos de IRAS principalmente por
microrganismos resistentes aos antimicrobianos comumente empregados na terapêutica,
ocasionando graves limitações ao tratamento dos pacientes e representando ameaça à saúde
pública (FERREIRA et al., 2011; KRAMER; SCHWEBKE; KAMPF, 2006; LIVSHIZ-
RIVEN et al., 2015; OLIVEIRA; DAMASCENO, 2010; SILVEIRA et al., 2006).
Estudos recentes (HEALTHCARE INFECTION CONTROL PRACTICES
ADVISORY COMMITTEE, 2008; OTTER; YEZLI; FRENCH, 2011) demonstram que as
superfícies ambientais desempenham um importante papel na transmissão de uma série de
agentes patogênicos (em sua maioria bactérias). Estes autores relatam ainda a importância que
os equipamentos não-invasivos compartilhados entre os diversos leitos hospitalares exercem
sobre as IRAS, uma vez que os mesmos são utilizados em contato direto com a pele e/ou
imediações próximas.
Atualmente, diferentes estratégias são utilizadas para prevenir a disseminação de
microrganismos no ambiente intra-hospitalar, sendo as mais frequentes os procedimentos anti-
aerossol (instalação de filtros em locais estratégicos), sistemas de desinfecção manuais e
automáticos ou ainda precauções de barreira, isolando o paciente colonizado/infectado dos
demais (LÓPEZ-CERERO, 2014; MANZO et al., 2015). A execução de tais medidas, no
entanto, torna-se muitas vezes impossibilitada pelas limitações físicas e/ou financeiras dos
hospitais.
2.3 Principais espécies bacterianas de importância clínica
O grupo de microrganismos que se destaca como principal causa de IRAS é o das
bactérias (ZANOL; PICOLI; MORSCH, 2010). No ambiente hospitalar, a presença destes
microrganismos em superfícies inanimadas e equipamentos é considerada uma ameaça à
saúde pública (SILVEIRA et al., 2006), tendo em vista sua capacidade de colonização e
20
infecção de pacientes, dificultando o prognóstico e favorecendo processos infecciosos
(OLIVEIRA; DAMASCENO, 2010). Em períodos de baixa imunidade, tais microrganismos
atuam como agentes oportunistas, causando infecções em indivíduos com estado clínico
comprometido (AGÊNCIA NACIONAL DE VIGILÂNCIA SANITÁRIA, 2004).
Atualmente, tem-se reportado o crescimento de casos de IRAS causadas por
Staphylococcus aureus resistente à Oxacilina (ORSA) e Staphylococcus aureus resistente à
Meticilina (MRSA), sendo a principal causa para o aparecimento desses microrganismos a
pressão seletiva devido ao uso indiscriminado de antibióticos (WANESS, 2010; WEISS et al.,
2015).
Demais bactérias Gram positivas que se destacam em processos infecciosos incluem
Enterococcus sp. e Staphylococcus coagulase negativa resistentes à vancomicina, fato que
decorreu, assim como relatado anteriormente, pelo uso constante de tal antibiótico na terapia
(PREMATUNGE et al., 2016; VALENCIA-REY et al., 2015; WEISS et al., 2015).
Apesar dos inúmeros relatos de bactérias Gram positivas relacionadas a processos de
IRAS (BERNARDES; JORGE; LEÃO, 2004; FURTADO et al., 2005; MIMICA; MENDES,
2007; SANTOS et al., 2007; VALENCIA-REY et al., 2015; WEISS et al., 2015), as Gram
negativas se destacam nesse tipo de infecção, tais como Acinetobacter baumannii, Klebsiella
pneumoniae, Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa, Enterobacter spp., Serratia spp. e
Proteus spp., compreendendo, desta maneira, bactérias da família Enterobacteriaceae e o
grupo dos Bacilos Gram negativos Não-fermentadores de glicose (BGNNF), (AGÊNCIA
NACIONAL DE VIGILÂNCIA SANITÁRIA, 2004; MEHRAD et al., 2015; NGAI et al.,
2016; PEREIRA et al., 2012).
As bactérias envolvidas em processos de IRAS, no geral, possuem a capacidade de
produzir enzimas (classificadas conforme sua ação sobre os antibióticos) que atuam na
degradação dos principais antimicrobianos administrados nos hospitais (MEYER; PICOLI,
2011). As mais prevalentes se encontram no grupo das β-lactamases e degradam β-lactâmicos
- uma classe de antimicrobianos bastante utilizados no tratamento de infecções hospitalares -
podendo-se destacar as cefalosporinas e os carbapenêmicos (MEYER; PICOLI, 2011).
As enterobactérias são bacilos Gram negativos que fazem parte da microbiota intestinal
de mamíferos e compreendem os mais comuns patógenos de humanos (NORDMANN;
DORTET; POIREL, 2012). O grupo corresponde também aos patógenos mais associados a
infecções na comunidade e àquelas associadas à assistência à saúde, ocasionando infecções
como pneumonias, peritonites, meningites e infecções urinárias, além de septicemias e
infecções associadas ao uso de dispositivos médicos, responsável por altos índices de
21
mortalidade principalmente quando associado a elevadas taxas de resistência aos
antimicrobianos (MOBLEY, 2016; NORDMANN; DORTET; POIREL, 2012; SAVARD;
PERL, 2014).
Diversos estudos têm relatado a presença de Enterobacteriaceae e BGNNF com perfil de
resistência aos carbapenêmicos em superfícies hospitalares secas, fato que, associado à sua
alta capacidade de disseminação entre humanos, reforça a possibilidade de ocorrência de
processos de contaminação cruzada (NORDMANN; DORTET; POIREL, 2012; SHIMOSE et
al., 2016; WEBER et al., 2015).
Os BGNNF, por sua vez, são caracterizados por serem microrganismos aeróbios, não
esporulados e que utilizam carboidratos por via oxidativa, sendo responsáveis por infecções
oportunistas tais como infecções do trato urinário, pneumonias, meningites e septicemias
(MARTINS; BARTH, 2013).
Dentre os principais exemplares com relevância clínica no grupo dos BGNNF,
destacam-se os gêneros Burkholderia spp., Stenotrophomonas spp., Acinetobacter spp. e
Pseudomonas spp., sendo os dois últimos os mais frequentemente relacionados a infecções
em ambientes de UTI (PEREIRA et al., 2012; PORTO ALEGRE, 2007).
Pseudomonas sp. pertence à família Pseudomonadaceae, apresentando-se na forma de
bastonetes, frequentemente associada a IRAS, acometendo pacientes imunossuprimidos
(FERREIRA; LALA, 2010). No ambiente hospitalar, os aparelhos de respiração, pias,
artefatos de limpeza e sistemas de hemodiálise são as fontes de maior contaminação pela
espécie (FERREIRA; LALA, 2010). Sua importância clínica se dá também à sua relativa
resistência aos antibióticos e sua susceptibilidade reduzida aos antissépticos e desinfetantes,
sendo a maioria dos exemplares isolados em UTIs resistentes (FERREIRA; LALA, 2010;
HARBARTH et al., 2014).
O gênero Acinetobacter, por sua vez, se apresenta como coco-bacilos, imóveis, aeróbios
estritos e não formadores de esporos. Diversas espécies já foram descritas, no entanto, a
espécie A. baumannii é a mais prevalente em amostras clínicas (MARTINS; BARTH, 2013;
PORTO ALEGRE, 2007).
Estudos sugerem que o uso de ampicilina associada à sulbactam no tratamento de
Acinetobacter sp. apresenta resultados satisfatórios, razão pela qual esse antimicrobiano tem
sido utilizado como opção para tratamento dessa bactéria. Esta combinação permite evitar o
uso de carbapenêmicos, exceto em casos de resistência, como observado na última década
(CHUANG et al., 2014; MARTINS; BARTH, 2013; PORTO ALEGRE, 2007).
22
2.4 Infecções da corrente sanguínea
Em Unidades de Terapia Intensiva (UTI), infecções da corrente sanguínea (ICS) são
indicativos de eventos graves (GUILARDE et al., 2007).
As bacteremias geralmente ocorrem pela penetração de microrganismos a partir de um
foco primário de infecção nos vasos linfáticos, chegando posteriormente até o sangue; ou por
uma via direta através de agulhas e/ou cateteres, podendo ocasionar a disseminação da
infecção, cuja expressão clínica varia desde quadros autocontroláveis até o óbito. Os índices
de mortalidade atingem até 35% dos pacientes, ocasionando, antes deste estágio, o
prolongamento da internação hospitalar e elevação de custos com procedimentos adicionais
(AGÊNCIA NACIONAL DE VIGILÂNCIA SANITÁRIA, 2004; GUILARDE et al., 2007).
Na prática clínica, o isolamento e identificação bacteriana em amostras sanguíneas são
tidos como recurso indispensável para o diagnóstico de processos infecciosos, sendo
importante também no monitoramento do paciente e na triagem dos casos de septicemia
(AGÊNCIA NACIONAL DE VIGILÂNCIA SANITÁRIA, 2004; ALVES et al., 2012;
GUILARDE et al., 2007).
As espécies mais frequentemente isoladas a partir de hemoculturas incluem S. aureus,
P. aeruginosa, Enterobacter spp., E. coli, Klebsiella spp., Acinetobacter spp., Staphylococcus
coagulase negativa, S. maltophilia e Serratia spp. (GUILARDE et al., 2007), embora a
epidemiologia das infecções variem de acordo com múltiplos fatores associados ao paciente,
ambiente ou ao agente infeccioso (ALLEGRANZI et al., 2011; PINHEIRO, 2014).
Apesar do grande número de estudos sobre infecções da corrente sanguínea (CUROVÁ
et al., 2014; HODZIC et al., 2014; KULKOVÁ et al., 2014), estudos nacionais são limitados e
muitas vezes realizados sem vinculação com dados ambientais (GUILARDE et al., 2007). A
realização de estudos que visem a integração das referidas partes é necessária. Desta maneira
torna-se possível a execução de procedimentos que visem a prevenção da disseminação de
bactérias e a consequente diminuição de casos de IRAS nestes ambientes (CARREIRO,
FIGUEIREDO; BRANDÃO, 2014; LIMA et al., 2015).
2.5 Formas de aquisição e principais mecanismos de resistência antimicrobiana
O material genético bacteriano é constituído frequentemente por um único cromossomo
circular, podendo conter fragmentos de ácido desoxirribonucleico circular, formando uma
23
estrutura conhecida como plasmídeo, que confere novas características à bactéria, dentre elas
a resistência a certos antibióticos (TRABULSI; ALTERTHUM, 2008).
A célula bacteriana pode adquirir os genes de resistência por processos conhecidos
como transformação, conjugação, transdução ou transposição. Na transformação, a bactéria
capta o material genético disperso no meio e incorpora ao seu. Na conjugação, o material
genético é transmitido entre duas bactérias através do contato direto pelo pilus sexual. Já a
transdução é um processo caracterizado pela presença de um bacteriófago, que realiza a
transferência do material genético entre as bactérias (TAVARES, 2000). A transposição
consiste na movimentação de estruturas denominadas transposons (ou elementos
transponíveis), que compreendem sequências nucleotídicas que são mobilizadas de um local
para outro do genoma, podendo carrear genes de resistência antimicrobiana, além de outros
cassetes gênicos (CABRERA; GÓMEZ; ZÚÑIGA, 2007).
As principais formas envolvidas no processo de resistência antimicrobiana incluem: a) a
produção de proteínas capazes de inativar o antibiótico ou impedir a ligação do mesmo ao seu
sítio-alvo (ARDEBILI et al., 2015; CLÍMACO, 2011), sendo os genes codificadores
presentes no cromossomo, plasmídeo ou elementos de transposição bacterianos (TRABULSI;
ALTERTHUM, 2008); b) as alterações estruturais ou redução da expressão de proteínas de
membrana (CLÍMACO, 2011; LIU et al., 2014); c) a expressão de bombas de efluxo que
expulsam moléculas do antibiótico do meio intracelular para o extracelular, impedindo ou
dificultando sua ligação com o sitio-alvo, causando, desta maneira, diminuição ou supressão
da sensibilidade a múltiplos antimicrobianos (BECEIRO; TOMÁS; BOU, 2013; CABRERA;
GÓMEZ; ZÚÑIGA, 2007; TRABULSI; ALTERTHUM, 2008); ou d) a presença de mutações
em um ou mais genes que codificam regiões-alvo (proteínas) destes antimicrobianos
(ARDEBILI et al., 2015; FONSECA et al., 2013).
2.6 Resistência antimicrobiana mediada por produção enzimática
O grau de resistência bacteriana é dependente de vários fatores, dentre eles, da
quantidade de enzima expressa pelo microrganismo, da capacidade que a enzima apresenta
em hidrolisar o antimicrobiano (potência), e ainda da velocidade de permeabilidade do
antibiótico, isto é, a rapidez com que o antibiótico penetra pela membrana externa bacteriana
(CAMPANA, 2009; LIVERMORE, 1995; MACEDO et al., 2005).
Em bactérias Gram negativas, a produção enzimática constitui o principal mecanismo
de aquisição de resistência aos antimicrobianos β-lactâmicos. Estas enzimas são conhecidas
24
em geral como β-lactamases (BECEIRO; TOMÁS; BOU, 2013; CLÍMACO, 2011;
OLIVEIRA, 2008; SILVA; LINCOPAN, 2012).
2.6.1 Antibióticos β-lactâmicos e as β-lactamases
Diversas propostas de classificação têm sido elaboradas em relação às β-lactamases com
o intuito de corrigir eventuais falhas de classificação anteriores, ou ainda pela necessidade em
caracterizar novas enzimas da classe (GRALHA, 2011).
Atualmente, dois modelos de classificação das β-lactamases encontram-se em vigor. O
primeiro deles foi preconizado por Ambler (1980) e utiliza como base a sequência de
nucleotídeos e aminoácidos para categorizar as β-lactamases de acordo com a estrutura
molecular da enzima. Neste modelo, quatro grupos básicos de β-lactamases foram propostos,
sendo eles: Grupo A (β-lactamases de espectro estendido - ESBL); Grupo B (metalo-β-
lactamases - MβL); Grupo C (cefalosporinases cromossomais); e o Grupo D (oxacilinases)
(AMBLER, 1980; EVANS; AMYES, 2014; GRALHA, 2011; NICOLETTI, 2014).
O segundo modelo, proposto inicialmente por Bush (1989) e atualizado por Bush,
Jacoby e Medeiros (BUSH; JACOBY; MEDEIROS, 1995), subdivide estas enzimas levando
em consideração suas características funcionais e bioquímicas, sendo composta por quatro
grupos (1 a 4) e seis subgrupos (A a F) (AMBLER, 1980; BUSH; JACOBY, 2010;
GRALHA, 2011; LIVERMORE, 1995). Em 2010, esta classificação foi novamente atualizada
com o intuito de abranger enzimas descritas entre esse intervalo (BUSH; JACOBY, 2010),
conforme apresentado no Quadro 1.
Os antibióticos β-lactâmicos são as drogas mais utilizadas no tratamento de infecções
bacterianas. Nas últimas décadas, o aumento da resistência a estes antimicrobianos em
bactérias Gram positivas e negativas tem se tornado grande ameaça à saúde pública
(JACOBY, 2009; LEONARD; BONOMO; PALZKILL, 2013; POWERS, 2013).
O mecanismo de ação desses antibióticos se dá pela inibição de enzimas do tipo
transpeptidase (ou proteínas ligadoras de penicilina), impedindo a estruturação da parede
bacteriana e conduzindo, desta maneira, as bactérias à morte (PALZKILL, 2013).
Reportadas pela primeira vez na década de 1940 em extratos de Bacillus coli
(Escherichia coli) (ABRAHAM; CHAIN, 1940), as β-lactamases são enzimas que possuem
capacidade de hidrolisar o anel β-lactâmico (Figura 1) pela quebra da ligação amida,
bloqueando assim a capacidade de inibição da síntese da parede celular bacteriana por estes
antimicrobianos (BERTONCHELI; HÖRNER, 2008; BUSH, 2010).
25
Dados publicados até o ano de 2010 (BUSH, 2010) estimaram a existência de cerca de
900 β-lactamases diferentes, sendo estas separadas em grupos de acordo com a sequência de
aminoácidos de sua composição ou ainda de acordo com as diferenças existentes entre suas
características catalíticas de inativação do antibiótico (BERTONCHELI; HÖRNER, 2008;
BUSH, 2010).
As β-lactamases representam o principal mecanismo de resistência bacteriana a
penicilinas, cefamicinas, cefalosporinas, monobactâmicos e carbapenêmicos (BECEIRO;
TOMÁS; BOU, 2013; CLÍMACO, 2011; OLIVEIRA, 2008; SILVA; LINCOPAN, 2012).
As principais enzimas β-lactamases de interesse clínico são a β-lactamase de Espectro
Estendido (ESBL), a Metalo-β-lactamase (MβL), a β-lactamase classe C e a Klebsiella
pneumoniae carbapenemase (KPC) (HAMIDIAN; HALL, 2014; LIN et al., 2011; MARTINS;
BARTH, 2013; MEYER; PICOLI, 2011).
Fonte: Adaptado de Danishuddin et al. (2013).
Figura 1 - Hidrólise do anel β-lactâmico de penicilina
26
Quadro 1 - Modelos de classificação das β-lactamases (continua)
Classificação
de Ambler
(1980)
Classificação de
Bush, Jacoby e
Medeiros (1995)
Classificação
de Bush e
Jacoby (2010)
Características hidrolíticas Inibição Principais enzimas
representantes Ác. clavulânico Tazobactam EDTA
A 2ª 2a Penicilinas Sim Sim Não PC1
A 2b 2b Penicilinas, cefalodrina, cefazolina e cefalotina Sim Sim Não SHV-1, TEM-1,-2 e -90
A 2be 2be Penicilinas, cefalosporinas e monobactâmicos Sim Sim Não PER-1, CTX-M-15
A 2br 2br Penicilinas, cefalodrina, cefazolina e cefalotina Fraca SI Não TEM-30, SHV-10 e 26
A NI 2ber Penicilinas, cefalosporinas e monobactâmicos Fraca Fraca SI TEM-50, 68 e 89
A 2c 2c Carbenicilina Sim SI Não CARB-3, PSE-1
A 2e 2e Cefalosporinas Sim Sim Não CepA
A 2f 2f Carbapenêmicos, cefalosporinas, penicilinas e
cefamicinas Fraca Fraca Não
IMI-1, KPC-2 e 3, GES-
2, SME-1 e BKC-1
B 3 3a Todos os β-lactâmicos Não Não Sim IMP-1, NDM-1, VIM-1
B 3 3b Carbapenêmicos Não Não Sim CphA, Sfh-1
C 1 1 Cefalosporinas e cefamicinas Não Não Não AmpC, CMY-2
C NI 1e Penicilinas, cefamicinas, cefalosporinas e
monobactâmicos Não Não SI CMY-37, GC1
27
Quadro 1 - Modelos de classificação das β-lactamases (conclusão)
Classificação
de Ambler
(1980)
Classificação de
Bush, Jacoby e
Medeiros (1995)
Classificação
de Bush e
Jacoby (2010)
Características hidrolíticas Inibição Principais enzimas
representantes Ác. clavulânico Tazobactam EDTA
D NI 2ce Carbenicilina, cefepime e cefpiroma Sim Sim SI RTG-4
D 2d 2d Cloxacilina ou oxacilina Variável SI Não OXA-1 e OXA-10
D NI 2de Penicilinas e cefalosporinas Variável SI SI OXA-11 e OXA-15
D NI 2df Carbapenêmicos e cloxacilina ou oxacilina Variável SI SI OXA-23 e OXA-48
ND 4 NI Não sequenciadas. Não agrupáveis. Fonte: Adaptado de Bush, Jacoby e Medeiros (1995), Bush e Jacoby (2010), Gralha (2011) e Nicoletti (2014). Legenda: ND - não determinado; NI - não incluído; SI – sem informação.
28
2.6.2 Principais grupos das β-lactamases
2.6.2.1 Cefalosporinases
As cefalosporinases, β-lactamases de classe C, são frequentemente produzidas por
espécies da família Enterobacteriaceae (BUSH, 2010), como Serratia marcescens,
Enterobacter cancerogenus/taylorae, Proteus mirabilis, Escherichia coli e Klebsiella
pneumoniae (CHÉRIF et al., 2015; JACOBY, 2009). Estas são uma das mais disseminadas
enzimas bacterianas (BUSH, 2010; JACOBY, 2009), sendo descritas também em outros
isolados de interesse clínico, como Pseudomonas aeruginosa (MORTARI et al., 2008) e
Acinetobacter baumannii (AGODI et al., 2014). Quanto à origem, podem ser cromossômicas
ou plasmidiais (JACOBY, 2009; NORCIA et al., 2015), sendo as cefalosporinases plasmidiais
derivadas de genes cromossômicos de exemplares pertencentes à família Enterobacteriaceae
(ALVAREZ et al., 2004).
Em relação às cefalosporinases cromossomais, as ADCs (Acinetobacter-derived
cephalosporinases) compreendem um vasto grupo com mais de 50 variantes enzimáticas
codificadas por genes localizados no cromossomo de Acinetobacter spp. Estas enzimas
possuem alto grau de similaridade entre si, diferenciando-se por 1 a 25 aminoácidos e
compartilhando de 35 a 45% de identidade em relação a outros exemplares da classe C
(BHATTACHARYA et al., 2014). As ADCs geralmente hidrolisam cefalosporinas, como a
cefotaxima e ceftazidima, mas foram descritas como incapazes de hidrolisar o cefepime e os
carbapenêmicos. No entanto, mudanças na atividade hidrolítica destas β-lactamases da classe
C têm sido associadas a substituições de aminoácidos e/ou deleções/inserções em regiões
estruturais específicas, como aquelas do sítio ativo da enzima; Ω-loop; hélices H2 e H10 e na
região do C-loop (C-terminal) apresentado por essas enzimas (NORDMANN; MAMMERI,
2007).
Recentemente, duas variantes dessas enzimas (ADC-33 e ADC-56) foram descritas com
a capacidade de hidrolisar cefepime (PÉREZ et al., 2014; TIAN et al., 2011). Posteriormente,
uma nova variante denominada ADC-68 foi caracterizada apresentando atividade contra os
carbapenêmicos (imipenem, meropenem e ertapenem) (JEON et al., 2014).
Embora sejam normalmente produzidas em níveis basais, as cefalosporinases podem
apresentar altos níveis de expressão quando associadas a promotores fortes, como os
elementos de inserção (IS) (e.g., ISAba1), conferindo, desta maneira, resistência a
cefalosporinas de terceira geração, como cefotaxima e ceftazidima (HAMIDIAN; HALL,
29
2014; JACOBY, 2009; JEON et al., 2014), e ocasionalmente aos carbapenêmicos (JEON et
al., 2014).
Em relação às cefalosporinases plasmidiais, no Brasil, sua presença tem sido reportada
em E. coli e Klebsiella pneumoniae isoladas a partir da corrente sanguínea e urina, estando
esta associada à presença do gene blaCMY-2 (CAMPANA et al., 2013; ROCHA et al., 2015b).
Além do mais, cepas produtoras de cefalosporinases plasmidiais apresentam normalmente
perfil de multirresistência, sendo propagadas na comunidade e, sobretudo no ambiente
hospitalar por transmissão horizontal ou contaminação cruzada (HANSON et al., 2008).
2.6.2.2 β-lactamase de Espectro Estendido (ESBL)
ESBLs são enzimas mediadas por plasmídeos não-induzíveis e atuam hidrolisando a
cadeia oximino-β-lactâmica do antimicrobiano, inativando penicilinas, cefalosporinas e
monobactâmicos, com exceção dos carbapenêmicos (MEYER; PICOLI, 2011).
Foram identificadas inicialmente em 1983, na Alemanha (DALMARCO; BLATT;
CÓRDOVA, 2006), no entanto, atualmente já são conhecidas mais de 150 variantes de
ESBLs, que diferem entre si em apenas alguns aminoácidos (LAGO; FUENTEFRIA;
FUENTEFRIA, 2010).
Estudos mostram o envolvimento de bactérias produtoras de ESBL em pacientes
hospitalizados, indicando a relação dessa enzima com complicações em quadros patológicos e
até na mortalidade desses indivíduos, além de se disseminar também pela comunidade, sendo
detectadas em amostras ambientais de diferentes países (OLIVEIRA, 2008; RODRÍGUEZ et
al., 2014).
A capacidade de disseminação, variedade e manutenção das ESBLs é atribuída a alguns
fatores importantes, tais como a associação com elementos transponíveis e integrons e a
captura de DNA exógeno (plasmídeos) (RODRÍGUEZ et al., 2014). A presença de genes
cromossomais codificantes de enzimas do tipo ESBL também já foi reportada previamente
(KIM et al., 2011; SONG et al., 2011), sendo essa crucial para estabilização e manutenção do
gene no microrganismo (RODRÍGUEZ et al., 2014).
Descritas inicialmente no ano de 1993 em isolado de Pseudomonas aeruginosa, e
posteriormente em Salmonella enterica serovar Typhimurium, Providencia rettgeri e
Acinetobacter, a enzima PER-1 pertence à classe A de Ambler e possui cinética similar às
demais ESBLs deste grupo, hidrolisando eficientemente penicilinas, cefotaxima, ceftibuten,
ceftazidima e aztreonam, sendo sensíveis aos carbapenêmicos e cefamicinas e à inibição por
30
ácido clavulânico (ALIKHANI et al., 2014; NEUHAUSER et al., 2003; NORDMANN et al.,
1993; POIREL et al., 2005a; SHAIKH et al., 2015).
Demais enzimas ESBL incluem as da família CTX-M, compreendendo um vasto,
complexo e heterogêneo grupo de enzimas representado por seus principais exemplares:
CTX-M-1, CTX-M-2, CTX-M-8, CTX-M-9 e CTX-M-25 (RODRÍGUEZ et al., 2014),
descritas principalmente em isolados de Salmonella enterica serovar Typhimurium e E. coli,
além de demais enterobactérias (SHAIKH et al., 2015); e as enzimas SHV (sulfhydryl reagent
variable), aparentemente derivada de K. pneumoniae e que confere resistência a penicilinas de
amplo espectro como ampicilina, tigeciclina e piperacilina (SHAIKH et al., 2015).
Devido ao fato desse mecanismo ser, na maioria das vezes, mediado por plasmídeos, os
microrganismos produtores de ESBLs possuem grande importância clínica, uma vez que essa
característica facilita a transmissão horizontal entre as diferentes bactérias. No ambiente
hospitalar, a presença de microrganismos produtores de ESBL causa impactos consideráveis
na terapia dos pacientes acometidos, podendo elevar a prescrição de carbapenêmicos devido à
minimização das opções terapêuticas (KOBS, 2016; LAGO; FUENTEFRIA; FUENTEFRIA,
2010).
2.6.2.3 Serino carbapenemases
As serino carbapenemases compreendem um grupo de enzimas capazes de hidrolisar a
maioria dos antibióticos β-lactâmicos, inclusive os carbapenêmicos, que são geralmente
estáveis à hidrólise por outras β-lactamases (BUSH, 2010).
Dentre as carbapenemases, a KPC (Klebsiella pneumoniae Carbapenemase) representa,
atualmente, grande impacto global no contexto da resistência aos antibióticos
carbapenêmicos, sendo a carbapenemase da classe A mais relevante (NICOLETTI, 2014;
SILVA; LINCOPAN, 2012).
Genes blaKPC podem ser encontrados em plasmídeos (QUEENAM; BUSH, 2007) e,
diferentemente da maioria dos genes codificantes de carbapenemases, possui rara integração
cromossômica (CHEN et al., 2015).
Diferentes variantes desta enzima (atualmente vinte e oito, de acordo com dados do
NCBI) têm sido descritas principalmente em isolados de Enterobacteriaceae, sendo as
principais a variante KPC-1, descrita mais frequentemente em isolados de K. pneumoniae,
KPC-2 em isolados de K. pneumoniae K. oxytoca, Salmonella enterica e Enterobacter sp. e
variante 3 descrita mais frequentemente em K. pneumoniae e Enterobacter cloacae. A KPC-4,
31
por sua vez, foi inicialmente descrita em 2003 no Reino Unido, em um isolado de E. cloacae
proveniente de amostra sanguínea da Escócia, sendo posteriormente descrita em K.
pneumoniae proveniente de uma amostra urinária também da Escócia (DIENSTMANN et al.,
2010; FINDLAY et al., 2016; PALEPOU et al., 2005; SILVA et al., 2015; WOODFORD et
al., 2008). No entanto, relatos da presença do gene blaKPC tem sido reportados também em
isolados clínicos de P. aeruginosa e P. putida isolados de Medellín (Colômbia) e Recife
(Brasil) (ALMEIDA et al., 2012; QUEENAM; BUSH, 2007) e, mais recentemente em
isolados de A. baumannii também provenientes de amostras clínicas no Oriente Médio e
América do Norte (AZIMI et al., 2015; ROBLEDO et al., 2010). O caráter global da
disseminação desta enzima em K. pneumoniae encontra-se demonstrado na Figura 2.
Estas enzimas são capazes de hidrolisar todas as classes de β-lactâmicos, no entanto, sua
eficiência de hidrólise é aumentada para antibióticos específicos tais como cefalotina,
nitrocefim, ampicilina e piperacilina, além de ser capaz de hidrolisar, com menos eficiência,
antibióticos como imipenem, meropenem, cefotaxima, aztreonam, cefoxitina e ceftazidima
(QUEENAM; BUSH, 2007).
Devido a este padrão de multirresistência, o tratamento de infecções ocasionadas por
microrganismos produtores de KPC representa um desafio à clínica hospitalar, além de estar
associado a elevados índices de mortalidade em hospitais (BORGES et al., 2015;
QUEENAM; BUSH, 2007; TUMBARELLO et al., 2015).
Figura 2 - Distribuição global de KPC em isolados de Klebsiella pneumoniae
Fonte: Adaptado de Lee et al. (2016).
32
Outra importante carbapenemase é a BKC-1 (Brazilian Klebsiella carbapenemase),
identificada recentemente no Brasil (NICOLETTI et al., 2015). Embora estudos sugiram uma
fraca atividade hidrolítica quando comparada com outras enzimas da classe (MARTINS et al.,
2016), a BKC-1 apresenta maior eficiência catalítica frente à cefalotina, benzilpenicilina
cefuroxima e cefotaxima, sendo também relevantes por ter localização plasmidial e
capacidade de disseminação (NICOLETTI, 2014).
2.6.2.4 Metalo-β-lactamases (MβL)
As MβL são β-lactamases pertencentes à classe B de Ambler e caracterizam-se por
necessitarem de íons divalentes (usualmente zinco) como co-fator, sendo capazes de
hidrolisar a maioria dos β-lactâmicos disponíveis atualmente, sendo os monobactâmicos a
única exceção (MENDES et al., 2006; PALZKILL, 2013).
Diferentemente das β-lactamases de classe A, as metalo-β-lactamases não são inibidas
por clavulanato, sulbactam ou tazobactam (PALZKILL, 2013). Os principais agentes
inibidores dessa enzima são os quelantes como o ácido etilenodiamino tetra-acético (EDTA)
ou por derivados de tiol (BERTONCHELI; HÖRNER, 2008).
Após o surgimento das MβL codificadas em plasmídeos de patógenos clinicamente
importantes, o mecanismo de resistência tornou-se um grave problema devido às limitações
que são geradas para o tratamento das infecções causadas por esses microrganismos, uma vez
que não existem inibidores eficazes de uso clínico contra essas enzimas (BERTONCHELI;
HÖRNER, 2008).
Dentre as principais metalo-β-lactamases, destacam-se a imipenemase (IMP), São Paulo
Metalo-β-lactamase (SPM), German imipenemase (GIM) (CLÍMACO, 2011), New Delhi
Metalo-β-lactamase (NDM-1) (NORDMANN et al., 2011), além da Verona imipenemase
(VIM) (CLÍMACO, 2011; HAWKEY; JONES, 2009), sendo esta última reportada em 37
países, entre 5 continentes, até o ano de 2009, conforme observado na Figura 3.
33
Figura 3 - Distribuição global da Verona imipenemase (VIM) até o ano de 2009
Fonte: Hawkey e Jones (2009).
A disseminação de isolados produtores de IMP-1 em hospitais do Brasil tem sido
frequentemente descrita (KOBS, 2016; TOGNIM et al., 2006). Em A. baumannii, esta MβL
foi primeiramente reportada em isolado proveniente de secreção traqueal de um paciente da
UTI do Hospital São Paulo (GALES et al., 2003a; KOBS, 2016) e, em K. pneumoniae, o
primeiro relato da prevalência clínica desta enzima ocorreu no mesmo hospital em isolado
obtido a partir de hemocultura (LINCOPAN et al., 2005).
A enzima SPM, por sua vez, foi identificada inicialmente em isolado de Pseudomonas
aeruginosa obtido em 1997 (TOLEMAN et al., 2002), tornando-se endêmica em hospitais do
país e sendo recorrentemente associada a casos de IRAS (GALES et al., 2003b; MARTINS et
al., 2007; PELLEGRINO et al., 2006), sendo identificada posteriormente em países da Europa
e Ásia (SALABI et al., 2010; SHAHCHERAGHI et al., 2011).
A NDM-1 é uma das mais recentes MβL adquiridas, sendo detectada pela primeira vez
em 2008 em isolado de K. pneumoniae na Índia, em paciente que retornava à Suécia (KOBS,
2016; YONG et al., 2009). Dois anos mais tarde, a presença do gene codificador da enzima
foi reportada em quase 40 países, tendo os primeiros casos da América Latina na Colômbia e
Guatemala no ano de 2011 (ESCOBAR et al., 2013; PASTERAN et al., 2012) e no Brasil em
2013 (KOBS, 2016; PILLONETTO et al., 2014). A Figura 4 apresenta a distribuição global
de isolados de K. pneumoniae produtores de NDM-1.
Os genes codificadores destas enzimas estão comumente associados a uma ampla
variedade de integrons que, quando dispostos em plasmídeos ou transposons, podem ser
facilmente transferidos entre diferentes microrganismos (QUEENAN; BUSH, 2007).
34
Figura 4 - Distribuição global de isolados de Klebsiella pneumoniae produtores de NDM-1
Fonte: Adaptado de Lee et al. (2016).
2.6.2.5 Oxacilinases
As oxacilinases compreendem uma classe de enzimas tipo β-lactamase pertencentes ao
grupo D (AMBLER, 1980; BERTONCHELI; HÖRNER, 2008), possuindo capacidade de
hidrolisar, mesmo que parcialmente, os carbapenêmicos, além de outros antibióticos β-
lactâmicos (BERTONCHELI; HÖRNER, 2008).
Consideradas uma emergência clínica e epidemiológica, as oxacilinases têm sido
identificadas sobretudo em isolados de Acinetobacter spp. em ambientes hospitalares, estando
relacionadas a isolados causadores de IRAS (MEDEIROS; LINCOPAN, 2013).
As oxacilinases são classificadas em nove grupos de acordo com as sequências de
aminoácidos, sendo cinco destes identificados em Acinetobacter spp. (BROWN; AMYES,
2005). O primeiro grupo é composto pelos exemplares enzimáticos OXA-23, -27 e -49. No
Brasil, a enzima OXA-23-like tem conferido fenótipos de multirresistência, inclusive aos
carbapenêmicos, e surtos de infecção (DALLA-COSTA et al., 2003; MARTINS et al., 2009;
MOSTACHIO et al., 2009).
O segundo grupo é composto por cinco variantes enzimáticas e compreende os
exemplares OXA-24, -25, -26, -40 e -72, tendo a OXA-72 prevalência significativa no estado
de Pernambuco (ANTÔNIO, 2010; MEDEIROS; LINCOPAN, 2013).
Compreendendo um total de 13 enzimas (OXA-51, -64, -65, -66, -68, -69, -70, -71, -78,
-79, -80, -82 e -107), o grupo 3 constitui o maior grupo de oxacilinases (ANTÔNIO, 2010),
35
sendo a OXA-51, em particular, produzida intrinsecamente pela espécie A. baumannii
(MARTÍNEZ; MATTAR, 2012; MU et al., 2016).
O quarto e quinto grupos de oxacilinases são compostos pelas OXA-58 e OXA-143
respectivamente, sendo o primeiro relato de OXA-58 descrito na França, em um isolado de
Acinetobacter baumannii (POIREL et al., 2005b).
Amplamente distribuídas no Brasil no cenário clínico e epidemiológico atual (Figura 5),
as principais oxacilinases relacionadas à multirresistência antimicrobiana em Acinetobacter
spp. são a OXA-23, -58, -72 e -143 (MEDEIROS; LINCOPAN, 2013). A OXA-51 também se
encontra relacionada ao aumento da resistência antimicrobiana, sobretudo quando associada a
elementos de inserção (MARTÍNEZ; MATTAR, 2012; MU et al., 2016).
Figura 5 - Distribuição das principais oxacilinases no território brasileiro
Fonte: Adaptado de Medeiros e Lincopan (2013).
2.7 Elementos de inserção
Os elementos de inserção (do inglês, insertion sequences - IS) são sequências contendo
repetições de bases de DNA, com capacidade de se mover entre diferentes regiões de um
cromossomo ou ainda entre cromossomos diferentes (MARTÍNEZ; MATTAR, 2012).
Quando dispostos dentro de uma determinada sequência gênica, estes elementos de
inserção interrompem a sequência codificadora e inibem a sua expressão. Entretanto, quando
posicionados upstream (à montante) a um determinado gene, estas sequências podem atuar
como fortes promotores, facilitando assim sua expressão (LEWIS; MACRINA, 1998;
MARTÍNEZ; MATTAR, 2012).
36
Em A. baumannii, o principal elemento de inserção é o ISAba1, que pertence à família
IS4 e é composto por regiões repetidas e invertidas de 16pb (MARTÍNEZ; MATTAR, 2012).
Vários estudos (MARTÍNEZ; MATTAR, 2012; REZAEE; ZARRINI; REZAEE, 2016;
TEIXEIRA et al., 2013) têm associado a presença do ISAba1 com o aumento da resistência
antimicrobiana, sobretudo em relação ao aumento da produção de oxacilinases,
carbapenemases e cefalosporinases, tendo sido descrito em regiões upstream de genes como
blaOXA-23, -51, -58 e blaADC/AmpC.
2.8 Proteínas de membrana externa e a resistência aos carbapenêmicos
Além dos mecanismos enzimáticos descritos anteriormente, alterações na
permeabilidade de proteínas de membrana externa específicas constituem um importante
mecanismo de resistência aos antimicrobianos (FONSECA et al., 2013).
Em Acinetobacter baumannii, a porina denominada carbapenem-associated outer
membrane protein (CarO), atua como um canal seletivo para a captação de aminoácidos
presentes no meio externo e do imipenem. Isto se dá devido à sua conformação estrutural e à
presença de um sítio de ligação a este antimicrobiano (FONSECA et al., 2013; NOVOVIC et
al., 2015). A resistência mediada por CarO é um mecanismo intrínseco e tem sido descrita em
diversos isolados de A. baumanni, ocorrendo principalmente devido: a) à disrupção do gene
carO, causada pela inserção ou substituições de nucleotídeos que resultem na alteração do
quadro de leitura e/ou formação de códons de parada prematuros, resultando na ausência de
formação desses canais; b) a alterações de aminoácidos que resultem na diminuição ou perda
da afinidade da porina com o antibiótico; ou c) à diminuição da expressão do gene codificador
de CarO (FONSECA et al., 2013; MUSSI et al., 2011; NOVOVIC et al., 2015).
Em P. aeruginosa, a proteína de membrana externa OprD constitui o principal canal de
entrada para os carbapenêmicos, mas não para outros β-lactâmicos. A presença de mutações
nas sequências nucleotídicas codificadoras de OprD tem sido reportada como um importante
mecanismo de resistência aos carbapenêmicos nos isolados desta espécie, sendo responsável
pela elevação da MIC para imipenem, meropenem e doripenem (SANTOS; NOGUEIRA;
MENDONÇA, 2015).
Em Enterobacteriaceae, as principais proteínas de membrana externa relacionadas à
resistência aos β-lactâmicos incluem a OmpK35 e OmpK36. Dimiuições na expressão e/ou
mutações presentes nestas proteínas têm sido associadas à elevação das concentrações
inibitórias mínimas de cefalosporinas - como cefazolina, cefalotina e cefoxitina - e também
37
aos carbapenêmicos em isolados de K. pneumoniae (NETIKUL; KIRATISIN, 2015; TSAI et
al., 2011).
2.9 Mecanismos de resistência aos aminoglicosídeos
Os aminoglicosídeos compreendem uma família de compostos caracterizados por
possuírem um núcleo de aminociclitol ligado a moléculas de monossacarídeos através de
ligação glicosídica, sendo os antimicrobianos utilizados para o tratamento de infecções
causadas por bacilos Gram negativos aeróbicos e Gram positivos (POLOTTO, 2014;
RAMIREZ; TOLMASKY, 2010). Seu mecanismo de ação constitui na inibição ou
interrupção da síntese proteica bacteriana através de sua ligação com a subunidade 30S do
ribossomo bacteriano, reduzindo assim a fidelidade de leitura do RNA mensageiro (mRNA)
no processo de tradução (RAMIREZ; TOLMASKY, 2010).
A resistência a estes antimicrobianos pode ocorrer por diversos mecanismos, tais como
modificação do sítio-alvo, metilação do 16S rRNA, redução da permeabilidade de proteínas
de membrana externas, expressão de bombas de efluxo ou pela inativação do antimicrobiano
por ação de enzimas modificadoras de aminoglicosídeos (amynoglycoside modifying enzymes,
AME), sendo este último o mecanismo mais prevalente no cenário clínico. As AMEs podem
ser do tipo acetiltransferase (AAC), nucleotidiltransferase (ANT) ou fosfotransferases (APH)
e atuam modificando grupamentos hidroxila (-OH) ou amina (-NH2) do núcleo de
aminociclitol ou do monossacarídeo associado (POLOTTO, 2014; RAMIREZ; TOLMASKY,
2010).
2.10 Mecanismos de resistência às fluoroquinolonas
As fluoroquinolonas são antimicrobianos de amplo espectro derivados da quinolona,
diferindo deste último grupo pela substituição do oitavo átomo de carbono da molécula por
um átomo de nitrogênio, e pela adição de um átomo de flúor na sexta posição, conferindo
espectro mais amplo de atividade antimicrobiana frente a bactérias Gram negativas e Gram
positivas (REDGRAVE et al., 2014).
Estes antimicrobianos são potentes inibidores da topoisomerase do tipo II (DNA girase)
e da topoisomerase do tipo IV. O direcionamento de cada topoisomerase como sítio-alvo para
ligação do antibiótico varia de acordo com a espécie bacteriana e com o antimicrobiano em
particular, no entanto, de forma geral, a topoisomerase do tipo II é o principal alvo nos
38
microrganismos Gram negativos, enquanto que a topoisomerase do tipo IV é o principal alvo
das fluoroquinolonas nos microrganismos Gram positivos (ARDEBILI et al., 2015;
HAMOUDA; AYMES, 2004; REDGRAVE et al., 2014).
A resistência às fluoroquinolonas pode decorrer por diferentes mecanismos, tais como: a
expressão de genes qnr, que podem estar presentes em elementos genéticos móveis e que
codificam uma proteína Qnr (quinolone resistance) que se liga à topoisomerase e impede a
ligação da molécula do antimicrobiano a seu sítio-alvo; e à expressão de sistemas de efluxo,
que removem ativamente as moléculas de antimicrobiano do interior celular. O principal
mecanismo de resistência a esta classe de antimicrobianos, no entanto, se dá devido à
alteração do sítio de ligação do antibiótico, causada sobretudo devido à presença de mutações
na região QRDR (quinolone resistance determining region), em um ou mais genes que
codificam tais topoisomerases, sendo eles: gyrA, gyrB, parC e parE. Em E. coli, mutações em
gyrA e parC são os principais mecanismos relacionados à resistência aos antimicrobianos da
classe, sendo também observado em isolados de A. baumannii (ARDEBILI et al., 2015).
2.11 Mecanismos de resistência às polimixinas
As polimixinas, descobertas em 1949 como produto de Bacillus polymyxa e B.
collistinum, são antimicrobianos catiônicos pertencentes à classe dos lipopeptídeos e atuam
nas membranas celulares. Estes antimicrobianos interagem com fosfolipídeos e
lipopolissacarídeos (LPS) e promovem o deslocamento de íons estabilizadores da membrana
(como Ca2+ e Mg2+), resultando na diminuição da integridade da parede celular bacteriana e
extravasamento do conteúdo celular, conduzindo as bactérias à morte (GIRARDELLO;
GALLES, 2012; MENDES; BURDMANN, 2009).
Na década de 60, as polimixinas B e E (colistina) consistiam nas opções terapêuticas
utilizadas para o tratamento de infecções graves, porém, devido ao seu caráter nefrotóxico e
neurotóxico, foram substituídas por cefalosporinas e aminoglicosídeos (FALAGAS;
KASIAKOU, 2006; GIRARDELLO; GALLES, 2012). No entanto, diante do cenário clínico
atual, no qual o isolamento de microrganismos multirresistentes aos principais
antimicrobianos tem se tornado cada vez mais frequente, as polimixinas estão sendo
novamente empregadas como opção terapêutica (CASSIR; ROLAIN; BROUQUI, 2014;
GIRARDELLO; GALLES, 2012).
Após a reintrodução das polimixinas no cenário clínico, foi observado um significativo
aumento no número de relatos de microrganismos resistentes a este antimicrobiano, incluindo
39
E. coli, K. pneumoniae, P. aeruginosa e A. baumannii (OLAITAN; MORAND; ROLAIN,
2014). Os mecanismos de resistência às polimixinas não são completamente elucidados. Os
principais mecanismos descritos são derivados de processos adaptativos e mutacionais,
entretanto, um mecanismo plasmidial de resistência a este lipopeptídeo (MCR-1) foi descrito
em isolados da China (BARON et al., 2016; LIU et al., 2015) e mais recentemente no Brasil,
em isolado proveniente de úlcera do calcâneo de um paciente diabético em Natal-RN
(FERNANDES et al., 2016), e em isolado de E. coli proveniente de infecção da corrente
sanguínea de paciente internada em um hospital da cidade de Recife-PE (ROCHA et. al.,
2017). O MCR-1 consiste em uma fosfoetanolamina transferase que, através da adição de
fosfoetanolamina no lipídio A do LPS da parede celular bacteriana, provoca modificações no
lipopolissacarídeo, diminuindo a afinidade do mesmo pelo antimicrobiano e acarretando na
resistência a este lipopeptídeo (BARON et al., 2016; LIU et al., 2015).
40
3 OBJETIVOS
3.1 Objetivo geral
Avaliar a presença de bactérias e identificar os mecanismos de resistência
antimicrobiana de isolados Gram negativos oriundos de superfícies de ambiente hospitalar e
sua relação com isolados associados a infecções à assistência à saúde em Unidades de Terapia
Intensiva de hospital localizado em Caruaru-PE.
3.2 Objetivos específicos
a) Isolar e identificar as espécies bacterianas presentes nas superfícies hospitalares e
hemoculturas;
b) Determinar o perfil de sensibilidade dos isolados Gram negativos mais
frequentemente isolados aos principais antimicrobianos de importância clínica;
c) Pesquisar a produção de carbapenemase pelos microrganismos Gram negativos
mais frequentemente isolados;
d) Identificar os principais genes e mecanismos de resistência aos antimicrobianos
nos isolados Gram negativos;
e) Determinar a relação genética entre os isolados Gram negativos de mesma espécie
bacteriana mais frequentemente isoladas.
41
4 METODOLOGIA
4.1 Desenho do estudo
O presente trabalho consiste de um estudo transversal e descritivo desenvolvido com o
intuito de determinar o papel das superfícies inanimadas do ambiente hospitalar como
reservatório de agentes etiológicos bacterianos associados às IRAS em hospital público
localizado na cidade de Caruaru-PE, no período entre maio e agosto de 2015.
O hospital de estudo conta com 225 leitos para internação, 19 destes compondo a UTI
adulto. A unidade atende à população da macrorregional de saúde de Caruaru, que abrange 87
municípios das microrregiões de saúde de Caruaru, Garanhuns, Arcoverde, Afogados da
Ingazeira e Serra Talhada, sendo referência em traumatologia, traumato-ortopedia, cirurgia
geral e buco-maxilo-facial de alta complexidade (dados fornecidos pela Secretaria Estadual de
Saúde de Pernambuco).
Foram realizadas coletas, cultivo, isolamento, identificação e caracterização de isolados
bacterianos oriundos das superfícies dos leitos no instante em que os mesmos se encontravam
ocupados por pacientes com a indicação de hemoculturas positivas, de acordo com a rotina de
diagnóstico realizada pelo Laboratório de Microbiologia Clínica do hospital estudado em
sistema automatizado BD BACTEC™ Instrumented Blood Culture Systems (Becton,
Dickinson and Company).
As superfícies inanimadas corresponderam às áreas previamente definidas como aquelas
de constante manipulação pelos profissionais de assistência de saúde e esporádicos familiares
e visitantes dos pacientes hospitalizados. Assim, foram selecionadas superfícies da a) grade
lateral externa direita da cama; b) grade lateral externa esquerda da cama; c) botões
reguladores de altura das camas; d) botões reguladores da bomba de infusão de medicamentos
e e) prateleira de apoio localizada na cabeceira dos leitos.
A associação entre a ocorrência de microrganismos bacterianos isolados das superfícies
estudadas e os agentes etiológicos associados à infecção da corrente sanguínea dos pacientes
assistidos em cada leito foi avaliada pela ocorrência da mesma espécie e pela relação genética
entre os mesmos.
42
4.2 Cultura, isolamento e identificação dos espécimes bacterianos
As coletas de microrganismos oriundos das superfícies avaliadas foram realizadas com
auxílio de swabs estéreis umedecidos em meio de cultura caldo triptona de soja (TSB, Oxoid)
estéril. Os swabs foram friccionados por toda a área correspondente à superfície avaliada
aplicando-se maior pressão possível e girando o mesmo em torno do seu próprio eixo. Os
swabs foram então imediatamente mergulhados em tubo de cultura contendo 5 mL de TSB e
incubados em estufa bacteriológica a uma temperatura de 35 ± 2° C por 18 horas. Para
isolamento do crescimento bacteriano, as culturas em caldo foram posteriormente semeadas
em ágar Müeller-Hinton (Difco) suplementado com 0,5% (v/v) de sangue de carneiro
desfibrilado e em ágar MacConkey (Oxoid), para isolamento seletivo de espécies bacterianas
Gram negativas. As placas foram incubadas em estufa bacteriológica a 35 ± 2° C durante 18 a
24 horas. As culturas em ágar foram visualmente inspecionadas para identificação das
diferentes morfologias das colônias crescidas na superfície do mesmo. Pelo menos uma
colônia de cada morfologia foi selecionada para posterior identificação e caracterização.
Os isolados bacterianos provenientes dos casos de ICSs que possivelmente acometiam
os pacientes internados no instante da coleta da superfície foram recuperados da rotina do
Laboratório de Microbiologia Clínica do hospital estudado. As hemoculturas foram feitas de
acordo com prescrição médica e o procedimento de coleta realizado de acordo com a
metodologia adotada pela rotina do hospital de estudo para o diagnóstico de ICS.
Resumidamente, um volume de 10 mL de sangue venoso do paciente com suspeita de ICS foi
coletado pelos profissionais de saúde da unidade por punção, inoculado nos frascos BD
BACTEC™ e incubados no BD BACTEC™ Instrumented Blood Culture Systems, de acordo
com as recomendações do fabricante (Becton, Dickinson and Company) até a indicação de
crescimento bacteriano ou por no máximo sete dias. As hemoculturas indicadas como
positivas pelo BD BACTEC™ Instrumented Blood Culture Systems tiveram uma alíquota de
aproximadamente 50 µL assepticamente coletada do interior do frasco de hemocultura e
semeada em ágar-sangue para isolamento e identificação das espécies associadas às ICSs.
Adicionalmente, para fins de comparação e avaliação da persistência de clones
bacterianos na UTI estudada, foram também incluídos neste estudo dez isolados clínicos de
microrganismos Gram negativos oriundos de hemoculturas de pacientes assistidos durante o
ano de 2014 naquela mesma UTI, sendo nove isolados de K. pneumoniae e um isolado de A.
baumannii, espécies mais frequentemente isoladas no presente estudo.
43
Os isolados bacterianos foram submetidos à identificação em gênero e/ou espécie pela
técnica de espectrometria de massas Matrix-Assisted Laser Desorption Ionization – Time of
Flight (MALDI-TOF) e pelo sistema MALDI Biotyper system versão 2.0 (Bruker Daltonics)
(CARBONNELLE et al., 2011; CLAYDON et al., 1996). Foi utilizado o método de colônia
direta, em duplicata (ALATOOM et al., 2011), onde duas a três colônias de cada isolado
foram transferidas de culturas em ágar Brain Heart Infusion (BHI, Himedia) com o auxílio de
uma ponteira de micropipeta e aplicadas de forma a compor uma fina camada de células nos
respectivos spots da placa 384 polished steel (Bruker Daltonics). Sobre as camadas de células
bacterianas foi aplicado 1 µL da MALDI matrix, que consistia de uma solução saturada de
ácido α-ciano-4- hidroxicinâmico (10 mg/mL), acetonitrila 50% (v/v) e ácido trifluoroacético
0,3% (v/v) e deixado à temperatura ambiente por 30 minutos para completa secagem da
matriz até o instante da obtenção dos espectros proteicos. Como calibrador espectral, foi
utilizado o Protein Calibration Standard I (Bruker Daltonics), aplicado nas mesmas
condições dos isolados bacterianos (ALATOOM et al., 2011). Os espectros foram obtidos
manualmente para cada spot no Bruker Daltonics Autoflex III Smartbeam (Bruker Daltonics)
utilizando os parâmetros originais previamente definidos como MBT_FC.par flexControl pelo
fabricante. Os espectros de massa foram gerados a partir dos dados provenientes de vários
disparos de laser (300-shots) em diferentes posições de cada spot contendo as amostras.
Os espectros de massa foram obtidos individualmente para cada isolado e comparados
com espectros previamente depositados no banco de dados do software Biotyper MALDI 2.0
(Bruker Daltonics) para a identificação em gênero e/ou espécie bacteriana. Os parâmetros
utilizados para a avaliação dos resultados seguiram conforme instrução do fabricante. As
identificações com score ≥ 2,300 foram considerados confiáveis para identificação do gênero
e espécie bacteriana (+++), scores entre 2,000 e 2,299 foram considerados confiáveis para o
gênero bacteriano e provável para espécie bacteriana (++), scores entre 1,700 e 1,999 foram
considerados como identificação confiável apenas para o gênero bacteriano (+) e, por fim,
scores ≤ 1,699 foram considerados não-confiáveis (-) para identificação bacteriana.
Os isolados bacterianos cuja identificação não foi possível pelo Biotyper MALDI 2.0
(Bruker Daltonics) (score < 2,300) foram submetidos à identificação em espécie bacteriana
pela análise da sequência de nucleotídeos do gene codificador do rRNA 16S, pela
amplificação por PCR da região do rDNA 16S de Eubacteria com a utilização
oligonucleotídeos iniciadores universais 8F (5'-AGAGTTTGATCATGGCTCAG-3') e 1492R
(5'-GGTTACCTTGTTACGACTT-3') (SKWOR et al., 2014). sob condições de
termociclagem com uma etapa de desnaturação inicial a 95 °C por 5 minutos, seguida por 30
44
ciclos de termociclagem com desnaturação a 92 °C por 1 minuto, anelamento a 55 °C por 45
segundos e extensão a 72 °C por 1 minuto (cada ciclo), finalizando em seguida por uma
extensão final a 72 °C por 6 minutos, e subsequente sequenciamento do produto amplificado.
4.3 Extração de DNA genômico, amplificação e sequenciamento
A extração do DNA genômico foi realizada com a utilização do DNeasy Blood & Tissue
Kit (Quiagen), seguindo as recomendações do fabricante, a partir de uma alíquota de 1500 µL
de cultura crescida em caldo Luria-Bertani (LB) (Himedia) a 35 ± 2° C por 18 a 24 horas.
Para isto, uma alíquota de cada amostra de interesse foi previamente semeada em ágar BHI
(Himedia), o qual foi incubado em estufa a 35 ± 2 °C durante 18 a 24 horas. O DNA
genômico extraído foi quantificado em NanoDrop 2000c (Thermo Fisher Scientific Inc.) com
a verificação dos parâmetros utilizados para estimar a pureza e rendimento da extração
(A260/280).
As reações de amplificação de DNA foram realizadas por PCR contendo 40-100 ng do
DNA-alvo, 20 pmol de cada oligonucleotídeo, 200 mM de cada dNTP, Tris-HCl 50mM (pH
9,0), NaCl 50 mM, MgCl2 5 mM e 1U de Taq DNA polimerase (Promega). As reações de
amplificação foram submetidas à termociclagem em GeneAmp PCR System 9700 (Applied
Biosystems) com pequenas modificações de acordo com a temperatura de anelamento para
cada par de oligonucleotídeo iniciador utilizado neste estudo e de acordo com o tamanho
esperado do amplicon (Apêndice A). Os produtos de PCR foram submetidos à eletroforese em
gel de agarose 1% (m/v) diluída em tampão 0,5x TBE (Tris-base 89 mM; ácido bórico 89 mM
e EDTA 2 mM pH 8,0) e contendo 0,1 µL/mL SYBR Safe DNA Gel Stain (Invitrogen), a 120
Volts e 150 mA durante 45 minutos, sendo posteriormente visualizados e fotografados sob luz
ultravioleta em aparelho de fotodocumentação L-Pix EX (Loccus Biotecnologia).
Para sequenciamento de DNA pelo método de Sanger, os produtos de PCR foram
previamente purificados com o kit ExoSAP-IT PCR Product Cleanup (Affymetrix) e
quantificados em NanoDrop 2000c (Thermo Fisher Scientific Inc.). De acordo com o
tamanho do fragmento amplificado, foram utilizados 3 a 40 ng do DNA oriundo dos produtos
de PCR purificados em reações de sequenciamento com BigDye Terminator Sequencing Kit
(Thermo Fisher Scientific), conforme recomendação do fabricante. As reações, realizadas
individualmente e contendo apenas um dos oligonucleotídeos forward ou reverse para cada
gene alvo, foram submetidas à termociclagem com etapa de desnaturação inicial de 2 minutos
a 94 °C, seguida por 40 ciclos de 94 °C por 10 segundos, 55 °C por 10 segundos e 60 °C por 4
45
minutos cada, realizada em termociclador GeneAmp PCR System 9700 (Applied Biosystems)
no Núcleo de Plataformas Tecnológicas do Centro de Pesquisas Aggeu Magalhães
(CPqAM/Fiocruz-PE).
Os produtos de PCR foram precipitados e ressuspendidos em 10 µL de Hi-Di
Formamida (Applied Biosystems) e posteriormente aplicados no sequenciador 3500 xL
Genetic Analyzer (Applied Biosystems). Os cromatogramas foram analisados com o software
Chromas Lite 2.1.1 (Technelysium) e os contigs montados com o software BioEdit Sequence
Alignment Editor (Tom Hall), sendo posteriormente comparados com as sequências gênicas
de DNA disponíveis no GenBank (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/) com a ferramenta
Basic Local Alignment Search Tool (BLAST).
4.4 Teste de sensibilidade aos antimicrobianos
O teste de sensibilidade aos antimicrobianos (TSA) foi realizado pela técnica de
microdiluição em caldo, de acordo com a padronização e recomendações do Clinical
Laboratory Standard Institute (CLSI), documento M07-A10 (CLINICAL LABORATORY
STANDARD INSTITUTE, 2015).
Resumidamente, os isolados bacterianos pertencentes às espécies Gram negativas foram
testados frente aos seguintes antimicrobianos: ceftriaxona (CRO), ceftazidima (CAZ),
cefepime (FEP), imipenem (IPM), meropenem (MEM), ciprofloxacina (CIP), levofloxacina
(LVX), amicacina (AMK), gentamicina (GEN) e polimixina B (PMB) (Sigma Aldrich). A
sensbilidade à combinação de ampicilina/sulbactam (AMP/SUB) foi testada exclusivamente
para os isolados de A. baumannii. As concentrações dos antibióticos utilizadas no teste e o
solvente/diluente utilizado para as respectivas diluições estão apresentados na Tabela 1.
Como controle de qualidade, foram utilizadas as cepas da American Type Culture
Colection (ATCC®) de E. coli ATCC® 25922 e Pseudomonas aeruginosa ATCC® 27853.
As soluções estoque de cada antimicrobiano foram preparadas, esterilizadas por
filtração em filtros para seringa Millex® de poros de 0.22 µM (Merck Millipore) e
armazenadas a -80 °C.
Placas de microdiluição de 96 poços para o teste de sensbilidade aos antimicrobianos
foram confeccionadas preenchendo cada coluna com um volume de 50 µL de CA-MHB
(Cation-adjusted Müeller-Hinton broth, Fluka – Sigma-Aldrich) contendo uma diluição
seriada de cada antimicrobiano a uma concentração correspondente ao dobro das
46
concentrações desejadas. As placas foram armazenadas em freezer -80 °C até a realização dos
testes.
O inóculo bacteriano foi preparado pela técnica de suspensão direta de colônias
crescidas em placas contendo ágar Müeller-Hinton (Himedia) em 1 mL de CA-MHB estéril
até uma densidade OD625nn de 0,08 – 0,13 UA, determinada em espectrofotômetro UV 1101
Biotech Photometer (WPA), correspondente a 0,5 da escala de McFarland ou 1-5 × 108
UFC/mL. Essa suspensão foi subsequentemente diluída 1:1000 em CA-MHB em volume
suficiente para inoculação dos poços da placa de microdiluição. Um volume de 50 µL desta
última diluição foi inoculado simultaneamente com o auxílio de pipetador automático
multicanal em cada poço da placa previamente confeccionada, de modo que, ao final dessa
etapa, cada poço contivesse um volume final de 100 µL, contendo a concentração final
desejada para cada antimicrobiano e uma densidade celular bacteriana de cerca de 1-5 × 105
UFC/mL. Como controle positivo do crescimento bacteriano foram inoculados poços
contendo CA-MHB livre de antimicrobianos e, como controle negativo de crescimento foram
reservados poços contendo apenas CA-MHB, sem inoculação.
As placas foram confeccionadas e inoculadas seguindo recomendações de boas práticas
de laboratório em capela de fluxo laminar. Após inoculação, as mesmas foram incubadas por
18-24 horas, a 35 ± 2° C e após esse período, inspecionadas visualmente para a determinação
da concentração inibitória mínima (MIC), que é considerada a menor concentração de cada
antimcrobiano capaz de inibir o crescimento bacteriano. Os resuldados da MIC foram
interpretados de acordo com o documento M100S (CLINICAL LABORATORY
STANDARD INSTITUTE, 2016) para classificação dos isolados como sensíveis,
intermediários ou resistentes a cada droga testada. Os critérios de interpretação do European
Committee on Antimicrobial Susceptibility Testing (EUCAST) (EUROPEAN COMMITTEE
ON ANTIMICROBIAL SUSCEPTIBILITY TESTING, 2016) foram utilizados para
classificação dos isolados de Enterobacteriaceae quanto à sensibilidade à polimixina B.
Para controle da qualidade do inóculo, um volume de 10 µL recuperados do poço
correspondente ao controle positivo do crescimento bacteriano foi diluído 1:1000 (10-3)
imediatamente após sua inoculação e, dessa diluição, 100 µL foram semeados em ágar BHI
(Himedia) e espalhados por toda a sua superfície com o auxílio de alças de Drigalski, sendo
esta etapa realizada em triplicata. As placas foram incubadas em estufa bacteriológica por 20
horas a 35 ± 2° C. O número de colônias foi determinado e utilizado para o cálculo da
concentração de células bacterianas presentes no inóculo.
47
Os testes considerados válidos foram aqueles nos quais: a) os controles negativos de
crescimento não apresentaram turvação; b) as concentrações inibitórias mínimas da cepa de E.
coli ATCC® 25922 e Pseudomonas aeruginosa ATCC® 27853 utilizada como controle de
qualidade para cada antibiótico corresponderam aos critérios estabelecidos pelo CLSI; c) o
inóculo apresentou uma densidade de 1-5 x 105 UFC/mL estimada como descrito para
controle de qualidade do inóculo bacteriano.
48
Tabela 1 - Concentrações avaliadas no teste fenotípico de resistência aos antimicrobianos
Antimicrobiano Classe Concentrações
avaliadas (µg/mL) Solvente/Diluente
Ampicilina/sulbactam Penicilina/inibidor de β-lactamase 1 - 128/0,5 – 64 PBS pH 8,0; 0,1 M/Água ultrapura
Ceftriaxona Cefalosporina 3ª geração 1 – 128 Água ultrapura
Ceftazidima Cefalosporina 3ª geração 1 – 128 Na2CO3 [anidro] (10% de CAZ)/Água ultrapura
Cefepime Cefalosporina 4ª geração 1 – 128 PBS pH 6; 0,1 M
Imipenem Carbapenem 0,5 – 64 PBS pH 7,2; 0,01 M
Meropenem Carbapenem 0,5 – 64 Água ultrapura
Ciprofloxacina Fluoroquinolona 2ª geração 0,25 – 32 Água ultrapura
Levofloxacina Fluoroquinolona 3ª geração 0,25 – 32 Água ultrapura
Amicacina Aminoglicosídeo 2 – 256 Água ultrapura
Gentamicina Aminoglicosídeo 0,5 – 64 Água ultrapura
Polimixina B Lipopeptídeo 0,25 – 32 Água ultrapura Fonte: Adaptado do Clinical Laboratory Standard Institute (2016). Legenda: PBS - Tampão fosfato; Na2CO3 - Carbonato de sódio.
49
4.5 Teste in vitro de hidrólise enzimática dos carbapenêmicos
A pesquisa da produção de enzimas β-lactamases do tipo carbapenemase pelos isolados
pertencentes à família Enterobacteriaceae e pelos isolados de A. baumannii foi realizada pelo
método do CarbaNP Enterobacteriaceae (DORTET; POIREL; NORDMANN, 2012) e
CarbAcineto (DORTET et al., 2014), respectivamente. Esse método baseia-se na detecção da
hidrólise enzimática do anel β-lactâmico de antimicrobiano da classe dos carbapenêmicos em
reações cromogênicas utilizando vermelho de fenol como indicador de pH. Quando
hidrolisado pelas carbapenemases, os carbapenêmicos são convertidos em sua forma
carboxílica, resultando na diminuição do pH e na consequente variação de coloração da
reação indicada pelo vermelho de fenol (DORTET; POIREL; NORDMANN, 2012).
O CarbaNP Enterobacteriaceae foi realizado a partir de aproximadamente 10 colônias
do isolado de interesse cultivados em ágar BHI (Difco). Essas colônias bacterianas foram
diluídas em 100 µL da solução de lise (Tris-HCl 20 mM pH 7,52) e homogeneizadas
vigorosamente por 30 segundos. Um volume de 100 µL do lisado bacteriano foi diretamente
testado para sua capacidade em hidrolisar o imipenem junto a 100 µL de solução de teste
contendo vermelho de fenol 0,5% (m/v), 0,1 mM ZnSO4 e 3 mg/mL de imipenem (pH 7,8). O
teste foi considerado positivo para a produção de carbapenemase quando a coloração variou
de sua cor original vermelha para coloração amarelada ou alaranjada. Como controle, o
mesmo volume do lisado celular bacteriano foi examinado contra a solução de teste na
ausência do imipenem, para averiguação da interferência do lisado na variação do pH da
solução.
Para aquelas reações positivas para a produção de carbapenemase, o teste de inibição de
sua atividade por EDTA 0,006 M, na ausência de ZnSO4, foi realizado para indicação da
produção de carbapenemases do tipo metalo-β-lactamase, carbapenemases inibidas por
quelante de íons metálicos como o Zn2+.
Como controles positivos para teste foram utilizadas as cepas K. pneumoniae Kp13
(RAMOS et al., 2014) e a cepa K. pneumoniae FL_C262 (CAMPANA et al., 2017),
produtoras de carbapenemase do tipo KPC-2 e da metalo-β-lactamase NDM-1,
respectivamente.
Os isolados de A. baumannii foram testados para a produção de carbapenemases pelo
teste CarbAcineto. As colônias de A. baumannii foram lisadas em solução contendo NaCl 5 M
(pH 7,5), e 100 µL do lisado foi testado junto a solução contendo vermelho de fenol 0,5%
(m/v); 0,1 mM ZnSO4 e 3 mg/mL de imipenem (pH 7,5) (BAKOUR et al., 2015; DORTET et
50
al., 2014). Como controle positivo, foi utilizada a cepa de A. baumannii L023 (Banco de
Microrganismos do Departamento de Microbiologia do CPqAM), sabidamente produtora de
carbapenemase do tipo oxacilinase; e a cepa de K. pneumoniae FL_C262, produtora de NDM-
1 (CAMPANA et al., 2017). O teste de inibição da atividade de carbapenemase foi realizada
em reações acrescidas de EDTA 0,006 e na ausência de ZnSO4, nas mesmas condições
descritas para o teste de detecção pelo CarbAcineto.
As reações foram incubadas a 37 °C por duas horas e a leitura foi realizada por inspeção
visual. Como controle negativo de reação para o cada um dos testes CarbaNP
Enterobacteriaceae e CarbAcineto, foi utilizada a cepa de Escherichia coli ATCC® 25922,
desprovida de carbapenemases.
4.6 Pesquisa de genes codificadores de β-lactamases
A pesquisa de genes codificadores para β-lactamases entre os isolados analisados foi
realizada por amplificação e sequenciamento dos genes que codificam para OXA-
carbapenemsases (blaOXA-23-like, blaOXA-24-like, blaOXA-51-like, blaOXA-58-like, blaOXA-143-like); β-
lactamase de espectro extendido (blaPER-1); carbapenemases da classe A (blaKPC e blaBKC) e
metalo-β-lactamases (blaIMP-1, blaNDM-1, blaVIM-1 e blaSPM-1) com os oligonucleotídeos
específicos listados no Quadro 2, de acordo com metodologia previamente descrita (item 4.3).
A presença do elemento genético de inserção ISAba1 foi pesquisada entre os isolados de
A. baumannii e sua localização à montante (upstream) aos genes blaOXA-23, blaOXA -24, blaOXA-
51 e blaOXA-143 foi avaliada por PCR com o oligonucleotídeo iniciador ISAba1-F (5´- 3´) e
oligonucleotídeo reverse (3´- 5´) que anela à sequencia de cada gene blaOXA-like (Quadro 2)
(RUIZ et al., 2007).
A presença do gene blaBKC, que codifica a β-lactamase Brazilian Klebsiella
carbapenemase, foi pesquisada entre os isolados de K. pneumoniae. O gene mcr-1,
codificador da fosfoetanolamina transferase relacionada à resistência às polimixinas, foi
pesquisado nos isolados de K. pneumoniae com sensibilidade reduzida à polimixina B.
51
Quadro 2 - Oligonucleotídeos utilizados para a amplificação de genes determinantes de resistência bacteriana e ISAba1
Mecanismos Oligonucleotídeo Sequência nucleotídica (5' to 3') Gene alvo Tamanho do produto Referência
OXA-Carbapenemases
OXA-23-like-F GATCGGATTGGAGAACCAGA blaOXA-23-like 501 pb WOODFORD et al., 2006 OXA-23-like-R ATTTCTGACCGCATTTCCAT OXA-24-like-F GGTTAGTTGGCCCCCTTAAA blaOXA-24-like 246 pb WOODFORD et al., 2006 OXA-24-like-R AGTTGAGCGAAAAGGGGATT OXA-51-like-F TAATGCTTTGATCGGCCTTG blaOXA-51-like 353 pb WOODFORD et al., 2006 OXA-51-like-R TGGATTGCACTTCATCTTGG OXA-58-like-F AAGTATTGGGGCTTGTGCTG blaOXA-58-like 599 pb AMUDHAN et al., 2011 OXA-58-like-R CCCCTCTGCGCTCTACATAC
OXA-143-like-F TGGCACTTTCAGCAGTTCCT blaOXA-143-like 149 pb HIGGINGS et al., 2010 OXA-143-like-R TAATCTTGAGGGGGCCAAG
Metalo-β-lactamases (MβL)
VIM-F GTTTGGTCGCATATCGCAAC blaVIM 382 pb MENDES et al., 2007 VIM-R AATGCGCAGCACCAGGATAG IMP-F GAATAGAATGGTTAACTCTC blaIMP 188 pb MENDES et al., 2007 IMP-R CCAAACCACTAGGTTATC SPM-F CCTACAATCTAACGGCGACC blaSPM 674 pb SADEGHI et al., 2012 SPM-R TCGCCGTGTCCAGGTATAAC
NDM-1-F CTGAGCACCGCATTAGCC blaNDM 754 pb PFIFER et al., 2011 NDM-1-R GGGCCGTATGAGTGATTGC
Classe A-ESBL PER-1-F ATGAATGTCATTATAAAAGC blaPER-1 925 pb FARAJNIA et al., 2013 PER-1-R AATTTGGGCTTAGGGCAGAA
Classe A-carbapenemase KPC-F TCGCTAAACTCGAACAGG blaKPC 762pb NICOLETTI, 2014 KPC-R TTACTGCCCGTTGACGCCCAATCC
BKC-1-F ACATAATCTCGCAACGGGCG blaBKC 513 pb NICOLETTI, 2014 BKC-1-R TCGCCGGTCTTGTTCATCAC
Fosfoetanolamina transferase MCR-1-F CGGTCAGTCCGTTTGTTC mcr-1 308 pb LIU et al., 2015 MCR-1-R CTTGGTCGGTCTGTAGGG
ISAba1 ISAba1-F CATTGGCATTAAACTGAGGAGAAA ISAba1 451 pb RUIZ et al., 2007 ISAba1-R TTGGAAATGGGGAAAACGAA Fonte: O autor.
52
4.7 Determinação da relação genética entre os isolados estudados
A avaliação da relação genética entre aqueles isolados da espécie A. baumannii e entre
os isolados de K. pneumoniae foi realizada pela técnica de eletroforese de campo pulsado (do
inglês, Pulsed-Field Gel Electrophoresis – PFGE), brevemente descrita nos tópicos abaixo.
4.7.1 Preparação dos blocos de agarose
Os isolados foram repicados em ágar BHI (Himedia) e incubados em estufa a 35 ± 2° C
durante 20 horas para isolamento do crescimento em colônias. Em seguida, uma colônia de
cada isolado foi inoculada em 10 mL de caldo Luria-Bertani (LB) (Himedia) e incubada a 35
± 2 °C sob agitação de 180 rpm durante 20 horas. As culturas foram centrifugadas a 1000 × g
por 15 minutos e o sobrenadante desprezado. O sedimento de células foi ressuspendido em 1
mL de solução salina estéril (NaCl 0,85%) e transferido para novos tubos de microcentrífuga,
cujo peso havia sido previamente determinado em balança analítica. As suspensões de células
bacterianas de cada isolado foram centrifugadas a 13000 × g durante 30 segundos e o
sobrenadante desprezado. O pellet foi novamente ressuspendido em um volume (1:1) de
solução salina calculado de acordo com massa do pellet, correspondente à diferença entre o
peso do microtubo contendo o sedimento celular (em mg) e o peso do mesmo microtubo
vazio. As suspensões de células bacterianas foram vigorosamente homogeneizadas em vórtice
e uma alíquota de 10 µL dessa suspensão foi transferida para um novo microtubo contendo
300 µL do tampão TEN (Tris 100 mM pH 7,5; EDTA 100 mM; NaCl 150 mM). A essa
suspensão, foram adicionados 340 µL de agarose 2% de baixo ponto de fusão a uma
temperatura de 58 °C, estabilizada em banho-maria, e homogeneizados com auxílio de pipeta.
Essa suspensão foi transferida para os moldes para confecção dos blocos de agarose (plugs)
contendo as células bacterianas e deixados até sua completa solidificação a 5 °C por 20
minutos.
Após solidificação, os blocos de agarose foram transferidos para placas para cultura de
células (24 poços) contendo 2 mL de tampão EC (Tris 6 mM pH 6,5; NaCl 1 M; EDTA 0.01
M, Brij 58 0,5%, Sarcosil 0,5% e Deoxiglicolato 0,2%), acrescido de 200 µL de lisozima (10
mg/mL) e incubados a 37 °C por 18 horas. Após este período, o EC foi aspirado e os plugs
lavados duas vezes com 2 mL de CHEF-TE (Tris 0,1 M pH 7,5; EDTA 0,1 M), com intervalo
de 30 minutos entre as lavagens. Após a lavagem, os plugs foram submergidos em 2 mL de
53
solução ES (EDTA 0,4 M pH 9,3 e Sarcosil 10%), adicionados de 100 µL de proteinase K (20
mg/mL) (Fluka – Sigma-Aldrich) e incubados a 50 °C por 12 horas.
Após incubação, a solução ES foi desprezada e os plugs lavados 4 vezes com CHEF-
TE, com intervalo de uma hora entre cada lavagem. Os plugs foram armazenados a 5 °C em
CHEF-TE até a etapa de clivagem do DNA com as endonucleases específica.
4.7.2 Restrição do DNA bacteriano
Para a etapa de restrição do DNA com endonucleases, os blocos de agarose contendo o
material genético dos isolados foram reduzidos a aproximadamente 1/3 do tamanho original,
com o auxílio de uma lâmina de bisturi, e transferidos para placas de microtitulação (96
poços) contendo 200 µL de DNS (Tris 0,6 M pH 8,0; MgCl2 0,02 M). Os blocos foram
lavados 4 vezes com intervalo de uma hora entre cada lavagem à temperatura ambiente com
DNS (Tris 0,6 M pH 8,0; MgCl2 0,02 M).
Após as lavagens, o DNS foi substituído por 50 µL do tampão da enzima de restrição
(CutSmart®) (New England Biolabs) e os blocos incubados a 5 °C por uma hora. O tampão
CutSmart® foi removido e substituído por uma nova alíquota do mesmo tampão contendo a
enzima de restrição. Foram utilizadas 20 U/plug de SmaI para A. baumannii e 10 U/plug de
SpeI (New England Biolabs) para K. pneumoniae e incubados a 5 °C por duas horas.
Por fim, as placas contendo os plugs com o DNA de A. baumannii foram incubadas a 25
°C durante 20 horas, enquanto que as placas com plugs de K. pneumoniae foram incubadas a
37 °C por 20 horas, respeitando a temperatura ótima de atividade enzimática fornecida pelo
fabricante das enzimas.
4.7.3 Eletroforese em campo pulsátil (PFGE)
Após a clivagem enzimática, os plugs foram lavados quatro vezes com 150 µL de
tampão TBE 10x, com intervalo de 15 minutos entre as lavagens. Os plugs foram
posicionados no molde de acrílico (pente) e fixados com agarose fundida. O pente foi
posicionado verticalmente na extremidade distal da forma do gel e cobertos com agarose 1% a
58 °C, permanecendo à temperatura ambiente até completa solidificação. O pente foi
removido de modo que os plugs permanecessem no interior do gel de agarose e os poços
remanecentes preenchidos com agarose 1% fundida.
54
Como marcador de peso molecular foi utilizado o Lambda Ladder PFG Marker N0340S
(New England Biolabs).
A eletroforese foi realizada em tampão TBE 0,5x, em sistema CHEF-DR III (Bio-Rad
Laboratories), à temperatura de 15 °C e 200 Volts (6 V/cm), conforme programa específico
para as espécies bacterianas analisadas, apresentados no Quadro 3.
O gel foi corado em recipiente contendo 400 mL de água destilada adicionado de 40 µL
de brometo de etídio (10 mg/mL) (Sigma Aldrich) e fotografado em equipamento L-Pix EX
(Loccus Biotecnologia).
Quadro 3 - Condições da eletroforese - PFGE em sistema CHEF-DR III (Bio-Rad)
Microrganismos Switch Time (Inicial – Final) Tempo
A. baumannii 5.0 - 30.0 19 horas
K. pneumoniae 5.0 - 60.0 19 horas Fonte: Campana (2013) e adaptado do protocolo PFGE - Laboratório Especial de Microbiologia Clínica da Universidade de São Paulo (LEMC - USP).
O grau de similaridade entre os isolados da mesma espécie foi determinado pelo
software GelClust (KHAKABIMAMAGHANI et al., 2013) e pelos critérios estabelecidos por
TENOVER et al. (1995), de acordo com os perfis de bandas observados.
4.8 Sequenciamento do genoma bacteriano das principais representantes de
Acinetobacter baumannii
Para o sequenciamento do genoma dos isolados selecionados, o DNA genômico dos
mesmos foi extraído, purificado e tagmentado para a confecção da biblioteca genômica, que
posteriormente foi normalizada e sequenciada de acordo com técnica descrita nos tópicos
seguintes. Foram selecionados isolados representantes dos principais clones de A. baumannii
de acordo com a relação genética estabelecida entre estes pelo PFGE, e considerando as
características fenotípicas de resistência in vitro aos antimicrobianos. Um total de cinco
isolados (Ab_07, Ab_83, Ab_107, Ab_112 e Ab_124) foram selecionados para
sequenciamento e análise mais detalhada sobre suas características genéticas, com ênfase nos
mecanismos de resistência antimicrobiana.
55
4.8.1 Extração e quantificação do DNA genômico
A extração do DNA genômico foi feita com a utilização do DNeasy Blood & Tissue Kit
(Quiagen), seguindo-se as recomendações do fabricante, conforme descrito anteriormente no
item 4.3.
Uma alíquota do DNA extraído foi quantificada em Qubit® Fluorometer com a
utilização do Qubit® Fluorometric Quantitation Kit (Thermo Fisher Scientific Inc.), a fim de
verificar a eficácia, pureza e rendimento da extração.
4.8.2 Preparação da biblioteca
A biblioteca genômica foi preparada com o Nextera XT Library Preparation Protocol
(Illumina Inc.), de acordo com as instruções do fabricante. Resumidamente, 2,1 ng do DNA
genômico de cada isolado foi adicionado em uma placa de microdiluição com fundo em
formato V contendo 11 µL do Tagment DNA buffer e 5 µL do Amplicon Tagment Mix Buffer
e centrifugados a 280 × g por 1 minuto. As placas foram incubadas a 55 °C por 3 minutos em
termociclador GeneAmp PCR System 9700 (Applied Biosystems). Em seguida, 5 µL do
Neutralize Tagment Buffer foi adicionado aos poços contendo as reações e novamente
centrifugado a 280 × g por 5 minutos.
O DNA genômico tagmentado na etapa anterior foi amplificado com 15 µL do Nextera
PCR Master Mix e diferentes combinações dos Index 1 (N7XX) e 2 (S5XX) necessários para
a formação dos clusters na etapa de sequenciamento. As condições de amplificação
corresponderam a uma etapa inicial de 72 °C por 3 minutos e 95 °C por 30 segundos,
seguidos por 12 ciclos de 95 °C por 10 segundos, 55 °C por 30 segundos e 72 °C por 30
segundos, finalizado por uma etapa de extensão final a 72 °C por 5 minutos.
A etapa seguinte consistiu na purificação das bibliotecas geradas, com a remoção de
fragmentos curtos para otimização do sequenciamento. Para isso, 50 µL de cada produto
amplificado foram transferidos para uma nova placa e homogeneizados em vórtice por 30
segundos. Um volume de 25 µL de AMPure XP Beads foi adicionado em cada poço e
homogeneizados sob agitação vigorosa por 1 minuto. A placa de microdiluição foi
posicionada sobre a placa magnética Magnetic Stand-96 (Thermo Fisher Scientific Inc.) e as
beads lavadas duas vezes com 200 µL de etanol 80%, sendo 20 µL do sobrenadante resultante
do processo de lavagem transferido para uma nova placa.
56
4.8.3 Normalização da biblioteca
A normalização da biblioteca foi feita com adição de 45 µL do Library Nornalization
Additives 1 e Library Normalization Beads 1 Mix, seguida de uma lavagem com o Library
Normalization Wash Buffer 1 e adição de 30 µL de NaOH 0,1N e 30 µL de Library
Normalization Storage 1 em cada um dos poços contendo os reagentes. A placa foi
novamente posicionada na superfície magnética durante 2 minutos e 30 µL do sobrenadante
foi recuperado, quantificado em NanoDrop 2000c (Thermo Fisher Scientific Inc.) e
armazenado a -20 °C até a realização das etapas de quantificação e sequenciamento.
A quantificação das bibliotecas foi avaliada por PCR Quantitativo em Tempo Real
(qPCR) para a padronização da quantidade de cada amostra a ser aplicada no cartucho de
sequenciamento MiSeq Reagent Kits v2 (Illumina Inc.). Essa técnica foi realizada com a
utilização do KAPA Library Quantification Kit for Illumina Sequencing Platforms (KAPA
Biosystems) em termociclador 7500 Fast Real Time PCR System (Applied Biosystems).
Inicialmente, a biblioteca de DNA previamente normalizada foi diluída 1:1000 (v/v) em
Tris-HCl 10 mM, pH 8,0 e 0,05% Tween 20. Um volume de 4 µL de cada diluição foi
adicionado em 12 µL do KAPA SYBR® FAST qPCR Master Mix containing Primer Premix e
água ultrapura suficiente para um volume final de 20 µL de reação. Como calibradores das
reações foram utilizados 4 µL de cada dsDNA Standard (1 ao 6) (KAPA Biosystems). A
condição de reação consistiu em uma etapa de desnaturação inicial a 95 °C por 5 minutos,
seguidas por 35 ciclos de desnaturação a 95 °C por 30 segundos e anelamento dos
oligonucleotídeos a 60 °C por 45 segundos, extensão e aferição dos dados a cada ciclo.
Os cálculos de quantificação foram realizados em Excel® (Microsoft Corporation), com
o valor do ciclo threshold obtido durante os testes.
4.8.4 Sequenciamento da biblioteca
Após descongelamento à temperatura ambiente, as amostras foram diluídas a 250 pmol
em água ultrapura, homogeneizadas com o auxílio de uma pipeta automática e transferidas
para um único microtubo contendo o Hybridization Buffer HT1 (Illumina Inc.), sendo
posteriormente desnaturadas a 96 °C por 2 minutos em termociclador e aplicadas no MiSeq
Reagent Kits v2 (Illumina Inc.).
57
A reação de sequenciamento foi realizada em MiSeq Sequencing System (Illumina Inc.),
no Núcleo de Plataformas Tecnológicas do CPqAM, de acordo com os parâmetros
recomendados pelo fabricante.
4.9 Montagem e anotação dos genomas
A montagem dos genomas foi realizada com o algoritmo SPAdes, utilizando a estratégia
de montagem de novo (BANKEVICH et al., 2012) e a anotação foi feita utilizando o servidor
Rapid Annotation using Subsystem Technology (RAST) Prokaryotic Genome Annotation
(http://rast.nmpdr.org/rast.cgi).
Os contigs montados foram analisados pela ferramenta BLASTn e comparados à base
de dados do Multi Locus Sequence Typing (MLST) e ResFinder 2.1 do Center of Genomic
Epidemiology services (http://cge.cbs.dtu.dk/services) para a tipagem bacteriana e
identificação dos mecanismos de resistência antimicrobiana adquiridos, respectivamente.
A tipagem bacteriana para determinação do sequence type (ST) foi realizada pela
utilização de ambos os esquemas de Bartual (Oxford) (BARTUAL et al., 2005) e Diancourt
(Pasteur) (DIANCOURT et al., 2010) (http://pubmlst.org/abaumannii), considerando sete
diferentes genes constitutivos (housekeeping) em cada um dos esquemas. A identificação do
complexo clonal (CC) relacionado a cada um dos isolados de A. baumannii sequenciados foi
realizada utilizando o algoritmo eBURST V3 (http://eburst.mlst.net).
Análises manuais de loci de interesse foram realizadas para a avaliação da presença de
mutações relacionadas à resistência aos antibióticos da classe das fluoroquinolonas e β-
lactâmicos pela utilização dos softwares Artemis Release 16.0.0 (Sanger Institute), Mega 6©
(Koichiro Tamura) e BioEdit Sequence Alignment Editor© (Tom Hall), em comparação com
o banco de dados do NCBI (www.ncbi.nlm.nih.gov). Foram analisadas as sequências
nucleotídicas das regiões determinantes de resistência às quinolonas (QRDR, quinolone-
resistance determining region), proteína externa de membrana carO (carbapenem-associated
outer membrane protein) e do gene que codifica para cefalosporinase ADC de A. baumannii
dos isolados, bem como a análise da sequência de aminoácidos de seus respectivos produtos.
4.10 Considerações éticas
O presente estudo foi parte do Projeto de Pesquisa intitulado “Susceptibilidade de
Bactérias Isoladas de Superfícies e Hemoculturas em uma Unidade de Terapia Intensiva”,
58
aprovado pelo CEP da ASCES, sob Parecer de número 1.061.201 em 06 de maio de 2015
(Anexo A), tendo como pesquisadora responsável a Prof.ª Dra. Sibele Ribeiro de Oliveira,
colaboradora do presente estudo.
Foram seguidos os preceitos éticos determinados pela resolução 466/12, do Conselho
Nacional de Saúde, que regulamenta as diretrizes e normas de pesquisas envolvendo seres
humanos.
4.11 Análise dos dados
Os resultados foram avaliados qualitativamente pela análise descritiva dos dados
coletados e armazenados em banco de dados pelo software SPSS 13.0 (Statistical Product and
Service Solutions®).
59
5 RESULTADOS
5.1 Distribuição e identificação dos isolados de superfícies inanimadas e de ICSs
Foram realizadas 12 coletas de microrganismos a partir das superfícies inanimadas de
acordo com a indicação de positividade para crescimento bacteriano em hemocultura pelo BD
BACTEC™ Instrumented Blood Culture Systems, provenientes de 12 diferentes pacientes
internados em 11 diferentes leitos da UTI em estudo, em três ocasiões distintas. Do total de
coletas realizadas, foram recuperados 70 isolados, dos quais 11 (15,7%) foram provenientes
de hemoculturas e 59 (84,2%) provenientes das superfícies hospitalares distribuídas entre os
leitos avaliados, conforme apresentado no Quadro 4.
Dentre os microrganismos recuperados a partir das hemoculturas, foi isolado um total
de 10 Gram positivos (90,9%) e 1 Gram negativo (9,1%). As espécies de microrganismos
Gram positivos mais frequentemente isoladas das amostras clínicas foram Staphylococcus
epidermidis (60%), S. haemolitycus (20%) e S. hominis e S. caprae (10% do total de Gram
positivos isolados cada). A única espécie de microrganismo Gram negativo isolada foi K.
pneumoniae, representando 9,1% do total de microrganismos isolados a partir das culturas de
sangue (Quadro 4).
Em uma das hemoculturas avaliadas, foram recuperados isolados pertencentes a duas
diferentes espécies de microrganismos Gram positivos, conforme observado na coleta de
número 08 (Quadro 4). Adicionalmente, não foram recuperados microrganismos das
hemoculturas correspondentes às coletas de número 07 e 11, apesar da indicação de
positividade de crescimento bacteriano pelo sistema automatizado de hemocultura, conforme
apresentado no Quadro 4.
A partir das superfícies inanimadas avaliadas foi recuperado um total de 57,6% (34/59)
isolados Gram positivos e 42,4% (25/59) isolados Gram negativos. Os microrganismos mais
frequentemente isolados corresponderam às espécies Acinetobacter baumannii (23,7% do
total), Enterococcus faecalis (16,9%), Bacillus cereus (15,2%), Staphylococcus epidermidis
(6,6%), Klebsiella pneumoniae (5%), Providencia stuartii (5%), Staphylococcus aureus (5%),
Proteus mirabilis (3,4%), Pseudomonas aeruginosa (3,4%) e Bacillus flexus (1,7%), Bacillus
weihenstephanensis (1,7%), Escherichia coli (1,7%), Staphylococcus cohnii (1,7%),
Staphylococcus hominis (1,7%) e Staphylococcus warneri (1,7%), conforme apresentado na
Tabela 2.
60
Quadro 4 - Distribuição dos isolados bacterianos provenientes de hemoculturas e superfícies inanimadas coletados em 2015 de acordo com cada leito analisado
(continua)
Coleta Data Isolados em Hemocultura/Paciente N° Leito Superfícies/Espécies isoladas (número
de isolados)
#01 19/05/2015 S. hominis 02
GD: B. cereus; S. hominis GE: B. cereus; S. epidermidis BC: E. faecalis BI: E. faecalis PA: S. epidermidis
#02 19/05/2015 S. haemolyticus 10
GD: A. baumannii GE: A. baumannii BC: B. cereus BI: S. epidermidis PA: S. epidermidis
#03 26/06/2015 S. haemolyticus 03
GD: A. baumannii GE: A. baumannii BC: S. haemolyticus BI: B. cereus; S. cohnii PA: AC
#04 26/06/2015 K. pneumonia 11
GD: E. coli GE: AC BC: S. aureus BI: AC PA: S. aureus;E. faecalis
#05 26/06/2015 S. epidermidis 15
GD: B. cereus GE: B. cereus; S. warneri BC: A. baumannii BI: B. weihenstephanensis PA: A. baumannii
#06 26/06/2015 S. epidermidis 17
GD: B. flexus GE: S. haemolyticus BC: S. aureus BI: P. stuartii PA: S. haemolyticus
#07 24/08/2015 AC 01
GD: K. pneumoniae GE: K. pneumoniae BC: B. cereus BI: B. cereus PA: A. baumannii
#08 24/08/2015 S. caprae; S. epidermidis 02
GD: K. pneumoniae GE: A. baumannii BC: A. baumannii BI: A. baumannii (02) PA: AC
#09 24/08/2015 S. epidermidis 04
GD: P. aeruginosa GE: P. aeruginosa BC: P. mirabilis BI: P. mirabilis PA: A. baumannii
#10 24/08/2015 S. epidermidis 06
GD: AC GE: A. baumannii BC: E. faecalis BI: AC PA: E. faecalis
#11 24/08/2015 AC 07
GD: E. faecalis GE: E. faecalis BC: E. faecalis BI: E. faecalis PA: P. stuartii; E. faecalis
61
Quadro 4 - Distribuição dos isolados bacterianos provenientes de hemoculturas e superfícies inanimadas coletados em 2015 de acordo com cada leito analisado
(conclusão)
Coleta Data Isolados em Hemoculturas /Pacientes Nº Leito Superfícies/Espécies isoladas (número
de isolados)
#12 24/08/2015 S. haemolyticus 13
GD: A. baumannii GE: P. stuartii BC: B. cereus BI: AC PA: AC
Fonte: O autor. Legenda: GD - grade direita da cama; GE - grade esquerda da cama; BC - botões controladores de altura da cama; BI - botões reguladores da bomba de infusão de medicamentos; PA - prateleira de apoio localizada na cabeceira da cama; AC - ausência de crescimento;
Em apenas duas situações (coletas) foram recuperados isolados pertencentes à mesma
espécie bacteriana provenientes de hemoculturas dos pacientes internados e das superfícies
inanimadas que rodeavam seus respectivos leitos, conforme apresentado no Quadro 4, onde se
pode observar nas coletas de número 01 e 03, respectivamente, um isolado de S. hominis
(grade direita) e outro isolado de S. haemolyticus (botões reguladores da altura da cama), em
concordância com as espécies isoladas das hemoculturas. No entanto, com essa observação,
sem a determinação da relação genética entre os isolados, não seria possível identificá-los
como pertencentes aos mesmos clones de S. hominis e S. haemolyticus.
Considerando o conjunto de cinco superfícies inanimadas pertencentes a cada leito
analisado em cada uma das doze coletas, uma avaliação geral da distribuição dos
microrganismos revelou que, na maioria dos leitos avaliados, pelo menos uma mesma espécie
bacteriana foi isolada em mais de um tipo de superfície daquele mesmo leito, conforme
observado no Quadro 4.
Uma análise da distribuição do número de microrganismos isolados a partir dos pontos
das superfícies estudadas revelou uma distribuição homogênea do número de microrganismos
versus superfícies avaliadas (Tabela 2). Dos microrganismos isolados a partir das superfícies
inanimadas, um total de 22% (13/59) dos isolados foi recuperado das grades esquerdas das
camas; 20,3% (12/59) foram recuperados das grades direitas das camas; 20,3% recuperado a
partir dos botões reguladores de altura das camas; 18,6% foram recuperados a partir dos
botões reguladores da bomba de infusão e 18,6% das prateleiras de apoio localizadas na
cabeceira das camas, conforme apresentado na Tabela 2.
As espécies A. baumannii e Enterococcus faecalis foram de forma geral as mais
amplamente distribuídas pelas superfícies inanimadas incluídas no estudo, estando presentes
em pelo menos um tipo de cada superfície analisada, como apresentado na Tabela 2, seguidas
de B. cereus, S. epidermidis, Providencia stuartii e S. haemolyticus (Gráfico 1).
62
Considerando a importância epidemiológica dos bacilos Gram negativos associados a
IRAS, os isolados pertencentes às espécies A. baumannii e K. pneumoniae foram selecionados
para melhor caracterização em etapas posteriores deste estudo, sendo avaliados quanto à
similaridade genética, ao perfil de sensibilidade aos principais antimicrobianos utilizados na
prática clínica e à presença de mecanismos de resistência aos antimicrobianos.
Adicionalmente, para fins de comparação e avaliação da persistência de clones bacterianos na
UTI estudada, foram incluídos neste estudo dez isolados clínicos de microrganismos oriundos
de hemoculturas de pacientes assistidos durante o ano de 2014 na mesma UTI, sendo nove
isolados de K. pneumoniae e um único isolado de A. baumannii.
Tabela 2 - Distribuição das espécies bacterianas isoladas nas superfícies inanimadas avaliadas
Espécies GD GE BC BI PA Total isoladas n(%) n(%) n(%) n (%) n (%) n (%)
A. baumannii 3 (21,4) 4 (28,5) 2 (14,3) 2 (14,3) 3 (21,4) 14 (23,7) E. faecalis 1 (10) 1 (10) 3 (30) 2 (20) 3 (30) 10 (16,9) B. cereus 2 (22,2) 2 (22,2) 3 (33,3) 2 (22,2) 0 (0) 9 (15,2) S. epidermidis 0 (0) 1 (25) 0 (0) 1 (25) 2 (50) 4 (6,6) K. pneumoniae 2 (66,6) 1 (33,3) 0 (0) 0 (0) 0 (0) 3 (5) P. stuartii 0 (0) 1 (33,3) 0 (0) 1 (33,3) 1 (33,3) 3 (5) S. aureus 0 (0) 0 (0) 2 (66,6) 0 (0) 1 (33,3) 3 (5) S. haemolitycus 0 (0) 1 (33,3) 1 (33,3) 0 (0) 1 (33,3) 3 (5) P. mirabilis 0 (0) 0 (0) 1 (50) 1 (50) 0 (0) 2 (3,4) P. aeruginosa 1 (50) 1 (50) 0 (0) 0 (0) 0 (0) 2 (3,4) B. flexus 1 (100) 0 (0) 0 (0) 0 (0) 0 (0) 1 (1,7) B. weihenstephanensis 0 (0) 0 (0) 0 (0) 1 (100) 0 (0) 1 (1,7) E. coli 1 (100) 0 (0) 0 (0) 0 (0) 0 (0) 1 (1,7) S. cohnii 0 (0) 0 (0) 0 (0) 1 (100) 0 (0) 1 (1,7) S. hominis 1 (100) 0 (0) 0 (0) 0 (0) 0 (0) 1 (1,7) S. warneri 0 (0) 1 (100) 0 (0) 0 (0) 0 (0) 1 (1,7) Total 12 (20,3) 13 (22) 12 (20,3) 11 (18,6) 11 (18,6) 59 (100)
Fonte: O autor. Legenda: GD - grade direita; GE - grade esquerda; BC - botões reguladores de altura da cama; BI - botões reguladores da bomba de infusão; PC - prateleira de apoio; Total - total de bactérias isoladas; n - número de isolados; % - porcentagem dos isolados com base no total identificado para a espécie.
63
Gráfico 1 - Distribuição das espécies isoladas nas superfícies hospitalares avaliadas
Fonte: O autor.
5.2 Acinetobacter baumannii
5.2.1 Análise da similaridade genética entre os isolados de A. baumannii
A análise da similaridade genética entre os diferentes isolados de Acinetobacter
baumannii demonstrou a presença diferentes clones distribuídos no ambiente hospitalar
analisado. Para os isolados desta espécie, foram observados 03 padrões distintos de bandas de
acordo com a técnica de PFGE, classificados de A a C, seguindo interpretação de Tenover et
al. (1995), e um perfil classificado como não-tipável (NT) de acordo com a técnica
empregada.
O padrão A foi observado em 6 isolados distribuídos por quatro diferentes leitos (leito
10; 13; 06 e 02), oriundos das grades esquerda e direita da cama do leito 10, grade direita da
cama do leito 13, grade esquerda da cama do leito 06 e na grade esquerda da cama e botões da
bomba de infusão do leito 02, sendo o padrão predominante nas superfícies hospitalares
analisadas.
O clone B foi o segundo mais frequente. O mesmo foi observado em 5 isolados
oriundos dos arredores dos leitos 02; 03 e 15, distribuídos pelas grades esquerda e direita da
cama do leito 03, botões reguladores de altura da cama e prateleira de apoio do leito 15 e, por
fim, nos botões da bomba de infusão do leito 02. O clone C foi observado exclusivamente no
isolado clínico recuperado a partir de hemocultura de paciente internado na UTI de estudo no
ano de 2014. Perfis não-tipáveis foram detectados em 3 isolados oriundos das prateleiras de
64
apoio dos leitos 01 e 04 e nos botões reguladores de altura da cama e grade esquerda da cama
do leito 02, respectivamente, conforme Figura 6.
A partir dos resultados de tipagem por PFGE, foram selecionados cinco isolados de A.
baumannii para o sequenciamento do genoma e tipagem por MLST. Foram selecionados
isolados do clone A (Ab_107 e Ab_124), B (Ab_83), C (Ab_07) e não-tipáveis (Ab_112),
como indicado na Figura 6. Desses, o sequenciamento do genoma do isolado Ab_83 falhou
para determinação das sequências e o mesmo foi excluído dessa análise. Detalhes das
características das sequências e montagem do genoma estão apresentados no Apêndice B. A
tipagem genética pelo MLST foi realizada pela análise das variantes alélicas dos genes
housekeeping pelos esquemas padronizados por Bartual (Oxford) (BARTUAL et al., 2005) e
Diancourt (Pasteur) (DIANCOURT et al., 2010).
A tipagem por MLST revelou a presença de duas diferentes STs (sequence types)
pertencentes a dois diferentes complexos clonais de A. baumannii nos isolados provenientes
das superfícies hospitalares analisadas. O isolado Ab_107 foi pertencente à STB227/STP79
(CC131B/CC79P) e os isolados Ab_112 e Ab_124 foram classificados como pertencentes à
STB405/STP1 (CC109B/CC1P). O isolado Ab_07, recuperado a partir de hemocultura realizada
em paciente internado na mesma UTI no ano de 2014, apresentou STB1336/STP113
(CC110B/CC25P), conforme apresentado na Figura 6.
65
Figura 6 - Padrões de PFGE, MLST, genes de resistência e perfil de sensibilidade observados em Acinetobacter baumannii
Fonte: O autor. Legenda: ID - identificação; PFGE - agrupamento pela técnica de PFGE; MLSTB/P - tipagem pela técnica de MLST utilizando os esquemas de Bartual/Oxford (B) e Diancourt/Pasteur (P); ISAba* - presença do elemento de inserção ISAba1 à motante da respectiva oxacilinase; ND - não determinado; GE - grade esquerda; GD - grade direita; BI - botões da bomba de infusão; HC - hemocultura; PA - prateleira de apoio; BC - botões reguladores de altura da cama; MIC - concentração inibitória mínima; CRO - ceftriaxona; CAZ - ceftazidima; FEP - cefepime; IPM - imipenem; MEM - meropenem; CIP - ciprofloxacina; LVX - levofloxacina; AMK - amicacina; GEN - gentamicina. Diferentes cores foram utilizadas para cada leito a fim de facilitar a leitura.
66
5.2.2 Perfil de sensibilidade aos antimicrobianos e mecanismos de resistência aos
antimicrobianos entre os isolados de A. baumannii
A avaliação do perfil de sensibilidade dos isolados de A. baumannii deste estudo
demonstrou que estes apresentavam elevada resistência às cefalosporinas, apresentando MIC
≥ 128 µg/mL para ceftriaxona e ceftazidima para a totalidade dos isolados analisados. A
resistência à cefepime foi identificada em 60% (9/15) dos isolados de A. baumannii, sendo 6
desses isolados resistentes à cefepime com MIC > 64 µg/mL. Os isolados de A. baumannii
também apresentaram alto grau de resistência aos carbapenêmicos, apresentando MICs para
imipenem e meropenem de no mínimo 32 µg/mL para todos os isolados avaliados. Um total
de 66,6% (10/15) dos isolados de A. baumannii apresentou MIC de imipenem ≥ 64 µg/mL,
enquanto que todos os isolados apresentaram MIC ≥ 64 µg/mL de meropenem.
Para a avaliação dos mecanismos de resistência aos carbapenêmicos, o teste
CarbAcineto foi realizado para a pesquisa da produção de enzimas β-lactamases do tipo
carbapenemase pelos 15 isolados de A. baumannii, incluindo aquele oriundo da coleta de
hemocultura realizada no ano de 2014 na UTI de estudo. O teste CarbAcineto resultou em
positivo para a produção de carbapenemases por todos os isolados testados, conforme
representado na Figura 7. Considerando a incapacidade do EDTA em inibir a atividade
enzimática das carbapenemases produzidas pelos isolados de A. baumannii neste estudo,
deduziu-se que nenhum dos isolados dessa espécie produziam enzimas do tipo metalo-β-
lactamase (Figura 7).
Para a confirmação da produção de β-lactamases pelos isolados de A. baumannii
avaliados, foram realizadas PCR para a identificação dos genes que codificam as principais β-
lactamases detectadas em A. baumannii de origem clínica. Um total de 4 (26,6%) isolados
oriundos das superfícies hospitalares analisadas, situados nas prateleiras de apoio dos leitos
01 e 04 e grade esquerda e botões reguladores de altura da cama do leito 02, (Figura 8a),
sendo esses isolados agrupados no clone A e entre aqueles não tipáveis, considerando o perfil
do PFGE.
Dois (13,3%) dos isolados de A. baumannii carregavam o gene que codifica para a
carbapenemase OXA-24-like. Esses dois isolados foram provenientes da grade direita do leito
13 e botões da bomba de infusão do leito 02 (Figura 8a), pertencentes ao perfil clonal A. A
análise da sequência de nucleotídeos do gene blaOXA-24-like e da sequência de aminoácidos
predita, realizada no isolado representante (Ab_107) a partir da utilização dos dados do
sequenciamento do genoma, revelou 100% de cobertura e 100% de identidade com
67
sequências depositadas da variante enzimática OXA-72 (número de acesso no GenBank:
WP_000713530).
Figura 7 - Teste CarbAcineto: Detecção de carbapenemase em Acinetobacter baumannii
Fonte: O autor. Legenda: a) Controles negativos das soluções sem o lisado bacteriano; b) Controle negativo do lisado bacteriano (cepa ATCC® 25922); c) Controle positivo para produção de carbapenemase (cepa L023 produtora de carbapenemase do tipo oxacilinase); d) Controle positivo para a produção de metalo-β-lactamase (cepa FL_C262 produtora de NDM-1); e) Representação de um dos isolados testados; VF - vermelho de fenol; ZnSO4 - sulfato de zinco; IPM - imipenem; EDTA - ácido etilenodiamino tetra-acético. Nota: Foto após 2 horas de incubação a 37 °C.
A presença do gene codificador de OXA-143-like foi observada em 1 (6,6%) isolado
ambiental de A. baumannii pertencente ao perfil clonal B de acordo com o PFGE, estando este
disposto nos botões da bomba de infusão do leito 02. Além disto, o blaOXA-143-like foi detectado
também no isolado clínico obtido no mesmo hospital no ano de 2014, conforme Figura 8b. A
análise da sequência de nucleotídeos do gene blaOXA-143-like e da sequência de aminoácidos
predita, realizada no isolado representante (Ab_07) a partir da utilização dos dados fornecidos
pelo sequenciamento do genoma, revelou 100% de cobertura e 100% de identidade com
68
sequências depositadas da variante enzimática OXA-253 (número de acesso no GenBank:
WP_032495764).
Todos os isolados de A. baumannii estudados apresentaram PCR positivo para o gene
blaOXA-51-like e para o elemento de inserção ISAba1, conforme Figura 8c e 8d, respectivamente.
Entretanto, a associação do blaOXA-51-like ao elemento de inserção ISAba1 não foi observada
dentre os isolados. As variantes alélicas dos genes codificadores da OXA-51-like foram
determinadas para aqueles isolados cujos genomas foram sequenciados. O gene blaOXA-64 foi
identificado no isolado Ab_07; enquando o blaOXA-65 foi a variante de OXA-51-like
identificada no isolado Ab_107; e o blaOXA-69 nos isolados Ab_112 e Ab_124, conforme
apresentado no Quadro 5.
O gene blaPER-1 foi observado em 11 isolados (73,3%) da espécie, incluindo o isolado
clínico recuperado de hemocultura realizada no ano de 2014, conforme apresentado na Figura
8e.
A associação entre o elemento de inserção ISAba1 à montante (upstream) dos genes
blaOXA-23, blaOXA-24, blaOXA-51 e blaOXA-143 foi avaliada por PCR nos isolados de A. baumannii
positivos para a presença dos respectivos genes. A presença do ISAba1 à montante do gene
blaOXA-23-like foi detectada por PCR nos quatro isolados positivos para a presença deste gene
(Figura 8f). O alinhamento e comparação das sequências com o banco de dados GenBank
apresentou 100% de cobertura e 99,7% de identidade com o ISAba1 e blaOXA-23-like localizados
no transposon Tn2008 (LN877214), tendo localização confirmada nos isolados Ab_112 e
Ab_124 pela análise do sequenciamento do genoma. Não foi observada associação do ISAba1
à montante aos genes blaOXA-24, blaOXA-51 e blaOXA-143 nos isolados de A. baumannii.
Por fim, a presença simultânea dos genes codificadores de OXA-23, OXA-24 e OXA-
143 não foi encontrada nesses isolados, assim como, nenhum isolado A. baumannii possuia
genes codificadores das enzimas carbapenemases OXA-58-like, KPC, nem genes
codificadores de MβLs, de acordo com o teste de hidrólise dos carbapenêmicos e sua inibição
pelo EDTA.
A análise do gene que codifica a proteína de membrana externa CarO foi realizada para
cada um dos isolados de A. baumannii representantes cujo genoma foi sequenciado. Nesses
isolados, as sequências de carO apresentaram diferentes substituições de nucleotídeos, no
entanto, não foram observadas mudanças na matriz de leitura do gene (frameshift) nem a
presença de códons de parada prematuros quando comparados à sequência de carO da cepa de
referência A. baumannii ATCC® 19606.
69
As análises in silico do contexto genético das sequências que codificam para a β-
lactamase da classe C constitutiva de A. baumannii (ADC) revelou que os genes blaADC dos
isolados Ab_107, Ab_112 e Ab_124, recuperados a partir de superfícies hospitalares e
pertencentes à STB227/STP79 (CC131B/CC79P) e STB405/STP1 (CC109B/CC1P),
respectivamente, estavam associados ao elemento de inserção ISAba1 à montante e que a
sequência de aminoácidos predita para a enzima apresentou 97% de identidade com a ADC-1
(BHATTACHARYA et al., 2014) e 98% de identidade com a ADC-68 (JEON et al., 2014).
Figura 8 – Eletroforese dos produtos de PCR realizada para os isolados de Acinetobacter baumannii
Fonte: O autor. Legenda: a) Eletroforese dos produtos de PCR para os genes codificadores de OXA-23-like e OXA-24-like; b) Eletroforese dos produtos de PCR para o gene codificador de OXA-143-like; c) Eletroforese dos produtos de PCR para o gene codificador de OXA-51-like em 10 isolados de A. baumannii; d) Eletroforese dos produtos de PCR com oligonucleotídeos ISAba1-F e ISAba1-R em 13 isolados de A. baumannii; e) Eletroforese dos produtos de PCR com oligonucleotídeos PER-1-F e PER-1-R em A. baumannii; f) Eletroforese dos produtos de PCR amplificados com a combinação dos oligonucleotídeos ISAba1-F e OXA-23-like-R em três isolados de A. baumannii; C- - controle negativo; C” - branco; os números correspondem à identificação de cada isolado analisado.
Em relação ao teste de sensibilidade in vitro às fluoroquinolonas, todos os isolados de
A. baumannii avaliados apresentaram resistência à ciprofloxacina com MIC ≥ 32 µg/mL,
enquanto que em relação à levofloxacina nenhum isolado de A. baumannii estudado
apresentou resistência in vitro. Desses, 86,6% (13/15) dos apresentaram MIC igual a 4 µg/mL
(intermediários) e 13,3% (2/15) apresentaram MIC igual a 2 µg/mL para a droga (sensíveis).
A identificação dos mecanismos de resistência antimicrobiana adquiridos, realizada com os
dados gerados pelo sequenciamento do genoma dos principais isolados representantes de A.
70
baumannii, revelou a presença do gene aac(6')Ibcr em dois isolados recuperados a partir da
grade esquerda e botões reguladores de altura da cama do leito 02.
Análises in silico das sequências gênicas que codificam a subunidade A da DNA girase
(GyrA) e subunidade IV da topoisomerase (ParC), correspondentes à Região Determinante de
Resistência à Quinolonas (do inglês, QRDR), daqueles isolados cujo genoma foi sequenciado,
revelou substituição do aminoácido Ser-83→Leu na sequência de aminoácidos preditos para
GyrA em todos os isolados de A. baumannii sequenciados neste estudo. A substituição de Ser-
80→Leu em ParC foi observada para os isolados Ab_07, Ab_112 e Ab_124, enquanto que o
isolado Ab_107 apresentou a substituição Ser-80→Tir na sequência de aminoácidos predita
para ParC (Figura 9). Nenhuma outra substituição relacionada à resistência aos antibióticos da
classe das fluoroquinolonas foi observada nas sequências de aminoácidos de GyrA e ParC dos
isolados de A. baumannii avaliados nesse estudo.
Fonte: O autor. Legenda: Os pontos indicam identidade entre os aminoácidos. As substituições estão indicadas pela abreviação de cada aminoácido na posição correspondente, utilizando a sequência da GyrA e ParC de E. coli como referência. Destacado em vermelho, encontram-se as substituições de aminoácidos dos quatro isolados em comparação à GyrA; em amarelo, encontra-se destacada as substituições de aminoácidos dos quatro isolados em comparação à ParC.
Todos os isolados de A. baumannii oriundos das superfícies analisadas nesse estudo
apresentaram redução da sensibilidade a pelo menos um dos antimicrobianos da classe dos
aminoglicosídeos testados: gentamicina (MIC ≥ 8 µg/mL) e amicacina (MIC ≥ 32 µg/mL).
Ainda entre os isolados oriundos das superfícies, 64,3% (9/14) isolados de A. baumannii
apresentaram resistência à amicacina e 42,8% (6/14) dos isolados foram resistentes à
Figura 9 - Alinhamento das sequências de aminoácidos de GyrA e ParC de quatro isolados de Acinetobacter baumannii
71
gentamicina. Apenas um isolado de superfície (Ab_85) apresentou resistência a ambos os
aminoglicosídeos testados, além do isolado Ab_07 obtido a partir de ICS em 2014, incluído
nesse estudo. A busca por mecanismos de resistência adquiridos, realizada com a utilização
das sequências de nucleotídeos geradas a partir do sequenciamento do genoma dos isolados
representantes de A. baumannii, revelou a presença de diversos genes codificadores de
enzimas relacionadas à resistência pela modificação de moléculas de aminoglicosídeos
distribuídos entre esses isolados: aadA1 (também denominado ant(3″)-Ia); aadB; aph(3’)-Via
(aphA-6); strA (aph(6)-Ia); strB (aph(6)-Id) e aacA4, conforme observado no Quadro 5.
Nenhum dos isolados apresentou resistência à ampicilina/sulbactam
(penicilina/inibidor) ou polimixina B (lipopeptídeo). O perfil de sensibilidade dos isolados de
A. baumannii aos principais antimicrobianos avaliados encontra-se descrito na Figura 6.
A identificação dos mecanismos de resistência antimicrobiana adquiridos, realizada pela
utilização do algoritmo ResFinder 2.1 a partir das sequências de nucleotídeos do genoma dos
principais isolados representantes, demonstrou ainda a presença de genes relacionados à
resistência a demais antibióticos não avaliados neste estudo, sendo estes pertencentes às
classes dos fenicóis (floR), sulfonamidas (sul2), trimetoprim (dfrA1), macrolídeos (mphE),
lincosamidas e streptogramina B (msrE), conforme apresentado no Quadro 5.
72
Quadro 5 - Mecanismos de resistência adquiridos identificados a partir do alinhamento dos genomas de Acinetobacter baumannii frente à base de dados ResFinder 2.1
Identificação Genes Adquiridos Identidade (%) Fenótipo de resistência predito
Ab_07
ant(2″)-Ia (aadB) ant(3″)-Ia (aadA1)
aph(3')-VIa blaTEM-1 blaOXA-64 blaOXA-253
floR sul2
dfrA1
99,5 100 100 100 100 100 98,4 100 100
Aminoglicosídeos Aminoglicosídeos Aminoglicosídeos
β-lactâmicos β-lactâmicos β-lactâmicos
Fenicol Sulfonamida Trimetoprim
Ab_107
ant(3″)-Ia (aadA1)
aph(3')-VIa aph(6)-Ia (strA) aph(6)-Id (strB)
blaOXA-65 blaOXA-72 blaTEM-1
floR sul2
dfrA1
100 100 100 100 100 100 100 98,4 100 100
Aminoglicosídeos Aminoglicosídeos Aminoglicosídeos Aminoglicosídeos
β-lactâmicos β-lactâmicos β-lactâmicos
Fenicol Sulfonamida Trimetoprim
Ab_112
aph(6)-Ia (strA) aph(6)-Id (strB)
aac(6')-4 (aacA4) blaOXA-23 blaOXA-69
aac(6')Ibcr msrE mphE floR sul2
100 100 99,8 100 100 99,5 100 100 98.4 100
Aminoglicosídeos Aminoglicosídeos Aminoglicosídeos
β-lactâmicos β-lactâmicos
Fluoroquinolonas e aminoglicosídeos Macrolídeos, lincosamidas e streptogramina B
Macrolídeos Fenicol
Sulfonamida
Ab_124
aph(6)-Ia (strA) aph(6)-Id (strB)
aac(6')-4 (aacA4) blaOXA-23 blaOXA-69
aac(6')Ibcr msrE mphE floR sul2
100 100 99,8 100 100 99,5 100 100 98,4 100
Aminoglicosídeos Aminoglicosídeos
β-lactâmicos β-lactâmicos β-lactâmicos
Fluoroquinolonas e aminoglicosídeos Macrolídeos, lincosamidas e streptogramina B
Macrolídeos Fenicol
Sulfonamida
Fonte: O autor. A cobertura para cada um dos genes adquiridos identificados a partir do alinhamento dos genomas de Acinetobacter baumannii frente à base de dados ResFinder 2.1 foi igual a 100%.
73
5.3 Klebsiella pneumoniae
5.3.1 Análise da similaridade genética e resistência antimicrobiana entre os isolados de K.
pneumoniae
A análise de similaridade genética por PFGE dos isolados de Klebsiella pneumoniae
mostrou a circulação de cinco perfis distintos de PFGE, classificados em A a E, entre os anos
de 2014 e 2015, daqueles associados a ICS de pacientes hospitalizados na UTI do hospital
e/ou das suas superfícies analisadas (Figura 10).
Quatro foram os isolados de K. pneumoniae do ano de 2015, sendo três desses isolados
de origem ambiental, pertencentes ao perfil clonal A por PFGE e distribuídos entre dois dos
12 leitos/coletas (leitos 01 e 02) avaliadas nesse estudo: isolados Kp_126, Kp_122 e Kp_104.
Um único isolado de K. pneumoniae foi recuperado da hemocultura no ano de 2015, sendo
esse classificado pelo perfil de PFGE como clone D, distinto dos isolados do ambiente
(Figura 10).
Para avaliar a possivel relação de clones de K. pneumoniae isolados da superfície com
aquelas cepas associadas às ICSs, foram incluídos mais 9 isolados recuperados de
hemoculturas de pacientes dessa UTI no ano de 2014, uma vez que durante o estudo um único
isolado clínico da espécie foi recuperado em 2015. O isolado Kp_92, oriundo de hemocultura
de paciente do leito 11, foi agrupado no mesmo perfil clonal de dois isolados de K.
pneumonaie de hemoculturas coletadas de pacientes dessa UTI em 2014: Kp_11 e Kp_05.
Enquanto que a maioria dos demais isolados clínicos de K. pneumoniae pertenciam aos perfis
clonais B (4 isolados) e C (2 isolados) e; um único isolado do clone E (Figura 10)
Para a avaliação dos mecanismos de resistência aos carbapenêmicos, o teste CarbaNP
Enterobacteriaceae foi realizado para a pesquisa da produção de enzimas β-lactamases do
tipo carbapenemase pelos 13 isolados de K. pneumoniae, incluindo aqueles oriundos das
coletas de hemoculturas realizadas no ano de 2014 na UTI de estudo. A resistência aos
carbapenêmicos (imipenem e meropenem) e a produção de carbapenemase foi detectada entre
isolados dos perfis D e E, sendo a presença do gene blaKPC-2, que codifica para a
carbapenemase KPC-2, observada entre esses isolados (Figura 11). Nenhum dos isolados de
K. pneumoniae oriundos das superfícies hospitalares analisadas apresentou positividade para a
produção desta enzima capaz de ser detectada pelo teste.
74
Figura 10 - Padrões de PFGE, genes de resistência, CarbaNP e perfil de resistência observados em Klebsiella pneumoniae
Fonte: O autor. Legenda: ID - identificação; ◊ - cepa de Klebsiella pneumoniae ATCC® 13883; PFGE - agrupamento pela técnica de PFGE; ND - não determinado; GE - grade esquerda; GD - grade direita; HC - hemocultura; MIC - concentração inibitória mínima; CRO - ceftriaxona; CAZ - ceftazidima; FEP - cefepime; IPM - imipenem; MEM - meropenem; CIP - ciprofloxacina; LVX - levofloxacina; AMK - amicacina; GEN - gentamicina; PMB - polimixina B. Diferentes cores foram utilizadas para cada leito a fim de facilitar a leitura.
75
Figura 11 - Eletroforese dos produtos de PCR com oligonucleotídeos KPC-F e KPC-R em Klebsiella pneumoniae
Fonte: O autor. Legenda: L – Marcador de peso molecular; C+ - controle positivo; C- - controle negativo; 01, 05, 11 e 92 - isolados testados.
O isolado Kp_126, apesar de apresentar alto grau de resistência aos carbapenêmicos,
com MIC para imipenem e meropenem de ≥ 64 µg/mL, foi negativo para a produção de
carbapenemase pelo teste de hidrólise enzimática do imipenem (CarbaNP
Enterobacteriaceae), indicando a presença de mecanismos não-enzimáticos associados à
resistência aos antibióticos carbapenêmicos nesse isolado (Figura 10 e Figura 12).
Figura 12 - Teste CarbaNP Enterobacteriaceae: Detecção de carbapenemase em Klebsiella pneumoniae
Fonte: O autor. Legenda: Colunas 1, 5 e 9 – solução contendo vermelho de fenol 0,5% + ZnSO4; Colunas 2, 6 e 10 – solução contendo vermelho de fenol 0,5% + ZnSO4 + imipenem; Colunas 3, 7 e 11 – solução contendo vermelho de fenol 0,5% + imipenem + EDTA; Poços A1/A2/A3 - controle das soluções sem o lisado bacteriano; Poços B1/B2/B3 a F5/F6/F7 - isolados testados; Poços G5/G6/G7 - controle negativo do lisado bacteriano (ATCC® 25922); Poços H5/H6/H7 - controle positivo para produção de carbapenemase (cepa Kp13 produtora de KPC-2); Poços A9/A10/A11 - controle positivo para produção de metalo-β-lactamase (cepa FL_C262 produtora de NDM-1). Nota: Foto após 2 horas de incubação a 37 °C.
76
A presença dos genes blaOXA-23-like, blaOXA-24-like, blaOXA-51-like, blaOXA-58-like, blaOXA-143-
like, blaBKC e blaPER-1 não foi detectada entre isolados dessa espécie, assim como, não foi
detectada a produção de metalo-β-lactamase ou presença de genes que as codificam.
A resistência às cefalosporinas ceftriaxona, ceftazidima e cefepime, foi observada em
todos os isolados de K. pneumoniae avaliados, incluindo aqueles oriundos de hemocultura
isolados em 2014.
Uma elevada resistência às fluoroquinolonas foi observada. Doze isolados (12/13;
92,3%) apresentaram MIC de ciprofloxacina ≥ 32 µg/mL. E, nove isolados (9/13; 69,2%)
apresentaram MIC ≥ 16 µg/mL para levofloxacina, sendo 3 dos 4 isolados sensíveis à
levofloxacina pertencentes ao clone D, que agrupa os isolados produtores de carbapenemase e
resistentes aos carbapenêmicos.
A resistência à gentamicina foi observada em 69,2% (9/13 isolados), enquanto que a
totalidade dos isolados de K. pneumoniae permaneceram sensíveis à amicacina, exibindo um
MIC para esse antimicrobiano ≤ 16 µg/mL.
A resistência à polimixina B foi observada em cinco isolados de K. pneumoniae
(38,4%) de acordo com os critérios estabelecidos pelo EUCAST (MIC > 2 µg/mL), com
MICs iguais a 4 µg/mL. A pesquisa do gene mcr-1 nesses isolados não apresentou resultado
positivo em PCR.
O perfil de sensibilidade dos isolados de K.pneumoniae aos principais antimicrobianos
avaliados e os genes de resistência aos antimicrobianos detectados para cada um dos isolados
encontram-se apresentados na Figura 10.
77
6 DISCUSSÃO
Diversos estudos têm reportado a importância que o ambiente hospitalar exerce no
contexto das IRAS, atuando como reservatório de importantes patógenos multirresistentes e
comumente associados a infecções hospitalares. As principais formas de contaminação
cruzada no ambiente hospitalar ocorrem durante a assistência aos pacientes por meio de
superfícies hospitalares contaminadas, equipamentos médicos compartilhados entre os
diversos pacientes e, sobretudo, pelas mãos dos profissionais de saúde, uma vez que estes
estão em frequente contato com as superfícies ambientais do leito nos momentos de
assistência ao paciente (DANCER, 2004; HUSLAGE et al., 2010; LIVSHIZ-RIVEN et al.,
2015; WEBER; RUTALA, 2013).
Visando o controle e redução das infecções hospitalares, estudos realizados em hospitais
de Carolina do Norte (EUA) determinaram, a partir de análises observacionais baseada na
frequência de contato, as superfícies hospitalares mais frequentemente manipuladas/tocadas
pelos profissionais de saúde. As cinco principais superfícies identificadas como mais
manipuladas foram as grades e superfícies das camas, o carro de suprimentos, a mesa de apoio
localizada na cabeceira das camas e a bomba de infusão, indicando tais superfícies como
possíveis reservatórios e transmissores de patógenos associados às IRAS (HUSLAGE et al.,
2010).
Em nosso estudo, os resultados demonstraram contaminação das diversas superfícies e
equipamentos analisados por diferentes espécies bacterianas. No ambiente hospitalar,
bactérias Gram positivas e Gram negativas presentes em superfícies inanimadas secas e
equipamentos podem persistir viáveis por meses, tornando-os potenciais reservatórios de
microrganismos e possibilitando a colonização e infecção de pacientes por processos de
contaminação cruzada (KRAMER; SCHWEBKE; KAMPF, 2006; PREVISDOMINI et al.,
2012).
Diversos fatores estão associados aos diferentes períodos de persistência destes
microrganismos em ambiente hospitalar, tais como temperatura, umidade, a composição do
material inanimado, intensidade de limpeza e produtos utilizados na higienização de
superfícies e fatores associados ao próprio microrganismo, como, por exemplo, a capacidade
de formação de biofilme (BOYCE, 2007; ESPINAL; MARTÍ; VILA, 2012; KRAMER;
SCHWEBKE; KAMPF, 2006).
A ocorrência de contaminação por bactérias Gram positivas e Gram negativas nas
diferentes superfícies e equipamentos analisados corroboram o descrito por Tajeddin e
78
colaboradores (2016), no qual 60,7% e 39,3% dos isolados corresponderam a Gram positivos
e Gram negativos, respectivamente. Além disso, espécies semelhantes foram observadas neste
estudo em comparação com o descrito por Rocha e colaboradores (2015a) em pesquisa que
avaliou bactérias ambientais presentes em superfícies hospitalares em UTI de um hospital da
cidade de Caruaru-PE no ano de 2013, bem como com estudos realizados em demais
localidades do Brasil (FERREIRA et al., 2011; OLIVEIRA; DAMASCENO, 2010).
Em relação às Gram negativas, a maior ocorrência de Acinetobacter baumannii pode
decorrer de sua maior versatilidade nutricional e metabólica e capacidade de formação de
biofilme bacteriano, podendo permanecer ativas durante meses no ambiente (ESPINAL;
MARTÍ; VILA, 2012). Apesar da existência de diversos estudos associarem a espécie como
agente causadora de IRAS (ALLEGRANZI et al., 2011; CIESLINSKI et al., 2013; DETTORI
et al., 2014) ainda há escassez de dados no que se diz respeito à ocorrência desta bactéria em
superfícies e equipamentos hospitalares no Brasil. Além do mais, a comparação da ocorrência
destes microrganismos torna-se muitas vezes imprecisa devido aos diferentes métodos de
seleção de amostras e detecção.
Em nosso estudo, a maioria dos isolados de A. baumannii ambientais foi obtida a partir
das grades das camas. Resultados semelhantes foram observados em estudos previamente
realizados em hospital da cidade de Caruaru (ROCHA et al., 2015a) e em Miami (SHIMOSE
et al., 2016), no qual, neste último, 28 isolados de A. baumannii - com resistência aos
carbapenêmicos (19,4%) encontraram-se presentes nestas superfícies, além de serem isolados
a partir de amostras do ar (13,1%), ventiladores (9,4%), bombas de infusão (4,6%) e em
mesas de apoio (4,6%).
Em relação aos isolados clínicos obtidos a partir de hemoculturas no ano de 2015,
apenas um isolado Gram negativo pertencente à família Enterobacteriaceae foi isolado, sendo
observada uma maior ocorrência de microrganismos Gram positivos.
Embora as enterobactérias sejam consideradas os principais agentes causadores de
infecções da corrente sanguínea (CALLEFI; MEDEIROS; FURTADO, 2013), a
epidemiologia e o perfil de resistência de microrganismos associados a estas infecções varia
entre as diferentes instituições hospitalares em função de fatores atribuídos ao paciente,
ambiente ou ao agente infeccioso, tais como condições ambientais e de higiene inadequadas,
infraestrutura deficiente, superlotações e tempo de permanência em UTIs, escassez de
conhecimento e aplicação de medidas básicas de controle de infecção, uso inapropriado e
prolongado de dispositivos venosos, doença de base do paciente, antibioticoterapia
79
empregada, estados de imunodepressão, virulência do agente infeccioso, dentre outros
(ALLEGRANZI et al., 2011; PINHEIRO, 2014).
Em relação a A. baumannii, foram observadas elevada resistência à ceftriaxona,
ceftazidima e cefepime. A resistência a estas oximino-cefalosporinas é comumente associada
à hiperexpressão de enzimas do tipo AmpC-β-lactamases, intrinsecamente produzidas por
estes isolados e ocasionalmente associadas ao elemento de inserção ISAba1, que carregam
regiões promotoras fortes que dirigem a transcrição gênica do blaAmpC (JACOBY, 2009;
JEON et al., 2014).
A análise do genoma dos principais representantes de A. baumannii revelou a presença
de substituições de aminoácidos na sequência predita para a enzima ADC dentre os isolados
analisados. A análise do contexto genético do ADC nestes isolados evidenciou também a
presença do elemento de inserção ISAba1 adjacente a este gene em alguns dos isolados
avaliados, atentando para a possível vantagem que esse evento pode acarretar ao
desenvolvimento de resistência aos β-lactâmicos e no estabelecimento dessas cepas no
ambiente hospitalar.
A variante enzimática ADC-68 (carbapenemase) apresenta 98% de identidade com a
sequência de aminoácidos da variante ADC-1 (não carbapenemase) (JEON et al., 2014) e,
interessantemente, as principais substituições de aminoácidos implicadas com a ampliação da
capacidade hidrolítica da ADC-68 em relação aos demais β-lactâmicos (incluindo os
carbapenêmicos) foram também observadas nas ADCs identificadas em isolados de nosso
estudo.
A expressão de enzimas do tipo TEM-β-lactamases e PER-1 também é fortemente
associada à resistência a penicilinas, cefalosporinas e antibióticos relacionados, sendo
frequentemente encontradas em ambientes hospitalares (MAURYA et al., 2015;
SALVERDA; VISSER; BARLOW, 2010). Até o ano de 2010, mais de 170 variantes de TEM
haviam sido descritas, apresentando alterações entre 1 a 5 aminoácidos em sua sequência e
conferindo diferentes fenótipos de resistência a estas drogas. No entanto, a variante TEM-1,
observada em nosso estudo, é capaz de conferir resistência apenas frente às penicilinas e
cefalosporinas de primeira geração (SALVERDA; VISSER; BARLOW, 2010).
A resistência aos carbapenêmicos, observada em 100% dos isolados avaliados no
presente estudo, tem crescido nas últimas décadas em função das dificuldades enfrentadas na
administração e tratamento antimicrobiano eficaz (EVANS; HAMOUDA; AMYES, 2013),
estando relacionadas, além das cefalosporinases cromossomais, às bombas de efluxo,
modificações do sítio-alvo do antimicrobiano e deficiência de porinas (ABBOTT et al., 2013;
80
JEON et al., 2014), sendo também associadas à hiperexpressão de genes de β-lactamases de
classe D, como blaOXA-23-like, blaOXA-24-like, blaOXA-51-like e blaOXA-143-like., sobretudo quando
associadas ao elemento de inserção ISAba1 (EVANS; HAMOUDA; AMYES, 2013; SARI;
BIÇMEN; GÜLAY, 2013; TURTON et al., 2006).
A análise do contexto genético das oxacilinases cromossomais e adquiridas evidenciou
a associação do elemento de inserção ISAba1 à montante ao gene blaOXA-23-like, fato o qual
pode ser suficiente para explicar a resistência a esta classe antimicrobiana nestes isolados. No
entanto, o elemento de inserção não estava associado aos demais genes codificadores de
oxacilinases, sejam estes constitutivos ou adquiridos. Resultados descritos anteriormente
subsidiam o fato de que a resistência dos demais isolados de A. baumannii deste estudo aos
carbapenêmicos seja mediada por mecanismos enzimáticos, como observado nos testes
CarbAcineto, reforçando a hipótese de que a resistência aos carbapenêmicos nestes isolados é
decorrente da expressão de carbapenemases não detectadas pelos métodos moleculares
utilizados nesse estudo.
Os genes codificadores de oxacilinases mais frequentes foram o blaOXA-51-like (intrínseco
da espécie), seguidos pelo blaOXA-23-like, blaOXA-24-like e blaOXA-143-like. O blaOXA-23-like tem sido
frequentemente descrito em isolados resistentes aos carbapenêmicos no Brasil (CHAGAS et
al., 2014; CIESLINSKI et al., 2013) e, mais recentemente, em isolados oriundos de
superfícies inanimadas hospitalares recuperados a partir das grades das camas, lençóis,
maçanetas, interruptores e torneiras de hospital da Argélia (ZENATI et al., 2016).
O gene codificador de OXA-24-like, por sua vez, foi previamente relatado em diversos
isolados clínicos de diferentes regiões do Brasil, incluindo São Paulo, Rio Grande do Sul e
Paraná (CAVALCANTI et al., 2013; ROCHA, 2013). O presente estudo evidenciou a
presença do blaOXA-72, pertencente ao cluster blaOXA-24-like. No Brasil, este gene foi descrito em
São Paulo (WERNECK et al., 2011) e mais recentemente em Recife (CAVALCANTI et al.,
2013), sendo, em ambos os casos, não relacionado ao ISAba1. A tipagem realizada a partir do
perfil de bandas obtido na técnica de clivagem do DNA genômico (PFGE) entre os
exemplares dos estudos de Werneck et al. (2011) e Cavalcanti et al. (2013) evidenciaram
relação clonal entre estes isolados, os quais apresentaram também o mesmo perfil de bandas
quando comparados com os isolados ambientais produtores de blaOXA-24-like e blaOXA-72 obtidos
em nosso estudo, atentando para uma provável disseminação clonal em Pernambuco e,
possivelmente, no país.
O blaOXA-143-like foi observado em apenas um isolado ambiental. Este gene tem sido
bastante descrito em isolados clínicos oriundos de diversas localidades do país (ANTÔNIO et
81
al., 2011; MEDEIROS; LINCOPAN, 2013; WERNECK et al., 2011), no entanto, dados
acerca de sua ocorrência em isolados ambientais de A. baumannii ainda são desconhecidos.
Em relação às fluoroquinolonas, elevadas taxas de resistência de A. baumannii à
ciprofloxacina têm sido associadas principalmente à presença de mutações espontâneas nos
genes que codificam a subunidade A da DNA girase (gyrA) e subunidade IV da
topoisomerase (parC) na Região Determinante de Resistência à Quinolonas (do inglês,
QRDR) (ARDEBILI et al., 2015). A substituição Ser-83→Leu na sequência de aminoácidos
de GyrA tem sido descrita como a principal mutação relacionada à resistência à
ciprofloxacina em isolados clínicos de Acinetobacter baumannii, sendo mais frequentemente
observada em conjunto à substituição Ser-80→Leu, presente na sequência de aminoácidos de
ParC destes isolados (LEE et al., 2005), corroborando os dados observados no presente
estudo. A substituição Ser-80→Tir em ParC em associação à substituição descrita em GyrA
também tem sido associada com altos níveis de resistência ao antibiótico, embora seja menos
frequente nestes isolados (ARDEBILI et al., 2015; LEE et al., 2005). Demais substituições de
aminoácidos relacionadas à resistência de A. baumannii aos antibióticos da classe das
fluoroquinolonas incluem: Gly-81→Cys e Glu-87→Gly na sequência de aminoácidos de
GyrA; e as substituições de Glu-84→Lys e Gly-78→Cys na sequência de aminoácidos de
ParC (HAMOUDA; AMYES, 2004), no entanto, tais substituições não foram observadas em
nossos isolados.
A resistência in vitro frente à amicacina e gentamicina nos isolados avaliados neste
estudo pode decorrer da ampla variedade de genes adquiridos codificadores de enzimas
modificadoras de grupamentos hidroxila ou amina dos aminoglicosídeos (RAMOS;
VELILLA, 2012; SHMARA et al., 2001). As sequências gênicas e de aminoácidos preditos
para estas enzimas foram identificadas nos principais representantes de cada grupo a partir da
análise do sequenciamento do genoma destes isolados. Outros possíveis mecanismos
relacionados a este fenótipo se deve à diminuição da permeabilidade da membrana externa ou
alterações do sítio-alvo enzimático, conforme previamente reportado em estudos com A.
baumannii, mas não avaliados neste estudo (MANCHANDA; SANCHAITA; SINGH, 2010;
RAMOS; VELILLA, 2012; SHMARA et al., 2001).
A análise da relação genética entre os isolados de A. baumannii demonstrou a presença
de diferentes grupos clonais no ambiente hospitalar, sendo um grupo classificado como não
tipável, considerando a técnica descrita.
A presença de diferentes isolados que apresentam o mesmo perfil de bandas de acordo
com a técnica de PFGE, bem como repertórios gênicos e perfis de resistência in vitro aos
82
antimicrobianos semelhantes entre si, localizados estes nas diferentes superfícies e diferentes
leitos analisados, sugere a disseminação de pelo menos 3 clones no ambiente hospitalar
avaliado.
O perfil clonal observado pela técnica do MLST nos isolados de A. baumannii
demonstraram que os isolados obtidos no presente estudo agruparam-se em STs e CCs
previamente associados a cepas com perfil de multirresistência relacionadas a infecções
hospitalares em diversos países (HAMMERUM et al., 2015; KARAH et al., 2012;
VILLALÓN et al., 2011; VILLAR et al., 2014) e também no Brasil (GIRLICH et al., 2014),
incluindo isolados clínicos provenientes da cidade de Recife-PE (CAVALCANTI et al.,
2016), ressaltando, apesar da baixa ocorrência desta espécie nas amostras clinicas avaliadas
nesse estudo, a importância que estes isolados possuem nas IRAS.
Em relação aos isolados de K. pneumoniae avaliados nesse estudo, foi observada
elevada resistência às cefalosporinas ceftriaxona, ceftazidima e cefepime. Perfis semelhantes
foram relatados em estudos realizados a partir de isolados oriundos de IRAS na corrente
sanguínea em crianças atendidas em hospital de Bangladesh (AKHTER et al., 2016), nos
quais Klebsiella sp. associadas a bacteremias apresentaram maior resistência à ceftriaxona, e
em isolados obtidos a partir de múltiplos sítios de infecções em hospital do Rio Grande do
Sul, onde os isolados de Klebsiella sp. apresentaram resistência à ceftazidima (WOLLHEIN,
2009), fenótipo frequentemente associado à presença de variantes das enzimas TEM e SHV.
Elevados índices de resistência à cefepime foram observados em nosso estudo quando
comparado com o descrito por Oladipo et al. (2014) em estudo realizado com isolados de
diferentes sítios de infecção em Ogbomoso (Nigéria), onde 52,94% dos isolados apresentaram
resistência ao antibiótico. No Brasil, desde 1985 tem se observado resistência a cefalosporinas
de terceira geração em enterobactérias, no entanto, apenas em 1994 foi publicado o primeiro
relato, no qual 52% dos isolados apresentaram resistência à cefepime, sendo estes resistentes
também à ceftazidima (JONES; MARSHALL, 1994; SAMPAIO; GALES, 2016).
A resistência aos carbapenêmicos imipenem e meropenem foi observada em cinco
isolados (38,5% do total para a espécie). Mecanismos enzimáticos associados a este fenótipo
foram observados em quatro isolados, conforme evidenciado no teste de CarbaNP
Enterobacteriaceae e confirmado posteriormente pela detecção da enzima KPC nestes
isolados. O isolado 126 (ambiental, oriundo da grade direita do leito 10) apresentou elevados
MICs em relação aos carbapenêmicos, no entanto, não apresentou positividade nos testes de
hidrólise enzimática, indicando que a resistência a estes antimicrobianos nessa cepa é
decorrente de outros mecanismos associados, como, por exemplo, alterações na expressão de
83
proteínas externas da membrana (OMPs) – especialmente das porinas OmpK35 e OmpK36 –,
relacionadas com a elevação do MIC para cefalosporinas e carbapenêmicos nesta espécie
(NETIKUL; KIRATISIN, 2015; TSAI et al., 2011).
A ocorrência de espécies pertencentes à família Enterobacteriaceae com resistência aos
carbapenêmicos tem aumentado ao longo dos anos em todo o mundo, sendo endêmica no
Brasil (BARTOLLETI et al., 2016; HAVILL; BOYCE; OTTER, 2014; McLAUGHLIN et al.,
2013). Dentre os principais agentes com este perfil em infecções da corrente sanguínea,
destacam-se K. pneumoniae, Enterobacter spp. e E. coli, estando associados a taxas de
mortalidade que variam de 40 a 50% (PATEL et al., 2008; WEBER et al., 2015).
Em superfícies hospitalares, a presença de enterobactérias resistentes aos
carbapenêmicos foi recentemente reportada em estudo realizado nos Estados Unidos, no qual
8,5% das superfícies avaliadas encontraram-se contaminadas, sendo os principais
reservatórios as grades das camas, pias e superfícies dos banheiros (WEBER et al., 2015). A
presença de enterobactérias resistentes aos antimicrobianos nas superfícies hospitalares, no
entanto, é observada com mais frequência quando os pacientes internados nos respectivos
leitos encontram-se colonizados ou infectados com microrganismos que apresentem esse
mesmo perfil (COCHARD et al., 2014; WEBER et al., 2015).
Em relação às fluoroquinolonas, cepas de K. pneumoniae resistentes a estes antibióticos
têm emergido na prática clínica, sendo este fenótipo associado à presença de mutações em
genes que codificam a subunidade A da DNA girase (gyrA) e subunidade IV da
topoisomerase (parC) na QRDR, à presença de proteínas do tipo Qnr – que impedem a
ligação do antibiótico ao seu sítio ativo –, à enzima Aac(6’)-lb-cr e, por fim, às bombas de
efluxo do tipo QepA e QepB – mediadas por plasmídeos –, sendo a expressão de genes qnr e
Aac(6’)-lb-cr os mais frequentes em cepas de K. pneumoniae (BRIALES et al., 2012).
Em relação aos aminoglicosídeos, a amicacina foi o antibiótico que apresentou melhores
resultados contra os isolados de K. pneumoniae. Resultados semelhantes foram descritos por
Almaghrabi e colaboradores (2014) em estudo realizado com isolados de K. pneumoniae
resistentes aos carbapenêmicos, no qual a redução da sensibilidade foi reportada em 40% e
16% dos isolados para gentamicina e amicacina, respectivamente.
Em relação aos lipopeptídeos, a resistência à polimixina B tem sido reportada em
diversos países. No Brasil, estudos evidenciam o aumento dos índices de cepas de K.
pneumoniae com este perfil de resistência, inclusive em cepas com sensibilidade reduzida aos
carbapenêmicos (BARTOLLETI et al., 2016; SAMPAIO; GALES, 2016), sendo, em nosso
estudo, esta relação observada em dois dos cinco isolados resistentes à polimixina B. A
84
resistência à polimixina B em isolados de K. pneumoniae tem sido associada à perda de
função (seja pela ruptura do gene por elementos de inserção, ou mutações que resultem na
alteração do quadro de leitura e/ou formação de códons de parada prematuros) do produto do
gene mgrB, uma proteína transmembrana que regula negativamente a expressão de sistemas
que participam da modificação do lipídeo A do LPS, resultando na diminuição da
sensibilidade às polimixinas (AIRES et al., 2016; BARTOLLETI et al., 2016; CANNATELLI
et al., 2013, 2014) e, mais recentemente, à presença do gene mcr-1 (GU et al., 2016).
A análise da relação filogenética dentre os isolados de K. pneumoniae evidenciou a
presença de cinco principais grupos clonais dentre os anos de 2014 e 2015.
O perfil A foi unicamente observado em isolados ambientais (2015), sendo encontrado
em leitos próximos entre si e apresentando relacionados perfis de resistência, atentando para
uma possível transmissão entre essas duas localidades.
Os isolados clínicos apresentaram-se mais diversificados do ponto de vista genético, nos
quais foram observados quatro diferentes perfis durante o ano de 2014.
85
7 CONCLUSÕES
a) Não foi observada relação entre as IRAS e o ambiente hospitalar no período de estudo.
Entretanto, as superfícies demonstraram ser importantes reservatórios de bactérias
resistentes aos antimicrobianos comumente utilizados na prática clínica;
b) Apesar da baixa ocorrência de A. baumannii em amostras clínicas, os isolados
ambientais da espécie agruparam-se em STs previamente reportadas como agentes de
IRAS, reforçando o papel do ambiente nas infecções;
c) A associação da ISAba-1 adjacente ao gene blaADC-like em isolados ambientais de A.
baumannii atenta para a possível vantagem adaptativa que esse evento pode acarretar
ao desenvolvimento de resistência aos β-lactâmicos;
d) Diferentes mecanismos de resistência foram detectados conferindo fenótipo de
multirresistência aos isolados bacterianos, sendo a produção enzimática o principal
mecanismo de resistência aos carbapenêmicos nos isolados de A. baumannii;
e) O principal mecanismo de resistência aos aminoglicosídeos observado nos isolados de
A. baumannii pode decorrer da expressão dos genes codificadores de enzimas
modificadoras destes antibióticos, identificados nos isolados sequenciados;
f) Ampicilina/sulbactam, levofloxacina e polimixina B apresentaram-se ativos contra
todos os isolados de A. baumannii analisados;
g) A produção de KPC foi o principal mecanismo de resistência aos β-lactâmicos
observados nos isolados de K. pneumoniae.
86
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APÊNDICE A - Condições de termociclagem da reação em cadeia da polimerase para
cada oligonucleotídeo iniciador
Quadro 1 - Condições de termociclagem da reação em cadeia da polimerase para cada oligonucleotído iniciador.
Fonte: O autor. Legenda: D - desnaturação; A - anelamento; E - extensão; pb - pares de bases.
Oligonucleotídeos Tamanho do produto Condições de termociclagem
OXA-23-like OXA-24-like OXA-51-like OXA-58-like OXA-143-like
501 pb 246 pb 353 pb 599 pb 149 pb
D: 94 °C por 5 minutos D: 94 °C por 45 segundos A: 52 °C por 45 segundos 30 ciclos E: 72 °C por 1 minuto E: 72 °C por 6 minutos
VIM IMP SPM NDM
382 pb 188 pb 674 pb 754 pb
D: 94 °C por 5 minutos D: 94 °C por 45 segundos A: 53 °C por 45 segundos 30 ciclos E: 72 °C por 30 segundos E: 72 °C por 5 minutos
PER-1 925 pb
D: 94 °C por 5 minutos D: 94 °C por 1 minuto A: 50 °C por 1 minuto 30 ciclos E: 72 °C por 45 segundos E: 72 °C por 7 minutos
KPC 762 pb
D: 94 °C por 5 minutos D: 94 °C por 45 segundos A: 53 °C por 45 segundos 30 ciclos E: 72 °C por 45 segundos E: 72 °C por 5 minutos
BKC 513 pb
D: 94 °C por 5 minutos D: 94 °C por 45 segundos A: 60 °C por 45 segundos 30 ciclos E: 72 °C por 45 segundos E: 72 °C por 5 minutos
MCR-1 308 pb
D: 94 °C por 15 minutos D: 94 °C por 30 segundos A: 58 °C por 1,5 minutos 30 ciclos E: 72 °C por 1 minuto E: 72 °C por 10 minutos
ISAba-1 451 pb
D: 94 °C por 5 minutos D: 94 °C por 45 segundos A: 53 °C por 45 segundos 30 ciclos E: 72 °C por 45 segundos E: 72 °C por 5 minutos
107
APÊNDICE B - Estatísticas decorrentes da montagem dos genomas de Acinetobacter
baumannii utilizando o algoritmo SPAdes
Tabela 1 - Estatísticas decorrentes da montagem dos genomas de Acinetobacter baumannii utilizando o
algoritmo SPAdes.
Parâmetros Isolado Ab_07
Isolado Ab_107
Isolado Ab_112
Isolado Ab_124
N° de sequências 324 258 223 113
N° de sequências (>1000pb) 271 215 184 89
Maior sequência 93.036 109.142 123.012 270.802
Total de bases montadas 3.882.986 4.091.567 3.838.209 3.868.183
Total de bases montadas (>1000pb) 3.843.769 4.062.300 3.811.980 3.851.454
N50 (Tamanho da sequência mais curta em 50% do genoma) 27.291 35.758 36.679 113.723
Conteúdo GC (%) 39.28 39.04 39.18 39.05
Fonte: O autor.
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ANEXO A - Parecer 1.061.201 do Comitê de Ética em Pesquisa
109