fundamento teórico de la detección de microorganismos en ... teórico.pdf · estas capas se...
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Fundamento Teórico de la Detección de Microorganismos en Alimentos por la Técnica de
Impedancia Eléctrica
TECNICAS MICROBIOLOGIA RAPIDA
• IMPEDANCIA ELECTRICA• ATP-LUMINISCENCIA• INMUNOENSAYOS• SONDAS ADN/PCR
MICROBIOLOGIA CLASICA
Criterios Deseables en un Método de microbiología Rápida
•• RRáápidopido•• Respaldado y/o Validado por Normas Respaldado y/o Validado por Normas
Oficiales y ValidacionesOficiales y Validaciones•• Bajo Coste por MuestraBajo Coste por Muestra•• Registro Informatizado de DatosRegistro Informatizado de Datos
• FUNDAMENTO:– Cambios en los parámetros de Conductividad Eléctrica
del medio de Cultivo (Caldo), debidos al Metabolismo microbiano.
– Los Parámetros a medir pueden ser.• Conductividad del medio• Capacitancia del Medio• Sistema IS “Sy-Lab”: Doble Medida:
– Impedancia del Medio y del Electrodo– Medios de Cultivo similares a los clásicos: Medios
Específicos o de Recuentos Totales
Impedancia ElImpedancia Elééctricactrica
SySy--LabLab BacTrac 4300
Impedancia elImpedancia elééctrica DIRECTActrica DIRECTA
Medio de cultivo en contacto directo con los electrodos.Medio de cultivo en contacto directo con los electrodos.
Impedancia elImpedancia elééctrica del Medioctrica del Medio
medio cultivo
resistenciaresistencia
++__
Fuente elFuente elééctricactrica Impedancia = Resistencia Impedancia = Resistencia total en un medio ltotal en un medio lííquido quido conductor.conductor.
El metabolismo de los El metabolismo de los microorganismos actmicroorganismos actúúa a como un catalizador que como un catalizador que transforma moltransforma molééculas culas grandes neutras o con grandes neutras o con poca polaridad, en poca polaridad, en molmolééculas pequeculas pequeññas con as con carga elcarga elééctrica o alta ctrica o alta polaridadpolaridad
(ZM)
(ZE)
Impedancia elImpedancia elééctrica DIRECTActrica DIRECTA
VisualizaciVisualizacióón de resultadosn de resultados
42 6 8 10 12 Tiempo detección (horas)
5
10
15
-15
-10
-5
% M
Impedancia elImpedancia elééctrica del Electrodoctrica del Electrodo
+
_+
+ -
+ -
+ -+ -
+ -
+
+ -
Sobre los electrodos se forman capas iSobre los electrodos se forman capas ióónicas de carga elnicas de carga elééctrica ctrica alternativamente opuestaalternativamente opuestaEstas capas se mantienen en equilibrio estacionario con la Estas capas se mantienen en equilibrio estacionario con la composicicomposicióón qun quíímica del medio. Pequemica del medio. Pequeññas modificaciones en el as modificaciones en el mismo, producidas por el metabolismo microbiano, inducen la mismo, producidas por el metabolismo microbiano, inducen la redistribuciredistribucióón de las capas, y una modificacin de las capas, y una modificacióón de la impedancia n de la impedancia del electrodo.del electrodo.
Impedancia elImpedancia elééctrica del Electrodoctrica del Electrodo
+
_+
+ -
+ -
+ -
+ -
+ -
-
DespuDespuéés del Crecimiento Microbiano: Se establecen nuevos s del Crecimiento Microbiano: Se establecen nuevos equilibrios iequilibrios ióónicos en el electrodo => Cambio de Impedancia del nicos en el electrodo => Cambio de Impedancia del Electrodo.Electrodo.
+ -42 6 8
5
10
15
-15
-10
-5
% E% E% M% M
+ -
Impedancia ElImpedancia Elééctricactrica
Bacterias AerBacterias Aeróóbicasbicas
DiferenciaciDiferenciacióón por morfologn por morfologíía colonial de a colonial de bacterias procedentes del agua de enjuague bacterias procedentes del agua de enjuague de botellas (3)de botellas (3)
CalibraciCalibracióón Bacterias Aern Bacterias Aeróóbicasbicas
y = -1,5558x + 16,14R2 = 0,9983
0
2
4
6
8
10
12
14
16
0 2 4 6 8 10
log (cfu)
tem
ps d
etec
ció
(h)
,,
RR22= 0,9983= 0,9983cfu log (cfu) tiempo
1 0 16,142 0,30103 15,671663 0,477121 15,397695 0,69897 15,05254
10 1 14,584220 1,30103 14,1158630 1,477121 13,8418940 1,60206 13,6475250 1,69897 13,4967460 1,778151 13,3735570 1,845098 13,269480 1,90309 13,1791790 1,954243 13,09959
100 2 13,02841000 3 11,4726
10000 4 9,9168100000 5 8,361
1000000 6 6,8052
MMéétodo INDIRECTOtodo INDIRECTO
Aprovechamos la producciAprovechamos la produccióón de COn de CO22 por parte de las por parte de las levaduras como medida indirecta de actividad levaduras como medida indirecta de actividad metabmetabóólicalica
2KOH 2KOH 2K2K++ 2OH2OH--
2OH2OH--COCO22 COCO33--22 HH22O O
COCO33--22 2K2K++ COCO33KK22
++
++
++
++
procedente de bacterias o levadurasprocedente de bacterias o levaduras
Impedancia elImpedancia elééctrica INDIRECTActrica INDIRECTA
SoluciSolucióón de KOH en contacto directo con los electrodos. n de KOH en contacto directo con los electrodos. Medio de cultivo en celda interna.Medio de cultivo en celda interna.
MMéétodo INDIRECTOtodo INDIRECTO
VisualizaciVisualizacióón de resultadosn de resultados
42 6 8 10 12Tiempo detección (horas)5
10
15
-15
-10
-5
%(M0-M’)
CalibraciCalibracióón Levadurasn Levaduras
Curvas de calibraciCurvas de calibracióón tanto para n tanto para S.cerevisiaeS.cerevisiae como para como para S.bayanus S.bayanus
Saccharomyces cerevisiaeSaccharomyces cerevisiae Saccharomyces bayanusSaccharomyces bayanus
Solapamiento de datosSolapamiento de datos
CalibraciCalibracióón Levadurasn Levaduras
y = -3,4113x + 23,248R2 = 0,9908
0
5
10
15
20
25
0 2 4 6 8
lo g (cfu)
Buena correlaciBuena correlacióón de resultadosn de resultados con con placa Rplaca R22=,9908=,9908
cfu log (cfu) horas1 0 23,2482 0,30103 22,22113 0,477121 21,62045 0,69897 20,8636
10 1 19,836720 1,30103 18,809830 1,477121 18,209140 1,60206 17,7828950 1,69897 17,452360 1,778151 17,1821970 1,845098 16,9538280 1,90309 16,7559990 1,954243 16,58149
100 2 16,42541000 3 13,0141
10000 4 9,6028100000 5 6,1915
SySy--LabLab uTrac 4200
SySy--LabLab uTrac 4200
• Características Técnicas– Bloque de 21 Muestras.– Una sola Temperatura de Incubación.– Sólo mide Impedancia del Medio (%M)– Rango de Temperatura de Incubación: 0ºC-60ºC– Control por Ordenador Portátil Integrado.– Triple “Software”:
• Control del Bloque en Tiempo Real (Transceiver y uTrac)• Análisis de Muestras ya Evaluadas (uAssist)
– Los “Software” operan en Windows 95/98. – Sólo utiliza Celdillas Desechables.
SySy--LabLab BacTrac 4300
SySy--LabLab BacTrac 4300• Características Técnicas
– Doble Bloque de 64 Muestras (32 por Bloque)– Doble Temperatura de Incubación.– Mide Impedancia del Medio (%M) y del Electrodo
(%E). Método IS.– Rango de Temperatura de Incubación: 0ºC-60ºC– Control por PC Externo.– Doble “Software”:
• Control del Bloque en Tiempo Real (BacMonitor)• Análisis de Muestras ya Evaluadas (BacEval)
– Los “Software” operan en Windows 2000/NT. – Utiliza Celdillas Reutilizables y Desechables.– Control de hasta 12 Bloques Simultáneo.
SySy--LabLab BacTrac• Tipos de Celdillas:
– Reutilizables (Vidrio):• Directo Aeróbicos 10ml (amarillas, verdes y rojas)• Directo Anaeróbicos 10ml(gris)• Indirecto 10ml (Azul) (No Autoclavables)• Directo 100ml • Indirecto 100ml
– Desechables (Plástico):• Directo 20ml (Estériles. Electrodos Largos. Tapón Blanco)• Indirecto 20ml (5 Usos. Electrodos Cortos. Tapón Azul)
– Desechables Rellenas de Caldo Estéril:• Totales, Enterobactérias, Coliformes y Salmonella (R y S)
Viales Internos para Método Indirecto:• Reutilizables (Vidrio) 5ml• Desechables (Plástico) 7ml
Impedancia ElImpedancia ElééctricactricaSySy--LabLab BacTrac
• APLICACIONES FUNDAMENTALES:– Recuentos Aeróbicos– Recuentos Levaduras– Ausencia de Patógenos– Test de Esterilidad– Test de Conservantes y Biocidas– Test de Toxicidad
BACBAC-- TRACTRAC• Recuentos Totales Aeróbicos (Mesófilos y
Termófilos)• Mohos y Levaduras • Salmonella • Coliformes/ E. coli/ E. coli O157:H7• Enterobacterias• Staph aureus• Clostridium • Bacillus cereus• Lactobacilos• Psicrófilos• Listeria
Diferentes Modos de Medida
• Directo Impedancia del MedioAeróbicosAnaeróbicos
• Directo Impedancia del Electrodo
• Indirecto
BACBAC-- TRACTRAC• METODO DIRECTO (Aeróbicos) %M%M
–– Recuentos TotalesRecuentos Totales–– Coliformes/ E. coli/ E. coli Coliformes/ E. coli/ E. coli O157:H7 O157:H7 –– Salmonella (Selenito/Cystina)Salmonella (Selenito/Cystina)–– EnterobacteriasEnterobacterias–– Staph. aureusStaph. aureus–– LactobacilosLactobacilos–– Mohos y LevadurasMohos y Levaduras–– PsicrPsicróófilosfilos
BACBAC-- TRACTRAC
• METODO DIRECTO (Aeróbicos) %E%E
–– Salmonella (Salmonella (Rappaport VassiliadisRappaport Vassiliadis))
–– ListeriaListeria
BACBAC-- TRACTRAC
• METODO DIRECTO (Anaeróbicos) %M%M
––ClostridiumClostridium––Bacillus cereusBacillus cereus
Normas Oficiales• Alemania:
DIN 10115 Método General de Impedancia
DIN 10120 Detección de Salmonella en Alimentos
DIN 10122 Recuento de Aeróbicos Totales en Alimentos
• Francia:
AFNOR, NF V08-105 Recuento de Microorganismos en Alimentos por Impedancia
AFNOR NF V08-106 Recuento de E. coli en Moluscos – Marisco
Validación AFNOR : Detección de Enterobacterias en Leche, Leche Infantil y Productos Lácteos. Primera ValidaciPrimera Validacióón segn segúún n ISO 16140ISO 16140.
Versatilidad: Otros Test realizables con BacTrac
• Control de Puntos Críticos (ARCPC-HACCP)• Test de Sustancias Inhibidoras – Biocidas –
Conservantes• Test de Actividad Microbiana• Challenge Test (Cosméticas)• Test de Estabilidad de Producto• Respiración de Suelos – Mineralización• Toxicidad – Genotoxicidad• Detección Microorganisms generadores de
CO2, SH2 y CH4
Máxima Comodidad: Diferentes Tipos de Celdilla
• Celdilla Cristal Autoclavable• Celdilla Plástico Esteril unico
uso.• Celdilla Plástico Rellena de
Medio.• Vial Interno Relleno de Medio
CALIDAD: Servicio Técnico
• Es el Único equipo de Microbiología Rápida que se puede Calibrar y Verificar
• FUNDAMENTO:– Cambios en los parámetros de Conductividad Eléctrica
del medio de Cultivo (Caldo), debidos al Metabolismo microbiano.
– Los Parámetros a medir pueden ser.• Conductividad del medio• Capacitancia del Medio• Sistema IS “Sy-Lab”: Doble Medida:
– Impedancia del Medio y del Electrodo– Medios de Cultivo similares a los clásicos: Medios
Específicos o de Recuentos Totales
RESUMEN: RESUMEN: Impedancia ElImpedancia Elééctricactrica
Impedancia ElImpedancia Elééctricactrica– La medida se puede realizar directamente sobre el
medio de cultivo (Impedancia Directa), o sobre una segunda solución de KOH (Impedancia Indirecta). Algunos equipos son solo capaces de medir la impedancia Directa.
– Es posible, en algunos equipos, determinar y cuantificar microorganismos Aeróbicos y Anaeróbicos (usando celdillas de medida especiales).
• TIEMPO DE ENSAYO:– Entre 12 a 24 horas (excepto Listeria y Esporulantes)
• SENSIBILIDAD:– Desde 1 CFU por Muestra
Impedancia ElImpedancia Elééctricactrica• ESPECIFICIDAD:
– La indicada por los Medios de Cultivo específicos y la Temperatura de Crecimiento (al igual que en microbiología clásica).
– Los rangos de temperatura de Incubación dependerán del Sistema de Incubación:
• Agua o Aire: Entre T ambiente y 50-60ºC• Bloque Sólido: Entre –10ºC y 50-60ºC
• APLICACIONES:• Recuentos Totales (en productos con formulaciones estables)• Ausencia de Patógenos• Test de Esterilidad• Test de Biocidas y Conservantes• Test de Toxicidad
Impedancia ElImpedancia Elééctricactrica• COSTE/EQUIPO:
– Alto. Disminuye con el número de Muestras (número de bloques)
• COSTE/DETERMINACION:– Muy Bajo: El coste de los Medios de Cultivo en polvo
• INTERFERENCIAS:– Solo en Recuentos: Modificaciones en la Formulación
de los Productos (Modificaciones del Ambiente Químico)
•• METODO OFICIAL:METODO OFICIAL: Norma DIN desde el año 2000 (Alemania, Austria y Suiza)