Fundamento y utilidad de la tcnica de electroforesis deProtenas del suero

Este Esta presentacin, que se recomienda ver en modo de presentacin, muestra las nuevas funciones de PowerPoint. Estas diapositivas estn diseadas para ofrecerle excelentes ideas para las presentaciones que crear en PowerPoint 2010.

Para obtener ms plantillas de muestra, haga clic en la pestaa Archivo y despus, en la ficha Nuevo, haga clic en Plantillas de muestra.1Qu es la Electroforesis de Protenas? La electroforesis de protenas es una prueba de laboratorio basada en la separacin de protenas aplicando un campo elctrico, las diferentes protenas de la mezcla se separarn en funcin de su peso molecular.

ARNE TISELIUSBioqumico sueco Creo el primer aparato sofisticado de electroforesis en 1937.Su trabajo le vali el premio Nobel en 1948.Fue quien desarrollo el concepto de frente mvil, que mas tarde se conoci como electroforesis de zona y se uso para separar protenas en solucin.

cirrosis, hepatitis autoinmune, artritis reumtica, osteomielitis, bronquitis, leishmaniosis, lepra, leucemia, SIDA, mieloma, carcinomas, embarazo, diabetes, dao celular, infecciones agudas, desordenes renales y desnutricin. Cual es su importancia?

Los niveles obtenidos son tiles para diagnosticar gammapatias monoclonales (asociadas al cncer)y diversas patologas entre algunas: LAS PROTEINAS PLASMATICASEl plasma, a menudo no permite determinar los cambios en los niveles de las beta y gamma globulinas.El suero sanguneo es el liquido amarillo que resulta despus de formarse el coagulo sanguneo, en el estn contenidas una gran cantidad de protenas, este carece de fibringeno, fibrina y varios factores de coagulacin.

Contiene dos principales grupos de protenas: albumina y globulinas.La albumina al igual que la y globulinas son sintetizadas en el hgadoLas globulinas son producidas por linfocitos y clulas plasmticas.

1. Albumina. Principal protena del plasma humano y constituye aproximadamente el 60% de la protena plasmtica total. Trasporta atreves del torrente sanguneo muchos metabolitos, como los cidos grasos libres y la bilirrubina, tambin se unen a metales como el calcio, cobre, zinc,; y a frmacos poco solubles , transportndolos eficazmente. Ayuda a mantener la presin osmtica de la sangre 5 grupos o fracciones proteicas en la sangre, de tamao, forma y carga similares.

-1-Globulinas. En esta fraccin se incluyen -1-antitripsina, glicoprotenas y lipoprotenas de alta densidad HDL, colesterol bueno .-2-Globulinas. Haptoglobulina, que es una protena que se une a la hemoglobina libre para evitar su excrecin por los riones-2 macroglobulina (inhibidor de proteasas), ceruplasmina (protena transportadora de cobre y lipoprotenas de muy baja densidad (VLDL), entre otras.-Globulinas. Transferrina (protena transportadora del hierro), el plasminogeno y el complemento, la hemoglobina libre y las lipoprotenas de baja densidad LDL.-Globulinas. Inmunoglobulinas o anticuerpos, protenas producidas por el sistema inmune en respuesta a infecciones, reacciones alrgicas y trasplantes de rganos,. Los anticuerpos se dividen en IgA, IgE, IgD, IgM e IgG.

Valores normalesProtena total: 6.4 a 8.3 g/dLAlbmina: 3.5 a 5.0 g/dLAlfa-1 globulina: 0.1 a 0.3 g/dLAlfa-2 globulina: 0.6 a 1.0 g/dLBeta globulina: 0.7 a 1.2 g/dLGammaglobulina: 0.7 a 1.6 g/dL

Los resultados de la electroforesis de protenas sricas pueden verse afectados por: - El consumo de medicamentos como la clorpromazina, corticosteroides, isoniazida, neomicina, fenacemida, salicilatos, sulfonamidas y tolbutamida. - Uso de colorantes de contraste pueden alterar los resultados. Procedimiento 1Obtencin de Suero Sanguneo 2Agregamos SDS a la muestra 3Se calienta la muestra Dodecil sulfato de sodio

12ReaccinUsando una fuente de energa los polipptidos cargados negativamente migran haciael polo positivo en el fondo del gel.

14Patrn electrofortico de las protenas

15Valores normales de las fracciones proteicas del sueroFraccinPorcentaje con respecto a las Protenas Sricas Totales (%)Concentracin expresada en gramos por decilitro(g/dL)Albmina54.7 60.23.5 5.5 1 globulina1.6 3.60.2 -0.4 2 globulina9.4 120.5- 0.9 globulina10.9 14.50.6 1.1 globulinas10.9 19.30.7 1.7Mediante la electroforesis pueden separarse y cuantificarse un gran numero de protenas presentes en el suero sin embargo los resultados pueden verse afectados por el consumo de medicamentos como clorpromazina, neomicina, corticoesteroides, fenacemida entre otros.

Patologas detectadas por electroforesis

17AlbuminaElevacin por encima de niveles normales: deshidratacin.Disminucin por debajo de los niveles normales: malnutricin, hepatopatas como cirrosis, nefropatas, hiperhidratacion, enfermedades inflamatorias.

A-1 globulinasElevacin por encima de niveles normales: inflamaciones crnicas por ejemplo artritis reumatoide, lupus eritematoso y inflamaciones agudas.Disminucin por debajo de los niveles normales: enfisema pulmonar juvenil.

A-2 globulinaElevacin por encima de niveles normales: inflamaciones agudas y crnicas.Disminucin por debajo de los niveles normales: hemolisis, insuficiencia heptica y enfermedad de Wilson.B globulinasElevacin por encima de niveles normales: hiperlipoproteinemia.Disminucin por debajo de los niveles normales: trastorno de coagulacin congnito, malnutricin, coagulopatia de consumo.Y globulinasElevacin por encima de niveles normales: mieloma mltiple, artritis reumatoide, hiperinmunizacion, macroglobulinemia de Waldenstrom.Disminucin por debajo de los niveles normales: inmunodeficiencias secundarias y trastornos inmunolgicos congnitos.

Fundamento y utilidad de la tcnica de ELISAEste Esta presentacin, que se recomienda ver en modo de presentacin, muestra las nuevas funciones de PowerPoint. Estas diapositivas estn diseadas para ofrecerle excelentes ideas para las presentaciones que crear en PowerPoint 2010.

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DIRECTOINDIRECTOhttp://medmol.es/tecnicas/28/http://www.cultek.com/inf/otros/soluciones/Soluciones-ELISA-protocolos.pdf27Tcnicas de ELISATtulo

?Quien invento ELISA?

Peter Perlmann y Eva Engvall en la universidad de Stockholm en 1971

29La prueba sirve para detectar antgenos, anticuerpos, medicamentos drogas de abuso contaminantes qumicos y bacterianos, etc.

La interaccin antgeno-anticuerpo en el laboratoriopuede serutilizada para determinar si un paciente tiene una infeccin o una enfermedad autoinmune.

Un resultado positivo que confirma la presencia de anticuerpos no significa necesariamente que el paciente est enfermo. El cuerpo de una persona que ha estado enferma y que ya se ha recuperado, puede seguir produciendo anticuerpos. Esto originara un falso positivo.

Hay personas que producen una baja cantidad de anticuerpos, por lo que stos pueden pasar desapercibidos y no ser medidos, dando lugar a un falso negativo. Sera el caso, por ejemplo, de personas que padezcan una inmunodeficiencia, o que se encuentren en el periodo ventana de la infeccin en el momento de realizar la prueba, o que estn infectadas por una cepa extraa.La prueba es especifica, fcil para la automatizacin de robots para hacer muchas pruebas en corto tiempo, es barato.

Se emplea para la presencia de anticuerpos contra agentes virales.Se emplea para identificar la presencia de antgenos de superficie virales.Detecta anticuerpos contra bacterias

Determinacin de antgenos o marcadores tumorales para seguir su evolucin o la respuesta a tratamiento Cuantificacin de medicamentos en sangreCuantificacin de drogas en abuso

Primer pasoLos antgenos se pegan a una placa de cloruro de polivinilo o poliestireno; tambin se pueden pegar anticuerpos.1 37 2Segundo pasoSe agrega el suero o liquido problema diluido. 38 3Tercer pasoDespus de la reaccin antgeno-anticuerpo se utiliza un segundo anticuerpo, conjugado a una enzima, especifico para el isotipo del anticuerpo a cuantificar. 39 4Cuarto pasoSe agrega el sustrato cromgeno que produce un cambio de coloracin. 40 5Quinto pasoEn un espectrofotmetro se produce una lectura de absorbancia, directamente proporcional a la concentracin del analito a determinar. 41Mtodo de ELISA

Fundamento y utilidad de la tcnica de WESTERN-BLOTEste Esta presentacin, que se recomienda ver en modo de presentacin, muestra las nuevas funciones de PowerPoint. Estas diapositivas estn diseadas para ofrecerle excelentes ideas para las presentaciones que crear en PowerPoint 2010.

Para obtener ms plantillas de muestra, haga clic en la pestaa Archivo y despus, en la ficha Nuevo, haga clic en Plantillas de muestra.43Western Blot Es una tcnica analtica usada para detectar protenas especficas en una muestra determinada (una mezcla compleja de protenas, como un extracto tisular)El Western blot fue desarrollado en el laboratorio deGeorge Stark, en laUniversidad de Stanford.

Antecedentes En 1975, Edwin Southern demostr que la nitrocelulosa era capaz de capturar cidos nucleicos separados previamente por electroforesis. De esta forma, se permita el anlisis de una mezcla compleja de molculas de ADN.Existen diversas tcnicas capaces de detectar un antgeno determinado en una muestra, como la inmunoelectroforesis.La aparicin del Western no fue posible hasta la aparicin de las membranas.

Mediante una electroforesis en gel se separan las protenas atendiendo al criterio que se desee: peso molecular, estructura, hidrofobicidadLuego son transferidas a unamembrana adsorbentepara poder buscar la protena de inters conanticuerposespecficos contra ella. Finalmente, se detecta launin antgeno-anticuerpoporactividad enzimtica, fluorescenciaentre otros mtodos.

Preparacin de la muestra47MaterialesLos materiales deben estar a bajas temperaturas (~4 C) para evitar la desnaturalizacin proteica. Para separar protenas de compartimentos y orgnulos celulares es preciso combinar tcnicas mecnicas - como filtraciones y bioqumicas.

Electroforesis en GelLas protenas de la muestra sern separadas en gel en funcin de lo siguiente:Punto isoelctricoPeso molecularCarga elctrica

La electroforesis con gel mas frecuente es la de poliacrilamida con dodecil sulfato (SDS-PAGE).Provoca la eliminacin de las estructuras secundarias y terciaras de las protenas y mantiene a los polipptidos en estado desnaturalizado. Esto permitir que las protenas sean separadas en funcin del tamao.

TransferenciaPara que las protenas sean accesibles a la deteccin de anticuerpos, se les transfiere desde el gel de poliacrilamida a una membrana de nitrocelulosa o de polifluoruro de vinilideno (PVDF). Las membranas utilizadas en la prueba Western Blot se caracterizan por su capacidad de unir protenas de forma inespecfica. Membrana de NitrocelulosaEn esta membrana ocurren interacciones membrana-protena de tipo no covalente, con naturaleza hidrfoba.

Membrana de PVDFSon interacciones hidrofbicas y de dipolos.Deben ser humedecidas en metanol o etanol, debido a su alta hidrofobicidad y a la ausencia de surfactantes.

ElectrotransferenciaEste mtodo se basa en una corriente elctrica y un buffer de transferencia para llevar las protenas desde el gel hasta la membrana.

Despues de la transferencia se suele proceder a la tincin de Coomassie Brilliant Blue para comprobar que se ha transferido suficiente material proteico a la membrana.

Bloqueo

DeteccinSe comprueba la presencia en la membrana de la protena.Se emplea un anticuerpo especfico contra ella unido a enzima que, en presencia de su sustrato, catalice una reaccin colorimtrica.Proceso tradicionalmente realizado en dos pasos, aunque ahora es posible la deteccin en un nico paso.Mtodo en 2 pasos

Mtodo en

pasoRequiere un anticuerpo que reconozca al mismo tiempo la protena de inters y una "etiqueta" detectable.Se incuba de manera similar al anticuerpo primario del proceso en dos pasos, y, tras una serie de lavados, ya se puede detectar directamente.1 60AnlisisSe pueden examinar la cantidad de protenas en una muestra y comparar los niveles de presencia entre varios grupos.Tras el lavado de las sondas marcadas no unidas, se procede a la deteccin de aquellas que s se han unido a la protena de inters.ResultadosGracias.

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