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Lernaufgabe Immunbiologie Lernaufgabe zur Immunbiologie: Funktionsweise des Enzyme- L inked I mmunos orbent Assay ELISA Fachdidaktik PH Bern Dozent: Andi Meyer Eva Lehner-Heiniger 29. Oktober 2017

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  • Lernaufgabe Immunbiologie

    LernaufgabezurImmunbiologie:

    FunktionsweisedesEnzyme-LinkedImmunosorbentAssayELISA

    FachdidaktikPHBernDozent:AndiMeyerEvaLehner-Heiniger29.Oktober2017

  • Lernaufgabe Immunbiologie

    Abstract:IndervorliegendenArbeitwirdeineLernaufgabezumEnzyme-LinkedImmunosorbentAssayfürLernendedesSchwerpunktfachesBiologieundChemieimzweitenZyklus(GYM3/GYM4)beschrieben.ZielderAufgabeistes,denAblaufeinesELISAunddieverschiedenenAssay-Konzeptezuverstehen.ZudemwerdendieLernendenmitderProblematikfalscherResultate(falschpositivundfalschnegativ)vertrautgemacht.DieBeschäftigungmitdertheoretischenFunktionsweisedesAssayserfolgtanhandvonTextenundderArbeitaneinerPräsentationaufdeneigenenmobilenGerätenderLernenden(bringyourowndevice,BYOD):ZielistdieErstellungverschiedenerSchemataalsVorbereitungaufdiepraktischeDurchführungeinesAntigennachweisesinBlutprobenvonSchweinen.

    DidaktischeHinweise:

    1. EinbettungderLernaufgabeindengymnasialenUnterrichtDieLernaufgabewurdekonzipiertfürLernendemitSchwerpunktfachBiologie/Chemie.DieEinbettungindenLehrplanorientiertsichamLehrplan2017desKantonsBern.ThemaderAufgabeistderEnzyme-linkedImmunosorbentassay(ELISA),welcherindieImmunbiologiesequenzdesZyklus2(GYM3/GYM4)platziertwird.

    1.1 VerortungimLehrplan2017fürdengymnasialenBildungsgagdesKantonsBern

    AlsallgemeinesBildungszielfürdasSchwerpunktfachBiologieundChemiesollendieLernendenunteranderemzueinemvertieftenVerständnisüberdieArtdeswissenschaftlichenErkenntnisgewinnsgeführtwerden.DieEinbettungderfolgendenUnterrichtssequenzundderdarinvorgestelltenLernaufgabeindenFachlehrplanfürdenZyklus2(GYM3/GYM4)orientiertsichandenfolgendenGrobzielen:DasVerständnisüberdieZusammenhängedesmenschlichenImmunsystemsvertiefenundKenntnisseüberAnwendungenderImmunbiologievermitteln(Grobziel3.1.2).DaimSchwerpunktfachvermehrtexperiment-undmethodenorientiert(Richtziel2.1)gearbeitetwerdensoll,erfolgtmittelsderLernaufgabeexemplarischeinevertieftetheoretischeAuseinandersetzungmiteinerimmunbiologischbedeutsamenArbeitstechnik:demELISA.DabeiwirdeinerseitsdieauchfürdiemeistenanderenimmunbiologischenTestmethodenzentralespezifischeInteraktionzwischenAntigenundAntikörperbetrachtet,andererseitssollendieSuSmitderProblematikfalscher(sowohlfalschpositiverwieauchfalschnegativer)Ergebnissevertrautgemachtwerden.EinweitererwichtigerAspektistdasErkennenderWichtigkeitderDurchführungvonKontrollversuchen(Negativ-undPositiv-Kontrollen)alswesentlicheBestandteileinnaturwissenschaftlichenExperimenten.DasVerfahrenELISAwurdeausmehrerenGründengewählt:

    - Bedeutung:ImmunoAssaysstellenalltäglicheTestverfahrendar,sowohlinderForschung,derLebensmittelüberwachungalsauchindermedizinischenDiagnostik(bekanntdürftendenSuShierSchwangerschaftstestsoderauchderHIV-Testsein).

    - Modifizierbarkeit:JenachFragestellung(waswirdnachgewiesen:Antigen(Ag)oderAntikörper(Ak),Sensitivität,Verfügbarkeitvon(markierten)Antikörpern,usw.)kann/mussderAssayangepasstwerden.

    - Interdisziplinarität(allgemeinesBildungsziel:dasSchwerpunktfachschafftVerknüpfungenzwischendenzweiFachgebietenBiologieundChemie):GeradederNachweismittels

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    enzymkatalysierterReaktionbietetsichfüreineZusammenarbeitmitderChemiean(®Biokatalysatoren,Enzymkinetik).

    1.2 KontextimUnterricht:Vorkenntnisse,Lernziele

    DieLernaufgabeknüpfthierandiebereitsvermitteltenKenntnisseausderImmunbiologiean,idealerweisewirdsieineinerdenThemenblockabschliessendenDoppelstundedurchgeführt.FallsgenügendZeitvorhandenist,kannderUnterrichtüberzweiDoppellektionenerfolgen,wobeizuerstdietheoretischenGrundlagendesAssayserarbeitetwerden(Lernaufgabe)undanschliessendeinepraktischeDurchführungerfolgt(vgl.VersuchsanleitungPraktischeImmunologie).WiebeivielenanderenexperimentellenTechnikenindenBereichenZellbiologie,MolekularbiologieundImmunologieistauchbeimELISAwährenddereinzelnenArbeitsschrittenoptischnichtzuerkennen,wasaufmolekularerEbenegeschieht.UmaufdiepraktischeDurchführungdesTestsvorzubereiten,lernendieSuSanhandvonSchematadenprinzipiellenAblaufdesAssayskennen.ObwohleineVielzahlvonDarstellungenzumELISAexistiert,wirdimRahmenderLernaufgabeWertdaraufgelegt,dassdieSuSsichihreDarstellungenselbererarbeiten.ZurbesserenVergleichbarkeitderErgebnissederverschiedenenLerngruppenwerdendieeinzelnenKomponentendesTestsinderPräsentationvorgegeben.LeistungsstärkereSuSkönnendieKomponentenverändernoderdenVorgangdurchdasEinfügenvonAnimationendynamischdarstellen.AusserdemstehenZusatzaufgabenzurVerfügung,dienichtvonallenSuSgelöstwerdenmüssen.DieAufgabe6knüpftandenzuBeginngezeigtenSchwangerschaftstestan,hiererfolgtderTransferdererworbenenKenntnisseaufeinanderesimmunbiologischesTestverfahren.JenachNiveauderKlasseundzurVerfügungstehenderzeit(Zeitpuffer)kanndieserTransferauchimPlenumerfolgen.1.1.1 Vorkenntnisse:DieSuSverfügenüberfolgendeVorkenntnisse:DieGrundzügedesImmunsystemssindbekannt,dieSuSunterscheidenzwischenImmunität,undResistenz.DerAblaufvonunspezifischenundspezifischeAbwehrreaktionenwurdebesprochen.EskannzwischenhumoralerundzellulärerImmunantwortunterschiedenwerden.InsbesondereverfügendieLernendenüberKenntnissedesAufbausvonAk(AufbauausKetten,variablerBereich(Fab)mitParatopundkonstanterBereich(Fc®wichtigzurKopplungmitReaktionsgefäss)sowiederenspezifischerInteraktionmitAg(Epitop)).IdealerweisewurdenauchInfektionskrankheiten(allgemeinoderexemplarischbeispielsweiseHIV-Infektion)besprochen,dieAuseinandersetzungmitELISAkanndannkonkretamBeispielderbesprochenenInfektiondurchgeführtwerden.1.1.2 Lernziele:DieSuS…… verstehendieInteraktionvonAkundAgauchimZusammenhangmitbiologischen

    Testverfahren.… verstehendasPrinzipdesELISATests.… könnendieverschiedenenSchrittedesELISAbeschreiben.… veranschaulichenUnterschiedezwischendirektenundindirektenELISA-Protokollen.… begreifendasDesigneinesELISAalsKonsequenzderFragestellung.… habenKenntnisüberdasAuftretenvonfalschenMessergebnissen… könnenzwischenfalsch-positivenundfalsch-negativenErgebnissenunterscheiden.… verstehendieBedeutungvonKontrollexperimenteninnaturwissenschaftlichen

    Experimenten.

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    1.1.3 Bringyourowndevice(BYOD)InverschiedenenSchulenwerdenimUnterrichtvermehrtdiepersönlichenmobilenGeräte(Laptops,Tablets)anstellederSchulinformatik-Infrastruktureingesetzt.VondenLernendenwirderwartet,einGerätwelchesgewisseMindestanforderungenerfüllt,mitindenUnterrichtzubringen.DieGerätesollendaherimUnterrichtauchvielfältigeingesetztwerden.DievorliegendeLernaufgabeorientiertsichandiesermodernenAnforderunganLehrpersonenundbautdaherdieGerätederLernendenalsArbeitsmittelein.1.1.4 MassstabundBewertungDieLernaufgabegiltalserfolgreichbestanden,wenndieAufgaben1bis3sowie5vollständigundkorrektgelöstsind.DieeinzelnenDarstellungenkönnenvondenLösungsvorschlägeninderPräsentationabweichen,allerdingssolltendieLernendendengrundsätzlichenAblaufdesELISAverständlichdarstellenkönnen.DieAufgabe4istalsZusatzauftragfürschnellereSuSgedacht.BeidenAufgaben3und4bestehenzudemweitereDifferenzierungsmöglichkeitendurchdiewahlweiseDarstellungalsSandwich-Assay.DieAufgabe6dientdemTransferdeserworbenenWissensvoneinerFormeinerimmunologischenTestmethode(ELISA)aufeineandere(Immunaffinitätschromatografie)undsolldenBogenzumSchwangerschaftstestzuBeginnderUnterrichtseinheitschliessen.HierbestehtwiederumeineMöglichkeitzurAnpassungandasNiveauderganzenKlasse:diesAufgabekannalsPartnerarbeitgelöstwerdenoderimPlenumzusammenmitderLehrpersonerarbeitetwerden.DieLernaufgabewirdnichtbenotet.DasProdukt(dieschematischenDarstellungenderverschiedenenAssay-Typen)dientdenSuSalsUnterstützungbeiderDurchführungdespraktischenExperimentessowiealsVorbereitungfürdiePrüfung.ImRahmenderErgebnissicherungkönneneinzelneSuSgebetenwerden,ihreDarstellungimPlenumzupräsentieren.

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    2 UnterrichtsverlaufZeit Thema Inhalt Unterrichtsform15` Einstieg Bedeutungimmunologischer

    Testmetodenerkennen,Grundprinzip(Wechselwirkungzw.Ag–AksowieSichtbarmachungdesImmunkomplexes)verstehen.

    Experimentalvortrag:DemonstrationderWirkungsweiseeinesSchwangerschaftstests(mittelshCGausfruchtbarkeitsstimulierendemMedikament®ZusatzinfofürInteressierte:wiewirdmenschlichesProteingewonnen?Vgl.Patientinneninformation).EinführungindieLernaufgabe®dieArbeitsweisemitderPräsentationwirdvorgestellt.

    30` Lernaufgabe1.Teil FunktioneinesELISA:AufbauverschiedenerAssays(direkt/indirekt,Sandwich,kompetitiv).VerschiedeneAssay-Typen:Aufträge1bis3obligatorischAuftrag4:Zusatz

    BearbeitenderTexte:EAErstellenderSchematainnerhalbderPräsentation.VergleichmitArbeitspartner/Arbeitspartnerin.

    10` Ergebnissicherung(Zeitpuffer®dieAusführlichkeitderBesprechungrichtetsichnachderzurVerfügungstehendenZeit)

    ZusammentragenderErgebnisseimPlenum,VorstelleneinzelnerLösungsvorschläge,Diskussion

    DiskussionimPlenum

    15` Lernaufgabe2.Teil Aufträge5und6:MöglicheFehler,Unterscheidungfalschpositiv/falschnegativKontrollversucheFunktionsweise:Schwangerschaftstest

    ErstellenderGrafiken:EADiskussionundVergleich:PAAlternativ:ErarbeitenderAufgabe6imPlenum

    15` VorbereitungPraktikum

    HerstellungderBeschichtungslösung

    Praktikum:PA

    FolgendeDoppellektion:

    90` Praktikum DurchführungELISAgemässVersuchsanleitung:PraktischeImmunologie,EuropeanInitiativeforBiotechnology

    Praktikum:PA

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    2.1 Material:Einstieg:� handelsüblicherSchwangerschaftstest,

    z.B.hCGComboIDEAL� hCGausMedikamentzur

    Fruchtbarkeitssteigerung,z.B.Merional®(abgelaufeneDoseninApothekenerhältlich)

    Lernaufgabe(MaterialimAnhang):� LaptopoderTabletderSuS(vgl.1.1.3)� Text1und2sowieArbeitsaufträgepro

    Lernendem(elektronisch,ev.auchinPapierform)

    � PowerpointPräsentation,onlinebereitstellen(z.BaufDropboxoderschulinternemNetz)

    � LösungshinweiseinbeschriftetenCouverts(Auftrag1bis6)aufdemLehrerpult.EinführungPraktikum:� MaterialausTrichemELISAKit.Zusätzlich(nichtimKit):

    - H2Odest.,- pH-Elektrode- 5MNaOH- 5MHCl

    3 Anhang3.1 MaterialfürdieLernendenArbeitsmaterial:Aufträge1bis6,Text1undText2.PowerpointpräsentationfürdieSuS(ohneLösungsvorschläge)3.2 MaterialfürLehrpersonenZusätzlichesMaterial:LösungshinweisezudenAufträgen®ausgedrucktaufdemLehrerpultbereitstellen.PowerpointpräsentationfürLehrpersonen(mitLösungsvorschlägen).

    Abbildung1:PositiverSchwangerschaftstest,durchgeführtmiteeinemMedikamentzurFruchtbarkeitssteigerung(Merional®).Bild:EvaLehner

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    AllgemeineInformationen:Lernziele:NachdemBearbeitenderLernaufgabe…… erkennenSiedieBedeutungimmunologischerTestmethoden… verstehenSiedieInteraktionvonAkundAgauchimZusammenhangmitbiologischen

    Testverfahren.… verstehenSiedasPrinzipdesELISATests.… könnenSiedieverschiedenenSchrittedesELISAbeschreiben.… veranschaulichenSiedieUnterschiedezwischendirektenundindirektenELISA-Protokollen.… begreifenSiedasDesigneinesELISAalsKonsequenzderFragestellung.… habenSieKenntnisüberdasAuftretenvonfalschenMessergebnissen… könnenSiezwischenfalsch-positivenundfalsch-negativenErgebnissenunterscheiden.… verstehenSiedieBedeutungvonKontrollexperimenteninnaturwissenschaftlichen

    Experimenten.Erwartungen/Bewertung:DieLernaufgabegiltalserfolgreichbestanden,wenndieAufgaben1bis3sowie5vollständigundkorrektgelöstsind.DieAufgabe4istalsZusatzauftraggedacht,siekannfreiwilliggelöstwerden(fallsSiefrüheralserwartetfertigsind).DieAufgaben3und4könnenwahlweisealsnormaleroderSandwich-Assay(oderbeides)dargestelltwerden.DieLernaufgabewirdnichtbenotet.DasProdukt(dieschematischenDarstellungenderverschiedenenAssay-Typen)dientIhnenalsUnterstützungbeiderDurchführungdespraktischenExperimentessowiealsVorbereitungfürdiePrüfung.ImRahmenderErgebnissicherungkönnenSiegebetenwerden,ihreDarstellungimPlenumzupräsentieren.

    Arbeitsaufträge:LesenSiezuerstdenText1sorgfältigdurch.ÖffnenSieanschliessenddiePowerpoint-PräsentationunterfolgendemLink.BearbeitenSiedanachdieAufträgealsPartnerarbeit.DazuwerdendiedargestelltenSymbole(Antigen,Antikörperetc.)inderPräsentation(mehrfach)kopiertundinderDarstellungsoangeordnet,wiederAblaufdesTestverfahrensgemässText1unddenuntenstehendenAufträgenstattfindet.Auftrag1:ImTextwirdderAblaufeinesdirektenELISAbeschrieben.StellenSieinderPräsentationaufderentsprechendenFoliedenAblaufeinessolchenTestsdar.LösenSiediesenAuftragzuerstalleine,vergleichenunddiskutierenSiediebeidenLösungenanschliessendmitArbeitspartner/IhrerArbeitspartnerin.Auftrag2:DerNachweisvonAgerfolgtoftineinemSandwich-Assay:DazuwirdeinalsFängerbezeichneterAntikörperandieMikrotiterplattegebunden.StellenSiediesendirektenSandwich-AssayaufderentsprechendenFoliedar.Auftrag3:DerTestkannweitermodifiziertwerden:InfektionskrankheitenkönnenkurznachderInfektionoftnichtdirektnachgewiesenwerden,dazuwenigAntigenimKörperdesInfiziertenvorhandenist.

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    StattdessenwerdenindirektdievomErkranktengebildetenAntikörpernachgewiesen.AuchhiererfolgtderNachweismiteinemenzymgekoppeltenAntikörper.StellenSiediesenindirektenAssaydar.®FallsSieschnellfertigsind:dieserTestkannauchals„Sandwich“aufgebautwerden.ProbierenSieesaus!Auftrag4:Zusatz:DerAssaywirdhäufigkompetitivdurchgeführt.DabeikonkurrierenmarkierteundnichtmarkierteAnalytenumBindungsstellenderfixiertenBindungspartner.SkizzierenSieeinensolchenAssay.Waswirddetektiert?WelcheVorteilehatdiesesSystem?WelcheProblematikkannsichausdergleichzeitigenInkubationvonmarkierterundunmarkierterProbeergeben?LesenSienundenText2sorgfältigdurch.BearbeitenSieanschliessendinderPräsentationdieAufträge5a)und5b).LösenSiehierdieAufträgewiederzuersteinzeln,vergleichenSieanschliessendmitIhremArbeitspartner/IhrerArbeitspartnerin.BeachtenSie:- Siedürfenwählen,anhandwelchesAssay-TypsausdenAufträgen1bis3SiedieAufgabe

    erledigen.- EssindvieleunterschiedlicheLösungenmöglich,Siemüssenjeweilsnureinedarstellen.- IndenvorbereitetenFoliendürfen/müssenSieweitereElemente(z.B.Störer)einfügen.

    BeschriftenSiediese!Auftrag5:StellenSiemitdemMaterialfüreinenfreiwählbarenAssayeinerealistischeAnordnungdar,die:

    a) FalschpositiveErgebnisseergibtb) FalschnegativeErgebnisseergibt

    DiskutierenSiemitIhremArbeitspartner/IhrerArbeitspartnerin:WelchegrundsätzlichenKontrollversuchesinddurchzuführen,umfalscheErgebnissealssolchezuerkennen?Auftrag6:BeidemzuBeginngezeigtenSchwangerschaftstestliegtalsTestprinzipebenfallseineInteraktionzwischenAgundAkzugrunde.DieseTestformwirdalsImmunchromatografiebezeichnet,dadieProbeaufgrundderKapillarwirkungübereinerfestenPhaseerfolgt.DieDetetktionerfolgtmitHilfeeinesgekoppeltenFarbstoffes.AusserdemerfolgtdieKopplungdesmarkiertenDetektorsandennachzuweisendenAnalytenbereitszuBeginn(beiderAuftragungderProbe),dermarkierteImmunkomplex(resp.dermarkierteungebundeneDetektor)wandertüberdiefestePhase.WarumhatderTestzweiAnzeigefenster?WaswirdimKontrollfensterangezeigt?

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    Text1:Enzyme-linkedImmunosorbentAssayELISA

    Einleitung:

    DerNameistProgramm:UntereinemELISAverstehtmaneinTestsystem(Assay),beiwelchemeinEnzymaneinenAntikörpergeheftet(linked)ist,derNachweiserfolgtdurchimmunologischeWechselwirkungdesAnalytenmiteinemaneinReaktionsgefässgebundenen(sorbent)Reaktionspartner.DerELISA-TestisteinweitverbreitetesTestverfahren,mitdembestimmteMoleküle–Analyten–sehrsensitivdurchentsprechendeDetektorennachgewiesenwerdenkönnen.DabeiliegendemTestzweiMechanismenzuGrunde:einerseitswirdderAnalytmittelseinerspezifischenAntigen-AntikörperBindungimReaktionsgefässgebunden,andererseitswirddurcheineenzymvermitteltechemischeReaktioneininderRegelfarbiges,löslichesProduktgebildet.DieIntensitätderFarbbildungdientdabeialsMassfürdieMengedesgebundenenMoleküls.Einsatz:

    DerELISAkannsehrvielfältigeingesetztwerden,sobeispielsweiseinderForschung,derLebensmittelsicherheitoderdermedizinischenDiagnostik.DasPrinzipdesELISAwirdanhandeinerInfektionskrankheitaufgezeigt:ImVerlaufderInfektionkommteszurBildungweitererErregerunddurchdieAktivierungdesImmunsystemsbildetderPatientAntikörpergegendenErreger.DurchdieEntnahmeeinerBlutprobedesErkranktenwerdennunauchErregermoleküleund/oderAntikörperentnommen.DasSerumdesPatientenkannnundurchELISAaufdasVorkommendesErregersoderderAntikörpergegendiesengetestetwerden.BeidemNachweisvonErregermolekülen(Ag)handeltessichumeinendirektenNachweis,währenddemdieBestimmungvonAntikörperneinindirekterNachweisist.AufbaueinesELISA

    Esgibt–abhängigvonderFragestellung,dergewünschtenSensitivität,oderderVerfügbarkeitdergewünschten(markierten)AntigeneundAntikörper–unterschiedlichkonzipierteAnordnungenfüreinELISA.NachstehendwirdderAufbaufürdenNachweisdesAntigensbeschrieben(direkterELISA):DasReaktionsgefäss(meisteineMikrotiterplattemit96wells)wirdmitdemzutestendenSeruminkubiert.AufgrundvonWechselwirkungen(Van-der-WaalsKräfte)zwischendemAntigenunddemTeströhrchenhaftetdasAgimGefäss.UngebundenesMaterialwirdweggewaschen.FreieBindungsstellendeswellswerdenmiteinemBlockingreagenswieBSA(RinderserumAlbumin)besetzt.ImnächstenSchrittwirdnuneinmiteinemEnzymgekoppelterAntikörperzugegeben,derspezifischfürdasgesuchteAgist.NacheinererneutenWaschungwirddasSubstratfürdasEnzymzugegeben.FallsdasEnzymvorhandenist,katalysiertesnundieUmsetzungdesSubstratsinein(anders)farbigesProdukt.DieReaktionwirdnacheinerbestimmtenInkubationszeitgestopptunddieIntensitätderFarbentwicklunggemessen.DieAuswertungerfolgtineinemSpektralphotometer,beiVerwendungeinerStandardverdünnungsreihekönnendieProbenauchquantitativausgewertetwerden.Antikörper

    DieVerwendungspezifischerAntikörperisteinzentralerSchrittinderDurchführungvonImmunassays:DieAntikörpermüssenmöglichstspezifischseinumnichtmitanderenMolekülenzuinteragieren(Kreuzreaktion)undzugleichsolldasgesuchteMolekülauchingeringenKonzentrationennachgewiesenwerdenkönnen.ZudemmüssendieAntikörpermiteinemEnzymgekoppeltwerden.DieKopplungkannselbstdurchgeführtwerden,wasallerdingsaufwändigist.EineVielzahlbereitsmarkierterAntikörperkannbeispezialisiertenFirmenbezogenwerden.DerEinsatzgekaufterAntikörperziehtvielfacheineModifizierungdesELISAnachsich.

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    Text2:StörungenbeiImmunassaysBeiImmunassayswiedemELISAkönnenauchfalscheErgebnisseerzieltwerden.DieStöreffektediedafürverantwortlichsind,sindvielfältigerNatur.SehrhäufigtretenKreuzreaktivitäten,unspezifischeBindungenundMatrixeffekteauf.StörerkönneninmehroderwenigergrossenKonzentrationeninRealprobenvorkommenunddirektmitdenAnalytenodermitdenAntikörperninteragieren.BeiunspezifischerBindungerfolgtdieBindunganSubstanzen,dieentwederinweitaushöherenKonzentrationenalsderZielanalytvorkommenoderanOberflächen.DochesgibtaucheineganzandereUrsachevonunspezifischenBindungen.AntikörperwerdenfürdieDetektionmitEnzymengekoppelt.DadurchkannunterUmständendieAntigen-Antikörperbindungverschlechtertwerden,waszurFolgehat,dassdermarkierteAntikörperverstärktunspezifischanFremdproteine,OberflächenoderandereAntikörperbindet.Antikörperkönnengrundsätzlichkreuzreagieren:darunterverstehtmandasAusbildenvonBindungenmitanderenAntigenenalsdemAnalyten.AmwenigstendefiniertistderBegriffderMatrixeffekte.MatrixeffektesinddieSummederStöreffekteallerKomponenten,dieineinerProbevorkommenunddieMessungdesZielanalytenbeeinflussen.WenndiegenauemolekulareUrsacheeinerStörungnichtbekanntist,abermitderZusammensetzungderzuvermessendenProbeinVerbindunggebrachtwerdenkann,sprichtmanimAllgemeinenvoneinemMatrixeffekt.ZudenMatrixeffektentragenauchphysikalischchemischeBedingungenwiepH-WertoderViskositätbei.

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    Lösungshinweise:WerdendurchdieLPausgedrucktundinangeschriebenen,ev.farblichmarkiertenCouvertsaufdemLehrerpultzurVerfügunggestellt.DieLösungshinweisewerdenbewusstnichtelektronischzurVerfügunggestellt,umeinzuschnellesZugreifenaufdieHinweisezuverhindern.Auftrag1:ImTextwirdderAblaufeinesdirektenELISAbeschrieben.StellenSiemitdemzurVerfügunggestelltenMaterialdenAblaufeinessolchenTestsdar.Hinweis:DasAntigenausderProbewirdandiePlattegebunden.DerNachweiserfolgtdirektmiteinemmarkiertenAntikörper.Auftrag2:DerNachweisvonAgerfolgtoftineinemSandwich-Assay:DazuwirdeinalsFängerbezeichneterAntikörperandieMikrotiterplattegebunden.StellenSiediesendirektenSandwich-AssaymitdemMaterialdar.Hinweis:DieserAntikörperbindetdasgesuchteAntigenausderProbe.DerTestkannweitermodifiziertwerden:InfektionskrankheitenkönnenkurznachderInfektionoftnichtdirektnachgewiesenwerden,dazuwenigAntigenimKörperdesInfiziertenvorhandenist.StattdessenwirdindirektdervomErkranktengebildeteAntikörpernachgewiesen.AuchhiererfolgtderNachweismiteinemenzymgekoppeltenAntikörper.StellenSiediesenindirektenAssaydar.Hinweis:GegenwasrichtetsichderenzymgekoppelteAntikörper?Auftrag4:Zusatz:DerAssaywirdhäufigkompetitivdurchgeführt.DabeikonkurrierenmarkierteundnichtmarkierteAnalytenumBindungsstellenderfixiertenBindungspartner.SkizzierenSieeinensolchenAssay.Waswirddetektiert?WelcheVorteilehatdiesesSystem?WelcheProblematikkannsichausdergleichzeitigenInkubationvonmarkierterundunmarkierterProbeergeben?Hinweis:BindungzwischenAkundAgisteineGleichgewichtsreaktion,alssolcheabhängigvondenKonzentrationendereinzelnenParameter:KonkurrenzzwischenmarkiertemAkundunmarkiertemAkausderProbe®JemehrunmarkiertesAg,destoweniger…Detektioni.d.R.vonAgobwohlgrundsätzlichauchAknachweisbarsind.EnzymistbeiZugabederProbebereitsvorhanden®Interaktion/StörungendurchKomponenten(Proteasen,Enzyminhibitoren)ausderProbe

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    Auftrag5:StellenSiemitdemMaterialfüreinenfreiwählbarenAssayeinerealistischeAnordnungdar,die:

    a) FalschpositiveErgebnisseergibtb) FalschnegativeErgebnisseergibt

    DiskutierenSiemitIhremArbeitspartner/IhrerArbeitspartnerin:WelchegrundsätzlichenKontrollversuchesinddurchzuführen,umfalscheErgebnissealssolchezuerkennen?Hinweis:Falschpositiv:DerDetektorverbleibtinderProbe,obwohlderAnalytnichtvorhandenist.Falschnegativ:DerDetektorverbleibtnichtinderProbe,obwohlderAnalytvorhandenist.Negativ-Kontrolle:StimmtinallenPunktenmitdemAnsatzüberein,ausserdassderAnalytnichtvorhandenist®Hintergrundwert(„Rauschen“).Positiv-Kontrolle:ZugabeeinerSubstanz,diedaspositiveErgebniserzeugt.SicherstellungderkorrektenFunktionsweisedesTests.Auftrag6:BeidemzuBeginngezeigtenSchwangerschaftstestliegtalsTestprinzipebenfallseineInteraktionzwischenAgundAkzugrunde.DieseTestformwirdalsImmunchromatografiebezeichnet,dadieProbeaufgrundderKapillarwirkungübereinerfestenPhaseerfolgt.DieDetetktionerfolgtmitHilfeeinesgekoppeltenFarbstoffes.AusserdemerfolgtdieKopplungdesmarkiertenDetektorsandennachzuweisendenAnalytenbereitszuBeginn(beiderAuftragungderProbe),dermarkierteImmunkomplex(resp.dermarkierteungebundeneDetektor)wandertüberdiefestePhase.Hinweis:NachgewiesenwirdhumanesChoriongonadotropin(hCG),einHormon,daszuBeginneinerSchwangerschaftvoneinemTeilderPlazentagebildetwird,umdieSchwangerschaftaufrechtzuerhalten.hCGisteinProteinundalssolchesimAssaydasAntigen.DetektiertwirdmiteinemSandwich-Assay.DiePositiv-KontrolleerfolgtdurchInteraktionvonzweiAk:DemDetektorundeinemfixiertenAkmithCG-ähnlicherStruktur.

    4 LösungenZudenAufträgen1bis6:InderPräsentation(unterschiedlichePräsentationenfürSuSundLP!)undindenLösungshinweisen(s.o.).

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    5 QuellenCampbell,N.undReece,J.(2009):Biologie.8.,aktualisierteAuflage.Hrsg.vonKratochwil,A.,Scheibe,R.undWieczorek,H.unterMitarbeitvonDozentendesFachbereichsBiologie/ChemiederUniversitätOsnabrück.AusdemAmerikanischenvonLazar,T.,Niehaus,M.,Vogel,S.undWink,C.PearsonVerlag,München.LuttmannW.etal(2009):DerExperimentatorImmunologie.3.Auflage.SpektrumAkademischerVerlag,Heidelberg.Lottspeich,F.(1998):Bioanalytik.Hrsg.vonZorbas,H.SpektrumAkademischerVerlag,Heidelberg.TitelbildMicrotiterPlatederFirmaBeacle,aufgerufenam29.10.2017:http://beacle.com/wordpress/wp-content/uploads/2016/01/s04.jpgGymnasialerLehrplan2017desKantonsBern,FachlehrplanfürdasSchwerpunktfachBiologie/Chemie,aufgerufenam25.10.2017:http://www.erz.be.ch/erz/de/index/mittelschule/mittelschule/gymnasium/lehrplan_maturitaetsausbildung.assetref/dam/documents/ERZ/MBA/de/AMS/GYM%20LP%2017/ams_gym_lehrplan_17_biologie_und_chemie_sf.pdfVersuchsanleitung:PraktischeImmunologie,EuropeanInitiativeforBiotechnologyEducation,aufgerufenam25.10.2017:http://archiv.ipn.uni-kiel.de/eibe/UNIT08DE.PDFPatientinneninformationzuMerional,aufgerufenam26.10.2017:https://compendium.ch/mpro/mnr/24626/html/dePatientinneninformationzuhCGComboIDEAL:,abgerufenam26.20.2017:https://diatools.ch/up/prod/13_35_.pdfFoliezurprinzipiellenFunktionsweiseeinesSchwangerschaftstests:adaptiertanAbbildungauswikipedia,aufgerufenam26.10.2017:https://de.wikipedia.org/wiki/SchwangerschaftstestBiochemischesPraktikumfürBachelorBiowissenschaftenderUniversitätKiel,aufgerufenam25.10.2017:https://www.chemie.uni-kl.de/fileadmin/chemie/Dokumente/Dokumente_BC/fuer_stud/bc-skript201302BBio.pdfIDEXX,Diagnostik,aufgerufenam25.10.2017:http://www.idexx.de/livestock-poultry/elisa-technology.htmlDarstellungenzufalschenMesswerten:ImmunoassayPufferbyApplieChem,aufgerufenam26.10.2017:https://www.applichem.com/fileadmin/Broschueren/Immunoassay_Puffer_dt.pdf