Gab1 adapter fehérje eredetű, sejtmembrán permeábilis

foszfopeptidek hatása a B sejtek jelátviteli folyamataira

doktori értekezés

Készítette: Kertész Ákos

Témavezető: Prof. Sármay Gabriella, egyetemi tanár

Programvezető: Prof. Mandl József, egyetemi tanár

SOTE KKK Doktori Iskola, Molekuláris orvostudományok / Pathobiokémia

(7/2) Program

A bírálóbizottság elnöke:

Prof. Falus András, egyetemi tanár, az MTA rendes tagja

Opponensek:

Prof. Sarkadi Balázs, kutató professzor, az MTA levelező tagja

Dr. Reményi Attila, tudományos főmunkatárs, Ph.D.

Bizottsági tagok:

Prof. Enyedi Péter, egyetemi tanár, az MTA doktora

Dr. Bauer Pál, egyetemi docens, Ph.D.

Dr. Vellai Tibor, tanszékvezető, Ph.D.

Dr. Váradi András

ELTE TTK, Immunológia Tanszék

Budapest, 2008

Tartalomjegyzék

Összefoglalás 3

Summary 4

Rövidítések 6

1. Irodalmi áttekintés 7

1.1. A fehérje foszforiláció szerepe 7

1.2. Receptorok és jelátviteli folyamatok B sejtekben 9

1.2.1. A B-sejt receptor komplex (BCR) 9

1.2.2. BCR keresztkötés által indukált jelátviteli folyamatok 10

1.2.3. A koreceptorok szerepe 13

1.3. SHP2 14

1.4. PI3-K 16

1.5. A Gab adapter-fehérje 18

1.5.1. A Gab transzlokációja a membránhoz, majd ezt követő foszforilációja 19

1.5.2. A Gab fehérje szerepe a jelátvitel szabályozásában 22

Gab-SHP2 22

Gab-PI-K 24

1.6. Foszfopeptidek transzportja a citoplazmába 25

2. Célkitűzések 27

3. Anyagok és módszerek 29

3.1. A kísérletek során felhasznált pufferek és médiumok 29

3.2. A felhasznált ellenanyagok 29

3.3. A kísérletekben felhasznált szintetikus, sejtmembrán permeábilis peptidek

(CPP) szekvenciái 30

3.4. A kísérletekben felhasznált szintetikus, Gab1 fehérje eredetű peptid

szekvenciák 30

3.5. A kísérleti módszerek 31

4. Eredmények 36

4.1. Az optimális, sejt-permeábilis hordozó peptid kiválasztása 36

4.2. Az hordozó-foszfopeptid konjugátum penetrációs képességének és

toxicitásának vizsgálata 42

1

4.3. A foszfopeptidekhez kapcsolódó fehérjék azonosítása 47

4.4. A foszfopeptidek in vitro SHP2 enzim-aktivitást módosító hatása 50

4.5. A Gab1-SHP2 sejten belüli interakció gátlása a sejtmembrán permeábilis

foszfopeptidekkel 52

4.6. Az OR8-GDLDpe és az OR8-ELPNpe peptidek hatása az intracelluláris

fehérje foszforilációs mintázatra. 53

4.7. Az SHP2 szerepe az Erk foszforiláció gátlásában 59

4.8. A PI3-K függő degranuláció gátlása RBL hízósejtekben 60

4.9. Módosított peptidek alkalmazása 61

5. Megbeszélés 64

6. Következtetések 78

7. Irodalomjegyzék 79

Köszönetnyílvánítás 91

Saját közlemények jegyzéke 92

2

Összefoglalás

A fehérjék reverzibilis tirozin foszforilációja kiemelt szerepet játszik a különböző

receptorok által közvetített jelátviteli kaszkádokban. A tirozin kinázok és foszfatázok

által szabályozott aktivációs lépések végső soron a sejtek sokrétű válaszát

eredményezhetik, úgymint proliferáció, túlélés, programozott sejthalál, differenciáció

vagy migráció. Az adapter fehérjék interakciós felszínt szolgáltatnak a multimolekuláris

jelátviteli komplexek számára, ezáltal fontos szerepet játszanak a plazmamembrántól a

sejtmagba irányuló jeltovábbítás szabályozásában. A Gab1 (Grb2-associated binder 1)

adapter fehérje fontos integráló szerepet játszik a növekedési faktor, citokin és antigén

receptorok keresztkötésével megindított jelátviteli eseményekben. A ligand általi

receptor keresztkötést követően a Gab1 számos tirozinján foszforilálódik. A

foszfotirozin tartalmú motívumokhoz SH2 doménnel rendelkező fehérjék

asszociálódnak, mint például az SHP2 tirozin foszfatáz és a foszfatidilinozitol-3 kináz

(PI3-K). A Gab1/SHP2 kapcsolat lényeges szerepet játszik a sejtnövekedés

szabályozásában, míg az SHP2 és PI3-K-nak a túlélési és proliferációs szignálokban

van nélkülözhetetlen szerepe. A Gab1/SHP2 és a Gab1/PI3-K fehérje kölcsönhatások

ebből kifolyólag a tumor terápiás kutatások kiemelt célpontjaivá válhatnak.

Feltételezésünk szerint az SH2 doménekkel interakcióba lépő szintetikus

foszfopeptidek gátolhatják a fehérje-fehérje kapcsolatok kialakulását, befolyásolva

ezáltal a jelátviteli folyamatok kimenetelét. Célunk a Gab1 fehérje SH2 doménekhez

kötődő szekvenciáit reprezentáló sejtmembrán-permeábilis foszfopeptidek tervezése és

vizsgálata, amelyek szelektíven módosíthatják a B sejtek jelátvitelét, ill. végső soron

gátolni képesek a B limfociták kóros sejtburjánzását. A foszfopeptidek élő sejtbe

juttatásához az előkísérletek alapján az oktanoil zsírsavlánccal kovalensen konjugált

okta-arginin (OR8) hordozót találtuk a legalkalmasabbnak. A továbbiakban

sejtvonalakon vizsgáltuk a membrán-permeábilis peptidek ex vivo hatásait. Kimutattuk,

hogy az SHP2 foszfatázhoz kötődő, Gab1 eredetű foszfopeptid (OR8-GDLDpe)

módosította az intracelluláris fehérjék tirozin foszforilációját, és csökkentette az anti-

IgM által kiváltott Erk foszforiláció mérékét BL41 Burkitt-limfóma sejtekben. Továbbá

az OR8-GDLDpe korlátozta a BCR által indukált Gab1-SHP2 kapcsolat kialakulását. A

PI3-K kötő OR8-ELPNpe szekvencia csökkentette az anti-IgM indukált Akt

3

foszforilációt és gátolta a PI3-K függő degranulációt RBL-2H3 patkány hízósejtvonal

eredetű sejtekben.

Az eredményeink alapján úgy gondoljuk, hogy a sejtmembrán- permeábilis

foszfopeptidek gátolni képesek a Gab1/SHP2 és Gab1/PI3-K fehérje kölcsönhatások

kialakulását és ezáltal módosíthatják a proliferációs, apoptotikus és túlélési szignálokat.

Summary

Reversible phosphorylation of protein tyrosine residues plays a critical role in

signaling cascades triggered by growth factors, cytokine and antigen receptors: BCR

and TCR. These activation events controlled by the opposing activities of protein

tyrosine kinases (PTKs) and phosphatases (PTPs) eventually lead to diverse cellular

response such as proliferation, survival, apoptosis, differentiation or migration. Adaptor

proteins play important regulatory role in downstream signal transduction from the cell

membrane towards the nucleus, providing a surface to form multimolecular signaling

complex. Grb2-associated binder 1 (Gab1) is a scaffolding/adaptor protein involved in

the signal transduction pathways of growth factors, cytokines, and antigen receptors.

Gab1 adaptor protein has several tyrosine residues, which are phosphorylated upon

ligand mediated tyrosine kinase activation and binds signaling molecules with SH2

domains, such as SHP-2 tyrosine phosphatase and phosphatidyl inositol 3-kinase (PI 3-

K). Gab1/SHP-2 contact is essential for cell growth, in addition, SHP-2 and PI3-K

regulate signals leading to proliferation and cell survival, thus Gab1/SHP-2 and

Gab1/PI3-K interactions might be attractive targets for the therapy of malignant cell

growth.

We hypothesized that phosphopeptides interacting with SH2 domains may disrupt

protein-protein interaction, thereby influencing intracellular signaling. Our main goal is

to design cell membrane permeable phosphopeptides corresponding to the SH2 domain

binding sequences of Gab1 that would selectively regulate the B cell response,

ultimately inhibiting the growth of B cell tumors. In order to transport the

phosphopeptides into living cells they were conjugated to membrane-permeable carrier,

namely octanoyl-oligoarginin (OR8). With this strategy the ex vivo effect of cell

4

membrane-penetrating phosphopeptides was analyzed. We have shown that

phosphopeptides corresponding to the SHP-2 binding motif of Gab1 (OR8-GDLDpe)

modulated tyrosine phosphorylation of intracellular proteins and reduced Erk

phosphorylation triggerd by anti-IgM in BL41 Burkitt-lymphoma cell line. Furthermore,

OR8-GDLDpe attenuated the BCR induced interaction between Gab1 and SHP2. The

PI3-K binding sequence of Gab1, OR8-ELPNpe decreased the anti-IgM induced Akt

phosphorylation and inhibited the PI3-K dependent mast cell degranulation in RBL-2H3

cells.

These data suggests that the cell penetrating phosphopeptides may interfere with the

Gab1/SHP-2 and Gab1/PI3K interaction and modulate intracellular signaling leading to

cell proliferation and cell survival.

5

Rövidítések

BCR - B Cell Receptor

BLNK – B cell linker protein

Btk – Bruton’s type kinase

BTAM-Bisphosphoryl tyrosine-based activation motif

CPP – Cell Penetrating Peptides

Csk – C terminal Src Kinase

Erk – Extracellular regulated kinase

FACS – Fluorescein Activated Cell Sorter

Gab – Grb2 associated binder

ITAM – Immunreceptor Tyrosine-based Activation Motif

ITIM - Immunreceptor Tyrosine-based Inhibition Motif

LPC – Lysophosphatidylcholine

MAPK – Mitogen Activated Protein Kinase

MIRR – Multisubunite Immune Recognition Receptor

MS – Mass Spectrometry

PH – Pleckstrin Homology

PI3-K – Phosphoinositide-3 - kinase

PIP3 /PIP2 – Phosphatidylinositol Tri/Bisphosphate

PLC – Phospholipase C

PP - Phosphopeptide

PTB – Phosphotyrosine Binding

PTEN – Phosphatase and Tensin Homolog deleted on chromosome 10

PTK – Protein Tyrosine Kinase

PTP – Protein Tyrosine Phosphatase

SH2 – Src Homology 2

SHP2 – Src Homology 2 domian containing Protein Tyrosine Phosphatase

SPR – Surface Plasmon Resonance

TCR – T Cell Receptor

6

1.) Irodalmi áttekintés

1.1. A fehérje-foszforiláció szerepe

A sejtélettani folyamatok egyik legáltalánosabb és egyben legfontosabb reverzibilis

szabályozási módja a fehérje-foszforiláció folyamata. Emlős sejteken végzett 32P

foszfor-izotópos vizsgálatok alapján a celluláris fehérjék mintegy harmadánál jellemző

e transzlációt követő kovalens módosítás. A kinázok által katlizált foszforiláció, ill. az

ellentétes szerepű foszfatázok által irányított defoszforiláció lényeges szerepet játszik a

növekedés és differenciáció szabályozásában, a sejtciklus, az alakváltozás, a

metabolizmus, az apoptózis, a transzkripció kontroljában és az intracelluláris jelátvitel

szabályozásában1,2.

A fehérjék foszforilációja túlnyomó többségben a szerin és treonin aminosavak

oldalláncain történik. A tirozin foszforilációja mindössze néhány százalékot tesz ki a

teljes fehérje-foszforilációs mintázatban, szerepe mégis kiemelt jelentőséggel bír,

ugyanis mintegy tíz százalékos eltérés a normál, egyensúlyi értéktől elegendő lehet a

sejt rosszindulatú transzformációjának megindításában ill. egyéb kóros működés

kialakításában3,4,9.

Számos receptor maga is rendelkezik fehérje tirozin kináz (PTK) aktivitással, mint

pl. az EGFR, PDGF növekedési receptorok vagy különböző citokin receptorok, míg

más receptorok citoplazmatikus PTK-okat toboroznak a közelükbe a jeltovábbítás során.

Ide tartoznak a több alegységből álló MIRR család receptorai a BCR, TCR ill. Fc-

receptorok. A sejtfelszíni receptorhoz történő ligandum kötődését követően a

receptorok, ill. a receptorhoz asszociált PTK-ok tirozin foszforilációja egy jelátviteli

kaszkádot indít meg. Az összetett jelpályák iránya a sejtmembrántól a sejtmagba vezet,

és a génátírást követően a jel minőségétől függő diverz sejtválasz alakul ki, amely lehet

differenciáció, prolifráció, apoptózis, motilitás változás stb5.

A tirozin foszforiláció egyrészt a molekulák konformációjának megváltoztatásával,

másrészt SH2, illetve PTB domént hordozó fehérjék toborzásával és intracelluláris

irányításával fejti ki szabályzó szerepét a jelátviteli folyamatokban. Az SH2 és PTB

domének olyan fehérjemodulok, melyek szelektíven képesek kapcsolódni foszforilált

tirozint tartalmazó peptidszekvenciákhoz. A mintegy 100 humán SH2 gén termékei

különböző osztályba tartozó foszfotirozin ligandumokhoz asszociálódnak. A kötődés

7

affinitásában és szelektivitásában a tirozint körülvevő amiosavak játszanak szerepet,

ezek közül is kiemelt jelentőséggel bír a C-terminálisan 3-as pozícióban elhelyezkedő

aminosav minősége (Yxx?)6,7.

Számos PTK játszik stimuláló szerepet a proliferációs jelpályákban, így a tirozin

kinázok gyakran válnak az onkogenikus mutációk célpontjává humán tumorok esetében.

Példa erre az emberben először azonosított proto-onkogén termék, az Src tirozin kináz.

Egészséges sejtben a vad típusú Src kináz 527-es foszforilált tirozinja intramolekuláris

kapcsolatot alakít ki a fehérje saját, SH2 doménjével, gátolva ezáltal az enzim

katalitikus aktivitását, míg mutált onkogén termék esetében hiányzik az 527-es gátló

tirozin, aminek következtében a kináz konstitutíven aktív8,9. Emellett meg kell jegyezni,

hogy szerin-treonin kinázok (Raf) ill. más jelátviteli molekulák, pl. G-fehérjék (Ras) is

protoonkogén termékek.

A foszfatázoknak konvencionálisan a kinázokkal ellentétes hatást tulajdonítanak,

többek között a proliferációs szignál csendesítésében játszanak szerepet, ezáltal egyes

foszfatázok tumor szupresszor hatásúak. Számos esetben ez már bizonyítást is nyert, pl.

a receptor típusú fehérje tirozin foszfatáz (PTP), Dep-1 overexpressziós kísérletekben

tumor szupresszor hatásúnak bizonyult, ill. a PTEN lipid foszfatáz esetében, amely a

PI3-K aktivációs utat gátolja10. Más PTP-k esszenciális szerepet játszanak a proliferáció

és/vagy túlélés pozitív szabályozásában. A PTPN11 volt az első leírt proto-onkogén,

1.1.ábra Az SHP2 mutációk okozta különböző megbetegedések.

8

melynek a terméke az SHP2 tirozin foszfatáz, és konstitutívan aktív mutált formája

szerepet játszik a gyermekkori leukémia, a Noonan-szindróma, Leopárd szindróma és

más fejlődési rendellenességek kialakulásában (1.1.ábra).

A mutáció hatására megszűnik az N-terminális SH2 domén és a foszfatáz doménben

található foszfotirozin közötti inhibíciós kölcsönhatás, amely következtében

folyamatosan aktív konformációt vesz fel az SHP2, ami a továbbiakban kóros

elváltozásokhoz vezet11,12.

A fent említett tények miatt a foszforilációs eseményekben szerepet játszó proto-

onkogén termékek mára a tumorterápiás kutatások kiemelt célpontjaivá váltak.

1.2. Receptorok és jelátviteli folyamatok B sejtekben.

1.2.1. A B-sejt receptor komplex (BCR) A B limfociták antigén-receptoron keresztül közvetített jelátviteli folyamatai

különböző módon befolyásolhatják a perifériára került B-sejtek sorsát. A BCR által

közvetített tonikus jelek ill. a BCR-antigén kölcsönhatás a körülményektől függően a

sejtek érését, szelekcióját, apoptózisát, anergiáját, túlélését ill. aktivációját válthatják

ki13-15.

A B-sejt receptor komplex a MIRR receptorcsalád többi tagjához hasonlóan több

komponensből áll, melyben ligandumkötő és jeltovábbító alegység különíthető el

egymástól. Az antigén megkötéséért felelős alegység a nagy variabilitást mutató

sejtfelszíni immunglobulin, melynek három aminosavat tartalmazó citoplazmatikus

régiója jeltovábbításra alkalmatlan. A hozzá nem kovalensen kapcsolódó járulékos

heterodimer Igα és Igβ láncok alkotják a jeltovábbító alegységet. A disszulfidhíddal

összekötött transzmembrán glikoprotein Igα és Igβ intracelluláris szakasza 61 ill. 48

aminosav hosszúságú. Ezek a szakaszok tartalmazzák az immunreceptor tirozin-alapú

aktivációs motívumot (ITAM), amely hat konzervált aminosavat tartalmaz a

D/Ex7D/Ex2Yx2L/Ix7Yx2L/I szekvenciában16. A BCR-ok keresztkötése az ITAM

motívumok tirozin foszforilációjához vezet. Az ITAM által közvetített jelekhez mindkét

konzervált tirozin aminosavra szükség van, bármelyikük fenilalaninra történő cseréje a

jeltovábbítás megszűnésével jár13,17.

9

A foszforilált ITAM motívumokhoz a jelátviteli folyamatok továbbításáért felelős

molekulák képesek kötődni. Ezek az SH2 doménnel rendelkező fehérjék az ITAM

motívum foszforilált tirozinjaihoz kapcsolódnak.

1.2.2. BCR keresztkötés által indukált jelátviteli folyamatok A BCR aggregációját követő foszforilációs kaszkád megindítja a korai aktivációs

folyamatokat, melyeknek részletei még számos ponton tisztázásra szorulnak18. A három

legjelentősebb és legjobban feltérképezett útvonal a következő: a foszfatidil-inozitol

specifikus foszfolipáz Cγ (PLCγ) aktiváció, a p21ras aktiváció és a foszfatidil-inozitol 3-

kináz (PI3-K) aktiválódásával beinduló jelpálya (1.2.ábra).

Proliferáció Túlélés Apoptózis

1.2.ábra A B sejt receptor által közvetített proliferációs, túlélési és apoptotikus

szignálok.

10

Érett B sejtekben az antigén általi keresztkötést követően a BCR áthelyeződik a lipid

raftokba, ahol a membrán asszociált Src tirozin kinázok (Lyn, Fyn) foszforilálják az

ITAM motívum tirozinjait, ami további Src kináz kötődését és aktivációját váltja ki19. A

következő lépésben a két SH2 doménnel rendelkező Syk tirozin kináz kapcsolódhat a

kétszeresen foszforilált ITAM szekvenciához, bár kis mértékű kötődése ismert a nyugvó

állapotú receptor komplexhez is20. Az ITAM-hoz kötődve fokozódik a Syk auto- és

transz-foszforilációs aktivitása, ami által a folyamat felerősödik és az enzimatikusan

aktív Src és Syk kinázok számos szubsztrátot foszforilálhatnak és több jelátviteli utat is

bekapcsolhatnak21.

A Syk egy másik tirozin kinázzal, a Btk-val együtt katalizálja a PLCγ jelpálya

aktiválódását22,23. A Btk PH doménjén keresztüli asszociációja a membrán

foszfatidilinozitol-3,4,5-triszfoszfáthoz elengedhetetlen szerepet játszik a kináz

aktivációjában24. A Syk foszforilálja a PH doménjével a sejtmembránhoz kötődő

BLNK adapter fehérjét, amely ezáltal dokkoló helyet képez a Btk és a PLCγ számára25.

A PLCγ tehát a BLNK-hoz kapcsolódva a citoplazmából a plazmamembrán közelébe

helyeződik át és Btk általi foszforilációja után hidrolizálja szubsztrátját, a

membránalkotó foszfatidil inozitol-4,5-biszfoszfátot (PIP2). A hasítási termékek az

1,4,5-inozitol-triszfoszfát (IP3) és a diacil-glicerol (DAG)26. Az IP3 az endoplazmatikus

retikulum (ER) membránjában lévő IP3 receptorokhoz kötődve Ca2+ felszabadulást

indukál. A megnövekedett intracelluláris szabad kalcium szint a plazmamembrán

kalciumcsatornáinak (SOC - store operated calcium) kinyílásához vezet, így további

kalcium ionok áramlanak a citoplazmába. A sejten belüli Ca2+ koncentráció

megemelkedése kalciumfüggő enzimek aktiválódását idézi elő, ami végül a korai gének

(c-fos, c-myc) átíródásához vezet. A lipid hidrolízis másik terméke a DAG a protein

kináz C (PKC) család számos izoformáját aktiválja. A szerin-treonin kináz aktivitású

PKC-k különböző transzkripciós faktorok (CREB) és jelátviteli molekulák (Ras)

működését szabályozzák27.

A BCR keresztkötése aktiválhatja a ras proto-onkogén termékét, a p21ras GTP-kötő

fehérjét is. A Ras membránhoz kötött guanin-nukleotid kötő fehérje, amely GTP-t kötött

formában aktív, GDP-t kötött formában pedig inaktív. A Ras PKC-tól független módon

történő aktivációjában a Grb2-Shc-Sos fehérje-komplex játszik főszerepet. Aktiváció

hiányában a Sos guanin nukleotid-cserefaktor a Ras-GDP formát stabilizálja és nyugvó

11

limfocitákban nincs kapcsolatban a Grb2-vel. Aktiváció során az Src kinázok tirozinon

foszforilálják a Shc adapter fehérjét, aminek következtében az a Grb2 adapterfehérje két

SH2 doménjével léphet kölcsönhatásba, miközben a Shc molekula SH2 doménje

segítségével a plazmamembránhoz transzlokálódnak. A membrán közeli Shc-Grb2

komplex a Grb2 SH3 doménjén keresztül a Sos prolinban gazdag régiójához

kapcsolódik. A továbbikban a Sos cserefaktor katalizálja a Ras-hoz kötött GDP

disszociációját ill. GTP-re történő cseréjét, ezután a Ras GTP-kötött formájáról a Sos-

Grb2-Shc komplex leválik28,29. Az aktivált Ras-hoz a Raf szerin-treonin kináz

kapcsolódik, amely aktiválódása után a MAP kináz kinázokat foszforilálja (MEK1/2). A

jelátviteli kaszkád következő lépése a MAP kinázok (Erk1/2) aktivációja, melyek végül

transzkripciós faktorokat aktiválnak (c-jun, c-fos, c-myc) és így a korai aktivációs gének

átírását szabályozzák. A Ras aktiválódását ezen kívűl számos egyéb tényező

befolyásolja B-sejtekben, így többek között a PI3-K, a PKC, a BLNK, Cbl vagy negatív

szabályozója a RasGAP fehérje13,30.

A harmadik jelentős jelpálya a B-sejtekben a PI3-kináz aktiválódásához kötődik. A

PI3-K egyrészt a transzmembrán CD19 molekulához, másrészt a Gab adapter fehérjéhez

asszociálódva vesz részt a B-sejtek aktivációjában31. A PI3-K p85-ös regulátor

alegysége SH2 doménjével kapcsolódik a CD19 ill. Gab fehérjék Src kinázok által

foszforilált tirozinjaihoz, aktiválva ezáltal a p85-höz kapcsolódó p110-es katalitikus

alegységét32. A PI3-K legfontosabb szerepét a membránalkotó foszfatidilinozitol

átalakulás szabályozásában tölti be. Az inozitol gyűrűt 3-as pozícióban foszforilálva a

foszfatidilinozitol-4,5-biszfoszfátot foszfatidilinozitol-3,4,5-triszfoszfáttá (

PtdIns(3,4,5)P3 v. PIP3 ), ill. a foszfatidilinozitol-4-foszfátot foszfatidilinozitol-3,4-

biszfoszfáttá ( PtdIns(3,4)P2 v. PIP2 ) alakítja át. Ezek a termékek dokkoló helyet

szolgáltatnak a különböző PH domén tartalmú fehérjék számára, mint például a PLCγ, a

Btk, az Akt, vagy a Gab adapterfehérjék33,34.

A PI3-K tehát a membránhoz toborzott fehérjék mennyiségét és összetételét

szabályozva a jelátadás igen sokrétű irányítója. Befolyásolja a sejtaktivációt, a

sejtciklust a citoszkeleton működését. Fontos szerepet tölt be a túlélési, proliferációs és

apoptotikus szignálok szabályozásában ill. hibás működés esetén a karcinogenezisben35.

12

1.2.3. A koreceptorok szerepe A BCR-en keresztül érkező jeleket az Igα/Igβ járulékos láncok ITAM motívumai

közvetítik a sejt belsejébe, ahol a különböző jelpályákat az adapter fehérjék integrálják

oly módon, hogy végül a sejt az adott környezeti ingerre egy bizonyos válasszal reagál..

Azonban a B-sejt jelátvitel szabályozásában in vivo körülmények között számos

koreceptor is részt vesz, melyek gátló vagy serkentő módon hatnak az antigénreceptor

közvetített aktivációs folyamatokra.

Aktiváló koreceptor a már korábban említett CD19 transzmembrán glikoprotein,

amely a CD21, CD81, Leu13 molekulákkal alkot tetramer receptorkomplexet36. A BCR

keresztkötése a CD19 gyors tirozin foszforilációját is eredményezi, amely SH2 domén

tartalmú jelátviteli fehérjéket toboroz a BCR közelébe (PI3-K, Lyn, Vav)37. Mivel a

CD19 kapcsolódik a CR2 (CD21) komplementreceptorral, a komplement tartalmú

immunkomplexek által kialakított jelátviteli folyamatokban is szerepet játszik38. A fenti

folyamatok következtében a CD19 és BCR egyidejű keresztkötése szinergista hatású,

ezáltal a CD19 csökkenti a B-sejtek aktivációs küszöbértékét.

Az FcγRIIb (CD32) a humorális immunválasz negatív szabályozó receptora, amely

gátolja az ellenanyag termelést, az intracelluláris kalcium koncentráció növekedését és a

proliferációt39. Az FcγRIIb a többi Fc receptorhoz hasonlóan az immunglobulinok nehéz

láncának konstans részét ismerik fel. Az antigén és a hozzá kapcsolódó ellenanyag

komplex egyidejűleg kapcsolódhat ugyanazon B-sejt sejtfelszíni immunglobulinjához és

Fc receptorához. Ebben az esetben a BCR-en keresztüli aktivációs szignállal

párhuzamosan az FcγRIIb negatív jelet közvetít a B-sejt felé. A gátló szignál csak az

FcγRIIb és a BCR együttes keresztkötésekor alakul ki. Ebben az esetben az FcγRIIb

intracelluláris szakaszán található immunreceptor tirozin-alpú inhibíciós motívum

(ITIM) I/VxYxxL/V szekvenciájában található tirozint foszforilálja a Lyn src kináz40. A

foszforilált ITIM ezután SH2 doménnel rendelkező tirozin- (SHP2, SHP1) ill. inozitol-

foszfatáz (SHIP) aktivitású molekulákat toboroz az aktiváló receptorok közelébe,

melyek negatívan szabályozzák a BCR indukált jelátviteli folyamatokat40,41 (1.3.ábra).

13

1.3.ábra A BCR indukált korai jelátviteli események és az FcγRII receptor

keresztkötésével megiduló, aktivációt gátló folyamatok.

A fent említett koreceptorokon kívűl számos egyéb serkentő ill. gátló hatású

sejtfelszíni receptor (CD22, PIR család, CD40, MHCII, B7 stb.) és intracelluláris

fehérje (Cbl, Vav, Crk, Cdc42 stb.) is szerepet játszik a B-sejt válasz kialakításában,

azonban ezek tárgyalására nem térünk ki.

1.3. SHP2 tirozin foszfatáz Az SHP2 két N-terminális SH2 domént és egy centrálisan elhelyezkedő foszfatáz

(PTP) domént tartalmazó 68 kDa-os fehérje. Inaktív formában a citoplazmában

helyezkedik el és zárt konformációt vesz fel, amelyben az N-terminális SH2 domén

kapcsolatba lép a PTP doménnel, ezáltal gátolva az enzim aktivitását. Ha az SH2 domén

egy tirozinon foszforilált peptidhez kapcsolódik a fehérje felveszi a nyitott

konformációját, ami által a PTP domén felszabadul a gátlás alól és az enzim aktívvá

14

válik. Tehát az SHP2-höz SH2 doménen keresztül kapcsolódó molekuláris partnerek a

lokalizáció mellett egyben az enzim aktivitását is szabályozhatják. A nyugalmi

állapotban mérhető alapaktivitáshoz képest 10-szeresére nő az enzim aktivitása, ha

monofoszfo-peptidhez kötődik, míg 100-szorosára, ha mindkét SH2 doménhez

kapcsolódó bifoszfo-peptiddel lép kapcsolatba a fehérje42,43. Irodalmi adatok szerint az

SHP2-közvetített Erk aktivációhoz az SHP2 C-terminális tirozinjainak a foszforilációja

is szükséges bizonyos növekedési faktorok jelátvitelében (PDGF, FGF) 44. Emellett az

SHP2 egy prolinban gazdag régiót is hordoz C-terminálisan, így adapter molekulaként

is funkcionálhat..

Míg a hasonló szerkezeti felépítést mutató SHP1 főleg hematopoetikus sejtekben

expresszálódik és az intracelluláris folyamatok negatív regulátora, az SHP2 minden

szövettípusban kifejeződik és általában a növekedési faktorok, citokinek, hormonok

pozitív szabályozója (PDGF, EGF, Inzulin, IL-1, IL-2, IL-6) 45-48. Funkcionális szerepük

csak részben átfedő, ami főleg az SH2 közvetített eltérő fehérje interakciókból és

katalitikus doménjeik közti különbségekből adódnak49,50.

Az SHP2 nélkülözhetetlen az embrionális fejlődésben, a hemato és limfopoézisben.

Hiánya letális51,52. Akár az azonos jelátviteli útvonal során betöltött pozitív és/vagy

negatív szabályzó mechanizmusaival a jelintenzitás finomra hangolásában, ill. a jel

időtartamának meghatározásában játszik fontos szerepet.

Pozitív szabályzó szerepét többféle mechanizmus alapján is betöltheti (1.4.ábra).

1.4.ábra Az SHP2 általi pozitív szabályzás lehetőségei

15

Az src kinázok szabályozása a Csk-t (C-terminális src kináz) kötő adapter-fehérje

SHP2 általi defoszforilációján keresztül valósul meg. A defoszforilációt követően a Csk

távol kerül szubtrátjaitól, így az src kinázok fölszabadulnak a Csk általi gátlás alól53.

Egyes receptorok jelátvitelében az SHP2 a Grb2-Sos komplexhez kapcsolódva, mint

adapter fehérje serkenti a Ras aktivációt47,54. Az EGF receptoron keresztüli Ras-Erk

aktivációban pedig a Gab1-el komplexben játszik pozitív szabályzó szerepet (lásd

később) 55. ITIM motívumot hordozó receptorokhoz asszociáltan az SHP2 negatív

regulátorként szerepel (CTLA-4, PD-1, BTLA, KIR, PECAM-1).

A Noonan szindrómás (NS) betegek 50%-nál kimutatható az SHP2 rendellenes

működése. Az NS betegekre jellemző, hogy nagy valószínűséggel alakul ki bennük

fiatalkori mielo-monocitozisos leukémia (JMML) 11,56. Szerepe van továbbá a BCR-

ABL onkogén okozta krónikus mieloid leukémiában (CML) 57.

1.4. PI3-K Az PI3-K (CLASS IA) 85 kDa-os regulátor alegysége hordozza az YxxM motívumot

felismerő két SH2 domént és emellett, izoformától függően SH3 domént ill. prolinban

gazdag régiókat is tartalmazhat. A 110 kDa-os alegység hordozza a kináz domént, mely

katalitikusan aktív konformációját akkor veszi fel, amikor a regulátor alegység SH2

doménje foszfotirozint tartalmazó szekvenciához kapcsolódik. Alternatív aktiválódási

lehetőség, amikor a fehérje a p110-es alegységén keresztül a Ras G-fehérjéhez kötődik

(CLASS IB) 58,59. A p110-es alegység α és β izoformájának hiánya egyaránt letális,

ugyanis nélkülözhetetlen szerepet játszanak az embrionális fejlődés korai

szakaszában60,61.

Legfontosabb szerepét a membrán foszfatidilinozitol összetétel szabályozásán

keresztül a PH domén tartalmú fehérjék membránhoz irányításával tölti be (lásd fent).

Az egyik legjobban ismert és a túlélési szignálokban legfontosabb szerepet játszó PI3-K

közvetített jelpálya az Akt/PKB szerin/treonin kináz aktivációs út. Az Akt első lépésben

a PI3-K foszforilációs termékéhez a PIP3-hoz asszociálódik PH doménjén keresztül. Ezt

követő lépésekben a PH doménjükkel szintén a PIP3-hoz kapcsolódó PDK1 és PDK2

kinázok foszforilálják az Akt thr 308, ill. ser 473 aminosav oldalláncait, ami által az Akt

elnyeri teljes aktivitását62,63. Az Akt a továbbiakban növekedési, túlélési, sejtciklust

szabályzó és anti-apoptotikus szignálokat közvetítő fehérjéket foszforilál ( Bad, GSK3,

16

mTOR, NFκB), melyek hibás szabályozás esetén kóros sejtburjánzást indukálhatnak64-66

(1.5.ábra).

1.5.ábra A PI3-K – Akt jelpálya szerepe

A foszfoinozitidek metabolizmusában a PI3-K mellett fontos szabályozó szerepet

játszanak a PTEN és az SHIP foszfatázok. Az SHIP a PtdIns(3,4,5)P3 ill. PtdIns(4,5)P

inozitol gyűrűket defoszforilálja 5’ pozícióban, míg a PTEN a PI3-K-al ellentétes

működésű, tehát 3’ pozícióban defoszforilálja a PtdIns(3,4,5)P3 –at10.

Emellett a PI3-kináznak szerepe van több, Akt-tól független, kevésbé ismert út

aktiválásában is. Az SGK kináz aktiválásával túlélési szignált közvetít, a Rac1, CdC42,

PKC fehérjéken keresztül a citoszkeleton átrendezésében és/vagy a sejtek

transzformációjában játszik szerepet67,68.

17

1.5. A Gab adapter-fehérje Az adapter fehérjék rendkívül fontos szerepet töltenek be a különböző stimulusok

hatására aktiválódó jelpályák szabályozásában, ill. a jel amplifikációban. Olyan

enzimatikusan inaktív fehérjék, amelyek a felszínükön található tirozinon-foszforilált

peptidszekvenciái és prolinban gazdag régiói segítségével különböző -SH2, PTB, SH3-

domén tartalmú enzimeket, ill. további adapter fehérjéket gyűjtenek egy

multimolekuláris jelátviteli komplexbe. Tehát a jelátviteli hálózatban szereplő

különböző enzimek és azok szubsztrátjainak térbeli lokalizációját szabályozva az egyes

jelpályák integrálásában van szerepük. Az úgynevezett scaffolding adapter fehérjék

sajátsága, hogy rendelkeznek egy sejtmembránhoz kapcsoló PH doménnel, vagy

valamilyen zsírsav-oldallánccal (pl.:mirisztoil-csoport), ami által képesek a jelátviteli

fehérjéket a membrán asszociált receptorok közelébe toborozni. A scaffolding adapter

fehérjék (pl.LAT, PAG, IRS ) közé soroljuk a Gab molekulacsaládot is, amely többek

között a növekedési faktorok, citokinek, inzulin ill. a MIRR család receptorain keresztül

aktivált jelpályák szabályozásában vesz részt69,70.

A Gab adapter családba tartozó Gab1, Gab2, Gab3 fehérjék emlősökben, míg a Soc1

Caenorhabditis elegansban, és a Dos molekula Drosophilaban expresszálódnak. Az öt

fehérje mintegy 40-50%-os szekvencia azonosságot, és nagyfokú strukturális

hasonlóságot mutat (1.6.ábra). Általános jellemzőjük az N-terminálisan elhelyezkedő,

62-76%-os homológiát mutató PH domének, melyek a plazmamembrán belső oldalán

található PIP3-hoz irányítják az adaptert. Emellett számos foszforilálható tirozin ill.

szerin/treonin aminosavat és több prolinban gazdag szekvenciát hordoznak71. A Gab1

(Grb2 associated binder 1) molekulát először a Grb2-höz asszociált fehérjeként

azonosították EGF és inzulin receptor közvetített jelátvitelben72. A Gab2-t az IL-3,

MCSF stimulust követően SHP2 tirozin foszfatáz szubsztrátként, ill. ahhoz asszociált,

tirozinon foszforilált fehérjeként klónozták73. A Gab3-at a Gab1 és Gab2 szekvencia

azonossága alapján írták le74. A Gab1 és Gab2 általánosan expresszálódik a különböző

emlős sejtekben, limfoid sejtekben azonban relatívan gyengébben fejeződnek ki72,73.

18

1.6.ábra A Gab adapter családba tartozó fehérjék

A Gab3 is általánosan előforduló fehérje, viszont a hematopoetikus sejtekben

expresszálódik erőteljesebben74. Gab3 hiányos egerek nem mutatnak fejlődési

rendellenességet, a hematopoézis és az immunrendszer funkciója zavartalan75. A Gab2

kiütött egerek is egészségesek és normális életidejűek, azonban magasabb az eozinofil

és bazofil sejtszám és a hízósejtek működése is abnormális. A nagy affinitású IgE

receptoron (FcRεI) keresztüli aktiváció során csökkent mértékű degranuláció és hibás

citokin génexpresszió figyelhető meg Gab2-/- hízósejtekben76,77. A Gab1 gén kiütése

letális. Az egérembriók 12-18 napos korukban elpusztulnak a szív, a placenta, a váz és

izomrendszer, a máj rendellenes fejlődése következtében, ami valószínűleg a EGF,

PDGF, HGF, gp130 jelátvitel kombinált, hibás működésével magyarázható78.

1.5.1. A Gab transzlokációja a membránhoz, majd ezt követő foszforilációja Nyugvó sejtekben a Gab fehérjék a citoplazmában lokalizálódnak, majd a stimulációt

követően a plazmamembrán közelébe helyeződnek át és ott foszforilálódnak. Az

aktiváló receptorok közelébe kerülés történhet direkt és indirekt módon (1.7.ábra). A

Gab1 molekulában található 13 aminosav hosszúságú MBS (Met-binding sequence)

szekvencia 487-499 ill. MBD (Met-binding domain) 450-532 alkalmassá teszik a

19

fehérjét, hogy direkt kapcsolatba kerüljön a tirozinon foszforilált cMet (hepatocita

növekedési faktor-HGF) receptorral. A többi Gab fehérje nem tartalmazza a MBD ill.

MBS szekvenciákat és ezek közvetlen receptorhoz kötődése nem ismert79,80.

Az indirekt kapcsolat egyik formája, amikor a Gab fehérje egy másik molekulán

keresztül kapcsolódik az adott receptorhoz. A Gab fehérjék több prolinban gazdag

régióval rendelkeznek, melyek közül a PXXPXK/R szekvencia tipikus kötőhelyet

szolgáltat a Grb2 adapter molekula SH3 doménje számára81. A Grb2 rendelkezik egy

olyan SH2 doménnel, melyen keresztül a Gab-Grb2 komplex az YXNX motívumot

hordozó receptorhoz asszociálódhat (pl.: HGFR, EGFR receptorok esetén)82. Az IL3,

IL-5, GM-CSF citokin receptorok estében hiányzik a Grb2-t kötő motívum, viszont a

jeltovábbító β láncban az Y577 kötődési lehetőséget nyújt az Shc molekula PTB

doménje számára. A foszforilált Shc pedig a Grb2 SH2 doménjeihez tud kapcsolódni,

kialakítva ezáltal a Shc-Grb2-Gab2 komplexet, amely a Shc-en keresztül kapcsolódik a

citokin receptorokhoz83.

1.7.ábra A Gab adapter fehérje irányítása ill. kötődési lehetőségei a jelátvivő

receptorhoz.

Az Gab fehérjék PH doménjeik segítségével is közel kerülhetnek a jelátvivő

receptorhoz, amely mechanizmust legjobban az EGFR jelátvitelében tisztázták. Az

EGFR ligandum kötődését követően a Gab1 a Grb2 fehérjén keresztül a receptorhoz

kapcsolódik, miközben tirozinjain foszforilálódik. A foszforilált Gab1 kölcsönhatásba

lép a PI3-K p85-ös alegységével, ami a PI3-K aktivációjával és foszfatidilinozitol-

triszfoszfát (PIP3) képződésével jár a plazmamembrán belső rétegében. A Gab1 ezután a

20

PH doménjén keresztül a PIP3-hoz asszociálódik, ezáltal erőteljesebbé válik a

receptorközeli lokalizáció és további Gab1 molekulák membránhoz toborzásával a PI3-

K-on keresztül egy pozitív visszacsatolási kör alakul ki84. A B-sejt aktivációban is

fontos szerepe van a Gab1 PH doménnek, ugyanis a PH deléciós mutáció esetén a BCR

aggregációt követően elmarad a Gab1 foszforilációja. Más esetekben a PH domén

szerepe nélkülözhetőnek tűnik85. A PH domén hiányának nincs hatása a Gab1 tirozin

foszforilációjára MDCK sejtek Met jelátvitelében, ill. BaF3 sejtek IL-3 stimulációját

követően normális a PH deletált Gab2 fehérje foszforilációja86.

A különböző receptorokon keresztüli aktiváció, részben átfedő módon az egyes Gab

fehérjék foszforilációjához vezet. Immunsejtek BCR, TCR ill. IL-3 stimulációja a Gab1

és Gab2 tirozin-foszforilációját okozza, míg az IL-6-on keresztüli aktiváció a Gab1

foszforilációját váltja ki87-89. A T-sejtek IL-2, IL-15, makrofágok FcγRII és hízósejtek

FcεRI aktivációja a Gab2, míg az M-CSF stimulus a Gab2 és a Gab3 foszforilációját

indukálja90,91,77.

A Gab1-et az Src családba tartozó tirozin kinázok (Lyn) foszforilálják a B-sejt

aktiváció során92. A TCR-en keresztüli stimulus hatására a Zap70, míg IL-2 és IL-15

aktivációt követően a JAK3 foszforilálja a Gab2-t T-sejtekben93,90. Az BCR

keresztkötést követően a számos tirozin-foszforilált Gab1 molekulához szekvencia

specifikusan SH2 doménnel rendelkező SHP2, PI3-K, PLCγ, Grb2, Shc fehérjék

kötődnek92. TCR aktivációt követően Zap70, SHP2, LAT, Grb2, CD3ζ fehérjék, míg

makrofágokban FcγRII stimulust követően PI3-K, SHP2 molekulák toborzódnak a Gab

foszfotirozin tartalmú motívumaihoz91.

A 13-16 darab foszforilálható tirozin mellett több szerin és treonin aminosav is

található a Gab fehérjék szekvenciájában, amelyeket sejtaktivációt követően a

szerin/treonin kinázok foszforilálhatnak. Ezek a foszforilált szerin/treonin aminosavak

szintén szerepet játszanak a Gab fehérjék jelátvitelének szabályozásában. A Gab1 Erk

általi foszforilációja például ellenkező hatású a Met és az EGFR jelátvitelben. Met

stimulációt követően az Erk2 foszforilálja a Gab1-en a p85 kötő Tyr472-hoz közeli

Thr477-et, ami fokozza a p85-Gab1 kölcsönhatás erősségét és így a PI3-K aktivációját.

Mivel a PI3-K elősegíti az Erk aktivációját, a Thr477 Erk2 általi foszforilációja egy

pozití visszacsatolási kört alakít ki. Ezzel ellentétben EGF stimulust követően az Erk2

21

foszforilálja a Gab1 egy eddig azonosítatlan ser/thre aminosav oldalláncát, ami ebben

esetben a PI3-K gátlását okozza94,95.

A Gab1 és Gab2 molekulák ekvivalens szerepe még a legtöbb jelátviteli út esetében

tisztázásra szorul, így limfociták esetében is. EGF receptoron keresztüli jelátvitelben

azonban siRNS módszerrel MCF7 (emberi emlőrákos) sejtvonalon kimutatták, hogy a

teljes Erk aktivációhoz a Gab1-SHP2 és a Gab2-SHP2 jelenléte is szükséges, tehát

egymást kiegészítő, jelamplifikáló hatású a Gab fehérjék együttes jelenléte96.

1.5.2. A Gab fehérje szerepe a jelátvitel szabályozásában

Gab1-SHP2

A legtöbb irodalmi adat a Gab adapter fehérjéket az SHP2 és PI3-K aktivációs utak

mediátoraként írja, melyekben egyaránt betölthetnek pozitív és negatív reguláló

szerepet.

Mindhárom emlős Gab fehérje hordoz két, konzervált, tirozin tartalmú

I/VLXYXXI/V/L motívumot (BTAM-bifoszforilált tirozin-alpú aktivációs motívum),

amely foszforilált formában képes az SHP2 foszfatáz két SH2 doménjéhez kötődni ill.

aktiválni az enzimet97. Az SHP1 és SHP2 foszfatázok SH2 doménjei hasonló

peptidszekvenciákat ismernek fel, a Gab fehérjék mégis az SHP2 kötődését preferálják,

ami talán magyarázatot adhat az SHP2 és az SHP1 ellentétes biológiai szerepére.

Számos receptoron keresztül meginduló jelpályában nélkülözhetetlen a Gab-SHP2

interakció a teljes Erk-MAPK-kináz kaszkád aktivációhoz, ami az egyik legfontosabb

közvetítője a növekedési szignáloknak és a celluláris transzformációnak72,88. A Gab

gének kiütése elnyomja az EGF indukált Raf-MEK aktivációt és csökkenti a Ras-GTP

kötött formáját, így a Gab1 a Ras előtt lép be a jelpálya szabályozásába98,99. Az SHP2

megkötésére képtelen Gab1 mutánsokkal végzett kísérletek alapján a Gab-SHP2

kapcsolat és az SHP2 aktivációja szükséges a normális szintű Erk aktivációhoz100. A

legtöbb esetben azonban a Gab1-SHP2 komplex nem a Ras-Erk aktiváció

megindításában, hanem a jel erősítésében és fenntartásában játszik szerepet101. Gab1-et

fokozottan kifejező NIH3T3 fibroblaszt sejtek transzformációs képessége és növekedése

22

erőteljesebb, a szabályozás Gab1-SHP2 interakciótól függő, viszont ebben az esetben

Erk ill. Akt útvonaltól független módon zajlik102.

A Ras-Erk jelpálya Gab-SHP2 általi

szabályozására három lehetséges modellt

írnak le103. a) Az SHP2 defoszforilálhatja a

Gab foszforilált tirozinjat, szabályozva

ezáltal az SH2 és/vagy PTB doménnel

rendelkező további fehérjék jelátviteli

komplexbe kerülését. b) Az SHP2

szabályozhatja a Gab-hoz kötődő fehérjék

foszforilációját, ezzel módosítva azok

szerkezetét, akivitását. c) A Gab toborozza

az SHP2-t a megfelelő szubsztrátja

közelébe. Az el ső modellt támasztja alá egy

1.8.ábra A Ras aktiváció SHP2 általi gátlása mostanában leírt eredmény. EGF stimulációt

követően az SHP2 defoszforilálja a Ras-t

negatívan szabályzó RasGAP fehérjének a kötőhelyét a Gab1 molekulán EGF

stimulációt követően (1.8.ábra). A RasGAP így nem tud szubsztrátja, a Ras közelébe

lokalizálódni, ezáltal a Ras-Erk aktivációs út felszabadul a gátlás alól 55 . Egy másik

kutatócsoport eredményei szerint az SHP2 a RasGAP kötőhelyét magán az EGFR-on

defoszforilálja (Y992), így gátolva a RasGAP plazmamembránhoz való áthelyeződését,

ill. katalizálva a hosszabb életidejű Ras-GTP kialakulását104. Az SHP2

defoszforilálhatja a Gab több tirozin motívumát is, melyeknek szerepe lehet a szignál

csendesítésben. A p85 kötőhely defoszforilációja például negatívan szabályozza az EGF

indukált PI3-K-Akt jelpályát 105. Emellet az SHP2 saját kötőhelyét is defoszforilálhatja

a Gab-on, ezáltal mintegy lekapcsolva magát a jelátviteli komplexről.

Az SHP2 kötőhelyre mutált Gab2 overexpressziója bizonyos stimulusuk esetében

gátolhatja az Erk aktivációt (M-CSF1) 106. Azonban Gab2 kiütött egerek hízósejtjeiben

és makrofágjaiban csökkent az Erk aktiváció szintje SCF és M-CSF1 stimulációt

követően76. A Gab2-SHP2 komplex ugyanakkor más jelátviteli utakban is szerepet

játszhat. Az SHP2-t megkötni képtelen Gab2 mutánsok overexpressziója gátolja az IL-3

indukált korai génaktivációt, miközben az Erk aktivációra nincs hatással73. Gab2

23

overexpressziója T-sejtekben gátolja a TCR indukált IL-2 promoter aktivációt az NFAT

és NFkB transzkripciójának blokkolásával107.

Gab-PI3-K

Minden Gab fehérje rendelkezik YVPM motívummal, amely potenciális kötőhelyet

szolgáltat a PI3-K p85-ös alegységének SH2 doménje számára86. A p85 alegység

megkötésével a Gab fehérjék lehetőséget nyújtanak a PI3-K jelpálya aktivációjához

olyan receptorok esetében, melyek nem rendelkeznek direkt PI3-K kötő motívummal

(BCR, TCR, IL-3/GM-CSF, FcεRI FGFR)77,85,107. Emellett PI3-K kötőhellyel

rendelkező receptorok esetében is toboroznak a Gab fehérjék PI3-K-t (NGFR, Ret) 108.

A Gab-hoz kapcsolódó PI3-K a membrán közelébe kerülve foszforilálja a foszfatidil-

inozitol gyűrűt a hármas pozícióban, dokkoló helyet létrehozva ezáltal a PH domént

hordozó fehérjék számára (PDK, Akt, Gab, Btk, PLCγ, Vav). Az evolúció során

megőrzött, konzervatív PI3-K-Akt jelpálya túlélési, növekedési és anti-apoptotikus

jelpályák aktivációját közvetíti. A különböző receptorokon keresztüli aktiváció során a

Gab fehérjéken kívül más adapterek is szerepet játszanak a PI3-K toborzásában és

aktiválásában (pl. Inzulin receptornál az IRS, TCR-nél a LAT). Egér embrionális

fibroblaszt sejtekben bizonyítottan a Gab1 játszik elsődleges szerepet az EGFR-on

keresztüli PI3-K-Akt jelpálya katalizálásában. ErB3 expresszáló sejtekben az EGF

stimulus Gab1 függő és Gab1-től független módon is képes a PI3-K-Akt jelpálya

aktiválására109.

B-sejtekben a BCR és az FcγRIIb együttes keresztkötése gátolja a sejtaktivációt. A

keresztkötés hatására csökken az intracelluláris Ca2+ szint ill. a membránban található

PIP3 molekulák száma, ami gátolja az Akt membránhoz toborzását és aktivációját.110 Ez

egyrészt csökkent PI3-K aktivitással magyarázható, másrészt azzal, hogy az FcγRIIb

tirozinon foszforilált ITIM motívuma az inzitol-5’ foszfatáz aktivitású SHIP enzimet

toborozza a membrán közelébe, ahol a PIP3-at PIP2-vé alakítja át. Munkacsoportunk

korábban kimutatta, hogy BCR és FcγRIIb keresztkötésekor a Gab1-hez kapcsolódó

SHP2 defoszforilálja a PI3-K-t kötő Gab1 motívumot, gátolva ezáltal a PI3-K-Akt

jelpálya aktiválását111. Az EGF indukált Gab1-PI3-K jelpálya aktivációjában is

termináló szerepet játszik az SHP2 a PI3-K kötőhely defoszforilálásával, míg más

receptorokon keresztüli jelátvitelben az SHP2 nincs hatással a PI3-K jelátvitelre105.

24

Tehát a PI3-K SHP2 általi szabályozása receptor specifikusan változik. A szabályozás

fordítottja is megvalósul. Gyenge EGF stimulus esetén a PI3-K játszik pozitív szerepet

az Gab1-SHP2 közvetített Erk aktivációban, ugyanis a PIP3 szint emelkedése a

membránban növeli a Ras közelébe kerülő Gab1-SHP2 komplex mennyiségét112.

A Gab fehérjék in vivo szerepét bizonyítja, hogy egérből izolált Gab2-/- hízósejtekben

jelentős mértékű PI3-K aktiváció gátlás figyelhető meg FcεRI keresztkötés hatására77.

A Gab2 negatív szabályzó szerepét is leírták az FcεRI közvetített hízósejt jelátvitelben,

melyben a Gab2-vel interakcióba lépő Lyn és PLCγ fehérjéknek lehet szerepe. Gab2

overexpresszált hízósejtekben csökken a TNFα és IL-6 gének transzkripciója, a kalcium

ionok mobilizációja és a degranuláció mértéke113.

Összességében a Gab-SHP2 és Gab-PI3-K közvetített jelpályák a proliferációs,

növekedési, túlélési és anti-apoptotikus szignálokra kifejtett serkentő hatását receptor és

sejttípustól függően változatos módon töltheti be. Az egyes jelátviteli lépésekben

azonban nemcsak pozitív, hanem negatív szabályozó szerepet is játszhatnak.

1.6. Foszfopeptidek transzportja a citoplazmába Különböző fehérje eredetű tirozinon-foszforilált peptidek in vitro esszékben

bizonyítottan fokozni tudják SH2 domén tartalmú enzimek katalitikus aktivitását111.

Ezek a foszfopeptidek sejtbe juttatva módosíthatják az endogén enzimek aktivitását, ill.

az intracelluláris fehérje-fehérje kölcsönhatásokat, ily módon megváltoztatva egyes

jelátviteli utak végső kimenetelét. Ezáltal ezek a funkcionális szekvenciát hordozó

foszfopeptidek új lehetőséget nyújthatnak a jelátviteli folyamatok tanulmányozásában és

a jelátviteli terápián alapuló eljárások lehetséges célpontjaivá válhatnak114,115.

Fizikai-kémia tulajdonságaikból kifolyólag a legtöbb oligopeptid a sejtmembránon

nem képes átjutni. A plazmamembrán permeabilizálásával, ill. pórusformáló reagensek

segítségével elérhető a peptidek sejtbe juttatása, azonban ezek a módszerek egyben a

membrán károsítását is előidézik116. Ezért előtérbe került a peptid alapú membrán-

permeábilis hordozó szekvenciák kutatása és alkalmazása, melyeknek több csoportját

különböztetik meg. PTD-nek (protein transduction domains) vagy CPP-nek (cell

penetrating peptides) is nevezik ezeket a vektor jellegű peptideket. A legjobban

karakterizált CPP-k az Antennapedia transzkripciós faktor fehérje eredetű Penetratin

(pozíció: 43-58), a HIV-1 transzaktivációs Tat fehérjéből származó Tat szekvencia

25

(pozíció: 48-60), ill. a különböző hosszúságú Oligoarginin (R7-9) peptidek. Mindhárom

CPP bázikus struktúrájú, pozitív töltéseket hordozó szekvencia, de míg a Penetratin

lizinben gazdag, addig a Tat és R7-9 peptideknél az arginin hordozza a pozitív

töltéseket117-119.

A CPP-hez kovalensen konjugált aktív peptid vagy fehérje, ill. a fúziós fehérjeként

előállított hordozó-peptid/fehérje konstrukció viszonylag gyorsan internalizálódik a

különböző sejttípusokba. A sejtmembránon való átjutás mechanizmusa még részleteiben

nem tisztázott, vitatott folyamat, melyben a különböző metodikák és sejttípusok eltérő

eredményeket adnak. Az eddigi eredmények alapján úgy tűnik, hogy a Penetratin

endocitózis útján, míg a Tat ill. R7-9 egy másik, energiát nem igénylő mechanizmus

alapján juttatják a sejtbe az aktív molekulákat. Az internalizációs folyamatban kiemelt

szerepet tulajdonítanak az arginin guanidino-csoport protonáltságának, amely a lipid

membránban elhelyezkedő foszfát és szulfát csoportok negatív töltéseivel léphet ionos

kölcsönhatásba. Ezután a membránnal kapcsolatba kerülő CPP-k vezikulák képződését

indukálják, melyek a továbbiakban a peptiddel együtt lefűződnek a citoplazmába120.

Egy másik membrán-transzlokációs szekvencia a 27 aminosavból álló Transportan,

amely a neuropeptid galaninból és a darázsméreg mastoparanból felépülő chimera

peptid. A molekula az előző CPPk-hez képest nagyobb hidrofóbicitást mutat és SDS

micellákon végzett kísérletek alapján jelentős mértékben ágyazódik a foszfolipid

membránt modellező SDS felszínbe.121 Ez a polipeptid nagyobb méretű molekulákat is

képes átjuttatni a membránon (pl.:GFP). Főleg DNS és RNS transzportjára használják a

27 aminosavból felépülő, amfipatikus MPG-t, amely a HIV-1 gp41 fehérjéből és az

SV40 NLS (nukleáris lokalizációs szekvencia) szekvenciájából felépülő fúziós peptid,

ami a nukleinsavakat nem kovalens komplex formájában juttatja a sejtekbe122.

Az említett CPP-k tehát eszközként szolgálhatnak biológiailag aktív peptidek/fehérjék

élő sejtekbe juttatásához.

26

2. Célkitűzések

Az intracelluláris fehérjék tirozinon foszforilát motívumainak kölcsönhatása az SH2

domén tartalmú molekulákkal központi szerepet játszik a jelátviteli folyamatok

szabályozásában. A Gab1 adapter fehérjéhez SH2 doménekkel kapcsolódó SHP2 és

PI3-K molekulák növekedési, proliferációs és túlélési jeleket közvetítenek a különböző

receptorokon keresztüli sejtaktiváció során. Az SHP2, illetve PI3-K gének onkogenikus

mutációi következtében átíródó fehérjék hibás működése a sejtek rosszindulatú

transzformációjához és kóros sejtburjánzáshoz vezethet. A foszfotirozin-SH2 domén

kölcsönhatáson alapuló jelátvitelt gátolhatják a sejtbe juttatott, foszforilált tirozint

tartalmazó peptidek, amelyek nagy affinitással és specifikusan kötődnek az adott SH2

doménhez, s így megakadályozzák annak kapcsolódását fiziológiás ligandumával. Célul

tűztük ki, olyan Gab1 fehérje eredetű sejtmembrán-permeábilis tirozinon foszforilált

peptideket előállítását és vizsgálatát, amelyek szelektíven szabályozhatják az SHP2 és a

PI3-K által irányított jelpályákat B sejtekben.

Tisztázni kívántuk:

1. Milyen sejtmembrán permeábilis hordozó (CPP) peptid a legalkalmasabb a bioaktív

foszfopeptidek sejtbe juttatására?

2. Milyen mechanizmus alapján jutnak át a plazmamembránon a CPP-k, illetve a CPP-

vel konjugált Gab1 eredetű foszfopeptidek, és milyen intracelluláris lokalizációt

mutatnak?

3. Hogyan befolyásolják az SHP2 foszfatáz aktivitását a Gab1 adapter fehérje SHP2 és

PI3K kötőhelyeit reprezentáló szintetikus foszfopeptidek, ill. ezek a peptidek

játszhatják-e az SHP2 szubsztrát szerepét?

4. Az irodalmi adatok alapján feltehetően az SHP2-höz kötődő GDLDpe és a PI3-K-hoz

kötődő ELPNpe foszfopeptidek kapcsolatba lépnek-e más SH2 domén tartalmú

fehérjékkel?

5. A sejtbe juttatott tirozinon foszforilált peptidek módosítják-e az SH2-foszfotirozin

kapcsolaton alapuló in vivo fehérje kölcsönhatásokat B sejtekben?

6. Hogyan befolyásolják a sejtbe jutott foszfopeptidek a fehérje foszforilációs

folyamatokat nyugvó és BCR aktivált sejtekben?

27

7. Szerepet játszhat-e az SHP2 és a PI3-K az Erk aktiváció szabályozásában B

sejtekben?

8. Befolyásolják-e az OR8-GDLDpe és OR8-ELPNpe foszfopeptidek az SHP2 és PI3-K

fehérjék által közvetített jelpályákat?

28

3. Anyagok és módszerek 3.1. A kísérletek során felhasznált pufferek és médiumok

RPMI 1640 sejttenyésztő médium

DMEM sejttenyésztő médium

GKN puffer

PBS puffer

TWB puffer

FACS puffer

Lízis puffer

Foszfatáz ELISA puffer

Degranulációhoz használt pufferek:

Tyrode puffer, Tyrode puffer 20x, Szubsztrát oldat, Stop puffer

3.2 A felhasznált ellenanyagok

szériaszám, elnevezés

specificitás származás izotípus gyártó/eredet

BU1 anti-humán IgM egér IgG2a Roy Jefferis,

Anglia

anti-humán IgM+IgG

kecske Jackson,

anti-csirke IgM

PY 20 anti-humán P-Tyr egér IgG2b Transduction

PT 40 anti-humán P-Tyr nyúl poli-klonális Israel Pecht, Izrael

Lyn anti-humán Lyn nyúl poli-klonális Transduction anti-human PLCγ2 nyúl poli-klonális Santa Cruz

SC-280 anti-human SHP2 nyúl poli-klonális Santa Cruz

610621 anti-human SHP2 egér IgG1 Transduction

SC-423 anti human PI3-K nyúl poli-klonális Santa Cruz

anti-human P-Erk nyúl poli-klonális Sigma

29

anti-human P-Akt nyúl poli-klonális Santa Cruz

SC-6293 anti-human Gab1 kecske poli-klonális Santa Cruz

SC-9049 anti-human Gab1 nyúl poli-klonális Santa Cruz

A-9917 HRPO jelölt anti-egér IgG F(ab)2

kecske poli-klonális Sigma

A-6154 HRPO jelölt anti-nyúl IgG F(ab)2

kecske poli-klonális Sigma

3.3. A kísérletekben felhasznált szintetikus, sejtmembrán permeábilis peptidek (CPP) szekvenciái R8C: RRRRRRRR-C(BODIPY) (-NH2)

Okt-R8C: Oktanoil-RRRRRRRR-C(BODIPY) (-NH2)

MPG alfa: C(BODIPY)-GALFLAFLAAALSLMGLWSQPKKKRKV (-NH2)

MPG alfa-ox: C(BODIPY)-GALFLAFLAAALSLM(O)GLWSQPKKKRKV (-NH2)

Transportan: C(BODIPY)-GWTLNSAGYLLGKINLKALAALAKKIL (-NH2)

TP10: C(BODIPY)-AGYLLGKINLKALAALAKKIL (-NH2)

3.4. A kísérletekben felhasznált szintetikus, Gab1 fehérje eredetű peptid

szekvenciák

3.1.ábra. A kísérletekben használt SHP2 ill. PI3-K kötő Gab1 szekvenciák

30

Okt-R8C-GDLDpe (foszfoészter):

Oktanoil-RRRRRRRR-C-GDKQVEY(p)LDLDLD(NH2)

Okt-R8C-GDLDsp (tiofoszfát):

Oktanoil-RRRRRRRR-C- GDKQVEY(sp)LDLDLD (NH2)

Okt-R8C-ELPN(pe):

Oktanoil-RRRRRRRR-C-ELDENY(p)VPMNPN (NH2)

Kontrolként használt peptidek:

Oct-R8C-GDLD: Octanoil-RRRRRRRR-C-GDKQVEYLDLDLD(NH2)

Oct-R8C-GDFLD: Octanoil-RRRRRRRR-C-GDKQVEFLDLDLD(NH2)

Oct-R8C-DELD: Octanoil-RRRRRRRR-C- DELVKLDFDQGLD(NH2)

Valamint alkalmaztuk ezen peptidek Bodipy-FL fluorokrómmal konjugált, ill.

hordozó szekvencia nélküli, Biotinnal kapcsolt formáit. A Bodipy-FL és a Biotin

konjugáció a nyolc arginin és az aktív peptid C-terminális vége közötti szerin

aminosavval történt.

A különböző peptidek és konjugátumaik szintézisére vonatkozó pontos leírását az

„Optimization of the cellular import of functionally active SH2-domain-interacting

phosphopeptides” című közlemény anyag-módszer részében lehet megtalálni.

3.5. A kísérleti módszerek

Sejttenyésztés

Vizsgálataink nagy részében BL41, Epstein Barr vírussal transzformált, de EBV

negatív, humán Burkitt limfóma sejtvonalat használtunk. A kísérletek másik

csoportjában ALV (avian leukosis virus) indukált burza limfóma eredetű DT40 csirke

B sejtvonalat, ill. RBL 2H3 sejtvonalat alkalmaztunk. A BL41 és DT40 sejteket

polisztirén sejttenyésztő edényekben (Costar, Amerikai Egyesült Államok), 10% FCS

tartalmú RPMI 1640 médiumban tartottuk fenn, a csirke sejtek médiumát 1%

csirkesavóval kiegészítve. Az RBL 2H3 hízósejteket 10% FCS-t tartalmazó DMEM

(Dulbecco’s modified Eagle’s medium) médiumban tenyésztettük.

31

FACS analízis A sejteket 4°C-on és 37°C-on inkubáltuk a Bodipy-FL festékkel konjugált különböző

permeábilis peptidekkel 5, 20, 60 percig (mintánként 5x105 sejtszámmal). A peptid

kezelést követően a sejteket kétszer mostuk FACS pufferben, majd bizonyos minták

esetén 1 μg propidium jodidot adtunk a károsodott sejtek jelölésére mintánként. Ezután

FACS Calibur (Beckton Dickinson, USA) áramlási citofluoriméteren mértük a sejtek

fluoreszcencia intenzitását. A méréshez és a kiértékeléshez a CellQuest programot

használtuk.

Mikroszkópos vizsgálatok Mintánként 2x106 sejtet inkubáltunk különböző, Bodipy-FL festékkel konjugált

permeábilis peptiddel 10μM-os végkoncentrációban, 4 és 37°C-on, különböző

időtartamokban. A mosási lépést követően a mintákat tárgylemezre cseppentve

konfokális lézer-pásztázó mikroszkóppal (Olympos FluoView 500) vizsgáltuk a sejtek

peptid felvételét, 488nm hullámhosszúságú argon-ion lézer gerjesztő fényforrást

alkalmazva. A sejtmembrán festésére a lipofil DiI-C18 (1,1’-dioktadecil–3,3,3’,3’-

tetrametilindokarbocianid perklorát) fluoreszcens festéket használtuk, míg a savas

partikulumok jelöléséhez a Lyso Tracker Red-et alkalmaztuk. Az utóbbi két festék

gerjesztéséhez az 543 nm-es fényt kibocsájtó He-Ne lézert használtuk. A kiértékelést és

a Pearson koeficiens értékek számítását az Image-J szoftver segítségével végeztük

Sejtaktiváció, lízis, immunprecipitáció

A sejtkultúrából mintánként 2x106 sejtet különítettünk el. A mintákat 0,5 ml szérum-

mentes RPMI 1640 médiumban 30 percig 37°C-on inkubáltuk, majd a permeábilis

peptidekkel különböző ideig, ill. különböző koncentrációban előinkubáltuk a sejteket.

Ezt követően a peptidkezelés utolsó két percében IgM specifikus egér monoklonális

ellenanyaggal 37°C-on aktiváltuk a sejteket. Ezután a sejteket azonnal lecentrifugáltuk

14000 rpm-mel 20 másodpercig, a felülúszót eltávolítottuk, majd a sejtüledéket

folyékony nitrogénben lefagyasztottuk. Ezt követően a mintákat 100μl lízis pufferben

vettük fel, mely a már leírtakon kívül frissen hozzáadva az alábbi proteázgátlókat

tartalmazta: 10 μg/ml aprotinin, 5 μg/ml leupeptin, 5 μg/ml pepsztatin, 0,2 mM fenil

metil szulfonil fluorid (PMSF). A mintákat jégen tartva és többszörösen alaposan

32

felkeverve 30 percen keresztül inkubáltuk a fent említett lízis pufferben. Fél óra

elteltével a lizátumokat 4°C-on 15000 rpm-mel 15 percig centrifugáltuk. A felülúszó

80μl-ét 20μl 5x SDS-PAGE mintapufferrel 95°C-on 5 percig inkubáltuk.

Immunprecipitációra szánt minták esetében 4x107 sejtből indultunk ki. A

továbbiakban a fent említett aktiválási metódust alkalmaztuk 400μl lízis puffert

alkalmazva a lizálást követő centrifugálásig. Ezután a felülúszót 1 órán át inkubáltuk

4°C-on rázatva 10μl Protein-G Sepharose (Pharmacia Biotech, Svédország) gyöngyökre

kötött ellenanyagok jelenlétében. 1 óra letelte után mintáinkat háromszor mostuk lízis

pufferrel (a centrifugálásokat 14000 rpm-mel 20 másodpercig végeztük), majd a

mintákat 40μl SDS-PAGE mintapufferrel 95°C-on 5 percig inkubáltuk. A

mintapufferben megfőzött mintákat SDS-poliakrilamid gélen futtattuk, majd a

fehérjéket nitrocellulóz membránra blottoltuk át.

SDS poliakrilamid gélelektroforézis, Western blot

Az elektroforézist 10%-os SDS poliakrilamid gélen, 120-150 V feszültséggel

végeztük (BioRad, USA). Ezt követően a szétválasztott fehérjéket Hybond C-extra

nitrocellulóz membránra (Amersham, Anglia) blottoltuk 90 V feszültséggel. Ezután a

membránt 10 percig mostuk 40 ml TWB - 0,05% Tween pufferben, majd blokkoltuk 20

ml 0,1% zselatin tartalmú TWB-ben. 1 óra eltelte után eltávolítottuk a blokkoló oldatot,

majd a membránt 10 ml TWB - 0,05% Tween-ben oldott 5-10 μg/ml végkoncentrációjú

elsődleges ellenanyaggal újabb egy órát inkubáltuk szobahőmérsékleten. Ezt követte

háromszor 5 perc mosás TWB - 0,05% Tween pufferben, majd ismét egy óra inkubálás

szobahőmérsékleten HRPO-val jelzett, az első ellenanyagra specifikus másodlagos

ellenanyaggal. Ezt 10 ml 0,1% zselatintartalmú TWB-0,05% Tween pufferben oldottuk,

a végkoncentrációja 0,1-0,5 μg/ml volt. Majd hatszor 10 percet mostuk TWB-0,05%

Tween pufferben. Az inkubálások és mosások ideje alatt a membránt lengőasztalon

helyeztük el. Előhíváshoz ECL reagenst (Pierce,USA) használtunk. A HRPO által

elhasított ECL kemilumineszcenciás jeleit Kodak röntgenfilmmel detektáltuk.

33

Affinitás tisztítás („pull down”) assay A sejtkultúrából mintánként 4x107 sejtet különítettünk el. A mintákat 0,5 ml szérum

mentes RPMI 1640 médiumban 30 percig 37°C-on inkubáltuk, majd IgM specifikus

egér monoklonális ellenanyaggal 2 percig 37°C-on aktiváltuk a sejteket. Ezt követően a

már leírt lizálási eljárás után a minták felülúszóit 2 órán át inkubáltuk 4°C-on rázatva

10μl Agarose-Streptavidin (Sigma) gyöngyökre kötött biotinált peptidek jelenlétében. 2

óra letelte után a mintáinkat háromszor mostuk lízis pufferrel, majd a mintákat 40μl

SDS-PAGE mintapufferrel 95°C-on 5 percig inkubáltuk. Ezután a már szintén leírt

módon SDS-PAGE és Western blot technikák segítségével azonosítottuk a fehérjéket,

ill. SDS-PAGE-t követően Comassie Blue festést alkalmaztunk az MS analízisre

küldendő fehérjék jelölésére.

Foszfatáz aktivitás mérés A rekombináns SHP2 különböző hígításait 96-lyukú plate-en 1 óráig, 37°C-on foszfatáz

pufferben inkubáltuk a biotinált foszfopeptidekkel. Az enzimreakció után az enzim

szubsztrát elegyet átmértük egy avidinnel fedett ELISA lemezre és egy éjszakán át 4°C-

on hagytuk, ami idő alatt kialakult a biotinált peptidek és az avidinnel fedett ELISA

lemez közötti kapcsolat. Másnap 3x-i mosást követően anit-foszfotirozin specifikus egér

ellenanyaggal jelöltük az ELISA lemezhez kötött maradék foszfotirozint, majd további

három mosási lépés után HRPO-val konjugált anti-egér másodlagos jelölést

alkalmaztunk. Eztán 6x mostuk a plate-et majd 30%-os H2O2 szubsztrátot adtunk a

mintákhoz, ami a tetrametil-benzidin (TMB) oxidációjával járó színreakciót ad. A

színváltozást kénsavval állítottuk le, majd ELISA leolvasón 450nm mértük a reakció

intenzitását jelző optikai denzitást (OD).

Hízósejt degranuláció mérése Az FcεRI indukált hízósejt degranuláció detektálása a granulumokból felszabaduló β-

hexaminidáz enzim-aktivitás mérésén alapszik. A megfelelő antigén dózis

kiválasztásához egy előkísérletet végeztünk, amelyben különböző koncentrációjú DNP-

BSA-val aktiválva a sejteket, kiválaszthatjuk a szuboptimális antigén mennyiséget. Az

34

RBL-2H3 hízósejteket DNP specifikus IgE-vel szenzitizálzuk. A sejteket 96 lyukú

lemezre mértük (1,5x105/ luk), majd két óra múlva Tyrode pufferrel mostuk. Ezt

követően a permeábilis peptidekkel 30 percig előinkubáltuk a sejteket, majd a

szuboptimális antigén dózissal (DNP-BSA) aktiváltuk a sejteket 37°C-on 1 óráig. Az

aktiválás után a felülúszókat a p-nitrophenyl-N-acetyl-β-D-glucosamine szubsztrátot

tartalmazó oldatra mértük és 45 percig 37°C-on inkubáltuk. A reakciót glicin tartalmú

„stop” pufferrel állítottuk le, majd fotometriásan mértük az optikai denzitást 405 nm-en.

35

4. Eredmények

4.1. Az optimális, sejt-permeábilis hordozó peptid kiválasztása Számos CPP (cell penetrating peptid)-ről leírták, hogy képes biológiailag aktív

peptideket/fehérjéket a sejtmembránon átjuttatni, azonban a különböző hordozó

vektorok egy rendszerben történő vizsgálata még nem történt meg119,123,124. Az optimális

hordozó kiválasztásához ezért három különböző típusú CPP-t és ezek módosított

formáit hasonlítottuk össze. A vizsgálat a bázikus karakterű okta-Argininra (R8), ennek

oktanoil-zsírsavláncal acilezett formájára (Okt-R8, OR8), a Transportanra és rövidebb

változatára a TP10-re ill. az MPG-re, mely a transportanhoz hasonlóan egy chimera

peptid és oxidált variációjára (MPGox) terjedt ki (lásd anyag-módszer fejezet). A

szintetizált hordozókat BL41 Burkitt lymphoma sejtvonalon teszteltük.

A Bodipy-FL (488nm gerjesztés) fluoreszcens festékkel jelzett CPP-k internalizációs

képességét konfokális lézer-páztázó mikroszkóppal vizsgáltuk, szolubilis, fixálatlan

sejteken. A sejtmembrán jelölésére a lipofil tulajdonságú DiI-C18-at, míg a hordozók

intracelluláris lokalizációjának jellemzésére az alacsony pH értékű kompartmentekkel

kapcsolatba lépő Lyso Tracker Red (543nm gerjesztés) festéket használtuk. 37 C°-on

történő 20 perces inkubációt követően a mikroszkópos felvételek alapján a CPP-k a

citoplazmában helyezkednek el diszkrét granulumok formájában. Kivételt az MPG

oxidált formája mutatott, melyet a plazmamembránhoz asszociáltan tudtunk detektálni

viszont a citoplazmában nem, ill. csak igen csekély mértékben. A granulált

elhelyezkedést mutató CPP-k a Lyso Trackerrel jelzett lizoszómákkal, ill. savas

partikulumokkal mutatnak ko-lokalizációt. A Pearson koeficiens alapján számított

korreláció mértéke az MPGox kivételével az összes hordozó esetében 0,4-0,5 közötti

értéket mutatott, amit az Image-J szoftver segítségével számoltuk. Tehát 20 perccel a

sejtek kezelése után a különböző CPP-k jelentős mennyisége ezekben a savas

vezikulákban található, melyek valószínűsíthetően a transzport során fűződtek le a

plazmamembránról (4.1.ábra). A fáziskontraszt képek alapján azt feltételezzük, hogy a

sejtmagba nem jutnak be a hordozók, de ezt magi jelöléses kísérlettel nem támasztottuk

alá.

36

DiI-C18 (piros) Bodipy-FL– CPP (zöld), Lyso-Tracker(piros)

R8

OR8

Transportan

TP10

MPG

MPGox

4.1.ábra. A Bodipy-FL (zöld) – CPP konjugátumok a sejtbe jutva részleges ko-

lokalizációt mutatnak a Lyso Tracker-el(piros) jelölt partikulumokkal. Az inkubálás

37C°-on 20 percig tartott 10 μM-os CPP koncentrációnál. Az MPG oxidált formája nem

detektálható a sejten belül.

37

A Bodipy-FL festékkel konjugált hordozók transzlokációjának kinetikai vizsgálatára és

bejutásuk mértékének kvantitatív összehasonlítására FACS analízist alkalmaztunk

(4.2.ábra). A kísérleteket 4C°-on és 37C°-on végeztük három különböző inkubációs

időtartammal. A hordozó peptidekkel történő inkubációt követően a sejtszuszpenzióhoz

propídium-jodidot (PI) adtunk, ami a sérült membránnal rendelkező sejtek magjába

jutva jelöli a halott, ill. nem ép sejteket. Az ép és halott sejtek arányából

következtethetünk a hordozók citotoxikus jellegére.

4.2.ábra

A hordozók 4 és 37C°-on is bejutnak a sejtekbe

már az 5 perces (fekete) kezelést követően, ami tovább

fokozódik 20 (zöld) ill. 60 percnél (kék). A legnagyobb

penetrációs képességet az R8 és OR8 hordozó mutatott,

melyek a többivel ellentétben a sejteket sem károsítják.

4C°

OR8

PI FL-3

Kontroll

FL-1

Bodipy

95%

37C°

R8

58%

MPG

94%

93%

38

Trans

TP10

25%

26%

Az FL-1 csatornában detektált Bodipy-FL fluoreszcencia intenzitási adatok alapján a

CPP-k 4C°-on és 37C°-on egyaránt bejutottak a sejtekbe, ami nem endocitózis

közvetített transzportra utal. Az internalizáció mértékében jelentkező különbségek jól

detektálhatók az áramlási citofluoriméter segítségével. Öt perc elteltével már jelentős

mértékben nő a sejtek FL-1-ben mért fluoreszcencia intenzitása, és a CPP-k

plazmamembránon keresztüli transzportja még tovább folytatódik a 20 és a 60 perces

inkubációs periódusok alatt. A penetráció legnagyobb mértéket az R8 és az igen hasonló

értéket mutató OR8 hordozóknál figyelhetjük meg. A Transportan-nál és a TP10-nél

jelentkező nagyobb FL-1 intenzitású csúcsokat a károsodott membránnal rendelkező ill.

elpusztult sejtek mutatják, melyekbe a CPP-k könnyebben jutnak be. Az MPG oxidált

formája az áramlási citofluoriméterrel mért eredmények alapján is igen alacsony

internalizációs éréket mutatott (az ábrán nem szerepel). A 4.2. ábra harmadik

oszlopában ábrázolt Dot Plot ábrákon látható, hogy a PI kezelést követően az MPG-vel

kezelt sejtek enyhe, míg a Transportan és TP10-el kezelt sejtek erőteljes FL-3

csatornában mért intenzitásnövekedést mutatnak, azaz PI pozitívak. Az R8 és OR8

hordozóknál ez nem figyelhető meg. A sejtek viabilitását jellemző százalékos értékeket

az alsó két kvadránsban elhelyezkedő sejtszám alapján számoltuk, melyek PI festésre

negatívak. Ez alapján az R8 és OR8 kezelt sejtek a kontrolhoz hasonlóan nem

károsodtak, míg a többi CPP hatására a plazmamembrán integritása és a sejtek

életképessége többé-kevésbé csökkent.

39

Vizsgáltuk továbbá, hogy hosszabb időtartam alatt hogyan hatnak a hordozó-

peptidek a sejtek életképességére. A vizsgálat 1, 6 és 24 órás inkubációs időközöket ill.

10 és 50 μM CPP koncentrációkat foglalt magába. Ebben az esetben is propidium-

jodidos festést alkalmaztunk az élő és károsodott sejtek elkülönítéséhez. A BL41

sejteket 96-lyukú plate-en tenyésztettük, majd a hordozókkal történő inkubációs idő

leteltével áramlási citométert használtunk az élő és elpusztult/károsodott sejtek

detektálására (4.3.ábra).

0

20

40

60

80

100

120

contr

ol

R8 1

0uM

R8 5

0uM

OR8 10u

M

OR8 50u

M

MPG 10

uM

MPG 50

uM

MPGox

10uM

MPGox

50u

M

trans

porta

n 10u

M

trans

porta

n 50u

M

TP10

10

uM

TP10

50

uM

Élő

sejte

k %

1h6h24h

4.3.ábra. A CPP-k 1, 6, 24 órás hatása a sejtek viabilitására

Az áramlási-citofluoriméteren mért életképességi adatok oszlopdiagramm formájában

láthatók a 4.3. ábrán, ahol az élő sejtek százalékos értékeit tüntettük fel. Az R8 és OR8

hordozókkal kezelt sejtek mindhárom kezelési periódus után a kontrollal

tulajdonképpen megegyező viabilitási értékeket mutattak a 10μM-os dózis esetében.

Ebben a koncentrációban az MPG, az MPGox, a TP10 és a Transportan már több mint a

sejtek felét elpusztította a 6 órás kezelést követően, ill. az MPG és az MPGox az összes

sejtet megölte/károsította a 24 órás inkubációs idő elteltével. Az 50 μM-os dózis már az

R8 és az OR8 esetében is erőteljesen toxikusnak mutatkozott, a többi CPP esetében

pedig mindhárom kezelési időben, minden sejt elpusztult ennél a koncentrációnál.

40

A későbbi műtermékek elkerülése végett tisztáznunk kellett továbbá, hogy a sejtbe

juttatott CPP-k hatással vannak-e a jelátviteli, ill. foszforilációs folyamatokra. Tehát a

kevésbé toxikus és nagy penetrációs fokkal rendelkező hordozók közül kell a leginkább

inert sajátosságút kiválasztanunk. Ennek érdekében vizsgáltuk a hordozókkal kezelt

BL41 sejtek foszforilációs mintázatának változását sejtlizátumból SDS-PAGE és

Western blot módszer segítségével. Az előzetes vizsgálatok alapján már csak az R8, az

OR8 és az MPG hordozókat teszteltük. A foszfotirozin specifikus ellenanyaggal történő

előhívás eredményeképpen azt mondhatjuk, hogy az R8 ill. OR8 hordozókkal kezelt

minták foszforilációs mintázata a kontrol mintáéval megegyező, míg az MPG a 85kDa

és 110 kDa környékén lévő, valamely fehérjék enyhe foszforilációját indukálják. Pozitív

kontrolként a BCR-ek keresztkötésével stimuláltuk a sejtek (4.4.ábra).

118-

85-

47-

5’ 30’ MPG

5’ 30’ OR8

5’ 30’ R8

A K

Wb: pTyr

Wb: PI3-K

kDa

4.4.ábra. BL41 sejtlizátum CPP indukált foszforilációs mintázata. A sejteket 5 ill. 30

percig kezeltük 10 μM-os CPP-kel . A membránt anti-foszfotirozin ellenanyaggal hívtuk

elő. K:kezeletlen kontrol, A: anti-μ specifikus ellenanyaggal aktivált pozitív kontrol.

Mennyiségi kontrolként PI3-K specifikus ellenanyaggal újra hívtuk a membránt.

41

Az elővizsgálatok eredményei alapján az arginin8 (R8) és az oktanoil-csoporttal

kapcsolt változata (OR8) bizonyultak a legalkalmasabb hordozó szekvenciáknak.

Viszont e két hordozó minden tesztben hasonló eredményt mutatott, így a további

vizsgálatokra történő kiválasztás némileg önkényesen történt a kettő közül. Irodalmi

adatok alapján a sztearilsavval konjugált R8 mintegy 100-szorosára növeli a hordozó

permeabilizációs képességét COS7 sejtekben125. Az általunk használt BL41 sejtek

esetében nem mutatkozott fokozott permeabilizáció a zsírsavlánccal megnövelt R8

hordozónál, mégis az OR8 vektort választottuk a további kísérletekhez, mert más sejtek

esetében a későbbiekben talán érvényesülhet előnyös hatása.

4.2. Az hordozó-foszfopeptid konjugátum penetrációs képességének és toxicitásának vizsgálata A megfelelő hordozó kiválasztása után a következő tisztázandó kérdés, hogy miként

változik a foszfopeptidekkel (PP) kapcsolt hordozó penetrációs képessége, sejtbe jutás

kinetikája, hőmérsékletfüggése, toxicitása a szimpla hordozó peptidhez képest. A

további kísérletekhez a Gab1 adapter fehérje SHP2 és PI3K kötőhelyeit reprezentáló,

foszforilált tirozint tartalmazó peptidszekvenciákat konjugáltuk kovalensen az OR8

hordozó vektorhoz. A hordozó-PP konstrukciók sejtbe jutását konfokális mikroszkóp

segítségével, míg a bejutás kinetikáját és hőmérsékletfüggését áramlási citométerrel

vizsgáltuk BL41 B-sejtvonalon. Az SHP2 kötő tirozinon foszforilált peptidszekvenciát

GDLDpe (pe:foszfo-észter), míg a PI3-K kötőt ELPNpe röviditésekkel jelöljük a

továbbiakban. Ezek membrán-permeábilis, hordozóhoz kötött formái az OR8-GDLDpe

és az OR8-ELPNpe (hordozó-PP)

A mikroszkópos vizsgálat során Bodipy FL fluorokrommal jelölt hordozó-PP

konstrukciók a CPPk-hez hasonlóan gyorsan transzlokálódtak a citoplazmába és ott a

Lyso Tracker-el jelöt granulumokkal ko-lokalizáltak. A Pearson koeficiens értéke 0,45

körüli érték volt mindkét peptid esetében (4.5. ábra).

42

OR8-GDLDpe OR8-ELPNpe

4.5.ábra. 10 perces inkubációt követően az OR8 hordozóhoz kapcsolt foszfopeptidek

internalizálódnak a citoplazmába és a Lyso Tracker-el ko-lokalizált, granulált

elrendeződést mutatnak. A inkubáció 37C°-on történt 10 μM-os peptidkoncentráció

mellett.

A FACS analízis során érdekes különbséget tapasztaltunk a Bodipy-val konjugált

hordozó és a hordozó-PP között a transzlokáció kinetikájában és a sejtek által felvett

peptid mennyiségében. Míg az OR8 hordozónál az idő függvényében folyamatosan

növekszik a felvett peptid intracelluláris koncentrációja, addig az OR8-GDLDpe

peptidnél nem tapasztaltunk időfüggést (4.6.ábra).

OR8 OR8-GDLDpe

4.6.ábra. A sejmembránon átjutó, hordozóhoz kapcsolt foszfopeptidek sejtbejutásának

kinetikája. 37C°-on történő 5, 20, 60 perces (piros, zöld, kék) OR8 ill. OR8-GDLDpe

kezelést követően eltérő fluoreszcencia intenzitásváltozást tapasztaltunk a két peptid

között. 10 μM-os peptid dózist alkalmaztunk.

43

Az 5 perces kezelési időt követően ugyanakkora a sejtek FL-1-ben mért fluoreszcencia

intenzitása, mint a 60 perces inkubációt követően. Emellett az OR8 hordozónál

körülbelül egy nagyságrenddel nagyobb penetrációs képességet mértünk, mint az OR8-

GDLDpe esetében egyazon kontrol mellett, ugyanabban a kísérletben.

Az időfüggés mellett vizsgáltuk a hordozó-foszfopeptid konjugátumok sejtbe

jutásának hőmérséklet és koncentrációfüggést (4.7.ábra). Az OR8-GDLDpe 4C°-on és

20C°-on ugyanakkora mértékben penetrálódott a sejtekbe, és a felvett peptid

mennyisége a fentiekkel megegyezően az inkubáció idejétől függetlenül zajlott. A

20C°-on történő 1, 10, 50 μM-os OR8-GDLDpe kezelést követően a sejtek a növekvő

dózissal korrelálva egyre több sejtpermeábilis peptidet vesznek fel. A különböző

inkubációs idők (5’, 20’) után mért azonos peptidkoncentrációk azonos FL-1-ben

mérhető intenzitási értékeket mutattak.

A B

OR8-GDLD 4C°

5’, 20’ OR8-GDLD 5’ ,10,50μM 1

OR8-GDLD 20’ ,10,50μM 1OR8-GDLD 20C° , 20’ 5’

4.7.ábra. Az OR8-GDLDpe sejtbe jutása hőmérséklet és inkubálási időtől független

(A,B oszlop), viszont dózisfüggő módon zajlik (B oszlop) BL41 sejtek esetében. Az A

oszlop mintáinál 10μM-os peptid koncentrációt alkalmaztunk.

44

Ezt követően az OR8-ELPNpe esetében már csak idő és dózis-függést vizsgáltunk

FACS analízissel. Az 5 és 30 perces inkubációs periódus és az 1, 10, 40μM-os

koncentrációk mellett az OR8-ELPNpe az OR8-GDLDpe-hez igen hasonló

eredményeket mutatott szobahőmérsékleten történő inkubálást követően (4.8.ábra).

OR8-ELPN 1μM, 5’ , 30’ OR8-ELPN 10μM, 5’ , 30’ OR8-ELPN 40μM, 5’ , 30’

4.8.ábra. Az OR8-ELPNpe koncentrációfüggően és időtől függetlenül jut a sejtekbe.

Tehát a hordozó-foszfopeptid konstrukciók sejtbe jutása - a hordozókétól némileg

eltérően - az inkubációs időtől függetlenül (az első néhány percet követően), viszont

dózisfüggő módon megy végbe.

Kíváncsiak voltunk, hogy a membrán-permeábilis foszfopeptidek miért mutattak ilyen

kinetikai sajátságokat a sejtbe jutáskor. Az időintervallumtól független és a

koncentrációtól függő internalizáció intenzitás alapján azt feltételeztük, hogy a

sejtmembrán külső és belső oldala között egy gyorsan kialakuló egyensúly alapján

oszlanak meg a hordozó-PP-k. Ebben az esetben az intercelluláris tér csökkenő

peptidkoncentrációja az intracelluláris térben lévő peptidek kiáramlását, azaz csökkenő

fluoreszcencia intenzitást vonnának maguk után. Ezt igazolandóan a következő

kísérletet hajtottuk végre a Bodipy FL-val jelölt OR8-GDLDpe, az OR8-ELPNpe és az

OR8 peptidekkel. A három peptiddel párhuzamosan 30 percig inkubáltunk 3X5 minta

sejtszuszpenziót. A minták közül az elsőt nem mostuk, viszont a másodikat egyszer, a

harmadikat kétszer, a negyediket háromszor és az ötödik mintákat négyszer mostuk

PBS-ben, majd ezt követően áramlási citométeren mértük a sejtben maradt peptidek

mennyiségét (4.9.ábra).

45

OR8-GDLDOR8-GDLD

OR8-ELPNOR8-ELPN

OR8OR8

4.9.ábra. A peptidek kimoshatóak a sejtekből, tehát a plazmamembránon keresztüli

transzportjuk kétirányú is lehet. Zöld-nem mosott, rózsszín-1x, világoskék 2x, narancs

3x, sötétkék 4x mosott sejtek.

A mért eredmények alátámasztják az elképzelésünket, azaz mindhárom peptid

kimosható a sejtekből. Az egymást követő mosások után azonban egyre kevesebb

permeábilis peptid hagyta el a sejtet, és egy alsó koncentrációhatár után úgy tűnt, hogy a

kiáramlás megszűnt. Ez a jelenség az OR8-GDLDpe-nél egyértelműen megfigyelhető, a

másik két esetben talán még egy mosási lépés tette volna ezt egyértelművé.

Vizsgáltuk továbbá a hordozóhoz kapcsolt foszfopeptidek sejtkárosító hatását 10μM

és 50μM-os koncentráció értékek mellett 1, 4, 24 órás kezelési időt követően. A

károsodott sejteket PI festéssel detektáltuk FACS segítségével (4.10.ábra).

46

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

contr. OR8-GDLD10 uM

OR8-GDLD50 uM

OR8-GDLD-Bodipy 10

uM

OR8-GDLD-Bodipy 50

uM

OR8-ELPN10uM

OR8-ELPN50uM

OR8-ELPN-Bodipy10uM

OR8-ELPN-Bodipy50uM

Élő

sejte

k %

-a1h 4h 24h

4.10.ábra. Az OR8 hordozóval kovalensen konjugált foszfopeptidek hatása BL41 sejtek

életképességére, százalékos formában feltüntetve az élő sejtek mennyiségét.

Az OR8-GDLDpe ill. OR8-ELPNpe peptidek még 50μM-os koncentrációnál sem

okoztak viabilitás csökkenést vagy csak néhány százaléknyit. Tehát a 13 aminosavnyi

foszfopeptiddel megnövelt hosszúságú hordozó még kevésbé toxikus, mint az OR8

hordozó magában. Viszont a Bodipy FL festék peptidekhez kapcsolása növelte a

konstrukció toxicitást, ami az 50μM-os dózisnál jelentkezett. Ezt a körülményt

figyelembe kell venni a festékkel konjugált peptid-kezelések során.

4.3. A foszfopeptidekhez kapcsolódó fehérjék azonosítása Annak tisztázására, hogy a sejtbe juttatott foszfopeptidek milyen hatással lehetnek a

jelátviteli folyamatokra, ismernünk kell, hogy milyen fehérjékkel léphetnek

kölcsönhatásba. Munkacsoportunk SPR (Surface Plasmon Resonance) módszerrel

korábban már kimutatta, hogy a Gab1 eredetű GDLDpe (Y627) peptid nagy affinitással

(Kd=1,5) kötődik az SHP2 tirozin foszfatázhoz111. Az ELPNpe (Y447) peptid irodalmi

adatok szerint a PI3-K megkötéséért felelős szekvencia. A továbbiakban vizsgáltuk,

hogy a két peptid és a GDLD különböző módosított formái milyen fehérjékkel

asszociálódnak BL41 sejtek lizátumában.

47

A kísérlet során streptavidinnel fedett gyöngyökhöz kötöttük a peptidek biotinált

formáit és inkubáltuk kontroll, ill. anti-IgM-el aktivált sejtek lizátumaival. A lizátumból

íly módon, szelektíven kihalászott fehérjék a gyöngyökhöz kapcsolódnak (pull down

assay). A gyöngyöket redukáló mintapufferben főztük, majd SDS-PAGE-t követően

Western blot analízis során specifikus ellenanyagokkal mutattuk ki a peptidekhez

kötődő fehérjéket (4.11.ábra). Az eredmények megerősítésére a gélből kivágott mintákat

tömegspektroszkópiás analízissel is azonosítottuk. A GDLDpe peptid

(GDKQVEY(p)LDLDLD) módosított formáit egyrészt kontrolként kívántuk

alkalmazni, másrészt kíváncsiak voltunk, hogy a kapcsolódó fehérjék mennyire

szekvencia specifikusak. Kontrol peptidnek tirozin-fenilalanin cserélt GDFLD-t ill.

tirozinon nem foszforilált GDLD-t szintetizáltattunk. Vizsgáltuk továbbá egy irodalmi

adatok szerint foszfatázokkal szembeni rezisztenciát okozó, a foszfát csoportban

oxigén-kén atom cserét hordozó GDYLDsp (tiofoszfát) peptidet 126. A QVDLpe peptid

pedig a GDLDpe N és C-terminálisan 3-3 aminosavval rövidített formája. Az ELPNpe

módosított formáit nem vizsgáltuk.

- + - + - +

BL41 lysate

Biot EL

4.11.ábra. A biotinált GDLDpe és módosított formáival ill. a biotinált ELPNpe

peptidekkel sejtlizátumban asszociálódó fehérjék azonosítása SDS-PAGE, Western blot

analízissel. Kontrol (-) és anti-IgM-el stimulált (+) BL41 sejtek lizátumát használtuk.

Az ábrán látható specifikus ellenanyagokkal történő előhívás után azt az eredényt

kaptuk, hogy az eredeti GDLDpe és módosított, tiofoszfát változata, a GDLDsp is

YPN pe

- + - + - +

130-

95-

72-

55-

PLCγ2

SHP2

kDa

BL41 lysate

Biot- GDYLD pe

Biot-GD

YLD sp

Biot- QV DL

Ype

Biot- GD

FLD Biot- GDYLD

PI3-K

Anti-I

PLCγ2

PI3-K SHP2

Lyn

pErk

Lyn

gM - + - +

48

erőteljesen asszociálódik az SHP2 tirozin foszfatázzal. Emellett a GDLDpe peptidhez a

PLCγ2 is egyértelműen kapcsolódik, míg a GDLDsp-nél ez a kapcsolat kevésbé

egyértelmű, inkább a röntgenfilm túlexponálásának a következménye (ahogy a Lyn

esetében is). A másik érdekesség, hogy a rövidítet QVDLpe szekvenciánál a PLCγ2-vel

a kapcsolat megmarad, viszont az SHP2 nem kötődik hozzá. A kontrolként használt

GDFLD ill. a GDLD nem foszforilált formájához sem az SHP2-t sem a PLCγ2 lipid

foszfatázt nem kötődött. Továbbá az ELPNpe foszfopeptidhez a vizsgált fehérjék közül

csak a PI3-K kötődött, míg ez a fehérje a GDLD egyik formájához sem asszociálódott .

A gélfestésből kiderült, hogy a kontrolként használt streptavidin gyöngyhöz több

fehérje is kötődött aspecifikusan. Ezek az MS-el azonosított fehérjék azonban a biotinált

peptidekkel fedett gyöngyöknél nem jelentek meg, tehát nem jelentettek zavaró

tényezőt. Az egyes peptidekhez kapcsolódó fehérjék tekintetében az MS-el mért adatok

alátámasztották a specifikus ellenanyagokkal kimutatott eredményeket (4.12.ábra).

1 2 3 4 5 6

4.12.ábra. A poliakrilamid gélből kivágott fehérjék azonosítása tömegspektroszkóppal.

A gél fölött az adott minta előállításához használt biotinált peptidek láthatók, míg jobb

oldalt az egyes mintákból azonosított fehérjéket és azok molekulatömegét ábrázoltuk. A

gélen pirossal bekeretezett minta megfelel a jobb oldalon bekeretezett azonosított

molekuláknak.

Da

1. -acetyl-CoA 270 000 -methylcrotonoyl-CoA 80 000

- Hsp 60 61 000 2. -PI3-K kat. alegység 120 000 -PI3-K reg alegység 83 000

-Hsp 90 98 000 3. -SHP-2 68 000

-beta aktin 41 000 4. -PLCgamma2 149 000

-PLCgamma1 161 000 -SHP-2 70 000 5. -PLCgamma2 149 000

6. -Hsp70/Hsp90 62 000 -alpha 1 aktin 42 000 -laktóz dehidrogenáz 36 000

Stre

ptav

idin

gyö

ngy

EL Y

p Ysp

Yp Yp F

PN

GD

LD

GD

LD

QV

DL

GD

LD

95-

72-

55-

42-

130-110-

Stre

ptav

idin

gyö

ngy

EL

PN

GD

LD

GD

LD

QV

DL

GD

LD

95-

72-

55-

42-

Yp Ysp

Yp Yp F

kDa

130-110-130-110-130-110-95-

72-

55-

42-

95-

72-

55-

42-

49

A festett gélkép és az MS adatok rávilágítanak arra, hogy a Western blottal kimutatott

fehérjéken kívül további molekulák is asszociálódnak a peptidekhez (pl. β-actin, Hsp60,

Hsp70). A negatív kontrol GDFLD például tényleg nem kötődött a PLCγ2 vagy SHP2-

höz, viszont három másik fehérje interakcióba lépett vele. Az eredményekből nem

minden esetben lehet megállapítani, hogy a fehérje közvetlen kapcsolatban volt-e az

adott peptiddel, vagy egymáshoz kapcsolódva, komplex formában halásztuk-e ki őket a

lizátumból.

4.4. A foszfopeptidek in vitro SHP2 enzim-aktivitást módosító hatása A tirozinon foszforilált permeábilis peptidek a sejtekbe jutva többféle módon

befolyásolhatják a jelátviteli folyamatokat. Adott enzim SH2 doménjeivel interakcióba

lépve fokozhatják az enzim katalitikus aktivitását, betölthetnek szubsztrát szerepet és

kompetálhatnak az endogén SH2 domén kötő fehérjeszekvenciákkal.

Teszteltük tehát a peptidek enzim-aktivitást befolyásoló tulajdonságait. Mivel a

csoportunk rendelkezett SHP2 rekombináns fehérje nagymennyiségű előállítására

alkalmas baktérium-expressziós rendszerrel, ezért a foszfopeptideket erre az enzimre

kidolgozott foszfatáz-assay-ben vizsgáltuk. A foszfopeptidek egyrészt a szubtrát

szerepet töltik be a rendszerben, másrészt az SHP2 SH2 doménjéhez kapcsolódó

foszfopeptid aktiválja az enzimet. Az ELISA alapú rendszer lényege, hogy a biotinált

foszfopeptideket a megfelelő pufferben rekombináns SHP2-vel inkubáltunk, majd az

enzimreakciót követően avidinnel fedett plate-re vittük fel. A mosási lépéseket követően

specifikus ellenanyaggal detektáltuk a maradék, SHP2 által nem defoszforilált, plate-

hez kötött foszfopeptidet. Tehát gyenge enzim-aktivitásnál sok foszfotirozint

detektáltunk és erős jelet kaptunk, míg az enzim-aktivitás növekedésével folyamatosan

csökkent a detektálható foszfopeptid mennyisége, így a jel erőssége is csökkent. A

kísérletben az ELPN és QVDL peptidek a negatív kontrol szerepét is betöltik

A 6nM-os enzimkoncentrációjú minták esetében azt tapasztaltuk, hogy mindhárom

peptid jelentős mértékben defoszforilálódott. Mivel az előzetes vizsgálatok alapján

bebizonyosodott, hogy az ELPNpe és QVDLpe peptidek nem kötődnek az SHP2

fehérjéhez, azaz SH2 doménen keresztül sem aktiválhatják, ezért ezekben az esetekben

csak az enzim alapaktivitása érvényesülhetett. Ezt támasztja alá az a tény is, hogy az

50

SHP2 koncentráció csökkentésével az ELPNpe és QVDLpe minták a kontrol értékekhez

tartó foszforiláltságot mutattak ugyanazon peptidkoncentrációknál. Az SHP2-höz

kapcsolódni képes GDLDpe esetében a 6 és 3 nM-os enzimkoncentrációnál minden

peptid defoszforilálódott, és az OD értékek a hatvanszoros SHP2 higítást követően is

csak a kontroll értékek 25%-át érték el (4.13.ábra). Tehát a kísérletből kiderűlt, hogy in

vitro körülmények között mindhárom tirozinon foszforilált peptid-szekvencia lehet

szubsztrátja az SHP2 tirozin foszfatáznak, és a GDLDpe peptid fokozni képes az enzim

katalitikus aktivitását.

.

0,00

0,05

0,10

0,15

0,20

0,25

0,30

0,35

0,40

0,45

_ 6 3 1,5 0,75 0,37 0,18 0,09 SHP2 nM

OD

biot-GDLDpe

biot-QVDLpe

biot-ELPNpe

4.13.ábra. A foszfopeptidek hatása az SHP2 enzimaktivitásra. Az indirekt mérés alapján

a gyenge jel nagy enzimaktivitást jelöl. Az enzimet felező higításban alkalmaztuk

állandó (0,5μM) peptidkoncentráció mellett. A kontroll minták csak a foszforilált

peptidet tartalmazták, SHP2-t nem.

Ezzel a módszerrel a GDLDsp enzim-aktiváló tulajdonságát ill. foszfatáz rezisztenciáját

nem tudtuk mérni, mert az előhívás során használt foszfotirozin-specifikus ellenanyag a

módosított foszfát-csoport miatt a peptidet nem ismerte fel.

51

4.5. A sejten belüli Gab1-SHP2 interakció gátlása a sejtmembrán-permeábilis foszfopeptidekkel A 4.4 pontban említettük, hogy a foszfopeptidek a sejtbe jutva SH2 domén tartalmú

fehérjékhez kötődve gátolhatják a molekuláris interakciókat. A kérdés tisztázására a

következő kísérletet végeztük el. Az OR8 hordozóval konjugált peptidekkel (5μM)

előkezelt BL41 sejteket BCR keresztkötéssel stimuláltuk, majd lizáltuk a sejteket. A

lizálást követően Gab1 ill. SHP2 specifikus monoklonális ellenanyaggal

immunprecipitációt végeztünk, majd SHP2 ill. Gab1 specifikus ellenanyaggal

ellenőriztük a Gab1-SHP2 interakció változását (4.14.ábra).

kDa

anti-IgM - + + + + +

OR8-GDpe - - 5’ 30’ - -OR8-GDsp - - - - 5’ 30’

anti-IgM - + + + + +

OR8-GDpe - - 5’ 30’ - -OR8-GDsp - - - - 5’ 30’

A

-72

-110

-95

SHP-2

IP:Gab1

Gab1

WB:

-72

-110

-95

SHP-2

IP:Gab1

Gab1

WB:

kDaB

C A GD GD El pe sp pe

anti.-IgM - + + + +

C A GD GD El pe sp pe

anti.-IgM - + + + +

WB: Gab1

SHP2

110-

95-

IP:SHP-2

72-

4.14.ábra. Az OR8-GDLP pe ill.OR8-GDLDsp peptidekkel 5 percig kezelt sejtekben a

Gab1-SHP2 interakció erőssége csökken (A és B panel), míg az OR8-ELPNpe peptiddel

kezelt mintában nincs változás (B panel 5 perces kezelés).

52

Az anti-IgM stimulust követően kialakuló Gab1-SHP2 interakció erőssége jelentős

mértékben csökken az 5 perces OR8-GDLDpe előkezelésen átesett mintákban. A 30

perces előinkubálást követően a peptid hatása sokkal gyengébben érvényesül, visszaáll a

pozitív kontrolra jellemző Gab1-SHP2 kapcsolat. Az OR8-GDLDsp esetében ugyanezt

tapasztaltuk (4.14.ábra A panel). Az OR8-ELPNpe peptid esetében ez a hatás nem

jelentkezik az elvártaknak megfelelően, ugyanis nem kompetál az endogén Gab1 SHP2

kötőhelyeivel (4.14.ábra B panel). A eredmények azt bizonyítják tehát, hogy a sejtbe

jutott GDLDpe peptid egy bizonyos időintervallumban gátolja az Gab1 SHP2 kapcsolat

kialakulását.

4.6. Az OR8-GDLDpe és az OR8-ELPNpe peptidek hatása az intracelluláris fehérje foszforilációs mintázatra. A következő lépésben arra a kérdésre kerestünk választ, hogy a BL41 sejtekbe

juttatott OR8-GDLDpe és OR8-ELPNpe peptidek megváltoztatják-e a nyugvó sejtek

tirozin foszforilációs mintázatát. A kísérletben két peptidkoncentrációt, és 5 perctől 120

percig terjedő inkubálási időket alkalmaztunk.

OR8-GDLDpe

Wb: anti-pTyr

SHP2

pErk

130- 100- 70-

55-

40-

kDa

5’ 20’ 60’ 120’ OR8-40µM GDLDpe

- - 5’ 20’ 60’120’

1µM5’ 20’ 60’ 120’ OR8-

40µM GDLDpe- - 5’ 20’ 60’120’

1µM

- + - - - - - - - - anti-IgM 2’- + - - - - - - - - anti-IgM 2’

10

4.15.ábra. Az OR8-GDLDpe peptid hatására kialakuló fehérje-foszforilációs

állapotváltozás nyugvó B sejtekben. Kontrolként kezeletlen és BCR keresztkötött

mintákat alkalmaztunk.

53

Az 1μM-os OR8-GDLDpe peptid hatására 60 és 120 percnél fokozatosan erősödő

fehérje foszforilációt figyelhettünk meg, amely egy 55 kDa körüli fehérjénél

jelentkezett a legintenzívebben (4.15.ábra). A magasabb dózis alkalmazásánál csak az 5

perces mintában láthattunk egy enyhe intenzitásbeli növekedést a szintén 55 kDa körüli

fehérje foszforilációjában. Sem a kisebb, sem a nagyobb dózisú peptidkezelés hatására

nem idukálódott az Erk szerin/treonin kináz foszforilációja.

Az OR8-ELPNpe peptid kezelés hatására viszont egészen más változás következett

be a nyugalmi foszforilációs mintázatban. Az 1 és 10 μM-os peptid dózis

alkalmazásánál határozottan megszűnik egy fehérje foszforilációja a 20 percig kezelt

mintákban, melynek mólsúlya szintén 55kDa környékén helyezkedik el. Ugyanakkor

más fehérje foszforilációja 85 kDa körül változatlan marad ugyanezekben a mintákban.

Az OR8-ELPNpe peptid kezelés sem indukálta az Erk és az Akt kinázok foszforilációját

(4.16.ábra). Az 55 kDa-os fehérjét még nem azonosítottuk, egyelőre a peptidek

szelektív hatására voltunk kíváncsiak. Az ábrák 2-3 független kísérlet egybevágó

eredményeit reprezentálják.

58-

45-

Wb: anti-pTyr

SHP2

OR8-ELPNpe

116-90-

58-

45-

OR8-ELPNpe

116-90-

58-

45-

116-90-

58-

45-

pErk

pAkt

kDa

5’ 20’ 60’ 120’ OR8-10µM ELPNpe

- - 5’ 20’ 60’120’

1µM5’ 20’ 60’ 120’ OR8-

10µM ELPNpe- - 5’ 20’ 60’120’

1µM

- + - - - - - - - - anti-IgM 2’- + - - - - - - - - anti-IgM 2’

4.16.ábra. Az OR8-ELPNpe peptid hatása nyugvó B sejtek tirozin-foszforilációs

mintázatára. A strippelt membránt újra hívtuk pAkt és pErk specifikus ellenanyagokkal.

54

Ezt követően megvizsgáltuk, hogy változik-e a BCR keresztkötés hatására kialakuló

Erk, Akt, ill. össz foszforilációs mintázat, ha a sejteket különböző ideig előkezeljük a

permeábilis foszfopeptidekkel. A különönböző előkezelési idők után egységesen két

percig aktiváltuk a sejteket IgM specifikus monoklonális ellenanyaggal. Ezután SDS-

PAGE , majd Wester blot technikák segítségével analizáltuk a foszforilációs mintázat

változásást (4.17.ábra). A GDLD peptid estében elsősorban arra voltunk kíváncsiak,

hogy a sejtbe jutott peptid befolyásolja-e a BCR keresztkötés által indukált Erk

foszforilációt. Az ELPN esetében, pedig egyrészt a GDLD hatásával való egyezéseket

ill. különbségeket figyeltük az Erk vonatkozásában, valamint a PI3-K-Akt útvonalra

gyakorolt hatást vizsgáltuk.

Az 1μM-os koncentrációjú OR8-GDLDpe előkezelés hatására egy erőteljes

intenzitásbeli növekedés figyelhető meg az össz-fehérje tirozin-foszforilációjában a csak

anti-IgM-el kezelt pozitív kontrolhoz képest. Az anti-IgM és a foszfopeptid

szinergisztikus hatása a 60 és 120 percig előkezelt mintáknál mutatkozott, hasonlóan a

csak peptiddel kezelt mintákhoz. A 10μM-os peptiddózis esetében ugyanez a hatás az öt

perces előinkubálásnál jelentkezett. Az Erk aktiváció vizsgálatánál azt tapasztaltuk,

hogy az öt perces OR8-GDLDpe kezelést követően az Erk foszforilációja csökkent a

pozitív kontrolhoz viszonyítva 1μM-os dózisnál. A 10μM-os pepid koncentrációnál

semmilyen inkubálási időnél nem tapasztaltunk változást az Erk foszforilációban. Az

Akt foszforilációja egységesen azonos képet mutatott, az anti-IgM-el aktivált mintához

képest nem tapasztaltunk eltérést. Az OR8-ELPNpe kezelt minták esetében a totál

fehérje foszforilációs szint enyhén emelkedett szintet mutatott a pozitív kontrolhoz

viszonyítva a legtöbb mintában. Az 1μM-os peptid dózis esetében a 60 perces, míg a

10μM-os koncentráció esetében 5 percnél figyeltük meg a legintenzívebb foszforilációt.

Az Erk foszforilációban megfigyelhető erősödés korrelált az össz fehérje-foszforiláció

változásával. Az Akt foszforilációjában itt sem tapasztaltunk eltérést a kontrolhoz

képest. Tehát az OR8-GDLDpe és az OR8-ELPNpe ellentétes módon befolyásolta az

anti-IgM indukált Erk foszforilációt, míg az Akt foszforilációjára egyik sem volt

hatással.

55

Wb:

anti-pTyr

panErk

55-

40-

70-

55-

40-

70-

pErk

pAkt

A

5’ 20’ 60’ 120’ OR8-10µM GDLDpe

- - 5’ 20’ 60’120’

1µM5’ 20’ 60’ 120’ OR8-

10µM GDLDpe- - 5’ 20’ 60’120’

1µM

- + + + + + + + + + anti-IgM 2’- + + + + + + + + + anti-IgM 2’

100-

55-

40-

130-

70-

kDa

100-

55-

40-

130-

70-

kDaOR8-GDLDpe

OR8-ELPNpe

Wb: anti-pTyr

panErk

pErk

pAkt

5’ 20’ 60’ 120’ OR8-10µM ELPNpe

- - 5’ 20’ 60’120’

1µM5’ 20’ 60’ 120’ OR8-

10µM ELPNpe- - 5’ 20’ 60’120’

1µM

- + + + + + + + + + anti-IgM 2’- + + + + + + + + + anti-IgM 2’

116-90-

58-

45-

116-90-

58-

45-

kDaB

4.17.ábra. Az OR8-GDLDpe (A) és az OR8-ELPNpe (B) peptidek hatása a BCR

keresztkötésével indukált intracelluláris fehérje-foszforilációra.

56

Kontrol peptidnek az OR8-GDLD szekvencia nem foszforilált formáját

teszteltük ugyanebben a rendszerben. A tirozinon nem foszforilált OR8-GDLD azonban

az OR8-GDLDpe-hez hasonlóan gátolta az anti-IgM indukált Erk foszforilációt az 5

percig előkezelt mintákban (4.18.ábra). Mivel az előzetes in vitro kísérletekben

bebizonyosodott, hogy ez a kontrol peptid nem kötődik az SHP2 tirozin foszfatázhoz,

úgy gondoljuk, hogy a sejtbe jutva kinázok által foszforilálódhatott és ez által nyert

biológiai aktivitást.

58-

46-

58-

46-

58-

46- pErk

pAkt

- - 2’ 5’ 20’ - - - OR8-GDLDpe- - - - - 2’ 5’ 20’ OR8-GDLD- - 2’ 5’ 20’ - - - OR8-GDLDpe- - - - - 2’ 5’ 20’ OR8-GDLD

- + + + + + + + anti-IgM

4.18.ábra. Az OR8-GDLD foszforilált és és nem foszforilált formája egyaránt gátolta az

anti-IgM indukált Erk aktivációt. Feltételezzük, hogy a sejtbe jutott peptideket az

intrcelluláris kinázok foszforilálják.

Mivel a tirozin-fenilalanin cserélt OR8-GDFLD peptid sem mutatkozott

konzekvensen inert szekvenciának a precipitációs és fehérje foszforilációs

kísérletekben, ezért a továbbiakban egy kevert GDLD szekvenciát használtunk negatív

kontrolként.

A negatív kontrolként használt kevert szekvenciájú OR8-DELD peptid valóban nem

befolyásolta az anti-IgM indukált Erk foszforilációt. Azonban a munkacsoportunk az

eddig használt monoklonális anti-IgM helyett ezután egy Jackson gyártmányú, affinitás

tisztított kecskében termelt anti-IgM + anti-IgG pecifitású ellenanyagot használt a B-sejt

receptorok keresztkötésére. Az ellenanyagcsere következtében, az előzőekkel azonos

körülmények között végrehajtott kísérletekben, a sejt-permeábilis foszfopeptidek az

eddigiektől eltérő hatást gyakoroltak az Erk foszforilációra. Az OR8 hordozóhoz

kapcsolt GDLDpe, GDLDsp és ELPNpe peptidek egyaránt gátolták a BCR

keresztkötésével aktivált Erk foszforilációt, azonban nem az 5 perces, hanem minden

57

esetben a 60 perces előinkubálást követően. Az OR8-ELPNpe esetében ez a jelenség a

60 perces mintákban az Akt foszforiláció gátlásával is párosult (4.19.ábra).

pAkt

panErk

panErk

pAkt

pErk

panErk

pErk

pErk pErk

panErk

4.19.ábra. A kevert szekvenciájú kontrol peptid kivételével, minden aktív peptid

esetében a 60 perces előkezelést követően tapasztaltuk az Erk foszforiláció gátlását. Az

ELPN peptid a GDLD-től eltérően az Akt foszforilációját is gátolta.

Tehát a különböző ellenanyagokkal aktivált BL41 sejtekben a permeábilis peptidek

eltérő módon hatottak az Erk foszforiláció kinetikájára, emellett az anti-IgG+IgM

(Jackson) ellenanyag esetében a PI3-K kötő ELPNpe peptid is gátolta az Erk

aktivációját. A továbbiakban tisztáznunk kellett, hogy a permeábilis foszfopeptidek

általi Erk foszforiláció gátlása SHP2 közvetített módon zajlik-e, ill. más sejtek esetében

milyen hatást gyakorolnak a peptidek a BCR indukált Erk/Akt foszforilációra.

58

4.7. Az SHP2 szerepe az Erk foszforiláció gátlásában A DT40 csirke B-sejtvonal általánosan használt vizsgálati rendszer a különböző gén

kiütött sejtek jelátvitelének vizsgálatára 127. Kísérletünkben a foszfopeptidek hatását

hasonlítottuk össze SHP2 foszfatázt tartalmazó vad típusú és SHP2 kiütött DT40

sejteken. A korábbi kísérletekhez hasonlóan a sejteket különböző ideig előkezeltük a

sejt-permeábilis foszfopeptidekkel (1μM-os koncentráció), majd csirke IgM specifikus

ellenanyaggal aktiváltuk a sejteket.

Wb:

SHP2

pErk

pErk

PI3-K

2’

4.20.ábra. Az OR8-GDLDpe peptid gátolja az Erk foszforilációját a vad típusú DT40

sejtekben (120 percnél), míg ez a hatás az SHP2-re kiütött DT40 ΔSHP2 sejtekben

megszűnik. Az OR8-ELPNpe peptid mindkét esetben gátolta az Erk aktivációt.

Az eredmények tulajdonképpen megegyeznek a BL41 sejteken végzett kísérletekkel,

amelyben az anti.IgG+IgM ellenanyagot használtuk. A 120 perces előinkubálást

követően az OR8-GDLDpe, az OR8-GDLDsp (nem ábrázoltuk), és az OR8-ELPNpe

peptidek egyaránt gátolták a BCR indukált Erk foszforilációt a vad típusú DT40

sejtekben (4.20.ábra). Az SHP2 deletált DT40 sejtekben az OR8-GDLDpe gátló hatása

megszűnik, míg az OR8-ELPNpe esetében az Erk foszforiláció gátlása megmarad. A

SHP2 fehérje hiányát Western blot technikával ellenőriztük sejtlizátumból. Az

eredmények alapján a GDLDpe peptid SHP2 függő módon gátolja az Erk foszforilációt,

míg az ELPNpe általi gátlás SHP2-től függetlenül zajlott.

59

4.8. A PI3-K függő degranuláció gátlása RBL hízósejtekben Az OR8-ELPNpe peptiddel törénő 60 perces előkezelés a BL41 sejtekben gátolta a

BCR keresztkötéssel kiváltott Akt foszforilációját. Az Akt kináz aktiválásában központi

szerpet játszik a PI3-K, amely a Gab adapter fehérjéhez kötődve, a PIP3 termelésén

keresztül indukálhatja a PH doménnel rendelkező Akt membrán asszociációját és

foszforilációját. Tisztázni kívántuk, hogy a Gab1 eredetű OR8-ELPNpe peptid a PI3-K

endogén kötőhelyével kompetálva gátolja-e a PI3-K-Akt aktivációs utat.

Az hízósejtek IgE receptor közvetített degranulációja részben PI3-K függő részben

attól független jelátviteli úton indukálódik 113,128. A PI3-K függő folyamatban

nélkülözhetetlen a Gab2-PI3-K interakció. Az RBL 2H3 hízósejteken végzett

degranulációs teszt lehetőséget nyújt arra, hogy vizsgáljuk az OR8-ELPNpe szerepét a

Gab2-PI3K közvetített jelátviteli folyamatban. A kísérlet során a foszfopeptidekkel 1

óráig előkezelt RBL sejteket DNP-BSA antigénnel aktiváltuk, majd ezt követően

mértük a degranuláció mértékét (4.21.ábra). Az LY294002

PI3-K gátlószert használtuk kontrolként, és összehasonlító vizsgálatként a PI3-K-hoz

nem kötődő OR8-GDLDpe peptiddel is kezeltük a sejteket. A degranuláció mértékét a

peptidkezelés nélküli 100%-os értékhez viszonyítva százalékos formában adtuk meg.

pe

4.21.ábra. A foszfopeptidek által gátolt PI3-K függő degranuláció RBL hízósejtekben

60

A kísérlet előtt konfokális mikroszkóp segítségével ellenőriztük a permeábilis peptidek

bejutását az RBL sejtekbe. Érdekes módon az OR8-GDLDpe hasonló mértékben gátolta

a DNP-BSA indukált degranulációt, mint az OR8-ELPNpe leghatásosabb

koncentrációja. Mindkét peptid hatása megközelítette az LY294002 általi gátlás

mértékét. A kísérlet alapján feltételezzük, hogy az OR8-ELPNpe peptid gátolni képes a

PI3-K kötődését a Gab2 adapter fehérjéhez, ami által a PI3-K-tól függő további

folyamatok is korlátozottá válnak. Mivel a GDLDpe peptid nem kötődik a PI3-

kinázhoz, ezért ez csak közvetett módon fejthetett ki gátló hatását a degranuláció

folyamatára.

Az eddigi eredmények alapján azt mondhatjuk, hogy a GDLDpe peptid egyaránt

befolyásolhatja az Erk és a PI3-K aktivációjában szerepet játszó jelátviteli lépéseket, ill.

az ELPNpe peptid szintén hatást gyakorol mindkét fehérje aktivitására.

4.9. Módosított peptidek alkalmazása A fenti kísérletek alapján azt állítjuk, hogy a sejtpermeábilis, Gab1 adapter fehérje

eredetű foszfopeptidekkel befolyásolni tudjuk a túlélési és növekedési szignálok egyes

korai jelátviteli lépéseit az Erk ill. PI3-K-Akt fehérjék szintjén. Azonban a sejtbe jutott

foszfopeptidek többféle módon is szerepet játszhatnak a jelátviteli fehérjék

aktivitásának szabályozásában, ezért egyes kísérletekben nem lehet egyértelműen

megállapítani az aktív peptid szerepét. A peptidek általi gátlás hatásmechanizmusának

pontosabb megértésében segítséget jelenthet olyan módosított peptidek alkalmazása,

melyek szűkebb hatásspektrummal rendelkeznek. A további tervek között szerepel tehát

olyan módosított peptidek tervezése és funkcionális analízise, amelyek segítségével

szelektívebb hatást érhetünk el, és ezáltal pontosabban feltérképezhetjük a Gab1-Erk ill.

Gab1-PI3-K jelpályák szabályozását B sejtekben. Az egyik ilyen irányú törekvést a

foszfatáz rezisztens tiofoszfát peptid alkalmazása jelentette, ugyanis ennél a peptidnél

elgondolásunk szerint nem kell számolnunk azzal, hogy a sejtbe jutva a foszfatáz

inaktiválja a peptidet, mivel irodalmi adatok szerint ez nem lehetséges 126. Azonban a

GDLDsp peptid az összes kísérletben a GDLDpe peptiddel megegyező hatást mutatott.

A továbbiakban vizsgálnunk kell tehát egy anorganikus foszfát-csoport felszabadulását

mérő foszfatáz rendszerben, hogy a tiofoszfát módosítás csakugyan foszfatáz

rezisztenciát okoz-e.

61

A továbbiakban a legrövidebb hatékony peptidszekvenciát szerettük volna

megtalálni. A GDLD peptid rövidítésével egy olyan szekvenciához jutottunk, amely az

SHP2 fehérjéhez még kötődik, de az enzim aktivitást fokozó hatása jóval gyengébb a 13

aminosavnyi GDLDpe peptidnél.

GDKQVEY(p)LDLDLD

DKQVEY(p)LDLD

KQVE LDLDY(p)

QVE LDLDY(p)

A

Wb:

B

4.22.ábra. A rövidített GDLDpe peptidekhez asszociálódó fehérjék (A). A peptidek SHP

enzim aktivitást módosító hatása, a maradék foszfotirozint ábrázolva (B), ahol az

alacsony OD érték nagy SHP2 aktivitást jelent.

Először a már korábban leírt, úgynevezett pull-down assay segítségével vizsgáltuk a

különböző rövidített peptidekhez kapcsolódó fehérjéket. A korábbi vizsgálatokkal

összhangban az összes rövidített szekvencia asszociálódott a PLCγ2-val, viszont az

62

SHP2-höz csak a 10 aminosav hosszúságú peptid kötődött. Az SHP2-vel kapcsolódni

képes DKLDpe enzim aktivitást fokozó hatása a két rövidebb peptiddel (KQLDpe,

QVLDpe) egyezett meg, amit az SHP2 alapaktivitásának tulajdoníthatunk, és jóval

kevésbé módosította az SHP2 foszfatázaktivitását, mint a teljes hosszúságú GDLDpe

peptid.

63

5. Megbeszélés

A tirozinon foszforilált fehérjék kölcsönhatása az SH2 doménekkel kulcsszerepet

játszik a jelátviteli folyamatok szabályozásában. A multimolekuláris jelátviteli

komplexekeben a foszfotirozint hordozó motívumok szelektíven kötődnek a különböző

jelátviteli molekulák SH2 doménjeihez, ezen keresztül lehetőség nyílik a kinázok és

foszfotázok lokalizációjának és aktivitásának pontos szabályzására7,129,130. Nagyszámú

próbálkozás irányult már a jelátviteli kaszkádok gátlásának megvalósítására a fehérje-

fehérje interakciók blokkolása révén. In vitro kísérletekben már számos esetben sikerült

szintetikus, SH2 doménhez kötődő fehérje szekvenciákat reprezentáló foszfopeptidekkel

(PP) gátolni különböző SH2 domének és foszforilált fehérjék közötti specifikus

kölcsönhatások kialakulását131-133. In vivo körülmények között azonban a

foszfátcsoport negatív töltése következtében a PP-ek nem képesek átjutni a lipid

kettősréteg alkotta sejtmembránon. A PP-ek sejtbe juttatásának egyik lehetséges módja

a plazmamembrán átjárhatóvá tétele (például LPC kezeléssel), ami által azonban a

membrán integritása károsodást szenved. A sejtek fiziológiás állapotát kevésbé

módosító lehetőség, hogy magát a PP-t tesszük permeábilissá. Több olyan természetes

eredetű, membrán permeábilis peptid szekvenciát ismerünk, amelyek hordozó

molekulaként viselkedve képesek a hozzájuk kapcsolt bioaktív peptideket/fehérjéket a

sejtek citoplazmájába/sejtmagjába juttatni 118-122. Mivel a foszfotirozin tartalmú

motívumok (pYXXX, ahol az X bármilyen aminosav lehet) specifikusan kapcsolódnak

a különböző fehérje SH2 doménekhez, a sejt permeábilis foszfopeptidek modellként

szolgálhatnak az SH2 domén alapú, fehérje-fehérje kölcsönhatás blokkolására szolgáló

peptid-mimetikumok, ill. kis molekulasúlyú gátlószerek tervezéséhez.

A Gab1 adapter fehérje fontos szerepet játszik több receptor és nem receptor-tirozin

kináz által aktivált jelpálya szabályozásában. A sejtaktiváció során a számos tirozinján

foszforilálódó adapter molekula interakciós felszínt képez az SH2 domén tartalmú

kinázok, foszfatázok és/vagy SH3 doménnel rendelkező további adapter molekulák

számára. A Gab1 fehérjéhez kapcsolódó, SH2 domén tartalmú fehérjék közül a

legtöbbet tanulmányozott az SHP2 tirozin foszfatáz és a PI3 kináz jelátvitelben betöltött

szerepe. A Gab1-SHP2 interakció több növekedési és citokin receptor esetében szerepet

játszik a Ras-Erk aktivációs jelpálya pozitív szabályozásán keresztül a növekedési és

64

proliferációs szignálokban. A Gab1-PI3-K kapcsolat az Akt szerin kináz által közvetített

túlélési, ill. anti-apoptotikus jelpályák aktiválásában tölt be fontos szerepet103,134. Az

SHP2 és PI3-K gének onkogenikus mutációi következtében átíródó fehérjék hibás

működése a sejtek rosszindulatú transzformációjához és kóros sejtburjánzáshoz

vezethet, így ezek a fehérjék, ill. a különböző jelpályákban betöltött szerepük a

tumorterápiás kutatások kiemelt célpontjaivá váltak. A malignus limfomák a limfoid

rendszer klonális daganatos betegségei. Jelenleg a 6. leggyakoribb daganattípus és a

halálozás vonatkozásában is az 5-6. helyen áll. Feltételezzük, hogy szintetikus tirozin

foszfopeptidek sejtbe juttatásával gátolhatók azok a patológiás jelátviteli utak,

amelyeknek szerepük van a B-sejt limfómák kialakulásában.

A B limfociták antigénkötő receptoraikon keresztüli aktivációját követően a Gab1

számos tirozinján foszforilálódik és kölcsönhatásba lép többek között az SHP2 és PI3-K

molekulákkal is92. A Gab1 fehérje jelamplifikáló szerepét már leírták B sejtekben,

azonban még nem tisztázott a Gab1-SHP2 és Gab1-PI3-K fehérje kölcsönhatások hatása

a Ras-Erk és az Akt közvetített jelpályákra, ill. ezen keresztül a proliferációs,

apoptotikus és túlélési szignálokra85. Kísérleteinkben SHP2- és PI3-K-kötő Gab1

motívumokat reprezentáló, tirozinon foszforilált peptideket juttattunk B limfocitákba,

majd vizsgáltuk a korai jelátviteli eseményekre gyakorolt hatásukat.

Az optimális hordozó szekvencia kiválasztása Kísérleteink első fázisában olyan sejt permeábilis hordozó molekulát (CPP)

kerestünk, amely alkalmas a bioaktív foszfopeptideket az élő sejtek citoplazmájába

juttatni a sejt károsítása nélkül. Fontos szempont volt továbbá a műtermékek elkerülése

végett olyan, „inert” hordozó kiválasztása, amely önmagában nem befolyásolja az

általunk vizsgált jelátviteli folyamatokat. Az optimális CPP kiválasztásához eltérő

rendszerekben már vizsgált, membrán permeábilis peptid szekvenciákat hasonlítottunk

össze egységes körülmények között, BL41 sejtvonalon. A HIV1 transzaktivációs

doménből (Tat) származtatható oktaarginin (R8) és a nyolc szénatomos, oktanoil

zsírsavlánccal módosított OR8 konstrukció esetében az arginin aminosavak pozitív

töltéstöbbletet hordoznak. A galaninból és mastoparanból felépülő 27 aminosavnyi

kiméra peptid Transportan és rövidített származéka, a TP10 az előző hordozóhoz képest

nagyobb hidrofóbicitással rendelkezik, míg a szintén 27 aminosavból felépülő MPG

65

amfipatikus tulajdonságú. Az MPG metioninon oxidált származéka a kromatográfiás

vizsgálatok alapján jelentős háromdimenziós változáson esett át a MPG-hez képest.

Az eltérő fizikai tulajdonságokkal rendelkező CPP-k a mikroszkópos vizsgálatok

alapján, a sejtbe jutást követően egységesen granulált elrendeződést mutattak az MPGox

kivételével. A savas partikulumokat festő Lyso Tracker-el történő jelölés jelentős

mértékű ko-lokalizációt mutatott a Bodipy-val konjugált CPP-ket tartalmazó

granulumokkal. Eredményeink alapján azt mondhatjuk, hogy a penetrálódott hordozók

jelentős része (kb. 40 %) a savas vezikulákban lokalizálódik 20 perces kezelést

követően, míg a többi a citoplazmában és a nem savas vezikulákban található. A

fáziskontraszt felvételek sejtmorfológiáját összehasonlítva a fluoreszcens képekkel azt

gondoljuk, hogy a hordozók a sejtmagba nem jutottak be.

A kinetikai vizsgálatokra és a kvantitatív összehasonlításra alkalmasabb FACS

analízis jobban rávilágított a CPP-k eltérő fizikai-kémiai tulajdonágaira. Az egyes

peptidek penetrációs képessége 4°C-on és 37°C-on azonos mértékű volt, tehát a CPP-k

transzportja nem magyarázható a tipikus endocitózis modellel. A hordozók már öt perc

elteltével az összes sejtben egységesen detektálhatók voltak és a hosszabb inkubációval

a felvétel mértéke még tovább fokozódott. A különböző hordozók penetrációs

képessége azonban eltérő mértékű volt azonos koncentráció viszonyok mellett. A BL41

sejtek a legnagyobb mértékben az R8 és OR8 hordozókat vették fel, és ehhez képest,

egységnyi idő alatt majdnem egy nagyságrenddel kevesebb MPG ill. TP10 jutott a

sejtekbe. A legkevésbé penetrábilis peptidnek a Transportan mutatkozott. A 20 percig

tartó 10 μM-os peptidkezelést követően a Transportannal és a TP-10-el kezelt sejtek 25

ill. 26 %-a, míg az MPG-vel inkubált sejtek 58 %-a maradt életben. Az R8 és az OR8

peptidek a kontrol értékekhez hasonló 94 %-os túlélést mutattak. A hosszú távú (1, 6, 24

óra) CPP kezelés eredményei egybevágnak a 20 perces kísérlet viabilitási adataival,

miszerint a két oktaarginin tartalmú hordozó jóval kevésbé toxikus hatású a BL41

sejtekre, mint az MPG, a Transportan vagy a TP10.

A Transportan és a TP10 magas toxicitása miatt a CPP-k hatását az intracelluláris

fehérje tirozin foszforilációs mintázat változására már csak az R8, OR8 és MPG

peptideken vizsgáltuk. Az R8 és OR8 hordozók önmagukban nem indukálták fehérjék

foszforilációját és az alap foszforiláltsági mintázatot sem változtatták meg, míg az MPG

hordozóval inkubált mintáknál néhány fehérje foszforilációjának enyhe intenzitásbeli

66

növekedését tapasztaltuk. Az R8 és OR8 hordozókat tehát a fehérje foszforiláció

szempontjából inertnek, és a Gab eredetű peptidek sejtbe juttatására alkalmasnak

találtuk.

Az eredmények alapján úgy gondoljuk, hogy a mikroszkópos vizsgálatok során

mutatott egységes intracelluláris lokalizáció ellenére, az eltérő fizikai tulajdonágú CPP-

k valószínüleg eltérő transzlokációs mechanizmussal jutnak a sejtekbe. Az irodalmi

adatok szerint az R8 peptid esetében leírt invertált micella elméletnek nem mondanak

ellent az eredményeink. Ezek szerint a pozitív töltésű oktaarginin peptidek kapcsolatba

lépve a sejtfelszíni negatív töltésű foszfát és/vagy szulfát csoportokkal vezikulák

lefűződését indukálják a plazmamembránról a citoplazma felé. A lefűződő vezikulákkal

egyrészt savas lizoszómák fúzionálhatnak, másrészt a felnyíló vezikulákból a

citoplazmába kerülhetnek az internalizálódott peptidek. Az amfipatikus MPG és a

lipofil Transportan/TP10 esetében elképzelhető, hogy a sejtmembránba épülve

pórusokat hoztak létre, megbontva ezzel a membrán integritását, ami végső soron

csökkentette a sejtek viabilitását. Az oktanoil csoporttal kapcsolt OR8 esetében a

hordozó fizikai tulajdonsága némileg változott a lipofil zsírsavlánc miatt, de a vizsgálati

körülmények között minden esetben az R8 hordozóhoz hasonlóan viselkedett. Az

irodalmi adatok szerint a zsírsavlánccal kapcsolt oktaarginin permeábilis képessége

bizonyos sejtek esetében jelentősen megnő125. Mivel a kísérleteket a későbbiekben más

sejttípuson is folytatni kívánjuk, ahol az oktanoil csoport penetrációs képességet fokozó

szerepe esetlegesen érvényesülhet, a további kísérletekhez az OR8 hordozót

választottuk a bioaktív foszfopeptidek sejtbe juttatásához.

Az OR8 hordozóval konjugált foszfopeptidek penetrációs és toxicitási jellemzői Továbbiakban a kiválasztott OR8 hordozóhoz kovalensen kapcsolt, SHP2-hez

kötődő GDLDpe és PI3-K-hoz kötődő ELPNpe foszfopeptidek penetrációs

tulajdonságát és toxicitását vizsgáltuk a hordozóhoz képest. A mikroszópos felvételek

alapján mind az OR8-GDLDpe, mind az OR8-ELPNpe hasonló intracelluláris

elhelyezkedést mutatott BL41 sejtekben, mint az OR8 hordozó magában. A hordozóval

kapcsolt foszfopeptidek jelentős része szintén a Lyso Tracker-el jelölt savas

partikulumokban helyezkedett el, míg a maradékot a citoplazmában és a nem savas

67

vezikulákban detektáltuk. A peptidek kolokalizációjának mértékét a Lyso Tracker-el

0,45-ös Pearson koefficiens érték jellemezte.

A FACS analízis eredményei alapján a hordozó-foszfopeptid konstrukciók (OR8-PP)

az CPPk-hez hasonlóan, ugyanolyan mértékben transzlokálódtak a plazmamembránon

keresztül 4°C-on mint szobahőmérsékleten. Viszont a 13 aminosavval megnövelt OR8-

PP szekvenciák penetrációs képessége csökkent a szimpla OR8 hordozóhoz képest.

Érdekes különbséget tapasztaltunk a hordozó és a hordozó-PP sejtbe jutás kinetikája

között. Az áramlási citofluoriméteren végzett kísérlet szerint a legrövidebb kezelési idő

alatt (5 perc) a sejtbe jutott OR8-PP-k mennyisége megegyezik a 20 ill. 60 perc alatt

penetrálódott OR8-PP mennyiséggel. A sejtbe jutás mértéke az OR8-PP

koncentrációjával arányosan nőtt, azonban a sejt által felvehető maximális OR8-PP

mennyiség már a legrövidebb kezelési idő alatt bejutott az intracelluláris vezikulákba,

ill. a citoplazmába. Következésképpen az OR8-PP-k internalizációja koncentációtól

függő és (a sejtbe jutás néhány percétől eltekintve) időintervallumtól független

folyamat, ellentétben az OR8-al, ahol időfüggést tapasztaltunk a hordozó felvételében.

Az eredmények alapján úgy gondoljuk, hogy gyorsan kialakuló egyensúlyi állapot jön

létre a plazmamembrán két oldala között. A permeábilis peptidek számára a

plazmamembránon keresztül kétirányú transzport lehetséges, amit a foszfopeptidekkel

kezelt sejtek mosásával vizsgáltunk. A sejtek többszöri mosása során az OR8-PP-k

intracelluláris mennyisége adott koncentráció szintig folyamatosan csökkent, de a teljes

mennyiséget nem tudtuk eltávolítani a sejtekből. Ezzel szemben a sejten belüli OR8

hordozó mennyisége a legutolsó mosási lépést követően is tovább csökkent. Ebből arra

következtethetünk, hogy a hordozóhoz kapcsolt foszfopeptidek egy része nagy

affinitással kapcsolódik az intracelluláris, SH2 domént tartalmazó fehérjékhez, míg a

foszforilált tirozint nem tartalmazó OR8 nem lép kölcsönhatásba intracelluláris

molekulákkal, így könnyebben kimosható a sejtekből.

Az 1, 4, 24 órás viabilitási tesztekben az OR8-GDLDpe és OR8-ELPNpe peptidek

még kevésbé mutatkoztak toxikusnak, mint az OR8 hordozó szekvencia. Még az 50

μM-os peptid dózis alkalmazásánál is csak az OR8-GDLDpe kezelt sejtek túlélési

aránya csökkent néhány százalékkal a kontrolhoz képest. Tehát a hordozó-foszfopeptid

konstrukciók penetrációs képessége valamelyest csökkent a hordozóhoz képest, viszont

kevésbé bizonyultak citotoxikusnak.

68

A foszfopeptidekkel kölcsönhatásba lépő intracelluláris fehérjék azonosítása A különböző receptorokon keresztüli sejtaktivációt követően a Gab1 adapter fehérje

számos tirozin, szerin és treonin aminosav oldalláncán foszforilálódhat. A foszforilált

aminosavakat tartalmazó peptid szekvenciákhoz kapcsolódó fehérjék közül már többet

azonosítottak. Az Y627 és Y659 által alkotott BTAM motívumhoz két SH2 doménnel

kapcsolódó SHP2 és az Y447, Y472 és Y589 aminosavakat hordozó YVPM

motívumhoz kötődő PI3-K fehérjéken kívül több SH2 doménnel kapcsolódó molekulát

is azonosítottak a Gab1-hez asszociáltan (PLCγ, Nck, RasGAP)97,101,108. A Gab1

prolinban gazdag régiójához SH3 doménnel kapcsolódik a Grb2 adapter fehérje, míg a

foszforilált szerin/treonin aminosavakhoz az Erk1/2 kinázok kötődhetnek.

A Gab1 eredetű peptid konstrukciókkal kapcsolatba kerülő intracelluláris fehérjék

azonosítása céljából streptavidinnel fedett gyöngyökhöz kötött biotinált peptideket

inkubáltunk nyugvó és aktivált BL41 sejtek lizátumával. A magas foszfopeptid

koncentráció valószínűleg leszorította az SH2 domén tartalmú fehérjéket az endogén

kötődési partnereikről, amit alátámaszt, hogy a nyugvó és aktivált minták között nem

jelentkezett különbség a peptidekhez kapcsolódó fehérjék mennyiségében. Elsősorban

az SH2 doménen keresztül kötődő fehérjékre voltunk kíváncsiak, bár a

tömegspektroszkópiás eredmények alapján számos SH2 doménnel nem rendelkező

molekulát is azonosítottunk a különböző peptidekhez asszociáltan. Ezek az SH2

doménnel nem rendelkező fehérjék vagy az adott peptid szekvenciához kapcsolódtak

közvetlenül, vagy közvetve, az SH2 doménen keresztül kötődött fehérjékhez

kapcsolódhattak. A peptiddel kialakított közvetlen kapcsolatra utal a tirozin-fenilalanin

cserét hordozó GDFLD kontrol szekvencia, ahol SH2 doménnel rendelkező fehérjét

nem tudtunk kimutatni, de három más molekulát igen (Hsp70/Hsp90 organizáló fehérje,

α-1-aktin, laktóz dehidrogenáz). A kapcsolatok erősségét jellemzi, hogy detergenssel

történő többszöri mosási lépést követően sem tudtuk ezeket az „aspecifikus” fehérjéket

eltávolítani. Az irodalmi adatok alapján a PI3-K fehérje regulátor alegységének SH2

doménjéhez kötődő ELPNpe peptid esetében MS technika segítségével festett gélből

kimutattuk a PI3-K 85 kDa-os regulátor és 120 kDa-os katalitikus alegységeit, és

emellett a Hsp 90 fehérje kis mennyiségét is. A GDLDpe és GDLDsp peptidek pedig az

SHP2 mellett a β-aktint kötötték jelentős mennyiségben. A GDLDpe szekvencia

69

rövidített formája, a QVDLpe nem kötődött az SHP2-höz, viszont a hosszabb GDLDpe

peptidhez hasonlóan, az SH2 doménnel szintén rendelkező PLCγ2 fehérjéhez igen. A

Western blot analízis eredményei tökéletesen alátámasztották a tömegspektroszkópiás

adatokat. Az eredmények alapján azt mondhatjuk, hogy a Gab1 adapter fehérje 627-es

tirozinját hordozó motívumot reprezentáló GDLDpe peptid az SHP2 fehérjén kívül in

vitro körülmények között a PLCγ2 fehérjével is interakcióba lép, ami az irodalmi adatok

között idáig nem szerepelt. A HGF és EGF receptor keresztkötést követően a Gab1

kilenc tirozinon foszforilálódik, amelyek közül az Y307, Y373, Y407 potenciális

kötőhelyet szolgáltat a PLCγ1 számára135. Tehát a Gab1 627-es tirozinja dokkoló helyet

szolgáltathat mind az SHP2, mind a PLCγ2 számára. A tirozin foszfátcsoportján

módosított, GDLDsp tioészter formához nem kötődött a PLCγ2, viszont a 13-ról 7

aminosavra rövidített QVDLpe foszfoészterhez igen. Az SH2 domének mély

kötőzsebébe kötődik bele a foszfotirozin, és a kötés erősségét a zseb alján levő

konzervált arginin biztosítja. A egyes fehérjék SH2 doménje esetében a kötőzseb és az

azt „bélelő” oldalláncok nem azonosak, így eltérő foszforilált motívumokkal léphetnek

kölcsönhatásba. A tiofoszfát csoportban oxigént helyettesítő kén atom nagyobb mérete

miatt lehetséges, hogy a PLCγ SH2 kötőzsebébe már nem fér be a foszfát csoport, míg

az SHP2 SH2 doménjébe igen. A kísérlet egyben arra is bizonyítékul szolgál, hogy a

PLCγ2 az SH2 doménjén keresztül kapcsolódott a foszfotirozint hordozó

szekvenciához. A PLCγ2-vel ellentétben az SHP2 a GDLDpe (foszfoészter) és a

GDLDsp (tioészter) formához is kötődött, viszont a rövidített QVDLpe szekvenciához

már nem. Tehát az SHP2 esetében a foszfotirozint körülvevő szekvenciának nagyobb

szerepe van az SH2 doménhez történő szelektív kötődésben, mint a PLCγ2 esetében.

Összefoglalva tehát a sejtmembrán permeábilis OR8-GDLDpe és OR8-ELPNpe

peptidek a BL41 sejtekbe juttatva képesek az endogén SHP2 és PI3-K fehérjékkel

kölcsönhatásba lépni. Meg kell jegyeznünk azonban, hogy néhány egyéb fehérjével is

kapcsolatba kerülhetnek, melyek hatással lehetnek a jelátviteli folyamatokra.

A foszfopeptidek enzimaktivitást módosító hatása A sejtek citoplazmájába juttatott foszfopeptidek alapvetően háromféleképpen

változtathatják meg a jelátviteli folyamatok egyes lépéseit. A tirozinon foszforilált

peptidek kompetálhatnak az endogén, SH2 doméneket kötő fehérje szekvenciákkal

70

(Gab1 627Y, 447Y), így az adott fehérje SH2 doménjéhez kötődve megakadályozhatják

annak eredeti térbeli lokalizációját. Szubsztrátként szolgálhatnak az SHP2 és más

tirozin foszfatázok számára, kompetálva ezáltal az enzimek eredeti szubsztrátjaival.

Végül az SH2 doménekhez kötődve, konformáció változást előidézve módosíthatják az

enzimek katalitikus aktvitását. Tisztázni kívántuk, hogy a lehetséges

hatásmechanizmusok közül, a már bizonyított fehérje-foszfopeptid kölcsönhatásokon

kívűl, melyek azok, amelyek élő sejtekben érvényesülhetnek.

Az irodalmi adatok alapján az SHP2 aktiválásában a N-terminális SH2 domén

foszfotirozin ligandummal kialakított kapcsolata játszik kritikus szerepet, bár az enzim

teljes aktivitásához a C-terminális SH2 domén ligand kötésére is szükség van43,48. Az

enzim aktiválása mellett a szubsztráthoz történő irányításban is nélkülözhetetlen

szerepet játszanak a foszfotirozin motívumokat hordozó fehérjék (Gab, FcγRII, CD45).

Az SHP2 leírt szubsztrátjai mellett (Gab1, Gab2, EGFR, PDGF, STAT) számos

ismeretlen, ill. feltételezett (CBP, PAG, Src) további szubsztrát is szerpelhet a

különböző jelátviteli utakban.

Az SHP2 N-terminális SH2 doménjével kölcsönhatásba lépő GDLDpe peptid

egyértelműen fokozta az enzim aktivitást, tehát a monofoszfo peptid is képes aktiválni a

rekombináns SHP2-t . Az előzetes vizsgálatokban az SHP2-höz nem kötődő rövidített

QVDLpe, illetve a PI3-K-hoz kötődő ELPNpe peptidek nem módosították jelentős

mértékben a foszfatáz aktivitását. Magas SHP2 koncentrációnál viszont az enzimet nem

aktiváló QVDLpe és ELPNpe is defoszforilálódott, ami csak az enzim alapaktivitásával

magyarázható, viszont rámutat arra, hogy fiziológiás körülmények között akár ezek a

peptidek is lehetnek szubsztrátjai az SHP2-nek.

A sejtbe jutott foszfopeptidek tehát egyrészt képesek megváltoztatni az enzimek

aktivitását, másrészt az SHP2 szubsztrátként szolgáló endogén Gab1 fehérje, ill. más

tirozinon foszforilált motívumokkal versengve alternatív enzim célpontokat

jelenthetnek.

A foszfopeptidek hatása a molekuláris interakciókra élő sejtekben A következőkben azt vizsgáltuk, hogy a sejtbe juttatott foszfopeptidek befolyásolják-e

a sejten belüli fehérje-fehérje kölcsönhatások létrejöttét.

71

B limfocitákban bizonyított, hogy a BCR-en keresztüli aktiváció hatására

foszforilálódó Gab1 adapterfehérje 627-es és 659-es tirozinjai az SHP2 tirozin foszfatáz

két SH2 doménjával lépnek kölcsönhatásba97. Ez a kapcsolat egyrészt katalizálja az

SHP2 nyitott, enzimatikusan aktív térszerkezetének kialakítását, másrészt lehetőséget

nyújt arra, hogy a szignaloszómába kerülő aktív enzim defoszforilálhassa szubsztrátjait.

Az SHP2 fehérje C-terminális foszforilált tirozinjain keresztül adapter funkciót is

elláthat, további jelátviteli molekulákat toborozva a multimolekuláris jelátvieteli

komplexbe (Grb2)136. Emellett a Gab1 447, 472, 589-es foszforilált tirozinjai a PI3-K

dokkolásával az Akt kináz aktiválása mellett a PI3-K további aktiválását eredményező

pozitív visszacsatolási mechanizmust biztosítanak, a Gab fehérje sejtmembrán PIP3-hoz

való kapcsolása és további PI3-K kötődésén keresztül. Amennyiben a sejtbe juttatott

peptidek in vivo körülmények között is kölcsönhatásba lépnek a citoplazmatikus

célfehérjék SH2 doménjeivel, akkor az adott fehérjék térbeli lokalizációja megváltozik,

ezáltal az általuk közvetített további funkciók gátolttá válhatnak.

Kísérleteinkben nagyobb hangsúlyt fektettünk az SHP2 kötő GDLDpe szekvencia,

ill. ennek módosított formáinak vizsgálatára, így a foszfopeptidek fehérje-fehérje

kölcsönhatásokra gyakorolt hatását a Gab1-SHP2 kapcsolat viszonylatában vizsgáltuk.

A PI3-K kötő ELPNpe szekvencia a kísérlet során negatív kontrolként szolgált, ugyanis

ez a peptid nem kötődött az SHP2 molekulához, tehát nem kompetálhat a foszfatáz

endogén kötőhelyeivel. A BL41 sejtek 5 perces OR8-GDLDpe előkezelését követően a

kontrol minta színtjére csökkent az anti-IgM stimulus hatására kialakuló Gab1-SHP2

kölcsönhatás erőssége, vagyis a foszfopeptid leszorította az SHP2-t a Gab1 SH2 domént

kötő motívumáról. A kölcsönhatás gátlása a foszfatáz rezisztens OR8-GDLDsp peptid

esetében is hasonlóan alakult, míg az OR8-ELPNpe szekvencia nem módosította

jelentős mértékben a Gab1-SHP2 fehérje interakció erősségét. Érdekes módon az SHP2

kötő foszfoészter és tiofoszfát GDLD peptidekkel törénő 30 perces előkezelés már

hatástalan volt az IgM indukált Gab1-SHP2 kölcsönhatás kialakulására. Erre

magyarázatul szolgálhatna a citoplazmában lévő proteázok és peptidázok működése,

azonban a kinetikai vizsgálatok eredményei nem támasztják alá a sejtbe jutott OR8-PP-

k enzimek általi, ilyen gyors lebontását. Feltételezhető, hogy a sejtbe juttatott

foszfopeptidek többféle hatásmechanizmusa egy időben is érvényesülhet, tehát nem

csak az SH2 doménekhez kötődő ligand szerepét játszák, hanem egyben szubsztrátként

72

is szolgálhatnak az aktivált SHP2, ill. egyéb foszfatáz molekulák számára. Ebből

kifolyólag a kezelési idő növelésével folyamatosan változhat a foszforilált peptidek

intracelluláris mennyisége. Ennek a hatásnak a kiküszöbölésére terveztük a

foszfatázoknak ellenálló GDLDsp (tiofoszfát) peptidet, amely a sejtbe jutást követően

hosszú távon is megtartja foszforilált formáját126. Mivel az általunk használt foszfatáz

aktivitást meghatározó rendszerben nem tudtuk tesztelni a GDLDsp foszfatáz

rezisztenciáját, és az a további kísérletekben sem mutatott eltérést a foszfoészter

GDLDpe formától, lehetséges, hogy a foszfátcsoportban végrehajtott oxigén-kén

szubsztitúció nem elégséges a teljes foszfatáz rezisztencia kialakulásához. Szerepe lehet

továbbá a fehérje kölcsönhatások gátlásában a citoplazma és a lefűződő vezikulák

közötti peptid megoszlásnak, ugyanis csak citoplazmába kerülő peptidek léphetnek

kölcsönhatásba az SH2 doménekkel. Mivel a foszfopeptid-kezelés és az azt követő anti

IgM-el történő aktiváció során a sejteket nem mostuk, és gyorsan kialakuló egyensúlyt

feltételezünk a sejtmembrán két oldala között, a kiindulási peptid koncentrációnak nagy

jelentősége van a kiváltott hatás időbeli lefolyására.

Az OR8-GDLDpe és az OR8-ELPNpe peptidek hatása az intracelluláris fehérje foszforilációs folyamatokra. A nyugvó B-sejtek alap foszforilációs mintázatára alapvetően eltérő módon hatott az

OR8-GDLDpe és az OR8-ELPNpe peptid kezelés. Mindkét foszfopeptid megváltoztatta

a nyugvó sejtek tirozin foszforilációs mintázatát, de míg az SHP2-höz kötődő OR8-

GDLDpe hatása koncentráció és időfüggést mutatott, a PI3-K-hoz kötődő OR8-ELPNpe

esetében ezt nem tapasztaltuk. Mivel a két peptid penetrációs tulajdonságai között nem

tapasztaltunk jelentős különbséget, az eltérő hatásmechanizmust a különböző

ligandumokkal kialakított kölcsönhatásokkal magyarázhatjuk. Az 1μM-os OR8-

GDLDpe dózis alkalmazásánál a hosszabb (1-2 órás) inkubálási idő okozott egy

általánosan fokozódó, fehérje foszforilációs szint növekedést, amely részben hasonlított

az anti-IgM stimuláció hatására kialakuló foszforilációs mintázatra. Az OR8-GDLDpe

kezelés következtében megváltozott fehérje foszforiláció intenzitás arra utal, hogy az

SHP2 foszfatáz kiemelt szerepet játszik a sejt foszforilációs állapotának

szabályozásában és ebből kifolyólag a sejtaktivációban is. Az előzetes kísérltekben

bebizonyosodott, hogy a sejtbe juttatott OR8-GDLDpe peptid többféle módon is

73

szerepet játszhat az SHP2 foszfatáz szabályozásában. Az SHP2-vel kölcsönhatásba lépő

foszfopeptid aktiválhatja az enzimet, amely ezt követően például a Csk kötőhely v. az

Src kinázok inhibíciós C-terminális tirozinjainak defoszforilációjával tirozin kinázokat

szabadíthat fel a gátlás alól. Az OR8-GDLDpe peptid a foszfatáz SH2 doménjéhez

kapcsolódva megakadályozhatja, hogy az SHP2 szubsztrátja közelébe kerüljön és

defoszforilálja azt. Továbbá az SHP2 szubsztrátként szolgáló endogén Gab1, ill. más

tirozinon foszforilált motívumokkal versengve az OR8-GDLDpe alternatív enzim

célpontot jelenthet. Ezek a hatások együttesen vagy külön-külön is okozhatják az

intracelluláris fehérje foszforilációs szint emelkedését. Úgy gondoljuk, hogy a

membránról lefűződő vezikulákból történő foszfopeptid kiáramlás sebessége szintén

befolyásolja a peptidhatás időbeli lefolyását.

A magasabb OR8-GDLDpe peptid koncentráció nem okozott intenzívebb változást a

fehérjék tirozin foszforilációjában, és az időbeli hatás is sokkal hamarabb jelentkezett.

A 10 μM-os foszopeptid koncentráció valószínűleg másképpen befolyásolta a fehérje

kölcsönhatásokat és a vezikulákból történő kiáramlás sebessége (esetleg minősége) is

megváltozhatott.

A PI3-K SH2 doménjéhez kötődő OR8-ELPNpe peptid egy nyugalmi állapotban

foszforilált, 55 kDa körüli fehérje tirozin foszforilációjának teljes gátlását okozta. A

specifikus hatás a peptid koncentráció növelésével sem változott, és csak a 20 perces

kezelést követően figyelhettük meg. Az OR8-ELPNpe hatása a nyugvó sejtek

foszforilációs állapotára tehát az OR8-GDLDpe-vel szemben sokkal specifikusabbnak

mutatkozott. Az 55 kDa körüli fehérje azonosítása későbbi munkánk egyik célpontja

lesz. Lehetséges, hogy a PI3-K térbeli lokalizációját megváltoztatva gátoltuk a membrán

PIP2, PIP3 képződését, és ezáltal egy PH domén tartalmú fehérje membránhoz történő

áthelyeződését, amely folyamatok eredményeképpen az azonosítatlan 55 kDa-os fehérje

nem foszforilálódhatott.

A BCR keresztkötést követően a Gab1 molekulák foszforilált tirozint tartalmazó

motívumaihoz SHP2 és PI3-K fehérjék kötődnek, melyek pontos szerepe a további

jelátviteli lépésekben még nem tisztázott B-sejtek esetében. Számos receptoron

keresztüli jelátvitelben ismert, hogy az Gab1-SHP2 kapcsolat pozitívan szabályozza

Ras-Erk aktivációs utat, bár az SHP2 szubsztrátja a legtöbb esetben még

74

azonosítatlan72,100. EGFR-on keresztüli aktiváció esetében leírták, hogy az SHP2

defoszforilálja a Ras-t negatívan szabályzó RasGAP kötőhelyét a Gab1 fehérjén

fibroblaszt sejtekben, amely a Ras-Erk kaszkád felerősítését eredményezi55. Az SHP2

adapter funkciója által, a Grb2-Sos komplex Ras-hoz irányításával is aktiválhatja a

MAP-kináz kaszkádot, amely folyamatban az SHP2 katalitikus aktivitására nincs

szükség. A Gab1-PI3-K kapcsolat Akt aktivációjában betöltött szerepe ismert, viszont a

Ras aktivációra gyakorolt hatása még tisztázásra szorul.

A továbbiakban azt vizsgáltuk, hogy a BL41 sejtekbe juttatott Gab1 eredetű

foszfopeptidek milyen hatást gyakorolnak az antigén receptor keresztkötésével kiváltott

Erk ill. Akt foszforilációra. Az SH2 doménekhez kapcsolódó foszfopeptidek a Gab1

közvetített és Gab1-től független jelátviteli eseményeket egyaránt befolyásolhatják.

Két különböző eredetű, IgM, ill. IgM+IgG specifikus monoklonális ellenanyaggal

történő aktiváció során eltérő eredményeket kaptunk. Az anti-IgM-el történő

sejtaktiváció során az OR8-GDLDpe peptiddel 5 percig előkezelt mintában csökkent a

BCR keresztkötés által indukált Erk foszforiláció. Az eredmény ebben az esetben is

koncentráció függő volt, ugyanis a magasabb peptid dózisnál nem alakult ki az Erk

gátlása. Az Erk foszforiláció gátlásának egyik lehetséges magyarázatául szolgálhat a

Patrick Raynal munkacsoportja által leírt mechanizmus, miszerint az SHP2

defoszforilálja a Gab1 molekula RasGAP kötőhelyét, amely negatívan szabályozza a

Ras aktivációt és ezen keresztül az Erk foszforilációját55. Amennyiben a sejtbe juttatott

OR8-GDLDpe peptid kölcsönhatásba lép az SHP2 SH2 doménjével, akkor a Gab1 627-

es tirozinjáról leszorítva nem tudja defoszforilálni a RasGAP kötőhelyét és így

kialakulhat a Ras-on keresztüli Erk gátlás. Az összes fehérje tirozin foszforilációját

vizsgálva azt tapasztaltuk, hogy az OR8-GDLDpe peptid és az anti-IgM hatása

összeadódott, és időbeli lefutása megegyezett a csak peptiddel kezelt minták esetében

tapasztalttal. Az OR8-GDLDpe foszfopeptid tehát a sejtbe juttatva időben eltolva két

különböző hatást is kiváltott. Az OR8-ELPNpe peptiddel előkezelt sejtekben a várt

eredményekkel ellentétben nem változott a BCR indukált Akt foszforiláció, az Erk

foszforilációja viszont bizonyos mintákban, idő és dózisfüggő módon fokozódott (60’ és

5’). Az anti-IgM-el történő aktivációt követően tehát nem érvényesült OR8-ELPNpe

peptid nyugvó sejtekre gyakorolt hatásmechanizmusa.

75

Az IgM+IgG specifikus ellenanyag használata rávilágított, hogy milyen jelentősége

van a membránhoz kötött eseményeknek az OR8-PP-k hatásának kimenetelére.

Lehetséges, hogy a különböző típusú ellenanyagok használata eltérő módon

befolyásolja a foszfopeptid tartalmú vezikulák lefűződését, azok stabilitását, ill.

foszfopeptidek citoplazmába kerülését. Az anti-IgG+IgM ellenanyaggal történő B-sejt

aktiváció során az Erk foszforilációjának a gátlása a korábbiakkal ellentétben csak a 60

perces OR8-GDLDpe előkezelést követően jelentkezett. Ugyanezt az eredményt kaptuk

az OR8-GDLDsp esetében is. Ugyanakkor a 60 perces OR8-ELPNpe kezelés hatására

egyaránt csökkent a BCR indukált Erk ill. Akt foszforiláció. Ebben az esetben az OR8-

ELPNpe gátolhatta a PI3-K membrán közelébe kerülését, ami a membrán PIP3 szint

csökkenését eredményezhette, ezzel megakadályozva az Akt membránhoz történő

asszociációját és PDK általi foszforilációját. Emellett a Ras aktiválásában szerepet

játszó PH domén tartalmú fehérjék (pl. Gab1) sem tudtak a membrán PIP3-hoz

kapcsolódni, így a foszfopeptid közvetett módon gátolhatta az Erk foszforilációját is.

Eredményeink alapján feltételezzük, hogy a BCR-en keresztüli Erk aktiváció

szabályozásában az SHP2 és a PI3-K is szerepet játszik. SHP2 fehérjét kifejező DT40

csirke B-sejtvonal sejtjeiben az OR8-GDLDpe és az OR8-ELPNpe peptidekkel történő

60 perces előinkubálás egyaránt gátolta az anti-IgM aktivációt követő Erk foszforilációt.

Az SHP2 fehérjét nem expresszáló DT40 sejtek esetében a BCR keresztkötést követően

megmaradt OR8-ELPNpe általi Erk gátlás, míg az SHP2-re szelektív OR8-GDLDpe

nem gátolta az Erk foszforilációját. Eredményeink szerint tehát az OR8-GDLDpe

valóban az SHP2-től függő Erk aktivációt befolyásolta, míg az OR8-ELPNpe peptid

SHP2-től független módon gátolta a BCR indukált Erk foszforilációt csirke B

sejtvonalon.

Az OR8-ELPNpe foszfopeptid PI3-kinázon keresztüli szabályzó szerepét támasztják

alá a hízósejtek IgE mediált degranulációjának vizsgálatával nyert eredmények. A

részben Gab1-PI3-K függő, IgE receptor közvetített hízósejt degranuláció mértékét az

LY294002 PI3-K gátlószer a felére képes csökkenteni113. Az OR8-ELPNpe peptiddel

történő 60 perces előkezelést követően az IgE keresztkötést követően 60-70%-ra

csökkent a degranuláció mértéke. A PI3-K-hoz nem kapcsolódó OR8-GDLDpe hasonló

mértékben gátolta a degranuláció mértékét, amit úgy is értelmezhetünk, hogy az SHP2

76

SH2 doménjéhez kapcsolódó foszfopeptid katalizálja a PI3-K kötő Gab1 tirozin

motívum defoszforilációját.

A sejtmembrán-permeábils OR8-GDLDpe és OR8-ELPNpe foszfopeptidek a sejtbe

jutva koncentráció és időfüggő módon megváltoztatják az SHP2, ill. PI3-K függő

jelátviteli utakat, tehát befolyásolhatják a proliferációs és apoptotikus jelpályák

kimenetelét. Mivel a foszfopeptidek többféle hatása akár egy időben is érvényesülhet,

így a jelátviteli kaszkádra gyakorolt pontos hatásmechanizmusokat egyelőre nem tudjuk

megállapítani. A foszfopeptidek hatásspektrumának csökkentésével tisztázhatjuk, hogy

a sejtbe juttatva miként befolyásolják az egyes jelátviteli lépéseket, ill. miként hatnak a

fehérje-fehérje kölcsönhatásokra.

Jelen kísérleteinkben a GDLDpe szekvenciának egy rövidített formáját vizsgáljuk,

amely az SHP2 fehérjéhez még kötődik, de az enzim aktivitást fokozó hatása jóval

gyengébb a GDLDpe-nél. Emellett olyan módosított peptidek szintézisét tervezzük,

amelyek ellenállnak a metabolizáló enzimeknek és foszfatázoknak (erre irányuló

próbálkozás volt a GDLDsp tiofoszfát). A további kísérletek célja tehát a fent leírt

tulajdonságú peptidek tervezése és funkcionális vizsgálata jelátviteli folyamatokban.

Tesztelni kívánjuk továbbá a meglévő és a módosított peptidek apoptózisra és

proliferációra gyakorolt hatását egészséges és beteg emberekből izolált sejteken.

A proliferáció gátlásában, ill. az apoptózis fokozásában hatásosnak bizonyuló

foszfopeptidek alapjául szolgáltathatnak farmakológiailag aktív peptidomimetikumok

tervezésének akár B-sejtes, akár más típusú tumorok esetében.

77

6. Következtetések 1. Az oktaarginin alapú hordozó peptidek alkalmasak bioaktív peptidek élő sejtekbe

juttatására. A hordozó-foszfopeptid konstrukciók kevésbé toxikusak, de penetrációjuk

gyengébb, mint a hordozóé.

2. A peptidszekvenciák és az SH2 domének kapcsolata specifikus. Az OR8-GDLDpe

és OR8-ELPNpe az endogén SHP2, illetve PI3-K fehérjékhez kötődnek. A Gab1

adapter 627Y-t hordozó motívumot reprezentáló GDLDpe az SHP2-n kívűl a PLCγ2-

vel is kapcsolatba lép.

3. In vitro körülmények között a GDLDpe megváltoztatja az SHP2 foszfatáz

enzimaktivitását, másrészt a szintetikus peptidek alternatív enzim célpontokat is

jelentenek.

4. Az SHP2-höz kötődő OR8-GDLDpe gátolja a BCR keresztkötést követő

Gab1-SHP2 kölcsönhatás kialakulását, tehát kompetál az endogén fehérjékkel az SH2

domén kötőhelyekért.

5. Az OR8-GDLDpe és OR8-ELPNpe peptidek eltérő módon változtatják meg az

intracelluláris fehérjék alap tirozin foszforilációs mintázatát BL41 sejtekben.

6. A OR8-GDLDpe és OR8-ELPNpe peptidkezelés hatására egyaránt csökken a BCR

indukált Erk foszfotiláció, míg Akt foszforilációját csak az OR8-ELPNpe gátolja.

7. A foszfopeptidek – egyenlőre nem ismert mechanizmussal – koncentráció és

időfüggő módon megváltoztatják az SHP2 és PI3-K függő jelátviteli utakat. Az SHP2-

nek szerepe lehet az Erk foszforiláció szabályozásában B limfocitákban.

78

7. Irodalomjegyzék

1 Bartholomew M. Sefton: Overview of protein phosphorilation. Current Protocols in Cell Biology 1998.Unit 14.1

2 Hunter T: Protein kinases and phosphatases: the yin and yang of protein

phosphorylation and signaling. Cell. 1995. 80, 225-236 3 Hunter T. Protein modification: phosphorylation on tyrosine residues. Curr. Opin. Cell

Biol. 1989. 1, 1168–1181 4 Kolibaba K. S., and Druker, B. J. Protein tyrosine kinases and cancer. Biochim.

Biophys. Acta. 1997.1333, F217–248 5Schemarova .: The role of tyrosine phosphorylation in regulation of signal transduction

pathways in unicellular eukaryotes. Curr Issues Mol Biol. 2006 Jan;8(1):27-49.

6Nollau, P., and Mayer, B. J. Profiling the global tyrosine phosphorylation state by Src homology 2 domain binding. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 2001. 98, 13531–13536

7Bradshaw, J. M., and Waksman, G.: Molecular recognition by SH2 domains. Adv.

Protein Chem. 2002. 61, 161–210 8Levin V.A.: Basis and importance of Src as a target in cancer. Cancer Treat Res. 2004.;

119:89-119.

9 Blume-Jensen P; Hunter T: Oncogenic kinase signalling. Nature 2001. 411:355-365

10Cantley LC, Neel BG.: New insights into tumor suppression: PTEN suppresses tumor formation by restraining the phosphoinositide 3-kinase/AKT pathway. Proc Natl Acad Sci U S A. 1999 Apr 13;96(8):4240-5

11

Bentires-Alj M, Paez JG, David FS, Keilhack H, Halmos B, Naoki K, Maris JM, Richardson A, Bardelli A, Sugarbaker DJ, Richards WG, Du J, Girard L, Minna JD, Loh ML, Fisher DE, Velculescu VE, Vogelstein B, Meyerson M, Sellers WR, Neel BG.: Activating mutations of the Noonan syndrome associated SHP2/PTPN11 gene in human solid tumors and adult acute myelogenous leukemia. Cancer Res. 2004.;64:8816-8820.

12

Kratz CP, Niemeyer CM, Castleberry RP, Cetin M, Bergsträsser E, Emanuel PD, Hasle H, Kardos G, Klein C, Kojima S, Stary J, Trebo M, Zecca M, Gelb BD, Tartaglia M, Loh ML. : The mutational spectrum of PTPN11 in juvenile myelomonocytic leukemia and Noonan syndrome/ myeloproliferative disease. Blood. 2005.; 106:2183-2185.

13DeFranco AL.: The complexity of signaling pathways activated by the BCR. Curr

Opin. Immunol. 1997 Jun;9(3):296-308.

79

14Fuentes-Pananá EM, Monroe JG.: Ligand-dependent and -independent processes in B-

cell-receptor-mediated signaling. Springer Semin Immunopathol. 2001 Dec;23(4):333-50

15Fuentes-Pananá EM, Bannish G, Monroe JG.: Basal B-cell receptor signaling in B lymphocytes: mechanisms of regulation and role in positive selection, differentiation, and peripheral survival. Immunol Rev. 2004 Feb;197:26-40

16 Reth M.: Antigen receptor tail clue. Nature. 1989 Mar 30;338(6214):383-4. 17 Cambier JC. Antigen and Fc receptor signaling. J Immunol. 1995 Oct 1;155(7):3281-

5.

18 Reth M, Wienands J.: Initiation and processing of signals from the B cell antigen receptor. Annu Rev Immunol. 1997;15:453-79

19Law DA, Chan VW, Datta SK, DeFranco AL.: B-cell antigen receptor motifs have redundant signalling capabilities and bind the tyrosine kinases PTK72, Lyn and Fyn. Curr Biol. 1993 Oct 1;3(10):645-57.

20Hutchcroft JE, Harrison ML, Geahlen RL.: Association of the 72-kDa protein-tyrosine kinase PTK72 with the B cell antigen receptor. J Biol Chem. 1992 Apr 25;267(12):8613-9. 21Rowley RB, Burkhardt AL, Chao HG, Matsueda GR, Bolen JB.: Syk protein-tyrosine

kinase is regulated by tyrosine-phosphorylated Ig alpha/Ig beta immunoreceptor tyrosine activation motif binding and autophosphorylation. J. Biol Chem. 1995 May 12; 270(19):11590-4.

22 Fu C, Turck CW, Kurosaki T, Chan AC.:BLNK: a central linker protein in B cell activation. Immunity. 1998 Jul;9(1):93-103.

23Takata M, Kurosaki T.: A role for Bruton's tyrosine kinase in B cell antigen receptor mediated activation of phospholipase C-gamma 2. J Exp Med. 1996 Jul 1;184(1):31-40.

24 Hashimoto S, Iwamatsu A, Ishiai M, Okawa K, Yamadori T, Matsushita M, Baba Y,

Kishimoto T, Kurosaki T, Tsukada S.: Identification of the SH2 domain binding protein of Bruton's tyrosine kinase as BLNK--functional significance of Btk-SH2 domain in B-cell antigen receptor-coupled calcium signaling. Blood. 1999 Oct 1;94(7):2357-64.

25 Kurosaki T, Tsukada S.: BLNK: connecting Syk and Btk to calcium signals. Immunity. 2000 Jan;12(1):1-5. 26Bijsterbosch MK, Meade CJ, Turner GA, Klaus GG.: B lymphocyte receptors and

polyphosphoinositide degradation. Cell. 1985 Jul;41(3):999-1006.

80

27Xie H, Rothstein TL.: Protein kinase C mediates activation of nuclear cAMP response element-binding protein (CREB) in B lymphocytes stimulated through surface Ig. J Immunol. 1995 Feb 15;154(4):1717-23.

28Ravichandran KS, Lorenz U, Shoelson SE, Burakoff SJ.: Interaction of Shc with Grb2 regulates association of Grb2 with mSOS. Mol Cell Biol. 1995 Feb;15(2):593-600.

29Harmer SL, DeFranco AL.: Shc contains two Grb2 binding sites needed for efficient formation of complexes with SOS in B lymphocytes. Mol Cell Biol. 1997 Jul;17(7):4087

30Roose JP, Mollenauer M, Gupta VA, Stone J, Weiss A.: A diacylglycerol-protein kinase C- RasGRP1 pathway directs Ras activation upon antigen receptor stimulation of T cells. Mol Cell Biol. 2005 Jun;25(11):4426-41

31Tuveson DA, Carter RH, Soltoff SP, Fearon DT.: CD19 of B cells as a surrogate kinase insert region to bind phosphatidylinositol 3-kinase. Science. 1993 May 14;260(5110):986

32Pleiman CM, Hertz WM, Cambier JC.: Activation of phosphatidylinositol-3' kinase by Src- family kinase SH3 binding to the p85 subunit. Science. 1994 Mar 18;263(5153):1609-12.

33Falasca M, Logan SK, Lehto VP, Baccante G, Lemmon MA, Schlessinger J.: Activation of phospholipase C gamma by PI 3-kinase-induced PH domain-mediated membrane targeting. EMBO J. 1998 Jan 15;17(2):414-22.

34 Gliki G, Wheeler-Jones C, Zachary I.: Vascular endothelial growth factor induces protein kinase C (PKC)-dependent Akt/PKB activation and phosphatidylinositol 3'-kinase-mediates PKC delta phosphorylation: role of PKC in angiogenesis. Cell Biol Int. 2002;26(9):751-9

35 Younes H, Leleu X, Hatjiharissi E, Moreau AS, Hideshima T, Richardson P, Anderson KC, Ghobrial IM.: Targeting the phosphatidylinositol 3-kinase pathway in multiple myeloma. Clin Cancer Res. 2007 Jul 1;13(13):3771-5.

36Cherukuri A, Shoham T, Sohn HW, Levy S, Brooks S, Carter R, Pierce SK.: The tetraspanin CD81 is necessary for partitioning of coligated CD19/CD21-B cell antigen receptor complexes into signaling-active lipid rafts. J Immunol. 2004 Jan 1;172(1):370-80.

37Fujimoto M, Poe JC, Jansen PJ, Sato S, Tedder TF.: CD19 amplifies B lymphocyte signal transduction by regulating Src-family protein tyrosine kinase activation. J Immunol. 1999 Jun 15;162(12):7088-94

81

38Cherukuri A, Cheng PC, Sohn HW, Pierce SK.: The CD19/CD21 complex functions

to prolong B cell antigen receptor signaling from lipid rafts Immunity. 2001 Feb;14(2):169-79

39 Coggeshall KM.: Inhibitory signaling by B cell Fc gamma RIIb. Curr Opin Immunol. 1998 Jun;10(3):306-12

40Leibson PJ.: The regulation of lymphocyte activation by inhibitory receptors. Curr Opin Immunol. 2004 Jun;16(3):328-36

41Ono M, Bolland S, Tempst P, Ravetch JV.: Role of the inositol phosphatase SHIP in negative regulation of the immune system by the receptor Fc(gamma)RIIB. Nature. 1996 Sep 19;383(6597):263-6

42Hof P, Pluskey S, Dhe-Paganon S, Eck MJ, Shoelson SE: Crystal structure of the tyrosine phosphatase SHP-2. Cell. 1998 Feb 20;92(4):441-50

43Barford D, Neel BG.: Revealing mechanisms for SH2 domain mediated regulation of the protein tyrosine phosphatase SHP-2. Structure. 1998 Mar 15;6(3):249-54

44Araki T, Nawa H, Neel BG.: Tyrosyl phosphorylation of Shp2 is required for normal

ERK activation in response to some, but not all, growth factors. J Biol Chem. 2003 Oct 24;278(43):41677-84.

45Qu CK.: Role of the SHP-2 tyrosine phosphatase in cytokine-induced signaling and cellular response. Biochim Biophys Acta. 2002 Nov 11;1592(3):297-301

46Wang Q, Downey GP, Herrera-Abreu MT, T Kapus A, McCulloch CA.: SHP-2 modulates interleukin-1-induced Ca2+ flux and ERK activation via phosphorylation of phospholipase Cgamma1. J Biol Chem. 2005 Mar 4;280(9):8397-406.

47MacGillivray M, Downey GP.: The protein tyrosine phosphatase SHP-2 regulates interleukin-1-induced ERK activation in fibroblasts. J Biol Chem. 2003 Jul 18;278(29):27190-8. Epub 2003 Apr 29

48Neel BG, Gu H, Pao L.: The 'Shp'ing news: SH2 domain-containing tyrosine phosphatases in cell signaling. Trends Biochem Sci. 2003 Jun;28(6):284-93.

49Tenev T, Keilhack H, Tomic S, Stoyanov B, Stein-Gerlach M, Lammers R, Krivtsov AV, Ullrich A, Böhmer FD.: Both SH2 domains are involved in interaction of SHP-1 with the epidermal growth factor receptor but cannot confer receptor-directed activity to SHP-1/SHP-2 chimera. J Biol Chem. 1997 Feb 28;272(9):5966-73

50Wang N, Li Z, Ding R, Frank GD, Senbonmatsu T, Landon EJ, Inagami T, Zhao ZJ:

Antagonism or synergism. Role of tyrosine phosphatases SHP-1 and SHP-2 in growth factor signaling. J Biol Chem. 2006 Aug 4;281(31):21878-83.

82

51Feng GS.: Shp2-mediated molecular signaling in control of embryonic stem cell self-renewal and differentiation. Cell Res. 2007 Jan;17(1):37-41

52Qu CK, Nguyen S, Chen J, Feng GS: Requirement of Shp-2 tyrosine phosphatase in lymphoid and hematopoietic cell development. Blood. 2001 Feb 15;97(4):911-4

53Zhang SQ, Yang W, Kontaridis MI, Bivona TG, Wen G, Araki T, Luo J, Thompson JA, Schraven BL, Philips MR, Neel BG.: Shp2 regulates SRC family kinase activity and Ras/Erk activation by controlling Csk recruitment. Mol Cell. 2004 Feb 13;13(3):341-55.

54Yu WM, Hawley TS, Hawley RG, Qu CK.: Catalytic-dependent and -independent roles of SHP-2 tyrosine phosphatase in interleukin-3 signaling. Oncogene. 2003 Sep 4;22(38):5995-6004.

55Montagner A, Yart A, Dance M, Perret B, Salles JP, Raynal P.: A novel role for Gab1 and SHP2 in epidermal growth factor-induced Ras activation. J Biol Chem. 2005 Feb 18;280(7):5350-60.

56Tartaglia M, Niemeyer CM, Fragale A, Song X, Buechner J, Jung A, Hählen K, Hasle H, Licht JD, Gelb BD.: Somatic mutations in PTPN11 in juvenile myelomonocytic leukemia, myelodysplastic syndromes and acute myeloid leukemia. Nat Genet. 2003 Jun;34(2):148-50

57Chen J, Yu WM, Daino H, Broxmeyer HE, Druker BJ, Qu CK.: SHP-2 phosphatase is required for hematopoietic cell transformation by Bcr-Abl. Blood. 2007 Jan 15;109(2):778-85.

58Vivanco I, Sawyers CL. The phosphatidylinositol 3-kinase AKT pathway in human

cancer. Nat Rev Cancer 2002;2:489-501

59Yu J, ZhangY, McIlroy, Rordorf-NikolicT, Orr GA, BackerJM. Regulation of the p85/p110 phosphatidylinositol 3-kinase: stabilization and inhibition of the p110a catalytic subunit by the p85 regulatory subunit. Mol Cell Biol 1998;18:1379^87.

60Bi L, Okabe I, Bernard DJ, Wynshaw-Boris A & Nussbaum RL.: Proliferative defect and embryonic lethality in mice homozygous for a deletion in the p110alpha subunit of phosphoinositide 3-kinase. Journal of Biological Chemistry 1999. 274 10963–10968.

61Bi L, Okabe I, Bernard DJ & Nussbaum RL 2002 Early embryonic lethality in mice deficient in the p110beta catalytic subunit of PI 3-kinase. Mammalian Genome 13 169–172.

62 Lawlor MA, Alessi DR.: PKB/Akt: a key mediator of cell proliferation, survival and insulin responses? JCell Sci 2001;114:2903-10.

83

63Brazil DP, Park J, Hemmings BA.: PKB binding proteins. Getting in on the Akt. Cell 2002;111:293-303.

64Downward J.: PI 3-kinase, Akt and cell survival. Semin Cell Dev Biol 2004;15:177-82

65 Pene F, Claessens YE, Muller O, Viguié F, Mayeux P, Dreyfus F, Lacombe C, Bouscary D.: Role of the phosphatidylinositol 3-kinase/Akt and mTOR/P70S6-kinase pathways in the proliferation and apoptosis in multiple myeloma. Oncogene 2002;21:6587-97. 26.

66 Fresno Vara JA, Casado E, de Castro J, Cejas P, Belda-Iniesta C, Gonzalez-Baron M. PI3K/Akt signalling pathway and cancer. CancerTreat Rev 2004;30:193 - 204

67 Hemmings BA.: Akt signaling: linking membrane events to life and death decisions. Science. 1997 Jan 31;275(5300):628-30

68 Alblas J, Honing H, de Lavalette CR, Brown MH, Dijkstra CD, van den Berg TK.: Signal regulatory protein alpha ligation induces macrophage nitric oxide production through JAK/STAT- and phosphatidylinositol 3-kinase/Rac1/NAPDH oxidase/H2O2-dependent pathways. Mol Cell Biol. 2005 Aug;25(16):7181-92.

69Simeoni L, Kliche S, Lindquist J, Schraven B.: Adaptors and linkers in T and B cells.

Curr Opin Immunol. 2004 Jun;16(3):304-13.

70Veillette A.: Specialised adaptors in immune cells. Curr Opin Cell Biol. 2004 Apr;16(2):146-55.

71 Liu Y, Rohrschneider LR: The gift of Gab. FEBS Lett. 2002 Mar 27;515(1-3):1-7. Review.

72 Holgado-Madruga M, Emlet DR, Moscatello DK, Godwin AK, Wong AJ.: A Grb2-associated docking protein in EGF- and Insulin-receptor signaling. Nature 1996. 379, 560-564

73 Gu H, Pratt JC, Burakoff SJ, Neel BG.: Cloning of p97/Gab2, the major SHP2 binding protein in hematopoietic cells, reveals a novel pathway for cytokine-induced gene activation. Mol Cell. 1998. 2, 729-740

74

Wolf I, Jenkins BJ, Liu Y, Seiffert M, Custodio JM, Young P, Rohrschneider LR.: Gab3, a new Dos/Gab family member, facilitates macrophage differentiation. Mol. Cell. Biol. 2002. 22, 231-244

75Seiffert M, Custodio JM, Wolf I, Harkey M, Liu Y, Blattman JN, Greenberg PD, Rohrschneider LR.: Gab3-deficient mice exhibit normal development and hematopoiesis and are immunocompetent. Mol Cell Biol. 2003 Apr;23(7):2415-24.

84

76Nishida K, Wang L, Morii E, Park SJ, Narimatsu M, Itoh S, Yamasaki S, Fujishima M, Ishihara K, Hibi M, Kitamura Y, Hirano T.: Requirement of Gab2 for mast cell development and KitL/c-Kit signaling. Blood. 2002 Mar 1;99(5):1866-9.

77Gu H, Saito K, Klaman LD, Shen J, Fleming T, Wang Y, Pratt JC, Lin G, Lim B, Kinet JP, Neel BG.: Essential role for Gab2 in the allergic response. Nature. 2001 Jul 12;412(6843):186-90.

78Itoh M, Yoshida Y, Nishida K, Narimatsu M, Hibi M, Hirano T.: Role of Gab1 in heart, placenta, and skin development and growth factor- and cytokine-induced extracellular signal-regulated kinase mitogen-activated protein kinase activation. Mol Cell Biol. 2000 May;20(10):3695-704.

79Weidner KM, Di Cesare S, Sachs M, Brinkmann V, Behrens J, Birchmeier W.: Interaction between Gab1 and the c-Met receptor tyrosine kinase is responsible for epithelial morphogenesis. Nature. 1996 Nov 14;384(6605):173-6

80Lock LS, Maroun CR, Naujokas MA, Park M.: Distinct recruitment and function of Gab1 and Gab2 in Met receptor-mediated epithelial morphogenesis. Mol Biol Cell. 2002 Jun;13(6):2132-46.

81Lock LS, Royal I, Naujokas MA, Park M.: Identification of an atypical Grb2 carboxyl-terminal SH3 domain binding site in Gab docking proteins reveals Grb2-dependent and -independent recruitment of Gab1 to receptor tyrosine kinases. J Biol Chem. 2000 Oct 6;275(40):31536-45.

82Nguyen L, Holgado-Madruga M, Maroun C, Fixman ED, Kamikura D, Fournier T, Charest A, Tremblay ML, Wong AJ, Park M.: Association of the multisubstrate docking protein Gab1 with the hepatocyte growth factor receptor requires a functional Grb2 binding site involving tyrosine 1356. J Biol Chem. 1997 Aug 15;272(33):20811-9.

83Ravichandran KS.: Signaling via Shc family adapter proteins. Oncogene. 2001 Oct 1;20(44):6322-30.

84Rodrigues GA, Falasca M, Zhang Z, Ong SH, Schlessinger J.: A novel positive feedback loop mediated by the docking protein Gab1 and phosphatidylinositol 3-kinase in epidermal growth factor receptor signaling. Mol Cell Biol. 2000 Feb;20(4):1448-59

85Ingham RJ, Santos L, Dang-Lawson M, Holgado-Madruga M, Dudek P, Maroun CR, Wong AJ, Matsuuchi L, Gold MR.: The Gab1 docking protein links the B cell antigen receptor to the phosphatidylinositol 3-kinase/Akt signaling pathway and to the SHP2 tyrosine phosphatase. J Biol Chem. 2001 Apr 13;276(15):12257-65.

86Gu H, Maeda H, Moon JJ, Lord JD, Yoakim M, Nelson BH, Neel BG.: New role for Shc in activation of the phosphatidylinositol 3-kinase/Akt pathway. Mol Cell Biol. 2000 Oct;20(19):7109-20.

85

87 Takahashi-Tezuka M, Yoshida Y, Fukada T, Ohtani T, Yamanaka Y, Nishida K, Nakajima K, Hibi M, Hirano T.: Gab1 acts as an adapter molecule linking the cytokine receptor gp130 to ERK mitogen-activated protein kinase. Mol Cell Biol. 1998 Jul;18(7):4109-17.

88Nishida K, Yoshida Y, Itoh M, Fukada T, Ohtani T, Shirogane T, Atsumi T, Takahashi-Tezuka M, Ishihara K, Hibi M, Hirano T.: Gab-family adapter proteins act downstream of cytokine and growth factor receptors and T- and B-cell antigen receptors. Blood. 1999 Mar 15;93(6):1809-16.

89Podar K, Anderson KC.: Critical role for hematopoietic cell kinase (Hck)-mediated

phosphorylation of Gab1 and Gab2 docking proteins in interleukin 6-induced proliferation and survival of multiple myeloma cells. J Biol Chem. 2004 May 14;279(20):21658-65.

90 Gadina M, Sudarshan C, Visconti R, Zhou YJ, Gu H, Neel BG, O'Shea JJ.: The docking molecule Gab2 is induced by lymphocyte activation and is involved in signaling by interleukin-2 and interleukin-15 but not other common gamma chain-using cytokines. J Biol Chem. 2000 Sep 1;275(35):26959-66.

91 Gu H, Botelho RJ, Yu M, Grinstein S, Neel BG.: Critical role for scaffolding adapter Gab2 in Fc gamma R-mediated phagocytosis. J Cell Biol. 2003 Jun 23;161(6):1151-61.

92Ingham RJ, Holgado-Madruga M, Siu C, Wong AJ, Gold MR.: The Gab1 protein is a docking site for multiple proteins involved in signaling by the B cell antigen receptor.

J Biol Chem. 1998 Nov 13;273(46):30630-7.

93Yamasaki S, Nishida K, Hibi M, Sakuma M, Shiina R, Takeuchi A, Ohnishi H, Hirano T, T Saito T.: Docking protein Gab2 is phosphorylated by ZAP-70 and negatively regulates T cell receptor signaling by recruitment of inhibitory molecules. J Biol Chem. 2001 Nov 30;276(48):45175-83.

94Yu CF, Roshan B, Liu ZX, Cantley LG.: ERK regulates the hepatocyte growth factor-mediated interaction of Gab1 and the phosphatidylinositol 3-kinase. J Biol Chem. 2001 Aug 31;276(35):32552-8.

95Yu CF, Liu ZX, Cantley LG.: ERK negatively regulates the epidermal growth factor-mediated interaction of Gab1 and the phosphatidylinositol 3-kinase. J Biol Chem. 2002 May 31;277(22):19382-8.

96Meng S, Chen Z, Munoz-Antonia T, Wu J.: Participation of both Gab1 and Gab2 in the activation of the ERK/MAPK pathway by epidermal growth factor. Biochem J. 2005 Oct 1;391(Pt 1):143-51.

97Cunnick JM, Mei L, Doupnik CA, Wu J.: Phosphotyrosines 627 and 659 of Gab1 constitute a bisphosphoryl tyrosine-based activation motif (BTAM) conferring

86

binding and activation of SHP2. J Biol Chem. 2001 Jun 29;276(26):24380-7. Epub 2001 Apr 25

98Cunnick JM, Dorsey JF, Munoz-Antonia T, Mei L, Wu J.: Requirement of SHP2 binding to Grb2-associated binder-1 for mitogen-activated protein kinase activation in response to lysophosphatidic acid and epidermal growth factor. J Biol Chem. 2000 May 5;275(18):13842-8.

99Yamasaki S, Nishida K, Yoshida Y, Itoh M, Hibi M, Hirano T.: Gab1 is required for EGF receptor signaling and the transformation by activated ErbB2.Oncogene. 2003 Mar 13;22(10):1546-56

100Schaeper U, Gehring NH, Fuchs KP, Sachs M, Kempkes B, Birchmeier W.: Coupling

of Gab1 to c-Met, Grb2, and Shp2 mediates biological responses. J Cell Biol. 2000 Jun 26;149(7):1419-32

101Maroun CR, Naujokas MA, Holgado-Madruga M, Wong AJ, Park M.: The tyrosine phosphatase SHP-2 is required for sustained activation of extracellular signal-regulated kinase and epithelial morphogenesis downstream from the met receptor tyrosine kinase. Mol Cell Biol. 2000 Nov;20(22):8513-25

102Holgado-Madruga M, Wong AJ.: Role of the Grb2-associated binder 1/SHP-2 interaction in cell growth and transformation. Cancer Res. 2004 Mar 15;64(6):2007-15.

103Gu H, Neel BG.: The "Gab" in signal transduction. Trends Cell Biol. 2003 Mar;13(3): 122-30.

104Agazie YM, Hayman MJ.: Molecular mechanism for a role of SHP2 in epidermal growth factor receptor signaling. Mol Cell Biol. 2003 Nov;23(21):7875-86

105Zhang SQ, Tsiaras WG, Araki T, Wen G, Minichiello L, Klein R, Neel BG.: Receptor-specific regulation of phosphatidylinositol 3'-kinase activation by the protein tyrosine phosphatase Shp2. Mol Cell Biol. 2002 Jun;22(12):4062-72.

106Liu Y, Jenkins B, Shin JL, Rohrschneider LR.: Scaffolding protein Gab2 mediates differentiation signaling downstream of Fms receptor tyrosine kinase. Mol Cell Biol. 2001 May;21(9):3047-56.

107Pratt JC, Igras VE, Maeda H, Baksh S, Gelfand EW, Burakoff SJ, Neel BG, Gu H.: Cutting edge: gab2 mediates an inhibitory phosphatidylinositol 3'-kinase pathway in T cell antigen receptor signaling. J Immunol. 2000 Oct 15;165(8):4158-63.

108 Holgado-Madruga M, Moscatello DK, Emlet DR, Dieterich R, Wong AJ.: Grb2-associated binder-1 mediates phosphatidylinositol 3-kinase activation and the promotion of cell survival by nerve growth factor. Proc Natl Acad Sci U S A. 1997 Nov 11;94(23):12419-24

87

109 Mattoon DR, Lamothe B, Lax I, Schlessinger J.: The docking protein Gab1 is the primary mediator of EGF-stimulated activation of the PI-3K/Akt cell survival pathway. BMC Biol. 2004 Nov 18;2:24.

110 Astoul E, Watton S, Cantrell D.: The dynamics of protein kinase B regulation during B cell antigen receptor engagement. J Cell Biol. 1999 Jun 28;145(7):1511-20.

111 Koncz G, Tóth GK, Bökönyi G, Kéri G, Pecht I, Medgyesi D, Gergely J, Sármay G.: Co-clustering of Fcgamma and B cell receptors induces dephosphorylation of the Grb2-associated binder 1 docking protein. Eur J Biochem. 2001 Jul;268(14):3898-906.

112 Sampaio C, Raynal P.: Signal strength dictates phosphoinositide 3-kinase contribution to Ras/extracellular signal-regulated kinase 1 and 2 activation via differential Gab1/Shp2 recruitment: consequences for resistance to epidermal growth factor receptor inhibition. Mol Cell Biol. 2008 Jan;28(2):587-600. Epub 2007 Nov 19.

113 Xie ZH, Ambudkar I, Siraganian RP.: The adapter molecule Gab2 regulates Fc epsilon RI-mediated signal transduction in mast cells. J Immunol. 2002 May 1;168(9):4682-91

114Foged C, Nielsen HM.: Cell-penetrating peptides for drug delivery across membrane barriers. Expert Opin Drug Deliv. 2008 Jan;5(1):105-17. Review.

115Morris MC, Deshayes S, Heitz F, Divita G.: Cell-penetrating peptides: from molecular mechanisms to therapeutics. Biol Cell. 2008 Apr;100(4):201-17. Review.

116Chitu V, Demydenko D, Tóth GK, Hegedüs Z, Monostori E.: Conditions for permeabilization of cells used for intracellular tyrosine phosphorylation studies. Biotechniques. 1999 Sep;27(3):435-7.

117Vivès E, Brodin P, Lebleu B.: A truncated HIV-1 Tat protein basic domain rapidly translocates through the plasma membrane and accumulates in the cell nucleus. J Biol Chem. 1997 Jun 20;272(25):16010-7.

118Derossi D, Joliot AH, Chassaing G, Prochiantz A.: The third helix of the Antennapedia homeodomain translocates through biological membranes. J Biol Chem. 1994 Apr 8;269(14):10444-50

119Futaki S, Suzuki T, Ohashi W, Yagami T, Tanaka S, Ueda K, Sugiura Y.: Arginine-rich peptides. An abundant source of membrane-permeable peptides having potential as carriers for intracellular protein delivery. J Biol Chem. 2001 Feb 23;276(8):5836-40.

120Thorén PE, Persson D, Lincoln P, Nordén B.: Membrane destabilizing properties of cell-penetrating peptides. Biophys Chem. 2005 Apr 22;114(2-3):169-79.

88

121Lindberg M, Jarvet J, Langel U, Gräslund A: Secondary structure and position of the cell-penetrating peptide transportan in SDS micelles as determined by NMR. Biochemistry. 2001 Mar 13;40(10):3141-9.

122Simeoni F, Morris MC, Heitz F, Divita G.: Insight into the mechanism of the peptide-based gene delivery system MPG: implications for delivery of siRNA into mammalian cells. Nucleic Acids Res. 2003 Jun 1;31(11):2717-24.

123Fischer PM, Krausz E, Lane DP.: Cellular delivery of impermeable effector molecules in the form of conjugates with peptides capable of mediating membrane translocation. Bioconjug Chem. 2001 Nov-Dec;12(6):825-41

124Tung CH, Weissleder R.: Arginine containing peptides as delivery vectors. Adv Drug Deliv Rev. 2003 Feb 10;55(2):281-94.

125Futaki S, Ohashi W, Suzuki T, Niwa M, Tanaka S, Ueda K, Harashima H, Sugiura Y. Stearylated arginine-rich peptides: a new class of transfection systems. Bioconjug Chem. 2001 Nov-Dec;12(6):1005-11.

126 Zhao Z.: Thiophosphate derivatives as inhibitors of tyrosine phosphatases. Biochem Biophys Res Commun. 1996 Jan 17;218(2):480-4.

127 Winding P, Berchtold M.: The chicken B cell line DT40: a novel tool for gene distruption experiments. J. of Imm. Methodes 2001 249, 1-16

128 Tkaczyk C, Beaven MA, Brachman SM, Metcalfe DD, Gilfillan AM.: The phospholipase C gamma 1-dependent pathway of Fc epsilon RI-mediated mast cell activation is regulated independently of phosphatidylinositol 3-kinase. J Biol Chem. 2003 Nov 28;278(48):48474-84.

129Pawson T, Nash P.: Protein-protein interactions define specificity in signal

transduction. 2000 Genes Dev. May 1;14(9):1027-47.

130Pawson T, Gish GD, Nash P.: SH2 domains, interaction modules and cellular wiring. Trends Cell Biol. 2001 Dec;11(12):504-11.

131Liu WQ, Vidal M, Mathé C, Périgaud C, Garbay C.: Inhibition of the ras-dependent mitogenic pathway by phosphopeptide prodrugs with antiproliferative properties. Bioorg Med Chem Lett. 2000 Apr 3;10(7):669-72.

132Nam NH, Ye G, Sun G, Parang K.: Conformationally constrained peptide analogues of pTyr-Glu-Glu-Ile as inhibitors of the Src SH2 domain binding. 2004 J Med Chem. Jun 3;47(12):3131-41.

133Nam NH, Pitts RL, Sun G, Sardari S, Tiemo A, Xie M, Yan B, Parang K.: Design of tetrapeptide ligands as inhibitors of the Src SH2 domain. 2004 Bioorg Med Chem. Feb 15;12(4):779-87.

89

134Nishida K, Hirano T.: The role of Gab family scaffolding adapter proteins in the signal transduction of cytokine and growth factor receptors. Cancer Sci. 2003 Dec;94(12):1029-33. Review.

135Gual P, Giordano S, Williams TA, Rocchi S, Van Obberghen E, Comoglio PM.: Sustained recruitment of phospholipase C-gamma to Gab1 is required for HGF-induced branching tubulogenesis. Oncogene. 2000 Mar 16;19(12):1509-18.

136Li W, Nishimura R, Kashishian A, Batzer AG, Kim WJ, Cooper JA, Schlessinger J.: A new function for a phosphotyrosine phosphatase: linking GRB2-Sos to a receptor tyrosine kinase. Mol Cell Biol. 1994 Jan;14(1):509-17.

90

Köszönetnyilvánítás

Mindenekelőtt témavezetőmnek, Prof. Sármay Gabriellának szeretném kifejezni

hálámat a sok éves törődésért, szakmai segítségért és türelméért.

Köszönettel tartozom a SOTE KKK doktori iskolának, hogy a Pathobiokémia doktori

program keretein belül lehetőséget kaptam a Ph.D fokozat megszerzésére.

Köszönöm Prof. Erdei Annának, hogy lehetőséget biztosított az ELTE Immunológia

Tanszéken a doktori munkám elvégzéséhez.

Köszönettel tartozom Prof. Tóth K. Gábornak és Váradi Györgyinek a peptidek

szintézisében vállat munkájukért, és Prof. Haihua Gu-nak aki a DT40 sejtvonalat és az

SHP2 vektort biztosította számunkra.

Köszönöm Péterfy Hajnának a hízósejt degranulációs tesztekben nyújtott segítségét.

Külön hálával tartozom labortársaimnak, Koncz Gábornak, Medgyesi Dávidnak, Maus

Máténak, Angyal Adriennek, Barad Zsuzsának, Hérincs Zoltánnak, Mikesy Árpádnak

és a többieknek, akik a szakmai segítségen túl emberileg is sokat nyújtottak számomra

az elmúlt években.

Köszönöm továbbá az Immunológia Tanszék összes munkatársának a segítséget és a

felejthetetlen hangulatot.

91

Saját közlemények jegyzéke

Sármay G, Angyal A, Kertész A, Maus M, Medgyesi D.: The multiple function of Grb2

associated binder (Gab) adaptor/scaffolding protein in immune cell signaling.

Immunol Lett. 2006 Apr 15;104(1-2):76-82.

Kertesz A, Takacs B, Varadi G, Toth GK, Sarmay G.: Design and functional activity of

phosphopeptides with potential immunomodulating capacity, based on the sequence of

Grb2-associated binder 1. Ann N Y Acad Sci. 2006;1091:437-44.

Kertész A, Váradi G, Tóth GK, Fajka-Boja R, Monostori E, Sármay G.: Optimization of

the cellular import of functionally active SH2-domain-interacting phosphopeptides.

Cell Mol Life Sci. 2006;63(22):2682-93.

Györgyi Váradi, Dávid Medgyesi, Ákos Kertész, Gabriella Sármay, Gábor K. Tóth.:

Synthesis of cell-permeable fluorescent lipo-phosphopeptides. in: Peptides 2004

Proceedings of the third international and twenty-eight European Peptide Symposium

Sept 5- 10, 2004 Prague. Kenes International pp 1137-1138

Sármay Gabriella, Kertész Ákos, Angyal Adrienn, Maus Máté, Medgyesi Dávid.:

Jelátvitel és Immungenomika: új eredmények az immunsejtek jelátviteli folyamatainak

vizsgálatában. Magyar Tudomány 2005/6, 671-682.

Sarmay, G; Kertesz, A; Takacs, B; et al.: The role of Grb2 associated binder 1 (Gab1)

scaffolding adaptor protein on signal transduction in human B cells.

FEBS JOURNAL, 272: 323-324 Suppl. 1 JUL 2005

92