gdański uniwersytet medyczny karolina gołąb - pbc.gda.plpbc.gda.pl/content/51368/doktorat goŁĄb...
TRANSCRIPT
Gdaski Uniwersytet Medyczny
Karolina Gob
Indukcja tolerancji immunologicznej
w przeszczepie wysp trzustkowych
ROZPRAWA NA STOPIE DOKTORA NAUK MEDYCZNYCH
Gdask 2015
Prac wykonano w Katedrze Chirurgii Uniwersytetu Chicago we
wsppracy z Pracowni Immunoregulacji i Terapii Komrkowych
Katedry Medycyny Rodzinnej Gdaskiego Uniwersytetu Medycznego
oraz firm CEllT spk z o.o. pod kierownictwem:
- Dr hab. n. med. Natalii Marek-Trzonkowskiej Promotora pracy - Dr hab. med. Piotra Witkowskiego Kopromotora pracy
Praca zostaa sfinansowana z funduszu Narodowego Centrum Bada i
Rozwoju (Projekt STRATEGMED1/233368/1/NCBR/2014) oraz ze
rodkw Narodowego Centrum Nauki przyznanych na podstawie decyzji
numer DEC-2011/01/NZ3/00262 i ze rodkw Ministerstwa Nauki i
Szkolnictwa Wyszego przyznanych na realizacj grantu Iuventus Plus nr
IP2011 033771
Pragn serdecznie podzikowa:
Promotorowi - Dr hab. n. med. Natalii Marek-Trzonkowskiej z Pracowni
Immunoregulacji i Terapii Komrkowych Katedry Medycyny Rodzinnej
Gdaskiego Uniwersytetu Medycznego za wdroenie w wiat komrek T
regulatorowych, opiek merytoryczn od samych pocztkw realizacji bada,
ktrych wyniki zostay przedstawione w publikacjach zawartych w niniejszej
rozprawie oraz za wsparcie, serdeczno, cierpliwo oraz za powicony czas i
nieocenion pomoc ju przy samym otwarciu przewodu doktorskiego i skadaniu
pracy do recenzji.
Kopromotorowi - Dr hab. med. Piotrowi Witkowskiemu Dyrektorowi
Programu Przeszczepiania Wysp Trzustkowych w Katedrze Chirurgii
Uniwersytetu w Chicago za umoliwienie realizacji bada naukowych w ramach
zatrudnienia w zespole, ktrego jest dyrektorem, opiek merytoryczn, motywacj
do rozwoju naukowego, udzielone zaufanie, szczeglnie przy kierowaniu
izolacjami wysp trzustkowych oraz pomoc i wsparcie przy pojawiajcych si
problemach.
Pracownikom Pracowni Immunoregulacji i Terapii Komrkowych Katedry
Medycyny Rodzinnej oraz Zakadu Immunologii Klinicznej i Transplantologii
Katedry Immunologii Gdaskiego Uniwersytetu Medycznego za owocn
wspprac, yczliwo, niezwykle cenn wymian myli i spostrzee, a w
szczeglnoci:
Kierownikowi Zakadu Immunologii Klinicznej i Transplantologii: Prof. dr. hab. med. Piotrowi Trzonkowskiemu za naukowe wsparcie,
wskazwki i uwagi dotyczce planowania dowiadcze i interpretacji
wynikw.
Dr n. biol. Adamowi Krzystyniakowi za pomoc w realizacji bada, owocne dyskusje dotyczce wynikw i podczas przygotowywania
publikacji prezentowanych w niniejszej rozprawie.
Koleankom i Kolegom z Zespou Izolacji i Transplantacji Wysp
Trzustkowych Katedry Chirurgii Uniwersytetu w Chicago za owocn wspprac, wszechstronn pomoc i rady w trakcie wykonywania bada i
stworzenie przyjaznej, rodzinnej atmosfery pracy.
Rodzinie i osobom bliskim za wyrozumiao wzgldem mojego
powicania codziennego czasu pracy oraz wiar we mnie i upewnianie, e to,
nad czym naukowo pracuj ma sens i due znaczenie.
5 Spis treci
SPIS TRECI
WYKAZ STOSOWANYCH SKRTW ............................................................. 6
WYKAZ PRAC WCHODZCYCH W SKAD ROZPRAWY DOKTORSKIEJ .......................................................................................................................................... 8
1. WPROWADZENIE ..................................................................................... 10 1.1. TRZUSTKA I FUNKCJA WYSP TRZUSTKOWYCH ..................................................... 10 1.2. CUKRZYCA TYPU 1 .................................................................................................... 10 1.3. PRZESZCZEP TRZUSTKI W CUKRZYCY TYPU 1 ...................................................... 11 1.4. PRZESZCZEP WYSP TRZUSTKOWYCH JAKO ALTERNATYWNA METODA TERAPII
CUKRZYCY TYPU 1 ................................................................................................................. 12 1.4.1. Historia i obecny status przeszczepu wysp trzustkowych .......... 12 1.4.2. Metoda izolacji wysp trzustkowych ...................................................... 14 1.4.3. Czynniki wpywajce na powodzenie izolacji i przeszczepu
wysp trzustkowych ............................................................................................................ 16 1.4.4. W kierunku nowych metod indukcji tolerancji immunologicznej
w przeszczepie wysp trzustkowych ........................................................................... 24
2. CELE PRACY ............................................................................................... 32
3. NAJWANIEJSZE SPOSTRZEENIA Z PREZENTOWANYCH PRAC WCHODZCYCH W SKAD ROZPRAWY DOKTORSKIEJ.............................. 33
3.1. WZROST DAWCY TRZUSTKI JAKO DODATKOWY CZYNNIK PRZY WYBORZE ODPOWIEDNIEGO DAWCY, WPYWAJACY NA POWODZENIE IZOLACJI WYSP
TRZUSTKOWYCH. ................................................................................................................... 33 3.2. KOMRKI T REGULATOROWE JAK NARZDZIE TERAPEUTYCZNE DO INDUKCJI
TOLERANCJI IMMUNOLOGICZNEJ W PRZESZCZEPIE WYSP TRZUSTKOWYCH ................ 36 3.3. OPTYMALIZACJA EKSPANSJI KOMREK T REGULATOROWYCH POPRZEZ DOBR
ODPOWIEDNIEJ POYWKI HODOWLANEGO ....................................................................... 38 3.4. KRIOPREZERWACJA KOMREK T REGULATOROWYCH NA SKAL KLINICZN
PROBLEMY I WYZWANIA ...................................................................................................... 42 3.5. WPYW WYBRANYCH LEKW IMMUNOSUPRESYJNYCH NA KOMRKI T
REGULATOROWE ................................................................................................................... 47 3.6. METODA LOKALNEJ IMMUNOPROTEKCJI WYSP TRZUSTKOWYCH
Z WYKORZYSTANIEM KOMREK T REGULATOROWYCH I JEJ OPTYMALIZACJA ............ 50
4. WNIOSKI ..................................................................................................... 56
5. WYKAZ CYTOWANEGO PIMIENNICTWA ....................................... 57
6. STRESZCZENIA PRAC / ABSTRACTS .................................................. 78
Karolina Gob 6
WYKAZ STOSOWANYCH SKRTW
AMP adenozynomonofosforan
APC Antigen Presenting Cell / komrka prezentujca antygen
ATG Anti-Thymocyte Globulin / globulina antytymocytarna
BMI Body Mass Index / wskanik masy ciaa
CCL22 Chemokine (C-C motif) ligand 22 / chemokina 22 typu C-C
CCR5 Chemokine (C-C motif) receptor 5 / receptor 5 chemokin typu C-C
CITR Collaborative Islet Transplant Registry / Centralny Rejestr
Przeszczepu Wysp
CFSE Carboxyfluorescein Succinimidyl Ester / ester sukcynoimidu
dioctanu karboksyfluoresceiny
CsA Cyclosporine A / cyklosporyna A
CTLA-4 Cytotoxic T Cell Antigen 4 / antygen 4 zwizany
z cytotoksycznymi limfocytami T
CXCL8 C-X-C Chemokine Ligand 8 / chemokina 8 typu C-X-C
CXCL12 C-X-C Chemokine Ligand 12 / chemokina 12 typu C-X-C
FBS Fetal Bovine Serum / bydlca surowica podowa
GvHD Graft versus Host Disease / choroba przeszczep przeciwko
gospodarzowi
GLP Good Laboratory Practice / dobra praktyka produkcyjna
HbA1C glikowana hemoglobina
HS Human Serum / surowica ludzka
HSC Hematopietic Stem Cell / hemapoetyczna komrka macierzysta
IBD Inflammatory Bowel Diseases / nieswoiste zapalenia jelit
IDO Indoleamine 2,3-dioxygenase / 2,3- dioksygenaza indoloaminy
IDS Islet Donor Score / punktowa ocena dawcy trzustki
IEQ Islet Equivalents / ekwiwalent wysp trzustkowych IFN- Interferon gamma
IL-1, IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-10, IL-35 Interleukina odpowiednio: -1,
-1, -2, -3, -4, -10, -35
IPEX Immunodysregulation Polyendocrinopathy Enteropathy X-linked
syndrome / sprzony z chromosomem X zesp dysregualcji
immunologicznej, poliendokrynopatii i enteropatii
JDRF Juvenile Diabetes Research Foundation / Fundacja na rzecz Bada
nad Cukrzyc Modziecz
LAG3 Lymphocyte-Activation gene 3 / gen 3 aktywacji limfocytw
LFA-1 Lymphocyte Function-Associated Antigen 1 / antygen 1 zwizany z
funkcj limfocytw
MHC Major Histocompatibility Complex / gwny ukad zgodnoci
tkankowej
MMF Mycophenolate Mofetil / mykofenolan mofetylu
MSC Mesenchymal Stem Cell / mezenchymalna komrka macierzysta
7 Skrty
mTOR Mammalian Target of Rapamycin / ssaczy cel rapamycyny
NK Natural Killer cell / komrka naturalny zabjca
NOD Non-Obese Diabetic mice / myszy zapadajce na cukrzyc pomimo braku otyoci; zwierzcy model cukrzycy typu 1
PBMC Peripheral Blood Mononuclear Cells / jednojdrzaste komrki
krwi obwodowej
TCR T Cell Receptor / receptor limfocytw T TGF- Transforming Growth Factor beta / transformujcy czynnik
wzrostu beta
TNF- Tumor Necrosis Factor alpha / czynnik martwicy nowotworw
alfa
TSDR Treg-specific-demethylated region / demetylowany region
specyficzny dla komrek Treg
UNOS United Network for Organ Sharing / Sie Wspdzielenia Organw
do Transplantacji sie zarzdzajca systemem transplantacji
organw w Stanach Zjednoczonych
Karolina Gob 8
WYKAZ PRAC WCHODZCYCH W SKAD ROZPRAWY
DOKTORSKIEJ
1. Wang LJ., Cochet O., Wang XJ., Krzystyniak A., Misawa R., Golab K.,
Tibudan M., Grose R., Savari O., Millis JM., Witkowski P. Donor height in
combination with islet donor score improves pancreas donor selection for
pancreatic islet isolation and transplantation. Transplant Proc. 2014, 46, 6,
1972-1974.
Czasopismo umieszczone na Licie Filadelfijskiej, wskanik IF: 0,984
Punktacja ministerstwa: 15,000
2. Krzystyniak A., Gob K., Witkowski P., Trzonkowski P. Islet cell transplant and the incorporation of Tregs. Curr Opin Organ Transplant. 2014, 19, 6,
610-615.
Czasopismo umieszczone na Licie Filadelfijskiej, wskanik IF: 2,379
Punktacja ministerstwa: 25,000
3. Gob K., Krzystyniak A., Marek-Trzonkowska N., Misawa R., Wang LJ., Wang X., Cochet O., Tibudan M., Langa P., Millis JM., Trzonkowski P.,
Witkowski P. (2013) Impact of culture medium on CD4+CD25
highCD127
lo/neg
Treg expansion for the purpose of clinical application. Int.
Immunopharmacol. 2013, 16, 3, 358-363.
Czasopismo umieszczone na Licie Filadelfijskiej, wskanik IF: 2,711
Punktacja ministerstwa: 30,000
4. Golab K., Leveson-Gower D., Wang XJ., Grzanka J., Marek-Trzonkowska N., Krzystyniak A., Millis JM., Trzonkowski P., Witkowski P. Challenges in
cryopreservation of regulatory T cells (Tregs) for clinical therapeutic
applications. Int Immunopharmacol. 2013, 16, 3, 371-375.
Czasopismo umieszczone na Licie Filadelfijskiej, wskanik IF: 2,711
Punktacja ministerstwa: 30,000
5. Wang XJ., Leveson-Gower D., Golab K., Wang LJ., Marek-Trzonkowska N., Krzystyniak A., Wardowska A., Millis JM. Trzonkowski P., Witkowski P.
Influence of pharmacological immunomodulatory agents on
CD4(+)CD25(high)FoxP3(+) T regulatory cells in humans. Int
Immunopharmacol. 2013, 16, 3, 364-370.
9 Wykaz prac wchodzcych w skad rozprawy doktorskiej
Czasopismo umieszczone na Licie Filadelfijskiej, wskanik IF: 2,711
Punktacja ministerstwa: 30,000
6. Marek N., Krzystyniak A., Ergenc I., Cochet O., Misawa R., Wang LJ., Gob K, Wang X., Kilimnik G., Hara M., Kizilel S., Trzonkowski P., Millis JM.,
Witkowski P. Coating human pancreatic islets with
CD4(+)CD25(high)CD127(-) regulatory T cells as a novel approach for the
local immunoprotection. Ann Surg. 2011 254, 3, 512-518.
Czasopismo umieszczone na Licie Filadelfijskiej, wskanik IF: 7,188
Punktacja ministerstwa: 50,000
7. Gob K., Kizilel S., Bal T., Hara M., Zielinski M., Grose R., Savari O., Wang XJ., Wang LJ., Tibudan M., Krzystyniak A., Marek-Trzonkowska N., Millis
JM., Trzonkowski P., Witkowski P. Improved coating of pancreatic islets
with regulatory T cells to create local immunosuppression by using
the biotin-polyethylene glycol-succinimidyl valeric acid ester
molecule. Transplant Proc. 2014, 46, 6, 1967-1971.
Czasopismo umieszczone na Licie Filadelfijskiej, wskanik IF: 0,984
Punktacja ministerstwa: 15,000
Karolina Gob 10
1. WPROWADZENIE
1.1. Trzustka i funkcja wysp trzustkowych
Trzustka jest organem, ktry spenia funkcje gruczou
zewntrzwydzielniczego oraz wewntrzwydzielniczego (dokrewnego). Jako
gruczo zewntrzwydzielniczy produkuje sok trzustkowy, zawierajcy enzymy
trawice biaka, kolagen i rozkadajce kwasy nukleinowe. W trzustce
produkowane s take hormony, std funkcja trzustki jako gruczou
dokrewnego. Hormony te wytwarzane s przez komrki zgromadzone w
skupiskach, umiejscowione nieregularnie wrd tkanki o funkcjach
zewntrzwydzielniczych. Nazywane s one wyspami trzustkowymi lub od
nazwiska ich odkrywcy wyspami Langerhansa. Wyspy trzustkowe skadaj si
w 60% z komrek , produkujcych insulin, w 20% z komrek ,
produkujcych glukagon, w 5% z komrek , produkujcych somatostatyn oraz
w mniej ni 5% z komrek F, wytwarzajcych polipeptyd trzustkowy.
Pojedyncze wyspy trzustkowe oplecione s sieci naczy krwiononych,
doprowadzajcych skadniki odywcze do komrek i odprowadzajcych
wytwarzane hormony. Wyspy trzustkowe posiadaj ponadto wasne unerwienie.
Funkcjonuj one zatem jako mikro-narzdy.
Istotn funkcj, jak peni wyspy trzustkowe jest utrzymanie
odpowiedniego poziomu glukozy we krwi (glikemii). Komrki oraz reaguj
na stenie glukozy i wydzielaj odpowiednie iloci insuliny oraz glukagonu,
aby utrzyma stan normoglikemii, wynoszcy u zdrowego czowieka na czczo
70-99 mg/dl. Gdy funkcja komrek jest upoledzona, nie dochodzi do
wytwarzania odpowiedniej iloci insuliny. W efekcie glukoza nie dociera do
komrek i pozostaje we krwi, gdzie jej stenie ronie (hiperglikemia).
Przewleka hiperglikemia prowadzi nastpnie do uszkodzenia lub zaburzenia
czynnoci wielu narzdw, w tym nerek, serca, naczy krwiononych i oczu.
1.2. Cukrzyca typu 1
Cukrzyca jest chorob, ktrej gwnym objawem jest hiperglikemia . Ze
wzgldu na etiopatogenez oraz przebieg choroby, mona wyrni jej kilka
typw. Jednym z nich jest cukrzyca typu 1, w ktrej dochodzi do niszczenia
przez ukad immunologiczny chorego komrek , i w konsekwencji do deficytu
insuliny. W tej sytuacji koniecznoci dla chorego staje si dostarczanie
egzogennej insuliny w postaci wstrzykni podskrnych. Std te ten typ
cukrzycy okrela si mianem insulinozalenej. Chorzy musz ponadto
wielokrotnie w cigu dnia kontrolowa poziom glukozy we krwi w celu
dostosowania dawek insuliny do pory dnia oraz iloci i jakoci spoywanych
pokarmw. Pomimo tego, u duej grupy chorych nie jest moliwe sterowanie
11 Wprowadzenie
odpowiednim steniem glukozy we krwi tak, jak jest to w przypadku obecnoci
w organizmie prawidowo funkcjonujcych wysp trzustkowych. Cz
pacjentw, stosujcych terapi insulinow cierpi na napady hipoglikemii. Chory
moe nie by wiadomy, e poziom glukozy w jego krwi spad poniej 50 mg/dl,
natomiast sytuacja taka stanowi realne zagroenie dla jego zdrowia i ycia.
Podczas napadu hipoglikemii moe doj do zaburze wiadomych reakcji,
braku kontaktu z otoczeniem, jak rwnie cakowitej utraty wiadomoci. W
skrajnych przypadkach, gdy do zdarze takich dochodzi w nocy, podczas snu,
moe doj do zgonu chorego, tzw. dead-in-bed (mier w ku) [1].
Jedynymi do tej pory istniejcymi metodami, ktre mog zastpi funkcj
komrek na okres kilku lat i zwolni chorych od obowizku codziennej
poday egzogennej insuliny oraz uchroni przed niewiadomymi napadami
hipoglikemii jest przeszczep trzustki lub wysp trzustkowych.
1.3. Przeszczep trzustki w cukrzycy typu 1
Pierwszy przeszczep trzustki wykonano w roku 1966 i od tego czasu
operacji takich przeprowadzono ponad 42 000 na caym wiecie [2].
Standardowo, przeszczep trzustki wykonuje si u pacjentw chorych na
cukrzyc typu 1 w trzech rnych przypadkach. W okoo 70% s to osoby, ktre
poddawane s rwnoczesnej transplantacji nerki i trzustki. W zwizku
z przeszczepem nerki i tak wymagany jest u nich zabieg operacyjny oraz
konieczno zastosowania immunosupresji. Kolejn grup chorych stanowi ci,
u ktrych przeszczep trzustki wykonywany jest po przeszczepie nerki, np. od
yjcego dawcy. Podobnie jak w powyszej grupie, pacjenci tacy stosuj ju leki
immunosupresyjne i nie jest konieczna dodatkowa indukja tolerancji przed
przeszczepem trzustki [3]. Transplantacj samej trzustki bez uprzedniej lub
rwnoczesnej transplantacji nerki wykonuje si rzadko, jedynie u chorych
cierpicych z powodu niekontrolowanych epizodw hipoglikemii, ale tylko u
okoo 5% pacjentw z tej grupy [4]. Liczba zgonw w pierwszym roku po
przeszczepie trzustki, stanowi mniej ni 5% wszystkich przypadkw. Dziki
poprawie technik chirurgicznych i terapii immunosupresyjnej, przecitnie po 5
latach do 71% przeszczepw nadal spenia swoje funkcje [2].
Pomimo ulepsze w transplantacji trzustki, zabieg ten wci jest
skomplikowany pod wzgldem chirurgicznym i charakteryzuje si znacznym
ryzykiem komplikacji i powika oraz czsto koniecznoci ponownej operacji
w przypadku ich wystpienia. Dodatkowo, pacjenci po przeszczepie trzustki
wymagaj doywotniego przyjmowania lekw immunosupresyjnych,
zwikszajcych ryzyko nowotworzenia, wtrnych zakae czy zaburze ze
strony ukadu neurologicznego i pokarmowego. Co wicej, leki te nie zawsze
Karolina Gob 12
skutkuj, dlatego nawet pomimo ich stosowania moe doj do odrzucenia
przeszczepu, a wtedy koniecznoci staje si ponowny zabieg operacyjny [5].
1.4. Przeszczep wysp trzustkowych jako alternatywna metoda terapii
cukrzycy typu 1
1.4.1. Historia i obecny status przeszczepu wysp trzustkowych
Pomysy terapii cukrzycy typu 1 wyizolowanymi fragmentami trzustki,
ktre produkowayby w organimie chorego insulin pojawiy si ju pod koniec
lat 90-tych XIX wieku. W 1894 roku, brytyjski lekarz Watson Williams
wszczepi pod skr 15-latka, u ktrego wystpoway objawy ketoacydozy,
fragmenty z trzustki owcy. Kondycja chopca na kilka dni si poprawia, ale
ksenotransplant zosta odrzucony, a chopiec zmar wskutek infekcji i postpo-
wania choroby [6]. W 1924 roku z kolei, w czasopimie Lancet pojawio si
doniesienie o transplantacji fragmentw ludzkiej trzustki [7].
Krtko po tym, jak potwierdzono, e to wanie wyspy Langerhansa s tymi,
w ktrych produkowana jest insulina, rozpoczto prby ich izolacji. Jednym z
pionierw tej technologii by polski lekarz patolog Profesor Moskalewski,
ktry w roku 1965, zaraz po doniesieniu o prbach dysekcji wysp trzustkowych
ssakw [8], opracowa metod enzymatycznej izolacji wysp trzustkowych z
trzustki winki morskiej [9]. Metod t rozwin Paul Lacy i jako pierwszy
dokona zakoczonego sukcesem przeszczepu wysp trzustkowych u szczura [10]
[11], nastpnie u map [12], co stopniowo przyczynio si do ugruntowania
potencjalnej skutecznoci izolacji i przeszczepiania wysp trzustkowych.
Metody opracowane przez Lacyego zostay zaadaptowane klinicznie przez
zesp Uniwersytetu w Minesocie i zaowocoway w 1977 roku pierwszym
raportem o przeszczepie wysp trzustkowych u czowieka przy jednoczesnej
poday azatiopryny i kortykosteroidw jako immunosupresji [13]. Pierwsze
doniesienie z kolei o tym, e pacjent cierpicy na cukrzyc typu 1 nie wymaga
terapii egzogenn insulin po przeszczepie wysp trzustkowych pochodzi z roku
1980 [14]. Pomimo pierwszych nielicznych sukcesw uzyskania inuslino-
niezalenoci po przeszczepie wysp trzustkowych, raport Midzynarodowego
Rejestru Przeszczepw Wysp z 1999 roku podawa, e spord 267 trans-
plantacji przeprowadzonych od roku 1990, mniej ni 10% biorcw uzyskao
insulinoniezaleno trwajc duej ni 1 rok [15].
Przeom nastpi w 2000 roku po opublikowaniu przez grup z Edmonton
raportu, w ktrym siedmiu pacjentw w okresie do roku po przeszczepie wysp
trzustkowych nie wymagao podawania insuliny [16]. Rnice pomidzy
poprzednimi metodami izolacji i przeszczepu wysp trzustkowych, a opisanymi
wedug tzw. Protokou Edmonton polegay gwnie na zastosowaniu wikszej
iloci wyizolowanych wysp (pochodzcych od rnych dawcw i podanych w 2-
13 Wprowadzenie
3 odlegych w czasie infuzjach) oraz zmianie protokou terapii immuno-
supresyjnej i rezygnacji z dziaajcych diabetogennie glikokortykoidw na rzecz
daklizumabu (monoklonalne przeciwciao anty-CD25), nowo wprowadzonego
do transplantacji sirolimusu (rapamycyna, inhibitor kinazy mTOR) oraz niskich
dawek takrolimusu (inhibiotr kalcyneuryny) [16].
Pomimo znaczego ulepszenia metody transplantacji wysp trzustkowych,
dugofalowe obserwacje wykazay, e wci mniej ni 10% spord 65
pacjentw, ktrzy otrzymali przeszczepy wysp trzustkowych w orodku
Edmonton utrzymao insulinoniezaleno przez 5 lat po ostatnim przeszczepie.
Jednake, u 80% pacjentw odnotowano obecno C-peptydu, wiadczc o
produkcji endogennej insuliny, a tym samym o zachowaniu funkcji pewnej iloci
przeszczepionych wysp, co z kolei przyczynia si do lepszej kontroli poziomu
glukozy we krwi i wyeliminowania napadw hipoglikemii [17]. Podobne wyniki
uzyskao 9 midzynarodowych orodkw badawczych, ktre wsplnie
stosoway Protok Edmonton. To znaczy, tylko 14% pacjentw spord 36
po przeszczepie wysp trzustkowych pozostao insulinoniezalenych w 2 lata po
przeszczepie, ale u wikszoci pacjentw odnotowano obecno C-peptydu i
obnienie poziomu glikowanej hemoglobiny (HbA1C), co wiadczy o poprawie
kontroli glikemii po przeszczepie wysp [18].
W 1999 roku przy wsparciu JDRF (Juvenile Diabetes Research Foundation)
zawizano Centralny Rejestr Przeszczepu Wysp (CITR; Collaborative Islet
Transplant Registry) w celu oceny oraz monitorowania bezpieczestwa i
rezultatw przeszczepw wysp trzustkowych. Najnowszy, smy raport tego
rejestru podsumowuje wyniki zebrane po przeprowadzeniu transplantacji u 864
pacjentw (686 pacjentw po transplantacji samych wysp i 178 z rwnoczesnym
przeszczepem nerki) w latach 1999-2012 w 37 centrach ze Stanw
Zjednoczonych, Australii i Europy.
W grupie faworyzowanej (pacjenci powyej 35 lat, z poziomem HbA1c
Karolina Gob 14
izolacji i transplantacji wysp trzustkowych oraz protokoy terapii immuno-
supresyjnej w ostatnich latach zostay znacznie udoskonalone.
1.4.2. Metoda izolacji wysp trzustkowych
Izolacja wysp trzustkowych to skomplikowany proces, wymagajcy
jednoczesnej pracy kilku technikw, ktry moe trwa nawet do 10 godzin.
Musi on si odbywa w specjalnych warunkach, zapewniajcych sterylno tak,
aby przygotowane wyspy, ktre maj trafi do pacjenta byy wolne od obecnoci
bakterii czy te bakteryjnej endotoksyny. Dlatego te izolacje wysp
trzustkowych odbywaj si w tzw. czystych laboratoriach (clean room), w
ktrych liczba zanieczyszcze, takich jak py, kurz, bakterie, spory bakteryjne
jest cile limitowana i systematycznie kontrolowana.
Sam proces izolacji wysp trzustkowych rozpoczyna si, gdy trzustka trafia
do laboratorium; przy czym laboratorium naley przed kad izolacj
odpowiednio przygotowa oraz sporzdzi wiee odczynniki, ktre bd
uywane podczas izolacji tak, aby sam proces przeprowadzi moliwie w jak
najkrtszym czasie. Jest to wane ze wzgldu na tzw. czas zimnego
niedokrwienia pobieranej trzustki (cold ischemia time). Powinien on by
moliwie jak najkrtszy, aby wyspy trzustkowe nie zostay nadtrawione przez
wydostajce si z komrek egzokrynnych enzymy trawienne lub zniszczone
wskutek braku odpowiedniej wymiany gazowej w niedokrwionym organie.
Podczas pierwszego etapu po transferze trzustki do czystego laboratorium,
organ jest oczyszczany z pozostaoci tkanki tuszczowej, naczy krwiononych,
czasami rwnie fragmentu dwunastnicy i ledziony. Nastpnie wykonuje si
kaniulacj przewodu trzustkowego jako przygotowanie do kolejnego etapu, czyli
perfuzji. Perfuzja polega na pompowaniu pod kontrolowanym cinieniem
enzymu kolagenazy przez przewd trzustkowy w celu wstpnego uwolnienia
wysp trzustkowych z tkanki rdpcherzykowej. Po tym etapie trzustka jest cita
na fragmenty o wielkoci okoo 1-2 cm, ktre trafiaj do tzw. komory
Ricordiego (Ricordi chamber), w ktrej nastpuje dynamiczny przepyw
enzymu kolagenazy w obiegu zamknitym. Naley podkreli, e dopiero na
tym etapie enzym jest podgrzewany do temperatury 36,6oC i tym samym ulega
aktywacji; uprzednie etapy wykonywane s w kontrolowanej niskiej
temperaturze tak, aby nie doszo do nadtrawienia wysp trzustkowych. W
komorze Ricordiego dochodzi do trawienia mechanicznego i enzymatycznego.
Podczas tego etapu co 1-2 minuty monitoruje si stopie trawienia, pobiera
prbki i pod mikroskopem, po wybarwieniu roztworem ditizonu (barwicym na
czerwono insulin), obserwuje si ilo uwolnionych wysp oraz ich jako. Na
tej podstawie decyduje si, w ktrym momencie przerwa trawienie. Okrelenie
odpowiedniego momentu, w ktrym naley to zrobi jest niezwykle wane
zbyt szybko przerwane trawienie bdzie skutkowa uzyskaniem wysp
trzustkowych nieoczyszczonych z tkanki egzogennej, a co za tym idzie zbyt
15 Wprowadzenie
du iloci tkanki, ktra nie moe zosta bezpiecznie przeszczepiona. Z kolei
zbyt pne przerwanie trawienia spowoduje nadtrawienie wysp trzustkowych, co
diametralnie wpywa na pogorszenie ich jakoci, a tym samym moe
dyskwalifikowa wyspy do przeszczepu. W momencie zatrzymania trawienia,
obniona zostaje temperatura w komorze Ricordiego, a strawiona tkanka jest
zbierana do duej objtoci poywki hodowlanej zawierajcej surowic, aby
zneutralizowa dziaanie enzymu. Kolejnym etapem jest oczyszczenie wysp
trzustkowych poprzez wirowanie w cigym gradiencie ste. Ten etap ma na
celu odseparowanie wysp trzustkowych od tkanki o funkcjach
zewntrzwydzielniczych. Uprzednio, zebrana podczas trawienia tkanka jest
kilkukrotnie pukana w celu usunicia pozostaoci kolagenazy. Podczas
wirowania w gradiencie zbierane s frakcje, ktre rni si midzy sob
czystoci, tj. proporcj wysp do tkanki egzokrynnej. Nastpnie szacuje si
procentow zawarto wysp trzustkowych w kadej z frakcji, a po zwirowaniu
ocenia si wielko uzyskanej tkanki w kadej z nich. Po ocenie, poszczeglne
frakcje czy si w nastpujce klasy czystoci: o wysokiej czystoci (> 59%
wysp trzustkowych), redniej czystoci (> 59-40% wysp trzustkowych) oraz
niskiej czystoci (39-31% wysp trzustkowych). Z kadej z klas czystoci
pobierane s prbki i obliczana jest ilo wysp wyraona przez tzw. ekwiwalent
wysp trzustkowych (islet equivalent quantity; IEQ). Na podstawie uzyskanego
IEQ, jakoci wyizolowanych wysp i iloci tkanki widocznej po zwirowaniu i
usuniciu nadsczu z kadej z frakcji ocenia si, czy wyspy mog zosta
przeszczepione danemu pacjentowi. Jako minimum zwykle przeszczepia si
5000 IEQ na kg masy ciaa pacjenta, ktre po zwirowaniu i usuniciu nadsczu
zajmuj objto nie wiksz ni 10 ml. Wyspy umieszcza si nastpnie w
poywce hodowlanej do czasu przygotowania pacjenta do przeszczepu i
rozpoczcia terapii immunosupresyjnej. Ze wzgldu na jako i przeywalno
wysp, istotnym elementem ich hodowli s czste zmiany poywki hodowlanej
(minimum co 12 h), majce na celu usunicie metabolitw uwolnianych podczas
procesu izolacji przez poddane stresowi wyspy.
W dniu przeszczepu, poszczeglne klasy czystoci wysp trzustkowych
zostaj kilkukrotnie przepukane. Zaznaczy trzeba, e unika si wirowania
wysp w celu zmniejszenia ryzyka ich uszkodzenia, a przy kadym etapie
pukania czeka si, a tkanka samoistnie ulegnie sedymentacji i dopiero wtedy
usuwa si nadscz. Kada z klas czystoci zostaje poddana badaniom
mikrobiologicznym na obecno bakterii Gram +/-. Nastpnie przygotowywany
jest produkt kocowy, ktry ma zosta podany pacjentowi. W tym celu wyspy z
poszczeglnych klas czystoci s zawieszane w 100 ml poywki do
transplantacji zawierajcej serum. Przed poczeniem, dokonuje si decyzji, jak
przygotowa produkt do transplantacji. Zwykle, wyspy podaje si w jednym
worku infuzyjnym. Jednak, gdy objto wysp o niskiej klasie czystoci jest
znaczna, nie czy si klas razem i przygotowywuje do infuzji w osobnych
Karolina Gob 16
workach. Pacjentowi podaje si w takim wypadku najpierw wyspy o wysokiej
klasie czystoci, a nastpnie o niskiej, monitorujc przy tym cinienie w yle
wrotnej, przez ktr wyspy s podawane. W przypadku, gdy cinienie ulegnie
znacznemu podwyszeniu, mona przerwa infuzj. Przygotowanie wysp
trzustkowych w dwch rnych workach infuzyjnych, gdy objto danej klasy
jest dua ma tak zalet, e zapewnia podanie przynajmniej czci produktu,
jeeli dojdzie do podniesienia cinienia w yle wrotnej.
Nastpnie pobiera si prbki do oceny jakoci produktu kocowego i jego
ewentualnej kwalifikacji do przeszczepu. Badania te obejmuj okrelenie
ywotnoci wysp trzustkowych, IEQ, zawartoci endotoksyny, sterylno
produktu (barwienie Gram +/-). Kocowy produkt zawierajcy wyspy
trzustkowe zawieszone w poywce suplementowanej heparyn, obliczon na
podstawie masy ciaa pacjenta, podawany jest przez y wrotn do wtroby
przez cewnik pod kontrol radiologiczn. Zabieg wykonywany jest w
znieczuleniu miejscowym.
1.4.3. Czynniki wpywajce na powodzenie izolacji i przeszczepu wysp
trzustkowych
Do powodzenia izolacji wysp trzustkowych i sukcesu klinicznego
przeszczepu wysp przyczynia si wiele czynnikw. Kady z etapw, poczwszy
od wyboru odpowiedniego dawcy trzustki, przez sposb pobrania organu i jego
transportu do laboratorium, izolacj wysp trzustkowych oraz ich hodowl przed
transplantacj jest niezywkle wany. Co wicej, aby w organizmie biorcy,
wyspy mogy spenia w peni swoj funkcj i skutecznie regulowa poziom
glukozy we krwi, przeszczepiona musi zosta ich odpowiednia liczba, ktra
najczciej wyraa si poprzez ilo IEQ podanych na kilogram masy ciaa
pacjenta. Do tego z kolei, aby przeszczepione wyspy mogy podj funkcj w
organizmie dawcy, konieczna jest skuteczna terapia immunosupresyjna, ktra
zapobiegnie odrzucaniu przeszczepu.
1.4.3.1. Ocena dawcy i jakoci trzustki
Ewaluacja i wybr odpowiedniego dawcy trzustki jest wany ze wzgldu na
fakt, e pozwala jeszcze przed pobraniem organu oceni, czy izolacja wysp z
trzustki od danego dawcy ma szans da odpowiedni ilo wysp do
przeszczepu, a tym samym unikn wydatkowania czasu, materiaw i rodkw
finansowych na nieskuteczn izolacj. Od samych pocztkw izolacji wysp
trzustkowych prbowano okreli parametry zarwno dotyczce dawcy, jak i
jakoci organu, ktre mogyby pomc w ocenie czy dany organ bdzie si
nadawa do izolacji wysp czy nie. Do najczstszych kryteriw branych pod
17 Wprowadzenie
uwag mona zaliczy: wiek dawcy, wskanik masy ciaa (BMI Body Mass
Index), przyczyn mierci, histori leczenia, dawk przyjtych lekw
wazopresyjnych, wyniki laboratoryjne okrelajce poziom kreatyniny,
bilirubiny, lipazy, amylazy, HbA1c, wstpny czas zimnego niedokrwienia
organu, wielko trzustki, zawarto tkanki tuszczowej, urazy organu, jako
pobrania oraz metod prezerwacji podczas transportu organu. W rnych
orodkach badano wpyw jednego lub kilku z tych czynnikw na powodzenie
izolacji wysp trzustkowych [2126], ale wnioski z tych bada s niejednokrotnie
sprzeczne, co moe by spowodowane ma iloci przenalizowanych izolacji w
pojedynczym orodku.
Orodek Edmonton w 2005 roku opracowa algorytm punktowy, ktry
pozwala na efektywn ocen czy izolacja wysp od danego dawcy ma szans na
powodzenie czy nie [27]. Wedug tego systemu branych jest pod uwag wiele
czynnikw i parametrw dawcy jak i organu, i przyznawane s punkty, zgodnie
z wag ich wpywu na powodzenie izolacji wysp. Trzustka od potencjalnego
dawcy oceniana jest w skali od 0 do 100. Grupa z Edmonton zaproponowaa, e
w przypadku wartoci >80 szansa na efektywn izolacj wysp wynosi ponad
50%. Natomiast, gdy dawca i organ oceniany jest na >90, szansa na izolacj, w
ktrej uzyska si znaczca ilo wysp dobrej jakoci, nadajcych si do
przeszczepu wynosi 100% [27].
System ten nadal jest walidowany w innych orodkach i oceniana jest jego
przydatno [2830].
1.4.3.2. Proces izolacji
Jak opisano powyej, proces izolacji wysp trzustkowych jest zoony i
kady z etapw jest istotny, aby mona byo uzyska wyspy w iloci i jakoci,
pozwalajcej na przeszczep.
Sam etap, w ktrym trzustka jest transportowana do laboratorium odgrywa
wan rol. Saba penetracja tlenu do tkanki naraa wyspy trzustkowe na
hipoksj i moe skutkowa zredukowan przeywalnoci izolowanych wysp.
Dlatego te opracowano metod konserwacji trzustki na granicy dwch pynw
roztworu UW (University of Wisconsin solution) oraz perfluorokarbonu, ktry
wspomaga transport tlenu do organu [31]. Wci jednak trwaj badania nad
ulepszeniem metody transportu, poprzez na przykad wykorzystanie urzdze do
wymiany gazowej [32] czy zastosowanie innych zwiazkw wspomagajcych
wymian tlenow [33].
Wybr waciwego enzymu trawicego podczas izolacji wysp trzustkowych
ma rwnie ogromne znaczenie. Enzym o zmniejszonej aktywnoci nie pozwoli
na uwolnienie wysp z tkanki zewntrzwydzielniczej, a zbyt dua aktywno
doprowadzi do fragmentacji izolowanych wysp. W rnych orodkach uywane
Karolina Gob 18
s rne enzymy: kolagenaza NB1 (Serva), Liberaza MTF (Roche), kolagenaza
CIzyme (VitaCyte) [3439], a kluczow rol odgrywa tu po prostu dowiad-
czenie danego orodka w uyciu poszczeglnego z enzymw.
Kolejny niezwykle istotny etap izolacji to wirowanie w gradiencie cigym,
aby oczyci wyspy trzustkowe z tkanki egzokrynnej. Stosowane s dwa rodzaje
gradientw: sporzdzony z roztworu UW i Biocollu o gstoci 1,1 g/ml
(Biochrom AG) lub w oparciu o uycie roztworu jodiksanolu (OptiPrep,
SigmaAldrich). Oba daj podobne wyniki, jeeli chodzi o ilo oczyszczonych
wysp, ale wykazano, e ten ostatni redukuje ilo uwalnianych cytokin i
chemokin, wpywajc na ywotno wyizolowanych wysp [4042].
1.4.3.3. Miejsce przeszczepu
Obecnie infuzji wysp trzustkowych dokonuje si zwykle przez y wrotn
do wtroby. Miejsce to, pomimo, e jest uwaane za optymalne, posiada swoje
wady. Wyspy trzustkowe naraone s tam na natychmiastow reakcj zapaln
poprzez kontakt ze skadnikami krwi. Szacuje si, e w wyniku tej reakcji
dochodzi do zniszczenia znacznej iloci przeszczepionych wysp w zaledwie
kilka godzin po przeszczepie [43]. Efekt ten mgby zosta wyeliminowany,
gdyby wyspy przeszczepiono w miejsce, gdzie nie ma bezporedniego kontaktu
z krwi. Alternatywne miejsca infuzji takie jak: ledziona, torebka nerki,
trzustka, jama otrzewnowa, grasica, szpik kostny, przestrze rdminiowa [44-
49] byy testowane z rnym rezultatem. Kade z tych miejsc posiada swoje
wady i zalety [50]. Najwikszym problemem we wszystkich tych potencjalnych
miejscach infuzji wysp trzustkowych jest stworzenie rodowiska, ktre
sprzyjaoby waskularyzacji wysp, a ktre jednoczenie byoby immunologicznie
uprzywilejowane [51]. Dlatego te badania pre-kliniczne i kliniczne nad
poszukiwaniem alternatywnych miejsc przeszczepu powinny by nadal
prowadzone, aby udao si okresli to najbardziej optymalne.
1.4.3.4. Wzbudzenie tolerancji i immunosupresja
Przeszczepione wyspy trzustkowe naraone s w organizmie biorcy na atak
ze strony niespecyficznej odpowiedzi immunologicznej, a take obecnej
wczeniej odpowiedzi autoimmunologicznej oraz indukowanej pojawieniem si
przeszczepu odpowiedzi allogenicznej. Dlatego te, zastosowanie odpo-
wiedniego protokou immunosupresji, ktry pozwoli na utrzymanie przeszczepu
i podjcie przez wyspy trzustkowe funkcji jest szczeglnie skomplikowanym
zagadnieniem. Dodatkowo, niektre z lekw immunosupresyjnych upoledzaj
funkcj komrek i maj dziaanie diabetogenne [52]. Duym przeomem w
immunosupresji podczas przeszczepu wysp trzustkowych bya rezygnacja ze
19 Wprowadzenie
szkodliwych steroidw wg protokou Edmonton na rzecz, daklizumabu,
sirolimusu oraz maych dawek takrolimusu [53]. Jednak, protok ten nie
pozwala wci na osignicie dugotrwaej insulinoniezalenosci przez
pacjentw po przeszczepie [17]. Dlatego te na przestrzeni ostatnich lat
poszukuje si i testuje nowe rodki biologiczne oraz strategie immunologiczne,
ktre pozwol na popraw wynikw transplantacji wysp trzustkowych.
W celu zapewnienia przeywalnoci i podjcia funkcji przez przeszczepione
wyspy trzustkowe stosuje si m.in. przeciwciaa monoklonalne, blokery
sygnaw ko-stymulacji, terapi antagonistami dla receptorw cytokin,
enkapsulacj, terapie komrkowe, regulujce odpowied immunologiczn, jak
rwnie leki hamujce aktywacj i/lub proliferacj limfocytw T [54].
Wspczenie stosowane strategie zapobiegajce odrzuceniu przeszczepu wysp
trzustkowych cz najczciej kilka terapii, majcych na celu wzbudzenie
tolerancji immunologicznej (np. globulina antytymocytarna, przeciwciao anty-
CD52 alemtuzumab, przeciwciao anty-CD3), zahamowanie odpowiedzi
zapalnej (np. przeciwciao anty-TNF-, blokery receptorw dla chemokiny
CXCL8), utrzymanie stanu immunosupresji (np. inhibitory kalcyneuryny,
blokery sygnaw kostymulacji, inhibitory szlaku kinazy mTOR (mammalian
target of rapamycin), MMF (mykofenolan mofetylu)).
Przeciwciao anty-CD25 wie si z podjednost receptora dla IL-2 na
aktywowanych limfocytach i hamuje w ten sposb ich dalsz proliferacj [55].
Na rynek wypuszczono dwa leki bdce monoklonalnymi przeciwciaami anty-
CD25: daklizumab (Zenapax, Roche) i basiliximab (Simulect, Novartis);
obecnie Zenapax jest wycofany z obrotu na obszarze Unii Europejskiej. Sukces
protokou Edmonton polegajcy na uzyskaniu przez pacjentw po przeszczepie
wysp trzustkowych insulinoniezalenoci, to w gwnej mierze zmiana immuno-
supresji z diabetogennych steroidw wanie na daklizumab w poczeniu z
tacrolimusem i sirolimusem [53]. Jednake, po 5 latach od transplantacji
wikszo pacjentw ponownie wymagaa podawania egzogennej insuliny, co
wiadczy o utracie funkcji przeszczepu [18]. Przeciwciao anty-CD25 dziaa na
limfocyty o wysokiej ekspresji receptora dla IL-2, czyli rwnie na limfocyty T
regulatorowe [56], a tym samym przyczynia si do blokowania naturalnych
mechanizmw regulacji odpowiedzi immunologicznej. Dodatkowo zaobserwo-
wano, e zastosowanie daklizumabu prowadzi do limfopenii z podwyszon
produkcj cytokin IL-7 i IL-15, ktre z kolei stymuluj proliferacj auto- i allo-
reaktywnych limfocytw T CD8+. W sytuacji, kiedy lek jednoczenie hamuje
proliferacj komrek Treg, zaczyna brakowa naturalnego mechanizmu
kontrolujcego dziaanie limfocytw T CD8+ [57,58]. W zwizku z powyszym
oraz z faktem, e w 2009 roku daklizumab zosta wycofany z rynku,
prowadzone s badania innych terapii immunosupresyjnych w przeszczepie
wysp trzustkowych.
Karolina Gob 20
Globulina antytymocytarna (ATG anti-thymocyte globulin) to
oczyszczona frakcja przeciwcia IgG z pozyskiwana surowicy zwierzt (krlika lub konia) immunizowanych ludzkimi limfocytami T lub tymocytami [59].
Dziaa ona na antygeny znajdujce si na powierzchni limfocytw T i prowadzi do ich niszczenia poprzez rne mechanizmy: aktywacj dopeniacza,
cytotoksyczno zalen od przeciwcia, indukcj apoptozy czy te wywoujc
zmiany w ekspresji receptorw chemokin na powierzchni limfocytw [60,61].
Globulina antytymocytarna jest dostpna jako lek immunosupresyjny od ponad
25 lat. Jednak zainteresowanie jej zastosowaniem w terapii indukcji tolerancji
wzroso w ostatnich latach, szczeglnie po odkryciu, e ma ona wpyw na
podwyszenie odsetka limfocytw T regulatorowych, ktre posiadaj
waciwoci immunosupresyjne [62,63]. Badania kliniczne, w ktrych
zastosowano ATG oraz daklizumab do indukcji tolerancji u biorcw wysp
trzustkowych wykazay, e wczenie tych lekw do protokou pozwala na
osignicie insulinoniezalenoci ju po jednej infuzji wysp nawet u 100%
pacjentw [64]. Podobne wyniki, przeprowadzone jednak na mniejszej grupie
pacjentw uzyskaa grupa, ktra w swoim protokole immunosupresji
zastosowaa ATG, inhibitor TNF- i IL-1 jako terapi hamujc odpowied
zapaln oraz MMF [40]. Dodatkowo, ATG jest obecnie testowana u pacjentw z
nowo zdiagnozowan cukrzyc typu 1 jako terapia zapobiegajca postpowi
choroby (ClinicalTrials.gov, NCT00515099) w ramach II fazy bada
klinicznych.
Przeciwciao anty-CD52 (alemtuzumab, Campath-1) CD52 jest antygenem wystpujcym na powierzchni wszystkich limfocytw [65]. W
zwizku z tym, alemtuzumab znalaz szerokie zastosowanie zarwno w terapii
biaaczek limfocytarnych i prolimfocytarnych, w chorobach o podou
autoimmunologicznym stwardnieniu rozsianym, reumatoidalnym zapaleniu
staww, jak i w transplantacji nerek. W transplantacji wysp trzustkowych
alemtuzumab wraz z takrolimusem i MMF by testowany przez grup Edmonton
po wycofaniu z rynku uywanego wczeniej do indukcji tolerancji w tym
orodku daklizumabu. Grupa ta odnotowaa wzrost odsetka pacjentw
insulinoniezalenych 5 lat po przeszczepie i osiagna podobne wyniki, jak w
przypadku transplantacji caej trzustki [66].
Przeciwciao anty-CD3 dziaa w sposb dwufazowy. W fazie pierwszej
prowadzi do spadku liczby limfocytw T, wykazujc dziaanie
immunosupresyjne, a nastpnie indukuje powstawanie komrek Treg, ktre
poprzez produkcj antyzapalnej IL-10 i TGF-b przeciwdziaaj reakcji zapalnej i
autoimmunologicznej. Badania pre-kliniczne na zwierztach wykazay, e
terapia anty-CD3 ma korzystne dziaanie w mysich modelach allo-transplantacji
oraz cukrzycy typu 1 [67,68]. Grupa z Uniwersytetu w Minesocie testowaa
przeciwciao anty-CD3 (teplizumab) w zestawieniu z sirolimusem i nisk dawk
takrolimusu w transplantacji wysp trzustkowych. Czterech z szeciu
przeszczepionych pacjentw nie wymagao podawania insuliny po przeszczepie.
21 Wprowadzenie
U czterech pacjentw insulinoniezalenych zanotowano istotny spadek liczby
komrek T CD4+ z rwnoczesnym wzrostem odsetka limfocytw Treg, co
sugeruje, e doszo do rozwoju rodowiska tolerogennego [69]. Nowsze badania,
w ktrych testowano teplizumab w poczeniu z przeciwciaami przeciwko
limfocytom T oraz inhibitorem TNF- pokazay potencjaln skuteczno takiej
terapii w przeszczepie wysp trzustkowych (uzyskanie insulinoniezalenoci)
[70]. Jak kada terapia immunosupresyjna, tak i zastosowanie przeciwciaa anty-
CD3 wie si z wystpowaniem efektw ubocznych, z ktrych najczciej
wystpujce to gorczka, ble gowy i mini, wysypka oraz wymioty.
Inhibitory TNF- TNF- jest cytokin, ktra peni wan funkcj w
procesach zapalnych i odpowiedzi immunologicznej poprzez m.in. indukcj
syntezy innych cytokin, produkcj przeciwcia przez limfocyty B, stymulacj
produkcji biaek ostrej fazy w wtrobie, indukcj apoptozy komrek
nowotworowych [71]. TNF- ma ponadto negatywny wpyw na funkcjonowanie
komrek , a efekt ten moe zosta zatrzymany poprzez zastosowanie inhibitora
TNF- [72]. Uudowodniono rwnie, e terapia przeciwciaami anty-TNF-
prowadzi do wzrostu odsetka komrek Treg we krwi obwodowej [73]. W
praktyce klinicznej stosowane s obecnie dwa leki hamujce dziaanie TNF-, tj.
etanercept oraz infliksymab. Etanercept by testowany w poczeniu z innymi
lekami jako terapia immunosupresyjna w przeszczepie wysp trzustkowych m.in.
na Uniwersytecie w Miami, w Minesocie i na Uniwersytecie Illinois [7476].
Pierwszym orodkiem, ktry osign obiecujce wyniki bya grupa w
Minesocie. Do indukcji tolerancji zastosowali oni etanercept poczony z
daklizumabem i ATG. Przeszczep otrzymao omiu pacjentw i aden z nich nie
wymaga podawania insuliny rok po przeszczepie wysp trzustkowych i nie
stwierdzono u nich niekontrolowanych napadw hipoglikemii [77].
Inhibitor IL-1 (anakinra) anakinra jest rekombinowanym biakiem,
antagonist ludzkiego receptora IL-1. Interleukina-1 jest cytokin prozapaln,
stymulujc odpowied immunologiczn. Co wicej, IL-1 niekorzystnie wpywa
na funkcj, proliferacj i ywotno komrek [78]. Badania kliniczne, w
ktrych wykorzystano blokery IL-1 i TNF- przy jednoczesnej terapii
takrolimusem i MMF w poczeniu z indukcj opart o zastosowanie ATG w
przeszczepie wysp trzustkowcyh, pokazay obiecujce wyniki [40]. Dodatkowo,
grupa ta, podczas oczyszczania wysp podczas wirowania w gradiencie cigym
wykorzystaa jodiksanol, ktry, jak ju wczeniej wspomniano, redukuje ilo
wydzielanych cytokin przez wyspy trzustkowe. Praca ta zatem wskazuje na
wany problem odpowiedzi zapalnej w odrzucaniu przeszczepu wysp
trzustkowych. Ograniczeniem w interpretacji tych wynikw jest maa liczba
pacjentw (n=3) poddanych transplantacji.
Inhibitor szlaku CXCL8 (reparixin) interleukina 8 (CXCL8) jest
chemokin, ktra czy si z receptorami CXCR1 i CXCR2 [79]. Wykazano, e
u biorcw wysp trzustkowych IL-8 odgrywa istotn rol w rekrutacji
Karolina Gob 22
neutrofilw oraz komrek NK (Natural Killer cells) do miejsca przeszczepu, co
nastpnie prowadzi do rozwoju odpowiedzi zapalnej. Na mysim modelu
syngenicznego oraz allogenicznego przeszczepu wysp trzustkowych
udowodniono, e blokada receptorw CXCR1 i CXCR2 wpywa na
przeywalno przeszczepu [80]. Inhibitor receptorw CXCR1/2 znany jest jako
lek reparixin (Dompe). Wyniki fazy II bada klinicznych, w ktrych testowano
wyej wymieniony lek w przeszczepie wysp trzustkowych (ClinicalTrials.gov,
NCT01220856) cznie z ATG, metylprednizolonem, MMF, takrolimusem i
rapamycyn wykazay, e pacjenci leczeni zgodnie z tym protokoem maj
lepsz kontrol glikemii, wyszy poziom C-peptydu i jednoczenie wymagaj
niszych dawek insuliny w porwnaniu z grup konroln [80]. Obecnie trwa III
faza bada klinicznych (ClinicalTrials.gov, NCT01817959), majca na celu
potwierdzenie koyci wynikajcych ze stosowania reparixinu w przeszczepie
wysp trzustkowych, w ktre zaangaowanych jest kilka instytucji na wiecie,
m.in. Uniwersytet w Chicago, Uniwersytet w Uppsali oraz Instytut San Raffaele
w Mediolanie.
Inhibitory kalcyneuryny (takrolimus, cyklosporyna) kalcyneuryna jest biakiem, uczestniczcym w szlaku aktywacji limfocytw T. Funkcja tego biaka
zostaa zidentyfikowana po odkryciu mechanizmw dziaania dwch lekw
immunosupresyjnych: cyklosporyny A (CsA) oraz takrolimusu (FK506) [81].
Leki te hamuj aktywacj i dalsz proliferacj limfocytw T poprzez inhibicj
syntezy m.in. IL-2, IL-3, IL-4, IFN- w tych komrkach [82,83]. Cyklosporyna
A bya testowana u osb z nowo zdiagnozowan cukrzyc typu 1.
Zaobserwowano, e proces niszczenia komrek by hamowany u pacjentw
poddanych terapii cyklosporyn, a pacjenci wymagali niszych dawek
egzogennej insuliny. Niemniej jednak efekt ten by krtkotrway, a lek
wykazywa silne dziaanie nefrotoksyczne [52,84].
Z kolei takrolimus w poczeniu z sirolimusem by stosowany np. we
wspomnianym wczeniej Protokole Edmonton [53]. Wykazano jednak
pniej, ze takrolimus ma dziaanie toksyczne wzgldem komrek oraz
podobnie do cyklosporyny, upoledza funkcj nerek [85]. Dodatkowo, hamuje
proces rewaskularyzacji wyizolowanych wysp trzustkowych [86]. Niemniej
jednak na podstawie sidmego raportu CIT, ktry podsumowuje wyniki
przeszczepw wysp trzustkowych, przy ktrych stosowano ATG, etanercept
oraz sirolimus i takrolimus, stwierdzono, e takrolimus i sirolimus podawane w
niskiej dawce, nie s toksyczne dla wysp trzustkowych [87].
Sirolimus (rapamycyna, inhibitor kinazy mTOR) rapamycyna jako
inhibitor kinazy mTOR hamuje aktywacj i proliferacj limfocytw T poprzez
blokowanie szlaku sygnalizacji zalenego od IL-2 [88]. W wikszoci proto-
kow immunosupresyjnych w przeszczepie wysp trzustkowych wykorzystuje
si sirolimus w poczeniu z takrolimusem lub MMF [66]. Z jednej strony,
rapamycyna korzystnie wpywa na funkcj limfocytw T regulatorowych [89-
92], a tym samym wspomaga naturalne mechanizmy immunosupresji w
23 Wprowadzenie
organizmie pacjenta, ale z drugiej strony upoledza funkcjonowanie wysp
trzustkowych, ich regeneracj i re-waskularyzacj [93-95]. Naley rwnie
doda, e z zastosowaniem rapamycyny wie si wiele efektw ubocznych
takich jak: leukopenia, trombocytopenia, anemia, hypercholesterolemia,
niestrawno, wystpowanie biegunek, wysypki skrnej, aft w jamie ustnej czy
zaburzenia cyklu menstruacyjnego u kobiet [18,94,96]. Terapia immuno-
supresyjna rapamycyn w przeszczepie wysp trzustkowych moe zatem
przynosi zarwno korzyci, jak i wywoywa skutki negatywne, a efekt ten
moe by rny w zalenoci od pacjenta. Z tego wzgldu rozwizaniem moe
tu by opracowanie terapii immunosupresyjnej, ktra bdzie dostosowana do
konkretnego, indywidualnego pacjenta [93].
Mykofenolan mofetylu (MMF, CellCept) w zwizku z wyej opisanymi faktami dotyczcymi toksycznoci wzgldem komrek oraz efektami
ubocznymi terapii takrolimusem i sirolimusem jako lekw do utrzymania stanu
immunosupresji, coraz czciej zamiast takiej terapii, stosuje si MMF. Lek ten
jest stosowany sam lub w poczeniu z niskimi dawkami takrolimusu czy
sirolimusu [50]. MMF blokuje szlak syntezy nukleotydw guaninowych,
hamujc w ten sposb syntez DNA. Komrkami szczeglnie wraliwymi na
MMF s limfocyty.[97]. Zastpienie takrolimusu przez MMF eliminuje efekt
niszczenia wysp, co jest szczeglnie wane w przypadku transplantacji maej
iloci IEQ na kg masy ciaa pacjenta. Dodatkowo MMF, w przeciwiestwie do
takrolimusu nie wykazuje efektw nefrotoksycznych. Skuteczno MMF przy
transplantacji minimalnej iloci wysp na kg masy ciaa potwierdziy badania
przeprowadzone na Uniwersytecie w Minesocie. Omiu pacjentw, u ktrych w
ramach protokou immunosupresyjnego w przeszczepie wysp trzustkowych
zastosowano ATG w poczeniu z daklizumabem i etanerceptem do indukcji
tolerancji i MMF wraz z sirolimusem do utrzymania immunosupresji nie
wymagao podawania insuliny i nie zaobserwowano u nich napadw
hipoglikemii. Piciu pacjentw z tej grupy pozostao insulinoniezalenych duej
ni rok po przeszczepie [77]. Negatywnym aspektem stosowania MMF w
przeszczepie wysp trzustkowych moe by fakt, e zwizek ten, jak
udowodniono, ma hamujcy wpyw na neogenez wysp przez blokowanie
proliferacji komrek prekursorowych [98].
Blokery kostymulacji aby naiwny limfocyt T zosta zaktywowany w
wyniku kontaktu ze swoistym antygenem prezentowanym w kontekcie MHC
(gwny ukad zgodnoci tkankowej Major Histocompatibility Complex)
niezbdne s dwa sygnay: pochodzcy z rozpoznania antygenu przez receptor
TCR (receptor limfocytw T T Cell Receptor) oraz drugi, pochodzcy z
receptorw ko-stymulacyjnych. Do przekazania sygnau kostymulacyjnego
niezbdna jest interakcja pomidzy receptorem CD28 na powierzchni limfocyta
T, a receptorem CD80 (B7.1) lub CD86 (B7.2) na powierzchni komrki
prezentujcej antygen (APC Antigen Presenting Cell) [99]. Limfocyty, po
Karolina Gob 24
pierwszym zetkniciu ze swoistym antygenem nabywaj take ekspresj
receptora CTLA-4 (antygen 4 zwizany z cytotoksycznymi limfocytami T
cytotoxic T cell antygen). Poczenie CTLA-4 z receptorem CD80 lub CD86 na
komrce APC prowadzi do zahamowania aktywnoci limfocyta, przy czym
ekspresja CTLA-4 jest proporcjonalna do siy sygnau z TCR [100]. Blokada
kostymulacji, prowadzca do zahamowania aktywacji i proliferacji limfocytw
stanowi atrakcyjn strategi immunosupresyjn. W transplantacji wysp trzustkowych prbowano wczy 3 rne blokery kostymulacji do protokow immunosupresyjnych: abatacept (biako fuzyjne bdce poczeniem fragmentu Fc ludzkiej immunoglobuliny IgG1 i zewntrzkomrkowej domeny CTLA-4), belatacept (druga generacja biaka fuzyjnego Fc IgG1 i CTLA-4) oraz efalizumab przeciwciao monoklonalne anty-LFA-1 (antygen 1 zwizany z funkcj limfocytw Lymphocyte Function-Associated Antigen 1) blokujce bezporedni kontakt komrek APC i limfocytw T podczas prezentacji antygenu [50,66]. Uniwersytet w San Francisco zanotowa obiecujce wyniki przeszczepu wysp trzustkowych stosujc belatacept lub efalizumab wraz z ATG i MMF lub sirolimusem. Wszyscy pacjenci (n=5), ktrym podawano immunosupresj opart o belatacept uzyskali insulinoniezaleno po jednym przeszczepie wysp. U jednego z pacjentw po 305 dniach od transplantacji, trzeba byo zastosowa insulin w obnionych dawkach, ale po drugim przeszczepie wysp trzustkowych uzyska ponownie insulinoniezaleno. Pacjenci po terapii efalizumabem (n=5) rwnie nie wymagali poday egzogennej insuliny przez ponad rok po przeszczepie, ale u dwch z nich do osigniecia tego rezultatu konieczne byy dwie transplantacje wysp. Dodatkowo, u adnego z pacjentw, ani po terapii belataceptem, ani efalizumabem nie zaobserwowano efektw ubocznych [101]. Efalizumab zosta wycofany z uytku klinicznego z powodu zanotowania przypadku postpujcej wieloogniskowej leukoencefalopatii po terapii tym lekiem, wic dugofalowe skutki stosowania nie s znane [66]. Jeeli chodzi o belatacept, to niedawno ukoczono badania kliniczne w ramach CIT (CIT-04), w ktrych zastosowano ten lek wraz z basiliximabem i MMF (ClinicalTrials.gov; NCT00468403). Wyniki tych bada nie zostay jeszcze podane.
1.4.4. W kierunku nowych metod indukcji tolerancji immunologicznej
w przeszczepie wysp trzustkowych
Jak opisano powyej, w transplantacji wysp trzustkowych obecnie testuje si wiele rnych terapii i kombinacji lekw chemicznych i biologicznych w celu zapewnienia ochrony przeszczepu. adna z tych terapii jednak nie jest stuprocentowo skuteczna. Co wicej, stosowaniu wielu lekw wie si z wystpowaniem szeregu skutkw ubocznych. Komplikacje wynikajce z terapii immunosupresyjnej i jej niecakowita skuteczno s wanymi czynnikami,
25 Wprowadzenie
ktre nie pozwalaj na stosowanie przeszczepu wysp trzustkowych jako
rytynowej metody leczenia okrelonej grupy pacjentw z cukrzyc typu 1.
Dlatego te wci trwaj poszukiwania innych strategii, ktre zapewni ochron
przeszczepionych wysp trzustkowych na poziomie allo- i autogenicznym.
1.4.4.1. Enkapsulacja wysp trzustkowych
Jedn ze strategii ochrony przeszczepianych wysp trzustkowych przed
atakiem ze strony ukadu immunologicznego biorcy jest mechaniczna izolacja.
Pojedyncze wyspy trzustkowe mog by opaszczone rnego rodzaju
materiaami zarwno syntetycznymi, jak i biologicznymi (mikroenkapsulacja)
lub przeszczepiane wyspy mog by razem umieszczone w sztucznym
urzdzeniu (makroenkapsulacja) [50]. Enkapsulacja ma na celu stworzenie
bariery nieprzepuszczalnej dla przeciwcia i komrek, aby ochroni przeszczep
przed atakiem ze strony ukadu immunologicznego, a jednoczenie umoliwi
przepyw maych czsteczek takich jak insulina i glukoza, aby przeszczepione
wyspy miay zapewnion odpowiedni wymian tlenow i dostp do skadnikw
odywczych. Przy wyborze odpowiedniego materiau do enkapsulacji naley
wzi pod uwag zrealizowanie powyszych celw, a przy tym naley rwnie
rozway takie czynniki jak: miejsce transplantacji, metod enkapsulacji,
zachowanie funkcji wysp, wytrzymao materiau, jego czysto oraz powta-
rzalno metody [102]. Dlatego te testowano rne materiay pochodzenia
biologicznego, jak: kolagen, hialuronian, fibryna, alginian, agaroza i chitosan
oraz syntetycznego, jak: kwas poliakrylamidowy, tlenek polietylenu, alkohol
poliwinylowy, polifosfazeny, polipeptydy i ich pochodne [103] na rnych
modelach zwierzcych, m.in. na myszach NOD (Non-Obese Diabetic mice),
szczurach Wistar i Lewis, psach, koniach i ssakach naczelnych. Cz metod
enkapsulacji testowanych z sukcesem na gryzoniach okazao si by
nieskutecznych w badaniach na wikszych zwierztach [104]. Midzy innymi
dlatego te bada klinicznych wykorzystujcych metod enkapsulacji
przeszczepianych wysp przeprowadzono niewiele. Pierwsz prb
przeszczepienia wysp trzustkowych opaszczonych otoczk alginianow
przeprowadzono w 1994 roku. Pacjentowi podano wyspy w dwch infuzjach
(pierwsza: 10 000 IEQ/kg, druga po p roku: 5 000 IEQ/kg). Po drugiej dawce
wysp pacjent wymaga podawania jedynie 1-2 jednostek insuliny dziennie
(przed transplantacj uywa 40-50 jednostek), a po 9 miesicach osign
insulinoniezaleno [105]. Ograniczeniem w interpretacji, czy przeszczepione
wyspy trzustkowe nie zostay odrzucone dziki enkapsulacji jest fakt, e pacjent
otrzymywa ju leki immunosupresyjne w zwizku z wczeniejszym
przeszczepem nerki. W 1994 roku przeprowadzono jeszcze jedno badanie
kliniczne, w ktrym podskrnie przeszczepiono wyspy trzustkowe po uprzedniej
makroenkapsulacji, tj. po zamkniciu wysp w specjalnym urzdzeniu
Karolina Gob 26
zbudowanym z wknika. Z powodu maej iloci przeszczepionych wysp (150-
200 IEQ) nie uzyskano znacznej poprawy metabolizmu glukozy u adnego z
pacjentw, ale po usuniciu urzdzenia od pacjentw, udowodniono, e wyspy zachoway ywotno i funkcj [106]. Kilka lat pniej przeprowadzono pierwsze badania kliniczne, w ktrym czowiekowi podano podskrnie wiskie wyspy trzustkowe zamknite wraz z komrkami Sertoliego w urzdzeniu wykonanym z kolagenu. U adnego z pacjentw (n=12) nie zaobserwowano komplikacji wynikajcych z ksenotransplanatcji. U poowy pacjentw zanotowano obnienie zapotrzebowania na egzogenn insulin po przeszczepie, utrzymujc si do 4 lat, a dwch pacjentw uzyskao insulinoniezaleno na kilka miesicy. Co wicej, kiedy po 3 latach u jednego z pacjentw poddanych terapii skontrolowano przeszczepione urzdzenie, stwierdzono w nim nadal obecno funkcjonalnych komrek [107]. Przeszczep opaszczonych obcogatunkowych wysp testowano jeszcze kilkukrotnie gwnie w badaniach klinicznych przeprowadzonych przez firm Living Cell Technologies Ltd. Spotkay si one jednak z krytyk, szczeglnie z powodu braku wynikw wskazujcych na produkowanie insuliny przez przeszczepione do jamy otrzewnej wyspy trzustkowe wyizolowane od win [103]. Wyniki bada z ostatnich lat, w ktrych przeszczepiano ludzkie wyspy po enkapsulacji nie daj rwnie zbyt zachcajcych wynikw, ale wskazuj na bezpieczestwo tej metody oraz, e opaszczanie ma potencja blokowania niszczenia przeszczepu przez ukad immunologiczny biorcy. W 2006 roku opublikowano rezultaty badania, w ktrym dwch chorych z cukrzyc typu 1 otrzymao wyspy poddane mikroenkapsulacji z zastosowaniem mikrosfer alginianowych. W obu
przypadkach zanotowano obnienie poziomu glukozy na czczo i redukcj zapotrzebowania na egzogenn insulin. aden z pacjentw nie uzyska jednak insulinoniezalenoci [108]. Rezultaty kolejnego badania, w ktrym 4 chorych otrzymao wyspy opaszczone alginianem baru byy jeszcze mniej satysfakcjonujce. U adnego z pacjentw nie zaobserwowano poprawy metabolizmu glukozy, jak rwnie nie wykryto C-peptydu, ktry wskazywaby na podjcie funkcji przez przeszczepione wyspy. Po 16 miesicach wykryto, e wyspy opaszczone alginianem zostay w organizmie pacjentw otoczone tkank wknist i ulegy nekrozie [109]. Nowsze wyniki bada z dootrzewnow transplantacj wysp mikroenkapsulowanych w algninianie sodu potwierdzaj, e metoda ta jest bezpieczna i skutecznie chroni przed rozwojem specyficznych
przeciwcia przeciwko przeszczepowi. U biorcw (n=4) stwierdzono obecno C-peptydu, spadek poziomu glukozy na czczo i HbA1c oraz redukcj zapotrzebowania na egzogenn insulin. Jeden z pacjentw uzyska okresow insulinoniezaleno [110].
Wyniki przeprowadzonych bada daj nadziej, e enkapsulacja moe by potencjaln metod ochrony przeszczepianych wysp przed odrzuceniem bez koniecznoci przyjmowania lekw immunosupresyjnych. Jednake, badania te rni si znacznie, jeeli chodzi o metod enkapsulacji, ilo przeszczepionych
27 Wprowadzenie
wysp oraz stan pacjentw. Dlatego trudno wycigna jednoznaczne wnioski, czy
metoda ta ma rzeczywicie szans zastpi dotychczasowe terapie
immunosupresyjne stosowane w przeszczepie wysp trzustkowych.
1.4.4.2. Immunomodulacja w oparciu o komrki macierzyste
Komrki macierzyste s komrkami o zdolnociach do samoodnawiania si
przez podziay komrkowe i rnicowania si w dojrzae, wyspecjalizowane
komrki [111]. W terapii cukrzycy typu 1 ich potencja moe znale
zastosowanie w strategiach regeneracji komrek . Dodatkowo udowodniono, e
niektre rodzaje komrek macierzystych posiadaj waciwoci
immunomodulacyjne, co moe by wykorzystane z kolei do hamowania
destrukcji komrek i do indukcji rodowiska tolerogennego w przeszczepie
wysp trzustkowych [112114]. Co wicej, komrki macierzyste wspomagaj
rewaskularyzacj i proces angiogenezy, co byoby dodatkowym atutem ich
zastosowania w transplantacji wysp trzustkowych [115]. W terapii cukrzycy
typu 1 prbowano uy autologicznych hematopoetycznych komrek
macierzystych (HSCs Hematopoietic Stem Cells). Celem tej terapii nie bya
regeneracja wysp trzustkowych, lecz odnowienie ukadu immunologicznego
pacjentw. Chorzy zakwalifikowani do leczenia otrzymywali najpierw leki
mobilizujce HSCs ze szpiku do krwi obwodowej. Nastpnie komrki te byy
kolekcjonowane podczas leukaferezy i mroone. W kolejnym etapie pacjenci
otrzymywali chemioterapi niemieloablacyjn, ktrej zadaniem byo zniszczenie
autoreaktywnych limfocytw, po czym podawano im wasne, uprzednio zebrane
i zamroone HSCs w celu regeneracji ukadu immunologicznego [116,117]. Po
takiej terapii okoo 66% pacjentw uzyskao okresow insulinoniezaleno,
ktra trwaa nawet 4 lata. Wyniki rnych orodkw, w ktrych prowadzona jest
ta terapia wskazuj, e przeszczep autologicznych HSCs chroni komrki
trzustki przed reakcj autoimmunologiczn (podwyszony poziom C-peptydu,
nisze wartoci HbA1c i spadek zapotrzebowania na egzogenn insulin w
porwnaniu z wynikami sprzed terapii) [116-118]. Niemniej jednak, metoda ta
nie jest skuteczna u wszystkich chorych, a leki immunosupresyjne stosowane
podczas chemioterapii stanowi realne zagroenie dla ycia pacjenta (1
przypadek miertelny), poza tym mog prowadzi do trwaej niepodnoci.
W transplantacji wysp trzustkowych zastosowano natomiast allogeniczne
HSCs do wzbudzenia chimeryzmu mieszanego, czyli sytuacji, w ktrej w szpiku
kostnym i krwi obwodowej biorcy obecne s zarwno jego wasne komrki, jak
rwnie komrki pochodzce od dawcy [119]. Celem takiego dziaania jest
indukcja tolerancji immunologicznej [120]. Badania kliniczne przeprowadzone
w orodku w Miami, w USA, gdzie biorcy wysp trzustkowych otrzymali
allogeniczne HSCs wraz z terapi immunosupresyjn opart o alemtuzumab nie
potwierdziy jednak skutecznoci tego podejcia. Nie uzyskano bowiem
Karolina Gob 28
chimeryzmu hematopoetycznego, a tym samym nie udao si zapobiec
odrzuceniu przeszczepu [121]. Obecnie prowadzi si szereg bada pre-
klinicznych na modelach zwierzcych w celu wytworzenia chimeryzmu mieszanego, a tym samym stworzenia rodowiska tolerogennego w organizmie
biorcy. Stosowane obecnie strategie, poza komrkami macierzystymi biorcy
wczaj do protokou terapii rwnie leki takie, jak np. przeciwciao monoklonalne anty-CD154 lub anty-CD3/CD8, co ma na celu uzyskanie
wikszego i bardziej i trwaego chimeryzmu mieszanego [122]. Mwic o komrkach macierzytych w terapii cukrzcy naley rwnie
wspomnie o mezenchymalnych komrkach macierzystych (MSCs Mesen-
chymal Stem Cells), ktre posiadaj funkcje pro-angiogenne i
immunomodulacyjne, predysponujce je do zastosowania take w przeszczepie
wysp trzustkowych. MSCs maj zdolno hamowania proliferacji limfocytw T
i B oraz komrek NK; wpywaj na aktywno komrek dendrytycznych oraz
indukuj proliferacj limfocytw T regulatorowych [114, 123]. Dodatkowo,
komrki te wydzielaj cytokiny przeciwzapalne i o dziaaniu
immunosupresyjnym, oraz produkuj czynniki pro-angiogenne [124126]. Maj
one zatem zdolno hamowania reakcji zapalnej, sprzyjaj regeneracji komrek
, inhibicji odpowiedzi immunologicznej zarwno o podou allo-, jak i
autogenicznym, a badania prekliniczne na modelach zwierzcych potwierdziy,
e terapia MSCs poprawia skuteczno przeszczepu wysp trzustkowych [122].
Obecnie prowadzone s badania kliniczne majce na celu potwierdzenie
bezpieczestwa ko-transplantacji wysp trzustkowych z MSCs jako terapii
cukrzycy typu 1 (ClinicalTrials.gov; NCT00646724).
Najnowsze wyniki bada dotyczcych waciwoci immunomodulacyjnych i
regeneracyjnych komrek macierzystych skaniaj ku optymistycznemu
postrzeganiu wykorzystania tego typu terapii w przeszczepie wysp
trzustkowych. Koniecznym jest jednak potwierdzenie bezpieczestwa takiego
leczenia, ewentualnych skutkw ubocznych, okrelenie skutecznej dawki i
opracowanie jednoznacznych, efektywnych protokow izolacji i namnaania
komrek macierzystych.
1.4.4.3. Indukcja tolerancji przez komrki T regulatorowe (Tregs)
Komrki T regulatorowe (Tregs T regulatory cells) stanowi wany
komponent ukadu odpornociowego, ktry nie bierze bezporednio udziau w
ochronie organizmu przed potencjalnie szkodliwymi czynnikami obcymi, ale
ktry chroni przed rozwojem nadmiernej reakcji immunologicznej, mogcej
doprowadzi do zniszczenia wasnych tkanek organizmu [127130]. Dlatego te
ich obecnoc i wzmoona aktywno jest podana w chorobach o podou
autoimmunologicznym, jak rwnie u biorcw narzdw, poniewa hamuj one
zarwno reakcje auto- jak i allogeniczne, indukujc tolerancj wasnych i
obcych tkanek [131].
29 Wprowadzenie
Pierwsze spekulacje na temat istnienia limfocytw supresorowych, ktre
poprzez inhibicj aktywnoci limfocytw efektorowych reguluj odpowied
immunologiczn, pojawiy si we wczesnych latach 70. XX wieku [132-134].
Jednak w zwizku z tym, e nie dao si scharakteryzowa i okreli ich
specyficznych markerw, hipotez o istnieniu limfocytw supresorowych
podawano przez lata w wtpliwo [135]. Dopiero w poowie lat 90. XX wieku
Sakaguchi potwierdzi, e grupa komrek o fenotypie CD4+CD25+ peni wan
rol w immunoregulacji, a ich usunicie prowadzi do rozwoju schorze
autoimmunologicznych [136]. Co wicej, odkrycie markera transkrypcyjnego
FoxP3, specyficznego dla komrek Treg ugruntowao pogld o komrkach T
regulatorowych [137139]. Poziom ekspresji FoxP3 w komrkach Treg koreluje
z ich supresyjn aktywnoci [140], a brak tego markera jest opdowiedzialny za
rozwj wielonarzdowych schorze autoimmunologicznych, co wida wyranie
w przypadku szczepu myszy scurfy oraz u osb ze sprzonym z chromosomem
X zespoem dysregualcji immunologicznej, poliendokrynopatii i enteropatii
(IPEX Immunodysregulation Polyendocrinopathy Enteropathy X-linked
Syndrome) [141143].
Komrki T regulatorowe stanowi kilka procent, zwykle mniej ni 10%
wszystkich limfocytw T CD4+ we krwi obwodowej [144] Komrki Treg s
populacj heterognn. Mona wrd nich wyrni: naturalne komrki Treg
(nTregs) i indukowane (iTregs). Pierwsze z nich s generowane w grasicy
nTregs [145], a drugie w obwodowych narzdach limfatycznych pod wpywem
kontaktu z antygenem prezentowanym przez komrki APC w odpowiednim
rodowisku cytokinowym [146]. Rni si one rwnie pod wzgldem
ekspresji markerw powierzchniowych. nTregs posiadaj ekspresj czynnika
transkrypcyjnego Helios i FoxP3 oraz wysok ekspresj czsteczki CD25,
podczas gdy iTregs s Helios negatywne [131]. Niedawno wykazano rwnie
rnice epigenetyczne w obrbie genu FoxP3 pomidzy dwoma typami komrek
Treg. Okrelono mianowicie, e nTregs wyrnia staa demetylacja
specyficznego regionu w obrbie locus genu foxp3 nazywanego TSDR (Treg-
specific-demethylated region) [147,148]. Obecnie trwaj badania nad
okreleniem dokadnych mechanizmw dziaania supresyjnego obydwu
populacji komrek Treg. Wiadomo, e obie populacje mog hamowa
aktywno efektorowych limfocytw T CD4+, T CD8+, B, komrek NK,
komrek dendrytycznych, makrofagw i neutrofilw [149,150]. Znanych jest
kilka mechanizmw supresorowych komrek Treg i prawdopodobnie s one
konsekwencj heterogennoci komorek, na ktre dziaaj limfocyty Treg, [151].
Mona do nich zaliczy: kompetytywn blokad sygnau kostymulacji przez
wizanie CTLA-4 do CD80 i 86, a nastpnie modulacj funkcji komrek
dendrytycznych poprzez interakcj CTLA-4-CD80/CD86, wydzielanie cytokin
immunosupresyjnych: IL-10, IL-35, syntez TGF- (zarwno w formie
sekrecyjnej, jak i zwizanej z bon komrkow), wydzielanie granzymu i
Karolina Gob 30
perforyny, inhibicj proliferacji limfocytw T poprzez bezporedni transfer
cyklicznego AMP (adenozynomonofosforan) do wntrza aktywowanych
limfocytw T CD4+ i T CD8+, konkurencj o IL-2 (mitogen limfocytw T),
indukcj IDO (indoleamine 2,3-dioxygenase) w komrkach APC, produkcj
biaka LAG3 (lymphocyte-activation gene 3), ktre hamuje proliferacj i
aktywacj limfocytw T w podobny sposb do CTLA-4 [150152].
Rola komrek Treg w tolerancji immunologicznej przeszczepw
allogenicznych staa si przedmiotem wielu bada [153155]. Wyniki uzyskane
na modelach zwierzcych wskazuj, e komrki Treg indukuj allotolerancj i w konsekwencji hamuj odrzucanie przeszczepu [156,157]. Skuteczno i
moliwo szerokiego zastosowania terapii komrkami Treg udowodniono
rwnie na modelach zwierzcych choroby przeszczep przeciw gospodarzowi
GvHD (Graft versus Host Disease) [158162] oraz schorze
autoimmunologicznych [163166]. W cigu ostatnich kilku lat bezpieczestwo
terapii komrkami Treg potwierdzono w kilku badaniach klinicznych, z czego
badania naszego zespou byy pierwszymi badaniami na wiecie, w ktrych
komrki Treg uyto z powodzeniem najpierw w terapii GvHD, a nastpnie w cukrzycy typu 1 [167169].
Badania na modelach zwierzcych udowodniy, e komrki Treg peni
wan rol w patogenezie cukrzycy typu 1. Usunicie komrek Treg u myszy
NOD powoduje gwatowny rozwj cukrzycy o podou autoimmunologicznym.
Z kolei podanie komrek Treg pozwala na zahamowanie postpu choroby [170
172]. Jednak informacje dotyczce roli komrek Treg w patogenezie cukrzycy
typu 1 u ludzi s niejednoznaczne. Cz opublikowanych do tej pory prac
wskazuje, e liczba tych komrek u chorych na cukrzyc typu 1 jest obniona,
cze, e jest podwyszona, a jeszcze inne donosz, e jest taka sama jak u osb
zdrowych, Sprzeczne s rwnie informacje na temat funkcjonalnoci komrek
Treg u tej grupy pacjentw [173]. Nie da si jednak tych wynikw obiektywnie
porwna, gdy rni si one pod wzgldem markerw, ktre brane byy pod
uwag w celu identyfikacji komrek Treg, a przede wszystkim badano chorych
w rnym czasie od pierwszej manifestacji cukrzycy, co niewtpliwie ma wpyw
na stan aktywacji i wyczerpania ukadu immunologicznego oraz samych
komrek Treg. Dodatkowo, wikszo bada dotyczyo limfocytw Treg we
krwi obwodowej, natomiast istotne z punktu widzenia patogenezy cukrzycy
zmiany mog dotyczy komrek Treg obecnych w wzach chonnych trzustki
[173,174]. Istnieje take pogld, e funkcja i liczba komrek Treg nie ulega
zmianie w cukrzycy typu 1, lecz problem stanowi komrki efektorowe, ktre
ulegaj hiperaktywacji i s odporne na mechanizmy supresorowe komrek Treg
[175,176]. Niemniej jednak, pierwsze badanie kliniczne z zastosowaniem
komrek Treg u dzieci ze wieo zdiagnozowan cukrzyc typu 1, ktre
przeprowadzi nasz zesp badawczy wskazuj, e terapia limfocytami Treg
chroni komrki b przed zniszczeniem na przestrzeni lat i znacznie poprawia
31 Wprowadzenie
kontrol glikemii [177,178]. Obecnie trwaj take badania kliniczne, w ktrych
komrki Treg podawane s dorosym (ClinicalTrials.gov; NCT01210664).
Badania prekliniczne i kliniczne dotyczce zastosowania komrek Treg w
przeszczepach allogenicznych i w schorzeniach o podou auto-immunologicznym pozwalaj stwierdzi, e terapia ta moe przynie
szczeglne korzyci w transplantacji wysp trzustkowych. Wynika to z faktu, e
komrki Treg maj zdolno hamowania nie tylko odpowiedzi na allogeniczny
przeszczep, jakim s wyspy pochodzce od dawcy, ale maj te zdolno
hamowania mechanizmw, ktre wczeniej doprowadziy do zniszczenia
wasnych komrek b pacjenta. Pierwsze badania prekliniczne na
humanizowanych modelach mysich przeszczepu wysp trzustkowych
udowodniy, e ludzkie komrki Treg mog by skutecznym narzdziem w
indukcji tolerancji immunologicznej i przyczyni si do eliminacji lub
zmniejszenia dawki stosowanych do tej pory lekw immunosupresyjnych, ktre,
jak to zostao omwione powyej, powoduj szereg skutkw ubocznych
[179,180]. Majc na wzgldzie obecny stan wiedzy i prace przygotowawcze
wielu zespow, naley si spodziewa, e pierwsze badania kliniczne, w
ktrych komrki Treg zostan podane pacjentom po przeszczepie wysp
trzustkowych zostan wkrtce zainicjowane. Aby zwikszy szans powodzenia
takiej terapii, obie metody, zarwno izolacji i transplantacji wysp trzustkowych,
jak i ekspansji komorek Treg wymagaj optymalizacji do warunkw klinicznych
i okrelenia czynnikw, ktre mog poprawi ich skuteczno.
Karolina Gob 32
2. CELE PRACY
Celem pracy byo opracowanie i optymalizacja nowej terapii
komrkowej w cukrzycy typu 1 w oparciu o przeszczep wysp trzustkowych z zastosowaniem komrek T regulatorowych do indukcji tolerancji immunologicznej.
Zadanie to realizowano poprzez:
optymalizacj wyboru dawcy trzustki w celu poprawy wydajnoci izolacji wysp trzustkowych - okrelenie nowego czynnika selekcji dawcy
modyfikacj protokou ekspansji komrek Treg zgodn z warunkami dobrej praktyki laboratoryjnej (Good Laboratory Practice; GLP) - dobr
poywki hodowlanej
dobr metody krioprezerwacji komrek Treg, ktra mogaby zosta wykorzystana do celw klinicznych
analiz wpywu wybranych lekw immunosupresyjnych stosowanych w przeszczepie wysp trzustkowych na komrki Treg
opracowanie metody lokalnej immunoprotekcji wysp trzustkowych z wykorzystaniem komrek Treg
Najwaniejsze spostrzeenia z prezentowanych prac 33
3. NAJWANIEJSZE SPOSTRZEENIA Z PREZENTOWANYCH PRAC WCHODZCYCH W SKAD ROZPRAWY DOKTORSKIEJ
3.1. Wzrost dawcy trzustki jako dodatkowy czynnik przy wyborze
odpowiedniego dawcy, wpywajacy na powodzenie izolacji wysp trzustkowych
Wang LJ., Cochet O., Wang XJ., Krzystyniak A., Misawa R., Golab K., Tibudan M.,
Grose R., Savari O., Millis JM., Witkowski P. Donor height in combination with islet
donor score improves pancreas donor selection for pancreatic islet isolation and
transplantation. Transplant Proc. 2014, 46, 6, 1972-1974.
Na powodzenie izolacji i transplantacji wysp trzustkowych wpywa szereg
czynnikw i kady etap, zarwno izolacji, jak i transplantacji ma tu znaczenie.
Ju sam wybr odpowiedniego organu, z ktrego zostan wyizolowane wyspy jest niezmiernie wany. Pozwala bowiem unikn nieskutecznych izolacji,
zakoczonych uzyskaniem niewystarczajcej iloci wysp dobrej jakoci, nie
pozwalajcych na transplantacj, a tym samym zaoszczdzi nakady finansowe,
materiay i czas.
Od pocztku ery izolacji ludzkich wysp trzustkowych prbowano okreli
czynniki wpywajce na jej powodzenie, a zwaszcza parametry, ktre
pozwoliyby oceni czy uycie danego organu moe da podan ilo wysp
dobrej jakoci [24,30,181185]. W 2005 roku orodek w Edmonton
zaproponowa kompleksowy system punktowej oceny potencjalnego dawcy
IDS (Islet Donor Score), majcy na celu popraw selekcji organw, ktre mog
zapewni izolacj trzustkow zakoczon sukcesem [27]. System ten bierze pod
uwag wiele czynnikw i przyznaje punkty w zalenoci od wagi znaczenia
danego czynnika. S to midzy innymi: wiek, BMI, wyniki bada
morfologicznych krwi, historia leczenia, przyczyna mierci dawcy, metoda
pobrania organu oraz czas zimnego niedokrwienia [27].
Nasz zesp badawczy zaproponowa dodanie wzrostu dawcy jako
niezalenego czynnika, ktry wraz z analiz IDS pozwoli na wybr
odpowiedniego dawcy trzustki, aby zapewni skuteczn izolacj wysp.
Przeanalizowalismy 22 izolacje wysp trzustkowych dokonane w naszym
orodku w latach 2011-2012. Parametry dawcy zostay zebrane na podstawie
danych umieszczonych w sieci UNOS (United Network for Organ Sharing).
Wyniki IDS zostay zanalizowane wedug tabeli udostpnionej przez Zesp
Izolacji Wysp Trzustkowych z Uniwersytetu Alberta, Edmonton, Kanada.
Karolina Gob 34
Tabela 1. Punktowa ocena dawcy trzustki IDS (Islet Donor Score) na podstawie
systemu opracowanego przez zesp z Uniwersytetu Alberta, Edmonton, Kanada [27].
PARAMETR PUNKTY
(max) PUNKTY W ZALENOCI OD PARAMETRU
Wiek (lata) 20 65
15 15 15 20 10 5
BMI (kg/m2) 15
35
5 10 12 15 12
Czas zimnego
niedokrwienia -
CIT (godziny)
15
< 3 3 - 8 8.1 - 12 > 12
12.5 15 10 5
Wyniki badania
krwi* 5
w normie
markery specyficzne
poza
norm**
inne markery
poza
norm***
markery
specyficzne
i inne markery
poza norm
5 2 4 0
Historia leczenia 5 brak
zatrzymanie
akcji serca
naduywanie
alkoholu
nadcinienie
ttnicze
5 -15 3 -10
Pobyt w szpitalu
(dni) 5
< 2 2-4 5 - 7 >8 dni
5 3 2 0
Leki
wazopresyjne
(liczba uytych) 5
0 1 2 3
5 3 0 -5
Przyczyna zgonu 20
anoksja
(niedotlenienie krwi)
obraenia
ciaa z
urazami jamy
brzusznej
obraenia
ciaa bez
urazw jamy
brzusznej
zdarzenie
naczyniowo-mzgowe
0 8 10 20
Zesp pobierajcy organ
10
wasny inny ni
wasny
10 5
Suma (OCENA) 100
* wartoci prawidowe wedug lokalnych standardw ** markery specyficzne to: poziom glukozy, amylazy, lipazy. Wartoci poza norm w
stanie Illinois, USA: glukoza >200 mg/dl (lub >11,1 mmol/l); amylaza >200 U/l; lipaza
>190 U/l
*** inne markery to: AST (aminotransferaza asparaginowa), ALT (aminotransferaza
alaninowa), kreatynina, BUN (azot mocznika we krwi Blood Urea Nitrogen). Wartoci
Najwaniejsze spostrzeenia z prezentowanych prac
35
poza norm w stanie Illinois, USA: AST >40 IU/l; ALT >50 IU/l; kreatynina
>1.38 mg/dl; BUN >24 mg/l.
Na podstawie 22 przeprowadzonych przez nas izolacji zestawilimy
informacje dotyczce iloci uzyskanych wysp wyraone przez IEQ z wag trzustki, faktem czy wyspy zostay zakwalifikowane do przeszczepu w oparciu o IDS, jak rwnie wczylimy do analizy wzrost kadego dawcy trzustki. Do okrelenia zalenoci pomidzy wymienionymi danymi w analizie statystycznej posuono si wspczynnikiem korelacji Pearsona.
Podczas wszystkich izolacji wysp trzustkowych, do ktrych uyto trzustek od dawcw z IDS wikszym ni 80 uzyskano wicej ni 300 000 IEQ. 80% (4/5) wysp trzustkowych wyizolowanych od tych dawcw zostao przeszczepionych. Wszyscy dawcy w tej grupie charakteryzowali si wzrostem 179 3 cm. Gdy IDS byo mniejsze ni 80, tylko w 17% przypadkw (3/17) udao si uzyska wicej ni 300 000 IEQ. Wszystkie trzy izolacje zakoczone zostay transplantacj. W tych trzech przypadkach, pomimo IDS 175 cm. Analiza statystyczna zebranych przez nas danych pozwolia stwierdzi, ze wzrost dawcy jest niezalenym parametrem, ktry koreluje z wag trzustki, IDS oraz uzyskan iloci wysp wyraon w IEQ przed- oraz po oczyszczeniu wysp na gradiencie ciagym.
Tabela 2. Analiza korelacji pomidzy wzrostem dawcy a: IEQ przed- (Pre-IEQ) i po oczyszczaniu wysp w gradiencie (Post-IEQ), IDS i wag trzustki (n=22).
Wzrost
dawcy
Pre-IEQ Post-IEQ IDS Waga trzustki
r 0,5486 0,5534 0,5919 0,4882
P 0,0082 0,0093 0,0037 0,02121
Skrty: IEQ islet equivalent, ekwiwalent wysp trzustkowych; IDS Islet Donor Score, punktowa ocena dawcy trzustki. rdo: 1) Wang LJ., Cochet O., Wang XJ., Krzystyniak A., Misawa R., Golab K., Tibudan M.,
Grose R., Savari O., Millis JM., Witkowski P. Donor height in combination with islet
donor score improves pancreas donor selection for pancreatic islet isolation and
transplantation. Transplant Proc. 2014, 46, 6, 1972-1974.
W parametrach branych pod uwag w IDS w przypadku BMI dawcy mona przyzna 15 punktw ze 100, gdy jest ono w zakresie 30,1-35 [27]. Jednak, na podstawie BMI nie da si jednoznacznie przewidzie wagi trzustki i iloci wysp trzustkowych, ktre bdzie mona z niej wyizolowa. Trzustka u dawcw z BMI w takim zakresie moe bowiem zawiera tkank tluszczow, nie zawierajc wikszej iloci wysp. Aby zwikszy przewidywalno wagi trzustki od danego dawcy, a tym samym ilo wysp trzustkowych w organie zaproponowalimy dodanie wzrostu jako kolejnego parametru przy ocenie potencjalnych dawcw trzustki. System IDS pozwala stwierdzi, e przy punktacji wikszej ni 80
Karolina Gob 36
szanse na transplantacj wysp trzustkowych po izolacji wynosz 50% [27]. W
naszym orodku otrzymywalimy podobne wyniki, gdy sam IDS by brany pod
uwag. Jednak, w niniejszej pracy udowodnilimy, e wzrost dawcy jako
niezaleny parametr jest skorelowany z wag trzustki oraz iloci ekwiwalentw
wysp trzustkowych uzyskanych podczas izolacji. Co wicej, gdy brany jest pod
uwag wzrost dawcy (179 3 cm) wraz z IDS, czstotliwo transplantacji po
izolacji wysp trzustkowych wzrasta do 80%. Nasza anzaliza wskazuje, e wzrost
dawcy powinien by brany pod uwag podczas oceny dawcy trzustki wedug
IDS, aby zapewni optymaln selekcj organu, ktra zapewni izolacj wysp
trzustkowych zakoczon transplantacj.
3.2. Komrki T regulatorowe jak narzdzie terapeutyczne do indukcji
tolerancji immunologicznej w przeszczepie wysp trzustkowych
Krzystyniak A., Gob K., Witkowski P., Trzonkowski P. Islet cell transplant and the
incorporation of Tregs. Curr Opin Organ Transplant. 2014, 19, 6, 610-615.
Transplantacja wysp trzustkowych moe by skuteczn metod terapii
cukrzycy typu 1, szczeglnie u pacjentw, u ktrych cukrzycy towarzysz
napady niewiadomej hipoglikemii. Pomimo ulepsze w samej metodzie izolacji
wysp oraz przeomu jaki nastapi po opublikowaniu protokou Edmonton, ktry
zakada wyeliminowanie diabetogennych steroidw jako lekw immuno-
supresyjnych przy transplantacji wysp trzustkowych [53], wci nie jest to
metoda w peni skuteczna, a gwny problem stanowi konieczno stosowania
doywotniej immunosupresji, czsto zwizanej, jak to opisano powyej, z
wieloma skutkami ubocznymi.
W naszej pracy sprbowalimy okreli potencja i szanse terapii
komrkami Treg do zapobiegania odrzucania przeszczepu wysp trzustkowych
na podstawie wynikw dotychczas przeprowadzonych bada preklinicznych i
wiedzy dotyczcej komrek Treg. Zidentyfikowalimy take problemy, ktre
mog by zwizane z tak terapi i podjelimy prb przedstawienia moliwych
rozwiza.
Jednym z problemw do rozwaenia podczas transplantacji wysp
trzustkowych z jednoczesn infuzj komrek Treg jest miejsce podania zarwno
wysp, jak i komrek Treg. Podane doylnie limfocyty Treg mog mie
ograniczon zdolno migracji do miejsca przeszczepu, a nastpnie do wzw
chonnych, co z kolei, jak udowodniono, jest warunkiem koniecznym, aby
mogy one skutecznie hamowa odpowied komrek T efektorowych [186].
Jeeli chodzi o wyspy trzustkowe, to w miejscach przeszczepu, gdzie dochodzi
do bezporedniego kontaktu wysp z krwi, naraone s one na atak ze strony
odpowiedzi nieswoistej i ukadu dopeniacza [187], z czego ostatni nie jest w
peni hamowany przez komrki Treg. Rozwizaniem moe by tu jednoczesny
przeszczep wysp trzustkowych i komrek Treg w miejsca, gdzie nie ma
bezporedniego kontaktu z krwi obwodow, takie jak: szpik kostny, minie
Najwaniejsze spostrzeenia z prezentowanych prac
37
szkieletowe, trzustka, torebka nerki. W przypadku jednoczesnego podania
komrek Treg i wysp trzustkowych w wyej wymienione miejsca problem
stanowi moe akumulacja insuliny, ktra wpywa negatywnie na sekrecj IL-10
przez komrki Treg [188], co jest z kolei jednym z wanych mechanizmw
supresorowych tych komrek. Potencjalnie, podawanie egzogennej insuliny
pacjentowi w pierwszych dniach po transplantacji, mogoby zahamowa
produkcj insuliny przez przeszczepione komrki , a komrki Treg do czasu
odstawienie insulinoterapii mogyby znajdowa si ju w wzach chonnych i
rozpocz dziaanie supresorowe. Innym rozwizaniem zapewniajcym
podan migracj limfocytw Treg, moe by stymulacja tej migracji przez
zastosowanie chemokin, np. CCL22 (Chemokine (C-C motif) Ligand 22;
chemokina 22 typu C-C). Badania na transgenicznych modelach mysich
charakteryzujcych si ekspresj genu CCL22 w wyspach trzustkowych
wykazay, e moe to by skuteczna metoda hamujca rozwj cukrzycy [189]
oraz zapewniajca ochron przeszczepionych wysp [190]. Klinicznie, wyspy
trzustkowe mogyby by opaszczone polimerami zawierajcymi chemokiny lub
przeszczepiane jednoczenie z mikrosferami, ktre maj zdolno uwalniania
chemokin. Metoda enkapsulacji wysp trzustkowych z zastosowaniem CCL22
lub/i CXCL12 (C-X-C Chemokine Ligand 22; chemokina 22 typu C-X-C) jest
obecnie optymalizowana przez naszy zesp badawczy. Indukcja migracji
komrek Treg do miejsca przeszczepu mogaby rwnie pozwoli na
ograniczenie liczby komrek Treg potrzebnych do skutecznego hamowania
odrzucania przeszczepu, gdy daaby moliwo, aby wicej limfocytw Treg
podjeo funkcj supresorow po migracji do przeszczepu, a nastpnie do
lokalnych wzw chonnych.
Wiele nowych publikacji podaje, e antygenowo specyficzne limfocyty Treg
s skuteczniejsze w hamowaniu reakcji immunologicznej ni komrki
poliklonalne [191193]. Zastosowanie antygenowo-specyficznych limfocytw
Treg mogoby rwnie zminimalizowa ilo tych komrek potrzebnych do
indukcji tolerancji immunologicznej. Jednake, w wypadku przeszczepu wysp
trzustkowych, koniecznym byoby wygenerowanie limfocytw Treg
specyficznych pod wzgldem antygenw dawcy, jak i specyficznych antygenw
komrek b, ktre s rozpoznawane przez ukad immunologiczny chorego w
procesie patogenezy cukrzycy typu 1.
Innym problemem moe by