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Application note IN Cell Analyzer 2200

제목제목제목제목 : Microslide fluorescence imaging – stitching & analysis

[Summary]

Microslide 상상상상에에에에 고정고정고정고정시킨시킨시킨시킨 fluorescence labeled mouse kidney와와와와 mouse brain을을을을 IN Cell Analyzer

system의의의의 hardware autofocusing technique과과과과 분석분석분석분석 소프트웨어의소프트웨어의소프트웨어의소프트웨어의 stitching 기법을기법을기법을기법을 사용하여사용하여사용하여사용하여

편리편리편리편리하게하게하게하게 1개개개개의의의의 전체전체전체전체 imaging을을을을 만만만만들어서들어서들어서들어서 분석할분석할분석할분석할 수수수수 있음을있음을있음을있음을 확인하였다확인하였다확인하였다확인하였다 (Fig 1).

Fig 1) Microslide module에에에에 준비된준비된준비된준비된 microslide상의상의상의상의 mouse sample의의의의 Imaging Processing 과정과정과정과정

[ Materials & Results]

Product used

IN Cell Analyzer 2200 Imaging system (2-D Deconvolution software) 29-0278-86

IN Cell Analyzer 2000 Imaging system (2-D Deconvolution software)

IN Cell Investigator software 28-4089-71

IN Cell Analyzer Slide Imaging Module 28-9544-75

20x 0.45NA objective standard

10x 0.45NA objective standard

Stitching &

Fused image Image taking

Sample (red)

on Microslide FOVs selection

분석

Sample slide used

• Microslide 1 : Mouse Kidney section ( with Alexa Fluor™ 488 WGA, Alexa Fluor 568 phalloidin & DAPI )

- FluoCells™ prepared slide #3 ( Invitrogen F24630 )

• Microslide 2 : Mouse brain section ( with FITC )

[ Methods & Result ]

Mouse kidney section slide ( IN Cell Analyzer 2200 )

1. IN Cell Analyzer 2200 system 의의의의 전원전원전원전원을을을을 켜고켜고켜고켜고, Microslide imaging module 상에상에상에상에 sample이이이이

고정된고정된고정된고정된 Microslide를를를를 올려올려올려올려 놓놓놓놓았았았았다다다다 (Fig 2).

Fig 2) Microslide Imaging module & Sample Microslide with cover slip

2. Protocol Designer를를를를 이용하여이용하여이용하여이용하여 new protocol을을을을 만들었만들었만들었만들었다다다다.

3. Protocol Designer에서에서에서에서 micro slide mode를를를를 선택선택선택선택했다했다했다했다 (Fig 3).

Fig3) Preveiw (3x3 binning) mode에서에서에서에서 Prescan 하여하여하여하여 tissue 위치위치위치위치 확인확인확인확인.

4. 샘플에샘플에샘플에샘플에 사용한사용한사용한사용한 fluorescence dye에에에에 적합한적합한적합한적합한 polychroic과과과과 20x 0.45NA objective를를를를 선택선택선택선택 했다했다했다했다.

5. 사용하기사용하기사용하기사용하기 원하는원하는원하는원하는 Objective lens와와와와 Channel setting 을을을을 통해통해통해통해 적합한적합한적합한적합한 view size와와와와 fluorescent

dye를를를를 선택선택선택선택하고하고하고하고, 2D Deconvolution mode를를를를 선택선택선택선택 했다했다했다했다 ( Fig 4).

Fig 4) Excitation과과과과 Emission dye를를를를 선택한선택한선택한선택한 후후후후, Image mode에서에서에서에서 2-D Deconvolution 을을을을

선택선택선택선택. Excitation & Emission filter 는는는는 DAPI, FITC & Texas Red 세가지를세가지를세가지를세가지를 선택선택선택선택.

6. Exposure time과과과과 Hardware autofocusing을을을을 통해서통해서통해서통해서 Imaging을을을을 위한위한위한위한 focusing을을을을 선택선택선택선택했다했다했다했다.

7. Preview mode (3x3 binning)를를를를 통해서통해서통해서통해서 specimen의의의의 Image를를를를 확인한확인한확인한확인한 후후후후, 필요한필요한필요한필요한 수수수수 만큼의만큼의만큼의만큼의

Fields를를를를 선택선택선택선택한한한한 후후후후, 15% overlap 시시시시켰다켰다켰다켰다.

8. Protocol Designer에서에서에서에서 protocol을을을을 완성한완성한완성한완성한 뒤뒤뒤뒤, Run을을을을 눌러서눌러서눌러서눌러서 image를를를를 찍찍찍찍었다었다었다었다 (Fig 5).

Fig 5) IN Cell Analyzer 2200시스템시스템시스템시스템에서에서에서에서 sample imaging이이이이 찍히고찍히고찍히고찍히고 있는있는있는있는 화면화면화면화면.

9. 전체전체전체전체 sample의의의의 FOV (Field of view)가가가가 찍힌찍힌찍힌찍힌 image를를를를 확인확인확인확인했다했다했다했다 (Fig 6).

Fig 6) Mouse kidney section 전체전체전체전체 image를를를를 97개의개의개의개의 FOVs 를를를를 통해통해통해통해 생성생성생성생성.

10. Investigator Developer software의의의의 protocol manager 활성화활성화활성화활성화 시킨시킨시킨시킨 후후후후, image stitching

mode를를를를 선택선택선택선택했다했다했다했다 (Fig 7).

Fig 7) 선택된선택된선택된선택된 Image stitching.

11. 전체전체전체전체 FOVs image를를를를 불러온불러온불러온불러온 뒤뒤뒤뒤, 1 개의개의개의개의 image으로으로으로으로 통합통합통합통합하고자하고자하고자하고자 하는하는하는하는 FOV (여기서는여기서는여기서는여기서는 9개개개개)를를를를

선택한선택한선택한선택한 후후후후 , stitching을을을을 했다했다했다했다 (Fig 8).

Fig 8) 전체전체전체전체 FOVs에서에서에서에서 선택된선택된선택된선택된 9개의개의개의개의 FOVs.

12. Stitching된된된된 image를를를를 fused image로로로로 선택하여선택하여선택하여선택하여 개선된개선된개선된개선된 선명한선명한선명한선명한 imaging 을을을을 만들었다만들었다만들었다만들었다 (Fig 9).

Fig 9) Stitched image (Alexa Fluor™ 488 WGA, Alexa Fluor 568 phalloidin & DAPI ).

Mouse brain section slide ( IN Cell Analyzer 2000 )

FITC labeled Mouse brain section sample을을을을 microslide에에에에 고정고정고정고정 했다했다했다했다. 앞서앞서앞서앞서 설명한설명한설명한설명한 방법으로방법으로방법으로방법으로

10x 0.45NA objective 사용하여사용하여사용하여사용하여 Brain내의내의내의내의 FITC labeled sample imaging을을을을 찍었다찍었다찍었다찍었다.

Investigator Developer software를를를를 통해서통해서통해서통해서stitching하고자하고자하고자하고자 한한한한 8개의개의개의개의 FOVs를를를를 합쳐서합쳐서합쳐서합쳐서 1개의개의개의개의

Image를를를를 만들었다만들었다만들었다만들었다. 분석을분석을분석을분석을 위해서위해서위해서위해서 Investigator software를를를를 사용하여사용하여사용하여사용하여 FITC signal 중중중중 saturated

intensity를를를를 보이는보이는보이는보이는 부분만을부분만을부분만을부분만을 선별해선별해선별해선별해 분석하여분석하여분석하여분석하여 counting과과과과 area 값을값을값을값을 확인하였다확인하였다확인하였다확인하였다. 이렇게이렇게이렇게이렇게

stitching을을을을 통해통해통해통해 만든만든만든만든 whole image의의의의 FITC 염샘된염샘된염샘된염샘된 area에서에서에서에서 high intensity를를를를 보이는보이는보이는보이는 area의의의의

숫자숫자숫자숫자는는는는 ‘45’ 개개개개 였고였고였고였고, Area 값값값값은은은은 ‘ 342.6’ 의의의의 결과를결과를결과를결과를 확인했는데확인했는데확인했는데확인했는데, 이것은이것은이것은이것은 대조군대조군대조군대조군과과과과 비교해비교해비교해비교해 보았을보았을보았을보았을 때때때때

유의한유의한유의한유의한 수치였다수치였다수치였다수치였다 (Fig 10). Fig 10) FITC labeled Mouse Brain section의의의의 stitching image를를를를

만든만든만든만든 뒤뒤뒤뒤, Investigator software 로로로로 counting하고하고하고하고 area 분석한분석한분석한분석한 것것것것.

[ Conclusions & Discussion ]

IN Cell Analyzer 2000 & 2200 systems을을을을 사용하여사용하여사용하여사용하여 microslide 상에서상에서상에서상에서 fluorescence labeled

mouse tissue image를를를를 만든만든만든만든 뒤뒤뒤뒤, Investigator software의의의의 stitching tool을을을을 이용하여이용하여이용하여이용하여 여러여러여러여러 개의개의개의개의

field of view에서에서에서에서 1개의개의개의개의 fused image를를를를 만들었다만들었다만들었다만들었다. 이를이를이를이를 통해서통해서통해서통해서 우리는우리는우리는우리는 HCS장비인장비인장비인장비인 IN Cell

Analyzer system은은은은 well plate에서에서에서에서 뿐만뿐만뿐만뿐만 아니라아니라아니라아니라 Microslide에서도에서도에서도에서도 훌륭하게훌륭하게훌륭하게훌륭하게 Image를를를를 만들만들만들만들 수수수수

있었있었있었있었다다다다. Investigator Developer 전용전용전용전용 분석분석분석분석 소프트웨어를소프트웨어를소프트웨어를소프트웨어를 이용한이용한이용한이용한 stitching과과과과 analysis는는는는 IN Cell

Analyzer 장비가장비가장비가장비가 Microslide에에에에 고정된고정된고정된고정된 tissue 시료에서도시료에서도시료에서도시료에서도 선명한선명한선명한선명한 Imaging과과과과 정확한정확한정확한정확한 분석분석분석분석

데이터를데이터를데이터를데이터를 제공제공제공제공 주는주는주는주는 것을것을것을것을 확인하였다확인하였다확인하였다확인하였다.

200W Metal halide lamp를를를를 사용하던사용하던사용하던사용하던 IN Cell Analyzer 2000과과과과 비교하여비교하여비교하여비교하여 2013년에년에년에년에 새로새로새로새로 선보인선보인선보인선보인

IN Cell Analyzer 2200은은은은 high performance scientific grade CMOS camera (2506 x 2260, 5.5

Megapixel)와와와와 기존의기존의기존의기존의 lamp보다보다보다보다 훨씬훨씬훨씬훨씬 밝은밝은밝은밝은 solid state illuminator (SSI) light source를를를를 내장하고내장하고내장하고내장하고

있다있다있다있다. 이를이를이를이를 통해통해통해통해, IN Cell Analyzer 2000에서에서에서에서 보이보이보이보이던던던던 현상인현상인현상인현상인 FOV의의의의 중심은중심은중심은중심은 밝고밝고밝고밝고, 가장자리는가장자리는가장자리는가장자리는

어어어어두운두운두운두운 문제를문제를문제를문제를 극복극복극복극복 하였고하였고하였고하였고, 전용전용전용전용 분석분석분석분석 소프트웨어로소프트웨어로소프트웨어로소프트웨어로 만든만든만든만든 1개의개의개의개의 stitched image에서에서에서에서 보이던보이던보이던보이던

어두운어두운어두운어두운 선선선선 (Fig 11a) 이이이이 IN Cell Analyzer 2200 (Fig 11b) 에서는에서는에서는에서는 보이지보이지보이지보이지 않게않게않게않게 되어되어되어되어 imaging quality와와와와

analysis의의의의 정확성을정확성을정확성을정확성을 높였다높였다높였다높였다.

IN Cell Analyzer system에서에서에서에서 지원하는지원하는지원하는지원하는 Microslide imaging technology는는는는 pathology slide, tissue

microarray, bacterial colony, small whole organism 분석등의분석등의분석등의분석등의 application에에에에 활용할활용할활용할활용할 수수수수 있다있다있다있다.

Fig 11) IN Cell Analyzer 2000과과과과 2200의의의의 Mouse kidney section 비교비교비교비교 Imaging.

a) IN Cell Analyzer 2000 b) IN Cell Analyzer 2200 ( New system )

( 20x objective, 9 FOVs ) ( 20x objective, 9 FOVs )