1

2

Gene Engineering การสร�าง gene ใหม่ โดยตั�ดตัอระหว่าง DNA จากแหล่งที่��ตัางก�น ได� DNA โม่เล่ก�ล่ใหม่ เป็�นโม่เล่ก�ล่ผสม่ เร�ยก

ว่า Recombinant DNA ว่ ธี�การที่"าหร#อ methodology เร�ยกว่า

Recombinant DNA technology หร#อ

Genetic engineering หร#อGene cloning

3

I. หล่�กการ Recombinant DNA (Gene cloning)

II. สว่นป็ระกอบในการที่"า gene cloning III. การป็ระย�กตั&ใช้� Gene cloning

4

I. หล่�กการที่"า Recombinant DNA

1. แยก DNA ของพาหะ แล่ะ DNA ที่��ตั�องการที่"า cloning2. ตั�ด DNA ของที่�*ง 2 แหล่งด�ว่ย Restriction endonuclease3. ผสม่ DNA ที่�*ง 2 แหล่ง ก�บ DNA ligase

ภายใตั� เง#�อนใขให� DNAs ตัอก�น -- > ได�

Recombinant DNA หร#อ Chimeric DNA

5

การสร�าง Recombinant DNA

6

II. สว่นป็ระกอบของการที่"า Gene Cloning

1.Gene ที่��ตั�องการศึ.กษา เร�ยกว่า foreign DNA

2. DNA พาหะ เร�ยว่า Vector DNA 3. Restriction endonuclease4. DNA ligase ตัอระหว่าง 2 nucleotides5. Host cells ส"าหร�บ recombinant DNA

เพ#�อเพ �ม่จ"านว่นในข�*นตั�นของกระบว่นการ ที่��พ�ฒนาใช้�ได�แล่�ว่ม่� bacteria บางช้น ด แล่ะyeast

7

ข�*นตัอนล่ะเอ�ยดในการที่"า Gene cloning

1. เล่#อก DNA โม่เล่ก�ล่ที่��ตั�องการ clone เร�ยกว่า Foreign DNA แล่ะเล่#อก

DNA โม่เล่ก�ล่ที่��น"าหน�าที่��เป็�นพาหะ เร�ยก ว่า Vector DNA

ตั�ด foreign DNA แล่ะ ตั�ด vector DNA ด�ว่ย enzyme ช้น ดเด�ยว่ก�นEnzyme ที่��ใช้�เร�ยกว่า Restriction enzyme (แยกคนล่ะหล่อด)

8

2. เล่#อกที่อน (fragment) ของ cut foreign DNA ขนาดพอเหม่าะที่��จะ clone

โดย แยก DNA ในแผนว่� �น ใน สนาม่ไฟฟ3า เร�ยกว่ ธี�น�*

ว่า Electrophoresis ซึ่.�ง DNA จะถู6กออก จากก�นตัาม่ขนาดคว่าม่ยาว่ ได�ป็รากฏเป็�นแถูบ

(bands) ตัาง ๆ ก�น ตั�ดแล่ะแยกแถูบที่��ตั�องการออกม่าสก�ดแยกDNA ที่อน (fragment) ที่��ตั�องการ

9

DNA gelelectrophoresi

s ส"าหร�บแยกช้ *น

สว่น DNA

10

3. Insert DNA fragment เข�าไป็ในโม่เล่ก�ล่ของ cut vector DNA ด�ว่ย enzyme Ligase จะได� DNA ผสม่โม่เล่ก�ล่ใหม่ เร�ยกว่าChimeric DNA หร#อ RRRRRRRRRRR RRR 4. น"า Recombinant DNA เข�าไป็ใน host cells ของ cloning vector โดยว่ ธี� Transformation หร#อ ว่ ธี�อ#�น ๆhost cells โดยที่��ว่ไป็ใช้� E. coli แล่ะ yeast 5. Recombinant DNA ภายใน host จะแบง

ตั�ว่เพ �ม่จ"านว่น เร�ยกว่า Amplification แล่ะ ถูายที่อดไป็พร�อม่ก�บการแบงตั�ว่เพ �ม่จ"านว่นของ

host ที่"าให�ได� identical copies หร#อclones ของ recombinant DNA จ"านว่นม่าก

11

หล่�กการพ#*น ฐานของ

Gene cloning

Clone หม่าย ถู.ง ป็ระช้ากร

(copy) ที่��เหม่#อนก�นของ

ส �งม่�ช้�ว่ ตัหร#อโม่เล่ก�ล่

12

6. ที่"าการตัรว่จเล่#อกหา (screening) host cells ม่� recombinant DNA

13

Cloning Vectors

1 . Plasmid 2.Bacteriophage

3. Cosmid 4. PhageRRR 5. Artificial

RRRRR RRRR R

14

1. Plasmid vectors

Plasmids เป็�น extrachromosome ในmicroorganisms โดยเฉพาะ

bacteria เป็�น double-stranded circular โม่เล่ก�ล่ ขนาด ~ 1 kb (1 kb = 1000 bp) ถู.ง 200 kb

ม่� antibiotic-resistant genes ที่��สาม่ารถูใช้� เป็�น markers

ส"าหร�บค�ดเล่#อก clones ที่�� positive pBR322 เป็�น plasmid ตั�ว่แรกที่��ใช้�ใน cloning

15

11. Plasmid322pBR

ขนาด 4.3 Kb ม่� Ampicillin resisteant gene Tetracyclin resistant gene ม่� restriction sites ม่ากแล่ะ งายตัอการใช้�ที่"า cloning เช้น EcoRI, PstI, BamHI ม่� Origin of replication เป็�น cloning vector ใน

prokaryote น"าเข�า bacteria โดย

Transformation

16

Bacteria l cloning

โดยใช้� plasmid pBR322

17

ด�ดแป็ล่งจาก 2 um plasmid (พ เศึษ ) ของ yeast

ขนาด 6 kb ม่� resistant gene ตัอ inhibitors

เช้น copper แล่ะ methotrexate marker ค#อ leu2 gene ใช้�เป็�น cloning vector ในeukaryote

Transform yeast

RRRRR RRRRRRRR RRRRRRRR 12

RRRR/

18

Yeastcl oni

ng โดยใช้�

plasmid ที่��ม่�LEU2 gene

เป็�นmarker

19

Ti p lasmid หร#อ T-DNA ในAgrobacterium tumefaciens ในด น

integrate เข�า plant chromosomal DNA

ที่"าให�เก ดเน#*องอกในพ#ช้ (callus) หร#อcancer growth หร#อ crown gall ในพ#ช้

13. Ti plasmid

20

Gene cloning โดยใช้�Ti plasmid

เพ#�อให� T-DNA (tumor DNA)

ใน bacteria infect (แที่รก )

เข�าchromosome ของพ#ช้ --> crown gall --> ช้�กน"าให�เจร ญเป็�นตั�นพ#ช้

21

2. Bacteriophage vectors

- Double stranded virus ที่��บางระยะของว่งจร ช้�ว่ ตัอย6ในร6ป็ Linear duplex

สว่นม่ากใช้� Bacteriophage Lambda ( ) ขนาด~ 50 kb

ม่� genes ~ 50 % อย6 2 ข�างของ linear duplex ที่��จ"าเป็�นตัอ growth

บร เว่ณกล่างไม่จ"าเป็�นตัอ growth สาม่ารถูตั�ดออกได� package DNA ให�เป็�น circular form ได� 78-105 %

22

การใช้� phage เป็�นcloning vector

สว่นกล่างเป็�นสว่นที่��ไม่จ"าเป็�นในการด"ารงช้�พ

ของ phage จ.งสาม่ารถูเอา

foreign DNA ใสเข�าไป็แที่นได�

cos

cos

23

ใน Linear duplex ที่��บร เว่ณป็ล่ายส�ดที่�*ง 2 ข�างของเส�นเป็�นช้ว่ง Single strand ขนาด

12 nucleotides เร�ยกว่า Cohesive ends หร#อ COS sites

Cos sites ที่"า complementary ตัอก�น ให� ได� circular duplex DNA กอน pack เข�า

capsule กล่ายเป็�น bacteriophage ใหม่ vector ร�บ insert ได� 12-25 % จ.ง

เหม่าะส"าหร�บในการที่"า cloning ของ eukaryotic genes ซึ่.�งสว่นม่�ขนาดใหญ เช้น ใช้�ที่"า Genomic library

24

2.2 M13 vector

S - ingle stranded phage ร�บ insert ที่��เป็�น single-stranded DNA ระหว่าง 300-1000 bases Rolling circle replication ให� double strand

ออกจาก bacteria ในร6ป็ single strand เหม่าะส"าหร�บใช้� cloning เพ#�อ sequence DNA

25

3. Cosmid vector

Vector ที่��สร�าง (construct) จากสว่นของ - 1. Plasmid: dr ug r esi st ant mar ker , or i gi n

of replication แล่ะ restriction sites จ.งม่� replication ได�เหม่#อนplasmid

2. Phage : cos sites ส"าหร�บpackaging cloned DNA ให�เป็�นphage chromosome ใน in vtro

26

cosmid ม่�ขนาด 4-6 kb

construct ให�ม่�polycloning site

cosmid สาม่ารถูร�บinsert foreign DNA ได�ระหว่าง 35 - 50 kb

เหม่าะในการ clone gene ขนาดใหญของeukaryote

27

4. Pagemid vector

Vector ที่�� construct ให�ม่� ค�ณล่�กษณะคล่�ายcosmid ค#อ ม่�ที่�*งล่�กษณะของ phage แล่ะplasmid

ม่� multiple cloning site insert เข�าที่�� lacZ gene

ม่� origin of replication จาก single-stranded f1 คล่�าย M13 ที่"าให� package

ได� single-stranded phagemid DNA

28

Bluescript vector / pBS ใช้�เป็�น Transcri pti onvector

ม่� Multiple cloning site ม่� 2 promoters ค#อ

T3 promoter ข�างหน.�ง แล่ะ T7 promoter อ�กข�างหน.�ง

สาม่ารถู transcribe RNA ใน in vitro ใช้� ศึ.กษา translation in vitro

29

5. Artificial chromosome

เป็�น Construct เพ��อที่"า cloning ในyeast เร�ยกว่า Yeast Artificial chromosome / YAC

เป็�น mini-chromosome ป็ระกอบด�ว่ย 1 centromere, 2 telomeres,

originof repl i cati on, แล่ะ seletable marker gene(s)

ใช้�ศึ.กษา chromosome segregation ระหว่าง meiosis แล่ะ cloning DNA

ขนาดใหญได�ถู.ง 150 kb

30

Yeast Artificial chromosome / YAC

31

Restriction Endonuclease

recognize specific nucleotidesequences

ตั�ดระหว่าง - 4 8 nucleotide ล่"าด�บเฉพาะแตัล่ะช้น ด

32

Resstriction enzymes

ตั�ด DNA ให� ป็ล่าย 2

แบบ Blunt end

Sticky end

33

DNA ligase เช้#�อม่ตัอระหว่าง 2 nucleotide

ของ 2 DNA โม่เล่ก�ล่ Sticky ends : efficiency

คอนข�างด� Blunt ends : efficiency

น�อยกว่า

34

35

DNA library ค#อ ห�องสม่�ด หร#อ s ets ของ cloned DNA

ใน vectors ที่��เก>บไว่�ที่�*งหม่ดใน host cells เพ#�อใช้�ตัรว่จหาแล่ะศึ.กษา genes ภายหล่�ง

แบงเป็�น 3 ป็ระเภที่1. Genomic DNA library : ห�องสม่�ดcloned DNA ของ 1 genome ซึ่.�งค#อgenes ที่�*งหม่ดของ ส �งม่�ช้�ว่ ตัใด ๆ เช้นhuman genome library

2. cDNA library : ห�องสม่�ด cloned cD NA ของ structural gene ใด ๆ

3. - Chromosome specific DNA library : ห�องสม่�ด cloned DNA ของ 1

chromosome

36

37

Application ของ Gene Recombinant Technology

1. Physi cal maps / restri cti onmaps o f DNAmol ecul e

หาแผนผ�งตั"าแหนงของ gene บนchromosomes 2. Nucleotide sequences of gene

หาล่"าด�บ base ของ gene 3. - In vitro site specific mutagenesis

ศึ.กษาการที่"างาน แล่ะการคว่บค�ม่ของ genes โดย การที่"า mutation เฉพาะ base(s)

38

4. I denti fi cati onof genes ช้�*บอก gene แล่ะ รายล่ะเอ�ยดของ gene

เช้น gene ที่��ที่"าให�เป็�นโรค 5. Human gene therapy

ร�กษาโรคที่างพ�นธี�กรรม่ โดยหล่�งว่ เคราะห& ได�ว่า gene ใดเป็�นเหตั�ของโรค น"า

gene หร#อผล่ผล่ ตั (protein) ของgene น�*น ใสหร#อใช้�ที่ดแที่น

ป็3องก�นโดยไม่ให� gene(s) เป็�นสาเหตั� ของโรคร�นแรงถูายถูอด

39

6. Producti onof protei ns ผล่ ตั proteins, hormones แล่ะ enzymes ใช้�bacteria ซึ่.�งเป็�น host ของ recombinant DNA เป็�นผ6�ผล่ ตัให� โดยไม่ตั�องสก�ดจากส �งม่�ช้�ว่ ตัช้�*นส6งโดยเฉพาะส�ตัว่& 7. Transgeni c organisms (plants & animals) หร#อ GMO (Gene modified organism)

crowngal l ,herbi c i de แล่ะ i nsecti ci de resi stant pl ants เช้น

ข�าว่ ข�าว่โพด ถู��ว่เหล่#อง ม่ะเข#อเที่ศึ ม่�นฝร��ง หน6 (ที่ดล่อง ) ฯล่ฯ 9. Paternity tests & forensi c appl i cati on

DNAfi ngerpri nts หาคว่าม่เป็�นพอ- แม่ หาคนร�าย

40

ตั�ว่อยางการป็ระย�กตั&ใช้�Gene Recombinant

Technology

41

Genetic Maps

42

DNA Sequencing

43

Cloning Growth Hormone Gene

44

Gene Therapy : ร�กษาโรคที่างพ�นธี�กรรม่

45

Transgenic Animal

การเตัร�ยม่ฉ�ด DNA ด�ว่ย

microinjection เข�าไป็ในไข

Transgenic mouse (ซึ่�าย)

46

Transgenic Plants

Luciferase plant พื�ชเรื�องแสง

Glyphosate-tolerant petunia

47

DNA Fingerprintings : Identify บ�คคล่ / พอ-แม่

การเตัร�ยม่ DNA Fingerprint

ings

48

หาพอ - แม่ หาคนร�ายจากผ6�ตั�องสงส�ย

49

Cell Cloning

ให�เป็�น cloned animal1. แยก cell จากส�ตัว่&ที่��โตั เตั>ม่ว่�ยแล่�ว่

2. Fuse รว่ม่ก�บ unfertilized egg ที่�� ได� เอา nucleus ออกแล่�ว่

3. กระตั��นให�แบงเซึ่ล่ล่& กล่ายเป็�นตั�ว่ออน(embryo)

4. น"าฝากใสม่ดล่6กของส�ตัว่& ตั�ว่เม่�ยที่��พร�อม่ตั�*งครรภ&l

50