genetische regulation in eukaryoten -...
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Genetische Regulation in Eukaryoten
Definition:
Im strengen Sinne: Regulierung der Transkription eines Genes zu RNAs
Im weiteren Sinne: + Regulierung der Expression und Funktion von Genprodukten (RNAs, Proteine)
Analyse der Genexpression 0.
Es kann bestimmt werden: 1. … die Menge eines Genprodukts in einem specifischen Zelltyp, in behandelten oder kranken Zellen
2. … gleichzeitige Expression von sehr vielen Genen
Real-time PCR cycler
Microarray scanner
Emryogenese Erwachsene
Die Bedeutung der genetischen Regulation
Komplexität und Vielfalt des Phenotyps
1.
1. Molekuläre Diagnostik 2. Gentherapie 3. Individuelles Medizin
2.
DNA oder Protein chips
Die Bedeutung der genetischen Regulation - Anwendungen
Roger D. Kornberg Andrew Z. Fire Craig C. Mello
2006 2006
1965
Francois Jacob Jacques Monod
Nobel Preis
Die Bedeutung der genetischen Regulation - Anerkennung
Chemie – Studieren der eukaryotischen Genexpression
Physiologie oder Medizin - Entdeckung der RNA-Interferenz
Physiologie oder Medizin - Entdeckung des lac operons
3.
4.
Post-Transkriptional
Post-Translational
Regulierung von den Genen bis zu Proteinen
Transkription
mRNA Processierung
mRNA Transport
mRNA Lokalisation
mRNA Stabilität Translation
Proteindegradation
Proteinmodification
5.
1. Genetische Regulierung
2. Epigenetische Regulierung
3. Epigenetische Vererbung
Über diesen Themen reden wir:
1. Regulierung der Transkription
1. Chromatinregulierung
- Methylation
- Acetylation
2. Interaktion zwischen Regulatorelementen
● cis-Elemente: Promotoren, Enhancers und Silencers
● trans-Elemente: RNA-Polymerase, Transkriptionsfaktoren und Co-Faktoren
Regulierung der Transkription
cis-Element: lokalisiert auf dem gleichen DNA Strang als das Gen Trans-Element: lokalisiert im Cytoplasma
Chromatin: DNA - Protein – Komplex im Zellkern
10.
upstream Promotor
Promotor Terminator
Exon Intron Exon Intron Exon polyA-Signal
upstream basic Ex1 Ex2 Ex3 I2 I1 pA T
Promotoren
Ex1 basic Promotor
25 - 30 Basenpaare
100 - 300 Basenpaare
11.
Promotor-Modul 34.
Basale Promotor-Modul
Response Modul
Zellspezifisches Modul
Entwicklungsregulatoren
Transkriptions- faktoren
TATA box TATAWAAR TFIID (core Promotor)
CAAT box GGCCAATCT NF-1
GC box GGGCGG Sp1
Octamer ATGCAAAT Oct-1
CRE WCGTCA CREB
Hitzenschock-Modul CTNGAATNTTCTAGA hsp27
Hypophysenzelle-Modul ATATTCAT Pit-1
Myoblast-Modul CAACTGAC MyoD
Lymphoid-Zelle-Modul GGGACTTTCC NF-B
Bicoid-Modul TCCTAATCCC Bicoid
Antennapedia-Modul TAATAATAATAATAA Ant
Consensus-sequenzen
N: allerlei Nukleotide W: A oder T
Expressionsmuster: bei der Kombination von Modulen bestimmt
Consensussequenzen = Motive, Elemente, Module
11
Modul
Umstrukturierung (remodeling) des Chromatins 13
Die Initiation der Transkription bei Eukaryoten
- Transkriptionsfaktoren
- Transkriptionskomplex
Transkribierte Region
E1 E2 E3 E4 E5 S2 S1
P T Ex1 Ex2 Ex3 I2 I1
E6 E7
P: Promotor Ex: Exon I: Intron T: Terninator + polyA-Signal E: Enhancer S: Silencer Is: Insulator
Is Is
10-30.000 Basenpaare
Enhancers and Silencers
Transkriptionsfaktoren binden zu den DNA Regulatorelementen
general Zelltyp-specifisch
15.
Transkriptionsfaktoren
Enhancer
RNA-PolymeraseII
Aktivatoren DNA Promotor Gen
RNA-Synthese
Transkriptionsinitiationskomplex
adaptoren
Allgemeine Transkriptionsfaktoren
16.
Gen 2
P2 T Ex2 Ex3 Ex4 I3 I2
Zellen-spezifische Genexpression
Gen 1
P1 T Ex1 Ex2 Ex3 I2 I1
Ex1 I1
Gen 2
P2 T Ex2 Ex3 Ex4 I3 I2
Gen 1
P1 T Ex1 Ex2 Ex3 I2 I1
Ex1 I1
Hautzellen-spezifisches Enhancer
S
Neuron-spezifisches Enhancer
TF
Zellen-spezifische Genexpression: Histon-Muster! 1. Transkriptionsfactor wird exprimiert in der Zelle 2. Erreichbarkeit der Regulatorregion des Genes
17.
Hautzellen-spezifisches Enhancer
Neuron-spezifisches Enhancer
Transkriptionsfaktoren
Strukturmotive der Transkriptionsfaktoren
Helix-loop-helix DNAbindende und
aktivierende Domäne Aktivator Domän
DNS-bindende Domän
Transzkription aktivator
Promoter Gen
DNS-bindende Domän
Bindungsstelle
Aktivation
RNA Polimerase
Stimulation der Zusammenstellung des Komplexes
Stimulation der Komplexaktivität
20.
Helix-loop-helix Der Zellkern und die Transkription
Zytoplasma
Kernhülle Kernpore
Zellkern
Nucleolus
Heterochromatin
Kernpore
Aktivirung der Transkription bestimmter Gene
21.
Posttranskriptionale
Regulierung
mRNA-Prozessierung
1. Spleiβen
2. Capping
3. Polyadenylation
4. RNA-Editing
23.
Exon Intron Exon Intron Exon
Terminator
polyA-Signal
upstream basic Ex1 Ex2 Ex3 I2 I1 pA T
Der Struktur der Gene
Transkribierte Region
Ex1 Ex2 Ex3 I2 I1
Ex1 Ex3
Codierende Region
Regulatorregion Transkribierte Region
Promotor
UTR: nicht-translatierte Region (untranslated region)
Introns: durchschnittlich 20-mal länger als Exons
Ex1
DNA
Prä-mRNA
mRNA
Ex2 Ex3
Ex2
ATG Stop
ATG Stop
pA
pA
pA AAAAAA Cap
5’-UTR - leader 3’-UTR- trailer
Enhancers
Schematische Darstellung des Spleiβens
Eukaryoten: Exons (kodierende Basensequenzen) und Introns (nichtkodierende Basensequenzen)
Der Vorgang des Spleiβens - Consensussequenzen an der Grenzen zwischen Introns und Exons - Spleiβosom: Komplex schneidet RNA, setzt Introns frei, verknüpft Exons (β-Thalassemie: β-Globin mRNA wird nicht richtig gespleiβt) - Selbst-Spleiβen: Ribozym (RNA mit katalytischer Aktivität)
(U1) (U2)
Die Funktionen der Intronen:
1. Alternatives spleiβen: mehr als ein Protein
2. Enthält Regulatorregionen
3. Genetischer Abfall
Spleiβen 27
5’-Ende: Cap-Gruppe (Schutz gegen Exonucleasen, Bindung der mRNA an das Ribosom)
3’-Ende: Poly(A)-Schwanz (Export aus dem Zellkern, Schutz
gegen Exonucleasen, Stabilität)
Prozessierung der mRNA
28.
RNA Editing 29
Alternative Promotornutzung und alternatives Spleiβen
DNA
RNA
Protein
DNA
Nicht-translatierte Region
Translatierte Region
Protein
Alternatives
Spleiβen Alternative
Promotornutzung
Alternative polyA Nutzung
mRNAs verlassen den Zellkern durch die Kenrpore
Zip-Code: Signale auf den mRNAs: bestimmen die Lokalisation in der Zelle
Motorproteine binden an das Zip-Code
31.
Codierende Region
Zip-code-Sequenz
Zip-Code-Struktur
ASH1 mRNA
Transport der mRNA
Posttranslationale Regulierung
Proteindegradation
Lebensdauer: -lang: zB. Steroid-Receptor; -kurz: zB. Proteine der Augenlinse
- Aminosäuren an den N-Enden korreliert mit: 1. Rate der ubiquitin-Bindung 2. Stabilität
- Arg, Lys, Phe, Leu, Trp 1/2 Existenzdauer: ≤ 3 min
- Cys, Ala, Ser, Thr, Gly, Val, Pro, Met 1/2 Existenzdauer: ≥ 20 hrs
Ubiquitin (ein Peptid aus 76 Aminosäuren) binden an Proteinen und markeirt sie zur Degradation bei proteolytischen Enzymen der Proteasomen
33.
proteasome
Ursachen der Degradation: - aberranter Structur - Optimale Existenzdauer - nicht mehr gebraucht - Hunger nach Aminosäuren
Proteindegradation 34
1. Proteolytisches Schneiden
- Verschiedene Peptide aus eineem Prekursorpeptid (zB. Neuropeptide)
- Entfernen von Inhibitorpeptiden (zB. Verdauundsenzyme)
2. Glycosylation: Transport (Kontrolle über Lokalisation der Proteine) 3. Phosphorylation: Aktivation - Inaktivation 4. Methylation – acethylation: Histon-Regulierung
Proteinmodifikationen Precursorpeptide
Peptidevarianten
I
35.
Glycosylation: Anknüpfen einer Glycosyl Gruppe
P kinase
phosphatase inactive active
Carb
ohyd
rate group
prote
in
mannose
glucose
N-acetil- gluckosamine
protein protein
Typen der Genexpression
Genexpression und Signalwege
Die Eigenschaften der Genexpression
a.Wann?
b.Wieviel?
c.Wo?
38.
Die Eigenschaften der Genexpression
a.Wann?
b. Wieviel?
c. Wo?
d. Wie?
e. In welcher Kombination?
Ontogenese, Induktion
Wieviel RNA, Prpteine?
In welcher Zelltyp?
Welche alternatives Form?
39
Welche Proteine interagieren miteinander?
1. Konstitutiv (kontinuirlich)
- Haushaltsgene
2. Induziert bei
2a. Nahrung: Glükose in Leberzellen
2b. Stress: Hitzenschock-Proteine, Osmotic (Salz) - Schock
2c. Zellkommunikation:
(Mediatoren: Hormone, Wachstumsfaktoren, Neurotransmitter)
2d. Ontogenetisch reguliert
3. Zelltypspezifisch
Die Typen der Genexpression
Genexpression – induciert bei Zellkommunikation
Signalmolekül beeinfluβt einen Transkriptionsfactor indirekt
Eintreten, oder nicht eintreten? Wenn in der Zelle . . . .
41
Aktivation durch Steroid-hormone
GRE: glucocorticoid response element
GRE DNA
Cytoplasma
Zellkern
Glucocorticoid Receptor
Inhibitor (hsp90) Steroid
Signaltransduction
42.
Aktivation durch Interferon-γ
RE: response element IFN: Interferon JAK: Janus activated kinase STAT-1: transcription factor
RE DNA
Cytoplasma
Zellkern
IFN-γ Receptor
JAK Kinase
IFN-γ
P P
Signaltransduction
43.
Rezeptor
Signalmolekül
Targetproteine
Veränderter Zellzustand
Sekundärer Botenstoff G Protein
1.
2.
3.
Regulatorproteine
Neu gebildete Regulatorproteine
4. 5.
6. 6.
7.
7.
8. 9.
5. inaktiv
inaktiv inaktiv
inaktiv aktiv
aktív
aktiv
aktiv
Schnelle und langsame Signalwege
Langsame Veränderung Schnelle Veränderung
DNA RE
Zellkern
Veränderter Zellzustand
Zellkern Zytoplasma
Veränderung in Zellfunktion
1.
2.
3. 4.
5.
6. 7.
8.
9.
10.
11.
12.
13. 14.
15.
16.
17.
Kommunikation mit anderen Zellen
18.
usw.
Informationsbewegung und Rückmeldung
7.
RNA- Interferenz
Slicer mRNA
siRNAs (21-23 Basenpaare)
siRNS: small interfering RNS
RISC: RNAi-induced silencing complex
RISC*: aktivált RISC
Slicer: a vágásért felelős
RNáz: ribonukleáz
1.RNAi -- schneiden (Dicing)
RISC
RISC* (aktiviert) Helikase
ds RNA Dicer
Degradiertes mRNA
RNAse
RNA abhängige
RNA-Polymerase viele siRNAs
siRNS: small interfering RNS
RISC: RNAi-induced silencing complex
RISC*: aktivált RISC
Slicer: a vágásért felelős
RNáz: ribonukleáz
48 RNAi- Amplifikation dsRNA
Dicer
siRNAs
mRNA repliziertes dsRNA
49.
DICER
Ago + andere RISC-Proteine
Ago + andere Proteine
aktiviertes RISC aktiviertes RITS
DNA
Degradiertes RNA Hemmung der Transkription
Mthylierung der Histone und der DNA
RNA-Interferenz
Parallele Wege
Andrew Z Fire; Craig C Mello
Kontroll Gefärbt
antisense-RNA dsRNA
RNAi: Abschaltung von Genen durch dsRNAs
Caenorhabditis elegans
mex-3 Gen GFP Gen (als Transgen in E. coli)
Futter: GFP- exprimierende E.coli
Wild Typ RNSi-Deffekt
1998
2006
. RNA-Interferenz
Andrew Z Fire; Craig C Mello
Technologien für selektive Hemmung der Genexprimierung:
Früher:
- In vitro – antisense DNA-Oligonukleotide + antisense RNAs:
- In vivo – Knock-out Technologie - - - - - - - - - - - -
Heute:
- Knock-down Technologie mithilfe von RNAi (in vitro + in vivo)
Natürliche Funktion:
- Antivirales Mechanismus
- Regulierung der Genexprimierung
51. RNA-Interferenz
52.
(1) Gentherapie
(2) Antimikrobiales Mittel
Medizinische Bedeutung
Epigenetik
1. Zelltyp Bestimmung
2. X-Chromosom Inaktivierung
3. Maternaler Effekt
4. Genetische Prägung (imprinting)
Epigenetische Merkmale - Vererbung ohne Gene
Epigenetische Vererbung: Informationsübertragung von einer Zelle od. von einem multizellulären Organismus zu den Nachkommen, ohne Veränderung der Nukleotidsequenz der Gene.
Epigenetik: Wissenschaftsfeld,dass sich mit epigenetischer Vererbung befasst
Chromatin: Komplex von DNA und Proteinen,der im Nukleus gebildet wird
Epigenetische Regulierung: (1) Innerhalb eines Individuums, zwischen Zellen
- Zelltypbestimmung (modifiziert: Histon – Methylierung, Acetylierung, Phoshorylierung)
(modifiziert: DNA – Methylierung) - Chromosom Inaktivierung (modifiziert: DNA - Methylierung)
Epigenetische Vererbung: (2) Von den Eltern zu den Nachkommen
- Genetisches Imprinting (modifiziert: DNA - Methylierung) - Maternaler Effekt (maternal mRNAs and proteins are transmitted to offspring)
Transmission von epigenetischen Informationen:
Epigenetik
Epigenetische Regulierung: Transmission von epigenetischen Informationen:
1. Veränderung in Transkription
2. epigenetische Veränderung in Ontogenese
3. Zelltypbestimmung
4. Epigenetisches Program hängt vom Umwelt ab
Chemischer Hintergrund: (modifiziert: Histon – Methylierung, Acetylierung, Phoshorylierung (modifiziert: DNA – Methylierung Chromosom Inaktivierung (modifiziert: DNA - Methylierung)
Innerhalb eines Individuums, zwischen Zellen
- direkt Effekt: Genetisches Imprinting (modifiziert: DNA - Methylierung)
- indirekt Effekt: Maternaler Effekt (mütterliche mRNA und Proteine werden den
Nachkommen übergetragt)
Epigenetische Vererbung:
!
Von den Eltern zu den Nachkommen, zwischen Individen
.
Hautzelle
Zelltypbestimmung Epigenetische Regulierung: innerhalb 1 Individuum
Zelltypbestimmung: Ein Zelltyp produziert die gleiche Zell, aber nicht(oder selten) anderer, obwohl ihr DNA Inhalt identisch ist.
Der Histonkod Die Histonkod-Hypothese besagt,dass die chemische Modifikation von Histonen eine Serie von vorprogrammierten Änderungen während der Zelldifferenzierung und Embryogenese ist.
Zelltypbestimmung Epigenetische Regulierung: innerhalb 1 Individuum
Differenzierung: Programmierte Veränderung der Histonmuster
Eizelle
Differenzierte Hautzelle
Zelltypbestimmung
Differenzierte Leberzelle
Der Histonkod Epigenetische Regulierung: innerhalb 1 Individuum
Embryogenese
zygote
Hypothetisches Experiment: Insertion des gleichen Zellkerns in unterschiedliche Zytoplasmen
Zelltypbestimmung Epigenetische Regulierung: innerhalb 1 Individuum
zygote
Embryogenese
Zelltypbestimmung
zygote
Hypothetisches Experiment: Insertion des gleichen Nukleus
in ein jeweils anderes Zytoplasma
Epigenetische Regulierung: innerhalb 1 Individuum
DNA Methylierung Die Methylierung der DNA verhindert Genexpression,aber ihre Rolle in der Gewebedifferenzierung ist unklar. Verschiedene Zelltypen haben verschiedene Metilationsmuster
Zelltypbestimmung
Metilom Code?
Epigenetische Regulierung: innerhalb 1 Individuum
Der Genotyp der Mutter manifestiert sich in den Nachkommen
Function: die Cytoplasma der Eizelle reguliert die ersten Schritte der Embriogenese
Maternaler Effekt
Pferde- od. Esel-Maultier?
Zygote
Epigenetische Verärbung: Von den Eltern zu den Nachkommen
Genetische Prägung (Imprinting)
Methylierung der DNA
Der Effekt eines geprägten Gens hängt vom Elternteil ab, von dem es stammt
Funktion: ?Eltern-Kind-Konflikt Hypothese?
Beispiel: IGF2 (insulin-like growth factor): männlich
Vorkommen: Säugetiere m. Plazenta, blühende Pflanzen
Epigenetische Verärbung: Von den Eltern zu den Nachkommen
apai kr. anyai kr.
In den somatischen Zellen sind bestimmte Gene der väterlichen Chromosomen metiliert (imprintert), andere Gene der mütterlichen Chromosomen sind also
imprintiert
In den Spermien wird alle Imprintierung
gelöscht und nach väterlichen Muster
wiederhergestellt
In den Eizellen wird alle Imprintierung
gelöscht und nach mütterlichen Muster
wiederhergestellt
Epigenetische Verärbung: Von den Eltern zu den Nachkommen
Genetisches Imprinting
väterliches Chomosom
mütterliches Chomosom
Genetisches Imprinting
Metilierung
15. Chromosom
SNRPN UBE3A SNRPN UBE3A
SNRPN UBE3A
SNRPN UBE3A
SNRPN UBE3A
SNRPN UBE3A
SNRPN UBE3A
Syndrom von Prader-Willi und von Angelman
Prader-Willi Syndrom Angelman Syndrom
Normal
Deletion
UPD
Imprinting
hiba
(~80%)
(~20%)
(~2%)
Epigenetische Vererbung: Von den Eltern zu den Nachkommen
Wild Typ Angelman-Syndrom
Prader-Willi-Syndrom
Lethal
Deletion
Deletion
Eltern- Konflikt David Haig
Je besser die Mutter das Embryo versorgt, desto weniger werden die anderen
Nachkommen versorgt, und desto mehr verliert sie an Fittnes.
Die gute Versorgung des Embryos liegt am Interesse des Vaters (der väterlichen
Gene), und er kümmert sich um die anderen Nachkommen und die zukünftige
Reproduktion der Mutter nicht.
Väterlich imprintirte Gene fördern das Wachstum des Embryos, mütterlich
imprintierte Gene hemmen das Wachstum des Embryos.
Epigenetische Umschaltung
•Väterlich imprintierte Gene dominieren
während der Embryogenese im Gehirn.
(Mütterliche Kopien der Gene werden
exprimeirt)
•Später, im Erwachsenenalter, dominieren
die väterlichen Gene
•Es gibt sehr viele imprintierte Gene (ca. 1300)
•Imprintierung ist dynamisch, es wird während
des Lebens des Individuums verändert
•Imprintierung spielt eine wichtige Rolle
während der Entwicklung und in der
Regulierung des Verhaltens
Dominanz
GRB10
Kodiert für ein intrazelluläres Adaptorprotein
Interagiert mit Rezeptor-Tyrosin-Kinasen, beeinflusst Signalübertragung
Ein imprintiertes Gen (mütterliche und väterliche Kopien des Gens werden unterschiedlich expremiert)
Väterliche Kopie: wird im Gehirn expremiert,
lindert die Dominanz, Knock-out: dominates Verhalten, kein Ausweichen in Röhr-Test
Mütterliche Kopie: wird im Körper expremiert (ausser Gehirn)
Funktion: reguliert Metabolismus und Wachstum
Weitere imprintierte Gene, die Verhalten beeinflussen: Mest, Peg3 (Pfegeverhalten der Weibchen)
Die Umwelt beeinflusst das epigenetische
Program
Unser Gehirn ist besonders empfindlich für epigenetische Signale
Die Entschlüsselung der Nukleotidsequenz der
DNA ist erst der Anfang…
Postgenomische Ära