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BC-Praktikum II WS 2011/12
Ralf Dürr AG Dietrich
Protein
Genexpressionsnachweis 1:
Proteinnachweise
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Genom - Proteom
aufgrund veränderter Bedingungen (Umweltfaktoren, Temperatur, Genexpression, Wirkstoffgabe etc.), z.B.:
Raupe und Schmetterling: gleiches Genom, aber unterschiedliches Proteom! Veränderungen des
Proteoms oftmals sehr schnell, z.B. Phosphorylierungen und Dephosphorylierung von
Proteinen (wichtig für Signaltransduktion).
Genom größtenteils bekannt
eher statisch
Proteom relativ unbekannt hoch dynamisch
Proteomik
Erforschung des Proteoms, das heißt der Gesamtheit aller in einer Zelle oder einem Lebewesen unter definierten Bedingungen und zu
einem definierten Zeitpunkt vorliegenden Proteine.
Einzelprotein-Analyse
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Proteomik
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Proteomik – Proteinanalyse im großen Maßstab
Protein-Expressionsprofile, Proteinmodifikationen und Protein-Netzwerke in Relation zu Zellfunktion und biologischen Prozessen,
z.B. Entwicklung, Gesundheit und Krankheit
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Microarrays
modernes molekularbiologisches Untersuchungssystem
erlaubt die parallele Analyse von mehreren tausend Einzelnachweisen in einer geringen Menge
biologischen Probenmaterials
→ "Genchips" oder "Biochips" (viele Informationen auf kleinstem Raum)
DNA-Microarrays Protein-Microarrays
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A) DNA-Microarrays
Genomanalyse, Diagnostik, differenzielle Genexpression
Bestimmung der mRNA-Menge bestimmter Gene
1.) Sonden (Oligos / cDNAs) an definierten Positionen eines Rasters, z. B. Glasträger
2.) RNA-Extraktion, cDNA- oder cRNA-Synthese mit Fluoreszenzfarbstoffen
3.) Hybridisierung mit Microarrays: markierte cDNA/cRNA Stücke binden an ihren
komplementären Gegenpart auf dem Array
4a.) Auslesen der Fluoreszenzsignale jeder Position des DNA-Microarrays mittels Lasers
4b.) Bioinformatischer Signalausgleich, Normalisierung, Auswertung
Chip mit Oligos
bzw. cDNAs
Hybridisierung, Exzitation, Auswertung
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Auswertung der DNA-Microarrays
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B) Protein-Microarrays
Spots: Vielzahl von Testfeldern
auf engstem Raum
C.) Detektion: Spots mit und ohne Protein-Protein-Interaktion (auch quantitative
Detektionsverfahren möglich)
B.) Auftrag der zu testenden Probe (Proteinmix / Antikörper)
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Einzelprotein-Nachweise
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verschiedenen Eigenschaften der Proteine
→verschiedene Möglichkeiten der Proteindetektion
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Methoden der Proteindetektion
Objektive Methoden
Molekulargewicht Aminosäuresequenz
Subjektive Methoden
colorimetrisch absorptionsspektroskopisch
→abhängig von funktionellen Gruppen →relative Quantifizierung anhand
Proteinstandards
Strukturelle Analyse
NMR-Analyse (Magnet-Resonanz-Tomographie) Röntgenkristall-Analyse Elektronenmikroskopie und 3D-Rekonstruktion
Funktionelle Analyse
immunologisch enzymatisch radioaktiv
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Prinzip
Proteine absorbieren und fluoreszieren im UV-Bereich (1 – 400 nm) Proteinabsorption wird bei definierter Wellenlänge gemessen Proteine werden nicht denaturiert
Assay reaktive Gruppe Detektionslimit (µg/ml)
Photometrisch A280 Tryptophan, Tyrosin 20 - 3000
A205 Peptidbindung 1 - 100
Fluorimetrisch
Anregung 280 aromatische AS 5 – 50 Emission 320 - 350
1. Absorptionsspektroskopie
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2. Colorimetrische Methoden
Prinzip
Quantifizierung von Protein-Farbstoff-Komplexen durch Messung der Absorption bei spezifischer Wellenlänge anhand einer Standardkurve.
abhängig von funktionellen Gruppen der Aminosäuren, welche mit einem Farbstoff reagieren keine absolute Quantifizierung
verschiedene Assays und Versuchsbedingungen können > 20 % Abweichung hervorrufen
Proteine denaturiert infolge von Färbung bei extremen pH-Werten
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Assay Prinzip Sensitivität
Bradford Coomassie brilliant blue G250 bindet 0.2 – 20 µg/ml an aromatische und basische AS-Reste
Biuret Komplexierung der Peptidbindungen mit 1 – 20 mg/ml Cu2+ unter Bildung eines Farbumschlags
Bicinchoninic acid (BCA) Reduktion von Cu2+ durch Peptide unter 0.2 – 50 µg/ml Bildung eines Farbumschlags
Lowry Komplexierung der Peptidbindungen mit 2 – 100 µg/ml Cu2+ unter Bildung eines Farbumschlags
2. Colorimetrische Methoden
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Bradford assay:
Coomassie brilliant blue G250 + aromatische od. basische Seitenketten der Proteine (insbesondere Arginin) in saurem Milieu; sehr sensitiv, einfache Durchführung, auch zur Färbung von Proteingelen geeignet
Quantifizierung: Absorption bei 595 nm Beeinträchtigung: Sensitivität gegenüber Detergenzien (z. B. sodium
dodecylsulfate (SDS)) oder reduzierende Substanzen (z. B. Dithiothreitol (DTT)).
2. Colorimetrische Methoden
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2. Colorimetrische Methoden
Biuret assay:
Bicinchoninic acid assay (BCA):
violett
A 562
Kupferreduktion
(Molybdän- / Wolfram-Heteropolysäure)
Lowry assay:
A 540; geringe
Sensitivität (Fehlings Reagenz)
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Proteindetektion und Charakterisierung
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3. Proteintrennung durch Gelelektrophorese
3.1 1-D-Gelelektrophorese / SDS-PAGE
→ Molekülgröße und Reinheit eines Proteins
Proteine wandern durch Poren eines Polyacrylamid-Gels innnerhalb eines elektrischen Feldes
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3. Proteintrennung durch Gelelektrophorese
3.2 2-D-Gelelektrophorese
1-D: erste Trennung nach pI 2-D: Trennung nach Größe (SDS-PAGE) pI-Elektrophorese wird einem SDS-Gel aufgelegt
Proteine wandern senkrecht zur 1. Dimension in das SDS-Gel
Ende der Auftrennung
Gel mit pH-Gradient
Gel mit Protein beladen
pI-Elektrophorese
nach der pI-Elektrophorese
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3. Proteintrennung durch Gelelektrophorese
3.2 2-D-Gelelektrophorese
Tausende von Proteinen können als einzelne Spots getrennt werden, geeignet zum Vergleich von Protein-Expressionsprofilen verschiedener Zellpopulationen, z. B. unterschiedliche Entwicklungsstadien, Tumor vs. Normalgewebe.
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Prinzip
Direkte Färbung des Gels (Coomassie, Silber, Fluoreszenzfarbstoffe) Indirekt nach Gel-Blotting auf eine Membran Detektion durch Autoradiografie radioaktiv markierter Proteine [35S].
4. Proteindetektion nach Trennung durch Gelelektrophorese
4.1 Direkte Färbung des Gels
Coomassie: bindet unspezifisch an Proteine, die durch Methanol/Essigsäure in einem Polyacrylamid-Gel fixiert sind. Detektionslimit: 0,3 – 1 µg/Proteinbande.
Silbernitrat: bindet an chemische Gruppen (Sulfhydryl, Carboxyl etc.). Nach Fixierung wird ein Polyacrylamid-Gel mit Silbernitrat gefärbt. Detektionslimit: 2 – 5 ng/Proteinbande.
Fluoreszenzfarbstoffe: z. B. SYPRO-Orange od. SYPRO-Red werden durch UV angeregt. Gefärbte Gele können in einem Transilluminator fotografiert oder mit einem Laserscanner gescannt werden. Detektionslimit: 1 – 2 ng/Proteinbande.
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4. Proteindetektion nach Trennung durch Gelelektrophorese
4.2 Detektion durch Gel-Blotting (Western Blot)
Proteinübertragung auf Membran durch elektrisches Feld (blotting)
→ Detektion direkt colorimetrisch oder durch spezifische, signalmarkierte
Antikörperbindung (India ink: →50 ng; Gold: → 3 ng; SYPRO Ruby: →2 ng;
Western Blot: →0.1 - 1 ng Antigen)
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5. Enzyme-linked immunosorbant assay (ELISA)
Basiert auf spezifischen Antigen- Antikörper-Komplexen, einer der Partner ist immobilisiert
Detektion durch einen markierten Antikörper (Enzym, Farbstoff etc.)
ELISA erfordert Optimierung hinsichtlich unspezifischer Bindungen (z. B. Bindung an Plastikoberfläche, unspezifische Bindung der Reaktionspartner Reduktion durch Blockierung der unspezifischen Bindestellen nach Immobilisierung der Bindepartner)
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5. Enzyme-linked immunosorbant assay (ELISA)
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Bsp: Enzymdetektion anhand ihrer katalytischen Aktivität
Für Nachweis der Expression eines unbekannten Proteins wird das codierende Gen an ein bekanntes Reportergen (z. B. β-Galactosidase oder Luciferase) gekoppelt, welches quantifiziert werden kann.
Assay zur Detektion von HIV-1 infizierten Zellen basierend auf β-gal Reportergen.
6. Funktionelle assays
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6. Funktionelle assays
Detektion der Inhibierung einer HIV-1 Infektion durch reduzierte Expression eines Reportergens
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Aminogruppe der terminalen AS-Reste reagieren mit Phenylisothiocyanat (PITC) zu einer Anilinthiazolin-AS
Flüssige oder gasförmige Trifluoressigsäure spaltet die AS-Derivate
7. Proteinsequenzierung durch Edman-Abbau
Konversion der Anilinthiazolin-AS in Phenylthiohydantoin-AS, identifiziert durch reverse Phasechromatografie.
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8. Massenspektrometrie
Quelle: IZKF Ulm, Dr. Markus Wunderlin
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8. Massenspektrometrie
Quelle: IZKF Ulm, Dr. Markus Wunderlin
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8. Massenspektrometrie
Quelle: http://www.chemie.uni-kl.de/forschung/oc/kubik/index
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a) Röntgenbeugungsanalyse (X-ray)
9. Strukturelle Analysen
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a) Röntgenbeugungsanalyse
1.) Züchten eines Proteinkristalls 2.) Synchotron (Teilchenbeschleuniger) - Röntgenbeugung
3.) Streuungsbild 4.) Computeranalyse und Proteinstruktur
in atomarer Auflösung
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b) Elektronenmikroskopie und 3D-Rekonstruktion
1.) Probenvorbereitung und Elektronenmikroskopie 2.) EM-Aufnahme
3.) „Picken“ einzelner Moleküle, Einteilung in Klassen, Winkelbestimmung, Rückprojektion, Computerberechnungen in
iterativen Verfahrung um Unschärfe zu minimieren 4.) 3D rekonstruiertes
Protein
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Fitting a) Röntgenkristallstruktur +
b) 3D-Rekonstruktion +
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