genoma funcional: identificar genes diferencialmente expressos 15 mil a 30 mil diferentes rnas...
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Genoma funcional: identificar genes diferencialmente expressos
15 mil a 30 mil diferentes RNAsPopulação de RNA em uma célula >100 000 moléculas de RNAClasse RNA abundantes: 1% dos genes = 50% da pop. de RNAsClasse de RNA raros: metade dos genes = 1% pop. de RNAs
Alguns fatos que afetam a eficiência dos métodos em identificar esses genes
Genoma funcional: outras metodologias para identificar genes diferencialmente expressos
Subtração de bibliotecas
PCR supressivo
mRNA fingerprint
cDNA-AFLP
CAP Trapper
Limitações microarrays: Genes pouco expressos não são detectados Difícil separação da contribuição de diferentes isoformas de um mesmo gene
Outros métodos
Genoma funcional: outras metodologias para identificar genes diferencialmente expressos
Tester: biblioteca de cDNA aonde estão os genes que quero fisgar meu gene (gene
induzido peloetileno:: tratamento com etileno)
Driver: biblioteca de cDNA aonde não estão os genes que quero fisgar meu gene (genes não
induzidos pelo etileno:: tratamento sem etileno)
Subtração de bibliotecas de cDNAsistema utilizando biotina, streptavidina
e partículas magnéticas
Genoma funcional: outras metodologias para identificar genes diferencialmente expressos
PCR supressivo
PCR supressivo
PCR supressivo
Sequência não forma est. pan em moléculasmaiores, só em menores
SUPRESSION PCR
Condição 1 Condição 2
Gel de poliacrilamida e uréia (sequenciamento)
Differential RNA display
TTTTTT
Primer OligodT
GCUAAAGCGAPrimer decâmero
randômico
AAAAAAAAGene 1
AAAAAAAAGene 2
TTTTTT
Primer OligodTGCUAAAGCGA
Primer decâmero randômico
Reação de PCRcom baixa temperatura
de anelamento,com nucleotídeos marcados
radioativamente
TTTTTT
Primer OligodTGCUAAAGCGA
Primer decâmero randômico
AAAAAAAAGene 3
GCUAAAGCGA TTTTTT
GCUAAAGCGA TTTTTT
GCUAAAGCGA TTTTTT
Gene mais expresso na condição 1
Gene mais expresso na condição 2
Gene somente expresso na condição 2
2 d
ias
CriticismosPouca capacidade para detectar RNA raramente expressos
Banda do gel: mistura de cDNAs: 50-75% bandas = falsos positivos
Artefatos: primers curtos e baixa temp. anelamento: amplificação inespecífica
Limitada quantitividade: competição pelos primers por transcritos de diferentes abundâncias
Primers curtos: semi-pareamento em outras regiões do mesmo gene:dif. Clones positivos
podem ser o mesmo geneFragmentos pequenos (150-400 bp) contendo principalmente região 3’ UTR: difícil identific.
Modificações do método originalPrimers mais longos com programa com ciclo alterado
Combinação com subtração
Arbitrary primed PCR (RAP-PCR): dois primes curtos: probl. Falsos positivos
Integração do protocolo para PCR de longa distância no Differential display (até 2Kb- LDD-PCR)
EcoR I+CC and Mse I+AAA).Ecotipos de A.thaliana:
linhas 1 and 2.Columbia; linhas 3 and 4. Landsberg.
Genótipo: Columbia, Usando primer EcoR I+AC e: Mse I primer+AA (lanes 1 and 2);Mse I primer+AAA (lanes 3 and 4).
Introdução de um novo nucleotídeoLevou a amplificação de um outro subgrupo
de cDNAs
Sinchronized tobacco cells ( 12 point into S and M→G1 transition were
sampled.Exhaustive cDNA-AFLP: 360 AFLP primer combinationsÇ 18,000 AFLP tagsAbout 10% exhibited a modulated cell cycle profileÇ 1150 AFLP tags Tobacco BY2 cells were synchronised in the G1→S transition phase usingMajority of these AFLP tags either match genes of unknown function or
represent novel sequences.
Uso em larga escala do cDNA-AFLP