genotipizacija slovenskih bolnikov z revmatoidnim … · 2020. 1. 30. · magnezijev klorid nacl...

Magistrsko delo

GENOTIPIZACIJA SLOVENSKIH BOLNIKOV Z REVMATOIDNIM ARTRITISOM ZA DNA

POLIMORFIZME PREDHODNO POVEZANE Z BOLEZNIJO V ASOCIACIJSKIH ŠTUDIJAH V CELOTNEM

GENOMU

Avgust, 2016 Doroteja Gselman

Doroteja Gselman

Genotipizacija slovenskih bolnikov z revmatoidnim artritisom za DNA polimorfizme predhodno povezane

z boleznijo v asociacijskih študijah v celotnem genomu

Magistrsko delo

Maribor, 2016

Genotipizacija slovenskih bolnikov z revmatoidnim

artritisom za DNA polimorfizme predhodno povezane

z boleznijo v asociacijskih študijah v celotnem

genomu

Magistrsko delo študijskega programa II. stopnje

Študent: Doroteja Gselman

Študijski program: magistrski študijski program II. stopnje Kemijska

tehnika

Predvideni strokovni naslov: magistrica inženirka kemijske tehnike

Mentor: red. prof. dr. Uroš Potočnik

Komentor: prim. prof. dr. Artur Pahor, dr. med.

Maribor, 2016

Genotipizacija slovenskih bolnikov z revmatoidnim artritisom za DNA polimorfizme predhodno povezane z boleznijo v asociacijskih študijah v celotnem genomu

I

Kazalo

Kazalo .......................................................................................................................................... I Izjava......................................................................................................................................... III Zahvala ..................................................................................................................................... IV

Povzetek ..................................................................................................................................... V Abstract ..................................................................................................................................... VI Seznam tabel ............................................................................................................................ VII Seznam slik ............................................................................................................................ VIII Uporabljeni simboli in kratice .................................................................................................. IX

1 Uvod .................................................................................................................................... 1

1.1 Opredelitev problema ................................................................................................... 1

1.2 Namen, hipoteze in cilji ............................................................................................... 1 2 Revmatoidni artritis ............................................................................................................. 3

2.1 Splošno o bolezni ......................................................................................................... 3 2.2 Patogeneza in patologija revmatoidnega artritisa ........................................................ 5

2.3 Klinična slika ............................................................................................................... 6 2.3.1 Prizadetost sklepov ............................................................................................... 7 2.3.2 Prizadetost drugih organov ................................................................................... 8

2.3.3 Laboratorijski testi ................................................................................................ 8 2.4 Diagnoza ...................................................................................................................... 9

2.5 Genetske študije pri RA ............................................................................................. 10 2.5.1 Študije genetske vezave ...................................................................................... 10 2.5.2 Asociacijske študije ............................................................................................ 10

2.6 Genetika RA ............................................................................................................... 13

2.7 Zdravljenje ................................................................................................................. 14 2.8 Farmakološko zdravljenje .......................................................................................... 15

2.8.1 Zdravila z nesteroidnimi protivnetnimi učinkovinami (NSAIDs) in analgetiki . 15

2.8.2 Glukokortikoidi................................................................................................... 16 2.8.3 Imunomodulirajoče protirevmatične učinkovine (DMARDs) ........................... 16

2.8.4 Biološka DMARDs ............................................................................................. 16 2.9 Genotipizacija ............................................................................................................ 17 2.10 Opis SNP-ov uporabljenih v nalogi ........................................................................... 17

2.10.1 rs1571878 (CCR6) .............................................................................................. 17 2.10.2 rs7574865 (STAT4) ............................................................................................. 18

2.10.3 rs909685 (SYNGR1)............................................................................................ 19 2.10.4 rs2476601 (PTPN22) .......................................................................................... 19

2.10.5 rs3087243 (CTLA4) ............................................................................................ 20 3 Eksperimentalni del ........................................................................................................... 21

3.1 Vzorci DNK ............................................................................................................... 21 3.2 Materiali ..................................................................................................................... 21

3.2.1 Osnovne kemikalije ............................................................................................ 21

3.2.2 CEPH vzorci ....................................................................................................... 22 3.2.3 Raztopine in pufri ............................................................................................... 22 3.2.4 Laboratorijska oprema ........................................................................................ 23

3.3 Laboratorijske metode ............................................................................................... 23 3.3.1 Izolacija DNK, RNK in proteinov ...................................................................... 23 3.3.2 Merjenje koncentracij in redčenje DNK ............................................................. 25


II

3.3.3 Verižna reakcija z encimom polimerazo (PCR) ................................................. 26 3.3.4 Priprava 2 % agaroznega gela in elektroforeza .................................................. 29

3.3.5 Polimorfizem dolžin restrikcijskih fragmentov (RFLP) ..................................... 29 3.3.6 Metoda HRM ...................................................................................................... 31

3.4 Računalniški programi ............................................................................................... 34 3.4.1 Bioinformatska orodja ........................................................................................ 34 3.4.2 Primer3 ............................................................................................................... 34

3.4.3 SNP cutter ........................................................................................................... 34 3.4.4 GeneRunner 3.05 ................................................................................................ 34 3.4.5 Program SPSS 20.0 ............................................................................................. 37

4 Rezultati ............................................................................................................................. 38 4.1 Izbor polimorfizmov .................................................................................................. 38

4.2 Optimizacija pogojev za RFLP test ........................................................................... 38 4.3 Optimizacija pogojev za HRM test ............................................................................ 42

4.4 Asociacijska analiza izbranih SNP pri bolnikih z RA ............................................... 44 4.4.1 Rezultati RFLP ................................................................................................... 44 4.4.2 Rezultati HRM .................................................................................................... 45 4.4.3 Primerjava rezultatov dobljenih iz genotipizacij ................................................ 45

4.4.4 Rezultati statističnih analiz ................................................................................. 46 5 Diskusija ............................................................................................................................ 51

6 Zaključek ........................................................................................................................... 53 7 Literatura ........................................................................................................................... 54 8 Življenjepis ........................................................................................................................ 59


III

Izjava

Izjavljam, da sem magistrsko delo izdelala sama, prispevki drugih so posebej označeni.

Pregledala sem literaturo s področja magistrskega dela po naslednjih geslih:

Vir: PubMed (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed)

Gesla: Število referenc

rheumatoid arthritis 111464

rheumatoid arthritis IN genetics 11457

rheumatoid arthritis IN single nucleotide polymorphism 1443

rheumatoid arthritis IN GWAS 389

rheumatoid arthritis IN treatment IN methotrexate 6181

PCR IN RFLP IN HRM 32

Vir: COBISS/OPAC (http://www.cobiss.si/scripts/cobiss?ukaz=getid, COBIB.SI)

Gesla: Število referenc

revmatoidni artritis IN zdravljenje 78

Skupno število pregledanih člankov: 112

Skupno število pregledanih knjig: 6

Maribor, avgust 2016 Doroteja Gselman


IV

Zahvala

Zahvaljujem se mentorju, red. prof. dr. Uroš Potočniku, za vodenje

in svetovanje pri nastanku magistrskega dela. Prav tako se

zahvaljujem somentorju prim. prof. dr. Artur Pahor, dr. med. za

pomoč in pregled magistrskega dela.

Zahvala gre tudi dr. Katji Repnik in Staši Jurgec za pomoč pri delu v

laboratoriju.

Zahvaljujem se tudi svoji družini za vso podporo in spodbujanje pri

študiju.


V


Povzetek

Revmatoidni artritis je kronična avtoimunska bolezen s kompleksno genetsko etiolologijo.

Prizadene vse sklepne dele telesa. Študije so pokazale da poleg okoljskih dejavnikov k razvoju

bolezni pomemben delež prispevajo tudi genetski dejavniki. Ocenjen prispevek dednega

dejavnika je 60 %. V patogenezo bolezni je vpleteno veliko število polimorfizmov posameznega

nukleotida (SNP).

Namen magistrskega dela je ugotoviti ali so SNP-eji, ki so bili najbolj statistično značilni v

asociacijskih študijah na celotnem genomu (GWAS), statistično značilni tudi za slovenske

bolnike z RA. V raziskavi smo izbrali rs1571878 (CCR6), rs7574865 (STAT4), rs909685

(SYNGR1), rs2476601 (PTPN22) in rs3087243 (CTLA4). Izvedli smo genotipizacijo s PCR-

RFLP metodo in HRM metodo na 276 vzorcih bolnikov in 276 vzorcih zdravih kontrol. Rezultate

smo analizirali s statistično analizo.

Statistična analiza je pokazala povezavo med RA in SNP-jema rs2476601 (PTPN22) (p = 1,3 x

10-5) in rs3087243 (CTLA4) (p = 0,002). Alel A za SNP rs2476601 zvišuje tveganje za nastanek

RA. Za SNP rs3087243 ima alel G zaščitno vlogo proti nastanku RA.

Ključne besede: revmatoidni artritis, asociacijske študije na celotnem genomu, verižna reakcija

s polimerazo, polimorfizem dolžin celotnega genoma, genotipizacija

UDK: 575.22:616.72-002(043.2)


VI

Genotyping of Slovenian patients with rheumatoid arthritis for DNA polymorphisms previously associated with the disease in genome wide association studies

Abstract

Rheumatoid arthritis is a chronic an autoimmune disease with a complex genetic etiololoy. It

affects all joints of the body. Studies have shown that in addition to the environmental factors

genetic factors also contribute an important proportion to the development of the disease. The

estimated contribution of hereditary factors is 60%. However, it is known that a substantial

number of single nucleotid polymorphisms (SNP) are involved in the pathogenesis of the disease.

The aim of the master thesis was to find out whether are the most strongly associated SNP-s in

the genome wide association studies (GWAS) also associated with the slovenian patients with

RA. In this study, we have chosen rs1571878 (CCR6), rs7574865 (STAT4), rs909685 (SYNGR1),

rs2476601 (PTPN22) and rs3087243 (CTLA4). We performed genotypization using PCR-RFLP

method and HRM method in 276 samples of patients and 276 samples of healthy controls. Results

have been analyzed with the statistical analysis.

In the assignment we have confirmed associations between SNPs rs2476601 (PTPN22) (p = 1,3

x 10-5) and rs3087243 (CTLA4) (p = 0,002). Allele A for SNP-rs2476601 increases the risk of

developing RA. For SNP-rs3087243, allel G has a protective role in the development of RA.

Key words: rheumatoid arthritis, Genome Wide Association Studies, Polymerase Chain

Reaction, Restriction Fragment Lenght Polymorphism, genotyping

UDK: 575.22:616.72-002(043.2)


VII

Seznam tabel

Tabela 2-1: Klasifikacijska merila RA glede na simptome. ..................................................... 9

Tabela 3-1: Osnovne kemikalije in njihovi proizvajalci......................................................... 21

Tabela 3-2: Izbrani začetni oligonukleotidi (primerji). .......................................................... 22

Tabela 3-3: Laboratorijska oprema in njeni proizvajalci ........................................................ 23

Tabela 3-4: Prikaz protokala za PCR reakcijo. ....................................................................... 28

Tabela 3-5: Izbrani protokol, ki je uporabljen v termociklizatorju. ....................................... 29

Tabela 3-6: Parametri uporabljeni pri RFLP metodi. ............................................................. 31

Tabela 3-7: Protokol za pripravo HRM reakcijske mešanice. ................................................ 34

Tabela 4-1: Kandidatni polimorfizmi posameznega nukleotida (SNP). ................................. 38

Tabela 4-2: Protokol za PCR reakcijo. ................................................................................... 42

Tabela 4-3: Protokol za RFLP reakcijo. ................................................................................. 42

Tabela 4-4: Optimalni pogoji za HRM test. ........................................................................... 43

Tabela 4-5: Ponovno optimizirani optimalni pogoji za HRM. ............................................... 43

Tabela 4-6: Primerjava izračunih frekvenc s frekvencami dobljenih iz projekta HapMap. ... 45

Tabela 4-7: p-vrednosti, razmerja obetov in intervali zaupanja za RA bolnike in kontrole za

CCR6. ..................................................................................................................................... 47


SYNGR1. ................................................................................................................................. 48


PTPN22. ................................................................................................................................. 49


CTLA4. .................................................................................................................................... 50

Tabela 5-1: Primerjava študij za SNP rs2476601. .................................................................. 51


VIII

Seznam slik

Slika 2-1: Prikaz simetrične prizadetosti sklepov (rdeča barva) in drugih organov (oči, srce,

pljuča, ledvice) (rumena barva) pri RA [8]. ............................................................................. 4

Slika 2-2: Imunopatogeneza RA [3]. ........................................................................................ 6

Slika 2-3: Prikaz zdravega in revmatoidnega sklepa [3]. ......................................................... 7

Slika 2-4: Vezavno ravnovesje in vezavno neravnovesje [18]. .............................................. 12

Slika 2-5: Položaj gena CCR6 [62]. ........................................................................................ 18

Slika 2-6: Položaj gena STAT4. [63] ....................................................................................... 18

Slika 2-7: Položaj gena SYNGR1 [72]. ................................................................................... 19

Slika 2-8: Položaj gena PTPN22 [73]. .................................................................................... 19

Slika 2-9: Položaj gena CTLA4 [75]. ...................................................................................... 20

Slika 3-1: Mešanica krvi in pufra PBS nanešenega na Ficol. ................................................. 24

Slika 3-2: Krvni vzorec, ki je po centrifugiranje razdeljen na štiri faze. ................................ 24

Slika 3-3: Prikaz postopka PCR reakcije [79]. ....................................................................... 27

Slika 3-4: Prikaz eksponentne rasti tarčne DNK [81]............................................................. 28

Slika 3-5: Primer razreza treh restrikcijskih encimov [83]. .................................................... 30

Slika 3-6: Razklop dvojne vijačnice DNK v enoverižno DNK [86]. ..................................... 32

Slika 3-7: Normalinizirana talilna krivulja. ............................................................................ 33

Slika 3-8: Normaliniziran diferencialni graf. .......................................................................... 33

Slika 3-9: Prikaz uporabe GeneRunner. ................................................................................. 36

Slika 4-1: Optimizacija optimalne temperature pripenjanja začetnih oligonukeotidov za rs909685

(SYNGR1). .............................................................................................................................. 39

Slika 4-2: Optimizacija koncentracij začetnih oligonukleotidov za rs909685 (SYNGR1). .... 40

Slika 4-3: Optimizacija volumna restrikcijskega encima za rs909685 (SYNGR1). ................ 41

Slika 4-4: Shematski in slikovni prikaz detekcije polimorfizma rs909685 (SYNGR1) na

agaroznem gelu. ...................................................................................................................... 44

Slika 4-5: Normalizirana in obdelana talilna krivulja HRM testa. ......................................... 45


IX

Uporabljeni simboli in kratice

Simboli c množinska koncentracija (M; mM)

f število obratov (vrt./min; g)

m masa (g)

t čas (h; min; s)

T temperatura (°C)

U napetost (V)

V volumen (L; mL; µL)

Grški simboli

masna koncentracija (g/L)

Δ /

λ valovna dolžina

Kratice

A adenin

anti-CCP protitelesa proti cikličnemu citruliranemu peptidu

bp bazni pari

C citozin

CI interval zaupanja

DNK deoksiribonukleinska kislina

dH2O destilirana voda

dNTP deoksiribonukleozid trifosfat

EDTA etilendiamin tetraocetna kislina

G gvanin

GWAS asociacijske študije na celotnem genomu

HCl klorovodikova kislina

HRM analiza talilne krivulje visoke ločljivosti

LD vezavno neravnovesje

LOD logaritem obetov

MgCl2 magnezijev klorid

NaCl natrijev klorid

NaOH natrijev hidroksid

OR razmerje obetov

p p-vrednost signifikance

PCR verižna reakcija s polimerazo

RA revmatoidni artritis


X

RE restrikcijski encim

RFLP polimorfizem dolžin restrikcijskih fragmentov

SNP polimorfizem posameznega nukleotida

T timin

TNF-α faktor tumorske nekroze alfa

TRIS 2-amino 2-hidroksimetil-1,3-propandiol

U enota


1

1 Uvod

1.1 Opredelitev problema

Revmatoidni artritis (RA) je kronična, vnetna bolezen, za katero zboli približno 1 %

prebivalstva. Ta bolezen prizadene vse sklepe in tudi notranje organe. Ženske za RA zbolevajo

od tri- do štirikrat pogosteje kot moški. RA se v nosečnosti umiri. Bolezen je posledica

kombinacije genetskih faktorjev in faktorjev okolja. Genetski faktorji predstavljajo približno

65 % dovzetnosti za bolezen [1].

Zdravljenje RA je individualno prilagojeno vsakemu bolniku. Poteka po smernicah, ki

predvidevajo, da je potrebno vedno upoštevati bolnikovo specifično stanje in položaj:

življenjski slog, starost, spol, kako dolgo RA že traja in stopnjo prizadetosi zaradi bolezni.

Glede na aktivnostno skalo bolezni (DAS28, ang. disease activity score) ločimo:

- remisijo,

- manjšo,

- zmerno,

- hudo aktivnost bolezni.

Za zdravljenje RA so na voljo zdravila iz različnih skupin:

- NSAIDS (nesteroidni antirevmatiki),

- glukokortikoidi,

- imunomodulatorji: metotreksat, leflunomid, sulfasalazin ipd. in

- biološka zdravila.

Prvi izbor, ki mu rečejo tudi zlati standard zdravljenja je običajno metotreksat. Zdravniki ga

predpisujejo za lajšanje bolečin in osnovnega vnetja.

Asociacijske študije celotnega genoma (GWA, ang. za genome wide association) so z RA

povezale že več kot 100 lokusov na genomu. GWA študije temeljijo na primerjavi frekvence

bolezenskega alela med kontrolami in bolniki, pri čemer genotipiziramo na tisoče

polimorfizmov posameznega nukleotida (SNP, ang. za single nucleotide polymorphism) v

celotnem genomu na skupini posameznikov z boleznijo in zdravih posameznikih. Kljub temu,

pa velik delež dejavnika dednosti ostaja neznanka. Ker se frekvence polimorfizmov SNP med

populacijami razlikujejo, je pomembno, da asociacijske študije za odkrite povezave

ponavljamo na različnih populacijah. SNP-ji, ki so do sedaj pokazali najmočnejšo povezavo z

RA v genih PTPN22, STAT4, TNFAIP3, PADI4 in CCR6, ki so prav tako biološko zelo

pomembni v patogenezi RA.

1.2 Namen, hipoteze in cilji

Namen magistrskega dela je ugotoviti ali so najmočneje povezani SNP-ji v GWA študijah

povezani tudi s slovenskimi bolniki z RA.

Hipoteza magistrskega dela je, da so izbrani polimorfizmi SNP povezani z RA v slovenski

populaciji.


2

V delu smo naredili obsežen pregled do sedaj objavljenih GWA študij na drugih populacijah

ter izbrali 5 SNP-jev. Izvedli smo genotipizacijo na vzorcih bolnikov in vzorcih zdravih

kontrol. Genotipizacijo smo izvedli s PCR-RFLP in HRM metodo. Povezavo analiziranih

SNP-jem smo nato statistično ovrednotili.


3

2 Revmatoidni artritis

Poznamo pet glavnih skupin revmatičnih bolezni [2]:

1. Zunaj-sklepni revmatizem

2. vnetne revmatične bolezni (kosti, sklepi, mišice):

a) revmatoidni artritis,

b) spondiloartritis

3. osteoartroza

4. sistemske vezivno-tkivne bolezni, ki lahko prizadenejo tako rekoč sleherni organ v

našem telesu

5. s kristali povzročeni artritisi (metabolni revmatizem).

Revmatoidni artritis (RA) je avtoimunska, kompleksna bolezen. Ta bolezen prizadene vse

sklepe in tudi obsklepne dele. Za RA lahko zboli vsak, najpogosteje pa ženske. Čeprav vzrok

za RA ni znan [3], se domneva, da je povezan s patogenimi povzročitelji ali alergeni novejšega

sveta [4].

2.1 Splošno o bolezni

Bolezen ni omejena le na sklepe, saj lahko prizadene skoraj vse organske sisteme (koža, ožilje,

srce, pljuča, oči in mišice) (slika 2-1). RA je razširjen po vsem svetu in prizadene ljudi vseh

ras in etničnih skupin, čeprav se zdi, da sta incidenca in pogostost manjša v ruralni sub-Saharni

Afriki in Karibih [5]. Razširjenost bolezni je približno 1 % in se lahko pojavi v vsaki starosti,

kar pomeni, da lahko zbolijo tako otroci kot tudi starejši. Najpogosteje pa zbolijo ljudje med

30. in 55. letom starosti. Dvakrat do trikrat pogosteje zbolevajo ženske kot moški [4].

Prevalenca se s starostjo poveča, razlika med spoloma pa se zmanjša [5]. V Sloveniji je okrog

20.000 bolnikov s to boleznijo.

Vzročnih dejavnikov za nastanek RA je več. Najpogosteje se bolezen pojavlja pri genetsko

dovzetnih ljudeh. Druge dejavnike, kot so okužbe, poškodbe, hormonske spremembe, zunanji

dejavniki, ki lahko sprožijo RA, še proučujejo. Pomembno vlogo pri sklepnem vnetju ima

imunski sistem. Le-ta ščiti organizem pred bakterijami, virusi in drugimi tujimi snovmi. Pri

RA imunski sistem napade lastna tkiva in sklepe ter druge organe [6].

Če se bolezen ne zdravi ustrezno, lahko privede do nastanka nepopravljivih okvar sklepov in

invalidnosti, posredno pa vodi do povečane umrljivosti. Bolniki z RA živijo 3 do 12 let manj

kot splošna populacija. Vzrok za hitrejšo umrljivost teh bolnikov so pogosto kardiovaskularne

bolezni, katerih incidenca je pri le-teh večja. Ustrezno oz. hitro zdravljenje bolezni ob uporabi

vseh razpoložljivih zdravil (tudi bioloških), lahko zavre napredovanje RA in podaljša življenje

teh bolnikov [7].


4

Slika 2-1: Prikaz simetrične prizadetosti sklepov (rdeča barva) in drugih organov (oči, srce, pljuča,

ledvice) (rumena barva) pri RA [8].


5

2.2 Patogeneza in patologija revmatoidnega artritisa RA je avtoimunska bolezen, ki jo sproži izpostavljanje genetsko dovzetnega gostitelja

neznanemu antigenu. Ponavljajoča avtoimunska reakcija z aktivacijo T celic pomagalk in

drugih limfocitov ter lokalno sproščanje vnetnih mediatorjev in citokinov je proces, ki uniči

sklep [3]. Postopek patogeneze prikazuje slika 2-2.

Antigen, ki sproži bolezensko dogajanje še ni znan. Bilo je veliko zanimanja za raziskovanje

mikrobnih antigenov kot začetnih povzročiteljev RA. Vendar za zdaj še niso našli trdnih

dokazov za identifikacijo mikroorganizma kot etiološkega agensa pri RA [3]. Antigen pride v

sinovijsko ovojnico. V sinovijski ovojnici le-tega predelajo antigen predstavitvene celice, ki

so lahko sinoviociti A (makrofagom podobne celice), makrofagi ali dentritične celice. Vse

predstavitvene celice izražajo antigene HLA-DR na svojih celičnih ovojnicah [4].

Med citokini, ki jih izločajo aktivirane antigen predstavitvene celice, sta najpomembnejša

interlevkin 1 (IL-1) in tumorje nekrotizirajoči faktor alfa (TNF-alfa) [3], [4]. Omenjena

citokina sta provnetna mediatorja, ki vzpodbujata različne celice (T celice pomagalke,

sinovijske celice, hondrocite, fibroblaste in endotelijske celice). Prav tako vplivata tudi na

razvoj simptomov pri RA (izguba apetita, hujšanje in povišana telesna temperatura). Pri RA

sta pomembna tudi limfokina interlevkin 2 (IL-2) in interferon gama (INF-gama). IL-2

spodbuja rast limfocitov T in B in diferenciacijo, ter aktivira T celice pomagalke. IFN-gama

aktivira makrofage in na antigen predstavitvenih celicah povečuje izražanje gena HLA-DR.

Sinovijske celice, hondrociti in fibroblasti pod vplivom provnetnih citokinov proliferirajo in

izločajo prostaglandin E2 in proteolitične encime [4].

Adhezijske molekule, ki jih izražajo aktivirane endotelijske celice na svoji površini,

privabljajo limfocite T in druge provnetne celice. Le-te nato migrirajo v sinovijsko tkivo.

Sinovijske, epitelijsko urejene celice nabreknejo in sinovija se zadebeli. Tvori se granulacijsko

tkivo, ki mu rečemo panus [4]. Ta se vrašča v sklepni hrustanec in ga razgrajuje. Po razgradnji

hrustanca se panus začne vraščati na kosti in tvori fibrozno ankilozo, ki okosteni [3].

Makrofagi in aktivirane endotelijske celice sintetizirajo levkotrien B4, ki deluje na granulocite

močno kemotaktično. Vzporedno citokini spodbujajo še proliferacijo limfocitov B in tvorbo

protiteles. Imunski kompleksi, ki jih protitelesa tvorijo z antigenom, se sproščajo v sklep. Tam

se vežejo v komplement, ki jih nato fagocitirajo polimorfonuklearni levkociti. Med fagocitozo

se tvorijo in sproščajo kisikovi prosti radikali, prostaglandini in različne proteaze, ki

povzročajo tkivno okvaro [4].


6

Slika 2-2: Imunopatogeneza RA [3].

2.3 Klinična slika

Začetek bolezni je navadno počasen in zahrbten pri več kot polovici bolnikov [3]. Spremljajo

jo splošni znaki, kot so slabo počutje, povišana temperatura, utrujenost, znojenje, izguba teka,

hujšanje, nespečnost in bolečine v sklepih. Oteklina in v akutni fazi tudi rdečina prizadetih

sklepov je najočitnejši znak [6]. Le občasno je začetek nenaden z izrazitim vnetjem številnih

sklepov [4]. Stalna bolečina in okorelost sta najhujša simptoma. Običajno so najprej prizadeti

manjši sklepi, katerim nato sledijo večji. Simptomi se pojavijo na sklepih prstov rok in nog.

Kasneje se simptomi razširijo še na zapestja, gležnje, komolce in kolena [3]. Spodnja slika 2-

3 prikazuje revmatoidni sklep.

Antigen (neznani

mikrob)

MHC razred II

(genetska dovzetnost)

CD4+ T celice

Citokini

Aktivacija B-celice

Aktivacija

makrofaga Aktivacija endotelija

Formacija revmatoidnega faktorja

Formacija imunskega kompleksa

Fibroblasti, hondrociste,

sinovijske celice

Izpust kolagenaz, elastaz, PGE2 in drugih

encimov

Poškodba sklepa

Nastanek panusa, razgradnja sklepa,

hrustanca; fibroza; ankiloza

Ekspresija vezavnih

molekul Proliferacija

Akumulacija vnetnih celic


7

Slika 2-3: Prikaz zdravega in revmatoidnega sklepa [3].

2.3.1 Prizadetost sklepov

Sinovitis pri RA simetrično zajame različne sklepe, najpogosteje metakarpofalangealne in

proksimalne interfalangealne sklepe rok in/ali zapestja ter metatarzofalangealne sklepe stopal.

Prizadeti so lahko tudi vsi veliki periferni sklepi in mali sinovijski sklepi hrbtenice, posebno

v vratnem delu (redko na začetku bolezni). Bolečina v sklepih je pri RA stalna, bolj intenzivna

je zgodaj zjutraj. Prizadeti sklepi so otekli, v kronični fazi tudi toplejši od okolice in včasih

pordeli. Zaradi bolečine in otekline so sklepi tudi omejeno gibljivi. Okorelost prizadetih

sklepov je pomemben simptom RA in lahko traja več ur. Najizrazitejša je zjutraj in po daljšem

počitku ter se pogosto ujema z aktivnostjo bolezni [4].

Pri napredovani, slabo zdravljeni ali nezdravljeni bolezni se razvijejo deformacije sklepov,

najpogosteje ulnarna deviacija in deformacije prstov rok v obliki labodjega vratu ter flektorne

kontrakture komolcev in kolen [4].

Pri RA je pogost sinovitis upogibalnih in izteznih kitnih ovojnic na rokah. Najpogosteje ga

vidimo nad zapestji in na hrbtišču rok, kjer se pojavi kot podkožna vretenasta elastična in

boleča zatrdlina. V kronični fazi RA so prisotne tudi sinovijske ciste in sinovijske hernije, ki

nastanejo zaradi povečanega pritiska v vnetno spremenjenih sklepih. Najpogostejša je

Bakerjeva cista v kolenski jami, ki nastane zaradi raztezanja središčnih kitnih burz

gastroknemične in semitendinozne mišice [4].

Dentridska

celica


8

2.3.2 Prizadetost drugih organov

Zunajsklepno prizadetost se opaža pri bolnikih s hujšo obliko bolezni. Domnevajo, da se

razvije zaradi vpliva imunskih kompleksov, ki sprožijo vaskulitis in zaradi vpliva rastnih

faktorjev. Oblike izvensklepnih prizadetosti so lahko naslednje [4]:

- Revmatoidni vozliči nastanejo predvsem pri serološko pozitivnih bolnikih (pri 20 do

25 %). Nahajajo se podkožno, na mehanično izpostavljenih mestih: iztezne strani

komolcev, podlakti, na malih sklepih rok, nad kolenoma, redkeje tudi v notranjih

organih. Histološka slika revmatoidnega vozliča prikazuje v sredini prisotna

fibrinoidna nekroza veziva, katero obdaja plast palisadno razporejenih fibroblastov, ki

so obkroženi z granulacijskim tkivom, ta pa vsebuje številne skupke mononuklearnih

celic ob žilah.

- Kožni vaskulitis se pojavlja pr hujši obliki RA in prizadane oba spola enako. Pojavlja

se kot pikčaste krvavitve, tipna purpura, drobni infarkti ob nohtih, kožne razjede,

gangrena. Razjede na koži se pogosto zagnojijo in so prisotne na hrbtišču stopal in

okoli gležnjev.

- Vaskulitis notranjih organov je možen na srcu, pljučih, črevesju, ledvicah, jetrih,

trebušni slinavki, bezgavkah, modih.

- Revmatična pljuča so najpogostejša komplikacija revmatoidnega artritisa. Prizadeta

sta lahko pljučni parenhim z ožiljem in plevra, kar se kaže kot kronična fibrozirajoča

pljučnica, revmatoidni vozliči, difuzni fibrozirajoči alveolitis ali plevritis. Omenjene

spremembe pljuč se navadno razvijejo pri dalj časa trajajočem RA. Redko kot prvi in

izolirani pojav bolezni.

- Pri spremembah na srcu je najpogostejši perikarditis (1 do 10 % bolnikov), ki se

navadno pojavi zgodaj, ko je RA še zelo aktivna. Redko se pojavlja endokarditis,

revmatoidni vozliči, miokarditis in koronaritis.

- Spremembe na očeh so pri RA pogoste. Pojavi se lahko episkleritis, skleritis,

prizadetost veznice in roženice v sklopu sindroma suhih oči. Pojavijo se lahko depoziti

zlata v roženici kot posledica zdravljenja RA z zlatom, spremembe mrežnice po

jemanju antimalarikov in siva mrena po zdravljenju s kortikosteroidi.

- Nevrološka prizadetost. Utesnitveni sindromi, difuzna senzorična nevropatija, multipli

mononevritis, vratna mielopatija (pri atlantoaksialni dislokaciji ali subluksaciji).

- Amiloidoza prizadane 5–15 % bolnikov in je najpogostejša v ledvicah, redkeje na srcu,

jetrih, vranici ali prebavilih.

2.3.3 Laboratorijski testi

Avtoimunske bolezni kot je RA so pogosto karakterizirane s prisotnostjo protiteles.

Revmatoidni faktor ni specifičen za RA in je lahko prisoten tako pri bolnikih z drugimi bolezni

(npr. hepatitis C) kot tudi pri zdravih ljudeh. Protitelesa proti cikličnemu citruliranemu peptidu

(anti-CCP) so visoko specifična za RA in lahko imajo vlogo pri patogenezi bolezni [7]. Poleg

diagnostične vrednosti, ki jo imajo, so tudi dober prognostični dejavnik. Približno 50 do 80 %

bolnikov z RA ima v krvi revmatoidni faktor, anti-CCP ali oboje, takrat govorimo o serološko

pozitivnem RA. IgM proti revmatoidnemu faktorju določamo z Waaler-Rosejevo reakcijo in

lateks testom, z encimsko imunskim testom (ELISA) pa poleg IgM določamo še IgA in IgG

proti revmatoidnemu faktorju. Sedimentacija eritrocitov je navadno pospešena in v sorazmerju

z aktivnostjo bolezni. Koncentracija reaktivnega proteina C v serumu je običajna. Pogosto se

pojavlja normocitna ali mikrocitna anemija [4]. S hitrostjo sedimentacije eritrocitov in

koncentracije reaktivnega proteina C v serumu lahko sledimo napredku bolezni in odzivu na

zdravila [7]. Sočasna prisotnost anti-CCP in IgM proti revmatoidnemu faktorju namreč kaže

na bolj neugoden potek bolezni z zelo zgodnjim pojavom erozij [4].


9

2.4 Diagnoza Diagnozo RA postavi osebni zdravnik, ki jo nato potrdi revmatolog. Bolezen diagnosticiramo

na podlagi bolnikovih težav, telesnega pregleda, s krvnimi preiskavami, rentgenskim

slikanjem, ultrazvokom, ipd. Pri postavitvi diagnoze so bila v pomoč klasifikacijska merila iz

leta 1987, ki jih prikazuje tabela 2-1. Vendar so bila merila iz leta 1987 primernejša za

postavitev diagnoze pri bolnikih z že razvito obliko bolezni. Za zgodnjo odkrivanje

nediferenciranih oblik artritisa pa imajo nizko občutljivost [9]. Sodobno zdravljenje narekuje

hitro diagnozo, zato so strokovnjaki Ameriškega revmatološkega združenja in Evropske lige

proti revmatizmu leta 2010 izdelali nova klasifikacijska merila (Tabela 2-1) [10].

Tabela 2-1: Klasifikacijska merila RA glede na simptome [11].

Kriteriji Ameriškega

revmatološkega združenja leta

1987

Kriteriji Ameriškega

revmatološkega združenja leta

2010

1. Jutranja otrdelost sklepov vsaj 1 uro

pred popolnim izboljšanjem

2. Artritis treh ali več sklepov

3. Artritis na sklepih v roki

4. Simetrični artritis

5. Revmatoidni noduli

6. Pozitiven revmatoidni faktor

7. Radiografske spremembe na rokah

ali zapestjih (erozija ali pomanjkanje

kalcija)

1. Prizadetost sklepov (0-5 točk))

- Eden srednji ali velik sklep (0 točk)

- Dva do deset srednjih ali velikih

sklepov (1 točka)

- Ena do tri malih sklepov (2 točki)

- Štiri do deset sklepov (veliki sklepi

niso šteti)(3 točke)

- Več kot deset sklepov (vsaj en mali

sklep)(5 točk)

2. Serologija (0-3 točke)

- Negativen revmatoidni faktor in

negativen proti-citrulinirani

protein/protitelesa (0 točk)

- Nizko pozitiven revmatoidni faktor ali

nizko pozitiven proti citrulinirani

protein (2 točki)

- Visoko pozitiven revmatoidni faktor

ali visoko pozitiven proti citrulinirani

protein (3 točke)

3. Akutni parametri vnetja (0-1 točka)

- Reaktivn protein C ni zvišan in

sedimentacija eritrocitov ni pospešena

(0 točk)

- Zvišan reaktivni protein C ali

pospešena sedimentacija eritrocitov (1

točka)

4. Trajanje simptomov (0-1 točka)

- Manj kot šest tednov (0 točk)

- Šest tednov ali več (1 točka)

Pri bolniku z razvito klinično sliko serološko pozitivnega RA pravilne diagnoze običajno ni

težko določiti. Težje je ločiti začetne znake RA od drugih sorodnih bolezni. Virusne okužbe

potekajo pogosto s sklepnimi bolečinami in celo otekanjem sklepov. Nekaterim vrstam

bakterijskih okužb lahko sledijo artritisi. Diferencialno diagnostično nam v teh primerih

pomagajo natančna anamneza o okužbi ter pozitivni laboratorijski testi na povzročitelja

okužbe.


10

2.5 Genetske študije pri RA Najpomembnejši pristopi, ki se uporabljajo za odkrivanje genetskih lokusov, povezanih z RA

so [12]:

- študije genetske vezave,

- asociacijske študije:

- asociacijske študije kandidatnih genov

- asociacijske študije celotnega genoma.

Uporaba študij genetske vezave in študij kandidatnih genov za odkrivanje genetske

dovzetnosti ni dala nobenih dokončnih odgovorov glede etiologije RA [13]. Asociacijske

študije celotnega genoma so se izkazale za najbolj uspešne [12].

2.5.1 Študije genetske vezave

Pretekla desetletja so bile analize genetske vezave vodilne pri genetskih študijah bolezni.

Študije genetske vezave testirajo kosegregacijo genetskih markerjev in fenotipov bolezni z

uporabo družinskih podatkov. Signifikantni rezultat genetske vezave pokaže, da sta marker in

susceptibilni gen genetsko povezana. Analize vezave so bile zelo uspešne pri mnogih redkih

monogenskih bolezni.

Slabost študije analize genetske vezave je v tem, da potrebuje veliko obolelih svojcev [15].

Omejen uspeh analize genetske vezave pri kompleksnih boleznih je zaradi nezadostne moči

in resolucij za odkrivanje variant [12]. Alternativna metoda za genetske študije vezave so

asociacijske študije.

Cilj analize genetske vezave je določiti nahajanje gena ali genov, ki so odgovorni za nastanek

bolezni. Poznamo dve vrsti analize genetske vezave: parametrično in neparametrično. Če je

dovolj informacij glede parametrov (dednost in DNK številnih članov iste družine), uporabimo

parametrično študijo genetske vezave. Če pa je genetski model neznan, se uporabi

neparametrična študija. Parametrična študija genetske vezave je močna strategija za mapiranje

genov z Mendlovim tipom dedovanja. Rezultat te študije je izražen z LOD vrednostjo

(logaritem obetov). LOD vrednost je funkcija rekombinantnega količnika (ϴ). Rekombinantni

količnik poda verjetnost rekombinacije med dvema markerjema. Dva lokusa sta povezama

takrat, kadar je rekombinantni količnik manj kot 0,5. Če je LOD vrednost 3 (kar ponazarja

verjetnost 1000:1) ali več je to dokaz statistično signifikantne vezave. Negativna LOD

vrednost dokazuje odsotnost vezave [16].

2.5.2 Asociacijske študije

Namen genetskih asociacijskih študij je odkriti povezavo med enim ali več genetskimi

polimorfizmi in lastnostmi, ki so lahko kvantitativno značilne ali diskretni atributi ali bolezni.

Asociacijska študija se razlikuje od vezavne študije po tem, da je isti alel (ali aleli) povezan z

lastnostmi na podoben način skozi celotno populacijo, medtem, ko so pri analizi vezave

različni aleli asociirani z lastnostjo v različnih družinah. Asociacijske študije lahko

obravnavamo kot študije vezave, saj imamo ljudje skupne prednike, kjer je povečana družina

širša populacija. Asociacijske študije delujejo na kratke razdalje v genomu. Z asociacijskimi

študijami lahko odkrijemo majhne učinke, ki jih imajo geni, ki so prisotni pri običajnih

kompleksnih boleznih. Toda pregledati moramo veliko več markerjev kot pri vezavni. To


11

spoznanje je, skupaj z identifikacijo velikega števila polimorfizmov posameznega nukleotida

(SNP) v genomu in zmanjšanja stroškov genotipizacije, privedlo do pomembnosti

asociacijskih študij v genetski epidemiologiji [17].

Z asociacijskimi študijami skušamo najti povezavo med polimorfizmi SNP in boleznijo pri

posameznikih, ki niso v sorodu. Asociacijo izvedemo tako, da primerjamo frekvence alelov

med skupino bolnikov in kontrolno skupino zdravih posameznikov, t.j. študija

primeri:kontrole.

Asociacijske študije so deljene na posredne in neposredne študije. Pri posrednih asociacijskih

študijah je kandidatni gen znan. Asociacija je direktna. Metoda uporablja kavzalno mutacijo

določenega gena pri analizi asociacije bolezenskega fenotipa. Pri neposredni metodi

kandidatni gen ni znan in je vezan na genske markerje. Vezavno neravnovesje (LD – linkage

disequilibrium) je oblika neposredne metode [17].

Vezavno neravnovesje (LD – linkage disequilibrium)

Kartiranje genov za kompleksne motnje in drugih genskih značilnosti z indirektno metodo je

odvisno od asociacije na stopnji populacije, med naključnimi variacijami in bližnjimi markerji

[17].

LD opisuje zvezo med aleli, ki so na različnih lokusih. Vezavno neravnovesje med aleloma je

takrat, ko asociacija med dvema aleloma v dveh lokusih ni naključna. Če pa je asociacija med

aleloma v dveh lokusih naključna, takrat govorimo o vezavnem ravnovesju (LE-linkage

equilibrium) [16].

Za merjenje LD se uporablja veliko različnih parametrov, med njimi tudi Lewontinov D', ki

se imenuje tudi »asociacijska verjetnost« [7] in indeks r2 [8]. Lewontinov D' je pomemben

parameter za identifikacijo regij, v katerih je bilo malo rekombinacij in kjer je možnost za

kartiranje kavzalnih lokusov z indirektnimi asociacijskimi študijami. [6] Kadar je vrednost D'

= 0, takrat govorimo o popolnem vezavnem ravnovesju. D' = 1 ponazarja popolno LD, kjer ni

rekombinacije med dvema markerjema pri populaciji [8]. Indeks r2 nam pokaže moč

neposrednih študij. Kljub temu, da so loci v popolnem neravnovesju (D' = 1), lahko indeks r2

variira. Vrednosti indeksa r2 so povezane s frekvencami alelov in s pozicijo korespodenčnih

mutacij [17].

Slika 2-4 prikazuje dva originalna kromosoma (eden je modri, drugi oranžen). Rekombinacije

v družini iz generacije v generacijo ločujejo kromosomske segmente. Učinek se skozi

generacijo še ojača in na populaciji fiksne velikosti doživlja naključno parjenje. Ponavljajoča

naključna rekombinacija bo ločila segmente strnjenega kromosoma (vsebuje povezane alele),

dokler ne bodo vsi aleli v populaciji v vezavnem ravnovesju ali pa bodo neodvisni. Vezavo

med markerji pri populaciji imenujemo vezavno neravnovesje [18].


12

Slika 2-4: Vezavno ravnovesje in vezavno neravnovesje [18].

2.5.2.1 Študije kandidatnih genov

Osredotočajo se na specifičen gen, ki je izbran na podlagi njegove etiološke vloge v bolezni,

in je pogosto povezan z razumevanjem biološke poti. Študije so poceni in hitro opravljene.

Metoda vključuje genotipizacijo markerjev znotraj izbranega gena med vzorci bolnikov in

kontrol. Študije kandidatnih genov so v preteklosti odkrile številne povezave za kompleksne

bolezni, ki pa so bile težko ponovljive in v nekaterih primerih so preveč ocenile genetski vpliv

na bolezen [14]. Ta pristop je prav tako omejen zaradi odvisnosti od predhodnega poznavanja

biologije bolezni in zaradi zelo subjektivne izbire potencialnih genov [12].

Vezavno ravnovesje med družino

Točka rekombinacije

Začetna generacija

Generacija 1

Generacija 2

Generacija 3

Vezava med dvema

točkama/markerjema

Vezavno neravnovesje med populacijo

Začetna

generacija

100

generacij

1000

generacij Populacija se čez čas premakne iz

vezavnega neravnovesja v vezavno

ravnovesje


13

2.5.2.2 Asociacijske študije na celotnem genomu

Asociacijske študije na celotnem genomu (ang. Genome Wide Association Studies, GWAS)

sistematično preiščejo celoten genom z namenom odkrivanja SNP-jev, povezanih z boleznijo.

Zadnjih nekaj let so GWAS pripomogle pri razumevanju in odkrivanju polimorfizmov,

povezanih s kompleksnimi bolezni in tako predstavljajo zanesljiv in na široko uporabljen

pristop [12]. Uspeh GWA študij se lahko pripiše trem glavnim dejavnikom v humani genetiki:

(1) Zaključek projekta Humanega genoma leta 2001 [19], katerega cilj je bil razviti

haplotipsko strukturo humanega genoma, ki bo opisal skupne vzorce genskih variacij

človeškega genoma in zaključek HapMap projekta leta 2003 [20].

(2) Razvoj zanesljivih in cenovno ugodnih platform za genotipizacijo [21].

(3) Oblikovanje konzorcijev za proučevanje velikega števila kompleksnih bolezni [21].

GWA študije genotipizirajo veliko število SNP-jev v celotnem genomu na veliki skupini

bolnikov (primeri) in zdravih posameznikov (kontrole). Nična hipoteza GWA študije pravi,

da med danim SNP-jem in nastankom bolezni ni povezave. Hipoteza se testira s primerjavo

alelnih frekvenc ali s frekvencami genotipov med primeri in kontrolami. Nična hipoteza ni

potrjena takrat, ko je nivo signifikance p = 5 x 10-8 in je genski marker zaznal prisotnost

vzročne variante [22]. Napredek v tehnologiji, predvsem pri razvoju DNK mikročipov in nižji

stroški, so omogočili razpon GWA študij. Označevalci, ki jih za posamezno bolezen

ugotovimo, so pogosto v vezavnem neravnotežju [12].

Uspeh in popularnost te strategije je prikazana v spletnem katalogu, ki vsebuje 812 objavljenih

GWA študij za 476 različnih kompleksnih bolezni od marca 2011 in še vedno raste [12].

2.6 Genetika RA

Prve dokaze za genetsko dovzetnost pri RA so dokazale prav študije dvojčkov in družinske

študije. Študije dvojčkov so pokazale vlogo genetskih faktorjev za RA, s konkordanco od 12-

15 % med enojajčnimi dvojčki in 2-4 % med dvojajčnimi dvojčki [23], [24], [25]. Družinske

študije in študije dvojčkov so pokazale velik vpliv genetske komponenten na razvoj RA,

katerih dednost je ocenjena med 50-60 % [24], [26].

Najbolj pomemben genetski faktor za RA je HLA lokus [22]. Študije so pokazale, da so

številni HLA-DRB1 aleli povezani z RA in da so različni aleli povezani z različnimi etničnimi

populacijami [27], [28].

HLA-DRB1 aleli, ki so znotraj glavnega histokompatibilnega kompleksa (MHC), so

odgovorni za imunski odziv. Peptidi, produkti teh genov, so na površinah celic in so odgovorni

za vezavo HLA-antigena in posredovanje le tega limfocitom T. Vsi HLA-DRB1 aleli, ki so

povezani s pojavom RA, imajo skupno regijo podobnih zaporedij. Ti aleli se imenujejo tudi

skupni epitopi (SE) [25], [29]. Domneva se, da so prav SE odgovorni pri patogenezi RA, ki

določijo kateri patogeni peptid bo predstavljen limfocitom T. Natančen mehanizem tega

procesa še ni poznan [25].

HLA lokus je najbolj močan genetski faktor in predstavlja okoli 30 % genetske dovzetnosti za

RA [30].

Preteklo je skoraj 30 let, preden so odkrili genetske povezave zunaj HLA lokusa. Najprej sta

bila odkrita gena PADI4 in PTPN22. Prvi gen, povezan z RA, je bil PADI4 in je bil odkrit pri


14

japonski populaciji na kromosomu 1p36 leta 2003 [31]. PADI4 spada v gensko družino

peptidil arginin deaminaz (PADI4). Ta gen kodira PAD encim, kateri je potreben za

posttranslacijsko modifikacijo arginina v citrulin. Asociacijo so uspešno ponovili še na drugih

azijskih populacijah. Niso je pa mogli ponoviti na populaciji evropejcev [32], [33]. Po odkritju

gena PADI4 so v povezavi z RA odkrili še gen PTPN22 leta 2004 pri evropejski populaciji

[34]. Po letu 2004 se je odkrivanje novih genetskih faktorjev za RA pospešilo zaradi napredka

pri genotipizaciji. Z asociacijsko študijo kandidatnega gena so odkrili CTLA4 gen [35],

kateremu je sledilo odkritje TRAF1/C5 regije [36]. Povezava gena STAT4 z RA je bila odkrita

s kombinacijo asociacijske študije kandidatnih genov in študije genetske vezave [37].

Številne GWA študije so bile izvedene na svetovni populaciji in so odkrile številne z RA

lokuse, vključno s PADI4, PTPN22 [38], TNFAIP3 [39], TRAF1/C5 [40], REL [41] in CCR6

[42]. REL predstavlja dober primer RA lokusa, ki je bil odkrit z neodvisno GWA študijo [41]

in ga niso odkrili s predhodno asociacijsko študijo [43]. Vendar pa vsaki od teh študij

primanjkuje statistične moči za odkritje lokusov, ki imajo zmerno velikost [22]. To omejitev

so premostili z meta-analizami. Leta 2008 so odkrili dodatni lokus z meta-analizo različnih

GWAS, ki se nahaja v bližini gena CD40 [44]. Z meta-analizami GWA študij evropejskih in

azijskih populacij so povečali število lokusov [45], [46]. Nedavno nazaj so izvedli večetnično

metastatistično GWA študijo, v kateri je sodelovalo 25 študijskih skupin iz celega sveta in

skupaj več kot 100,000 preiskovancev (29,880 primerov RA in 73,758 kontrol) azijskega in

evropejskega porekla. To je bila največja meta-analiza za imunske bolezni GWA študije, ki

so bile kadarkoli izvedene. V tej študiji so potrdili 101 genetskih lokus povezan z nastankom

RA [47].

Imunočip olajšuje gosto genotipizacijo in kartiranje 186 genetskih lokusov, vključno z že

potrjenimi avtoimunskimi lokusi in drugimi aleli. Z uporabo imunočipa, so v tej študiji

identificirali 14 genetskih lokusov za RA. Zanimivo je, da so SNP na genu PADI4, ki je

nedvomno povezan z RA v azijski populaciji v prejšnjih študijah, prav tako povezali tudi z

RA bolniki evropejskega porekla [48]. Tega jim v prejšnjih študijah ni uspelo. Prav tako so v

študiji leta 2013 [49] s pomočjo imunočipa pri Korejcih in Evropejcih identificirali dodatnih

8 novih genetskih lokusov za RA. Med njimi je tudi SNP rs909685.

Čeprav so GWA študije močno orodje za identifikacijo z boleznijo povezanih lokusov, ostaja

velik delež dejavnika dednosti neznanka. Pri RA odkritih 101 lokusov, ki so jih odkrili zunaj

HLA regije, razložijo samo 5,5 % in 4,7 % tveganja za nastanek bolezni pri evropejcih in

azijcih [47]. Analiza GWAS podatkov z uporabo Bayesian pristopa sklepanja je ocenila, da

100 do 1000 lokusov vsebuje skupne vzročne variante, ki skupaj z HLA-DRB1 in GWAS

identificiranih lokusov razložijo le približno 30 % tveganja za RA. To je približno polovica

dedovanja [50]. Preostali genetsi dejavnik veganja lahko razložimo z vplivom redkih variant,

katere frekvenca alela je < 1 % [51]. Redke variante pa se lahko analizirajo le s tehnologijo

sekvenciranja, ki zagotovijo večjo statistično moč.

2.7 Zdravljenje

V večini primerov je RA neozdravljiva bolezen. Le 5 % bolnikov doseže spontano remisijo

bolezni [52]. Obstoječa zdravljenja zato niso usmerjena k odstranjevanju vzrokov, temveč

zgolj blažijo vnetne reakcije in skušajo upočasniti napredovanje bolezni. Za uspešno terapijo


15

RA je bilo ključno spoznanje, da so erozije kosti in deformacije sklepov ireverzibilne, zato je

zgodnja diagnoza in čim hitrejši pričetek zdravljenja bistvenega pomena. Le na ta način lahko

preprečimo trajne poškodbe in uničenje sklepov. Cilj antirevmatskega zdravljenja je dvojen in

zajema remisijo simptomov bolezni (zmanjšanje bolečine v sklepih in zatekanje,

preprečevanje deformacij) ter spremembo poteka bolezni. Zdravila z nesteroidnimi

protivnetnimi učinkovinami (ang. non-steroidal anti-inflammatory drugs ali NSAIDs) se

uporabljajo za odpravljanje simptomov RA, kot so vnetje in bolečine v sklepih. Zdravljenje z

NSAIDs je simptomatsko, zaradi česar ni nobenega učinka na dolgoročne posledice bolezni.

Potek RA spreminjamo z imunomodulirajočimi protirevmatičnimi učinkovinami /zdravili

(ang. Disease modifying antirheumatic drugs ali DMARDs) in kortikosteroidi, katerih učinek

je večplasten [53].

Zaporedje ukrepov pri zdravljenju RA je naslednje [54]:

1. zgodnja uporaba DMARD (praviloma metotreksata),

2. redni pregledi in sistematično spremljanje terapevtskih učinkov,

3. hitro stopnjevanje terapije (višanje odmerkov in krajšanje odmernega intervala),

4. uvedba kombinirane terapije,

5. uvedba zdravljenja z biološkimi zdravili, če bolnik ni odziven na DMARD,

6. zamenjava biološkega zdravila, če bolnik ni odziven na prvega ali če pride do

znižane učinkovitosti prvega,

7. uvedba pomožnega zdravljenja s kortikosteroidi (praviloma časovno omejena).

Operativno zdravljenje je potrebno, kadar nastanejo nepopravljive okvare sklepov in

obsklepnih struktur. Dolgoročni rezultati so dobri. Ponovitev operativnega posega je

potrebna samo pri 4 do 13 % bolnikov [8].

Pri zdravljenju RA je pomembna tudi redna telesna aktivnost [55]. Le-ta mora biti prilagojena

potrebam in zmožnostim vsakega posameznika, zaradi česar so v proces zdravljenja vključeni

tudi fizioterapevti in delovni terapevti, ter psihologi, psihiatri in socialni delavci.

2.8 Farmakološko zdravljenje Kot je že omenjeno v poglavju 2.7, se zdravila, ki se uporabljajo pri zdravljenju RA, delijo v

naslednje skupine:

- zdravila z nesteroidnimi protivnetnimi učinkovinami (NSAIDS) in analgetiki,

- glukokortikoidi,

- imunomodulirajoče protirevmatične učinkovine (DMARDS)

- biološka imunomodulirajoča zdravila

2.8.1 Zdravila z nesteroidnimi protivnetnimi učinkovinami (NSAIDs) in analgetiki

NSAIDS delujejo zaviralno na encime iz skupine ciklooksigenaz (COX). Ti encimi so v telesu

odgovorni za sintezo prostaglandinov, ki imajo funkcijo mediatorjev vnetja, povzročijo dvig

telesne temperature in povečajo vzdraženost živčnih končičev. Zaviralci COX pa delujejo

protivnetno, protibolečinsko in protivročinsko. NSAIDS delimo na neselektivne in selektivne

(COX-2) zaviralce. Selektivni zaviralci COX-2 imajo manj neželenih učinkov na prebavila

[6]. V primerjavi s klasičnimi neselektivnimi NSAID pa povzročajo več neželenih učinkov na

srčno-žilnem sistemu [56]. V zadnjih letih se je izkazalo, da so vsi NSAIDS, razen naproksena

in deloma ibuprofena, odgovorni za neželene učinke na srčno-žilnem sistemu [57].


16

2.8.2 Glukokortikoidi

Kortikosteroidi se uporabljajo zaradi pleotropnih protivnetnih učinkov. Zaradi hitrega

delovanja hitro umirijo vnetje. Včasih je bila njihova uporaba precej razširjena. Danes pa se

jih uporablja s previdnostjo, saj ob dolgotrajnem zdravljenju povzročajo neželene stranske

učinke (osteoporoza, arterijska hipertenzija, steroidni diabetes, itn.) [55].

Zdravljenje RA z glukokortikoidi v kombinaciji z DMARD upočasni nastanek erozivnih

sprememb [58]. Najpogosteje se uporablja metilprednizolon.

Kombinacija NSAIDS in kortikosteroidov ni priporočljiva.

2.8.3 Imunomodulirajoče protirevmatične učinkovine (DMARDs)

DMARDs v kombinaciji z glukokortikoidi uporabljamo za vzdrževanje remisije. Ta zdravila

na različne načine zavirajo imunski sistem in so pri zdravljenju RA precej spremenila

prognoze te bolezni. Predstavljajo terapijo prvega izbora in jih je potrebno začeti uporabljati

v najkrajšem možnem času po postavitvi diagnoze. Zmanjšajo aktivnost bolezni, omejijo

okvaro sklepov in preprečujejo invalidnost [52].

Iz skupine DMARDs se uporabljajo metotreksat, leflunomid in sulfalsalazin. Druga zdravila

iz te skupine (antimalariki, azatioprin, ciklofosfamid, parenteralno zlato in ciklosporin A) se

zaradi učinkovitejših in varnejših alternativ pri zdravljenju RA le redko uporabljajo [52].

V skupino DMARDs se uvršča tudi novo zdravilo tofacitinib, ki zavira encim JAK3 kinazo.

Ameriška agencija za zdravila in prehrano (ang. FDA) je njegovo uporabo za zdravljenje RA

udobrila, medtem ko Evropska agencija za zdravila njegove uporabe ni udobrila. Trenutno je

namenjem za zdravljenje tistih bolnikov z RA, pri katerih zdravljenje s klasičnimi in

biološkimi NSAIDs ni bilo uspešno [52].

Metotreksat (MTX) je visoko učinkovit in varen, zato velja za zdravilo prvega izbora [59].

Glavni mehanizem delovanje je zaviranje encima dihidro folat reduktaza, ki je potreben v

sintezi DNK.

Najpogostejši neželeni učinki so slabost, bruhanje, driska, hematološki odkloni in toksičen

vpliv na jetra [60].

Zdravilo drugega izbora je leflunomid, na katerega preidemo ob neučinkovitosti ali

nezaželenih stranskih učinkov MTX.

Leflunomid uporabljamo v monoterapiji ali v kombinaciji z MTX. Zavira delovanje encima

dihidroorotatna dehidrogenaza in s tem zavira sintezo pirimidinskih nukleotidov in posledično

razrast limfocitov T.

Najpogostejši neželeni učinki so hujšanje, izpadanje las, kožne spremembe, driska, arterijska

hipertenzija, hematološki odkloni in toksični vpliv na jetra.

Sulfalsalazin se kot monoterapija pri zdravljenju RA le redko uporablja. Pogosteje se

uporablja v kombinaciji z MTX. Čeprav mehanizem delovanja ni povsem pojasnjen, se je

pokazalo zaviranje izločanja citokinov, izločanje makrofagov in apoptoze limfocitov T.

Najpogostejši neželeni učinki so slabost, bruhanje, zvišana telesna temperatura, kožni

izpuščaj, fotosenzitivnost in glavobol.

2.8.4 Biološka DMARDs

Biološka DMARDs se uporabljajo ob odpovedi ali neželenih učinkih standardnih zdravil. Na

različne načine zavirajo delovanje specifičnih citokinov ali celic. Tako zmanjšajo vnetje in

upočasnijo napredovanje bolezni. Zdravljenje z biološkimi zdravili poveča tveganje za okužbe


17

in aktivacijo latentne tuberkuloze ali virusnega hepatitisa. Ob zdravljenju je nujen reden

laboratorijski nadzor.

Zaviralci TNF-alfa. TNF-alfa je eden izmed glavnih provnetnih citokinov. Zaviranje

njegovega delovanja ima protivnetni učinek. V to skupino uvrščamo monoklinska protitelesa

(adalimumab, certolizumab pegol, infliksimab, golimumab) in TNF-alfa receptor, vezan na Fc

del IgG1-etanercept, ki specifično vežejo TNF-alfa in preprečijo vezavo na njegove receptorje.

Uporabljajo se v kombinaciji z MTX ali leflunomidom.

Tocilizumab je monoklinsko protitelo, ki je usmerjeno proti receptorju za IL-6. IL-6 je

provnetni citokin s širokim spektrom delovanja. Je edino biološko zrdavilo, ki je pokazalo

podobno učinkovitost v monoterapiji kot v kombinaciji z MTX pri zdravljenju RA [59].

Kontraindikacija za zdravljenje s tocilizumabom je divertikuloza črevesja.

Rituksimab je monoklinsko protitelo, ki je usmerjeno proti antigenu CD20. Antigen CD20 se

nahaja na površini nezrelih limfocitov B. Rituksimab po vezavi povzroči apoptozo tarčne

celice. Uporablja se v kombinaciji z MTX ali leflunomidom.

Anakinra je rekombinantna beljakovina, ki deluje kot antagonist receptorja IL-1. Receptor

IL-1 spodbuja vnetje z indukcijo IL-6 in COX. Pri zdravljenju RA se redko uporablja.

2.9 Genotipizacija Genotip je genska zasnova organizma. Nanaša se lahko na kompleten genom ali na posamezen

odsek DNK, ki je lahko gen ali pa posamezen SNP. Genotip SNP-ja je tako lahko:

- ˝wild type˝, ki je homozigot za normalen alel,

- homozigot za mutiran alel in

- heterozigot, ki vsebuje oba alela.

Genotipizacija je proces ugotavljanja genotipa posameznika. Pri vsakem posamezniku se

lahko ugotavlja genotip enega ali večih genov/SNP-jev. SNP markerji se uporabljajo pri

genotipizaciji bolezni ali določanju pripadnosti določeni etnični skupini. Pojavljanje SNP-jev

je povezano s pojavljanjem določenega gena. Pri določanju verjetnosti za razvoj kompleksnih

bolezni ugotavljamo, kakšen genotip ima za določene markerje posameznik [61]. Za gensko

tipizacijo polimorfizmov se uporabljajo različne metode, npr. verižna reakcija s polimerazo

(PCR), polimorfizem dolžin restrikcijskih fragmentov (RFLP), analiza talilne krivulje visoke

ločljivosti (HRM), itd.

2.10 Opis SNP-ov uporabljenih v nalogi

2.10.1 rs1571878 (CCR6)

CCR6 ali kemokinski (C-C) receptor 6 se nahaja na dolgi ročici q kromosoma 6 na položaju

27 (6q27). Položaj gena prikazuje slika 2-5.

Gen kodira člana iz družine beta kemokinskih receptorjev. CCR6 je izražen iz nedozorelih

dendritskih celic in spominskih T celic. Ligand teh receptorjev je makrofag vnetni protein 3

alfa (MIP-3 alfa). Ta receptor je pomemben za B linijsko dozorelost in diferenciacijo antigen

B celice, ter regulacijo migracije dentritskih in T celic med vnetnim in imunskim odzivom

[62].

CCR6 povezujejo z RA, Chronovo boleznijo in Basedovo boleznijo [22].


18

Slika 2-5: Položaj gena CCR6 [62].

2.10.2 rs7574865 (STAT4)

Signalni pretvornik in aktivator transkripcije 4 oz. STAT4 spada v družino genov, ki vsebujejo

SH2 domene. Gen je lociran na daljši ročici kromosoma 2 med položajema 32.2 in 32.3

(2q32.2-q32.3), kar prikazuje slika 2-6 [63].

STAT4 je član družine sedmih transkripcijskih faktorjev, kar pomeni, da se veže na specifično

mesto na DNK in pomaga kontrolirati aktivnost določenih genov. STAT4 aktivirajo proteine

imunskega sistema (citokine), kateri pomagajo pri boju z okužbo. Ko je gen aktiviran, ta zviša

aktivnost genov, ki pomagajo T celicam dozoreti v specializirane T celice. Specializirane T-

celice se imenujejo Th celice, ki proizvedejo specifične citokine in stimulirajo druge imunske

celice za odstranitev patogena iz celice [64].

STAT4 je povezan s številnimi avtoimunskimi boleznimi, kot so RA, sistemski lupus

eritematozus [65], diabetes I [66] in Sjögren sindrom [67].

Slika 2-6: Položaj gena STAT4. [63]


19

2.10.3 rs909685 (SYNGR1)

Synaptogyrin 1 je protein in je pri ljudeh kodiran z genom SYNGR1 [68]. Lociran je na daljši

ročici kromosoma 22 na položaju 13.1 (22q13.1). Lego gena SYNGR1 prikazuje slika 2-7.

Sestavljen je iz šestih eksonov. Gen kodira sestavni del membrane proteina povezanega s

presinaptičnim veziklom v nevronski celici. Točna funkcija proteina ni znana, vendar študije

podobnega proteina murina kažejo na funkcijo v sinaptični plastičnosti brez zahteve po

sinaptičnem prenosu [69]. SYNGR1 gen povezujejo s shizofrenijo [70], [71] in bipolarno

motnjo [71].

SNP rs909685 se nahaja na genu SYNGR1. Z GWA študijo [49] so ga povezali s pojavom RA.

Slika 2-7: Položaj gena SYNGR1 [72].

2.10.4 rs2476601 (PTPN22)

Gen PTPN22 je lociran na krajši ročici (p) kromosoma 1, položaj 13.2 (1p13.2). Položaj

PTPN22 prikazuje slika 2-8. Sestavlja ga 24 eksonov [73].

PTPN22 kodira nereceptorski protein tirozin fosfatazo 22 (LYP), ki je izražen v limfnih tkivih.

Mutacija rs2476601, ki se nahaja na genu PTPN22, spremeni aminokislinsko zaporedje na

mestu 620 iz arginina v triptofan. Fizična povezava med LYP in proteina tirozin kinaza CSK

(ang. C terminal SRC kinase) zavira LYP aktivnost. SNP rs 2476601 zmoti vezavo LYP na

CSK in sproži odzivnost B in T celičnih receptorjev [1]. Le-ta SNP je povezan s pojavom več

kot 20 različnih avtoimunskih bolezni v evropski populaciji, ki vključuje RA, diabetes tipa 1,

Graves-ovo bolezen in multiplo sklerozo [74].

Slika 2-8: Položaj gena PTPN22 [73].


20

2.10.5 rs3087243 (CTLA4)

Citotoksik T-limfocit-povezan protein 4 (CTLA4) je gen, ki kodira protein. Nahaja se na daljši

roki kromosoma 2, položaj 33.3 (2q33.3). Položaj CTLA4 vidimo na sliki 2-9.

Gen je član super družine imunoglobulinov in kodira protein za transmisijo zaviralnih signalov

do T celic. Protein vsebuje V domeno, transmembransko domeno in citoplazmitski rep.

Mutacije tega gena so povezali z inzulin-odvisnim diabetesom, Graves-ovo boleznijo,

Hašimoto tiroidizmom, celiakijo, sistematičnim lupos eritematozisom, RA in drugimi

avtoimunskimi boleznimi [75].

Slika 2-9: Položaj gena CTLA4 [75].


21

3 Eksperimentalni del

3.1 Vzorci DNK Laboratorijske raziskave so bile izvedene na 276 vzorcih DNK, kateri so bili predhodno

izolirani iz periferne krvi, natančneje iz krvnih limfocitov iz vzorcev bolnikov diagnosticiranih

z RA ter na 276 vzorcih DNK, kateri so bili predhodno izolirani iz vzorcev zdravih

posameznikov.

3.2 Materiali

3.2.1 Osnovne kemikalije

Pri naši nalogi smo uporabili kemikalije, ki so predstavljene v spodnji tabeli 3-1.

Tabela 3-1: Osnovne kemikalije in njihovi proizvajalci.

Kemikalija Proizvajalec

Agaroza SeaKem

dNTP-ji Sigma Aldrich

EDTA Sigma Aldrich

Etanol absolut Merck

Etidijev bromid Sigma Aldrich

Ficoll-Paque Plus GE Healthcare

Izopropanol Sigma Aldrich

Kloroform Sigma Aldrich

Ksilen cianol Sigma Aldrich

Light Cycler Master Mix Roche

Magnezijev klorid (HRM) Roche

Magnezijev klorid (PCR) Fermentas

PBS pufer Sigma Aldrich

PCR pufer Sigma Aldrich

Pufri za restrikcijske encime Fermentas

Restrikcijski encimi Fermentas

Saharoza Merck

TAQ polimeraza Sigma Aldrich

TRI reagent Sigma Aldrich

TRIS baza Calbiochem

Začetni oligonukleotidi Sigma Aldrich


22

Za RFLP in HRM smo uporabljali začetne oligonukleotide, ki so navedeni v tabeli 3-2.

Začetne oligonukleotide smo ročno oblikovali s pomočjo spletnega programa Primer3

(http://bioinfo.ut.ee/primer3-0.4.0/).

Tabela 3-2: Izbrani začetni oligonukleotidi (primerji).

Gen SNP ID Oznaka Zaporedje 5´-3´

CCR6 rs1571878 CCR6_rs1571878hrm(1) CTCAAGTGATCCACCCACCT

CCR6_rs1571878hrm(2) AGCCTGGGAACCCCTATCTA

SYNGR1 rs909685 SYNGR1_rs909685(1) ATCTGTGCCAGTCTCCTGCT

SYNGR1_rs909685(2) GGCCCAGCAGATTCAATAAA

STAT4 rs7574865 STAT4_rs7574865hrm(1) TGGAAACTGAAGGGATTGCT

STAT4_rs7574865hrm(2) CCTCATGCCCACAGTTGAC

PTPN22 rs2476601 PTPN22_rs2476601(1) CCAGCTTCCTCAACCACAAT

PTPN22_rs2476601(2) GGATAGCAACTGCTCCAAGG

CTLA4 rs3087243 CTLA4_rs3087243(1) CACCACTATTTGGGATATACC

CTLA4_rs3087243(2) AGGTCTATATTTCAGGAAGGC

3.2.2 CEPH vzorci

Pri eksperimentalnem delu smo pri genotipizacijah kot referenčne vzorce uporabili CEPH

vzorce. Fundacija Jean Dausset – Centre d'Etude du Polymorphisme Humain (CEPH) oziroma

Center za študijo človeških polimorfizmov vsebuje podatkovno bazo genotipov za genetske

markerje. Le-ti so bili genotipizirani na CEPH referenčnih družinah. Iz rakastih celic in celic

posameznikov so v fundaciji razvili nesmrtne celične linije, ki so vir DNK za genetske študije

po vsem svetu [76].

3.2.3 Raztopine in pufri

Vse raztopine in pufri v našem delu so bile pripravljene s posebno čisto destilirano vodo. Vodo

je destilirala naprava TKA PacificUP-UPW water purification system.

3.2.3.1 TBE pufer

TBE pufer smo pripravili kot založno raztopino z 10 x koncentracijo. Sestava 10 x TBE pufra

je iz:

- c = 445 mM borove kisline,

- c = 445 mM TRIS pufra in

- c = 5 mM EDTA.

Za pripravo V = 1 L 10 x TBE pufra smo zatehtali m = 55 g borove kisline, m = 108 g TRIS

baze in m = 3,72 EDTA. Vse skupaj smo raztopili v V = 1 L vode.

Za pripravo 1 x pufra smo V = 100 mL 10 x TBE pufra dodali v V = 900 mL destilirane vode.

http://bioinfo.ut.ee/primer3-0.4.0/


23

3.2.3.2 PBS pufer

Pri pripravi PBS pufra smo uporabili PBS v obliki tablet. V V = 200 mL destilirane smo

raztopili 1 tableto PBS. Raztopino smo nato sterilizirali v avtoklavu s programom za

sterilizacijo raztopin.

3.2.3.3 Nanašalni pufer za gelsko elektroforezo

Nanašalni pufer oziroma barvilo za gelsko elektroforezo smo pripravili tako, da smo zatehtali

m = 40 g saharoze in m = 0,25 g ksilen cianola. Vse skupaj smo raztopili v V = 100 mL 1 x

TBE pufra.

3.2.4 Laboratorijska oprema

V nalogi smo uporabili laboratorijsko opremo, ki je navedena v tabeli 3-3.

Tabela 3-3: Laboratorijska oprema in njeni proizvajalci

Oprema Proizvajalec

Centrifuge Biosan CMC-3000

Eppendorf centrifuge 5415R

Ciklični termostat Biometra T1 Thermocycler

Biometra Professional basic gradient

PCR v realnem času Light Cycler LC480

Mikropipete Finnpipette 10 µL, 100µL, 1000 µL

Mikrovalovna pečica Gorenje

Spektrofotometer BioTek Synergy2 Plate Reader

UV transiluminator Gel imaging system GBOX

3.3 Laboratorijske metode Poleg pregleda znanstvenih člankov smo v nalogi uporabili tudi različne laboratorijske metode

in tehnike, ki se uporabljajo pri molekularni biologiji. Uporabili smo naslednje laboratorijske

metode:

Izolacija DNK, RNK in proteinov

Merjenje koncentracij in redčenje DNK

Verižna reakcija z encimom polimeraza (PCR)

Polimorfizem dolžin restrikcijskih fragmentov (RFLP)

PCR v realnem času (qPCR) in metoda analize talilne krivulje visoke ločljivosti (HRM)

3.3.1 Izolacija DNK, RNK in proteinov

3.3.1.1 Zbiranje limfocitov

Z izolacijo limfocitov smo pričeli s pripravo vzorca. Kri z V = 12 mL, ki je bila odvzeta v

epruveto z EDTA smo prenesli v novo sterilno V = 50 mL centrifugirko ter dodali V = 12 mL

pufra PBS (skupen volumen 24 mL). Raztopino smo dobro premešali. V novo sterilno V = 50

mL centrifugirko smo nalili V = 12 mL Ficola. Na Ficol smo previdno in počasi ob steni


24

nalivali celotno suspenzijo krvi in PBS-a. Paziti smo morali, da se raztopina ni pomešala s

Ficolom, kot prikazuje spodnja slika 3-1.

Slika 3-1: Mešanica krvi in pufra PBS nanešenega na Ficol.

Centrifugirko smo pri f = 2500 rpm, t = 20 min in T = 18 °C centrifugirali. Po centrifugiranju

smo dobili vzorec, razdeljen na štiri faze, ki so vidne na sliki 3-2: eritrocite, Ficol, limfocite

in krvno plazmo.

Slika 3-2: Krvni vzorec, ki je po centrifugiranje razdeljen na štiri faze.

Krvno plazmo smo prenesli v sterilno V= 50 mL centrifugirko in jo shranili na T = - 20 °C.

Drugo fazo z limfociti smo s pipeto prenesli v novo V = 50 mL sterilno centrifugirko, katerim

smo nato dodali 3 volumne pufra PBS. Raztopino smo nato centrifugirali pri f = 2800 rpm in

t = 10 min. Po koncu centrifugiranja smo supernatant odsesali. Limfocitom smo dodali V = 10

mL PBS-a, zvorteksirali in ponovno centrifugirali pri f = 2800 rpm in t = 10 min. Supernatant

smo nato s pomočjo pipete v celoti odsesali in limfocite, ki so ostali, shranili v zmrzovalnik

pri T = 70 °C do njihove nadalnje uporabe.

Prav tako smo odstrabili Ficol nad plastjo eritrocitov in eritrocite shranili na – 20 °C.

3.3.1.2 Izolacija RNA s TRI reagentom

Zbrane limfocite smo odmrznili na sobni temperaturi in jim dodali V = 1500 µL TRI reagenta.

Celice smo razbili s pipetiranjem tako, da ni bilo več vidnih večjih koščkov. Vse skupaj smo

nato iz centrifugirk prenesli v V = 2 mL mikrocentrifugirke in inkubirali t = 5 min na sobni

temperaturi. Mešanici smo dodali V = 300 mL kloroforma, zaprli mikrocentrifugirke in

Kri pomešana s

pufrom PBS

Ficol

Krvna plazma

Limfociti

Ficol

Eritrociti


25

vorteksirali t = 15 s, da je raztopina postala motno bela. Vzorce smo inkubirali na sobni

temperaturi t = 2 -15 min. Po inkubaciji smo mešanico centrifugirali pri f = 12 000 x g (rcf), t

= 15 min pri T = 4 °C, da se loči v tri faze:

- spodnja rdeča – proteini,

- vmesna bela – DNK,

- zgornja prozorna – vodna raztopina RNK.

Vodno fazo smo prenesli v svežo V = 1,5 mL mikrocentrifugirko, preostanek pa smo uporabili

za izolacijo DNK in proteinov, kateri postopek je opisan v nadaljevanju tega dela. Vodni fazi

smo dodali V = 700 µL izopropanola in premešali z obračanjem mikrocentrifugirke. Vzorec

smo inkubirali na sobni temperaturi t = 5 – 10 min. Po inkubaciji smo vzorec centrifugirali pri

f = 12 000 x g (rcf), t = 10 min in T 4 °C. Na dnu mikrocentrifugirke nastane viden pelet.

Supernatant smo odlili in dodali V = 1500 µL 75 % etanola. Mešanico smo dobro premešali z

obračanjem in nato ponovno centrifugirali na f = 12 000 x g (rcf), t = 5 min pri T = 4 °C.

Supernatant smo odlili in pelet, ki je ostal na dnu mikrocentrifugirke smo posušili na zraku t

= 5 – 10 min. Vzorcu smo dodali V = 60 µL RNase free water in ga shranili pri T = - 70 °C.

3.3.1.3 Izolacija DNK

Po odstranitvi vodne faze za izolacijo RNK, smo DNK precipitirali iz vmesne faze in

organeske faze tako, da smo dodali V = 450 µL 100 % etanola. Mikrocentrifugirko smo nato

zvorteksirali in pustili stati na sobni temperaturi t = 2 – 3 min. Nato smo mešanico

centrifugirali pri f = 5 000 x g (rcf), t = 5 min in T = 4 °C. Po centrifugiranju smo odstranili

supernatant in ga shranili pri T = 4 °C za izolacijo proteinov. Pelet DNK smo dvakrat sprali v

V = 1500 µL, c = 0,1 M natrijevega citrata/10 % etanolu in dobro zvorteksirali. Med vsakim

spiranjem smo pustili pelet DNK stati z občasnim mešanjem t = 30 min. Sledilo je

centrifugiranje pri f = 5000 x g (rcf) t = 5 min pri T = 4 °C. Supernatant smo z odlivanjem

zavrzili. Pelet DNK smo resuspendirali v V= 1,0 mL 75 % etanola in pustili stati t = 10 – 20

min pri sobni temperaturi. Vzorce smo lahko na tej stopnji že shranili na – 20 °C. Lahko pa

smo jih ponovno centrifugirali pri f = 5000 x g (rcf), t = 5 min in T = 4 °C in supernatant smo

po koncu centrifugiranja ponovno zavrgli z odlivanjem. Pelet DNK smo nato posušili na zraku

in ga raztopili v V = 400 µL vode (ponavljajoče pipetiranje, uporabi konice s filtrom).

Raztopljeno DNK smo shranili na T = 4 °C v hladilnik.

3.3.1.4 Izolacija proteinov

Proteine smo iz fenol-etanolnega supernatanta precipitirali tako, da smo dodali V = 2250 µL

izopropanola. Vzorce smo pustili stati najmanj t = 10 min pri sobni temperaturi in jih nato

centrifugirali pri f = 12 000 x g (rcp), t = 10 min in T = 4 °C. Supernatant, kot zgornjo fazo

smo zavrgli, pelet pa smo sprali v V = 1 mL, c = 0,3 M gvanidijevega hidroklorida/95 %

etanolu. Spiranje smo ponovili dvakrat. Med vsakim spiranjem pa smo mešanico pustili stati

t = 20 min pri sobni temperaturi in nato centrifugirali pri f = 7 600 x g (rcf), t = 5 min pri 4 °C.

Nastali supernatant smo zavrgli. Po treh spiranjih smo dodali V = 1 mL 100 % etanola in

premešali z vorteksiranjem. Do nadaljne uporabe smo proteine shranili v 100 % etanolu na T

= - 20 °C.

3.3.2 Merjenje koncentracij in redčenje DNK

Koncentracija DNK je za metodo HRM zelo pomembna. Izoliranim vzorcem DNK smo

izmerili koncentracije s spektrofotometrom BioTek Synergy2 Plate Reader. DNK smo nato

razredčili do koncentracije c = 15 ng/µL. Za PCR-RFLP in HRM smo uporabili 2 µL tako

razredčene koncentracije (30 ng).


26

Volumen vzorca in vode za izračun želene koncentracije vzorca smo izračunali po enačbah

3.1 in 3.2:

𝑐 ∗ 𝑣 = 𝑐1 ∗ 𝑣1 + 𝑐2 ∗ 𝑣2 (3.1)

𝑣 = 𝑣1 + 𝑣2 (3.2)

Kjer je

c = končna koncentracija (15 ng/µL)

v = končni volumen

c1 = koncentracija raztopine DNK

v1 = volumen raztopine DNK, ki ga moramo dodati, da dobimo željen končni volumen

c2 = koncentracija DNK v vodi, ki je enaka 0

v2 = volumen vode, ki ga moramo dodati, da dobimo želeni končni volumen z želeno

koncentracijo

3.3.3 Verižna reakcija z encimom polimerazo (PCR)

Verižna reakcija s polimerazo (ang. PCR za Polymerase Chain Reaction) je metoda, ki

omogoča kopiranje odsekov DNK s pomočjo termično obstojnega encima DNK polimeraze.

Metodo je leta 1983 zasnoval ameriški biokemik Kary Mullis in je zanjo tudi dobil Nobelovo

nagrado za kemijo leta 1993. Je enostavna, hitra in cenovno ugodnejša od drugih metod, ki se

uporabljajo za pomnoževanje DNK. PCR metoda posnema in vivo pomnoževanje DNK.

Uporabljajo jo pri diagnostičnih postopkih molekularne medicine in forenzični znanosti [77],

[78].

Za PCR reakcijo potrebujmo naslednje osnovne komponente:

- dve kratki molekuli DNK, ki sta komplementarni začetnemu in končnemu delu

segmenta, ki ga želimo kopirati,

- dva sintetična začetna oligonukleotida, dolga med 18 in 25 nukleotidov, ki sta

komplementarna sosednjima zaporedjema,

- termostabilno DNK polimerazo (Taq DNK polimeraza), ki kopira regije,

- vse štiri deoksiribonukleozid trifosfate oz. dNTP (dATP, dGTP, dCTP, dTTP), za

gradnjo nove DNK,

- MgCl2,

- pufer, ki poskrbi za primerno kemijsko okolje v katerem encim DNK polimeraza

optimalno deluje.

PCR se izvaja v cikličnem termostatu. To je naprava, ki segreva in hladi reakcijske posodice

do določene temperature, ki je potrebna za vsak korak reakcije. PCR vsebuje serije od 20 do

35 ciklov. Vsak cikel je sestavljen iz treh stopenj, ki jih predstavlja slika 3-3:

1. Denaturacija. Matrično DNK segrejemo do T = 93 – 95 °C za t = 15 – 30 s. Tako

razbijemo vodikove vezi in ločimo verigi matrične DNK. Dobimo enoverižno DNK.

2. Pripenjanje začetnih oligonukleotidov. Temperaturo znižamo do T = 37 – 55°C za t =

15 – 30 s, kar omogoči pripenjanje začetnih oligonukleotidov (primer-jev) na ustrezne

komplementarne regije. Za uspešno pripenjanje oligonukleotidov in preprečitev

ponovnega prileganja matričnih verig DNK se v reakcijsko mešanico doda prebitek

začetnih nukleotidov [78]. Prav tako pa je ključnega pomena izbira temperature.


27

Napačna temperatura med procesom pripenjanja lahko privede do nespecifične vezave

nukleotidov.

3. Podaljševanje. Za pospešitev reakcije polimerizacije temperaturo dvignemo do T = 72

°C za t = 15 – 30 s. Taq DNK polimeraza se veže na oba začetna oligonukleotida in z

dodajanjem nukleotidov polimerizira dve novi verigi. Izbrana Taq DNK polimeraza je

iz termofilne bakterije Thermus aquaticus, ki je bila odkrita v vročih vrelcih v

ameriškem narodnem parku Yellowstone. Slabost Taq polimeraze je pomanjkanje

»proofreading« mehanizma, zato pride včasih do napak pri kopiranju DNK (mutacij).

Zato so še druge uporabne polimeraze izolirali iz bakterij, ki jih najdemo v

hidrotermalnih vrelcih na oceanskem dnu. Termostabilna polimeraza s »proofreading«

mehanizmom je npr. Pfu polimeraza iz bakterije Pyrococcus furiosus [79].

Slika 3-3: Prikaz postopka PCR reakcije [79].

Denaturacija Segrevanje do 95 °C

veriga DNK se loči

Pripenjanje

začetnih

oligonukleotidov

55 °C

Primerji se pripenjajo na

matrično DNK verigo

Podaljševanje 72 °C

Taq polimeraza sintetizira nove

DNK verige


28

Koncentracija tarčne DNK narašča eksponentno (Slika 3-4), saj vsaka na novo sintetizirana

veriga služi kot matrica. Po 20 ponovitvah reakcije dobimo iz 1 kopije DNK teoretično več

kot 1 milijon kopij [80].

Slika 3-4: Prikaz eksponentne rasti tarčne DNK [81].

Števila ciklov ni smiselno povečevati v neskončnost, saj običajno pri 35 do 45 ciklov pride do

t.i. efekta PCR platoja. Pri efektu platoja novi produkti ne nastajajo več. Vzrok za efekt platoja

je prebitek pridelkov PCR, ki izpodrinejo pri prilepljanju primerje in se kompetitivno vežejo

nazaj na drugo verigo DNK [77].

PCR produkte preverimo in analiziramo z gelsko elektroforezo. S pomočjo velikostnega

markerja ocenimo velikost nastalih pridelkov. Za detekcijo mutacij na DNK sekvenci

uporabimo metodo verižna reakcija s polimerazo, polimorfizem dolžin restrikcijskih

fragmentov (RFLP), metodo analize talilne krivulje visoke ločljivosti (HRM), TaqMan

metodo genotipiziacije [82].

Poznamo več vrst PCR metod, npr. »touch down« PCR, »hot start« PCR, »nested« PCR, Alu-

PCR, inverzni CPR, Real time PCR, itd. [83].

Reakcije smo izvedli po protokolu, ki je naveden v tabeli 3-4.

Tabela 3-4: Prikaz protokala za PCR reakcijo.

Reagenti Volumen za 1 vozrec (µL)

DNK 2

H2O a

pufer + MgCl2 1

dNTP-ji 0,2

primer 1 b

primer 2 b

TAQ polimeraza 0,05

tarča

Teoretično,

neskočna

eksponenčna

amplifikacija Matrična DNK

1 cikel

2 cikel

3 cikel 4 cikel

4 kopije 8 kopij 16 kopij 32 kopij


29

Parametra v tabeli 3-4 označena z a in b sta odvisna od vrste para začetnih oligonukleotidov.

S procesom optimizacije smo določili parameter b oziroma njegov volumen. Volumen a smo

izračunali naknadno.

Vse reagente smo dodali v mikrocentrifugirko, jih premešali na vorteksu in jih na kratko

centrifugirali. Mešanico smo nanesli na stripe ali ploščice, na katere smo predhodno

odpipetirali V = 2 µL DNK vzorca. Ploščico smo nato dali v termociklizator, kjer smo izbrali

ustrezen protokol glede na začetne oligonukleotide.

Najpogosteje izbrani protokol prikazuje tabela 3-5.

Tabela 3-5: Izbrani protokol, ki je uporabljen v termociklizatorju.

Začetna denaturacija T = 94 – 96 °C, t = 5 min

Denaturacija T = 94 – 96 °C, t = 30 – 60 s

Pripenjanje začetnih oligonukleotidov T = X, t = 20 – 30 s

Podaljševanje T = 72 °C, t = 30 s

Število ciklov 35 – 40 ciklov

Končno podaljševanje T = 72 °C, t = 7 min

Parameter X smo določili z optimizacijo.

3.3.4 Priprava 2 % agaroznega gela in elektroforeza

Agarozni gel smo pripravili tako, da smo v erlenmajerici zatehtali m = 0,8 g agaroze in dodali

40 mL 1 x TBE pufra. Mešanico smo segrevali v mikrovalovni pečici tako dolgo, dokler se

agaroza ni popolnoma raztopila. Nato smo dodali V = 3 µL etidijevega bromida, ki se vgrajuje

med bazne pare DNK in fluorescira pod UV svetlobo ( λ = 365 nm). Raztopino smo nalili na

nosilec z glavnički, katerih glavna naloga je narediti žepke v gel. Po strditvi gela smo

glavničke odstranili in gel potopili v banjico za elektroforezo, napolnjeno z 1 x TBE pufrom.

V = 10 µL PCR produkta smo dodali V = 5 µL barvila (ksilencianol) in vse skupaj nanesli na

dno žepka. Na gel smo tudi dali velikostni marker, tj. mešanica več DNK produktov znanih

dolžin, ki služijo kot standard, da lahko ocenimo velikost nastalih PCR produktov. Banjico z

gelom priključimo na konstantno napetost U = 150 V in pustimo teči t = 10 – 15 min. Molekula

DNK ima negative naboj, zato bo v elektroforeznem sistemu potovala skozi agarozni gel v

smeri pozitivno nabite elektrode. Večje molekule DNK so težje in potujejo počasneje v

primerjavi z manjšimi.

3.3.5 Polimorfizem dolžin restrikcijskih fragmentov (RFLP)

Pojem polimorfizem dolžin restrikcijskih fragmentov (ang. RFLP za restriction fragment

lenght polymorphism) se nanaša na različno dolge fragmente DNK, ki nastanejo po razrezu

DNK z restrikcijskim encimom (RE) ter na laboratorijsko metodo, ki se uporablja za ločevanje

in analizo teh fragmentov. Je ena izmed prvih metod, ki so jih uporabili v forenziki. V kliničnih

študijah pa se uporablja na področjih študije DNK polimorfizmov in študije mutacij tumorjev

[82].

V preteklosti se je za tipizacijo RFLP-jev uporabljala hibridizacija (Southern blotting) in z

radioaktivnimi sondami. Hibridizacijo je zamenjala PCR metoda saj je preprostejša, hitra in

ne zahteva velikih količin DNK. S PCR metodo pomnožimo željen odsek DNK, ki vsebuje


30

SNP, ki ga preiskujemo. PCR produktom se doda RE, ki specifično reže produkt. Fragmente

različnih velikosti ločimo z gelsko elektroforezo in na podlagi velikosti fragmentov določimo

genotip [82].

3.3.5.1 Restrikcijski encimi

Restrikcijski encimi, restrikcijske endonukleaze ali restriktaze so najbolj specifični bakterijski

encimi, ki režejo dvoverižne DNK molekule. Restrikcijske encime proizvajajo bakterije, ki z

njimi razgrajujejo tujo DNK bakteriofagov. RE prepoznajo specifično zaporedje nukleotidov

v DNK molekuli. Znotraj prepoznavnega zaporedja RE režejo DNK molekulo na fragmente

točno definirane dolžine, ti. restrikcijske fragmente. Uporabna vrednost RE je v tem, da so

sposobni rezati DNK molekulo na natančen in ponovljiv način [83].

Odkritje RE je švicarju Werner Arberju prineslo Nobelovo nagrado leta 1978. Delijo se na tri

glavne skupine:

- vrsta I,

- vrsta II in

- vrsta III.

Najbolj se uporablja vrsta II saj sta drugi dve skupini precej bolj kompleksni [84].

Izoliranih in preiskanih je bilo že več sto RE. Za raziskave jih uporabljajo približno 200. Vsaka

vrsta bakterij proizvede različne RE, ki prepoznajo različno zaporedje v DNK. Imena RE so

sestavljena iz treh črk bakterije iz katerih so bili izolirani, oznako seva in rimske številke, ki

označuje, kateri po vrsti je bil encim odkrit. Prvi odkriti RE, poimenovani Eco RI, so izolirali

iz seva R bakterij E. coli [83].

Večina RE prepoznajo specifična štiri, šest ali osem baznih parov dolga zaporedja nukleotidov

v DNK. Encimi se vežejo na določeno mesto v DNK in režejo dvoverižno DNK molekulo.

Prepoznano zaporedje nukleotidov, ki ga RE reže se imenuje mesto restrikcije. Številni RE

režejo prepoznavno zaporedje simetrično (na istem mestu na obeh verigah DNK). Nekateri

encimi pa režejo prepoznavna zaporedja asimetrično (pri različnih nukleotidih), da dobimo

DNK fragmente, ki imajo kratke enoverižne konce. Te konce imenujemo »lepljivi konci« [83].

Na sliki 3-5 je prikazan razrez DNK s tremi različnimi encimi. Restrikcijska encima EcoRI in

HindIII režeta DNK asimetrično, medtem ko AluI reže DNK simetrično.

Slika 3-5: Primer razreza treh restrikcijskih encimov [83].

EcoRI

(Escherichia coli)

HindIII

(Haemophilus influenzae)

AluI

(Arthrobacter luteus)

Tarčna sekvenca

in mesto razreza;

»lepljivi konci«

Tarčna sekvenca

in mesto razreza;

»topi konci«


31

PCR produktu z V = 10 µL smo dodali V = 20 µL reakcijske mešanice. Reakcijska mešanica

za RFLP vsebuje vodo, restrikcijski encim in restrikcijski pufer. Reakcijsko mešanico dobro

premešamo in dodamo PCR produktu. Vse skupaj nato premešamo na vorteksu in

centrifugiramo. Nato inkubiramo na T = 37 °C za t = 15 min.

Parametri, ki smo jih uporabili za restrikcijsko mešanico, so prikazani v tabeli 3-6.

Tabela 3-6: Parametri uporabljeni pri RFLP metodi.

Sestavina Količina za 1 vzorec (µL)

PCR produkt 10

Restrikcijski encim a

10 x pufer za restrikcijski encim 3

dH2O b

Parameter a smo določili z optimizacijo restrikcijskega encima. Parameter b smo izračunali

naknadno.

3.3.6 Metoda HRM

Analiza talilne krivulje visoke ločljivosti (ang. HRM za High Resolution Melting) je preprosto

orodje, ki hitro in učinkovito odkrije genetske spremembe (SNP, mutacije, metilacije) in ne

potrebuje označenih sond in procesiranja ali separacije po PCR (High Resolution Melting

Applications for Clinical Laboratory Medicine). HRM je bila predstavljena leta 2003 v

sodelovanju med Univerzo v Utahu (University of Utah) in podjetjem (Idaho Technology, Inc

(Salt Lake City, UT)). Zaradi preprostosti in hitrosti se metoda vedno bolj uporablja v kliničnih

laboratorijih [84].

HRM metoda se nanaša na taljenje DNK v prisotnosti nasičenih DNK barvil. V preteklosti je

bila toplotna talitev dvojne vijačnice DNK nadzorovana z UV absorbanco (hiperkromični

efekt). Analiza je zahtevala µg količine DNK in veliko časa, saj se je temperatura višala za

0,1-1,0 °C na minuto. Sodobna DNK analiza taljenja uporablja fluorescenco in potrebuje le

ng količine DNK. Analiza taljenja DNK z fluorescenco je postala popularna leta 1997 z

napredkom PCR v realnem času in prihodom inštrumenta LightCycler®. Majhne količine

vzorca so pripomogle k boljši kontroli temperature in hitremu taljenju za 0,1- 1,0 °C na

sekundo. Fluorescentno barvilo iz leta 1997 za real-time podaljševanje in taljenje pomnoženih

produktov je bilo SYBR® Green I [84]. Visoko specifična barvila, kot so SYTO® 9,

EvaGreen® in LCGreen® I nam dajejo boljše rezultate, saj bolj svetijo in jih lahko

uporabljamo pri višjih koncentracijah v primerjavi s tradicionalnimi barvili, kot je SYBR®

Green I [85]. LCGreen® I ima v primerjavi s SYBR® Green I sposobnost zaznavanja

heterodupleksov med samo talilno analizo. Prav tako ne inhibira PCR produktov, zato ga lahko

uporabljamo pri koncentracijah nasičenja in s tem zmanjšamo možnost za nastanek

nespecifičnih produktov. SYBR® Green I pa PCR produkt inhibira, zato ga uporabljamo pri

nizkih koncentracijah. Zaradi nizkih koncentracij ne dosežemo nasičenja, kar lahko privede

do prerazporejanja molekul barvila znotraj DNK med taljenjem.

Za HRM potrebujemo reakcijsko mešanico, ki vsebuje barvilo in DNK. Prvi korak je PCR, pri

katerem se pomnožijo zaporedja okoli izbranega polimorfizma SNP. Pomnoženi regiji rečemo

amplikon, PCR produkti pa so navadno krajši (100 do 159 bp). Drugi korak je HRM analiza


32

pri kateri se po PCR reakciji zmes postopoma segreva iz 50 °C na 95 °C. Pri nižji temperaturi

prisotna dvojna vijačnica DNK oddaja močno fluorescenco. Z višanjem temperature se

intenzivnost fluorescence znižuje, najprej počasi nato pa, ko doseže temperaturo Tm, naglo

pade in pride do razklopa dvojne vijačnice v dve ločeni verigi.

Razklop dvojne vijačnice v enovijačno DNK prikazuje slika 3-6.

Slika 3-6: Razklop dvojne vijačnice DNK v enoverižno DNK [86].

Talilna temperatura (Tm) je temperatura pri kateri je 50 % DNK v obliki dvojne vijačnice in

je odvisna od zaporedja (od števila posameznih baznih parov) [87]. Med C in G je trojna

vodikova vez in za njeno prekinitev je potrebno več energije in višja temperatura kot v primeru

A in T, ki se povezujeta le z dvojno vodikovo vezjo. HRM analiza genotipizira vzorec na

podlagi zaporedja v amplikonu, ki je povsod drugod enak, razlikuje pa se samo v SNP-ju, ki

ga preiskujemo.

Normalizirana talilna krivulja

Temperatura [°C]

Enoverižna DNK Dvoverižna DNK


33

Edinstven vzorec talilne krivulje in diferencialnega grafa je predstavljen na slikah 3-7 in 3-8.

Slika 3-7: Normalinizirana talilna krivulja.

Slika 3-8: Normaliniziran diferencialni graf.


34

Podobno kot pri PCR se tudi za HRM pripravi reakcijska mešanica. Reakcijsko mešanico smo

dodali V = 2 µL DNK vzorcem.

HRM reakcijsko mešanico smo naredili po protokolu, ki je prikazan v tabeli 3-7.

Tabela 3-7: Protokol za pripravo HRM reakcijske mešanice.

Reagent Volumen za 1 vzorec (µL)

DNK 2

PCR-grade H2O a

HRM Master Mix 5

MgCl2 b

Primer 1 c

Primer 2 c

Vrednosti a in b so bile določene po optmizaciji HRM. Parameter a smo izračunali naknadno.

Reakcije smo izvedli v Light Cycler LC480.

3.4 Računalniški programi Za načrtovanje eksperimentov in pri analizi podatkov smo si pomagali z različnimi

računalniškimi programi in bioinformatskimi orodji.

3.4.1 Bioinformatska orodja

Bioinformatika, uporaba računalniških tehnik za analizo informacij, povezane z

biomolekulami v velikem obsegu, je uveljavljena kot disciplina v molekularni biologiji in

zajema širok spekter področij od strukturne biologije, genomike do študij genske ekspresije

[88], [89], [90]. Bioinformatika se ukvarja s študijo metod za shranjevanje, pridobivanje in

analizo bioloških podatkov [91].

3.4.2 Primer3

Primer3 je spletni računalniški program, ki ga najdemo na spletni strani

http://bioinfo.ut.ee/primer3-0.4.0/. S Primer3 načrtujemo in analiziramo primerje za PCR in

PCR v realnem času. Program lahko zazna primerje za reakcije sekvenciranja in lahko načrtuje

hibridizacijske probe za oligonukleotide. Spletno orodje vsebuje pomembne aplikacije kot so

detekcija primerja, kloniranje, sekvenciranje in Primer seznam.

S Primer3 smo načrtovali začetne oligonukleotide za HRM.

3.4.3 SNP cutter

SNP cutter je prav tako spletno računalniško orodje za načrtovanje začetnih oligonukleotidov.

Najdemo ga na spletni strani http://bioapp.psych.uic.edu/SNP_cutter.htm. S tem programom

smo načrtovali začetne oligonukleotide za RFLP reakcijo.

3.4.4 GeneRunner 3.05

GeneRunner je preprost program za analizo v molekularni biologiji, katerega smo uporabili

za analizo sekvenc polimorfizmov SNP za RFLP.

http://bioinfo.ut.ee/primer3-0.4.0/

http://bioapp.psych.uic.edu/SNP_cutter.htm


35

V program lahko vstaviš sekvenco DNK ali proteinov. GeneRunner lahko izvede standardne

manipulacije sekvenčnih podatkov [92]:

- iskanje DNK sekvence za mesto restrikcije,

- iskanje sekvence proteinov za restikcijsko mesto peptidaz,

- translacija DNK v sekvenco proteinov in iskanje ORF,

- PCR in oblikovanje sekvenc začetnih oligonukleotidov,

- multi sekvenčno poravnanje.

Na spletnih straneh ameriškega Nacionalnega centra za biotehnološke informacije (NCBI)

smo v podatkovni bazi dbSN. poiskali sekvenco nukleotidnega tarčnega DNK fragmenta. V

program smo nato vnesli sekvenco prvega in sekvenco drugega alela. Dobili smo vse

restrikcijske encime, ki režejo eno in drugo sekvenco. Izbrali smo najbolj primeren

restrikcijski encim in ga naročili.

Slika 3-9 prikazuje primer uporabe programa GeneRunner. Zgoraj je prikazana sekvenca z

alelom A, katero nam restrikcijski encim NlaIII razreže na dva fragmenta. Spodaj pa je

prikazana homologna sekvenca z alelom T, ki je encim NlaIII ne reže. Zaradi razlik v velikosti

fragmentov lahko po končani elektroforezi na agaroznem gelu ločimo med posameznimi

genotipi.


36

Slika 3-9: Prikaz uporabe GeneRunner.

Alel A

Mesto

razreza z

restrikcijskim

encimom

NlaIII

Alel T


37

3.4.5 Program SPSS 20.0

Za statistično obdelavo smo uporabljali programski paket SPSS, pridobljeni z raziskavami. S

programom SPSS lahko opravljamo standardne statistične analize, kot so: opisno statistične

metode, korelacijske in regresijske metode, splošno linearno modeliranje, ipd. Z omenjenim

programskim orodjem smo analizirali dobljene rezultate genotipizacij. Za asociacijsko analizo

smo izvajali χ2 (hi-kvadrat) test t.j. Fisherjev natančni test. Fisherjev test se uporablja za

primerjavo frekvenc in za analizo variance. Za vsak SNP smo dobili p-vrednosti (statistično

signifikantne vrednosti p˂0,05), intervale zaupanja (confidence interval-CI95 %) in razmerja

obetov (odds ratio-OR). OR nam pove kakšen doprinos ima SNP, ki ga preiskujemo, za

nastanek določene bolezni. V našem primeru je to revmatoidi artritis.


38

4 Rezultati

4.1 Izbor polimorfizmov Kandidatne polimorfizme posameznega nukleotida (SNP), ki so pokazali povezavo z RA, smo

izbrali s sistematičnim pregledom GWA študij, ki so bile izvedene v zadnjih letih. Iz teh

asociacijskih študij smo izpisali vse polimorfizme posameznega nukleotida (SNP), ki

sodelujejo pri razvoju RA. V izbor smo uvrstili SNP-je, ki so bili največkrat replicirani in

imajo p < 5 x 10-8. Izbrali smo tudi gene, ki imajo p < 5 x 10-6 in še ni ustreznih replikacijskih

študij.

Po pregledu vse literature smo izbrali pet SNP-jev: rs1571878 (CCR6), rs7574865 (STAT4),

rs909685 (SYNGR1), rs2476601 (PTPN22) in rs3087243 (CTLA4). Izbrane SNP-je smo

predstavili v tabeli 4-1, v kateri so prikazani izbrani SNP-ji, citogenetska lokacija in

sprememba.

Tabela 4-1: Kandidatni polimorfizmi posameznega nukleotida (SNP).

SNP GEN Citogenetska

lokacija

Sprememba

rs1571878 CCR6 6q27 C/T

rs7574865 STAT4 2q32 G/T

rs909685 SINGR1 22q13.1 A/T

rs2476601 PTPN22 1p13 A/G

rs3087243 CTLA4 2q33 A/G

4.2 Optimizacija pogojev za RFLP test Za RFLP test smo uporabili polimorfizme SNP (rs909685 (SYNGR1), rs3087243 (CTLA4) in

rs2476601 (PTPN22). Začetne oligonukleotide (primerje) smo poiskali s pomočjo spletnega

programa SNPcutter-ja. Optimizacijo optimalnih pogojev smo izvedli samo za rs909685

(SYNGR1), ker so bili pogoji za rs3087243 (CTLA4) in rs2476601 (PTPN22) že optimizirani.

Najprej smo optimizirali optimalno temperaturo začetnih oligonukleotidov, pri kateri se le-ti

pripenjajo.


39

Slika 4-6 prikazuje PCR produkte rs909685 (SYNGR1) pri različnih temperaturah pripenjanja

primerjev.

Slika 4-1: Optimizacija optimalne temperature pripenjanja začetnih oligonukeotidov za rs909685

(SYNGR1).

Nespecifični produkti so najbolj vidni pri temperaturah pripenjanja od 51,1 – 59 °C. Vidni so

kot trakovi pod PCR produktom. Nespecifični produkti povzročajo težave pri nadaljnjih

analizah in so pogosta težava PCR reakcij. Zaradi tega niso zaželeni. Izbrali smo T = 62 °C.

Z namenom dodatnega izboljšanja specifičnosti reakcije smo izvedli optimizacijo koncentracij

začetnih oligonukleotidov. Pripravili smo štiri različne mešanice z različnimi koncentracijami

začetnih oligonukleotidov. V prvi smo imeli c = 375 nM (1,5 µL), v drugi c = 250 nM (1 µL),

v tretji c = 187,5 nM (0,75 µL) in v četrti c = 125 nM (0,5 µL).

504

433

259

217

94


40

Na sliki 4-7 so vidni PCR produkti rs909685 (SYNGR1) pri različnih koncentracijah primerjev.

Slika 4-2: Optimizacija koncentracij začetnih oligonukleotidov za rs909685 (SYNGR1).

PCR produkti so zelo dobro vidni pri vseh volumnih primerjev, zato smo izbrali najmanjši

volumen, tj. V = 0,5 µL. Optimizacija MgCl2 ni bila potrebna, ker začetni oligonukleotidi niso

tvorili nobenih nespecifičnih produktov.

Za rs909685 (SYNGR1) smo morali še optimizirati količino restrikcijskega encima NlaIII, ki

ga potrebujemo pri RFLP reakciji. Produktom PCR reakcije smo dodali različne količine

restrikcijskega encima in izbrali optimalno količino pri kateri se izbrana sekvenca DNK

najlepše reže.

1,5 µL 1 µL

0,75 µL 0,5 µL


41

Slika 4-8 prikazuje produkte restrikcije pri petih različnih volumnih restrikcijskega encima

NlaIII (1 U; 0,75 U; 0,5 U; 0,25 U in 0,1 U).

Slika 4-3: Optimizacija volumna restrikcijskega encima za rs909685 (SYNGR1).

Iz slike je razvidno, da restrikcijski encim uspešno reže tudi pri manjših količinah. Izbrali smo

0,25 U, ker se restrikcijski fragmenti pri 0,1 U ne vidijo več dobro razločno. Za 10 µL reakcijo

potrebujemo V = 0,025 µL restrikcijskega encima.

1 U 0,75 U

0,5 U 0,25 U

0,1 U


42

V tabeli 4-1 so izbrani optimalni pogoji za uspešno PCR reakcijo. V tabeli so dodani tudi

pogoji že optimiziranih začetnih oligonukleotidov rs3087243 (CTLA4) in rs2476601

(PTPN22).

Tabela 4-2: Protokol za PCR reakcijo.

Začetni oligonukleotidi rs909685 (SYNGR1) rs3087243 (CTLA4) rs2476601 (PTPN22)

Temperatura

pripenjanja

62 (°C) 55 (°C) 56 (°C)

DNK 2 2 2

Primer 1 0,5 0,75 0,5

Primer 2 0,5 0,75 0,5

dNTP-ji 0,2 0,2 0,2

Taq polimeraza 0,05 0,05 0,05

dH2O 5,75 5,25 5,75

PCR pufer 1 1 1

Produkte smo zaznali na agaroznem gelu, kateremu smo dodali etidijev bromid. Gelska

elektroforeza je trajala približno t = 15 min.

Po PCR testu smo izvedli RFLP po protokolu, ki je prikazan v tabeli 4-2.

Tabela 4-3: Protokol za RFLP reakcijo.

Začetni oligonukleotidi rs909685 (SYNGR1) rs3087243 (CTLA4) rs2476601 (PTPN22)

Restrikcijski encim NlaIII NcoI RsaI

Količina encima (c =

10 U/µL) 0,25 U 1 U 0,5 U

Temperatura

restrikcije 37 °C 37 °C 37 °C

Čas restrikcije 15 min 16 h 15 min

10 x pufer za

restrikcijski encim 3 2 2

Po določenem času smo vzorce nanesli na 2 % agarozni gel. Gelska elektroforeza je trajala t

= 20 min pri napetosti U = 150 V.

4.3 Optimizacija pogojev za HRM test Polimorfizma rs7574865 (STAT4) in rs1571878 (CCR6) smo uporabili za HRM test. Isto kot

v zgornjem poglavju smo tudi za ta dva SNP-eja optimizirali temperaturo, količino začetnih

oligonukleotidov in količno MgCl2.


43

Optimalne pogoje, ki smo jih pridobili s PCR testom prikazuje tabela 4-3.

Tabela 4-4: Optimalni pogoji za HRM test.

Začetni oligonukleotidi rs7574865 (STAT4) rs1571878 (CCR6)

DNK 1 1

PCR-grade H2O 0,6 0,4

HRM Master Mix 5 5

MgCl2 0,4 0,6

Primer 1 1,5 1,5

Primer 2 1,5 1,5

Temperatura pripenjanja 60 °C 60 °C

Pri poteku HRM testa smo naletili na težavo, ko smo genotipizirali referenčne vzorce z že

znanimi genotipi. Med njimi ni bilo nobenega jasnega ločevanja za rs1571878 (CCR6),

medtem ko za rs 7574865 (STAT4) nismo dobili nobenih produktov. Zato smo morali še

dodatno optimizirati HRM test.

Najprej smo ponovno optimizirali temperaturo in jo iz T = 60 °C znižali na T = 50 °C.

Pripravili smo tudi 2 x bolj koncentrirane začetne oligonukleotide, tj. c = 187 nm (0,72 µL) in

količino DNK vzorca povišali na 2 µL.

Za SNP rs1571878 (CCR6) se je s temi novimi optimalnimi pogoji genotipizacija dala izvesti,

še vedno pa so bili rezultati genotipizacije nekaterih vzorcev nejasni in dvoumni. Zaradi tega

obstaja možnost, da so rezultati genotipizacij nezanesljivi. Za rs 7574865 (STAT4) nam ni

uspelo optimizirati pogojev, ki bi dali jasen rezultat genotipizacije.

Rezultate optimizacij protokola za HRM rs7574865 (STAT4) in rs1571878 (CCR6) prikazuje

tabela 4-4.

Tabela 4-5: Ponovno optimizirani optimalni pogoji za HRM.

Začetni oligonukleotidi rs7574865 (STAT4) rs1571878 (CCR6)

DNK 2 2

PCR-grade H2O / 0,96

HRM Master Mix 5 5

MgCl2 0,4 0,6

Primer 1 / 0,72

Primer 2 / 0,72

Temperatura pripenjanja / 50 °C


44

4.4 Asociacijska analiza izbranih SNP pri bolnikih z RA Izvedli smo genotipizacijo z metodo PCR-RFLP in z HRM metodo na različnem številu

vzorcev bolnikov in zdravih kontrol. Genotipizirane vzorce smo analizirali in jih med seboj

primerjali. Primerjali smo genotipe bolnikov in genotipe zdravih kontrol.

4.4.1 Rezultati RFLP

Po končani optimizaciji smo izvedli genotipizacijo na RFLP in HRM testu. Genotipizirali smo

vzorce bolnikov z RA in vzorce kontrol.

Rezultati RFLP testa so bili vidni na agaroznih gelih z uporabo referenčnih CEPH vzorcev.

Te vzorce znanih genotipov smo predhodno poiskali v podatkovni bazi.

Slika 4-9 prikazuje shematski prikaz detekcije izbranega polimorfizma po restrikciji na

agaroznem gelu.

Slika 4-4: Shematski in slikovni prikaz detekcije polimorfizma rs909685 (SYNGR1) na agaroznem

gelu.

rs909685

Velikost

produkta

237

172

65

A/A A/T T/T


45

4.4.2 Rezultati HRM

Slika 4-10 prikazuje rezultate HRM testa za rs1571878 (CCR6).

Slika 4-5: Normalizirana in obdelana talilna krivulja HRM testa.

4.4.3 Primerjava rezultatov dobljenih iz genotipizacij

Genotipizirali smo izbrane SNP-je pri bolnikih in zdravih posameznikih in primerjali dobljene

frekvence genotipov posameznega SNP-ja in frekvence alelov s frekvencami iz podatkovne

baze projekta HapMap. Naše izračunane vrednosti smo primerjali s frekvencami izmerjenimi

na populaciji Evropejcev (CEU), katere smo našli na spletni strani NCBI [93], [94], [95], [96].

Primerjave prikazuje spodnja tabela 4-5.

Tabela 4-6: Primerjava izračunih frekvenc s frekvencami dobljenih iz projekta HapMap.

CCR6

(rs1571878)

SYNGR1

(rs909685)

PTPN22

(rs2476601)

Izmerjeno HapMap Izmerjeno HapMap Izmerjeno HapMap

Frekvenca

genotipov

CC: 0,211

CT: 0,463

TT: 0,325

CC: 0,183

CT: 0,450

TT: 0,367

AA: 0,188

AT: 0,437

TT: 0,376

AA: 0,133

AT: 0,450

TT: 0,417

AA: 0,011

AG: 0,144

GG: 0,844

AA: 0,009

AG: 0,216

GG: 0,775

Frekvenca

alelov

C: 0,443

T: 0,556

T: 0,592

C: 0,408

A: 0,406

T: 0,594

A: 0,358

T: 0,642

A: 0,083

G: 0,917

A: 0,117

G: 0,883

CTLA4

(rs3087243)

Izmerjeno HapMap

Frekvenca

genotipov

AA: 0,216

AG: 0,511

GG: 0,272

AA: 0,204

AG: 0,513

GG: 0,283


46

Frekvenca

alelov

A: 0,472

G: 0,528

A: 0,460

G: 0,540

Med izračunanimi frekvancami in frekvencami genotipov iz podatkovne baze je opazno

odstopanje. To razhajanje je lahko posledica različnih populacij saj smo pri našem delu

uporabljali vzorce slovenske populacije, pri projektu HapMap pa so bili uporabljeni vzorci

evropske populacije.

Največje razlike so vidne pri SNP rs1571878 (CCR6), kar lahko pripišemo manj zanesljivi

genotipizaciji ali pa kot smo že omenili, različni populaciji.

4.4.4 Rezultati statističnih analiz

Povezave med posameznim SNP-jem in boleznijo smo ugotavljali s statistično analizo. Izvedli

smo jo z uporabo pridobljenih podatkov za genotipe izbranih SNP-jev za 276 zdravih

posameznikov in 276 bolnikov z RA.

Tabele 4-7, 4-8, 4-9 in 4-10 predstavljajo statistične analize. Primerjali smo frekvence

genotipov in alelov med bolniki in kontrolno skupino (zdravi posamezniki). Za primerjavo

genotipskih frekvenc smo uporabili recesivni model, nato pa še dominantni model glede na

prvi alel.

S p-vrednostjo smo preverjali statistično signifikantnost. Izračunana p-vrednost je morala biti

p˂0,05, da bi povezavo ovrednotili kot statistično signifikantno.

Pri naši analizi je do razlik v signifikanci prišlo le pri dveh SNP-jih. Pri SNP-eju rs2476601

(Tabela 4-9) smo ugotovili, da je frekvenca genotipa A/A signifikantno višja (p = 1,3 x 10-5)

pri bolnikih (3,1 %) v primerjavi s kontrolami (1,1 %). Alelna frekvenca za alel A je prav tako

višja pri bolnikih (17,5 %). P-vrednost je bila p = 1,1 x 10-5.

Predvidevamo lahko, da alel A zvišuje tveganje za razvoj RA.

SNP rs3087243 prikazuje tabela 4-10. Frekvenca genotipa G/G je signifikantno nižja (p =

0,002) pri bolnikih (25,6 %) v primerjavi s kontrolami (29,5 %). Prav tako je alelna frekvenca

za alel G nižja pri bolnikih (44,5 %). P-vrednost je 0,028.

Sklepamo lahko, da alel G zmanjšuje tveganje za nastanek RA.


47

Tabela 4-7: p-vrednosti, razmerja obetov in intervali zaupanja za RA bolnike in kontrole za CCR6.

CCR6

rs1571878

RA

(n= 247)

Kontrole

(n= 246)

TT 38,0 % 32,5 %

CT 42,5 % 46,3 %

CC 19,8 % 21,1 %

T 0,589 0,557

C 0,411 0,443

Statistična analiza

Primerjava genotipov

CC proti CT + TT

p vrednost 0,739

OR 0,923

95 % CI 0,644-1,511

CC + CT proti TT

p vrednost 0,228

OR 0,786

95 % CI 0,596-1,430

Primerjava alelov

p vrednost 0,334

OR 0,877

95 % CI 0,681-1,129

TT = homozigot za alel T, CT = heterozigot, CC = homozigot za alel C, CC proti CT + TT je

dominantni model za alel T, CC + CT proti TT je dominantni model za alel C

n = število oseb z določenim genotipom, p = vrednost statistično značilne povezave, OR =

razmerje obetov z 95 % intervalom zaupanja


48

Tabela 4-8: p-vrednosti, razmerja obetov in intervali zaupanja za RA bolnike in kontrole za SYNGR1.

SYNGR1

rs909685

RA

(n= 269)

Kontrole

(n= 213)

TT 41,3 % 37,6 %

AT 44,6 % 43,7 %

AA 14,1 % 18,8 %

T 0,636 0,594

A 0,364 0,406



AA proti AT + TT

p vrednost 0,457

OR 0,806

95 % CI 0,494-1,314

AA + AT proti TT

p vrednost 0,780

OR 0,954

95 % CI 0,656-1,362

Primerjava alelov

p vrednost 0,508

OR 0,914

95 % CI 0,704-1,185

TT = homozigot za alel T, AT = heterozigot, AA = homozigot za alel A, AA proti AT + TT je

dominantni model za alel T, AA + AT proti TT je dominantni model za alel A




49

Tabela 4-9: p-vrednosti, razmerja obetov in intervali zaupanja za RA bolnike in kontrole za PTPN22.

PTPN22

rs2476601

RA

(n= 254)

Kontrole

(n= 270)

AA 3,1 % 1,1 %

AG 28,7 % 14,4 %

GG 68,1 % 84,4 %

A 0,175 0,083

G 0,825 0,917



AA proti AG + GG

p vrednost 1,3 x 10-5

OR 2,542

95 % CI 1,667-3,875

AA + AG proti GG

p vrednost 0,132

OR 2,894

95 % CI 0,759-11,033

Primerjava alelov

p vrednost 1,1 x 10-5

OR 2,337

95 % CI 1,596-3,421

AA = homozigot za alel A, AG = heterozigot, GG = homozigot za alel G, AA proti AG + GG

je dominantni model za alel G, AA + AG proti GG je dominantni model za alel A




50

Tabela 4-10: p-vrednosti, razmerja obetov in intervali zaupanja za RA bolnike in kontrole za CTLA4.

CTLA4

rs3087243

RA

(n= 172)

Kontrole

(n= 176)

AA 36,6 % 18,9 %

AG 37,8 % 51,6 %

GG 25,6 % 29,5 %

A 0,555 0,472

G 0,445 0,528



AA proti AG + GG

p vrednost 0,808

OR 1,091

95 % CI 0,677-1,757

AA + AG proti GG

p vrednost 0,002

OR 2,099

95 % CI 1,306-3,373

Primerjava alelov

p vrednost 0,028

OR 1,399

95 % CI 1,038-1,885

AA = homozigot za alel A, AG = heterozigot, GG = homozigot za alel G, AA proti AG + GG

je dominantni model za alel G, AA + AG proti GG je dominantni model za alel A

n = število oseb z določenim genotipom, p= vrednost statistično značilne povezave, OR =



51

5 Diskusija

V nalogi smo s povečanim tveganjem za nastanek RA v slovenski populaciji povezali dva

SNP-ja, rs2476601 (PTPN22) in rs3087243 (CTLA4), medtem ko za SNP-ja rs1571878

(CCR6) in rs909685 (SYNGR1) statistične povezave nismo dokazali.

Odkar so leta 2004 prvič odkrili povezavo SNP-ja rs2476601 (PTPN22) z RA [34], so številne

študije pri različnih populacijah, vključno s francosko, britansko, finsko, švedsko, nemško,

špansko in kanadsko, potrdile to povezavo. Ugotovili so, da alel A povečuje tveganje za

nastanek bolezni [46], [97].

V naši študiji smo za SNP rs2476601 (PTPN22) uspešno genotipizirali 254 vzorcev bolnikov

z RA in 270 vzorcev zdravih posameznikov in potrdili statistično značilno povezavo.

Ugotovili smo, da je frekvenca alela A višja pri bolnikih (17,5 %) v primerjavi z zdravimi

posamezniki (8,3 %, p = 1,1 x 10-5). Iz tega sklepamo da alel A zvišuje tveganje za razvoj RA

tudi v slovenski populaciji.

Primerjali smo rezultate naše študije s študijo, ki so jo izvedli na britanski populaciji [98].

Rezultate obeh študij smo predstavili v tabeli 5-1.

Kot je razvidno iz tabele 5-1, so za SNP rs2476601 na genu PTPN22 potrdili statistično

značilno povezavo z RA na britanski populaciji (p = 4,87 x 10-33) [98]. Želeli smo preveriti,

če bi dobili podoben rezultat z enakim številom vzorcev kontrol in RA bolnikov, kot v tuji

študiji, saj je p-vrednost v primerjavi z našo visoka. Izvedli smo ponovno statistično analizo

in dobili, da je p = 3,096 x 10-30.

Tabela 5-1: Primerjava študij za SNP rs2476601.

Število kontrol

(n)

Število RA

bolnikov (n)

p-vrednost

SLOVENSKA

ŠTUDIJA 270 254 p = 1,3 x 10-5

SLOVENSKA

ŠTUDIJA

(povečano

število kontrol

in RA

bolnikov)

2 334 1 361 p = 3,096 x 10-30

BRITANSKA

ŠTUDIJA [98] 2 334 1 361 p = 4,87 x 10-33


52

Za SNP rs3087243 na genu CTLA4 so različne replikacijske študije pokazale spodbudne,

vendar neponovljive rezultate v povezavi z RA. Študija na severno ameriški populaciji je

potrdila asociacijo SNP-ja rs3087243 (CTLA4) [41], toda študija, opravljena na švedski

populaciji [35] asociacije SNP-ja rs3087243 z RA ni dokazala. Povezavo med CTLA4 in RA

pa so potrdili pri evropski in azijski populaciji [46]. Plenge s sod. [35] je dokazal, da razlike

med študijami lahko nastanejo zaradi nezadostne statistične moči v nekaterih študijah.

Za SNP rs3087243 (CTLA4) smo uspešno genotipizirali 172 RA bolnikov in 176 zdravih

posameznikov.

Asociacijska študija na evropski populaciji [44] je pokazala, da ima alel A SNP-eja rs3087243

(CTLA4) zaščitno vlogo pred RA in zmanjšuje tveganje za nastanek RA. Alel A ima nižjo

frekvenco pri bolnikih (39 %) v primerjavi s kontrolami (44 %).

V naši študiji je frekvenca genotipa G/G pri bolnikih (25,6 %) nižja v primerjavi s kontrolami

(29,5 %). Sklepamo lahko, da ima G/G genotip za slovensko populacijo zaščitno vlogo (p =

0,002), kar pomeni, da imajo nosilci tega genotipa zmanjšano tveganje za nastanek bolezni.

Gen CCR6 je bil povezan z RA v različnih etničnih populacijah. Vendar je nekaj replikacijskih

študij poročalo o nasprotujočih rezultatih asociacije CCR6 z RA [99]. Nedavno so tri GWA

študije povezale CCR6 z RA [42], [45], [100]. Najmočnejša povezava med CCR6 in RA se je

pokazala na japonski populaciji [99].

Študije, ki so preučevale povezavo med genom CCR6 in RA, so v večini analizirale SNP-je

rs3093024, rs3099023 in rs1854853. Povezavo s SNP-jem rs1571878 na genu CCR6 so do

sedaj opravile dve GWA študiji [46], [47].

Okada s sod. je v GWA študiji [47], ki jo je opravil na japonski in evropski populaciji, potrdil

povezavo med SNP-jem rs1571878 (CCR6) in RA (p = 5,9 x 10-7).

V slovenski populaciji smo genotipizirali rs1571878 (CCR6) pri 247 RA bolnikih in 246

zdravih posameznikih. V naši študiji nismo našli povezave med RA in SNP-jem rs1571878

(CCR6). V prihodnjih raziskavah bo potrebno povečati število vzorcev saj je lahko na naš

rezultat vplivalo premalo število vzorcev, ki niso dosegli zadostne statistične moči.

V GWA študiji [47] so potrdili povezavo med SNP-jem rs909685 (SYNGR1) in RA. Študijo

so opravili na azijski in evropski populaciji pri 19 243 bolnikih in 61 565 kontrolah. Na azijski

populaciji so dobili vrednost statistično značilne povezave p = 2,0 x 10-7, na evropski

populaciji pa p = 6,4 x 10-12. V naši študiji nismo našli povezave med SNP-jem rs909685

(SYNGR1) in RA. Na to je lahko vplivalo premalo število vzorcev, ki ni doseglo zadostne

statistične moči in bo v prihodnjih raziskavah število vzorcev potrebno povečati.


53

6 Zaključek

Revmatoidni artritis je avtoimunska bolezen, ki prizadene vse sklepne dele telesa. Na nastanek

in patogenezo RA vplivajo dejavniki okolja in genetika. Na področju genetike RA niso

pojasnjeni vsi dejavniki, ki vplivajo na tveganje za razvoj RA. Odkar ugotavljajo vpliv

posameznih genov na razvoj bolezni so odkrili že veliko SNP-jev, ki v določeni meri povečajo

tveganje za nastanek RA.

V raziskavi smo izbrali pet SNP-jev in preverajli njihovo povezanost z RA pri slovenski

populaciji.

Statistična analiza je pokazala povezavo med RA in SNP-jem rs2476601 na genu PTPN22 za

genotipski model AA proti AG + GG (p = 1,3 x 10-5) in alelni model (p = 1,1 x 10-5). Za SNP

rs3087243 na genu CTLA4 smo potrdili statistično značilno povezavo za genotipski model AA

+ AG proti GG (p = 0,002) kot tudi za alelni model (p = 0,028). V primeru SNP-jev rs1571878

(CCR6) in rs909685 (SYNGR1) statistično značilne povezave nismo potrdili.

Z odkrivanjem in določanjem novih SNP-jev ter genov, ki povečujejo dovzetnost za razvoj

RA, omogočimo lažjo napoved bolezni in lažje načrtovanje zdravljenja. Zdravila za popolno

ozdravitev RA ni. Obstajajo pa standardna in biološka zdravila, s katerimi se pri bolnikih

lajšajo bolečine in simptomi. Z nadaljnjim odkrivanjem novih SNP-jev ter genov pri RA bi

pripomogli k razvoju zdravil, katera bi omogočila učinkovitejše zdravljenje in izboljšala

kakovost življenja bolnikov z RA.


54

7 Literatura

[1] Viatte S., Plant D., Raychaudhuri S. Genetics and epigenetics of rheumatoid arthritis.

Nat Rev Rheumatol., 9 (3), 141-153, 2014.

[2] Ješe R., Tomšič M. Vnetne revmatične bolezni. Farmacevtski vestnik, 64 (4), 267-271,

2013.

[3] Kumar V., Abbas A. K., Fausto N. Robbins and Cotran Pathologic Basis of Disease,

8th edition. Philadelphia: Elsevier Saunders, 2010.

[4] Kocjančič A., Mrevlje F., Štajer D. Interna medicina, tretja izdaja. Ljubljana: Littera

picta, 2005.

[5] Fauci A. S. et al. Harrison's principles of internal medicine, 17th edition. New York:

McGraw-Hill, Medical Publishing Division, 2008.

[6] Klemenc-Ketiš Z., Tušek-Bunc K. Navodila za bolnike: knjiga 2, Bolezni in poškodbe.

Ljubljana: Zavod za razvoj družinske medicine, 2009.

[7] Wasserman A. M. Diagnosis and Management of Rheumatoid Arthritis. American

Academy of Family Physicians, 84 (11) 1245-1252, 2011.

[8] Sotlar Južnič M., Kralj T. Viva, priloga skrb zase: Zdravljenje do cilja, revmatoidni

artritis, 2013. http://www.revmatiki.si/wp-content/uploads/2013/06/Priloga-Revma.pdf

(dostop 2. 4. 2015)

[9] Banal F, Dougados M, Combescure C, Gossec L. Sensitivity and specificity of the

American College of Rheumatology 1987 criteria for the diagnosis of rheumatoid arthritis

according to disease duration: a systematic literature review and meta-analysis. Ann Rheum

Dis, 68 (7), 1184-1191, 2009.

[10] Combe B, Landewe R, Lukas C, Bolosiu HD, Breedveld F, Dougados M, et al. EULAR

recommendations for the management of early arthritis: report of a task force of the European

Standing Committee for International Clinical Studies Including Therapeutics (ESCISIT).

Ann Rheum Dis, 66 (1), 34-45, 2007.

[11] Gupta S., Kumar S. Ethiopathogenesis and Investigation Tools: A Shadow of

Rheumatoid Arthritis. International Journal of Pharmaceutical Studies and Research, 2 (2), 63-

78, 2011.

[12] McAllister K., Eyre S., Orozco G. Genetic of rheumatoid arthritis: GWAS and beyond.

Open Access Rheumatology: Research Reviews, 3 (1), 31-46, 2011.

[13] Risch N., Merikangas K. The future of genetic studies of complex human diseases.

Science, 273 (5281), 1516-1517, 1996.

[14] Zhu M., Zhao S. Candidate gene identification approach: progress and challenges. Int

J Biol Sci., 3 (7), 420-427, 2007.

[15] Lengauer T. Bioinformatics–From Genomes to Therapies: Volume 3: Molecular

Function. Nemčija: Wiley-VCH, 2007.

[16] Sahebi L., Dastgiri S., Ansarin K., Sahebi R., Mohammadi S. A. Study Design in

Genetic Epidemiology. ISRN Genetics, 1-8, 2013.

[17] Cordell H. J., Clayton D. G. Genetic association studies. Lancet, 366, 1121-1131,

2005.

[18] Bush W. S., Moore J. H. Chapter 11: Genome-Wide Association Studies. PLoS

Comput Biol., 8 (12), e1002822, 2012.

http://www.revmatiki.si/wp-content/uploads/2013/06/Priloga-Revma.pdf


55

[19] Lander E. S., Linton L. M., Birren B., et al. Initial sequencing and analysis of the

human genome. Nature, 409 (6822), 860-921, 2001.

[20] International HapMap Consortium. A haplotype map of the human genome. Nature,

437 (7063), 1299-1320, 2005.

[21] Lee J.K. Statistical Bioinformatics: A Guide For Biomedical and Life Science

Reasearchers. ZDA: John Wiley and Sons, 2010.

[22] Kochi Y., Suzuki A., Yamamoto K. Genetic basis of rheumatoid arthritis: A current

review. Biochemical and Biophysical Research Communications, 452, 254-262, 2014.

[23] Seldin M. F., Amos C. I., Ward R., Gregersen P. K. The Genetics Revolution and the

Assault on Rheumatoid Arthritis. Arthritis & Rheumatism, 42 (6), 1071-1079, 1999.

[24] Bax M., van Heemst J., Hulzinga T. W. J., Toes R. E. M. Genetics of Rheumatoid

Arthritis: what have we learned? Immunogenetics, 63, 459-466, 2011.

[25] McInnes I. B., Schnett G. Mechanisms of Disease: The Pathogenesis of Rheumatoid

Arthritis. The New England Journal of Medicine, 365 (23), 2205-2219, 2011.

[26] MacKay K., Eyre S., et al. Whole – Genome Linkage Analysis of Rheumatoid Arthritis

Susceptibility Loci in 252 Affected Sibling Pairs in the United Kingdom. Arthritis &

Rheumatism, 46 (3), 632-639, 2002.

[27] Wakitani S, Murata N, Toda Y et al. The relationship between HLA-DRB1 alleles and

disease subsets of rheumatoid arthritis in Japanese. Br J Rheumatol 36; 630-636, 1997.

[28] Wordsworth B. P., Lanchbury J. S., Sakkas L. I., Welsh K. I., Panayi G. S., Bell J. I.

HLA-DR4 subtype frequencies in rheumatoid arthritis indicate that DRB1 is the major

susceptibility locus within the HLA class II region. Proc Natl Acad Sci U S A, 86 (24), 10049-

10053, 1989.

[29] Gregersen PK, Shen M, Song QL et al. Molecular diversity of HLA-DR4 haplotypes.

Proc Natl Acad Sci U S A 83 (8), 2642-2646, 1986.

[30] Deighton C. M., Walker D. J., Griffiths I.D., Roberts D. F. The contribution of HLA

to rheumatoid arthritis. Clin Genet, 36 (3), 178-182, 1989.

[31] Suzuki A., Yamada R., Chang X. et al. Functional haplotypes of PADI4, encoding

citrullinating enzyme peptidylarginine deiminase 4, are associated with rheumatoid arthritis.

Nat Genet, 34 (4); 395-402, 2003.

[32] Burr M. L., Naseem H., Hinks A. et al. PADI4 genotype is not associated with

rheumatoid arthritis in a large UK Caucasian population. Ann Rheum Dis, 69; 666-670, 2010.

[33] Lee Y. H., Rho Y. H., Choi S. J., Ji J. D., Song G. G. PADI4 polymorphisms and

rheumatoid arthritis susceptibility: a meta-analysis. Rheumatol Int, 27 (9), 827-833, 2007.

[34] Begovich A. B., Carlton V. E., Honigberg L. A. et al. A missense single-nucleotide

polymorphism in a gene encoding a protein tyrosine phosphatase (PTPN22) is associated with

rheumatoid arthritis. Am J Hum Genet, 75 (2), 330-337, 2004.

[35] Plenge R. M., Padyukov L., Remmers E. F. et al. Replication of putative candidate-

gene associations with rheumatoid arthritis in >4,000 samples from North America and

Sweden: association of susceptibility with PTPN22, CTLA4, and PADI4. Am J Hum Genet,

77 (6), 1044-1060, 2005.

[36] Kurreeman F. A., Padyukov L., Marques R. B. et al. A candidate gene approach

identifies the TRAF1/C5 region as a risk factor for rheumatoid arthritis. PLoS Med, 4

(9),1515-1524, 2007.

[37] Remmers E. F., Plenge R. M., Lee A. T. et al. STAT4 and the risk of rheumatoid

arthritis and systemic lupus erythematosus. N Engl J Med, 357 (10), 977-986, 2007.


56

[38] The Wellcome Trust Case Control Consortium. Genome-wide association study of

14,000 cases of seven common diseases and 3,000 shared controls. Nature, 447, 661-678,

2007.

[39] Thomson W., Bardon A., Ke X., Eyre S., et al. Rheumatoid arthritis association at

6q23. Nat Genet., 39 (12), 1431-1433, 2007.

[40] Plenge R. M., Seielstad M., Padyukov L. et al. TRAF1-C5 as a risk locus for

rheumatoid arthritis--a genomewide study. N Engl J Med, 357 (12), 1199-1209, 2007.

[41] Gregersen P. K., Amos C. I., Lee A. T., Lu Y., et al. REL, encoding a member of the

NF-kappaB family of transcription factors, is a newly defined risk locus for rheumatoid

arthritis. Nat Genet., 41 (7), 820-823, 2009.

[42] Kochi Y., Okada Y., Suzuki A., Ikari K., et al. A regulatory variant in CCR6 is

associated with rheumatoid arthritis susceptibility. Nat Genet., 42 (6), 515-519, 2010.

[43] Ballina J. A., Canete J., et al. Genome-wide association study of rheumatoid arthritis

in the Spanish population: KLF12 as a risk locus for rheumatoid arthrits susceptibility.

Arthritis Rheum., 58 (8), 2275-2286, 2008.

[44] Raychaudhuri S., Remmers E. F., Lee A. T. et al. Common variants at CD40 and other

loci confer risk of rheumatoid arthritis. Nat Genet, 40 (10), 1216-1223, 2008.

[45] Stahl E. A., Raychaudhuri S., Remmers E. F., Eyre S., et al. Genome-wide association

study meta-analysis identifies seven new rheumatoid arthritis risk loci. Nat Genet., 42 (6),

508-514, 2010.

[46] Okada Y., Terao C., Ikari K., Kochi Y., et al. Meta-analysis identifies nine new loci

associated with rheumatoid arthritis in the Japanese population. Nat Genet., 44 (5), 511-516,

2012.

[47] Okada Y., Wu D., Trynka G., et al. Genetics of rheumatoid arthritis contributes to

biology and drug discovery. Nature, 506 (7488), 376-381, 2014.

[48] Eyre S., Bowes J., Diogo D., Lee A., et al. High-density genetic mapping identifies

new susceptibility loci for rheumatoid arthritis. Nat Genet., 44 (12), 1336-1340, 2012.

[49] Kim K., Bang S. Y., Lee H.-S., Cho S.-K., et al. High density genotyping of immune

loci in Koreans and Europeans identifies eight new rheumatoid arthritis risk loci. Ann Rheum

Dis., 74 (3), 1-17, 2015.

[50] Stahl E. A., Wegmann D., Trynka G. Gutierrez-Achury J., et al. Bayesian inference

analyses of the polygenic architecture of rheumatoid arthritis. Nat Genet., 44 (5), 483-489,

2012.

[51] Kiezun A., Garimella K., Do R., Stitziel N. O., et al. Exome sequencing and the genetic

basis of complex traits. Nat Genet., 44 (6), 623-630, 2012.

Zdravljenje

[52] Smolen J. S., Landewe R., Breedveld F. C., Buch M., Burmester G., Dougados M., et

al. EULAR recommendations for the management of rheumatoid arthritis with synthetic and

biological disease-modifying antirheumatic drugs. Ann Rheum Dis., 73 (3), 492-509, 2014.

[53] Ipavec M., Simonišek U., Pibernik N., Saje A. Revmatoidni artritis: zbornik predavanj.

Zdravstveni TIM, 1-52, 2011.

[54] van Vollenhoven R. F. Treatment of rheumatoid arthritis: state of the art 2009. Nat Rev

Rheumatol., 5 (10), 531-541, 2009.

[55] Ostrovršnik J., Tomšič M. Sodobno zdravljenje revmatoidnega artritisa. Rehabilitacija,

8 (1), 157-162, 2014.


57

[56] Bennett J. S., Daugherty A., Herrington D., Greenland P., Roberts H., Taubert K. A.

The use of nonsteroidal antiinflammatory drugs (NSAIDs): a science advisory from the

American Heart Association. Circulation, 111 (13), 1713-1716, 2005.

[57] Coxib, traditional NTC, Bhala N., Emberson J., Merhi A., et al. Vascular and upper

gastrointestinal effects of non-steroidal anti-inflammatory drugs: meta-analyses of individual

participant data from randomised trials. Lancet, 382 (9894), 769-779, 2013.

[58] Kirwan J. R., Bijlsma J. W., Boers M., Shea B. J. Effects of glucocorticoids on

radiological progression in rheumatoid arthritis. Cochrane Database Syst Rev., 1, CD006356,

2007.

[59] Jones G., Sebba A., Gu J., Lowenstein M. B., Calvo A., Gomez-Reino J. J., et al.

Comparison of tocilizumab monotherapy versus methotrexate monotherapy in patients with

moderate to severe rheumatoid arthritis: the AMBITION study. Ann Rheum Dis, 69 (1), 88-

96, 2010.

[60] Holt K. A Review of Pathophysiology and Medicinal Treatment Options of

Rheumatoid Arthritis. PharmCon, 1-21, 2011.

[61] http://www.geneplanet.si/genetika/slovarcek-genetskih-pojmov/genotipizacija/

(dostop 25. 5. 2015)

[62] http://ghr.nlm.nih.gov/gene/CCR6 (dostop 3. 6. 2015)

[63] http://ghr.nlm.nih.gov/gene/STAT4 (dostop 3. 6. 2015)

[64] Wurster A. L, Tanaka T., Grusby M. J. The biology of Stat4 and Stat6. Oncogene, 19

(21), 2577-2584, 2000.

[65] Kobayashi S., Ikari K., Kaneko K., et al. Association of STAT4 with susceptibility to

rheumatoid arthritis and systemic lupus erythematosus in the Japanese population. Arthritis

Rheum, 58 (7), 1940-1946, 2008.

[66] Zervou M. I., Mamoulakis D., Panierakis C., Boumpas D. T., Goulielmos G. N.

STAT4: a risk factor for type 1 diabetes? Hum Immunol, 69 (10), 647-650, 2008.

[67] Zheng J., Yin J., Huang R., Petersen F., Yu X. Meta-analysis reveals an association of

STAT4 polymorphisms with systemic autoimmune disorders and anti-dsDNA antibody. Hum

Immunol, 74 (8), 986-992, 2013.

[68] Kedra D., Pan H. Q., Seroussi E., Fransson I., et al. Characterization of the human

synaptogyrin gene family. Hum Genet, 103 (2), 131-141, 1998.

[69] http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/9145 (dostop 3. 6. 2015)

[70] Latropoulos P., Gardella R., Valsecchi P., Magri C., et al. Association study and

mutational screening of SYNGR1 as a candidate susceptibility gene for schizophrenia.

Psychiatr Genet, 19 (5), 237-243, 2009.

[71] Verma R., Kubendran S., Das S. K., Jain S., et al. SYNGR1 is associated with

schizophrenia and bipolar disorder in southern India. J Hum Genet., 50 (12), 635-640, 2005.

[72] http://www.genecards.org/cgi-bin/carddisp.pl?gene=SYNGR1 (dostop 3. 6. 2015)

[73] http://www.genecards.org/cgi-bin/carddisp.pl?gene=PTPN22 (dostop 3. 6. 2015)

[74] Zheng J., Ibrahim S., Petersen F., Yu X. Meta-analysis reveals an association of

PTPN22 C1858T with autoimmune diseases, which depends on the localization of the affected

tissue. Genes Immun, 13 (8), 641-652, 2012.

[75] http://www.genecards.org/cgi-bin/carddisp.pl?gene=CTLA4 (dostop 3. 6. 2015)

[76] Foundation Jean Dausset. CEPH. http://www.cephb.fr/en/cephdb/ (dostop 7. 6. 2015)

http://www.geneplanet.si/genetika/slovarcek-genetskih-pojmov/genotipizacija/

http://ghr.nlm.nih.gov/gene/CCR6

http://ghr.nlm.nih.gov/gene/STAT4

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/9145

http://www.genecards.org/cgi-bin/carddisp.pl?gene=SYNGR1

http://www.genecards.org/cgi-bin/carddisp.pl?gene=PTPN22

http://www.genecards.org/cgi-bin/carddisp.pl?gene=CTLA4

http://www.cephb.fr/en/cephdb/


58

[77] Lo Y. M. D., Chiu R. W. K., Chan K. C A. Clinical Applications of PCR, second

edition. New Jersey: Humana Press Inc., 2006.

[78] Boyer R. Temelji biokemije. Ljubljana: Študentska založba, 2005.

[79] Strachan T., Read A. P. Human molecular genetics 3, 3. edition. New York: Garland

Publishing, 2004.

[80] http://scienceinfoworld.blogspot.com/2012/11/polymerase-chain-reaction-pcr.htm

(dostop 25. 5. 2015)

[81] http://openwetware.org/wiki/CH391L/S12/PCR_and_advanced_PCR_techniques

(dostop 25. 5. 2015)

[82] Gormus U., Selvi N., Yaylim-Eraltan I. PCR-RFLP and Real-Time PCR Techniques

in Molecular Cancer Investigations. InTech, 2012.

[83] Hartl D. L., Jones E. W. Genetics: Analysis of Genes and Genomes, fifth edition. USA:

2001.

[84] https://dna.utah.edu/Hi-Res/TOP_Hi-Res%20Melting.html (dostop 25. 5. 2015)

[85] Applied biosystems. A Guide to High Resolution Melting (HRM) Analysis. USA:

2010.

[86] http://www.gene-quantification.de/hrm-dyes.html (dostop 7. 6. 2015)

[87] Erali M., Voelkerding K. V., Wittwe C. T. High Resolution Melting Applications for

Clinical Laboratory Medicine. Exp Mol Pathol., 85 (1), 50-58, 2008.

[88] Lascombe N. M., Greenbaum D., Gerstein M, et al. What is bioinformatics? A

proposed Definition and Overview of the Field. Method Inform Med, 40, 346-358, 2001.

[89] Sharma N., Kumar D., Investigating HMM in Protein Profile Analysis. UNIASCIT, 2

(1), 141-146, 2012.

[90] Mohammed J. Machine Learning in Bioinformatics. International Journal of Advanced

Research, 2 (12), 545-549, 2014.

[91] http://www.uniassignment.com/essay-samples/biology/bioinformatics-is-a-sub-field-

biology-essay.php (dostop 1. 6. 2015)

[92] http://primerssr.blogspot.com/2011/04/generunner.html (dostop 1. 6. 2015)

[93] http://www.ncbi.nlm.nih.gov/projects/SNP/snp_ref.cgi?rs=1571878 (dostop 1. 6.

2015)

[94] http://www.ncbi.nlm.nih.gov/projects/SNP/snp_ref.cgi?rs=909685 (dostop 1. 6. 2015)


2015)


2015)

[97] Fodil M., Benzaoui A., et al. Association of PTPN22 (rs2476601) and STAT4

(rs7574865) polymorphisms with Rheumatoid Arthritis in the Western Algerian population.

Acta Reumatol port., 40 (1), 56-62, 2015.

[98] Orozco G., Viatte S., Bowes J. Novel Rheumatoid Athritis Susceptibility Locus at

22g12 Identified in an Extended UK Genome Wide Association Study. Arthritis Rheumatol.,

66 (1), 24-30, 2014.

[99] Cheng P., Zhang Y., Huang H., et al. Association between CCR6 and rheumatoid

arthritis: a meta-analysis. Int J Clin Exp Med., 8 (4), 5388-5396, 2015.

[100] Jiang L., Yin J., Ye L., et al. Novel risk loci for rheumatoid arthritis in han chinese and

congruence with risk variants in europeans. Arthritis Rheumatol.;66 (5), 1121–1132, 2014

http://www.amazon.com/s/ref=dp_byline_sr_book_1?ie=UTF8&field-author=Tom+Strachan&search-alias=books&text=Tom+Strachan&sort=relevancerank

http://www.amazon.com/s/ref=dp_byline_sr_book_2?ie=UTF8&field-author=Andrew+Read&search-alias=books&text=Andrew+Read&sort=relevancerank

http://scienceinfoworld.blogspot.com/2012/11/polymerase-chain-reaction-pcr.htm

http://openwetware.org/wiki/CH391L/S12/PCR_and_advanced_PCR_techniques

https://dna.utah.edu/Hi-Res/TOP_Hi-Res%20Melting.html

http://www.gene-quantification.de/hrm-dyes.html

http://www.uniassignment.com/essay-samples/biology/bioinformatics-is-a-sub-field-biology-essay.php

http://www.uniassignment.com/essay-samples/biology/bioinformatics-is-a-sub-field-biology-essay.php

http://primerssr.blogspot.com/2011/04/generunner.html

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/projects/SNP/snp_ref.cgi?rs=1571878





59

8 Življenjepis

OSEBNI PODATKI Gselman Doroteja

Na hribu 26, 2319 Poljčane (Slovenija)

+386 31228607

[email protected]

DELOVNE IZKUŠNJE

IZOBRAŽEVANJE IN USPOSABLJANJE

ŽELENO PODROČJE DELA Kemijski tehnolog, živilski tehnolog

24.3. 2014–v teku Genotipizacija slovenskih bolnikov z revmatoidnim artritisom za DNA polimorfizme predhodno povezane z boleznijo v asociacijskih študijah v celotnem genomu (v okviru magistrskega dela)

Fakulteta za kemijo in kemjsko tehnologijo Maribor, Maribor (Slovenija)

Izolacija DNA iz vzorcev krvi, genotipizacija izbranih polimorfizov SNP s tehniko PCR-RFLP in HRM in statistična analiza s programom SPSS.

15.7. 2014–1.9. 2014 Priprava in analiza vzorcev (v okviru praktičnega usposabljanja)

Steklarna Rogaška d.d., Rogaška Slatina (Slovenija)

Analiza trdote hladilnih vod, priprava surovin (sejalna analiza, nasipna teža), določanje gostote stekla, določitev števila bakterij, pH in motnosti v vodah za hlajenje brusov in pomoč pri določanju izluževanja Pb iz steklenih površin.

18.1. 2012–27.6. 2012 Vpliv superkritičnega ogljikovega dioksida (SC CO2) na aktivnost zamreženih encimskih agregatov (CLEAs) iz celulaze (v okviru dela za diplomo)

Fakulteta za kemijo in kemijsko tehnologijo Maribor, Maribor (Slovenija)

Sinteza zamreženih encimskih agregatov (CLEAs) iz celulaze, izpostavljanje CLEAs superkritičnemu ogljikovemu dioksidu in merjenje aktivnosti CLEAs s pomočjo UV-Vis spektrofotometrom.

1.10. 2012–v teku Magistrica inženirka kemijske tehnike Raven 7 EOK

Fakulteta za kemijo in kemijsko tehnologijo, Maribor (Slovenija)

- Bioseparacijska tehnika in kataliza

- Industrijska mikrobiologija

- Procesne surovine za bio in prehrambeno industrijo

- Osnove tehnologije živilskih izdelkov

- Genomika v biomedicinski tehnologiji

- Encimske tehnologije

2009–2012 Diplomirana inženirka kemijske tehnologije (UN) Raven 6 EOK


60

KOMPETENCE

Fakulteta za kemijo in kemijsko tehnologijo Maribor, Maribor (Slovenija)

- Splošna in anorganska kemija

- Analizna kemija

- Organska kemija

- Biokemijska tehnika-biotehnologija

- Biokemija in molekularna biologija

2004–2008 Gimnazijski maturant Raven 5 EOK

Prva gimnazija Maribor, Maribor (Slovenija)

Materni jezik slovenščina

Drugi jeziki RAZUMEVANJE GOVORJENJE PISNO SPOROČANJE

Slušno razumevanje Bralno razumevanje Govorno

sporazumevanje Govorno sporočanje

angleščina C1 C1 C1 C1 C1

nemščina A1 A1 A1 A1 A1

španščina B1 B1 A2 A2 A2

Stopnja: A1 in A2: Osnovni uporabnik - B1 in B2: Samostojni uporabnik - C1 in C2: Usposobljeni uporabnik Skupni evropski jezikovni okvir

Komunikacijske kompetence Komunikacijske veščine sem pridobila predvsem med delom v laboratoriju (med študijem), kjer smo bili razdeljeni v skupine.

Digitalna pismenost - Dobro poznavanje MS Office (Word, Excel, PowerPoint),

- delo v SPSS,

- elektronska pošta,

- spletni brskalniki.

Druge kompetence Vajena sem javnega nastopanja, se hitro učim, sposobna sem samostojnega dela kot tudi dela v skupini.

Vozniško dovoljenje B

http://europass.cedefop.europa.eu/sl/resources/european-language-levels-cefr

genotipizacija slovenskih bolnikov z revmatoidnim … · 2020. 1. 30. · magnezijev klorid nacl...

Documents